JP2014510737A

JP2014510737A - 標的細胞による治療薬の取り込みを高めるための方法及び組成物

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Publication number: JP2014510737A
Application number: JP2014501425A
Authority: JP
Inventors: ヨンジャンルオ，; ヤンチェン，; ヤンフ，; リンジャ，; グオドンチャン，
Original assignee: Tsinghua University; Protgen Ltd
Current assignee: Tsinghua University; Protgen Ltd
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2014-05-01
Anticipated expiration: 2032-03-28
Also published as: AU2012237786A1; US20140335152A2; AU2012237786B2; EP2702997B1; CA2837122C; CN102698270B; US9364493B2; JP6114940B2; EP2702997A1; CN102698270A; US20140147492A1; EP2702997A4; WO2012130141A1; CA2837122A1

Abstract

本発明は、既知の医薬の新規な使用に関する。詳細には、本発明は、標的細胞による治療薬の取り込みを増加させることにより、治療薬の治療効力を高めるための方法及び組成物に関し、特に、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤及び例えば抗腫瘍剤などの治療薬を含む、医薬組成物に関する。本発明はまた、抗腫瘍剤の治療効力を高めることができる、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤をスクリーニングする方法に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、既知の医薬の新規な使用に関する。詳細には、本発明は、標的細胞による治療薬の取り込みを増加させることにより、治療薬の治療効力を高めるための方法及び組成物に関し、特に、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤及び例えば抗腫瘍剤などの治療薬を含む、医薬組成物に関する。本発明はまた、抗腫瘍剤の治療効力を高めることができる、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤をスクリーニングする方法に関する。

腫瘍の成長及び遊走は、血管新生及びリンパ脈管新生に依存する。したがって、腫瘍血管新生及びリンパ脈管新生内皮細胞が、がん治療に対する新しい標的として現れている（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ、１９７１；２８５：１１８２〜１１８６、ＷｉｔｔｅＭＨら、Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ．１９８７；２０（４）：２５７〜６６）。一方、異常な血管新生が、肥満、糖尿病網膜症、硝子体過形成遺残、乾癬、アレルギー性皮膚炎、関節炎、動脈硬化症、子宮内膜症、喘息、腹水症、及び腹膜癒着を含む種々の疾患にも含まれることが示されている（ＣａｒｍｅｌｉｅｔＰ．、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、２００３；９（６）：６５３〜６６０）。

エンドスタチン（ＥＳ）は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの２０ｋＤａ（キロダルトン）のＣ末端断片であり、血管新生及びリンパ脈管新生の内因性阻害剤である。ＥＳは、血管新生及びリンパ脈管新生内皮細胞の増殖及び遊走を阻害することができ、したがって新しい血管及びリンパ管の形成を妨げることができる。組換え型エンドスタチンが、動物モデルにおいて薬物耐性を誘発することなく、種々のタイプの腫瘍の成長及び転移を阻害できることが示されている（ＦｏｌｋｍａｎＪ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７；８８：２７７〜２８５、ＦｏｌｋｍａｎＪ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７；３９０：４０４〜４０７、ＺｈｕｏＷ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ；２２２：２４９〜２６０）。近年、天然のエンドスタチンに比べて、別のＮ末端（Ｍ）ＧＧＳＨＨＨＨＨアミノ酸残基を含む、ヒト型組換えエンドスタチンＥｎｄｕが、多様な型のがん、特に、非小細胞肺がんの治療のために診療所で広く使用され、試験されている。ＥＳが、活性化した血管新生及びリンパ脈管新生内皮細胞によって、内部移行され得ることが示されている。しかしながら、その特定のメカニズムは不明なままである。

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、種々のタイプの腫瘍細胞の表面において過剰発現し、腫瘍細胞の増殖及び転移に密接に関連する。ＥＧＦＲに対するいくつかのモノクローナル抗体が、抗腫瘍治療として発展している。例えば、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、腫瘍細胞の細胞表面ＥＧＦＲに特異的に結合する、ＥＧＦＲのモノクローナル抗体である。セツキシマブは、特定のがんの治療のために使用されている。

ナイスタチン（Ｎｙｓｔａｔｉｎ）（ＮＴ）は、広域性抗真菌薬としてヒトに使用される、ポリエン系抗生物質である。他の薬物との相互作用なしに、経口投与又は局所投与され得る。ＮＴは、カンジダ菌に対して高い効力を有し、一方、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ケカビ（ｍｕｃｏｒ）、小胞子菌（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマチチジス（ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、皮膚糸状菌（ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）を含む他の菌類も同様に、通常はＮＴに感受性である。ＮＴはまた、一般に、エイズ患者及び化学療法を受けている患者などの、真菌感染症を起こしやすい患者において予防的治療として使用される。ナイスタチン及びその類縁体（例えば、アムホテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ））のメカニズムは、真菌細胞膜のエルゴステロールと結合し得ることにより、膜穿孔、カリウム漏出を引き起こし、その結果真菌は死に至るものである。エルゴステロールは真菌細胞膜特有の脂質組成物であり、ＮＴ及びアムホテリシンＢは、ヒト又は動物に投与されても真核細胞膜に影響を与えない。

ＮＴは、細胞のコレステロール依存性のエンドサイトーシスに影響を及ぼし得、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の特異的阻害剤として使用されている。コレステロールは脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路に必要であるため、ＮＴは細胞表面膜コレステロールと結合し得ることにより、本経路を阻害する。アムホテリシンＢ、メチル−β−シクロデキストリン、及びフィリピンは、ＮＴと同様の機能を有し、コレステロールに影響を与えることにより、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路をも阻害し得る。アムホテリシンＢ（ＡＭＢ）は、ＮＴと同一の機能を有し、クリプトコッカス感染症及びアスペルギルス感染症の治療に使用される。

Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（２００２、２００３）は、内皮細胞において、ＥＳは、脂質ラフトのカベオリン（カベオラの構造タンパク質）及びインテグリンα５β１に結合し得ることを報告し、ＥＳと脂質ラフトとの関連性を示した（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、２００２；６２：５５８０〜９、Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００３；２７８（３９）：３７８９５〜３７９０１）。さらに、Ｄｉｘｅｌｉｕｓら（２０００）、Ｓｈｉら（２００７）、及びＺｈｕｏら（２０１０）は、ＥＳが血管新生及びリンパ脈管新生内皮細胞において明確に内部移行し得ることを独立に報告した（Ｄｉｘｅｌｉｕｓら、Ｂｌｏｏｄ２０００、９５、３４０３〜３４１１；Ｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ２００７、１１０、２８９９〜２９０６、ＺｈｕｏＷ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ；２２２：２４９〜２６０）。

２００２年に、Ｐｉｋｅら及びＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆらは、ＥＧＦＲのリガンドである上皮成長因子（ＥＧＦ）の細胞表面結合が、コレステロール及び脂質ラフトの阻害によって増加し得ることを発見した（Ｐｉｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００２；４１：１０３１５〜２２、Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００２；２７７：１８９５４〜６０）。

Ｋｏｊｉｃら（２００８）は、腫瘍細胞が脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路を介してＡＭＦ／ＰＧＩを内部移行し得ることを報告した。さらに、このエンドサイトーシス過程は細胞型特異的であり、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシスが腫瘍細胞を特異的に標的とする薬物送達ルートを提供するかもしれないことを示した（Ｋｏｊｉｃら、ＰＬｏＳＯＮＥ、２００８；３：ｅ３５９７）。Ｍｉｇａｌｏｖｉｃｈら（２００９）は、ＮＴが、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシスを調節することによって、卵巣がん細胞によるダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）−ＢＳＡの取り込みを増加させることを報告した。ダイゼイン−ＢＳＡは、有望な腫瘍イメージング剤である。腫瘍細胞によるダイゼイン−ＢＳＡの取り込みを増加させることによって、腫瘍のイメージングにおいて、ＮＴがこの腫瘍イメージング剤の効果を改善させる可能性がある（Ｍｉｇａｌｏｖｉｃｈら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００９；６９：５６１０〜５６１７）。結論として、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシスは、サイトカイン、外来性タンパク質、及び治療用の化合物でさえも含む多くの重要な分子の取り込みにかかわっている可能性がある。細胞レベルでのこのようなエンドサイトーシスプロセスの調節及び操作は、対象におけるこれらの物質の取り込みに影響を及ぼし、薬物送達のための有望な応用手段が見出される可能性がある。

本発明は、以下の発見に基づく。ＥＳは、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路及びクラスリン被覆ピットエンドサイトーシス経路の両方を介して、内皮細胞によって内部移行し得る。驚くことに、ＮＴを用いて脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路を阻害すると、血管新生内及びリンパ脈管新生内皮細胞によるＥＳの取り込みが増加するという予期せぬ結果が生じ、内皮細胞、腫瘍血管新生及び腫瘍成長に対するＥＳの阻害効果を高める結果に至ることを本発明者らは発見した。学説とは異なるが、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の阻害によって、高度に有効なクラスリン被覆ピットエンドサイトーシス経路の代償的な活性化が生じ、ＥＳの総合的なエンドサイトーシスが増加するという結果に至ることが推測される。

同様に、ＥＧＦＲのリガンドは、ＥＳに対して同様のエンドサートーシスの機構を有することが示されている。例えば、ＥＧＦＲのモノクローナル抗体は、腫瘍細胞表面におけるＥＧＦＲに特異的に結合することにより、シグナル活性化及び腫瘍増殖を阻害する有望な抗腫瘍剤である。本発明者らは、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシスに影響を与えることにより、腫瘍細胞によるＥＧＦＲモノクローナル抗体の取り込みをＮＴが著しく高め、その結果、この抗体の治療効力を高めることを発見した。これらの発見は、腫瘍治療及び腫瘍のイメージングにおいて、ＮＴを使用することが有望であることを示す。さらに、エンドセリン受容体タイプＡ、コレラトキシン、トランスフォーミング成長因子β受容体、Ｂ細胞抗原受容体、骨形成タンパク質受容体、ＨＭ１．２４及びインテグリンを含む、ＥＳと似た同様のエンドサイトーシスパターンを分担する多くのタンパク質薬物が存在する。これらのタンパク質はすべて、ＮＴと併用して使用することにより治療効果を高めることができるという点で有望である。

したがって、一つの態様において、本発明は、対象の標的細胞による治療薬の取り込みを増加させる医薬組成物の調製における、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤の使用を提供する。

別の態様において、本発明は、対象に脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤を投与するステップを含む、対象の標的細胞による治療薬の取り込みを増加させる方法を提供する。

別の態様において、本発明は、対象の標的細胞による治療薬の取り込みの増加に使用するための、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤を提供する。

別の態様において、本発明は、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤及び抗腫瘍剤などの治療薬を含む医薬組成物を提供する。
本発明の前述の各態様における特定の実施形態において、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤は、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の阻害剤である。このような阻害剤の例は、ポリエン系抗真菌薬（例えば、ＮＴ又はＡＭＢ）、メチル−β−シクロデキストリン、又はフィリピンである。

本発明によれば、前述の治療薬は、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路及びクラスリン被覆ピットエンドサイトーシス経路の両方を介して、標的細胞によって内部移行し得るものである。

本発明によれば、対象は血管新生関連疾患又はリンパ脈管新生関連疾患を有する。

本発明によれば、対象は、例えば、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん、食道がん、鼻咽頭癌、悪性メラノーマ、骨がん、リンパ腫、乳がん、子宮頚がん、前立腺がん、血管腫、神経内分泌腫瘍、口腔がん、肉腫、腎がん、又は胆管がんなどのがんに罹る。

本発明によれば、前述の治療薬は、ＥＳ及びその誘導体などの血管新生又はリンパ脈管新生阻害剤である。ＥＳは、天然のエンドスタチン又は（ヒト型組換えエンドスタチンなどの）組換えエンドスタチンであり得る。本発明の特定の実施形態において、ＥＳは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列を有する。本発明のさらなる実施形態において、ＥＳ誘導体は、ＰＥＧ修飾エンドスタチンである。ＰＥＧは、平均分子量が５〜４０ｋＤａであるメトキシＰＥＧであることが好ましい。ＰＥＧ試薬の例は、メトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドである。本発明の特定の実施形態によれば、メトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドは、２０ｋＤａの平均分子量を有し、その修飾部位は、ＥＳのＮ末端αアミノ基である。

本発明によれば、治療薬は、腫瘍の成長を阻害することができる抗体である。本発明の特定の実施形態では、抗体は、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体などのＥＧＦＲ抗体である。ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体の例はセツキシマブである。

本発明の前述の態様における特定の実施形態において、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤は、静脈注射、点滴静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、皮下包埋、経皮吸収、及び肝動脈注射の群から選択される非経口的な経路で投与され得る。脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤は、リポソーム包埋形として製剤されることが好ましい。

本発明はまた、ＥＳ又は抗体などの前述の治療薬と、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤とを含む医薬組成物を提供する。

別の態様において、本発明はまた、抗腫瘍治療に対する増大効果を有し得る、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の機能的な調節剤をスクリーニングする方法を提供する。

本発明はまた、（ＡＭＢなどの）ＮＴと同様のメカニズムを有する薬物又は薬剤と、ＥＳ又はＥＧＦＲ抗体と同様のエンドサイトーシス及び作用メカニズムを有する治療薬とを含む、併用療法剤、併用製剤、又は医薬組成物に関する。

Ａ〜Ｅ：ＮＴ及びその類縁体（ＡＭＢ、メチル−β−シクロデキストリン、及びフィリピン）は、内皮細胞においてＥＳ及びその誘導体（又は修飾誘導体）の内部移行を用量依存的に高める。Ａ：ＮＴが、内皮細胞におけるＥＳの内部移行を用量依存的に高めたこと、及び、この増大がＮＴの濃度と正に相関したことを示すウエスタンブロッティング分析。この増大は、ＮＴを処理しない条件と比べて、細胞質画分、核画分、及び全細胞溶解産物におけるＥＳの蓄積が増加したことによって明示される。Ｂ：ＮＴが、リンパ管内皮細胞におけるＥＳの内部移行を用量依存的に高めたことを示すウエスタンブロッティング分析。Ｃ：ＡＭＢ、メチル−β−シクロデキストリン、及びフィリピンが、内皮細胞におけるＥＳの内部移行を用量依存的に高めたことを示すウエスタンブロッティング分析。Ｄ：ＮＴが、内皮細胞におけるＰＥＧ修飾ＥＳの内部移行を用量依存的に高めたことを示すウエスタンブロッティング分析。Ｅ：ＮＴが、Ｅｎｄｕ（Ｎ末端に、付加的な（Ｍ）ＧＧＳＨＨＨＨＨアミノ酸配列を含む、ヒト型組換えエンドスタチン）及びＮ末端がＰＥＧによって単一点修飾されたＥｎｄｕ（ＰＥＧ−Ｅｎｄｕ）の内部移行を、内皮細胞において用量依存的に高めたこと、及びこの増大が、ＮＴ濃度と正に相関したことを示すウエスタンブロッティング分析。ＮＴとＥＳの併用処理が、内皮細胞によるＥＳの内部移行を高めたこと、及び内皮細胞のＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫシグナル経路に対するＥＳの阻害効果を高めたことを示すウエスタンブロッティング分析。Ａ〜Ｂ：ＮＴとＥＳの併用処理は、内皮細胞の遊走に対するＥＳの阻害効果を高める。Ａ：ＮＴを処理しないＥＳと比べて、遊走細胞の数が減少することによって明示されるように、ＮＴとＥＳの併用処理が内皮細胞の活動に対するＥＳの阻害効果を高めることが、細胞遊走アッセイにより確認された。Ｂ：それぞれの処理群における内皮細胞の遊走能力を提示する、細胞遊走アッセイにおける遊走細胞数の統計値データ。Ａ〜Ｅ：ＮＴとＥＳの併用療法は、腫瘍成長に対するＥＳの阻害効果を高め、腫瘍組織におけるＥＳ分布を改善する。Ａ：ＮＴとＥＳの併用療法は、Ａ５４９非小細胞肺がん動物モデルの腫瘍成長に対するＥＳの阻害効果を高めた。Ｂ：ＮＴとＥＳの併用療法がＡ５４９動物モデルの腫瘍血管新生に対するＥＳの阻害効果を高めることを、免疫蛍光抗体染色法により確認した。Ｃ：ＮＴとＥＳの併用療法は、Ｈ２２肝臓がん動物モデルの腫瘍成長に対するＥＳの阻害効果を高めた。Ｄ：ＮＴとＥＳの併用療法がＨ２２肝臓がん動物モデルの腫瘍血管新生に対するＥＳの阻害効果を高めることを、免疫蛍光抗体染色法により確認した。Ｅ：ＮＴとＥＳの併用療法が、腫瘍を保有する動物モデルの腫瘍組織内の（ローダミン蛍光標識を含む）ＥＳの取り込み及び分布を高めることを、蛍光イメージングアッセイにより確認した。Ａ〜Ｂ：ＮＴは、腫瘍におけるＥＧＦＲモノクローナル抗体の取り込みを高める。Ａ：ＮＴが、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲモノクローナル抗体の内部移行を用量依存的に高めたことを示すウエスタンブロッティング分析。Ｂ：ＮＴとＥＧＦＲモノクローナル抗体の併用療法が、腫瘍を保有する動物モデルの腫瘍組織内のＥＧＦＲモノクローナル抗体の取り込み及び分布を高めることを、ｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージングアッセイにより確認した。

本発明は、広域性ポリエン系抗生物質ナイスタチン（ＮＴ）及び同様の薬剤の新規な使用を提供する。さらに、本発明は、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路及びクラスリン被覆ピットエンドサイトーシス経路によって内部移行する、ＥＳ及びＥＧＦＲモノクローナル抗体などの治療タンパク質薬物の効力を高めるための新規な医薬組成物及びその投与方法を提供する。

脂質ラフトは、コレステロール及びスフィンゴミエリンに富む原形質膜上の微小ドメインである。スフィンゴミエリン及びスフィンゴ糖脂質の飽和脂肪族鎖は固く密集し、この飽和脂肪族鎖間の間隙は、直径約５０ｎｍの、液状の秩序相すなわち脂質ラフトを形成するために、スペーサ−分子としてコレステロールで満たされる。脂質ラフトは、細胞膜シグナル伝達及びタンパク質ソーティングと密接な関係にある動的構造である。

カベオラ（洞穴状膜陥入又は膜マイクロカプセルとしても知られる）は、脂質ラフトと同一の膜脂質組成を有し、さらにはカベオリン（分子量が小さいタンパク質、２１ｋＤａ）を含む脂質ラフトの一形態を指す。脂質ラフト／カベオラ依存性経路は、クラスリンを必要としない。脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、及び平滑筋細胞は、エンドサイトーシスに含まれるカベオラが豊富である。さらに、カベオラ内の一定のシグナル分子の存在は、それが細胞シグナル伝達と関連することを示している。

クラスリン被覆ピットは、クラスリン媒介エンドサイトーシスの過程で形成される、動的な膜輸送構造である。このタイプの構造に依存するエンドサイトーシスはクラスリン媒介エンドサイトーシスと呼ばれる。

血管新生関連疾患及びリンパ脈管新生関連疾患は、がん、関節炎や乾癬などの自己免疫疾患、糖尿病、肥満症、及び種々の眼疾患を含む、血管新生異常及びリンパ脈管新生異常に密接に関連する疾患である。

ＮＴ及びエンドスタチンの両方が血管内皮細胞の培地に添加されたとき、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路阻害剤ＮＴが、血管内皮細胞におけるＥＳのエンドサイトーシスを著しく高めることを本発明者らは発見した。この増大効果は、ＮＴの濃度に正に相関する。一方、同じ結果がリンパ管内皮細胞でも観察された。

この増大効果が、ＮＴと同様の作用機構を有する他の治療薬及び試薬によっても達成され得ることが、さらなる実験によって明らかとなった。実施例１で実証されているとおり、アムホテリシンＢ（ＡＭＢ）、メチル化β−シクロデキストリン（Ｍβ−ＣＤ）、及びフィリピンなどのＮＴと同様の作用機構を有するある種の物質が、血管内皮細胞におけるＥＳのエンドサイトーシスをも高め得る。ＡＭＢ及びフィリピンは、抗真菌性抗生物質である。ＮＴと同様、ＡＭＢ、Ｍβ−ＣＤ、及びフィリピンが血管内皮細胞におけるＥＳのエンドサイトーシスを著しく高めることができ、この増大効果はこれらの化合物の濃度に正に相関する。

さらに、ＮＴが、内皮細胞においてＰＥＧ修飾ＥＳ（ＰＥＧ−ＥＳ）、Ｎ末端に付加的なアミノ酸配列（Ｍ）ＧＧＳＨＨＨＨＨを有するＥＳ（Ｅｎｄｕ）、及びＮ末端にＰＥＧ修飾を有するＥｎｄｕのエンドサイトーシスを著しく高め得ること、及びこの増大効果はＮＴの濃度に正に相関することを本発明者らは発見した。

分子細胞生物学レベルで、ＮＴが内皮細胞におけるＥＳのエンドサイトーシスを促進し、さらに（ＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫなどの）シグナル経路に関連する内皮細胞生存に対するＥＳの阻害効果を高め得ることを本発明者らは実証した。

細胞レベルで、ＮＴとＥＳの併用は、内皮細胞の遊走活動に対するＥＳの阻害効果を高め得ることを本発明者らは実証した。さらに、Ａ５４９肺がん動物モデル及びＨ２２肝臓がん動物モデルを使用して、ＮＴは腫瘍成長及び腫瘍血管新生に対するＥＳの阻害効果を高め得ることを本発明者らは実証した。加えて、ＮＴが腫瘍組織におけるＥＳの取り込み及び分布をも高め得ることが発見されている。

本発明者らはまた、ＥＧＦＲモノクローナル抗体は、エンドサイトーシスのメカニズムに関してＥＳにいくつかの類似点があり、腫瘍細胞におけるそのエンドサイトーシスもＮＴによって調節され得ることを発見した。分子細胞生物学レベルで、ＮＴが腫瘍細胞におけるＥＧＦＲモノクローナル抗体のエンドサイトーシスを高め得ることを本発明者らは実証した。さらに、ＮＴとＥＧＦＲモノクローナル抗体の併用処理が、マウスの異種移植片腫瘍においてＥＧＦＲモノクローナル抗体の取り込み及び分布を改善し得ることも本発明者らは実証した。

したがって、本発明は、ＥＳ又はＥＧＦＲモノクローナル抗体などの抗がん剤の取り込み及び効力を促進する併用抗がん療法における抗真菌性抗生物質ＮＴの新規な使用を提供する。これはがん治療及び腫瘍イメージングに使用され得る。

ポリマーでタンパク質を修飾することは、半減期などの薬物の動的特性を変化させるため、及び免疫学的特性や毒性学的性質を改善するために一般的に使用される技術である。ポリマーの中で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も一般的に使用されるタンパク質修飾分子である。本発明者らは、Ｎ末端αアミンでＰＥＧ（モノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）修飾されたエンドスタチン（及びその誘導体Ｅｎｄｕ）のエンドサイトーシスが、ＮＴによって内皮細胞で著しく増加することを証明した。この事実は、ＮＴ及び修飾又は標識されたＥＳ若しくはその誘導体の併用療法が相乗効果を達成するための理論的基礎を提供する。

この併用療法が、ＥＳと同様のエンドサイトーシスパターン及び作用メカニズムを有する他の薬物に拡張し得ることも本発明者らは実証した。このような薬物は、ＥＧＦＲモノクローナル抗体及び修飾、標識されたＥＧＦＲモノクローナル抗体など、腫瘍又は腫瘍血管系を標的とすることができ、治療又はイメージング目的に使用できる物質を含む。また、このような物質の取り込み及び効力は、ＮＴなどのポリエン系薬剤と併用して使用すると促進され得る。

本発明はまた、ＮＴ（又はＡＭＢなど）とＥＳとの併用療法のための新規な製剤及び医薬組成物を提供する。ＥＳはがん療法において静脈内注入によって投与される。ＮＴは、経口投与後の消化管による吸収は困難であり、直接注射では高い毒性を有する、不溶性の広域性抗真菌性ポリエン系抗生物質である。しかし、ＮＴはリポソームカプセル化による静脈内注入によって投与できることが示されている。例えば、アロネックス（Ａｒｏｎｅｘ）のＮＴリポソーム製剤ニオトラン（Ｎｙｏｔｒａｎ）は、１９９９年、第三相臨床試験を完了し、近年中に商品化されることが期待されている。これによってＮＴの静脈内投与が可能となるだろう。ＡＭＢ及びＮＴはどちらも広域性抗真菌性ポリエン系抗生物質に属し、これらは同一の作用メカニズムを有する。現在までに、欧州及び米国市場で製品化されているアムホテリシンＢリポソーム製剤は三種類があり（商品名はそれぞれ、アベルセット（Ａｂｅｌｃｅｔ）、アムホシル（Ａｍｐｈｏｃｉｌ）、及びアムビゾーム（ＡｍＢｉｓｏｍｅ））、これらはこの種の不溶性抗生物質の静脈内注入を可能にする。新たなリポソームアムホテリシンＢ注入製剤も、２００３年にファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）の商品名で発売された。したがって、リポソーム製剤及び静脈内投与によってＮＴ又はＡＭＢと、ＥＳ又はＥＧＦＲモノクローナル抗体との併用療法が達成可能である。

実施例１：ＮＴは血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞においてＥＳの取り込み及び内部移行を高める。
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）はＡＴＣＣ（受託番号ＣＲＬ１０６３６）から入手した。マウスリンパ管内皮細胞（ｍＬＥＣ）は、不完全フロイントアジュバントによって誘導される腹膜リンパ腫の消化により単離した（ＺｈｕｏＷ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ；２２２：２４９〜２６０）。ＥｎｄｕはＳｉｍｃｅｒｅ−ＭｅｄｇｅｎｎＢｉｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，から入手した。Ｅｎｄｕは、Ｎ末端に付加的なアミノ酸配列（Ｍ）ＧＧＳＨＨＨＨＨを含む組換えＥＳであり、この配列は配列番号３又は配列番号４である。その最初のアミノ酸残基Ｍが大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で発現する際に任意に削除されるためである。ＥＳはＰｒｏｔｇｅｎＬｔｄ．から入手し、このアミノ配列は配列番号１又は配列番号２である。その最初のアミノ酸残基Ｍが大腸菌で発現する際に任意に削除されるためである。２０ｋＤａの平均分子量を有するメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）（ＪｅｎｋｅｍＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．，）は、タンパク質のＮ末端でαアミノ基を特異的に修飾するＰＥＧ試薬として使用した。ＰＥＧ−ＥＳ及びＰＥＧ−Ｅｎｄｕは、ＰＥＧ試薬キットで提供される使用説明書にしたがってＰｒｏｔｇｅｎＬｔｄ．により調製した。ＥＳのモノクローナル抗体は、ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．から購入した。ＮＴ及び他の試薬はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．から購入した。

内皮細胞は９０％コンフルエントに達するまで培養し、その後以下のようにＮＴを含むＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で前処理をした。ＮＴ保存溶液を最終濃度が０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、その後、培養液を、ＮＴ前処理として、３７℃で２０分間、５％二酸化炭素環境下でインキュベートした。前処理後、ＥＳ保存溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度５μｇ／ｍＬになるように培地に添加した。培養液を、その後３７℃で３０分間、５％二酸化炭素環境下でインキュベートし、内皮細胞によるＥＳの内部移行を行った。培地を取り除いた後、内皮細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、回収した。全細胞溶解産物、細胞質画分、及び核画分におけるＥＳの内部移行を、ＮＴを処理しない細胞と比べて、ウエスタンブロッティングによって調べた。ＥＳ用量及び処理時間が同一の場合には、ＮＴ処理によって、全細胞溶解産物、細胞質画分、及び核画分におけるＥＳの内部移行が有意に増加するという結果が示された（図１Ａ）。ＥＳの内部移行は、２５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのＮＴで処理された細胞において、それぞれ約２倍及び１５倍増加し、このＥＳ内部移行の増加は、ＮＴ濃度に正に相関した（図１Ａ）。

ｍＬＥＣは、０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、又は３００μｇ／ｍＬのＮＴを含むＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で、３７℃で２０分間、５％二酸化炭素環境下で前処理をした。その後、細胞をＥＳ（最終濃度２μｇ／ｍＬ）を含む培地で、３７℃で１５分間、５％二酸化炭素環境下でインキュベートした。処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、回収した。種々の濃度のＮＴで処理をした細胞におけるＥＳの内部移行をウエスタンブロッティングによって調べた。７５μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬのＮＴで処理をすると、ｍＬＥＣにおいてＥＳの内部移行は、それぞれ１６倍、３２倍、及び７８倍に増加し、このＥＳ内部移行の増加は、ＮＴ濃度に正に相関するという結果が示された（図１Ｂ）。

ＡＭＢ（２５〜５０μｇ／ｍＬ）、メチル−β−シクロデキストリン（１〜２ｍＭ）、及びフィリピン（２．５〜５μｇ／ｍＬ）などの、ＮＴと同一の作用メカニズムを有するいくつかの他の薬剤もまた、本実施例に代えて試験した。これらは内皮細胞においてＥＳ内部移行を増加し得るという結果が示された（図１Ｃ）。

ＰＥＧ修飾ＥＳなどの、ＥＳと同一の作用メカニズムを有する他の治療薬もまた、本実施例において使用され得る。本目的のために、タンパク質のＮ末端を特異的に修飾する２０ｋＤａのメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）でＥＳを修飾すると、この産物（ＰＥＧ−ＥＳ）は、ＥＳのＮ末端αアミノ基で一つのＰＥＧ分子と結合したＥＳタンパク質となった。ＰＥＧ−ＥＳ用量及び処理時間が同一の場合には、血管内皮細胞におけるＰＥＧ−ＥＳ内部移行がＮＴ処理により増加し、この増加はＮＴ濃度に正に相関するという結果が示された（図１Ｄ）。

ＥＳの他の誘導体、Ｅｎｄｕ及びＰＥＧ−Ｅｎｄｕ（Ｎ末端αアミノ基で一つのＰＥＧ基と結合したＥｎｄｕ）を用いた内部移行実験においても、同様の結果が得られた。用量及び処理時間が同一の場合には、内皮細胞におけるＥｎｄｕ／ＰＥＧ−Ｅｎｄｕ内部移行がＮＴ処理により増加し、この増加はＮＴ濃度に正に相関した（図１Ｅ）。

実施例２：ＮＴは、ＥＳ内部移行を高めることによって内皮細胞シグナル経路に対するＥＳの阻害効果を増加させる。
Ｋｉｍら（２００２）は、ＥＳが、細胞外調節プロテインキナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、及びｐ１２５接着斑キナーゼ（ｐ１２５ＦＡＫ）によって媒介される内皮細胞におけるシグナル伝達経路を阻害し、その結果、内皮細胞活動を阻害することを発見した（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２、２７７、２７８７２〜２７８７９）。本実施例において、ＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫ経路は内皮細胞活性化のマーカーとされ、ＮＴとＥＳの併用によって、これらの経路に対するＥＳの阻害効果がさらに上昇することが発見されている。

本実施例において、内皮細胞を４群に分けた。（１）陰性対照群：ＮＴ処理もＥＳ処理も行わない。（２）ＮＴ群：ＥＳ処理は行わず、２０分間、５０μｇ／ｍＬのＮＴで処理を行う。（３）ＥＳ群：ＮＴ処理は行わず、３０分間、５μｇ／ｍＬのＥＳで処理を行う。（４）ＮＴ＋ＥＳ群：２０分間、５０μｇ／ｍＬのＮＴで処理を行い、その後３０分間、５μｇ／ｍＬのＥＳで処理を行う。実施例１で記載した同一の方法で処理した後、細胞を回収してＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫ経路を調べた。陰性対照群に比べて、ＮＴ処理（ＮＴ群）はＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫ経路のシグナル伝達に影響を及ぼさないという結果が示された。ＥＳ処理（ＥＳ群）はＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫ経路の活性化を阻害し、これはＫｉｍらによって報告された結果と矛盾しない。ＮＴ＋ＥＳ処理（ＮＴ＋ＥＳ群）は、ＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫ経路の活性化に対するＥＳの阻害効果をさらに高めた。これらの結果により、ＮＴ＋ＥＳの併用処理は細胞シグナル経路の活性化に対するＥＳの阻害効果を増強することが実証された（図２）。

実施例３：ＮＴは、内皮細胞の遊走に対するＥＳの阻害効果を高める。
細胞遊走アッセイ：ＨＭＥＣ（１ウェルあたり細胞２×１０^４個）を、トランスウェルチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｃｈａｍｂｅｒｓ）（８μｍ孔、Ｃｏｓｔａｒ）の上層に、０．５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含むＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）にまいた。ＥＳ（４０μｇ／ｍＬ）又はＮＴ（５０μｇ／ｍＬ）を、上層及び下層に添加し、その後、このチャンバーを３７℃で６時間、５％二酸化炭素環境下でインキュベートし、細胞を遊走させた。グルタルアルデヒド固定及びクリスタルバイオレット染色の後、各ウェルの任意に選んだ５ヶ所の範囲について、顕微鏡（４００倍率、ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１）にて観察した。下層へ遊走した細胞の数を数え、平均値を算出した。３連実験を行い、各実験は２回繰り返した。

本実施例において、内皮細胞を４群に分けた。（１）陰性対照群：ＮＴ処理もＥＳ処理も行わない。（２）ＮＴ群：ＥＳ処理は行わず、５０μｇ／ｍＬのＮＴで処理を行う。（３）ＥＳ群：ＮＴ処理は行わず、４０μｇ／ｍＬのＥＳで処理を行う。（４）ＮＴ＋ＥＳ群：５０μｇ／ｍＬのＮＴ及び４０μｇ／ｍＬのＥＳで併用処理を行う。陰性対照群に比べて、ＮＴ処理（ＮＴ群）は内皮細胞の遊走能に実質的な影響を及ぼさないという結果が示された。ＥＳ処理（ＥＳ群）は内皮細胞の遊走を６１％阻害した。ＮＴ＋ＥＳ処理（ＮＴ＋ＥＳ群）は、内皮細胞の遊走に対するＥＳの阻害効果を高めた（阻害率８７％、Ｐ＜０．００１、ＮＴ＋ＥＳ群対ＥＳ群）。これらの結果により、ＮＴ＋ＥＳの併用処理は内皮細胞の遊走に対するＥＳの阻害効果を増強することが実証された。各群の細胞遊走の代表的な画像を図３Ａに示した。遊走細胞数の平均値を図３Ｂに示した。

実施例４：ＮＴは腫瘍組織におけるＥＳの取り込み及び分布を増加させ、動物におけるＥＳの抗腫瘍効力及び血管新生阻害効力を高める結果となる。
指数増殖期のヒト肺腺癌Ａ５４９腫瘍細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１８５）を６〜８週齢のヌードマウス（ＶｉｔａｌＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ）に皮下接種した。腫瘍容積が１００ｍｍ^３に達したとき、腫瘍保有ヌードマウスを４群に分けた。（１）陰性対照：生理食塩水で処理を行う。（２）ＮＴ群：ＥＳ処理は行わず、ＮＴ（毎日、６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で処理を行う。（３）ＥＳ群：ＮＴ処理は行わず、ＥＳ（毎日、１２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で処理を行う。（４）ＮＴ＋ＥＳ群：ＮＴ（毎日、６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）及びＥＳ（毎日、１２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で併用処理を行う。１４日間毎日の注射を行った後、マウスを屠殺し、腫瘍の重量及び容積を測定した。対照群に比べて、ＮＴ処理は腫瘍の成長に影響を及ぼさず、ＥＳ処理は腫瘍の成長を４０％阻害するという結果が示された。ＮＴ＋ＥＳ処理は、腫瘍の成長に対するＥＳの阻害効果を高めた（阻害率６０％）。これらの結果より、ＮＴは腫瘍の成長におけるＥＳの阻害効力を増強することが実証された（図４Ａ）。体重、摂食、及び日常行動に関して、すべての群の動物において異常な変化は観察されなかった。

腫瘍血管形成アッセイ：Ａ５４９マウス由来の腫瘍を切除し、固定及び切片を作成した。試料をＣＤ３１に対する一次抗体（腫瘍血管内皮細胞のマーカー）及びＦＩＴＣ標識二次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で検出し、その後ＮｉｋｏｎＡ１レーザ走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）により観察した。任意に選んだ範囲（４００×）における血管の断面積を定量化し、ＬＳＣＭシステムのソフトウエアで平均値を計算した。ＮＴは腫瘍血管形成におけるＥＳの阻害効力を増強するという結果が示され、これは腫瘍の成長における阻害効力と同様であった。各群の平均腫瘍重量を図４Ａに示した。各群の平均腫瘍血管面積（任意単位）を図４Ｂに示した。

ＥＳの抗腫瘍活性及び血管新生阻害活性に対するＮＴの増大効果は、Ｈ２２肝臓がんマウスモデルにおいても明示された。各群の平均腫瘍重量を図４Ｃに示した。各群の平均腫瘍血管面積（任意単位）を図４Ｄに示した。体重、摂食、及び日常行動に関して、すべての群の動物において異常な変化は観察されなかった。

腫瘍保有マウスの腫瘍組織における蛍光標識ＥＳの取り込み及び分布の測定：指数増殖期のヒト肺腺癌Ａ５４９腫瘍細胞を６〜８週齢のヌードマウス（ＶｉｔａｌＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ）に皮下接種した。腫瘍容積が３００ｍｍ^３に達したとき、腫瘍保有マウス（ｎ＝４／群）は２つの群に分類された。（１）ＥＳ群：ＮＴ処理は行わず、ローダミン（Ｐｉｅｒｃｅ）標識ＥＳ（Ｒｈ−ＥＳ、２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で処理を行う。（２）ＮＴ＋ＥＳ群：ＮＴ（６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）及びＲｈ−ＥＳ（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で併用処理を行う。４時間後、マウスを屠殺し、腫瘍を切除し、腫瘍における蛍光標識ＥＳの取り込みのイメージング及び定量分析を、生物発光画像処理システム（ＴｓｉｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて実施した。ＮＴは、腫瘍組織においてＥＳの取り込み及び分布を有意に４倍増加させる結果が示された（図４Ｅ）。

実施例５：ＮＴは、腫瘍細胞によるＥＧＦＲモノクローナル抗体（セツキシマブ）のエンドサイトーシス及び動物腫瘍組織におけるＥＧＦＲモノクローナル抗体の取り込み及び分布を著しく高める。
指数増殖期のＥＧＦＲ発現Ａ５４９細胞を９０％コンフルエントに達するまで培養し、その後以下のようにＮＴを含むＤＭＥＭ培地で前処理をした。ＮＴ保存溶液を最終濃度が０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、その後、培養液を、ＮＴ前処理として、３７℃で２０分間、５％二酸化炭素環境下でインキュベートした。前処理後、ＥＧＦＲモノクローナル抗体（セツキシマブ、Ｍｅｒｃｋ）保存溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度５μｇ／ｍＬになるように培地に添加した。培養液を、その後３７℃で３０分間、５％二酸化炭素環境下でインキュベートし、内皮細胞によるＥＧＦＲモノクローナル抗体の内部移行を行った。処理後、培地を取り除き、内皮細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、回収した。細胞におけるＥＧＦＲモノクローナル抗体の内部移行を、ＮＴを処理しない細胞におけるＥＧＦＲモノクローナル抗体の内部移行と比べて、ウエスタンブロッティングによって調べた。セツキシマブ用量及び処理時間が同一の場合には、ＮＴ処理によって、細胞におけるセツキシマブの内部移行が有意に増加し、セツキシマブの内部移行は、ＮＴ濃度に正に相関するという結果が示された（図５Ａ）。

指数増殖期のヒト肺腺癌Ａ５４９腫瘍細胞を６〜８週齢のヌードマウス（ＶｉｔａｌＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ）に皮下接種した。マウス（ｎ＝４／群）は２つの群に分類された。腫瘍容積が約５００ｍｍ^３に達したとき、第１の群はＣｙ５．５標識セツキシマブ（Ｃｙ５．５、ＧＥ）で処理し、第２の群はＣｙ５．５標識セツキシマブ（第１の群と同一用量）＋ＮＴで処理を行った。２つの群の動物由来の腫瘍におけるＣｙ５．５−セツキシマブの取り込みを、生物発光画像処理システム（ＴｓｉｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて調べた。ＮＴは、腫瘍組織においてセツキシマブの取り込み及び分布を増加させ、したがって、薬の取り込みを高め、治療効力を改善し、腫瘍イメージングに有用であるという結果が実証された（図５Ｂ）。

Claims

対象の標的細胞による治療薬の取り込みを増加させる医薬組成物の調製における、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の調節剤の使用。
脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の前記調節剤が、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の阻害剤である、請求項１に記載の使用。
前記脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の阻害剤が、ポリエン系抗真菌薬である、請求項２に記載の使用。
前記脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の阻害剤が、ナイスタチン及びアムホテリシンＢから選択される、請求項３に記載の使用。
前記脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の阻害剤が、メチル−β−シクロデキストリン又はフィリピンである、請求項２に記載の使用。
前記治療薬が、脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路及びクラスリン被覆ピットエンドサイトーシス経路を介して前記標的細胞に取り込まれることができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
前記対象が、血管新生関連疾患又はリンパ脈管新生関連疾患に罹っている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
前記対象が、腫瘍に罹っている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
前記治療薬が、血管新生又はリンパ脈管新生阻害剤である、請求項７又は８に記載の使用。
前記血管新生又はリンパ脈管新生阻害剤が、天然のエンドスタチン又はヒト型組換えエンドスタチン又はその誘導体である、請求項９に記載の使用。
前記エンドスタチンが、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の使用。
前記エンドスタチンが、Ｎ末端に付加的なアミノ酸配列（Ｍ）ＧＧＳＨＨＨＨＨを有し、配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の使用。
前記エンドスタチン誘導体が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾エンドスタチンである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、５〜４０ｋＤの平均分子量を有するメトキシＰＥＧである、請求項１３に記載の使用。
前記ＰＥＧがメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドである、請求項１４に記載の使用。
前記メトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドの前記平均分子量が２０ｋＤである、請求項１５に記載の使用。
前記エンドスタチンが、Ｎ末端αアミンの部位でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって修飾されている、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
前記治療薬が、腫瘍細胞の増殖を阻害することができる抗体である、請求項８に記載の使用。
前記抗体が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗体である、請求項１８に記載の使用。
前記抗体が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の使用。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の前記モノクローナル抗体がセツキシマブである、請求項１８に記載の使用。
前記腫瘍が、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん、食道がん、鼻咽頭癌、悪性メラノーマ、骨がん、リンパ腫、乳がん、子宮頚がん、前立腺がん、血管腫、神経内分泌腫瘍、口腔がん、肉腫、腎がん、及び胆のうがんからなる群から選択される、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の使用。
脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の前記調節剤が、静脈注射、点滴静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、皮下包埋、経皮吸収、及び肝動脈注射からなる群から選択される非経口的な経路を介して投与される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の前記調節剤が、リポソームカプセル化の形態に調製される、請求項２３に記載の使用。
（ａ）請求項１０〜１７のいずれか一項に記載のエンドスタチン又は請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の抗体と、
（ｂ）請求項２〜５のいずれか一項に記載の脂質ラフト／カベオラ依存性エンドサイトーシス経路の阻害剤と
を含む医薬組成物。