JP2022545429A - がん治療のための化学療法剤とα－ラクトグロブリン－オレイン酸複合体との組合せ - Google Patents

がん治療のための化学療法剤とα－ラクトグロブリン－オレイン酸複合体との組合せ Download PDF

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Abstract

がん治療における使用のための第１の化学療法剤と第２の化学療法剤とを提供し、第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。がん治療における使用のための、他の化学療法剤と併せた使用のための、第１の化学療法剤又は第２の化学療法剤のいずれか、それに関する医薬組成物、及び処置の方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、がん治療における組合せの化学療法に使用するための化学療法剤に関する。組合せは、第１の化学療法剤と第２の化学療法剤とを含み、第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。また、本発明は、これに関する医薬組成物及び方法に関する。
がんは、極めて不均一で非常に複雑な疾患群を形成する。しかし、健康な組織よりも増殖して破壊すること、及び必須の生理的機能を狂わせることができるということを含む、多様ながんの種類に共通する特色は、簡潔に定義されている。腫瘍特異性が向上した標的のがん治療が開発されているが、他が効果を示さないとき、医師は、放射線、外科手術、又はがん細胞と健康な細胞とを同様に殺傷する毒性の高い物質の使用に頼ることになる。薬剤が十分に選択的でないので、患者は重篤な副作用を受け、「がんを処置する間に患者が亡くなってしまう」。
膀胱がんは、高再発率及び根治療法を欠くことから、米国において一般的で最もコストの高いがん形態である。有病率は約３４０万人であり、毎年４３万人の新規症例が診断され、約２０万人の死亡が例年起こると推定される。生存は再発率及び脱分化のリスクによって決まり、浸潤性腫瘍は膀胱摘除術及び全身性化学療法を必要とし得る。対照的に、表在性乳頭状腫瘍は粘膜に限られ、短期予後は良好である。カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、マイトマイシン、チオテパ、又はエピルビシンなどの局所処置により、多くの患者が長期の無病期間を得ているが、重篤な副作用を引き起こし得る（Ｍａｌｍｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．Ｕ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，４，１０５７－１０６７（２００４）；Ｓｃｈｅｎｋｍａｎ，Ｅ．＆Ｌａｍｍ，Ｄ．，ＳｃｉＷｏｒｌｄ Ｊ ４，３８７－３９９（２００４））。
より詳しくは、現行の膀胱がん治療の限界が、この患者群における高再発率、及びより悪性の浸潤性疾患への進行のリスクに反映されている。非筋肉型浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）における現行の標準処置は、膀胱腫瘍の経尿道切除術である。膀胱内化学療法は、一般に、切除後のアジュバント療法として使用され、低リスクのＮＭＩＢＣを有する患者の疾患進行ではなく再発を低下させることが示されている（Ｋａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７，４５４７９（２０１６）；Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ６９，２３１－２４４（２０１６））。カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）での膀胱内免疫療法は外科手術後に推奨されており、腫瘍再発を抑止するため膀胱内化学療法より優れている（Ｋａｍａｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８８，２７９６－２８１０（２０１６））。マイトマイシンＣは、新規診断の表在性膀胱がんの膀胱内化学療法に広く使用されており、腫瘍再発を低下させ、無病間隔を延長させる（Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍａｔｅｒ １，１６０１４（２０１６））。これらの治療は、重大な副作用及び重大な腫瘍再発リスクを伴う。腫瘍殺傷特性を高めた、毒性が少なく、より特異的な治療に対する、未だ対処されていない大きなニーズがある。
Ｍａｌｍｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．Ｕ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，４，１０５７－１０６７（２００４） Ｓｃｈｅｎｋｍａｎ，Ｅ．＆Ｌａｍｍ，Ｄ．，ＳｃｉＷｏｒｌｄ Ｊ ４，３８７－３９９（２００４） Ｋａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７，４５４７９（２０１６） Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ６９，２３１－２４４（２０１６） Ｋａｍａｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８８，２７９６－２８１０（２０１６） Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍａｔｅｒ １，１６０１４（２０１６）
本研究は、がん、特に膀胱がんに対して大きな治療効果を示す組合せの化学療法を提供する。
本発明は、がん処置のための２つの化学療法剤の使用に関する。これらの薬剤は、一般に組合せ療法における使用のためのものであり、つまり、これらは両方とも、処置経過において同じ対象に投与されるものである。これらは、個別の投与のため、又は同じ組成物におけるものとすることができる。これらの薬剤は、実質的に同時の投与のため、すなわち、同時又は同じ処置セッション時のものとすることができる。あるいは、これらは、同じ処置経過内だが別の時間における投与のためのものとすることができる。
特に、本発明は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体、又はそうした複合体を含む薬剤に関し、該生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなり、化学療法剤は他の化学療法剤と共に使用するためのものである。
発明者らは、２つの化学療法剤を組み合わせた効果が予期せぬ高い抗腫瘍活性をもたらすことを特定した。発明者らは、理論に縛られることなく、本発明における生物学的に活性の複合体と他の化学療法剤とを併せて投与するとき、腫瘍細胞における生物学的に活性の複合体の作用機序が、該他の化学療法剤の化学療法効果を、個別に使用するときのその化学療法剤の効果と比較して増強するように作用すると考える。また、理論に縛られることを望まないが、本発明における生物学的に活性の複合体が腫瘍膜完全性を破壊し、共に投与した化学療法剤の腫瘍細胞及び／若しくは腫瘍細胞核への取り込みを増大させることができる、並びに／又は、場合によってがんパスウェイに関与する分子の発現における生物学的に活性の複合体の効果を介して、他の化学療法剤の下流における効果に腫瘍細胞が抵抗する能力を低下させることができるとさらに考えられる。組合せのさらに重要な効果は、健康な細胞に対する腫瘍細胞を標的化する精度の向上である。
一態様において、本発明は、がん治療における使用のための第１の化学療法剤と第２の化学療法剤とを提供し、第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。
他の態様において、本発明は、がん治療における使用のための、第１の化学療法剤を提供し、これは、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含む第２の化学療法剤と併せて使用され、生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。
これにおいて、及び任意で他の態様において、第１の化学療法剤は、対象に投与するようにがん治療に使用するためのものであり、薬剤を投与する対象は、第２の化学療法剤の用量又は処置経過を得ている、又はこれを得る過程にある、又はこれを得る予定である。
さらなる態様において、本発明は、がん治療における使用のための第２の化学療法剤を提供し、これは第１の化学療法剤と併せて使用され、第２の化学療法剤は抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。
これにおいて、及び任意で他の態様において、第２の化学療法剤は、対象に投与するようにがん治療に使用するためのものであり、薬剤を投与する対象は、第１の化学療法剤の用量又は処置経過を得ている、これを得る過程にある、又はこれを得る予定である。
化学療法剤によって、がん治療、すなわちがんの処置及び／又は予防に使用される薬剤を指す。予防は、最初に発生するがんの予防、及びがん再発の予防を含むことができる。第１の化学療法剤及び第２の化学療法剤を言及することで、該化学療法剤が互いに異なることを意味する。第１の化学療法剤は、例えば、膀胱内化学療法剤、局所化学療法剤、及び／又はＤＮＡ相互作用化学療法剤とすることができる。ＤＮＡ相互作用化学療法剤は、ＤＮＡアルキル化、ＤＮＡクロスリンカー、及びＤＮＡインターカレーター化学療法剤を含む。
薬剤は、例えば同じ組成物の一部として、組み合わせの投与のためのものとすることができる。第１の化学療法剤と第２の化学療法剤とが、例えば１つ以上の共有結合によって、互いに化学結合できるということも可能だが、典型的に第１の化学療法剤と第２の化学療法剤とは、互いに化学結合しない。
一実施形態において、第１の化学療法剤は膀胱内化学療法剤である。膀胱内化学療法剤によって、膀胱がんの処置に使用される又は使用可能な化学療法剤を指す。膀胱内化学療法剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、カルメット・ゲラン桿菌、ベバシズマブ、カルボザンチニブ、セファレキシン、シプロフロキサシン、シスプラチン、ドキソルビシン塩酸塩、デュルバルマブ、エフロルニチン、エピルビシン、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フェンレチニド、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ラパチニブ、マイトマイシンＣ、ニボルマブ、パゾバニブ（ｐａｚｏｂａｎｉｂ）、ペムブロリズマブ、ラパマイシン、セレン、ソラフェニブ、チオテパ、ウロシジン（ｕｒｏｃｉｄｉｎ）、バルルビシン、及びビシニウムを含む。好ましい実施形態において、第１の化学療法剤は、チオテパ、マイトマイシンＣ、カルメット・ゲラン桿菌、又はエピルビシンからなる群より選択され、好ましくは、マイトマイシンＣ又はエピルビシンである。一実施形態において、これはマイトマイシンＣである。他の実施形態において、これはエピルビシンである。また、マイトマイシンＣは、アパジコンなどのプロドラッグの形態でも投与することができる。マイトマイシンは、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、及びマイトマイシンＣを含む天然生成物のファミリーである。マイトマイシンのうち、化学療法に使用されるのは典型的にマイトマイシンＣである。一般に、本明細書において使用するように「マイトマイシン」という用語は、該用語がマイトマイシン化合物のファミリーを指すように使用されていることが明確でない限り、特に図面及び実施例において、マイトマイシンの簡略表現である。
第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含む。一実施形態において、第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体からなる。「抗腫瘍活性」によって、増殖を止める、弱める、遅延する、又は腫瘍細胞における任意の他の有害な作用を示す複合体の能力を指す。抗腫瘍活性は、以下にさらに詳細に記載される技術を含む、数多くの確立されている技術のいずれかによって容易にスクリーニングすることができる。好ましくは、複合体は、ペプチド分子とオレイン酸又はオレイン酸塩分子との非共有結合性複合体である。
生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。数多くのそうした生物学的に活性の複合体が、これまでに同定されている（例えば、国際公開第２０１０／０７９３６２号、国際公開第２０１２／０５２３１０号、国際公開第２０１８／１１６１６５号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０６６４０９号を参照）。ペプチドは、自然宿主（例えば、酵母、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）における発現、組換え発現、又は化学合成などの任意の適切な供給源から取得することができる。ペプチドは、酵母、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等のペプチドの野生型ペプチド配列の配列を含む若しくは有することができる、又はそのフラグメント及び／若しくは変異体配列を含む若しくはそのフラグメント及び／若しくは変異体配列とすることができる。一実施形態において、ペプチド配列は、真核生物由来、好ましくは哺乳動物又は酵母由来のものである。好ましくは、哺乳動物由来のペプチドは、ヒト配列又はヒト配列のフラグメント及び／若しくは変異体である。好ましくは、酵母由来のペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ配列又はサッカロマイセス・セレビシエ配列のフラグメント及び／若しくは変異体である。
一実施形態において、生物学的に活性の複合体におけるペプチドは、膜摂動活性を有するタンパク質のものである（例えば国際公開第２０１８／１１６１６５号参照）。
生物学的に活性の複合体におけるペプチドは、複合体に存在するとき、非複合体のペプチドの１Ｈ ＮＭＲピークにおける対応する幅と比較した、複合体の少なくとも一部の１Ｈ ＮＭＲピークにおけるピーク幅の増加によって示すように、単独のペプチドと比較して、３次元構造における構造流動性が増加し得る。複合体の抗腫瘍活性における構造流動性のこの増加の有意性は、他で記載されている（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０６６４０９号参照）。まとめると、発明者らは、多様な配列を有するペプチドが、抗腫瘍特性をもたらす所定の構造特性を共有するオレートとの複合体を形成可能であることを特定した。これは、αヘリックス構造を有すること、オレイン酸又はオレートを結合できること、結合の際に３次元構造の構造流動性を増加させることを含む。３次元構造における流動性の増加のマーカーは、非複合体のペプチド（すなわちオレートとの複合体でないとき）の１Ｈ ＮＭＲピークにおける対応する幅と比較した、複合体の少なくとも一部の１Ｈ ＮＭＲピークにおけるピーク幅の増加である。一実施形態において、非複合体のペプチドの１Ｈ ＮＭＲピークにおける対応する幅と比較した、複合体の少なくとも１つの１Ｈ ＮＭＲピークにおけるピーク幅の増加が存在する。一実施形態において、ペプチドは少なくとも１つのトリプトファン残基を有し、複合体における少なくとも１つのトリプトファンインドールプロトンの１Ｈ ＮＭＲピークが、ペプチド単独の１Ｈ ＮＭＲピークにおける対応する幅と比較して、増加する。流動性の増加の他の指標は、ペプチド単独の対応する１Ｈ ＮＭＲピークと比較した、複合体の１Ｈ ＮＭＲにおける１Ｈ ＮＭＲピークの化学シフト分散の減少である。
生物学的に活性の複合体におけるペプチドはシステイン残基を有しないことが可能である。システイン残基は、典型的にペプチドの３次元立体構造に剛性をもたらすジスルフィド結合を形成することができる。システイン残基のないペプチドを有することで、このジスルフィド結合形成を防ぎ、これがペプチドの構造流動性の増加、及び生物学的に活性の複合体の形成及び抗腫瘍効果の向上を促す。
生物学的に活性の複合体におけるペプチドは、ペプチドフラグメントが生物学的に活性の複合体において抗腫瘍活性を示す限り、より長いタンパク質のフラグメントとすることができる。実施形態において、生物学的に活性の複合体におけるペプチドは、長さが５０個以下のアミノ酸である、すなわち、これは長さが最大５０個のアミノ酸を有する配列からなる。特に、これは、長さが４５、４０、又は３５個未満のアミノ酸とすることができる。これは、好ましくは、長さが少なくとも１０、１２、１５、２０、又は２５個のアミノ酸である。初期の研究では全長タンパク質を使用したが、近年の研究では、抗腫瘍効力がその適切なタンパク質フラグメント又は変異体の使用で得られるということが示されている。そうしたフラグメントのより短いアミノ酸鎖が、より簡単で迅速、且つより再現可能な製造プロセスを可能にし、これは、製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）に準拠する必要がある製造プロセスを考慮する際に特に重要となる。例として、そうしたペプチドは効率的に化学的合成することができる。
好ましい実施形態において、生物学的に活性の複合体におけるペプチドは、α－ラクトアルブミン又はＳＡＲ－１、又はその変異体若しくはフラグメント、好ましくはそのＮ末端フラグメントである。Ｎ末端フラグメントによって、一般に、野生型タンパク質のＮ末端アミノ酸を含むフラグメント（又はＮ末端アミノ酸のアミノ酸変異体）を指す。
ペプチドがα－ラクトアルブミンである生物学的に活性の複合体は、例えばＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞致死性ヒトα－ラクトアルブミン）の形態において、これまでに記載されており、α－ラクトアルブミン由来の数多くのペプチドも、それ自体で治療効果を有することが分かっている（例えば国際公開第２０１２／０６９８３６号参照）。全長α－ラクトアルブミン配列の例は、配列番号５及び６である。
ＫＱＦＴＫＣＥＬＳＱ ＬＬＫＤＩＤＧＹＧＧ ＩＡＬＰＥＬＩＣＴＭ ＦＨＴＳＧＹＤＴＱＡ ＩＶＥＮＮＥＳＴＥＹ ＧＬＦＱＩＳＮＫＬＷ ＣＫＳＳＱＶＰＱＳＲ ＮＩＣＤＩＳＣＤＫＦ ＬＤＤＤＩＴＤＤＩＭ ＣＡＫＫＩＬＤＩＫＧ ＩＤＹＷＬＡＨＫＡＬ ＣＴＥＫＬＥＱＷＬＣ ＥＫＬ（配列番号５）
ＫＱＦＴＫＡＥＬＳＱ ＬＬＫＤＩＤＧＹＧＧ ＩＡＬＰＥＬＩＡＴＭ ＦＨＴＳＧＹＤＴＱＡ ＩＶＥＮＮＥＳＴＥＹ ＧＬＦＱＩＳＮＫＬＷ ＡＫＳＳＱＶＰＱＳＲ ＮＩＡＤＩＳＡＤＫＦ ＬＤＤＤＩＴＤＤＩＭ ＡＡＫＫＩＬＤＩＫＧ ＩＤＹＷＬＡＨＫＡＬ ＡＴＥＫＬＥＱＷＬＡ ＥＫＬ（配列番号６）
ペプチドがＳＡＲ１又はそのフラグメントである生物学的に活性の複合体も、これまでに記載されている（例えば国際公開第２０１８／１１６１６５号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０６６４０９号参照）。好ましくは、ＳＡＲ１は酵母由来である、又は酵母配列の変異体又はフラグメントである。全長ＳＡＲ１配列の例は配列番号７である。
ＭＡＧＷＤＩＦＧＷＦ ＲＤＶＬＡＳＬＧＬＷ ＮＫＨＧＫＬＬＦＬＧ ＬＤＮＡＧＫＴＴＬＬ ＨＭＬＫＮＤＲＬＡＴ ＬＱＰＴＷＨＰＴＳＥ ＥＬＡＩＧＮＩＫＦＴ ＴＦＤＬＧＧＨＩＱＡ ＲＲＬＷＫＤＹＦＰＥ ＶＮＧＩＶＦＬＶＤＡ ＡＤＰＥＲＦＤＥＡＲ ＶＥＬＤＡＬＦＮＩＡ ＥＬＫＤＶＰＦＶＩＬ ＧＮＫＩＤＡＰＮＡＶ ＳＥＡＥＬＲＳＡＬＧ ＬＬＮＴＴＧＳＱＲＩ ＥＧＱＲＰＶＥＶＦＭ ＣＳＶＶＭＲＮＧＹＬ ＥＡＦＱＷＬＳＱＹＩ（配列番号７）
「変異体」という表現は、同様の生物学的機能を有するものの、アミノ酸配列が、該配列内の１つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸と置換しているという点で該アミノ酸配列が由来するベース配列とは異なるタンパク質又はポリペプチドを指す。アミノ酸置換は、アミノ酸がほぼ類似する特性を有する別のアミノ酸で置換されている、「保存的」なものとみなすことができる。非保存置換は、アミノ酸が別の種類のアミノ酸で置換されていることである。
「保存置換」によって、同じクラスの他のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味し、クラスを以下に定義する。
アミノ酸クラスの例
非極性 Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
極性無電荷 Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性 Ｄ、Ｅ
塩基性 Ｋ、Ｒ、Ｈ
当業者に周知であるように、ペプチドの一次構造を保存置換によって変えることが、そのペプチドの活性を著しく変えてしまうということはなく、これは、配列に挿入されるアミノ酸の側鎖が、置換されてなくなったアミノ酸の側鎖と同様の結合及びコンタクトを形成することができるためである。置換がペプチドの構造の決定に重要な領域であっても、そのようになる。
非保存置換がペプチドの機能を妨げないという条件で、これが可能である。概して、より少ない数の非保存置換が、ポリペプチドの生物学的活性を変えることなく、可能である。
任意の置換（及び、実際には任意のアミノ酸欠失又は挿入）の効果の判定は、全面的に、変異体ポリペプチドがベースタンパク質の基本特性及び活性を保持するかどうかを容易に判定することができる当業者の通常の能力内のことである。例えば、ポリペプチドの変異体が本発明の範囲に該当するかどうかを判定するとき、当業者は、該変異体を含む複合体が自然タンパク質の折り畳まれていない形態とともに形成された複合体の生物学的活性（例えば腫瘍細胞死）を保持するかどうかを判定すると考えられ、該ポリペプチドは、自然タンパク質に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の活性を有する。
ポリペプチドの変異体は、α－ラクトアルブミン又はＳＡＲ１などの自然タンパク質配列に対して、又はそうした自然タンパク質配列の活性フラグメントに対して、少なくとも約７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る又は実質的にそれからなり得る。
配列同一性のレベルは、ベース配列として自然タンパク質配列を用いて、ＢＬＡＳＴＰコンピュータープログラムを使用して、適切に決定される。これは、自然タンパク質配列が同一性パーセンテージを決定する配列を構成することを意味する。ＢＬＡＳＴソフトウェアは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにて一般に利用可能である（２００９年３月１２日においてアクセス可能）。
一実施形態において、変異体は、システイン残基を有しない変異体である。
ペプチドがフラグメントである場合、好適に、ペプチドは、長さが最大４０個のアミノ酸、例えば長さが最大３０個のアミノ酸、又は最大２５個のアミノ酸である。典型的に、ペプチドは、長さが１０～４０個のアミノ酸のものであり得、例えば、長さが１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９個のアミノ酸のものであり得る。一実施形態において、これは長さが１５個のアミノ酸である。他において、これは長さが２３個のアミノ酸であり、他において、長さが３９個のアミノ酸である。特に、ペプチドは、Ｎ末端αヘリックスドメインを有するタンパク質のＮ末端フラグメントとすることができる。
特に好ましい実施形態において、生物学的に活性の複合体におけるペプチドは、配列番号１～４のいずれか、又はその機能性変異体若しくはフラグメント、好ましくは配列番号１を含む又はそれからなる。
Figure 2022545429000001
好ましい実施形態において、生物学的に活性の複合体におけるペプチドは配列番号１からなる。
一実施形態において、生物学的に活性の複合体におけるペプチドは、長さが最大１９個のアミノ酸である配列番号１又は配列番号２のトランケート形態を含む。
一実施形態において、第１の薬剤はマイトマイシンＣであり、第２の薬剤は配列番号１である。
一実施形態において、第１の薬剤はマイトマイシンＣであり、第２の薬剤は配列番号２である。
一実施形態において、第１の薬剤はマイトマイシンＣであり、第２の薬剤は配列番号３である。
一実施形態において、第１の薬剤はマイトマイシンＣであり、第２の薬剤は配列番号４である。
一実施形態において、第１の薬剤はエピルビシンであり、第２の薬剤は配列番号１である。
一実施形態において、第１の薬剤はエピルビシンであり、第２の薬剤は配列番号２である。
一実施形態において、第１の薬剤はエピルビシンであり、第２の薬剤は配列番号３である。
一実施形態において、第１の薬剤はエピルビシンであり、第２の薬剤は配列番号４である。
化学療法剤の任意の組合せを表２に示す。表２に示す組合せは、第１の化学療法剤として、記載した薬剤の機能的同等物を含む。組合せは、第２の化学療法剤として、表１に示す配列を有するペプチドをさらに含む。可能な組合せは、示した配列を含むより長いペプチド、又は示した配列を有するペプチドの機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含む。
Figure 2022545429000002
Figure 2022545429000003
Figure 2022545429000004
Figure 2022545429000005
Figure 2022545429000006
一実施形態において、その使用は、癌腫、リンパ腫、又は脳腫瘍の処置又は予防、好ましくは胃腸管がん、粘膜がん、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、膠芽腫、及び皮膚乳頭腫の処置又は予防、より好ましくは膀胱がんの処置又は予防においてなされる。好ましくは、がんはヒトのがんである。一実施形態において、これは膀胱がんの処置である。一実施形態において、これは膀胱がんの予防である。
第１の化学療法剤は、第２の化学療法剤なしで投与するときの治療効果を生じさせるために必要とされる用量の半分未満の用量で投与される、又は投与するためのものであり得る。第１の化学療法剤は、体重において少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、若しくは１．２５ｍｇ／ｋｇ、又は体重において少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、若しくは１．２５μｇ／ｋｇの量で投与される、又は投与するためのものであり得る。特定の実施形態において、第１の化学療法剤は、体重において最大１０００、５００、１００、５０、１０、４、２、及び１．５ｍｇ／ｋｇ、又は体重において最大１０００、５００、５０、１０、４、２、若しくは１．５μｇ／ｋｇの量で投与される、又は投与するためのものであり得る。特定の実施形態において、第２の化学療法剤は、体重において少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、２、４、若しくは８ｍｇ／ｋｇ、又は体重において少なくとも０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、４０、若しくは４５μｇ／ｋｇの量で投与される、又は投与するためのものであり得る。第２の化学療法剤は、体重において最大５０００、１０００、５００、１００、５０、２５、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ、又は体重において最大１００００、５０００、１００、５００、７５、若しくは５０μｇ／ｋｇの量で投与される、又は投与するためのものであり得る。好ましくは、第１の化学療法剤は体重において０．５～２ｍｇ／ｋｇの範囲で投与し、及び／又は、第２の化学療法剤は体重において２５～７５ｍｇ／ｋｇの範囲で投与する。
第１の化学療法剤及び第２の化学療法剤は、一般に併せて投与する。第１の化学療法剤及び第２の化学療法剤は、組み合わせて、共に、又は順次投与することができる。これは、同じ組成物の一部として、別の組成物だが同時に、又は同じ処置プログラム若しくはレジームの一部として、これらが投与されるということを意味し得る。
他の態様において、本発明は、第１の化学療法剤と、第２の化学療法剤と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供し、第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。医薬組成物の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤は、本発明の任意の他の態様において記載する特徴のいずれもさらに含むことができる。
さらなる態様において、本発明は、治療における使用のための本発明の第４の態様における医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、がんを処置又は予防する方法を提供し、該方法は、処置又は予防を必要とする対象に、第２の化学療法剤と併せた第１の化学療法剤を投与することを含み、第２の化学療法剤は抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、生物学的に活性の複合体は、αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及びオレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる。がんを処置又は予防する方法における第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤は、本発明の第１、第２、及び第３の態様において上述する特徴のいずれもさらに含むことができる。
本発明のこの態様における組成物は、好適に、例えばクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、又は水性若しくは油性液剤若しくは懸濁剤として局所使用に適する形態の医薬組成物である。これは、一般に知られて、薬学的に許容される担体、充填剤、及び／又は補助剤を含むことができる。局所用液剤又はクリーム剤は、好適に、希釈剤又はクリーム基剤とともに乳化剤を含む。組成物は任意の経路で送達することができる。例えば、組成物を、特に消化管を標的とするため、経口で投与することができる。組成物を、特に粘膜表面を標的とするため、経局所で投与することができる。さらなる送達経路は、例えば静脈内又は筋肉内注入による、循環器系への投与を含む。膀胱を標的とする場合、組成物は、典型的に尿路カテーテルによって、膀胱内に投与することができる。
典型的に、本発明における生物学的に活性の複合体の調製は、他で記載されているように行うことができる（例えば国際公開第２０１８／１１６１５６号参照）。簡単に記載すると、例えば水溶液などの溶液内において、単に適切なペプチドとオレイン酸又はその塩を共に混合することで、調製を行うことができる。混合物に添加するオレート：ペプチドの比は、好適に、２０：１～３：１の範囲であり、例えば約５：１のオレート：ペプチドの比である。混合は、０～５０℃の温度、簡便に周囲温度及び圧力で行うことができる。この簡単な調製方法は、特にそうしたペプチドを複合体において使用する利点となる。この方法は、処置に必要とされるとき、その場所で行うことができる。したがって、投与直前に混合するためのペプチド及び塩を含むキットを提供することができる。
この明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲において、「含む」及び「含有」という用語、並びに例えば「含むこと」及び「含む」などのその用語の変形は、「含むが限定されない」ということを意味し、他の成分、構成物、又はステップを除外するものではない。さらに、文脈において要求されない限り単数形は複数形を含み、特に不定冠詞が使用される場合、文脈において要求されない限り、明細書は単数形と同じく複数形も考慮するとして理解される必要がある。
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関して記載されるようなものであってもよい。本願の範囲内において、前述の段落、特許請求の範囲、並びに／又は以下の詳細な説明及び図面に述べられる種々の態様、実施形態、実施例、及び他の態様、特にその個々の特徴が、独立的に又は任意の組合せにおいてなされ得るということを明確に意図する。すなわち、すべての実施形態及び／又は任意の実施形態の特徴は、そうした特徴が矛盾しない限り、任意の方法で、及び／又は任意の組合せで組み合わせられる。
ここで、本発明の１つ以上の実施形態を添付の図面に関して一例としてのみ記載する。
図１は、α１－オレートの用量依存的な治療効果を測定するためのマウス膀胱腫瘍モデルの模式図を示す。膀胱がんを、ＭＢ４９細胞（１００μｌのＰＢＳ中の２×１０５）の膀胱内滴下によってＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおいて誘発した。マウスを、３、５、７、９、及び１１日目においてα１－オレート（１．７ｍＭ、８．５ｍＭ、又は１７ｍＭ）の膀胱内滴下によって処置し、１２日目に絶命させた。偽処置のマウスにＰＢＳを与えた。 図２は、明らかな膀胱病変の肉眼による検査から推定した、α１－オレートの用量依存的効果を示す。 図３は、膀胱重量、膀胱サイズ、及び腫瘍面積の比較を示し、データは２つの実験の平均±標準誤差として示す（ｎ＝６＋５マウス、偽処置マウスと比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 図４は、腫瘍組織におけるα１－オレートの蓄積を示す。Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５６８標識α１－オレートを使用して、腫瘍保持マウスに負荷し、腫瘍組織において分子を追跡した。（Ａ）膀胱内Ａｌｅｘａ－α１－オレート負荷のスキームを示す。１１日目に膀胱内滴下を行い、組織を６時間後に採取した。（Ｂ）凍結組織切片の共焦点イメージングによる腫瘍保持マウスにおけるＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５６８標識α１－オレートの検出を示す。標識α１－オレートを負荷した健康なマウスをコントロールとして使用した。（Ｃ）（Ｂ）における蛍光強度の定量化を示す。５つのイメージ／用量の平均±標準誤差を示す。 図５は、腫瘍保持マウスにおける遺伝子発現の用量依存的変化を示す。（Ａ）ヒートマップは、処置マウスにおける調節遺伝子の数の用量依存的低下を示す。赤色（左）は、アップレギュレートされた遺伝子、青色（右）はダウンレギュレートされた遺伝子を示し、健康な膀胱と比較したカットオフ倍率変化＞２．０である。（Ｂ）がんパスウェイ遺伝子における分子機構の用量依存的低下を示す。（Ｃ）このパスウェイにおける個々の調節遺伝子を示す。（Ｄ）全膀胱組織におけるｍＲＮＡプロファイルの主成分分析を示す。用量を増加させたα１－オレートは、トランスクリプトームプロファイルを腫瘍保持の偽処置クラスターから、健康な膀胱組織クラスターへと変化させた。（Ｅ）腫瘍保持マウスと健康なマウスとの膀胱のトランスクリプトームプロファイルを比較するプローブの散布図を示す（信号強度値ｌｏｇ２）。（Ｆ）健康な膀胱と比較して偽処置マウス及びα１－オレート処置マウスにおいて有意に調節された遺伝子のベン図を示す。 図６は、マウス膀胱がんモデルの模式図を示す。膀胱がんを、ＭＢ４９細胞（１００μｌのＰＢＳ中の２×１０５）の膀胱内滴下によってＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおいて誘発した。マウスを、３、５、７、９、及び１１日目においてマイトマイシンＣ（２５μｇ、＊２５μｇはマウスの治療用量の半分であり、腹腔内の５０μｇは全身性毒性を生じる）又はα１－オレート（８．５ｍＭ）の膀胱内滴下によって処置し、１２日目に絶命させた。偽処置のマウスにＰＢＳを与えた。 図７は、図１のモデルにおけるマウスの絶命後の膀胱サイズ（及び肉眼での膀胱の外観における腫瘍サイズの任意の影響）を示し、マウスは、偽処置、８．５ｍＭのα１－オレート又は２５μｇのマイトマイシンで処置されており、健康なコントロールも示す（すべて同じ拡大率で示す）。 図８は、α１－オレート及びマイトマイシンＣの組合せの治療効果を検討するために改変した、図１の模式図を示す。 図９は、図３のモデルにおけるマウスの絶命後の膀胱サイズ（及び肉眼での膀胱の外観における腫瘍サイズの任意の影響）を示し、マウスは、偽処置、１．７ｍＭのα１－オレート、２５μｇのマイトマイシン、及び１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンで処置されている（すべて同じ拡大率で示す）。 図１０は、図４の１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシン研究における絶命後の膀胱サイズ（及び肉眼での膀胱の外観における腫瘍サイズの任意の影響）を、同じモデルだが、１７ｍＭのα１－オレートで処置したマウスの膀胱サイズ（及び肉眼での膀胱の外観における腫瘍サイズの任意の影響）と比較した研究を示す（すべて同じ拡大率で示す）。 図１１は、α１－オレート、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、及びそれら２つの組合せの治療効果を測定するためのマウス膀胱腫瘍モデルの模式図を示す。膀胱がんを、ＭＢ４９細胞（１００μｌのＰＢＳ中の２×１０５）の膀胱内滴下によってＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおいて誘発した。マウスを、３、５、７、９、及び１１日目においてα１－オレート（１．７ｍＭ）、ＭＭＣ（２５μｇ）、及びα１－オレート（１．７ｍＭ）とＭＭＣ（２５μｇ）の膀胱内滴下によって処置し、１２日目に絶命させた。偽処置のマウスにＰＢＳを与えた。 図１２は、明らかな膀胱病変の肉眼による検査から推定した、α１－オレート、ＭＭＣ、及びα１－オレートとＭＭＣの効果を示す。 図１３は、膀胱組織学的検査から推定した、α１－オレート、ＭＭＣ、及びα１－オレートとＭＭＣの効果を示す。 図１４は、α１－オレート、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、及びそれら２つの組合せの用量依存的治療効果を測定するためのマウス膀胱腫瘍モデルの模式図を示す。膀胱がんを、ＭＢ４９細胞（１００μｌのＰＢＳ中の２×１０５）の膀胱内滴下によってＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおいて誘発した。マウスを、３、５、７、９、及び１１日目においてα１－オレート（１．７ｍＭ及び８．５ｍＭ）、ＭＭＣ（２５μｇ）、及びα１－オレート（１．７ｍＭ及び８．５ｍＭ）とＭＭＣ（２５μｇ）の膀胱内滴下によって処置した。偽群を１２日目に絶命させ、処置群を４週又は８週に絶命させた。偽処置のマウスにＰＢＳを与えた。 図１５は、明らかな膀胱病変の肉眼による検査から推定した、α１－オレートの用量依存的効果、ＭＭＣの効果、及びα１－オレートとＭＭＣとの用量依存的効果を示す。 図１６は、膀胱組織学的検査から推定した、α１－オレートの用量依存的効果、ＭＭＣの効果、及びα１－オレートとＭＭＣとの用量依存的効果を示す。 図１７は、α１－オレート、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、エピルビシン（Ｅｐｉ）、α１－オレートとＭＭＣとの組合せ、及びα１－オレートとＥｐｉとの組合せの治療効果を測定するためのマウス膀胱腫瘍モデルの模式図を示す。膀胱がんを、ＭＢ４９細胞（１００μｌのＰＢＳ中の２×１０５）の膀胱内滴下によってＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおいて誘発した。マウスを、３、５、７、９、及び１１日目においてα１－オレート（１．７ｍＭ）、ＭＭＣ（２５μｇ）、Ｅｐｉ（２５μｇ）、α１－オレート（１．７ｍＭ）とＭＭＣ（２５μｇ）、及びα１－オレート（１．７ｍＭ）とＥｐｉ（２５μｇ）の膀胱内滴下によって処置し、１２日目に絶命させた。偽処置のマウスにＰＢＳを与えた。 図１８は、明らかな膀胱病変の肉眼による検査から推定した、α１－オレート、Ｅｐｉ、及びα１－オレートとＥｐｉの効果を示す。 図１９は、図１７に示すものと同様の模式図を示す。 図２０は、明らかな膀胱病変の肉眼による検査から推定した、α１－オレート、ＭＭＣ、Ｅｐｉ、α１－オレートとＭＭＣ、及びα１－オレートとＥｐｉの効果を示す。 図２１は、マウス膀胱がんモデルにおけるα１－オレートとマイトマイシンＣとの治療有効性を示す。 （ａ）処置モデルの模式図を示す。膀胱がんを、ＭＢ４９細胞（５０μｌのＰＢＳ中の２×１０５）の膀胱内滴下によってＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスにおいて誘発した。処置群に、３、５、７、９、及び１１日目に、単独のα１－オレート（１．７ｍＭ若しくは８．５ｍＭ）又はＭＭＣ（２５μｇ／ｍＬ）又はその組合せを与えた。偽処置のマウスにＰＢＳを与え、すべてのマウスを１２日目に絶命させた。（ｂ）膀胱の肉眼による検査から推定した処置の効果を示す。（ｃ、ｄ、ｅ）病理スコア、膀胱重量、膀胱サイズ、及び腫瘍面積を示す（図２０も参照）。データを、２つの実験の平均±標準誤差として示す（群につきｎ＝５＋６マウス、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析）。 図２２は、単独又は組合せのα１－オレート及びマイトマイシンＣによる腫瘍サイズの低下を示す。 腫瘍面積を、偽処置マウスと、単独の１．７ｍＭのα１－オレート又は２５μｇのＭＭＣ又はその組合せを与えたマウスとの間で比較した。（ａ）偽処置のマウスは膀胱内腔を満たす大きな腫瘍を示した（点線）。（ｂ～ｃ）α１－オレート（１．７ｍＭ）及びＭＭＣ処置マウスは腫瘍サイズの低下を示した。（ｄ）α１－オレート（１．７ｍＭ）とＭＭＣ（２５μｇ／ｍＬ）との組合せで処置したマウスにおける腫瘍サイズのさらなる低下を示す。（ｅ）ネガティブコントロールとして用いた健康な膀胱を示す。代表的なイメージを示す（群につきｎ＝５＋６マウス）。（群につきｎ＝５＋６マウス、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析）。腫瘍面積をＨ＆Ｅ染色した全膀胱切片において特定し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。 図２３は、マウス膀胱がんモデルにおけるα１－オレートとエピルビシンとの治療有効性を示す。 （ａ）処置モデルの模式図を示す。処置群に、３、５、７、９、及び１１日目に、膀胱内滴下によって単独のα１－オレート（α１－オレート１．７ｍＭ若しくは８．５ｍＭ）又はエピルビシン（２５μｇ／ｍＬ）又はその組合せを与えた。偽処置のマウスにＰＢＳを与え、すべてのマウスを１２日目に絶命させた。（ｂ）肉眼による検査によって定めた明らかな膀胱病変を示す。（ｃ、ｄ、ｅ）病理スコア、膀胱重量、膀胱サイズ、及び腫瘍面積を示す（図２２も参照）。データを、２つの実験の平均±標準誤差として示す（群につきｎ＝５＋５マウス、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析）。 図２４は、単独又は組合せのα１－オレート及びエピルビシン治療による腫瘍サイズの低下を示す。（ａ）偽処置のマウスは膀胱内腔を満たす大きな腫瘍を示した（点線）。（ｂ～ｃ）α１－オレート（１．７ｍＭ又は８．５ｍM）及びエピルビシン処置マウスは腫瘍サイズの低下を示した。（ｄ、ｅ）α１－オレート（１．７ｍＭ又は８．５ｍM）とエピルビシンとの組合せを与えたマウスにおける腫瘍サイズのさらなる低下を示す。腫瘍面積をＨ＆Ｅ染色した全膀胱切片において特定し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。 図２５は、α１－オレートとマイトマイシンＣとの組合せによる腫瘍再発の抑止を示す。 α１とマイトマイシンＣとの組合せは、長期間の防護効果を示し、腫瘍再発を４週間抑止した。（ａ）膀胱の肉眼による検査によって定めた単独又は組合せのα１－オレート及びＭＭＣの効果を示す（図１９ａの模式図も参照）。（ｃ、ｄ、ｅ）病理スコア、膀胱重量、膀胱サイズの低下を示す（ｐ＜０．００１、図６も参照）。データを、２つの実験の平均±標準誤差として示す（ｎ＝５＋５マウス）。 図２６は、α１－オレート又はマイトマイシンＣで処置したマウスの長期経過観察における腫瘍パラメーターを示す。 （ａ）病理スコア、膀胱サイズ、膀胱重量、及び腫瘍面積の定量化を示す。（ｂ～ｅ）腫瘍面積を、１．７ｍＭ及び８ｍＭのα１－オレート及び２５μｇのＭＭＣを与えたマウスの間で４週後に比較した。（ｂ、ｃ）単独のα１－オレート（１．７ｍＭ）及びＭＭＣ（２５μｇ）を与えたマウスにおける腫瘍再発のエビデンスを示す。（ｄ～ｅ）α１－オレート１．７ｍＭ又は８．５ｍＭとマイトマイシンＣとの組合せによる腫瘍再発の抑止を示す。腫瘍をＨ＆Ｅ染色した全膀胱切片において検出しなかった。代表的なイメージを示す（群につきｎ＝５＋５マウス）。 図２７は、α１－オレート又はエピルビシンで処置したマウスの長期経過観察における腫瘍パラメーターを示す。 （ａ）病理スコア、膀胱サイズ、膀胱重量、及び腫瘍面積の定量化を示す。（ｂ～ｅ）腫瘍面積を、１．７ｍＭ及び８ｍＭのα１－オレート及び２５μｇのエピルビシンを与えたマウスの間で4週後に比較した。（ｂ、ｃ）単独のα１－オレート（１．７ｍＭ）及びエピルビシン（２５μｇ）を与えたマウスにおける腫瘍再発のエビデンスを示す。（ｄ～ｅ）α１－オレート１．７ｍＭ又は８．５ｍＭとエピルビシンとの組合せによる腫瘍再発の抑止を示す。腫瘍をＨ＆Ｅ染色した全膀胱切片において検出しなかった。代表的なイメージを示す（群につきｎ＝５＋５マウス）。
本発明は、組合せ療法を用いて高い効力及び正確性で腫瘍細胞を標的とし殺傷する、新しい分子による解決手段を提供する。発明者らは、腫瘍細胞における、本発明の生物学的に活性の複合体の効果が、複合体の直接的な抗腫瘍特性のみよりも大きいということを示している。また、複合体により、腫瘍細胞が、他の化学療法剤の効果をより受けやすくなる。さらに、本発明における複合体が健康な細胞に影響すると認められず（実施例２参照）、さらなる化学療法剤の任意の効果増強が腫瘍細胞に限定されることを示唆するということがさらに留意される。この増強は、例えば、細胞壁の破壊によって（脂質二重層を直接破壊することによって、若しくはイオンチャネルを含む膜結合性タンパク質の破壊によってなど）、及び／又は、遺伝子発現、特にがんパスウェイの分子機構に関与する遺伝子の調節によって起こり得る（実施例３参照）。いずれの事象においても、本発明における複合体及び他の化学療法剤について収集したデータは、個々の使用（実施例４）と組合せの使用（実施例５）とを比較したとき治療効果における明らかな相乗的増強を示す。
実施例１－腫瘍保持マウスにおけるα１－オレートの用量漸増研究
マウスＭＢ４９膀胱がんモデルにおける用量漸増研究を行った（０日目に接種、図１）。処置群のマウスに、３、５、７、９、及び１１日目においてα１－オレートの５回の膀胱内滴下を行い、偽処置のマウスに、これらの時点においてＰＢＳ滴下を行った。偽処置のマウスは、腫瘍細胞を与えなかったコントロールと比較して、肉眼における膀胱の外観を変化させる触知可能な腫瘍を発症した。腫瘍は粘膜から急速に増殖し、腫留が徐々に膀胱内腔を満たして、機能的な膀胱組織を置き換えた。
処置マウスに、濃度を増加させたα１－オレートを投与した（１００μ中で１．７、８．５、又は１７ｍＭ、群につき５～６匹のマウス、用量につき２回の実験）。膀胱を１２日目に採取し、肉眼で評価し（図２）、膀胱サイズ、重量、及び腫瘍面積を記録した（図３）。１．７ｍＭのα１－オレートでの処置後、腫瘍増殖は抑えられ、膀胱重量、膀胱サイズ、及び腫瘍サイズが低下した（偽処置マウスと比較してＰ＜０．００１、図３）。膀胱重量、膀胱サイズ、及び腫瘍サイズにおける、さらなる用量依存的な低下を、８．５ｍＭのα１－オレートを与えたマウスにおいて記録し（Ｐ＜０．００１）、最も高い濃度において（１７ｍＭ）肉眼で観察可能な腫瘍組織は残っていなかった。これらのマウスにおける膀胱サイズ及び重量は、健康なコントロールマウスのものと違わなかった。
この結果は、腫瘍の大部分を除くまで化合物の用量が増加すると増大する治療有効性を有する殺腫瘍性複合体として、α１－オレートを同定するものである。
実施例２－腫瘍組織におけるα１－オレートの蓄積
α１－オレートが腫瘍組織に達しているかどうか検討するため、腫瘍保持マウスにＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５６８標識α１－オレートを接種した（１１日目、ｎ＝２）。膀胱を滴下の６時間後に採取して、凍結組織切片に共焦点イメージングを行った。Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ標識複合体は、用量依存的に腫瘍組織に蓄積することを示したが（１．７対８．５ｍＭ、８．５ｍＭ対１７ｍＭ）（図４Ａ～図４Ｃ）、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５６８のα１－オレートは、同じ手技を受けた健康なマウスにおいて検出されなかった（図４Ｂ及び図４Ｃ）。この結果を、抗α１抗体を使用して、α１－オレートで処置した腫瘍保持マウスのドットブロット分析によって確認した。腫瘍組織におけるα１－オレートの蓄積を、凍結組織切片の抗α１抗体による染色によって確認した。α１－オレートに曝露した健康なマウスの組織はネガティブであった。
実施例３－腫瘍保持マウスにおける遺伝子発現の用量依存的阻害
α１－オレートに対する腫瘍応答をさらに特徴づけるため、全膀胱ＲＮＡに、全ゲノムトランスクリプトームプロファイリングを行った。遺伝子発現を、偽処置群と、用量を増加させたα１－オレートを与えたマウスとの間で比較した。健康なマウスをコントロールとして用いた。
トランスクリプトームデータにより、偽処置マウスとα１－オレート処置マウスとの間で遺伝子発現における大きな違いが明らかになった。示差的に発現する遺伝子の数における用量依存的な減少を、処置マウスにおける腫瘍サイズの著しい低下と一致して、観察した（健康なものと比較した倍率変化、図５Ａのヒートマップ参照）。がんパスウェイにおける及び遺伝子を含む分子機構は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析（ＩＰＡ）によって示すように用量依存的に非活性化された（図５Ｂ及び図５Ｃ）。主成分分析（ＰＣＡ、図５Ｄ）によって、腫瘍を保持した偽処置マウスは、処置マウス及び健康なコントロールから明らかに離れた特定のトランスクリプトームプロファイルを構成した。ＰＣＡ１（７９．３％のばらつき）では、偽処置の膀胱と健康な膀胱との間の違いが支配した。用量が増加すると、処置マウスは、健康な発現プロファイルへと変化した。ＰＣＡ２（１４．９％のばらつき）では、未処置群をα１－オレート処置マウスと区別した。この結論を、プローブ信号強度の散布図分析（図５Ｅ）によって裏付け、健康なコントロールと処置マウスとの間において示差的に発現する転写物の数における用量依存的減少を明らかにし、またベン図でも示した（図５Ｆ）。
実施例４－α１－オレート及びマイトマイシンＣの個々の治療効果の検討
マウスＭＢ４９膀胱がんモデルに別の研究を行い、処置群のマウスに、３、５、７、９、及び１１日目において８．５ｍＭのα１－オレート又は２５μｇのマイトマイシンＣの５回の膀胱内滴下を行い、偽処置のマウスに、これらの時点においてＰＢＳ滴下を行った（図６）。
膀胱を１２日目に採取し、評価した（図７）。８．５ｍＭのα１－オレート又は２５μｍのマイトマイシンでの処置後、腫瘍増殖は同程度に抑えられ、偽処置マウスと比較して膀胱重量、膀胱サイズ、及び腫瘍サイズが低下した。
実施例５－α１－オレート及びマイトマイシンの組合せの治療効果の検討
先の研究の改変版を行い、処置群のマウスに、１．７ｍＭのα１－オレート、２５μｇのマイトマイシン、又は１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せの５回の膀胱内滴下を行い、偽処置のマウスに、これらの時点においてＰＢＳ滴下を行った（図８）。
この結果は、１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せによる処置が、１．７ｍＭのα１－オレート又は２５μｇのマイトマイシン単独のいずれかによる処置とは異なり、健康な膀胱と同等又はほぼ同等の膀胱を生じさせることを示す（図９）。さらに、図１０は、組合せによる処置が、１０倍の濃度のα１－オレート単独（すなわち、１７ｍＭのα１－オレート）と同等と認められる腫瘍における効果を生じさせることを示す。
実施例６－α１－オレート及びマイトマイシンの組合せの治療効果の検討
先の研究の改変版を行い、処置群のマウスに、１．７ｍＭのα１－オレート、２５μｇのマイトマイシン、又は１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せの５回の膀胱内滴下を行い、偽処置のマウスに、これらの時点においてＰＢＳ滴下を行った（図１１）。
この結果は、１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せによる処置が、１．７ｍＭのα１－オレート又は２５μｇのマイトマイシン単独のいずれかによる処置とは異なり、健康な膀胱と同等又はほぼ同等の膀胱を生じさせることを示す（図１２）。さらに、図１３は、組合せによる処置が、健康な膀胱に見受けられるものと同等又はほぼ同等の膀胱組織像を生じさせることを示す。
実施例７－α１－オレート及びマイトマイシンの組合せの治療効果の検討
先の研究の改変版を行い、処置群のマウスに、１．７ｍＭ若しくは８．５ｍＭのα１－オレート、２５μｇのマイトマイシン、又は１．７ｍＭ若しくは８．５ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せの５回の膀胱内滴下を行い、偽処置のマウスに、これらの時点においてＰＢＳ滴下を行った（図１４）。
この結果は、１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せによる処置が、１．７ｍＭのα１－オレート又は２５μｇのマイトマイシン単独のいずれかによる処置とは異なり、健康な膀胱と同等又はほぼ同等の膀胱を生じさせることを示す（図１５）。さらに、図１５は、組合せによる処置が、５倍の濃度のα１－オレート単独（すなわち、８．５ｍＭのα１－オレート）と同等と認められる腫瘍における効果を生じさせることを示す。図１６は、組合せによる処置が、健康な膀胱に見受けられるものと同等又はほぼ同等の膀胱組織像を生じさせることを示す。また、図１５及び図１６は、接種から４週及び８週の長期間にわたって、効果が維持されることを示す。
実施例８－α１－オレート及びマイトマイシン又はエピルビシンの組合せの治療効果の検討
先の研究の改変版を行い、処置群のマウスに、１．７ｍＭのα１－オレート、２５μｇのマイトマイシン、２５μｇのエピルビシン、１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せ、又は１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのエピルビシンの組合せの５回の膀胱内滴下を行い、偽処置のマウスに、これらの時点においてＰＢＳ滴下を行った（図１７）。
この結果は、１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのエピルビシンの組合せによる処置が、１．７ｍＭのα１－オレート、２５μｇのマイトマイシン又は２５μｇのエピルビシン単独のいずれかによる処置と異なり、１．７ｍＭのα１－オレート＋２５μｇのマイトマイシンの組合せにより処置したマウスからのもの、及び健康な膀胱と同等又はほぼ同等の膀胱を生じさせることを示す（図１８）。さらに、図１８は、α１－オレートとエピルビシンとの組合せによる処置が、５倍の濃度のα１－オレート単独（すなわち、８．５ｍＭのα１－オレート）と同等と認められる腫瘍における効果を生じさせることを示す。
材料及び方法
化学物質及び抗体
オレイン酸（Ｃｒｏｄａ、ロット番号：０００１１２０４３９）、ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＲＮＢＦ４２３９）、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５６８タンパク質標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１０２３８）、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ検出試薬（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＲＰＮ２１３２）、Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシグネチャーシリーズ ヘマトキシリン及びエオジン－Ｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号＃７２１１及び７１１１）、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ９５４２）、抗αラクトアルブミン（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カタログ番号ＭＢＳ１７５２７０）、モノクローナルマウス抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２２２８）、ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｐ０２６０）、ポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７４）、ウサギポリクローナル抗ＶＥＧＦ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ４６１５４）、マウスモノクローナル抗Ｋｉ－６７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５６００３）、ウサギモノクローナル抗サイクリンＤ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＳＣ８３９６）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ－１１０３４）、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ－１１００４）、ＤＲＡＱ５（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１０８４１０）。
ペプチド合成及び複合体作製
Ｆｍｏｃ固相化学反応を使用して（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）、α１を合成した。α１ストック濃度をＰＢＳ中で希釈して、ＰＢＳ中の５倍の濃度のオレイン酸と混合し、最終α１－オレート複合体を得た。α１配列は、Ａｃ－ＫＱＦＴＫＡＥＬＳＱ ＬＬＫＤＩＤＧＹＧＧ ＩＡＬＰＥＬＩＡＴＭ ＦＨＴＳＧＹＤＴＱ－ＯＨである。
膀胱がんモデル
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを、ルンド大学の臨床検査医学科において飼育し、７週～１２週齢で使用した。手技のため、マウスにケタミン（１００μｌのＮａＣｌ中で１．４８ｍｇ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）とキシラジン（１００μｌのＮａＣｌ中で０．２２ｍｇ、Ｖｅｔｍｅｄｉｃ）との混合物の腹腔内注射によって麻酔をかけた。０日目に、膀胱を空にして、０．６１ｍｍの外径の軟質ポリエチレンカテーテル（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ）を介した１００μｌのポリ－Ｌ－リジン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）の膀胱内滴下によってプレコンディショニングした。３０分後、ＭＢ４９マウス膀胱癌細胞（１００μｌのＰＢＳ中の２×１０５）を滴下した。３、５、７、９、及び１１日目に、１００μｌのα１－オレート（それぞれα１：１．７ｍＭ、８．５ｍＭ、若しくは１７ｍＭ、オレイン酸：８．５ｍＭ、４２．５ｍＭ、若しくは８５ｍＭ）又はＰＢＳ（偽処置コントロール）を滴下した。マウスは、ペプチド－オレート複合体への腫瘍曝露を延長するため、カテーテルを適所につけた状態で予熱したブロック上で麻酔下に保った（約１時間）。各処置及びコントロールにおける５～６匹のマウス群を１２日後に絶命させ、膀胱をイメージングし、組織学的検査のため処理した。２つの独立実験を行った。
統計分析
結果を平均±標準誤差として示し、群を一元配置ＡＮＯＶＡによって比較する。Ｐ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、スチューデントのｔ検定及び一元配置分散分析、その後のボンフェローニのポストホック検定によって計算した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると認めた。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
実施例９－組合せ療法のさらなる検討
材料及び方法
化学物質及び抗体
オレイン酸（Ｃｒｏｄａ、ロット番号：０００１１２０４３９）、ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＲＮＢＦ４２３９）、Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシグネチャーシリーズ ヘマトキシリン及びエオジン－Ｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号＃７２１１及び７１１１）、エピルビシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ９４０６）及びマイトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ０４４０）。
ペプチド合成及び複合体作製
αラクトアルブミンのＮ末端のαヘリックスドメインを殺腫瘍性成分として同定し、これはオレイン酸と複合体を形成する（Ｈｏ Ｊ，Ｒｙｄｓｔｒｏｍ Ａ，Ｍａｎｉｍｅｋａｌａｉ ＭＳＳ，Ｓｖａｎｂｏｒｇ Ｃ，Ｇｒｕｅｂｅｒ Ｇ．Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＡＭＬＥＴ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ａｌｐｈａ－ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２；７： ｅ５３０５１）。この研究のため、９５％を超える純度でＦｍｏｃ固相化学反応を使用して、３９個のアミノ酸ペプチド（ａａ１－３９、Ａｃ－ＫＱＦＴＫＡＥＬＳＱＬＬＫＤＩＤＧＹＧＧＩＡＬＰＥＬＩＡＴＭＦＨＴＳＧＹＤＴＱ－ＯＨ）を合成した（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｇｒｏｕｐ、Ｆｒａｎｃｅ）。α１－オレート複合体を形成するため、α１ペプチドをオレイン酸ナトリウムと１：５のモル比で混合した。原液を、各実験のため適切な濃度になるようにＰＢＳ中でさらに希釈した。
膀胱がんモデル
ＭＢ４９（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿７０７６）細胞を、瑞国ウプサラ大学のＳａｒａ Ｍａｎｇｓｂｏより取得した。ＭＢ４９膀胱がんを、これまでに記載されたように形成させた（Ｍｏｓｓｂｅｒｇ Ａ－Ｋ，Ｈｏｕ Ｙ，Ｓｖｅｎｓｓｏｎ Ｍ，Ｈｏｌｍｑｖｉｓｔ Ｂ，Ｓｖａｎｂｏｒｇ Ｃ．ＨＡＭＬＥＴ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｅｌａｙｓ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｕｒｏｌｏｇｙ ２０１０；１８３： １５９０－７）。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを、ルンド大学の臨床検査医学科において飼育し、７週～１２週齢で使用した。手技のため、マウスにケタミン（１００μｌの０．９％ＮａＣｌ溶液中で１．４８ｍｇ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）とキシラジン（１００μｌの０．９％ＮａＣｌ溶液中で０．２２ｍｇ、Ｖｅｔｍｅｄｉｃ）との混合物の腹腔内注射によって麻酔をかけた。０日目に、膀胱を空にして、０．６１ｍｍの外径の軟質ポリエチレンカテーテル（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ）を介した１００μｌのポリ－Ｌ－リジン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）の膀胱内滴下によってプレコンディショニングした。３０分後、ＭＢ４９マウス膀胱癌細胞（５０μｌ培地中の２×１０５細胞）を滴下した。３、５、７、９、及び１１日目に、マウスを、α１－オレート（１．７ｍＭ若しくは８．５ｍＭ）、化学療法剤（ＭＭＣ２５μｇ、エピルビシン２５μｇ）、α１－オレートと化学療法剤との組合せ、又はＰＢＳ偽処置群に、無作為に割り当てて、滴下した。カテーテルを約１分間適所に残したが、マウスが麻酔下に保たれていたので、物質がなくなるまでの時間（滞留時間）を２～３時間とした。各処置及びコントロールにおける５～６匹のマウス群を１２日後に絶命させた。経過観察の５～８匹のマウス群を４週及び８週で絶命させた。膀胱をイメージングして、組織学的検査又はＲＮＡ抽出のため処理した。２つの独立実験を各条件で行った。すべての実験はマイコプラズマを含まない細胞で行った。
組織学的検査
膀胱をＯＣＴコンパウンド（ＶＷＲ）に包埋し、連続する５μｍの切片を各膀胱の中心から採取し、正荷電の顕微鏡スライドに配置した（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色のため、、Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシグネチャーシリーズのヘマトキシリン７２１１、その後対比染色のためエオジン－Ｙ７１１１を使用した。ＡＸ１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して、イメージを取得した。腫瘍面積分析のため、ＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、腫瘍外周を測定した。
遺伝子発現分析
液体窒素を使用して、凍結膀胱組織を微粉砕した。（Ｔｒａｎ Ｔ． Ｈｉｅｎ１，Ａｍｂｉｔｅ，Ｉ．，Ｌａｍ Ｙｉｍ Ｗａｎ，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｄ．，Ｔｒａｎ Ｔ． Ｈｉｅｐ，Ｈｏｅｇｌｕｎｄ，Ｕ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ． ａｎｄ Ｓｖａｎｂｏｒｇ，Ｃ． Ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ － Ａ ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ｏｌｅａｔｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．ｉｎ ｐｒｅｓｓ）全ＲＮＡを抽出した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。ＧｅｎｅＣｈｉｐ ３´ＩＶＴ Ｅｘｐｒｅｓｓキットを使用して、１００ｎｇの全ＲＮＡを増幅させてから、フラグメント化した。次に、標識したａＲＮＡを、マウスゲノム４３０ＰＭアレイストリップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に４５℃で１６時間ハイブリダイゼーションし、洗浄、染色して（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してスキャンした。すべての試料は、アレイストリップに含まれる内部品質管理をクリアした（信号対ノイズ比による信号強度、ハイブリダイゼーション及び標識管理、ＧＡＰＤＨ信号及び３’－５’比＜３による試料品質）。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェア（ｖ．４．０．１．３６、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において実行したロバストマルチ平均法を使用して、トランスクリプトームデータをノーマライズした。腫瘍保持膀胱又は処置した健康な膀胱を未処置の健康な膀胱のコントロール組織と比較することで、倍率変化を計算した。相対発現レベルを分析し、絶対倍率変化＞２．０の遺伝子を示差的に発現すると認めた。Ｇｉｔｏｏｌｓ２．１．１ソフトウェア使用して、ヒートマップを構成した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析（ＩＰＡ、Ｑｉａｇｅｎ）ソフトウェアを使用して、示差的に発現する遺伝子を機能的に特徴づけた。
統計分析
結果を平均±標準誤差として示した。Ｐ値を、Ｐｒｉｓｍバージョン７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、スチューデントのｔ検定又は一元配置ＡＮＯＶＡ、その後のボンフェローニのポストホック検定によって計算した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると認めた。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
結果
α１－オレート及びマイトマイシンでの組合せ療法の効果
α１－オレートとマイトマイシンＣとの効果をマウスＭＢ４９膀胱がんモデルにおいて検討した（研究の設計について、図１９Ａ参照）。膀胱がんを、ＭＢ４９細胞の膀胱内滴下によって形成させ、処置を３日目に開始した。処置群に、α１－オレート（１．７ｍＭ若しくは８．５ｍＭ）、ＭＭＣ（０．１ｍＬ、２５μｇ／ｄｏｓｅ）、又はα１－オレート（１．７ｍＭ若しくは８．５ｍＭ）とＭＭＣ（０．１ｍＬ、２５μｇ／ｄｏｓｅ）との組合せを与えた。３、５、７、９、及び１１日目において滴下を行い、偽処置のマウスにＰＢＳを与えた。膀胱を、１２日目の絶命時に採取し、腫瘍形成を、膀胱重量、膀胱サイズ、腫瘍サイズ、及び病理スコアとして定量化した（図２１ｃ～図２１ｆ）。腫瘍面積を、Ｈ＆Ｅ染色した全膀胱組織切片において定量化した（図２２）。
偽処置のマウスは、１２日後に、膀胱内腔を満たす大きな腫瘍を発症した（１２／１２マウス、図２１ｂ）。α１－オレート及びマイトマイシンＣの治療有効性を偽処置群に対して示した。腫瘍進行は、用量依存的にα１－オレート単独（ｐ＜０．０１、図１９ｃ～図１９ｆ）によって、及びマイトマイシンＣ単独（０．１ｍＬ、２５μｇ／ｄｏｓｅ）によって遅延した（図２１及び図２２）。
マイトマイシンとα１－オレートとを組み合わせた効果を、まず、マウスにα１－オレート（１．７又は８．５μＭ）を接種することで検討した。２時間後、マウスにマイトマイシンの第２の接種を行い（図２１ａ参照）、この手技を３、５、７、９、及び１１日目において１日に１回繰り返し、その後１２日目に絶命させた。強力な相乗作用を、化学療法剤とα１－オレートとの間で検出した（図２１ｂ）。治療効果は、α１－オレートとマイトマイシンＣとの組合せを与えたマウスにおいて（ｐ＝０．０３）、より多い用量のα１－オレート（８．５ｍＭ）を与えたマウスにおいて最も顕著に、さらに高まった。腫瘍組織は、目視検査で、絶命時に処置マウスにおいて検出されず、膀胱重量及び膀胱サイズは、コントロールマウスの健康な膀胱のものとは異ならなかった（ｐ＝０．９９、図２１ｃ及び図２１ｅ）。腫瘍面積の減少を、Ｈ＆Ｅ染色後の顕微鏡観察によって確認した。処置群のいずれにおいても腫瘍を検出しなかった（ｐ＜０．００１）（図２０）。８．５ｍＭの用量におけるα１－オレートが効果的であるので、ＭＭＣ組合せ療法の治療効果のさらなる増大を１２日目に検出しなかった（ｐ＝０．９９）。
α１－オレート及びエピルビシンでの組合せ療法の効果
エピルビシンの作用機序は、マイトマイシンのものと類似し、ＤＮＡインターカレーションに影響を与え、細胞増殖を抑止する。また、この２つの化合物は同様の毒性プロファイルを示す。したがって、以降の実験は、α１－オレート及びエピルビシンの単独及び組合せの治療有効性を扱った（図２３ａ）。エピルビシンとα１－オレートとを組み合わせた効果を、まず、マウスにα１－オレート（１．７又は８．５μＭ）を接種することで検討した。２時間後、マウスにエピルビシンの第２の接種を行い（図２３ａ参照）、この手技を３、５、７、９、及び１１日目において１日に１回繰り返し、その後１２日目に絶命させた。
腫瘍形成は、膀胱重量、膀胱サイズ、腫瘍サイズ、及び病理スコアによって定められるように、エピルビシンによって遅延した（偽処置コントロールと比較してｐ＜０．００１）（図２２ｃ～図２２ｆ）。腫瘍面積の減少を、全膀胱組織切片のＨ＆Ｅ染色によって確認した。エピルビシン単独の治療効果は、α１－オレートのものと同等であった（１．７ｍＭ、ｐ＝０．９７）。より多い用量（８．５ｍＭ）において、α１－オレートがより効果的であった（図２４、ｐ＝０．００４）。
強力な相乗作用を、エピルビシンとα１－オレートの間で検出した。腫瘍組織は、目視検査で、絶命時に処置マウスにおいて検出されず、膀胱重量及び膀胱サイズは、コントロールマウスの健康な膀胱のものとは異ならなかった（図２３ｃ～図２３ｅ及び図２１ｃ～図２１ｅ）。腫瘍面積の減少をＨ＆Ｅ染色によって確認し、腫瘍組織を検出しなかった（図２４）。８．５ｍＭの用量は、スタンドアロン治療として１．７ｍＭよりも効果的であるが（ｐ＝０．００１）、１２日後に、ＭＭＣ組合せ療法の治療効果を有意に増大させなかった（ｐ＝０．６２）。
この結果は、α１－オレート処置が腫瘍形成を抑止するところまで化学療法剤のマイトマイシン及びエピルビシンの効果を高めるということを示唆する。
長期経過観察
治療効果の持続期間を、全部で４週間マウスを追跡することで評価した（図２８）。偽処置群は、腫瘍の急速な増殖のため、絶命させたときの１２日を超えて追跡しなかった。しかしながら、処置群において長期間の防護を観察した。４週後、低用量のα１－オレート（１．７ｍＭ）、ＭＭＣ又はエピルビシンを与えたマウスは腫瘍増殖の増加を示した。しかしながら、組合せ療法群では、マウスは腫瘍再発のエビデンスなく防護を保った（図２５及び図２６）。低用量のα１－オレート（１．７ｍＭ）とＭＭＣ又はエピルビシン（２５μｇ／ｄｏｓｅ）とを組み合わせた効果は、ＭＭＣ又はエピルビシン単独のものより強力であった（ＭＭＣ又はエピルビシンと比較してｐ＜０．００１）が、より多い用量のα１－オレート（８．５μＭ）と同等であり、有意差を示さなかった。８．５ｍＭのα１－オレートとエピルビシンとの組合せで処置したマウスにおいて、さらなる防護が観察された（図２７）。

Claims (19)

  1. 組合せがん治療における使用のための第１の化学療法剤及び第２の化学療法剤であって、前記第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、前記生物学的に活性の複合体は、
    αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及び
    オレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる、第１の化学療法剤及び第２の化学療法剤。
  2. がんの処置における使用のための第１の化学療法剤であって、前記第１の化学療法剤は、第２の化学療法剤を投与するとされる、又は投与した、又は投与している対象に投与するためのものであり、前記第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、前記生物学的に活性の複合体は、
    αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及び
    オレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる、第１の化学療法剤。
  3. がんの処置における使用のための第２の化学療法剤であって、前記第２の化学療法剤は、第１の化学療法剤を投与するとされる、又は投与した、又は投与している対象に投与するためのものであり、前記第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、前記生物学的に活性の複合体は、
    αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及び
    オレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる、第２の化学療法剤。
  4. 前記第１の化学療法剤は、膀胱内化学療法剤、局所化学療法剤、ＤＮＡ相互作用化学療法剤、ＤＮＡアルキル化化学療法剤、及び／又はＤＮＡクロスリンカー化学療法剤である、請求項１～３のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  5. 前記第１の化学療法剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、カルメット・ゲラン桿菌、ベバシズマブ、カルボザンチニブ、セファレキシン、シプロフロキサシン、シスプラチン、ドキソルビシン塩酸塩、デュルバルマブ、エフロルニチン、エピルビシン、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フェンレチニド、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ラパチニブ、マイトマイシンＣ、ニボルマブ、パゾバニブ（ｐａｚｏｂａｎｉｂ）、ペムブロリズマブ、ラパマイシン、セレン、ソラフェニブ、チオテパ、ウロシジン（ｕｒｏｃｉｄｉｎ）、バルルビシン、及びビシニウム、好ましくは、チオテパ、マイトマイシンＣ、カルメット・ゲラン桿菌、又はエピルビシン、より好ましくはマイトマイシンＣ又はエピルビシンからなる群より選択される、請求項１～４のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  6. 前記生物学的に活性の複合体における前記ペプチドは、膜摂動活性を有するタンパク質のものである、請求項１～５のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  7. 前記生物学的に活性の複合体における前記ペプチドは、前記複合体に存在するとき、非複合体のペプチドの１Ｈ ＮＭＲピークにおける対応する幅と比較した、前記複合体の少なくとも一部の１Ｈ ＮＭＲピークにおけるピーク幅の増加によって示すように、前記非複合体のペプチドと比較して、３次元構造における構造流動性が増加する、請求項１～６のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  8. 前記生物学的に活性の複合体における前記ペプチドは、システイン残基を有しない、請求項１～７のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  9. 前記生物学的に活性の複合体における前記ペプチドは、長さが最大５０個のアミノ酸からなる、請求項１～８のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  10. 前記生物学的に活性の複合体における前記ペプチドは、α－ラクトアルブミン又はＳＡＲ－１、又はその変異体若しくはフラグメント、好ましくはそのＮ末端フラグメントである、請求項１～９のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  11. 前記生物学的に活性の複合体における前記ペプチドは、配列番号１～４のいずれか、又はその変異体若しくはフラグメントを含む又はそれからなる、請求項１～１０のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤：
    ＫＱＦＴＫＡＥＬＳＱ ＬＬＫＤＩＤＧＹＧＧ ＩＡＬＰＥＬＩＡＴＭ ＦＨＴＳＧＹＤＴＱ（配列番号１）
    ＭＡＧＷＤＩＦＧＷＦ ＲＤＶＬＡＳＬＧＬＷ ＮＫＨ（配列番号２）
    ＫＱＦＴＫＡＥＬＳＱ ＬＬＫＤＩ（配列番号３）
    ＭＡＧＷＤＩＦＧＷＦ ＲＤＶＬＡ（配列番号４）。
  12. 前記生物学的に活性の複合体における前記ペプチドは、配列番号１～４のいずれか、好ましくは配列番号１からなる、請求項１～１１のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  13. 前記使用は、癌腫、リンパ腫、又は脳腫瘍の処置又は予防、好ましくは胃腸管がん、粘膜がん、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、膠芽腫、及び皮膚乳頭腫の処置又は予防、より好ましくは膀胱がんの処置又は予防である、請求項１～１２のいずれかに記載の第１の化学療法剤及び／又は第２の化学療法剤。
  14. 第１の化学療法剤、第２の化学療法剤、並びに薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又はアジュバントを含む医薬組成物であって、前記第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、前記生物学的に活性の複合体は、
    αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及び
    オレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる、医薬組成物。
  15. がん治療における使用のための、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記第１の化学療法剤は、マイトマイシン、好ましくはマイトマイシンＣである、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記第１の化学療法剤は、エピルビシンである、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
  18. 前記第２の化学療法剤は、抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、前記生物学的に活性の複合体は、
    以下のペプチド配列を有する又は含むペプチド、及び
    ＫＱＦＴＫＡＥＬＳＱ ＬＬＫＤＩＤＧＹＧＧ ＩＡＬＰＥＬＩＡＴＭ ＦＨＴＳＧＹＤＴＱ
    オレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる、請求項１４～１７のいずれかに記載の医薬組成物。
  19. がんを処置又は予防する方法であって、処置又は予防を必要とする対象に、第２の化学療法剤と併せた第１の化学療法剤を投与することを含み、前記第２の化学療法剤は抗腫瘍活性を有する生物学的に活性の複合体を含み、前記生物学的に活性の複合体は、
    αヘリックス構造を含む少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド、及び
    オレイン酸又はオレイン酸塩から、ペプチド分子につき少なくとも３つのオレイン酸又はオレイン酸塩分子の比でなる、方法。
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