JP2021506943A

JP2021506943A - 乳房障害の治療の乳管内送達方法

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Publication number: JP2021506943A
Application number: JP2020534923A
Authority: JP
Inventors: スティーヴン・シー・クエイ
Original assignee: アトッサ・セラピューティクス・インコーポレイテッド
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2021-02-22
Also published as: AU2018392692A1; SG11202005944VA; RU2020124144A3; KR20200103764A; WO2019126538A1; US20210000920A1; EP3727403A1; RU2020124144A; CA3086655A1; MX2020006654A; IL275543A; EP3727403A4; CN111936152A

Abstract

本発明は、乳房障害を有する対象を治療するための乳管内送達方法及び組成物に関する。組成物は、腫瘍微小環境において、M2マクロファージをM1マクロファージに再分極化させ、M2マクロファージを減少させ、M1マクロファージを増加させ、及び/又は対象における化学療法に対する感受性を増加させることができる、再分極化剤及び分極化遮断剤を含む。

Description

関連出願の相互参照

この出願は、2017年12月22日に提出された米国出願第62/609665号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

乳がんは、ヒトのがん死亡原因の第2位である。乳がんの診断と治療の進歩にも関わらず、この病気の有病率は1940年以来、毎年約1%の割合で着実に増加している。今日、北米に住む女性が生涯に乳がんを発症する可能性は8分の1である。予後を大幅に改善した最近の早期診断と治療の進歩にもかかわらず、化学療法や転移に対する腫瘍の抵抗性は依然として死亡率の重要な原因となっている。

敵対的な腫瘍微小環境(TME)の存在は、投与された薬物の標的細胞へのアクセス不良と腫瘍エスケープをもたらした。TMEには、高組織圧、低酸素、栄養飢餓(例えば、グルコース及び他の代謝物の減少による)、乳酸生成の増加及びその結果生じるアシドーシス、調節性CD4+T細胞(T-regs)、骨髄由来抑制細胞(MDSC)及び腫瘍関連マクロファージ(TAM)の浸潤の増加、免疫抑制性サイトカイン(IL-10やTGF-β等)の存在、活性化されたT細胞(CTLA4やPD-1等)によって発現される免疫抑制性受容体を標的としたリガンドの発現、及びT細胞増殖の抑制等の条件が含まれ、腫瘍が免疫認識から身を守り、寛容性を維持し、排除を回避することを可能にする免疫抑制性の微小環境を作り出すのに役立つ。

腫瘍微小環境(TME)は、腫瘍の進行とともに進展し、転移の拡大を促進する複合構造である。固形腫瘍において、腫瘍塊の5%〜40%がTAMからなる。TAMは、CSF-1及びCCL-2(MCP-1)によって動員された腫瘍微小環境で最も豊富な免疫抑制細胞集団に相当し得る(Sicaら、2006、 Eur J Cancer.、42、717〜727頁)。

乳房に常駐するマクロファージは、組織損傷のセンサーとして機能するために重要であり、組織の恒常性及び免疫を維持する。マクロファージは、炎症の重要なメディエーターであり、乳腺発生過程の重要な調節因子である。炎症促進性因子と抗炎症性因子間のバランスは、TME内のマクロファージ機能の調節の鍵である。炎症と腫瘍発生の間、循環している単球は、炎症部位とTMEに動員され、特定のサイトカインと成長因子の存在によって決まるマクロファージ表現型をとる。腫瘍微小環境に動員されると、マクロファージはTME内の大量の刺激に応答し、さまざまなサブセットに分化(分極化)する。ヒトにおいて、マクロファージの分極化は古典的に活性化された殺菌及び炎症誘発性M1マクロファージから、代替的に活性化された抗炎症性及び免疫抑制性M2マクロファージまでの両極端にわたる連続体である。

M1マクロファージは、インターフェロンガンマ(IFNγ)又はリポ多糖(LPS)刺激によって分極化され、IL-6、IL-12、活性酸素種(ROS)、反応性窒素(RN)、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)等の炎症促進性サイトカインを分泌する。ヒトM1マクロファージの確証された細胞表面マーカーには、高レベルのCD14、C16、CD64、CD86、及びHLA-DRαが含まれる。M1マクロファージは一般に、病原体と細胞を排除するように働く。

対照的に、M2マクロファージは、一般に抗炎症性サイトカインを産生し、組織再構築と修復、血管新生、免疫抑制、及び調節性T細胞の動員に関与している。M2マクロファージは、更にM2a、M2b、M2cマクロファージに分けられる。M2aマクロファージは、IL-4又はIL-13刺激から生じ、マトリックス再構築サイトカインを放出する。CD200R及びCD86の発現上昇は、M2aマクロファージの確証された細胞表面マーカーである。M2bマクロファージは、IL-1β又はLPS刺激と組み合わせた免疫複合体の認識から生じ、M2aマクロファージと同様に、創傷治癒に関与している。免疫抑制M2cマクロファージは、IL-10、TGFβ、グルココルチコイド、又は免疫複合体が豊富な環境の結果である。M2cマクロファージは、更にIL-10等の免疫抑制性サイトカインや、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えばMMP-9)等のマトリックス再構築因子を生成する。CD163発現の上昇は、M2c分極化の確証されたマーカーである。

TAM表現型には、TAMのトランスクリプトーム研究に基づいてM1及びM2表現型に通常割り当てられるマーカーの組み合わせが含まれると考えられている(J. Xue、S.V. Schmidt、J. Sanderら、Immunity、40巻、2号、274〜288頁、2014年)。しかしながら、TAMは通常、腫瘍由来の乳酸又はTME内の異なる細胞若しくはTMEにおける機能に基づいたB細胞由来の免疫グロブリンからのIL-4、IL-10、IL-13等の免疫抑制性サイトカインの分泌によって引き起こされるM2様分極化状態に関連している(Bradyら、Mediators of Inflammation、2016巻(2016)、Article ID 4549676)。

一般に抗炎症性、免疫抑制性及び腫瘍形成性であるにもかかわらず、免疫応答を活性化することによりTAMを殺腫瘍性にし腫瘍成長を抑制する試みが行われている(Wynnら、Nature 2013年、496:445〜455頁)。乳がんのマクロファージのCD8 +細胞に対する比率が低いと生存が予測され、これは、腫瘍に対するT細胞活性の抑制におけるマクロファージの主要な役割を示唆している(Ruffell、B.ら、P.N.A.S. USA、2012;109、2796〜2801頁)。CD8+やメモリーT細胞等の特定の白血球細胞サブセットによる腫瘍の浸潤は、さまざまながんの好ましい予後に関連しており、免疫関与が、がんの成長と拡大を制限し得ることを示唆している(Noy R、Pollard JW、Immunity、2014; 41:49〜61頁)。抗PD-1等のチェックポイント阻害剤を使用した腫瘍におけるT細胞活性の増強は、黒色腫及び肺がんを治療する臨床試験である程度成功していることが見出されている。

M1活性化マクロファージへのTAMの再分極化によるTAMのリプログラミングやエデュケーティングは、例えば、全身送達された抗体を媒介としたCD40、Il-12サイトカイン等の共刺激により研究されている(Casetta L、Pollard JW.、Cell Research (2017) 27:963〜964頁); Georgoudakiら、Cell Reports.、2016、15, 2000〜2011頁; Guerrieroら、Nature 2017、543;428〜432頁; US9,139,652; US9,795,570; US20170266131; US20170056430; US20160220692; US20150297679; US20150252115;及びUS20150080940)、乳がん等の乳房疾患の治療やマクロファージの恒常性のための新規戦略に対する医学的必要性は依然として満たされていない。本発明は、乳房障害を有する対象を治療し、化学療法に対する感受性を改善し、マクロファージの恒常性を促進するための新規な方法を提供する。

US9,139,652 US9,795,570 US20170266131 US20170056430 US20160220692 US20150297679 US20150252115 US20150080940 米国特許第6,413,228号米国特許第6,689,070号米国特許第6,638,727号特許出願PCT/US2015/010808 米国特許第5,531,736号米国特許第5,279,608号米国特許第5,562,654号米国特許第5,827,538号米国特許第5,798,119号米国特許第5,795,591号米国特許第4,552,561号米国特許第5,492,534号

Sicaら、2006、Eur J Cancer.、42、717〜727頁 J. Xue、S.V. Schmidt、J. Sanderら、Immunity、40巻、2号、274〜288頁、2014年 Bradyら、Mediators of Inflammation、2016巻(2016)、Article ID 4549676 Wynnら、Nature 2013年、496:445〜455頁 Ruffell、B.ら、P.N.A.S. USA、2012;109、2796〜2801頁 Noy R、Pollard JW、Immunity、2014; 41:49〜61頁 Casetta L、Pollard JW.、Cell Research (2017) 27:963〜964頁 Georgoudakiら、Cell Reports.、2016、15、2000〜2011頁 Guerrieroら、Nature 2017、543;428〜432頁 Gunthner及びAnders、Mediators of Inflammation、2013巻(2013)、Article ID 731023 Squadrito及びPalma、Cell Cycle、2016、15巻、23号、3149〜3150頁 Xueら、Immunity、2014年、40(2):274〜288頁 Nielsen及びSchmid、Mediators of Inflammation、2017巻、Article ID. 9624760 Wellings SR、Pathol. Res. Prac. 1980; 166:515〜535頁 Love及びBarsky、Cancer、2004、101巻(9):1947〜1957頁 Changら、Molecular Oncology、2016; 10(1):157頁 Krishnanら、RSNA Radiology、2008年3月、246巻、3号 Whitneyら、Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med.、16(2008); 658頁 Lehrmannら、J. Clin. Invest、2011、121(7)、2750〜2767頁 Neuzilletら、Pharmacology&Therapeutics、147巻、2015年3月、22〜31頁 Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser.、215-223頁 Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser.、225-232頁 Banga、AK、Therapeutic Peptides and Proteins、Formulation、Processing and Delivery Systems (1995) Technomic出版社、Lancaster、Pa. Roberge (1995) Science、269:202頁 Merrifield (1997) Methods Enzymol.、289:3-13頁 Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol, A.編(1980) Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott Williams&Wilkins;第21版(2005年5月1日) Tangら、FASEB J. 2016 9月;30(9):3097〜3106頁 Akbarzadehら、Nanoscale Research Letters 2013年、8:102頁 Gregoriadis G. Immunol. Today、11:89〜97頁, 1990年 Frezard, F.、Braz. J. Med. Bio. Res.、32:181〜189頁、1999年 Palら、Journal of Applied Pharmaceutical Science 01(06); 2011年:228〜234頁 Hu Yら、Nanoparticles. Nano Letters、2007年; 7巻:3056〜3064頁 Hu YHら、Biomacromolecules、2009年;10巻:756〜765頁 Lynn DM、Langer R.、Journal of the American Chemical Society、2000年;122巻:10761〜10768頁 Krauseら、J. Vis. Exp.、2013年;(80):50692頁 Herrlichら、Advanced Drug Delivery Reviews、2012年、1617〜1626頁 Stephanら、Nature Biotechnology、2015年、33巻、97〜101頁 Suら、Molecular Pharmaceutics 8巻、3号(2011年6月6日):774〜787頁 Kavanaughら、Blood、2006; 107:1963-1969頁

本発明の目的は、乳房障害を有する対象を治療する新規の方法を提供することであり、この方法は、M2分極化マクロファージを再分極化させることができる再分極化剤、若しくはマクロファージのM2分極化を遮断することができる遮断剤、又はその両方を含む組成物を対象に乳管内送達することを含む。

別の態様では、本発明は、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を対象に乳管内投与し、組成物の乳管内投与が化学療法に対する感受性の増加を促進することを含む、乳房障害を有する対象における化学療法に対する感受性の増加を促進する新規の方法を提供する。

少なくとも1つの実施形態では、本発明は、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を対象に乳管内投与することを含む、乳房障害を有する対象におけるM2マクロファージの選択的減少のための方法を提供する。

組成物の乳管内投与は、M2マクロファージの減少、M1マクロファージの増加、抗炎症性サイトカインの減少、炎症誘発性サイトカインの増加、細胞傷害性Tリンパ球の動員、及びTリンパ球の活性化の1つ又は複数をもたらす。

いくつかの実施形態では、M2マクロファージ表現型は、M2a表現型、M2b表現型、及びM2c表現型、又はそれらの組み合わせのいずれかの1つ又は複数である。

一態様では、本発明は、本明細書に開示される組成物の乳管内投与が、F4/80+マクロファージ;Grl-マクロファージ;CD206+マクロファージ;CD200R細胞/マクロファージ;CD63+マクロファージ;CD68+/CD68+マクロファージ;CD68+/CD163+マクロファージ;MARCO+マクロファージ;Tie2R+細胞/マクロファージ;CD11b+/VEGF-R1+マクロファージ;CCR2+骨髄細胞/マクロファージ;MerTK+マクロファージ;CD11b^low/MHCII^high/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+マクロファージ;CD11b+Grl-/F4/80+マクロファージ;CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6C^low/F4/80+マクロファージ;CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-マクロファージ;CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-マクロファージ;及びCD45+/F480+/Tie2-/CD31-マクロファージ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるマクロファージ集団のいずれかの1つ又は複数の減少をもたらすことを提供する。

他の態様では、本発明は、本明細書に開示される組成物の乳管内投与が、CD11b^high/MHCII^highマクロファージ;HLA-DRα+マクロファージ;CD86+マクロファージ;CD80+マクロファージ;CD68+/CD80+マクロファージ;CD64+マクロファージ;及びLy6C^high/CX3CR1^high/CCR2-/CD62L-/CD43^low(Ly6C^high)マクロファージ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるマクロファージ集団のいずれかの1つ又は複数の増加をもたらすことを提供する。

一態様では、本発明は、フェンレチニド(4-ヒドロキシ(フェニル)レチンアミド、4-HPR);IL-12; IFNγ; miR127;miR155; miR223;フェルモキシトール; CD40L;阻害剤:CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、アルギナーゼ1(Arg1)、M2マクロファージスカベンジャー受容体(A、B、MARCO等)、ヒストンデアセチラーゼ(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6シグナル伝達経路、IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、(miRNA-146a)等のmiRNA-146ファミリーメンバー、let7ファミリーメンバー(let-7c等)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187;CCR-CCl2軸シグナル伝達、CCL2/MCP-1合成、胎盤成長因子(PlGF)(HRG)及びC/EBPβ(PI3Kγ削除)、AMPKα1(メトホルミン(metformin))、p50-p50NFκB、NADPHオキシダーゼ(NOX)(NOX 1及びNOX 2)、Notchシグナル伝達経路及びRbpj;活性化因子:CD40、CD40L、IRF1、IRF5、STAT1(IFNγ、バディメザン(vadimezan)(DMXAA)等)、STAT3、核因子カッパB活性化因子、イミキモド(Imiquimod)等のトール様受容体(TLR)アゴニスト、合成非メチル化シトシン-グアニン(CpG )オリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)、p65-p50NFκB、MyD88、miR127、miR155、及びmiR223、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される再分極化剤を提供する。

一態様では、本発明は、抗CSF-1阻害剤、抗CSF-1R阻害剤、抗MCP-1阻害剤、抗IL-4阻害剤(パスコリズマブ(pascolizumab)、ピタキンラ(pitakinra)及びデュピルマブ(dupilumab)等)、抗IL-13阻害剤(アンルキンズマブ(anrukinzumab)、レブリキズナブ(lebrikizunab)、及びトラロキヌマブ(tralokinumab)等)、デュプリマブ(duplimab)等抗IL-4/IL-13デュアル阻害剤、STAT3阻害剤(ソラフェニブ(sorafenib)、スニチニブ(sunitinib)、WP1066及びレスベラトロール(resveratrol)等)、並びにSTAT6阻害剤(フェンレチニド(4-HPR)、レフルノミド(leflunomid)、TMX264、及びAS1217499等)、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される遮断薬を提供する。

いくつかの実施形態では、1つ又は複数のHDACiは、TMP195、MC1568、TMP269、(アリールオキソプロペニル)ピロリルヒドロキサメート)、トリコスタチンA、トラポキシンB、ツバスタチンA塩酸塩(抗HDAC7)、パノビノスタット(Panobinostat)、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)クラスI及びクラスII阻害剤ボリノスタット(Vorinostat)(ボリンザ(Volinza)(登録商標)Merck)、ロミデプシン(Romidepsin)(イストダックス(Istodax)(登録商標));デプシペプチド、FK-228)、ベリノスタット(Belinostat)(PXD-101)、パノビノスタット(Panobinostat)(LBH589)、ダシノスタット(Dacinostat)(LAQ824)、SB939、チダミド、汎HDAC阻害剤(ギビノスタット(Givinostat)(ITF2357)、PCI 2478、R306465(JNJ-16241199)、レスミノスタット(Resminostat)(4SC-201)等)、バルプロ酸、酪酸、フェニル酪酸、AN9/ピバネックス(Pivanex)、クラスI選択的HDAC阻害剤ベンズアミド若しくはアミノアナライド(例えば、CI-994、エンチノスタット(Entinostat)(SNDX-275 / MS-275)、モセチノスタット(Mocetinostat)(MGCD0103)、アベキシノスタット(Abexinostat)(PCI-24781)、キシノスタット(Quisinostat)(JNJ-26481585)、HBI-8000、ケベトリン(Kevetrin)、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、並びにスルフォラファン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

他の実施形態では、MARCO阻害剤は、抗MARCO抗体(ab103311、モノクローナルED31、PLK-1、ABN 1389等)、抗MARCO ScFv、Fab、Fab'、及びFab2、抗MARCO、ScFv mRNA、抗MARCO miRNA、MARCOアンチセンスRNA、MARCO siRNA、抗MARCO DNA、抗MARCOオリゴヌクレオチド、抗MARCOペプチド阻害剤、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。

一態様では、本発明は、組成物が追加の治療薬を更に含むことを提供する。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、チェックポイント阻害剤、抗ホルモン剤、ステロイド、アントラサイクリン、甲状腺ホルモン補充薬、チミジル酸標的薬(ドセタキセル(docetaxel)、ゲムシタビン(gemcitabine)、パクリタキセル(paclitaxel)若しくはカルボプラチン(carboplatin)及びペグ化リポソーム型ドキソルビシン(doxorubicin)等)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン(decitabine)等)、トラスツズマブ(trastuzumab)、アド-トラスツズマブエンタンシン(ado-trastuzumab emtansine)、ペルツズマブ(pertuzumab)、アベマシクリブ(abemaciclib)、パルボシクリブ(palbociclib)、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、並びに他の養子細胞療法、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、抗ホルモン剤は、タモキシフェン(tamoxifen)、シス-タモキシフェン(cis-tamoxifen)、エンドキシフェン(endoxifen)、デスメチルタモキシフェン(desmethyltamoxifen)、ラソフォキシフェン(lasofoxifene)、ラロキシフェン(raloxifene)、ベンゾチオフェン(benzothiophene)、バゼドフォキシフェン(bazedofoxifene)、アルゾキシフェン(arzoxifene)、ミプロキシフェン(miproxifene)、レボルメロキシフェン(levormeloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、クロミフェン(clomifene)、イドキシフェン(idoxifene)、トレミフェン(toremifene)、EM652及びERA-923、フルベストラント(fulvestrant)、ARN-810、若しくはCH498、アナストロゾール(anastrozole)、エキセメスタン(exemestane)、並びにレトロゾール(letrozole)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、チェックポイントポイント阻害剤は、抗PD-1(ニボルマブ(Nivolumab)等)、抗PD-1L(アテゾリズマブ(atezolizumab)(MPDL3280)等)、アベルマブ(Avelumab)(MSB0010718C)、デュルバルマブ(Durvalumab)、MDX-1105)、抗CTLA4(例えば、イピリムマブ(Ipilimumab))、並びに抗LAG-3(IMP321、BMS-986016及びGSK2831781等)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示される組成物が、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び他の磁気レポーター遺伝子、例えば金属タンパク質ベースのMRIプローブからなる群から選択される造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含むことを提供する。

一態様では、本発明は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、及びエキソソームとして製剤化された再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、及びエキソソーム中に含まれる。他の実施形態では、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセル上に含まれる。

少なくとも1つの実施形態では、ナノ粒子は脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、細胞標的化剤でコーティングされる。細胞標的化剤は、M2マクロファージ選択的細胞表面分子である。特定の実施形態では、M2マクロファージ選択的細胞表面分子は、IL-13Rα、CD163、CD206、CD200R、MerTK、スカベンジャー受容体A、スカベンジャー受容体B、MARCO、及びF4/80からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物がデポー製剤として製剤化される、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。

一態様では、本開示は、対象に再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を乳管内投与することを提供し、組成物は、単位用量あたり1×10⁴から1×10⁸のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はエキソソームを含む。対象は、本明細書に開示される組成物を単回用量又は複数回用量で投与され得る。

一態様では、乳房障害は乳がんである。いくつかの実施形態では、乳がんは、非浸潤性乳管癌(DCIS)、非浸潤性小葉癌(LCIS)、浸潤性(invasive)(又は浸潤性(infiltrating))小葉癌(ILC)、浸潤性(invasive)(又は浸潤性(infiltrating))乳管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER +)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR +)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、 HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞性(腺嚢胞性)癌、低悪性度腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液性(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、又は微小乳頭癌からなる群から選択される乳がんである。

いくつかの実施形態では、方法は、対象に化学療法、放射線療法、又は細胞療法を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、化学療法、放射線療法、若しくは細胞療法又はそれらの組み合わせは、対象における腫瘍サイズ又は免疫抑制又はその両方を減少させる。

他の実施形態において、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物の乳管内投与は、対象における、M1-分極化マクロファージの殺腫瘍活性;炎症性サイトカイン、ケモカイン、成長因子の放出;細胞傷害性Tリンパ球の動員;そしてT細胞の活性化のいずれか1つ又は複数を増加させる。

更に他の実施形態では、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方の乳管内投与は、対象における、腫瘍血管新生;腫瘍浸潤;転移;免疫抑制;及び抗炎症性サイトカイン、ケモカイン、成長因子の放出のいずれか1つ又は複数を減少させる。

別の態様では、本発明は、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物、1つ又は複数の容器、包装材料、ラベル又は添付文書、及び任意選択でデバイスを含む製品を提供する。いくつかの実施形態では、デバイスは、針及びシリンジ、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、浸透圧ポンプ、又はカプセル化デバイスである。他の実施形態では、製品は、本明細書に開示されるもの等の追加の治療剤を更に含む。

一般に、マクロファージ活性化を調節し、TMEにおけるM2マクロファージを再分極化させ、化学療法、放射線療法、免疫療法、及び細胞療法等の療法への感受性を改善するために使用できる組成物が、本明細書に開示される。そのような組成物は、M2マクロファージをM1マクロファージに再分極化させる、又は浸潤単球及びマクロファージのM2マクロファージへの分極化を遮断することができる再分極化剤及び分極化遮断剤を含む。また、本明細書に開示される組成物を対象の1つ又は複数の乳管に乳管内投与することによる、乳房障害を有する対象の治療方法が、本明細書に提供される。

マクロファージとTAM - 分極化と表現型
乳房に内在するマクロファージ(CD11b^high/MHCII^high)は、組織損傷のセンサーとして機能し、組織の恒常性と免疫を維持するために重要である。マクロファージは、炎症の重要なメディエーターであり、乳腺発生過程の重要な調節因子である。炎症促進性因子と抗炎症性因子のバランスは、TME内のマクロファージ機能の調節の鍵となる。TMEはさまざまなサイトカイン、ケモカイン、及び成長因子を放出して、循環単球をTMEに動員し、そこで成熟してマクロファージを形成する。腫瘍微小環境に動員されると、マクロファージは、TME内の過剰な刺激に応答し、さまざまなサブセットに分化する。ヒトにおいて、マクロファージの分極化は、古典的に活性化された炎症促進性M1マクロファージから、代替的に活性化された抗炎症性M2マクロファージまでの両極端にわたる連続体である。

M1表現型へのマクロファージの分極化は、GM-CSF、IFNγ、TNFα、IL-1β、及びLPS等の炎症シグナル並びに、さまざまな転写因子及びマイクロRNA(miRNA)によって、インビトロで調節される。インターフェロン調節因子は、マクロファージ分極化の表現型を決定する。IFNγは、インターフェロン調節因子1(IRF1)及びSTAT1を使用して、インターフェロン調節経路を介してマクロファージをM1表現型に分極化させる。LPSは、Toll様受容体ファミリー(TLR-4等)を介してM1表現型を誘導する。miRNAは、転写後に遺伝子発現を調節する長さ22ヌクレオチドの小さな非コードRNAであり、mRNAの分解速度に影響を与える。いくつかのmiRNAは、M1分極化マクロファージ、特にmiRNA-155、miRNA-125、miRNA-127、miRNA-17、miRNA-20、miRNA-106a、及びmiRNA-378で高発現することが示されている。これらのmiRNAを阻害すると、M1分極化が減少するとされている。

古典的に活性化されたマクロファージは、CXCL9、CXCL10(IP-10としても知られている)、IFN調節因子1、及びサイトカインシグナル伝達抑制因子1(SOCS1)を標的とするSTAT1転写因子の誘導を開始する。M1マクロファージは、IL-6、IL-12、IL-23、酵素NADPHオキシダーゼNOX1及びNOX2の活性によって生成される活性酸素種(ROS)、反応性窒素種(RN)、及び腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)致死細胞等の炎症促進性サイトカインを分泌する。M1マクロファージは、食作用性が高く、一般に病原体や細胞を排除する働きをする。

IL-12は、Th17細胞の活性化とクローン性増殖を誘導し、大量のIL-17を分泌し、更に炎症に寄与する。これらの特性により、M1マクロファージは転移を制御し、腫瘍成長を抑制し、微生物感染を制御させる。腫瘍部位への炎症促進性M1マクロファージの浸潤及び動員が、固形腫瘍を有する患者において、より良い予後及びより高い全生存率と相互に関係していることが、研究により示唆されている。

ヒトM1マクロファージの確証された細胞表面マーカーには、高レベルのCD14、C16、CD64、CD86、及びHLA-DRαが含まれる。

M1マクロファージと対照的に、M2マクロファージは、一般に抗炎症性サイトカインを産生し、組織の再構築及び修復、血管新生、免疫抑制、並びに調節性T細胞の動員を誘導する。M2マクロファージは、更にM2a、M2b、M2cマクロファージに分類できる。M2aマクロファージは、IL-4又はIL-13刺激から生じ、マトリックス再構築サイトカインを放出する(Gunthner及びAnders、Mediators of Inflammation、2013巻(2013)、Article ID 731023)。IL-4は、IRF4及びSTAT6シグナル伝達を介したインターフェロン調節経路を使用して、マクロファージをM2表現型に分極化する。CD200R及びCD86の発現の上昇は、M2aマクロファージの確証された細胞表面マーカーである。M2bマクロファージは、IL-1β又はLPS刺激と組み合わせた免疫複合体の認識から生じ、M2aマクロファージと同様に、創傷治癒に関与している。免疫抑制M2cマクロファージは、IL-10、TGFβ、グルココルチコイド、又は免疫複合体が豊富な環境の結果である。IL-10は、STAT3シグナル伝達経路を使用してマクロファージをM2表現型に分極化させる(Gunthner及びAnders、Mediators of Inflammation、2013巻(2013)、Article ID 731023)。M2cマクロファージは、更にIL-10等の免疫抑制性サイトカインや、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えばMMP-9)等のマトリックス再構築因子を生成する。CD163発現、ARG1、RETNLB、IL4R、CHIA、CD68の上昇は、M2c分極化の確証されたマーカーである。

いくつかのmiRNA、特にmiRNA-9、miRNA-21、miRNA147、miRNA-187、(miRNA-146a)等のmiRNA-146ファミリーメンバー、及び(let-7c等の)let7ファミリーメンバーは、M2分極化マクロファージで高発現することが示されている。これらのmiRNAを阻害すると、M2分極化が減少するとされている。miRNAプロセシング酵素DICERの欠乏により、炎症促進性サイトカイン及びT細胞動員ケモカインの発現の増強により特徴付けされるIFNγを介したM1様表現型へのTAMの再分極化が生じ、let-7のレスキューがM2マクロファージ表現型を部分的に回復させることが、研究により示されている(Squadrito及びPalma、Cell Cycle、2016、15巻、23号、3149〜3150頁)。TAMにおけるDICERの不活性化は、がん免疫療法、すなわちPD1チェックポイント遮断及びCD40アゴニスト抗体の効力を大きく増強し、マウスの完全な腫瘍退縮をもたらした。(Id.)M2マクロファージの追加マーカーには、アルギナーゼ1(Arg1)、マクロファージスカベンジャー受容体A、B及びMARCO、Tie2R+、Grl-、F4/80+、MerTK+、CD206+、及びCD200Rが含まれるが、これらに限定されない。

TAMは、TAMのトランスクリプトーム研究に基づき、M1マクロファージ及びM2マクロファージ表現型に通常割り当てられるマーカーの組み合わせを表現型的に含むと考えられている(Xueら、Immunity、2014年、40(2):274〜288頁)。CD11b+Grl-/F4/80+マクロファージ、CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+マクロファージ、CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-マクロファージ、CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-マクロファージ;及びCD45+/F480+/Tie2-/CD31-マクロファージ等のM2様マクロファージ集団サブセットが、乳がんにおいて見出されている(Nielsen及びSchmid、Mediators of Inflammation、2017巻、Article ID. 9624760)。しかしながら、TMEでの機能に基づいて、TAMは通常、腫瘍由来の乳酸又はTMEにおけるさまざまな細胞又はB細胞由来の免疫グロブリンからのIL-4、IL-10、及びIL-13等の免疫抑制性サイトカインの分泌によって引き起こされるM2のような分極化状態に関連付けられていることが広く受け入れられている。(Bradyら、Mediators of Inflammation、2016巻(2016)、Article ID 4549676)。本開示の目的のために、本発明は、いくつかのM1様表現型マーカーもまた示し得るTAM(本開示において「M2マクロファージ」、「M2分極化マクロファージ」又は「TAM」として交換可能に使用される)を含む、M2様TAMの再分極化を提供する。M2マクロファージ集団は、本発明の目的のために、M2マクロファージのサブセット(M2a、M2b、及びM2c)のいずれか、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。

不均一なTAM集団は、これらの領域の低酸素レベルに基づき、腫瘍内の異なる区画に見出される。TMEに動員された炎症性単球はMHCII^lowとMHCII^highTAMの両方を引き起こすが、低酸素領域内のTAMは主にMHCII^lowであり、M2マーカーの発現の増加に関連している。CD68+/CD68+マクロファージ、CD68+/CD163+マクロファージ、CD11b+/VEGF-R1+マクロファージ、CCR2+骨髄細胞/マクロファージ、CD11b^low/MHCII^high/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+マクロファージ、CD11b+Grl-/F4/80+マクロファージ、CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+マクロファージ、CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-マクロファージ、CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-マクロファージ;及びCD45+/F480+/Tie2-/CD31-マクロファージ等のTAMのM2様マクロファージ集団は、乳がんで上昇していることが見出されている(Nielsen及びSchmid、Mediators of Inflammation、2017巻、Article ID. 9624760)。

治療方法
一態様では、本明細書で提供されるのは、乳房障害を有する対象を治療する新規の方法であり、方法は、M2分極化マクロファージを再分極化できる再分極化剤を含む組成物、若しくはマクロファージのM2分極化を遮断することができる分極化遮断剤(以下、「遮断剤」)、又はその両方を対象の乳管に乳管内送達することを含む。本明細書に開示される方法における乳管内送達は、非侵襲的又は最小侵襲的に行われ、通常、治療を送達する臨床医による皮膚の破壊を含まない。代わりに、組成物は、乳腺乳頭の乳首にある対象自身の自然管口を介して対象に投与される。

本明細書で使用する場合、「乳管内」及び「乳管内に」という用語は、本明細書に開示される組成物が、乳房の奥に到達するために、乳腺乳頭の乳首の乳管開口部(管口)を通して、対象の少なくとも1つの母乳管の内腔に送達される治療方法を指す。

一態様では、乳管内投与は、乳腺乳頭の乳首への本開示の組成物の適用を指し、そこから、組成物は、乳首の管口を通して少なくとも1つの母乳管に送達される。乳首と管口は、再分極化剤、分極化遮断剤、及び治療剤を乳管に送るために唯一適したものである。別の態様では、乳管内投与は、乳腺乳頭の乳首の管口を介して母乳管の内腔に直接組成物を乳管内送達することを指す。本明細書に開示される乳管内送達方法は、対象の乳房の母乳管の自然開口部を介した、本明細書に開示される組成物の送達を含むことが、当業者に理解されるであろう。本発明の有利な態様は、乳管内送達が、典型的には、対象の皮膚又は組織又は細胞層の意図的な損傷を含まず、発症した乳房組織の近くに組成物を送達することである。

乳がん等の乳房障害は、通常、個体の乳管で起こる(Wellings SR、Pathol. Res. Prac. 1980; 166:515〜535頁; Love及びBarsky、Cancer、2004、101巻(9):1947〜1957頁)。したがって、母乳管(乳管)内の患部に近い、例えば、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物の療法の局所送達が、高く望まれる。このような組成物の乳管内投与は、再分極化剤及び/又は遮断剤を含む組成物への全身曝露を低減することにより全身治療の副作用を未然に防ぐ局所的、効果的、易投与性の療法を提供する。これには、腫瘍標的を外した効果の可能性/リスクを低減するという追加の利点がある。乳管内投与による乳管への局所送達は、移行時間を減少させ、TME内のM2マクロファージの組成物へのより速い曝露を提供し、それにより細胞傷害性活性及び有効性を改善させるとともに、M2マクロファージへの移行がより短いため、薬物不活性化及び/又は分解の可能性もまた減少させる。本明細書に開示される方法の特定の利点は、乳房組織におけるマクロファージのインビボ形質導入である。

本明細書に開示される組成物の乳管内投与は、M2マクロファージの減少、M1マクロファージの増加、抗炎症性因子の減少、炎症促進性因子の増加、及び細胞傷害性Tリンパ球の動員の増加の1つ又は複数の出現をもたらす。いくつかの実施形態では、M1マクロファージに対するM2マクロファージの比率が変更される。M1マクロファージの数は、M2マクロファージと比較して増加している。いくつかの実施形態では、再分極化は、マクロファージ分極化状態に関してM1/M2マクロファージ恒常性を回復させる。

いくつかの実施形態では、再分極化されるM2マクロファージ表現型は、M2a表現型、M2b表現型、M2c表現型、又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、CD68+/CD163+マクロファージ、CD11b+/VEGF-R1+マクロファージ、CCR2+骨髄細胞/マクロファージ、CD68+/CD68+マクロファージ、CD11b^low/MHCII^high/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+マクロファージ、CD11b+Grl-/F4/80+マクロファージ、CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+マクロファージ、CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-マクロファージ、CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-マクロファージ;及びCD45+/F480+/Tie2-/CD31-マクロファージ等のTAMのM2様マクロファージ集団が、本明細書に開示される組成物及び方法によって再分極化される。その結果、そのようなM2マクロファージの数の減少が生じる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の乳管内投与は、CD11b^high/MHCII^highマクロファージ、HLA-DRα+マクロファージ、CD86+マクロファージ、CD80+マクロファージ、CD68+/CD80+マクロファージ、CD64+マクロファージ、又はLy6C^high/CX3CR1^high/CCR2-/CD62L-/CD43^low(Ly6C^high)マクロファージ等の任意の1つ又は複数のマクロファージ集団の数の増加をもたらす。

他の実施形態では、本明細書に開示される組成物の乳管内投与は、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子(例えば、IL-1、IL-1β、IL-17、IFNγ、ROS、RNs、TNFα、GM-CSF)等の炎症促進性因子の増加をもたらす。他の実施形態では、本組成物の乳管内投与は、サイトカイン及びケモカイン(IL-4、IL-13、IL-10、CSF-1等)、成長因子(VEGF及びTGFβのような血管新生成長因子等)及び組織再構築因子(MMP9等のMMP等)等の抗炎症因子の減少をもたらす。当業者は、本開示の目的に適した他の既知の炎症促進性及び抗炎症性因子があることを理解するであろう。炎症促進性及び免疫抑制性マーカー等の分極化/活性化マーカーの変化は、当技術分野における任意の既知の方法を使用して、例えばImmunity、40巻、2号、274〜288頁、2014年のXueらによって記載されたELISA、IHC、qPCR、及びトランスクリプトームに基づく分析を使用して検出できる。

M2マクロファージからM1マクロファージへ切り替わると、バランスがより炎症促進性の高いM1マクロファージの殺腫瘍性エフェクター機能が活性化される状態に移行する。したがって、いくつかの実施形態では、TAMは、腫瘍形成性マクロファージから殺腫瘍性マクロファージに再分極化される。更に他の実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与は、M2マクロファージの腫瘍形成機能を低下させる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与は、腫瘍血管新生を低減する。M2マクロファージは、新血管新生を促進して腫瘍組織に栄養を供給し、血管内皮成長因子(VEGF-A)及び胎盤成長因子(PlGF)等の血管新生成長因子の放出を介して、正常な乳房組織の静止状態から新しい血管を芽生えさせる血管新生スイッチをオンにすることにより、腫瘍転移を助ける。

他の実施形態において、本明細書に開示される組成物の投与は、腫瘍浸潤を低減する。M2マクロファージは、血管への腫瘍細胞の血管内侵入を促進するVEGF-A等の血管新生成長因子を放出する。更に、SPARC又はCCL8等のマクロファージ由来のカテプシンは、細胞外マトリックスタンパク質への腫瘍細胞接着を向上し、腫瘍細胞の遊走を促進する。M2マクロファージは、マクロファージの浸潤の増加と腫瘍細胞の遊走を促進する自己分泌ループで腫瘍細胞に関与する能力(例えば、腫瘍細胞によるCSF-1及びCSF-R産生を介して)を介して転移を促進する。化学療法によって大転移巣が除去された場合であっても、いくつかの薬剤耐性腫瘍細胞が、最終的には薬剤耐性転移巣として再発する。肺における研究により、CCR2+マクロファージのアブレーションにより転移性負荷が低減することが示されている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与は転移を低減させる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組成物の投与はCCR2+マクロファージを減少させる。

さらなる実施形態において、本明細書に開示される組成物の投与は免疫抑制を低減する。なおさらなる実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与は細胞傷害性Tリンパ球の動員及び活性化を増加させる。

少なくとも1つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象の乳房疾患の負担を減少させる。

別の態様では、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を対象の1つ又は複数の乳管に乳管内投与することを含む、乳房障害を有する対象の乳房におけるマクロファージ恒常性を回復又は促進するための新規の方法が、本明細書で提供される。

別の態様では、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を対象に乳管内投与することを含む、乳房障害を有する対象におけるがん療法への感受性の増加を促進する新規の方法が、本明細書で提供される。マクロファージは化学療法抵抗性において重要な役割を果たす(Nielson及びSchmid、Mediators of Inflammation、2017巻、Article ID. 9624760)。TMEにおけるM2マクロファージは、一般的に使用される化学療法剤ゲムシタビンの主要代謝酵素である酵素シチジンデアミナーゼの発現を誘導する。本明細書に開示されている乳管内送達方法を使用してM2マクロファージをM1マクロファージに再プログラミングすると、腫瘍細胞の化学療法への感受性が増加し、T細胞及びM1マクロファージが媒介する細胞傷害性が増加する。

いくつかの実施形態では、本方法は、化学療法、放射線療法、細胞療法等の免疫療法(CAR-T療法又はユニバーサルT細胞療法等)を対象に送達することを含む。がん療法に対する感受性の増加は、腫瘍細胞死の増加をもたらす。対象における腫瘍細胞死は、当技術分野で知られている任意の方法によって測定することができる。例えば、これは、組織生検におけるアポトーシス検出アッセイ(TUNELアッセイ、R&D Systems社)等のアッセイによって検出することができる。腫瘍細胞死を検出する非侵襲的な方法には、対象の腫瘍の成長に伴う乳酸デヒドロゲナーゼの減少、及び/又は血液サンプル中のctDNA(循環腫瘍細胞由来DNA)の減少(液体生検)の測定が含まれる(Changら、Molecular Oncology、2016; 10(1):157頁)。対象の腫瘍細胞死は、MRイメージング及びガドリニウムに基づくターゲットコントラストエージェント(Krishnanら、RSNA Radiology、2008年3月、246巻、3号)、グルコースアナログ、2-¹⁸フルオロ-2-デオキシ-グルコース(¹⁸FDG)の取り込みのPETに基づく測定、並びに13C磁気共鳴分光法及び分光イメージングを使用した過分極[1-13C]ピルビン酸塩(Whitneyら、Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med.、16(2008); 658頁)を使用して非侵襲的に検出することもできる。

別の態様では、再プログラミング剤若しくは遮断剤又はその両方を含む、有効量の医薬組成物を対象に乳管内投与することを含む、乳房障害を有する対象におけるM2マクロファージの選択的減少のための新規な方法が、本明細書で提供される。

本明細書で使用される場合、「乳房障害」は乳がんを意味する。本明細書中で使用される場合、「乳がん」は、乳房細胞の任意の悪性腫瘍を意味する。乳がんは、前がん、初期がん、非転移性がん、前転移性がん、局所進行性がん、及び転移性がんの段階を含む、乳がんのいずれの段階であってもよい。乳がんにはいくつかの種類がある。例示的な乳がんには、非浸潤性乳管癌(DCIS)、非浸潤性小葉癌(LCIS)、浸潤性(又は浸潤型)小葉癌(ILC)、浸潤性(又は浸潤型)乳管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞(腺嚢胞)癌、低悪性度腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液性(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、又は微小乳頭癌が含まれるが、これらに限定されない。単一の乳がん腫瘍は、これらのタイプの任意の組み合わせ又は混合であるか、浸潤性及び上皮内がんの混合であり得る。

DCISは最も一般的な非浸潤性乳がんである。それは、乳管を裏打ちしている細胞を含む。DCISでは、細胞は管壁を越えて周囲の乳房組織に広がっていない。DCISは、乳がんの新規症例の約5分の1になる。DCISにはいくつかのバイオマーカーが関連している。例示的なバイオマーカーには、限定されないが、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、Ki-67、サイクリンD1、サイクリンA、サイクリンE、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、サバイビン(survivin)、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基底サイトケラチン、CK5/6、CK14、及びCK 17、上皮成長因子受容体、Tn、ER+、並びにc-kitが含まれる。DCISはIDCの非強制的な前駆体であるとされている。特定のHGF及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を分泌するがん関連線維芽細胞(CAF)等の間質細胞の関与は、DCIS細胞が浸潤性になり、IDCに発達することを助ける。

LCISは前がん性腫瘍である。それは浸潤性がんの素因の指標となり得る。LCISは、インサイツ(管又は小葉)乳がんの約15%しか占めていない。LCISバイオマーカーには、E-カドヘリン、ER、PgR、c-erbB-2、p53及びKi-67が含まれるが、これらに限定されない。

IDCは最も浸潤性の乳がんである。その名のとおり、それは乳管から始まり周囲の脂肪組織に浸潤する癌である。浸潤性乳がんの約8〜10は浸潤性乳管癌である。IDCは、がん組織を切除する手術と放射線療法でしばしば治療される。更に、IDCを治療するために、免疫療法(例えば、タモキシフェン及びトラツズマブ)を組み合わせた化学療法がしばしば使用される。腫瘍が4cmより大きい場合は、根治的乳房切除術が行われることがある。IDCのバイオマーカーには、炭水化物抗原、例えばTn、Tf、シアリルTn、ルイスx、ルイスa、ルイスy、及びガングリオシド、例えばGM3、GD3、9-0-アセチルGD3、9-0-アセチルGT3、N-グリコリ-GM3が含まれるが、これらに限定されない。

ILCは、乳房の小葉に発生し、周囲の組織に浸潤したがんである。浸潤性乳がんの約10分の1がILCである。ILCは、がん組織を切除する手術と放射線療法によって治療される。更に、化学療法と免疫療法の組み合わせ(例えば、タモキシフェンとトラツズマブ)は、ILCを治療するためのアジュバント療法としてしばしば使用される。がん関連線維芽細胞(CAF)によって放出される成長因子とサイトカインの支援で侵襲的であるIDCと同様に、ILCもまたCAF関連タンパク質FAP-α、FSP-1/S100A4、及びPDGFR-βによって支援される。

炎症性乳がんは、すべての乳がんの約1%から3%を占める。炎症性乳がんでは、がん細胞が皮膚のリンパ管を遮断し、その結果、乳房は赤くなり、熱っぽさを感じる。発症した乳房は、大きくなったり、硬くなったり、柔らかくなったり、かゆくなったりする。炎症性乳がんは、化学療法、免疫療法、放射線療法、場合によっては手術で治療される。

エストロゲン受容体陽性(ER+)乳がんは、がん性細胞の表面にエストロゲン受容体が存在することを特徴としている。ER+がん細胞の増殖は、エストロゲン(ホルモン依存性又はホルモン感受性乳がん)の利用可能性に関連付けられる。およそ、すべての乳がんの80%はER+乳がんである。ER+乳がんの治療の選択肢には、エストロゲンを遮断する化学療法薬(例えば、タモキシフェン)が含まれる。

三重陰性乳がんは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及びHER2受容体の欠如により特徴付けられ、診断された乳がんの約10%〜20%に発生する。TNBCは非常に攻撃的である可能性があり、対象は再発のリスクがある。治療の選択肢としては通常、ネオアジュバント化学療法(タモキシフェン等の抗エストロゲンやトラスツズマブ等の抗HER2は除く)とそれに続く乳腺腫瘤摘出等の手術が含まれる。更に、TNBCは非常に多様ながんのグループであり、2つの基底様(BL1及びBL2)、免疫調節(IM)、間葉(M)、間葉系幹様(MSL)、及び管腔内アンドロゲン受容体(LAR)サブタイプを含む、ユニークな遺伝子発現及びオントロジーを示す少なくとも6つのTNBCサブタイプにサブタイプ化される(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLehrmannら、J. Clin. Invest、2011、121(7)、2750〜2767頁)。特にTNBCサブタイプを標的とすることができる変異とマーカーが記載されている(同上)。TNBCの追加のバイオマーカーには、上皮成長因子受容体、葉酸受容体α、血管内皮成長因子、c-Myc、C-kit及び基底サイトケラチン、Poly(ADPリボース)ポリメラーゼ1、p53、チロシナーゼキナーゼ、m-TOR、熱及びショックタンパク質並びにTOP-2Aが含まれるが、それらに限定されない。更に、腫瘍を取り囲む間質細胞(がん関連線維芽細胞(CAF)及び腫瘍関連マクロファージ(TAM)や腫瘍関連好中球(TAN)等の免疫細胞)は、細胞外マトリックスの沈着増加並びにTGFベータ、bFGF、及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、EGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、IL1、IL-8、TNF-alpha等のサイトカイン、MM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13、COX2等の酵素等のがん細胞の増殖、浸潤、及び転移(例えば、上皮間葉移行を促進することによる)に影響を与えるその他の因子等のさまざまな線維化促進成長因子の放出による治療薬の浸透に対する障壁の生成に重要な役割を果たす。TAMは更に、T-reg細胞の動員及び免疫抑制性微小環境の生成を促進するサイトカインやケモカイン(例えば、IL-10、TGF-ベータ、CCL17、CCL22、及びCCL24)を分泌することにより、抗腫瘍免疫応答を抑制する。

いくつかの実施形態では、対象の乳房障害は、乳がん又は葉状腫瘍である。さらなる他の実施形態では、乳がんは、前がん、初期段階のがん、非転移性がん、前転移性がん、局所進行性がん、又は転移性がんである。

他の実施形態では、対象は、非浸潤性乳管癌(DCIS)、非浸潤性小葉癌(LCIS)、浸潤性(又は浸潤型)小葉癌(ILC)、浸潤性(又は浸潤型)乳管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞(腺嚢胞)癌、低悪性度腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液性(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、及び微小乳頭癌からなる群から選ばれる乳がんを有する。

組成物
再分極化剤
一態様では、本開示は、M2マクロファージを再分極化させることができる再分極化剤を含む組成物を提供する。いかなる理論又はメカニズムにも拘束されることを望まないが、再分極化剤を含む組成物は、TAMをM2マクロファージ活性化フェーズからM1マクロファージ活性化フェーズに再分極化させ又は切り替える。

再分極化剤は、M1マクロファージ表現型を促進する任意の薬剤であり得る。再分極化剤の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:フェンレチニド(4-ヒドロキシ(フェニル)レチンアミド、4-HPR); IL-12; IFNγ; LPS、フェルモキシトール、高ヒスチジン糖タンパク質(HRG); miRNA-155、miRNA-125、miRNA-127、miRNA-17、miRNA-20、miRNA-106a、及びmiRNA-378;コロニー刺激因子-1(CSF-1)及びCSF-1受容体(CSF-1R)の阻害剤;IL-10の阻害剤(IL-12及びその活性剤等)、IL-10受容体(IL-10R);TGFβの阻害剤(トラベデルセン(trabedersen)[AP12009]、ルカニクス(Lucanix)(登録商標)[ベラゲンプマテュセル-L(belagenpumatucel-L)]等)、ジシテルチド(disitertide)、レルデリムマブ(Lerdelimumab)、メテリムマブ(Metelimumab)、フレソリムマブ(Fresolimumab)、LY2382770等(TGFβ阻害剤の追加の例については、Neuzilletら、Pharmacology&Therapeutics、147巻、2015年3月、22〜31頁もまた、参照);CB-1158等のアルギナーゼ1(Arg1)の阻害剤;M2マクロファージスカベンジャー受容体の阻害剤(A、B、MARCO(抗MARCO抗体、ScFv等)等);ヒストンデアセチラーゼ(HDACi)の阻害剤;インターフェロン調節因子4(IRF4)の阻害剤、フェンレチニド(4-HPR)、レフルノミド、TMX264、AS1217499等の転写4及び6のシグナルトランスデューサー及び活性化因子(STAT4; STAT6)シグナル伝達経路;IL-4(ピタキンラ、パスコリズマブ、デュピルマブ、フォルモモネチン(formomonetin)、ブデソニド(budesonide)、ロカグラミド(rocaglamide)、メソプラム(mesopram)、GIT-27等)及びIL-4Rの阻害剤;デュプリマブ等の抗IL-4/IL-13阻害剤;IL-13(レブリキズマブ(lebrikizumab)、アンルキンズマブ、レブリキズナブ、トラロキヌマブ、IL-13R(α)2デコイ等)及びIL-13Rの阻害剤;IL-17(セキキヌマブ(secukinumab)等)及びIL-17R(例えば、ブロダルマブ(brodalumab)、イキセキズマブ(ixekizumab)、ビメキズマブ(bimekizumab)、ALX-0761、CJM112、CNTO 6785、LY3074828、及びSCH-900117)の阻害剤;ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ(PPARγ)の阻害剤(ロシグリタゾン(rosiglitazone)、ピオグリタゾゾン(pioglitazozne)等);クルッペル様因子4(KLF4)及びクルッペル様因子6(KLF6)の阻害剤;マイクロRNAプロセシング酵素DICERの阻害剤;miRNA-9、miRNA-21(AC1MMYR2等)、miRNA147、miRNA-187、(miRNA-146a)等miRNA-146ファミリーメンバー、let7ファミリーメンバー(let-7c等)の阻害剤;CCR-CCl2軸シグナル伝達の阻害剤;CCL2/MCP-1合成の阻害剤;胎盤成長因子(PlGF)及びC/EBPβ(PI3Kγ欠失)の阻害剤;AMPKα1の阻害剤(メトホルミン等);p50-p50NFκBの阻害剤(デコイNFkB p50(NLS)阻害剤ペプチドセット-Novus Biologicals等);NADPHオキシダーゼ1及び2(NOX 1及びNOX 2)の阻害剤、例えばML-171、GSK2795039、架橋テトラヒドロイソキノリン等;Notchシグナル伝達経路の阻害剤、例えばRPB-Jの阻害剤;CD40の活性剤、例えば活性化抗体、例えばCP-870,893、ダセツムマブ、ChiLob7/4、ワクチン等)及びCD40L(AdcuCD40L等);インターフェロン調節因子-1(IRF1)、インターフェロン調節因子-5(IRF5)の活性剤; IFNγ、バディメザン(DMXAA;シグナルトランスデューサー及び活性化因子転写3(STAT3)等のシグナルトランスデューサー及び活性化因子転写1(STAT1);トール様受容体(TLR)アゴニスト(イミキモド、合成非メチル化シトシン-グアニンオリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)、TLR4リガンド等);並びにp65-p50NFκB及びMyD88の活性化因子;又はそれらの任意の組み合わせ。

いくつかの実施形態では、組成物は、1つ又は複数のHDACiを適切な再分極化剤として含む。適切なHDACiの例には、限定なく、TMP195、MC1568、TMP269、(アリールオキソプロペニル)ピロリルヒドロキサメート)、トリコスタチンA、トラポキシンB、塩酸ツバスタチンA(抗HDAC7)、パノビノスタット、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)、クラスI及びクラスII阻害剤ボリノスタット(ボリンザ(登録商標)Merck)、ロミデプシン(イストダックス(登録商標));デプシペプチド、FK-228)、ベリノスタット(PXD-101)、パノビノスタット(LBH589)、ダシノスタット(LAQ824)、SB939、チダミド、汎HDAC阻害剤(ギビノスタット(ITF2357)、PCI 2478、R306465(JNJ-16241199)、レスミノスタット(4SC-201)等)、バルプロ酸、酪酸、フェニル酪酸、AN9/ピバネックス、クラスI選択的HDAC阻害剤ベンズアミド若しくはアミノアナライド(例えば、CI-994、エンチノスタット(SNDX-275/MS-275)、モセチノスタット(MGCD0103)、アベキシノスタット(PCI-24781)、キシノスタット(JNJ-26481585)、HBI-8000、ケベトリン、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、並びにスルフォラファンが含まれる。少なくとも1つの態様において、適切なHDACiはTMP195である。

MARCOは、ヒト乳がんの免疫抑制TAMによって発現される。M2マクロファージ、特に免疫抑制TAMの再プログラミング又は再分極化が非常に望ましい。したがって、いくつかの実施形態では、再分極化剤はMARCO阻害剤である。MARCO阻害剤は、抗MARCO抗体(ab103311、モノクローナルED31、PLK-1、ABN 1389等)、抗MARCO ScFv、Fab、Fab'、Fab2、抗MARCO ScFv mRNA、抗MARCO miRNA、MARCOアンチセンスRNA、MARCO siRNA、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。少なくとも1つの実施形態では、抗MARCO阻害剤は、抗MARCO抗体又はScFvである。

一態様では、本発明は、抗MARCO抗体又はScFvを含む組成物の対象の乳管への乳管内投与が、M2マクロファージにおいて抗体依存性細胞死(ADCC)を誘導できることを開示する。

少なくとも1つの実施形態では、再分極化剤はIL-12である。

遮断剤
一態様では、本開示は、浸潤性単球、乳房組織常駐マクロファージ、M1マクロファージの分極化がTMEにおいてM2分極化マクロファージになることを遮断することができる分極化遮断剤を含む組成物を提供する。いかなる理論又はメカニズムにも縛られることを望まないが、遮断剤を含む組成物の乳管内投与は、TMEにおけるM2マクロファージの数を減少させる。いくつかの実施形態では、M1マクロファージが増加する。他の実施形態では、M1マクロファージに対するM2マクロファージの比率が変更される。更に他の実施形態では、遮断薬の投与により、サイトカイン、ケモカイン、及びIFNγ、IL-1、IL-1β、TNF-α、GM-CSF等の成長因子等の炎症促進性因子が増加する。更に他の実施形態において、遮断薬の投与は、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子等の抗炎症性因子、例えばIL-4、IL-13、IL-10、TGFβ、VEGF、MMP等の減少をもたらす。

更に、乳がんモデルにおけるCSF-1及びCSF-1受容体(CSF-1R)の遮断は、TMEへの単球及びマクロファージ浸潤の減少及び腫瘍における細胞傷害性CD8+ T細胞の増加を示している。これは、CSF-1及びCSF-1Rの阻害が腫瘍におけるCD8+ T細胞の増加と相関していることを示唆している。

本開示の目的に適したM2分極化遮断剤は、浸潤する単球、乳房組織常駐マクロファージ、M1マクロファージの分極化がM2分極化マクロファージになることを遮断する任意の分極化遮断剤であり得る。例としては、限定されることなく、抗CSF-1阻害剤、抗CSF-1R阻害剤、抗MCP-1阻害剤、抗IL-4阻害剤(パスコリズマブ、ピタキンラ、デュピルマブ等)、抗IL-13阻害剤(レブリキズマブ、アンルキンズマブ、レブリキズナブ、トラロキヌマブ等)、デュプリマブ等の抗IL-4/IL-13阻害剤、STAT3阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブ、WP1066、及びレスベラトロール等)、並びにSTAT6阻害剤(フェンレチニド(4- HPR)、レフルノミド、TMX264、及びAS1217499)が含まれる。

当業者は、再分極化剤が分極化遮断剤として機能し得ることを認識するであろう。

本開示の目的に適した再分極化剤は、M2マクロファージをM1マクロファージに再分極化させる任意のタイプの再分極化剤であり得る。同様に、本開示の目的に適した分極化遮断剤は、マクロファージの分極化がM2マクロファージになることを遮断する任意のタイプの再分極化剤であり得る。非限定的な例として、そのような薬剤は、小分子阻害剤、小分子活性化因子、遺伝子、DNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド(ODN)、アプタマー、デンドリマー、コピーDNA(cDNA)、裸のRNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA(ASR)、サイレンサーRNA(siRNA)、長い非コードRNA(lncRNA)、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、デコイ配列、DNAワクチン、RNAワクチン、自己増幅mRNAレプリコン、抗体(ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、単一特異性、二重特異性等)、一本鎖可変フラグメント(ScFv)、Fabフラグメント、Fab'、Fab2、糖類、多糖類、遺伝子療法(CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集等)等であり得る。

本発明を実施するために使用されるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、天然の供給源から単離されるか、合成されるか、又は組換え生成されたポリペプチドであり得る。ペプチド及びタンパク質は、インビトロ又はインビボで組換え発現させることができる。本発明を実施するために使用されるタンパク質、ペプチド及びポリペプチドは、当技術分野で既知の任意の方法を使用して作製及び単離することができる。本発明を実施するために使用されるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドはまた、当該分野で周知の化学的方法を使用して、全体的又は部分的に合成され得る。例えば、Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser.、215-223頁;Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser.、225-232頁; Banga、A.K、Therapeutic Peptides and Proteins、Formulation、Processing and Delivery Systems (1995) Technomic出版社、Lancaster、Pa.を参照のこと。例えば、ペプチド合成は、さまざまな固相技術を使用して実行でき(例えば、Roberge (1995) Science、269:202頁; Merrifield (1997) Methods Enzymol.、289:3-13頁を参照)、自動合成は、例えば、製造業者により提供された取扱説明書に従い、ABI 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer社)を使用して達成されてもよい。

再分極化剤及び分極化遮断剤(例えば、タンパク質、ポリペプチド、遺伝子、DNA、ヌクレオチド配列)の配列は、公的及び商業的に利用可能な供給源から必要に応じて決定できるか、又は当技術分野においてNCBI Genbank及び配列ビューア等から知られている。

ポリヌクレオチドは、さまざまな形態で送達されてもよい。いくつかの実施形態では、裸のポリヌクレオチドを、線状形態で、又は発現プラスミド等のプラスミドに挿入して使用してもよい。他の実施形態では、ウイルス又は細菌ベクター等の生ベクターを使用してもよい。DNAのRNAへの転写及び/又はRNAのポリペプチドへの翻訳を支援する1つ又は複数の調節配列が存在し得る。メッセンジャーRNA(mRNA)分子であるポリヌクレオチドの場合等、場合によっては、転写プロセスに関連する調節配列(例えば、プロモーター)は必要ではなく、タンパク質発現はプロモーターの非存在下で行われてもよい。当業者は、状況に応じて適切な調節配列を含めることができる。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明の組成物が投与される対象においてポリヌクレオチドが発現されることが可能となる調節配列に作動可能に連結される発現カセット中に存在する。発現カセットの選択は、組成物が投与される対象、並びに発現されたポリペプチドに望まれる特徴に依存する。

典型的には、発現カセットには、対象において機能的であり、構成的又は誘導的であり得るプロモーター;リボソーム結合部位;必要に応じて開始コドン(ATG);目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;終止コドン;及び任意選択で3'末端領域(翻訳及び/又は転写ターミネーター)が含まれる。シグナルペプチドをコードする領域等の追加配列が含まれていてもよい。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現カセット内の他の調節配列のいずれかと相同又は異種であってよい。シグナルペプチドコード領域等の目的のポリペプチドとともに発現される配列は、典型的には、発現されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに隣接されるように位置し、適切なリーディングフレームに配置される。発現されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドによって構成されるオープンリーディングフレームは、単独で、又は発現される任意の他の配列(例えばシグナルペプチド)と一緒に、組成物が投与される対象において転写及び翻訳が起こるようにプロモーターの制御下に配置される。

いくつかの実施形態では、再分極化剤又は遮断剤は、M2マクロファージにおけるCRISPR-Cas9アシストカセット交換によるインサイツ遺伝子編集に使用されるCRISPR-Cas9アシストカセットを含む。

組成物は、M2マクロファージを再分極化させるか、又は浸潤している単球及びマクロファージのM2マクロファージへの分極化を遮断するのに有効な量の分極化剤又は遮断剤又は両方の細胞を含む。

担体
別の態様では、本開示は、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物が、薬学的に許容される担体を更に含み得ることを提供する。

選択される担体は、特定の再分極化剤又は遮断剤により、及び/又は投与方法により部分的に決定され得る。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol, A.編(1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒であり、以下が含まれるが、これらに限定されない:リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンザルコニウムクロライド;ベンゼトニウムクロライド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、デキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;ショ糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類;ナトリウム等の塩を形成する対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);並びに/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤。

適切な防腐剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムが含まれてもよい。いくつかの態様では、2つ以上の保存剤の混合物が使用される。保存料又はその混合物は、典型的には、全組成物の約0.0001重量%〜約2重量%の量で存在する。

いくつかの態様における緩衝剤は、組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、並びに他のさまざまな酸及び塩が含まれる。いくつかの態様では、2つ以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤又はそれらの混合物は、典型的には、全組成物の約0.001重量%〜約4重量%の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は既知である。例示的な方法は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott Williams&Wilkins;第21版(2005年5月1日)において詳細に記載されている。

製剤は、水溶液を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組成物の担体は、液体疎水性物質等の疎水性物質の連続相を含んでもよい。連続相は、本質的に純粋な疎水性物質又は疎水性物質の混合物であってもよい。更に、担体は、疎水性物質が連続相を構成するという条件で、疎水性物質中の水のエマルション又は疎水性物質の混合物中の水のエマルションであってもよい。

本明細書に記載される組成物において有用な疎水性物質は、薬学的に許容されるものである。担体は好ましくは液体であるが、常温で液体ではない特定の疎水性物質は、例えば加温によって液化されてもよく、本発明において有用でもある。一実施形態では、疎水性担体は、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。

油又は油中水型エマルションは、本発明での使用に特に適した担体である。油は薬学的に許容されるべきである。適切な油には、例えば、鉱油(特に、ドラケオール(Drakeol)(登録商標)6VR等の軽質又は低粘度鉱油)、植物油(例えば、大豆油)、ナッツ油(例えば、ピーナッツ油)、又はそれらの混合物が含まれる。一実施形態では、油はモンタニド(Montanide)(登録商標)ISA 51として市販されている鉱油溶液中のオレイン酸マンニドである。動物脂肪及び人工疎水性ポリマー材料、特に、常温で液体であるか、比較的容易に液化できるものもまた、使用されてもよい。

組成物が水を含まないリポソーム懸濁液(「水を含まない」(ウォーターフリー))であると記載される本明細書の実施形態では、これらの「水を含まない」組成物の疎水性担体は、水が担体の非連続相に存在することを条件として、依然として少量の水を含んでいる可能性がある。例えば、組成物の個々の成分は、凍結乾燥又は蒸発等のプロセスによって完全に除去されない可能性がある結合水を有することがあり、特定の疎水性担体は、その中に溶解した少量の水を含む可能性がある。一般に、「水を含まない」と記載されている本発明の組成物は、組成物の担体成分の総重量の重量/重量ベースで、例えば、約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%又は0.01%未満の水を含む。

別の態様では、本開示は、再分極化若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物が、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、及びエキソソームとして製剤化されることを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、再分極化若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、及びエキソソームに含まれる。他の実施形態では、再分極化若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、及びエキソソームの表面に含まれる。エキソソームは、Tangら(FASEB J. 2016 9月;30(9):3097〜3106頁)によって記載されているように、対象の炎症促進性単球、末梢血由来単球、及びM1マクロファージから採取してもよい。

リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、及びエキソソームを作製する方法は、当技術分野で周知である。

リポソームは、閉じ込められた水性容量を含む完全に閉じた脂質膜である。リポソームは、単層小胞(単一の二重層膜を有する)又は多層膜二重層に特徴付けられる多層小胞であってよく、各二重層は、水層によってその次と分離されていても、されていなくてもよい。本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「リポソーム」という用語は、「ニオソーム」、「トランスファーソーム」及び「ウイロソーム」として当技術分野で記載されるものを含むが、これらに限定されない、上記のすべての小胞構造を包含するものと意図される。リポソーム粒子の両親媒性構造は、親水性及び疎水性両方の医薬品のカプセル化を可能にする。

リポソームを作製する方法は、当技術分野で周知である。リポソームの一般的な議論は、Akbarzadehら、Nanoscale Research Letters 2013年、8:102頁;Gregoriadis G. Immunol. Today、11:89〜97頁, 1990年;及び、Frezard, F.、Braz. J. Med. Bio. Res.、32:181〜189頁、1999年に見出すことができる。リポソームを作製するための任意の適切な方法が、本発明の実施において使用され得るか、又はリポソームは、商業的供給源から取得され得る。リポソームは、典型的には、脂質二重層を形成するリポソーム成分(例えば、リン脂質及びコレステロール)を、純水又は水に溶解した1つ又は複数の成分の溶液であり得る水溶液で、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、リン酸を含まない生理食塩水、又はその他の生理学的に適合する水溶液で水和することにより調製される。

リポソーム組成物は、例えば、天然脂質、合成脂質、スフィンゴ脂質、エーテル脂質、ステロール、カルジオリピン、カチオン性脂質、及びポリ(エチレングリコール)及び他のポリマーで修飾された脂質を使用することにより、取得され得る。合成脂質には、次の脂肪酸成分を含んでもよい;ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、オレオイル、リノレオイル、エルコイル、又はこれらの脂肪酸の組み合わせ。リポソームの製造に特に適した脂質には、リン脂質、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、(1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)(DOTAP)、1-[2-(オレオイルオキシ)エチル]-2-オレイル-3-(2-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、及びジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)が含まれるが、それらに限定されない。

DOTAPやDOTIM等のカチオン性合成脂質は、腫瘍の血管系及び乳管に親和性を有するカチオン性リポソームの調製に有用である。いくつかの実施形態において、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセルを作製することは、カチオン性合成脂質を使用して調製される。

古細菌脂質から作製されたリポソームを含めて、任意のリポソームを本発明で使用することができるが、少なくとも1つの実施形態では、リン脂質及び非エステル化コレステロールがリポソーム製剤に使用される。コレステロールは、リポソームを安定化させるために使用され、リポソームを安定化する任意の他の化合物がコレステロールを置き換えてもよい。他のリポソーム安定化化合物は、当業者に知られている。例えば、飽和リン脂質は、安定性の増加を示す高い転移温度を有するリポソームを生成する。

リポソームの調製に好ましく使用されるリン脂質は、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン及びホスホイノシトールからなる群から選択される少なくとも1つの頭部基を有するものである。いくつかの実施形態では、リポソームは、94〜100%ホスファチジルコリンである脂質を含む。このような脂質は、レシチンホスホリポン(lecithin Phospholipon)(登録商標)90Gにおいて市販されている。非エステル化コレステロールもリポソーム製剤で使用される場合、コレステロールはリン脂質の重量の約10%に相当する量で使用される。コレステロール以外の化合物を使用してリポソームを安定化させる場合、当業者は、組成物に必要な量を容易に決定することができる。

他の実施形態において、リン脂質(例えば、ホスホリポン(登録商標)90G)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)等のリポソーム成分又はリポソーム成分の混合物は、クロロホルム及びメタノールの混合物等の有機溶媒に可溶化させた後、ろ過(例えば、PTFE 0.2μmフィルター)し、例えばロータリーエバポレーションにより乾燥させて、溶媒を除去する。

得られた脂質混合物の水和は、例えば、脂質混合物を水溶液に注入することによって、又は脂質混合物及び水溶液を超音波処理することによって達成され得る。リポソームの形成中、リポソーム成分は、リポソーム成分が水和される水溶液の容積を囲む単一の二重層(単層)又は複数の二重層(多層)を形成する。

他の実施形態では、リポソームは、連続的な疎水性相を含む担体と組み合わせてもよい。

担体が疎水性物質又は疎水性物質の混合物のみで構成されている場合(例えば、100%鉱油担体の使用)、リポソームは単に疎水性物質と混合させるか、又は複数の疎水性物質がある場合は、任意の1つ又はそれらの組み合わせと混合させてもよい。代わりに、疎水性物質の連続相を含む担体が不連続な水相を含む場合、担体は典型的には、油中水型エマルション等の疎水相中の水相のエマルションの形態をとる。そのような組成物は、エマルションを安定化し、リポソームの均一な分布を促進するために乳化剤を含んでもよい。乳化剤は、担体中のリポソームの均一な分布を促進する目的で、水を含まない担体が使用されている場合であっても有用であり得る。典型的な乳化剤には、オレイン酸マンニド(アーラセル(Arlacel)(商標)A)、レシチン(例えば、S100レシチン)、リン脂質、Tween(商標)80、及びSpans(商標)20、80、83及び85が含まれる。いくつかの実施形態では、疎水性物質の乳化剤に対する体積比(v/v)は、約5:1〜約15:1の範囲である。少なくとも1つの実施形態では、比率は約10:1である。

リポソームは、最終のエマルションに加えてもよいし、乳化前に水相又は疎水相のいずれかに存在してもよい。いくつかの実施形態では、リポソームはその後、例えば、フリーズドライ又は凍結乾燥によって脱水されてもよい。

再分極化剤、遮断剤、又はその両方は、配合プロセスのさまざまな異なる段階で導入してもよい。複数のタイプの再分極化剤又は遮断剤を組成物に組み込むことができる(例えば、抗体及び小分子阻害剤又はsiRNA及びmRNA、ポリペプチド及びRNAワクチン等)。

いくつかの実施形態において、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方は、リポソームの脂質二重層(例えば、リン脂質及びコレステロール)を形成するために使用される成分を水和するために使用される水溶液中に存在する。この場合、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方は、その水性内部に存在するリポソームに封入される。得られたリポソームが洗浄又は乾燥されず、最終的に疎水性物質の連続相を含む担体と混合される残留水溶液が存在する場合、追加の分極化剤又は遮断剤が最終産物のリポソーム外に存在する可能性がある。

関連する技術では、水溶液で水和する前に、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を、リポソームの脂質二重層を形成するために使用される成分と混合することができる。分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を予め形成されたリポソームに添加することもでき、その場合、抗原はリポソームに能動的にロードされるか、又はリポソームの表面に結合するか、又は抗原はリポソームの外部に留まり得る。そのような実施形態では、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方の添加前に、事前に形成されたリポソームは、空のリポソーム(例えば、封入された分極化剤又は遮断剤を含まない)であるか、事前に形成されたリポソームは、リポソームに取り込まれたか、会合した分極化剤又は遮断薬を含み得る。これらの工程は、疎水性物質の連続相を含む担体と混合する前に行ってもよい。

別のアプローチでは、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方は、代わりに、担体がリポソームと組み合わされる前、途中又は後に、疎水性物質の連続相を含む担体と混合されてもよい。担体がエマルションである場合、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を、乳化剤の前に、水相又は疎水性相のいずれか又は両方と混合してもよい。或いは、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を、乳化後に担体と混合してもよい。いくつかの実施形態では、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方は、リポソーム内に存在してもよく、疎水性物質の連続相を含む担体中にも存在してよい。

分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物が追加の治療剤を更に含む場合、追加の治療剤は、上記のように組み合わせてもよい。

スクロース等の糖等の安定剤、アルファ-トコフェロール等の抗酸化剤、又は生物活性を維持するか、化学的安定性を改善して再分極化剤及び遮断剤の保存期間を延長する保存剤をそのような組成物に加えてもよい。他の賦形剤には、塩化ナトリウム(NaCl)及び塩化カルシウム、無水リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等の塩が含まれ得る。

一実施形態では、本発明の組成物を製剤化するために、S100レシチン及びコレステロールの均質混合物(例えば、10:1 w:w)は、再分極化剤又は遮断剤(抗MARCO ScFV、又は抗MARCO抗体、IL-12mRNA、TMP195等)の存在下で、任意選択でリン酸緩衝液中で水和され、再分極化剤又は遮断剤が封入されたリポソームを形成する。その後、リポソーム調製物を、任意選択で手動ミニ押し出し機を通して押し出してもよく、任意選択で追加の治療剤又は造影剤と混合してもよい。その後、この懸濁液を凍結乾燥し、疎水性物質の連続相を含む担体中に復元させ、水を含まないリポソーム懸濁液を形成してもよい。

いくつかの実施形態では、組成物は、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン(0.01mg/ml〜0.2mg/ml)、セファリン(0.005mg/ml〜0.05mg/ml)、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)(例えば、10:1 w:w)からなる群から選択される少なくとも1つの脂質成分と再分極化剤、遮断剤又はその両方との均質混合物を、任意選択でリン酸緩衝液中で、水和させて、再分極化剤、遮断剤又はその両方で封入されたリポソームを形成することにより製剤化してもよい。

他の実施形態では、組成物は、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン(0.01mg/ml〜0.2mg/ml)、セファリン(0.005mg/ml〜0.05mg/ml)、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)(例えば、10:1 w:w)からなる群から選択される少なくとも2つの脂質成分の均質混合物を、と再分極化剤、遮断剤又はその両方の存在下で、任意選択でリン酸緩衝液中で、水和させて、再分極化剤、遮断剤又はその両方で封入されたリポソームを形成することにより製剤化してもよい。

いくつかの実施形態では、組成物は、ジオレオイル-ホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールの均質混合物(例えば、10:1 w:w)を、再分極化剤、遮断剤又はその両方の存在下で、任意選択でリン酸緩衝液中で、水和させ、再分極化剤、遮断剤、又はその両方で封入されたリポソームを形成することにより製剤化してもよい。

一態様では、本開示は、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物がナノ粒子として製剤化されることを提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子等は、脂質ナノ粒子(修飾されたリポソーム等)であってもよい。ナノスケールで修飾されたリポソームは、DNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、タンパク質、及び化学療法剤の送達のための優れた薬物動態プロファイルを持つことが示されている。したがって、いくつかの実施形態では、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方が脂質ナノ粒子に含まれる。他の実施形態では、分極化剤若しくは遮断剤又はその両方は、ナノ粒子(例えば、実施例1に示されるような脂質被覆ナノ粒子等の脂質粒子)又はリポソームの表面にロードされる。

他の適したナノ粒子には、ポリマーナノ粒子(例えば、ポリラクチド-ポリグリコリドコポリマー、ポリアクリレート及びポリカプロラクトン等の生分解性合成ポリマー、又はアルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン及びキトサン等の天然ポリマーを使用して製造される)、ポリマーミセル、ヒドロゲルナノ粒子、デンドリマー、貴金属ナノ粒子(金ナノ粒子等)等が含まれる。

いくつかの実施形態では、組成物は、約900、800、700、600、500、400、300、200、及び100nmのいずれか以下等、約1000ナノメートル(nm)以下の平均径又は平均直径を有するナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約200nm以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約150nm以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約100nm以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約20〜約400nmである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約40〜約200nmである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は無菌濾過可能である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子-及びリポソーム-応答性ポリマー、又はヒドロゲルからの再分極化剤及び遮断剤の放出は、pH、温度、高周波又は磁場の変化により誘発され得る。

一態様では、本開示は、ナノ粒子及びリポソームが標的特異的薬物送達のために製剤化されることを提供する。そのような標的特異性は、ナノ粒子及びリポソームを、M2マクロファージを標的とする1つ又は複数の細胞標的化剤とコンジュゲートすることによってもたらされる。本発明の目的に適した細胞標的化剤は、任意のM2マクロファージ選択的細胞表面分子であり得る。本開示は、ナノ粒子及びリポソームが、1つ又は複数のM2マクロファージ選択的細胞表面分子でコーティングされることを提供する。当業者は、M2マクロファージ選択的細胞表面分子がM2マクロファージ上で独占的に存在し得るが、非M2マクロファージ上にも存在し得ることを認識するであろう。しかしながら、適したM2マクロファージ選択的細胞表面分子は、M2マクロファージで独占的に発現される分子、又は非M2マクロファージよりもM2マクロファージでより高いレベルで発現される分子である。本発明の目的に適したM2マクロファージ選択的細胞表面分子には、IL-13Rα、CD163、CD206、CD200R、MerTK、スカベンジャー受容体A、スカベンジャー受容体B、MARCO、及びF4/80が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に記載されるナノ粒子は、(凍結乾燥組成物等の)乾燥製剤中に存在してもよく、又は生体適合性媒体中に懸濁されてもよい。適した生体適合性媒体には、水、緩衝水性媒体、生理食塩水、緩衝生理食塩水、任意選択でアミノ酸の緩衝液、任意選択でタンパク質の緩衝液、任意選択で糖の緩衝液、任意選択でビタミンの緩衝液、任意選択で合成ポリマーの緩衝液、脂質含有エマルション等が含まれるが、これらに限定されない。

ナノ粒子は、当技術分野で知られている任意の方法で調製することができる(Palら、Journal of Applied Pharmaceutical Science 01(06); 2011年:228〜234頁; Hu Yら、Nanoparticles. Nano Letters、2007年; 7巻:3056〜3064頁; Hu YHら、Biomacromolecules、2009年;10巻:756〜765頁; Lynn DM、Langer R.、Journal of the American Chemical Society、2000年;122巻:10761〜10768頁を参照のこと)。

分極化剤及び遮断剤の添加は、既知の任意の適切な手段によって、もたらされてもよい。非限定的な例として、Goncalvesら、Suらによって記載されるように、DNA配列は、線状又はプラスミド及びカセットとして、リポソーム、微粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、及びエキソソームに加えられてもよい。

本開示は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの脂質対核酸比(LNR)が30:1〜2.5:1の範囲であることを提供する。いくつかの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、25:1〜5:1の範囲である。少なくとも1つの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、20:1〜10:1の範囲である。

本開示は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの脂質対タンパク質比(LPR)が30:1〜1:1の範囲であることを提供する。いくつかの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、25:1〜5:1の範囲である。少なくとも1つの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、20:1〜10:1の範囲である。

本開示は、本発明のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの小分子薬物対脂質(D/L)比が、典型的には、脂質mgあたり少なくとも0.05、0.1、0.2、0.35、0.5、又は少なくとも0.65mgの薬物であることを提供する。モル比に関して、本発明によるD/L比は、脂質モルあたり少なくとも約0.02から約5、少なくとも0.1から約2、及び約0.15から約1.5モルの薬物である。

一態様では、本開示は、分極化剤若しくは遮断剤、又はその両方を含む組成物が、造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含むことを提供する。適した造影剤は、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び金属タンパク質ベースのMRIプローブ等の他の磁気レポーター遺伝子である。本明細書に開示される造影剤、色素及びコントラスト剤の追加は、本明細書に開示される組成物の乳管内送達及びこれらの組成物を貪食するマクロファージの遊走を追跡するという追加の利点を提供する。

別の態様では、本開示は、分極化剤若しくは遮断剤、又はその両方を含む組成物が追加の治療剤を更に含むことを提供する。そのような追加の治療薬は、乳房障害の治療に有用な任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、チェックポイント阻害剤、抗ホルモン剤、ステロイド、アントラサイクリン、甲状腺ホルモン補充薬、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル又はカルボプラチン及びPEG化リポソームドキソルビシン等)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、キメラ抗原受容体/ T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、並びにその他の養子細胞療法の1つ又は複数である。

いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、タモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、若しくはCH498、アナストロゾール、エキセメスタン並びにレトロゾールからなる群から選択される抗ホルモン剤の1つ又は複数である。

いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗PD-1(ニボルマブ等)、抗PD-1L(アテゾリズマブ(MPDL3280等)、アベルマブ(MSB0010718C)、デュルバルマブ、MDX-1105)、抗CTLA4(例えば、イピリムマブ)、抗LAG-3(IMP321、BMS-986016、GSK2831781等)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイント阻害剤を含むチェックポイント阻害剤の1つ又は複数である。

いくつかの実施形態では、組成物はデポー製剤として製剤化される。

本明細書に開示される組成物は、対象の乳管への乳管内投与に適している。

送達のモード;デバイス
一態様では、本開示は、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物が、当技術分野で既知の方法のいずれかによって対象の1つ又は複数の乳管に乳管内送達され得ることを提供する。これらには、注射器/針(Krauseら、J. Vis. Exp.、2013年;(80):50692頁);カニューレ、カテーテル、プローブ、及び米国特許第6,413,228;6,689,070;6,638,727号、特許出願PCT/US2015/010808)に開示されているもの、徐放性カプセル並びにカプセル化デバイス等を使用する注射が含まれるが、これらに限定されない。

非限定的な例として、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞又は組成物は、 (a)デバイスの治療チャンバー内に含まれる改変細胞を含む組成物を乳房の乳首と接触させること;及び(b)組成物に陽圧を加えることを含めて、対象の母乳管に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、陽圧のために乳管に押し込まれる。好ましくは、組成物は1つ又は複数の乳管に押し込まれる。他の実施形態では、組成物は、2〜5個の乳管、4〜8個の乳管、又は7〜11個の乳管に押し込まれる。

例えば、米国特許第6,413,228号は、管液を収集し、管に洗浄液を注入することができる管アクセスデバイスを開示している。このようなデバイスは、本発明の組成物の乳管内送達のためのこの開示の目的のために、適切に適合又は構成され得る。

いくつかの実施形態では、デバイスはカニューレ又はマイクロカニューレである。

乳管内投与の別の方法として、管領域への改変細胞のゆっくりとした連続投与のために、管にアクセスするように、小さなポンプを管の内又は乳首の表面に設置してもよい。例えば、ポンプは、改変された細胞をそこに投与するために乳管洞に設置され、残りの管への細胞の拡散を引き起こさせてもよいし、又はポンプは、管へアクセスするように乳首の表面に設置されてもよい。乳首表面に設置されたポンプは、例えば、タック(又は上部又はタック部分を有する指ぬき形状の部分及び乳首表面の残りが治療を必要とするか治療を必要とするリスクがある管に伸びている部分のような形状にすることができる。ポンプ機構は、例えば、Johnson&Johnson社により買収されたAlza社により製造されたDuros(商標)浸透圧(マイクロ)ポンプ(Viadur)、IntelliDrug、Alzet(登録商標)(Durect社)、Ivomec SR(登録商標)ボーラス等(Herrlichら、Advanced Drug Delivery Reviews、2012年、1617〜1626頁)を含むことができる。

浸透圧ポンプはまた、本質的に米国特許第5,531,736号、米国特許第5,279,608号、米国特許第5,562,654号、米国特許第5,827,538号、米国特許第5,798,119号、米国特許第5,795,591号、米国特許第4,552,561号、又は米国特許第5,492,534号に記載されるポンプと実質的に同様に、乳房の管への投与、例えば、管への配置(例えば、乳管洞)のため、又は乳首表面への配置のためのサイズ及び容量の適切な変更を伴って、組み立てられるか、又は構成することもできる。(管にアクセスする)チップは、乳首表面のさまざまな位置の管に対応するために回転することが可能であってもよい。単一のタックヘッドポンプは、特定の管にアクセスするために、タックヘッドの下に、例えば、乳房の2つ以上の管にアクセスする必要がある場所に、1つ又は複数のチップを配置できる。このように構成され、乳管内投与のための分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む適切に製剤化された組成物をロードしたポンプは、記載の組成物を投与することができるが、乳管における前がん又はがん状態の治療のための適切な治療目的のために本明細書に開示された組成物以外の薬剤も含有及び投与することができる。おそらく、ポンプは、サイズ及び容量の変更とともに、乳房にあるすべての管に投与されるように構成されてもよい。

カプセル化デバイスは別の魅力的な方法であり、マイクロカプセル化及びマクロカプセル化デバイスが含まれる。栄養素や治療薬の選択的な透過を可能にする合成半透性ナノポーラス膜で細胞を取り囲むことにより、細胞が免疫隔離される自己折りたたみ式免疫保護カプセル化デバイスが開発されている。そのようなカプセル化デバイスには、細胞が収容されるポーチ、繊維、ビーズ、及び半透性材料から作製される任意のデバイスが含まれる。そのようなデバイスは、療法用に構成されてもよく、例えば、管の内部に細胞を放出するような生分解性材料で調製されてもよい。

本発明の目的のための有用なデバイスは、埋め込み可能であり得る。例えば、Stephanらは組成物の送達のための生体高分子インプラントを記載している(Stephanら、Nature Biotechnology、2015年、33巻、97〜101頁)。一態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、カニューレ、マイクロカニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、ビーズ、カプセル化デバイス等の埋め込み可能なデバイスである。埋め込み可能なデバイスは、例えば本発明の細胞及び組成物を患部組織の近くに放出し、それらの正常細胞への曝露を低減するように構成され得る。

別の態様では、本明細書に開示される組成物の乳管内送達は、乳房の管への及び/又は管の内部での細胞の移動を助ける乳房への電流の印加を含むイオン導入法で支援されてもよい。

投薬
本明細書に開示される組成物の投与のタイミング及び規模は、一般的に、リスクを低減し、又は毒性結果を最小化し、及び/又は効力を改善するように、例えば、経時的等、より速くかつ増加した対象の組成物への曝露を提供するように設計される。投与の量及び頻度は、患者の状態、年齢、体重、腫瘍サイズ及び病期、表面積、並びに対象の疾患の重症度等の要因によって決定されるが、適切な投与量は主治医によって決定されてもよい。

最適な投与量及び投薬計画は、疾患の兆候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することで、医学分野の当業者により容易に決定することができる。組成物はこれらの投与量で複数回投与することができる。したがって、本方法は、一定期間にわたる単回用量又は複数回用量、又は例えば、注入による連続用量を包含することができる。いくつかの実施形態では、用量は、単一の単位用量であり得る。他の実施形態では、単回用量は分割単位用量であり得る。本明細書で使用される場合、「分割単位用量」という用語は、1日間に複数回にわたって投与されるように分割される単位用量を指し、1日を超えるものを含む。本発明の目的のための分割単位用量は、単一の、すなわち1単位用量と見なされる。用量を分割する例示的な方法には、初日に用量の25%を投与し、残りを翌日に投与することが含まれる。別の実施形態において、単位用量は2つに分割されてもよく、それぞれ50%が2連続日に送達され得る。さらなる他の実施形態では、分割単位用量は、隔日で与えられてもよい。なお他の実施形態では、単位用量を3つに分割して、3連続日に等しく投与することができる。

一態様では、本発明は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びエキソソームのいずれかを含む組成物が、単位用量あたり1×10⁴〜1×10⁸のリポソームマイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はエキソソームの濃度で乳管内投与されることを提供する。

本明細書に開示される方法は、初回用量を受けた可能性のある対象の乳管に細胞の1つ又は複数の連続用量を投与すること、及び/又は初回及び1つ又は複数の後続用量を投与することを包含する。用量は、特定の量で、特定のタイミングスケジュール及びパラメーターに従って投与される。

別の態様では、初回用量は乳管内投与され、任意の後続用量は、乳管内投与、注射及び注入、例えば、静脈内又は皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、トランス中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、サブコンジェクトバル(subconjectval)注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、又はポステリアジャクスタスクレラル(posterior juxtascleral)送達を含む、任意の適した手段により投与される。いくつかの実施形態では、それらは、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望ましい場合は、病変内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、胸腔内、頭蓋内、又は皮下投与が含まれる。

いくつかの実施形態では、本方法は一般に、本明細書に開示される組成物の初回用量を乳管内投与することを包含し、それにより疾患の負担を軽減する。この後に、初回用量に対して特定時間帯に投与される組成物の後続用量、又は初回用量を受けた対象への後続用量の投与が続いてもよい。いくつかの実施形態での初回用量は比較的低い。投与される組成物の量及び組成物の用量のタイミングは、免疫抑制の減少、腫瘍サイズの減少、及び炎症促進性サイトカインの増加、ケモカイン、M1-マクロファージへのM2再分極化、細胞傷害性Tリンパ球の動員等の1つ又は複数の結果を改善するように設計される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、初回/最初の用量よりも数が増加した、したがってより高い用量での組成物の後続用量の投与を包含する方法である。

投薬計画が複数回用量を包含する場合、各用量は、毎日、1日数回(2回、3回、4回等)、隔日、2日ごと、3日、5日、7日、14日、15日、28日、毎月、四半期、6月、及び毎年投与されてもよい。

いくつかの態様では、最初の用量後の用量のタイミングは、最初の(初回)用量の開始から次の用量の開始まで測定される。他の実施形態では、最初の用量後の用量のタイミングは、最初の(初回)用量の完了から測定される。

本発明は、最初の用量が分割単位用量であり、その後に投与される第2用量が続いてもよいことを包含する。いくつかの実施形態では、第2又は後続用量は分割単位用量であってもよい。非限定的な例として、分割単位用量は、3日間にわたって投与してもよく、第2の単位用量をその翌日に投与するか、又は1年後に投与してもよい。最初の用量は、対象が細胞療法の用量を受けたことがないこと、又はなお、対象が以前に同じ組換え受容体を発現する、又は同じ抗原を標的とする同じ細胞の用量を受けたことがないことを暗示することによって、そのような用量を必要とする対象に関して、何らかの制限を生じさせることを意図している。

一般に、本明細書に記載の組成物は、単位用量あたり1×10⁴〜1×10⁸のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はエキソソームのいずれかで乳管内投与することができる。

併用療法
本発明は、本明細書に開示される乳管内送達方法が更に併用療法を含むことを企図する。一態様では、乳管内送達方法は、対象に1つ又は複数の追加の治療剤又は療法を投与することを更に含む。追加の治療薬は、乳管内、局所、経口、経鼻、注射又は注入による非経口、皮下等を限定無く含む、当技術分野で既知の任意の適した手段によって対象に投与することができる。追加の治療薬は、本明細書に開示される組成物に含まれても、独立して製剤化されてもよい。治療剤及び/又は療法の投与の順序は、任意の投与の順序であってもよい。例えば、本明細書に開示される組成物は、追加の治療剤と同時投与されてもよいし、又は追加の治療剤は、最初に投与されてもよいし、又は追加の治療剤は、本発明の組成物が投与された後に投与されてもよい。

追加の治療薬は、本発明の目的に有用な任意のものであり得る。

例示的な追加の治療薬には、チェックポイント阻害剤、抗ホルモン剤、ステロイド、アントラサイクリン、甲状腺ホルモン補充薬、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル又はカルボプラチン及びPEG化リポソームドキソルビシン等)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、キメラ抗原受容体/ T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、並びにその他の養子細胞療法が、限定無く含まれる。

追加の療法には、手術、放射線、化学療法、鍼治療、非経乳頭養子細胞療法等が含まれる。本明細書に開示される方法は、一次療法、ネオアジュバント療法(例えば、手術(乳房切除術や乳腺腫瘤摘出術等)又は化学療法の前)、又はアジュバント療法(例示目的のみ、化学療法又は養子細胞療法の他の方法での治療の後)として使用してもよい。

製品
養子細胞療法のための本明細書に開示される細胞及び組成物の投与のための、並びに細胞及び組成物の貯蔵及び投与のための、キット及びデバイス等の製品も本明細書に提供される。

製品には、本明細書に開示される組成物、1つ又は複数の容器、包装材料、及びラベル又は対象への細胞の投与についての指示を一般に含む添付文書が含まれる。

容器は、投与される組成物の1つ又は複数の単位用量を含む。いくつかの実施形態では、製品は、各々が組成物の単一の単位用量を含む、1つ又は複数の容器を含む。単位用量は、初回用量に対象に投与されるリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びエキソソームのいずれかの量又は数であってもよく、又はナノ粒子、リポソーム等の初回又は後続用量に投与される数の2倍(又はそれ以上)であってもよい。投与方法に関連して対象に投与されるのは、ナノ粒子、リポソーム等の最低用量又は最低可能用量であってもよい。

いくつかの実施形態では、各容器は、同じか又は実質的に同じ数のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びエキソソームのいずれかを含む組成物の単位用量を個別に含む。したがって、いくつかの実施形態では、各容器は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びエキソソームのいずれかと同じか、又はおよそか、又は実質的に同じ数を含む。いくつかの実施形態では、単位用量は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、エキソソームのいずれかを1×10⁴以上含む。いくつかの実施形態では、単位用量は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びエキソソームのいずれかの1×10⁴〜1×10⁸を含む。

いくつかの実施形態では、製品は、チェックポイント阻害剤、抗ホルモン剤、ステロイド、アントラサイクリン、甲状腺ホルモン補充薬、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル又はカルボプラチン及びPEG化リポソームドキソルビシン等)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、並びにその他の養子細胞療法等の追加の治療薬を更に含む。抗ホルモン剤は、タモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652からなる群から選択することができる。

いくつかの実施形態では、製品は、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子からなる群から選択される造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含む。

適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び輸液バッグ等の可撓性バッグが含まれるが、これらに限定されない。容器は、ガラス又はプラスチック等のさまざまな材料から形成されてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、例えば、経乳頭送達のために並びに/又は細胞培養及び/若しくは貯蔵バッグ又は他の容器等の他の容器への又は他の容器からの輸送目的の接続のために、例えば、チューブ挿入又はカニューレ挿入を1つ又は複数のチューブに接続するための、1つ又は複数のポート、例えば、無菌アクセスポートを有する。

製品は更に、1つ又は複数の識別情報及び/又は使用指示を有する添付文書又はラベルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、情報又は指示は、内容物が乳房障害を治療するために使用できるか又は使用すべきであること、及び/又はそのための指示を提供することを示す。ラベル又は添付文書は、製品の内容物が乳房障害の治療に使用されることを示していてもよい。いくつかの実施形態では、ラベル又は添付文書は、例えば、提供される方法の実施形態のいずれかに従って、細胞の初回及び1回以上の後続用量の乳管内投与を含む方法を介して、対象、例えば乳房障害を有する対象を治療するための指示を提供する。いくつかの実施形態では、取扱説明書は、初回用量での1回の単位用量、例えば、製品中の単一の個々の容器の内容物の投与を指定し、その後、指定された時点又は指定された時間範囲内及び/又は対象の1つ又は複数の要因又は結果の有無又は量又は程度の検出後に1回以上の後続用量が続く。

本明細書で使用される場合、「a」、「an」、及び「the」という用語は、文脈が他を指示しない限り、複数の参照を含む。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、量、時間的期間等の測定可能な値を指し、指定された値から±20%、いくつかの例では±10%、又はいくつかの例では±5%、いくつかの例では±1%、及びいくつかの例では±0.1%の変動を包含することを意味する。それは、そのような変動は開示された方法を実行するために適切であるからである。

本明細書で使用される「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されている細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能とも関連している可能性がある。「活性化T細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているT細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「アジュバント療法」は、一次療法に続く、再発のリスクがある対象に投与される療法を指す。これらは、乳房障害の病歴を有し、別のモードの療法で治療された対象である。乳がんの場合のアジュバント全身療法は通常、再発を遅らせ、生存期間を延ばし、又は対象を治癒させるために、一次療法の直後に始められる。本明細書で使用される場合、「一次療法」は、対象における乳房障害の最初の診断時の治療の第一線を指す。非限定的な例示的一次療法は、手術、広い範囲の化学療法、及び放射線療法を含み得る。

本明細書で使用する場合、「対象」、「患者」、及び「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒト等の哺乳動物を指す。哺乳動物には、イヌ、ネコ等のペット動物、ラット、マウス等の実験動物、及びウシやウマ等の家畜も含まれる。他に指定しない限り、哺乳類は任意のジェンダー又は性別であってよい。

本明細書で使用する場合、本開示の「投与経路」又は「送達経路」組成物は、本開示の組成物を対象に送達するための経路を指す。

(実施例1)
脂質被覆ナノ粒子の合成
脂質被覆ナノ粒子の調製。poly-1コアを含む脂質被覆ナノ粒子は、Suらによって記載されるように合成される(Molecular Pharmaceutics 8巻、3号(2011年6月6日):774〜787頁)。簡潔に述べると、poly-1コアを含む脂質被覆ナノ粒子は、2つの異なるプロセス:二重エマルション/溶媒蒸発アプローチ又は溶媒拡散/ナノ沈殿ストラテジーを介して合成される。二重エマルション合成については、30mgのpoly-1(又はpH非感受性対照粒子の場合はPLGA)及び7:2:1のモル比のリン脂質DOPC、DOTAP、及びDSPE-PEGの2mgが1mlのジクロロメタン(DCM)中に共溶解される。次に、200μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、プローブチップソニケーター(Misonix XL2000、Farmingdale、NY)を使用して7Wで1分間超音波処理段階の間に、氷上で混合物に追加して、最初のエマルションを形成する。次に、一次エマルションを、6mlの蒸留脱イオン化ヌクレアーゼフリー水に12Wで5分間の超音波処理とともに分散させた後、シェーカーに25℃で18時間置いて、有機溶媒を蒸発させる。ナノ沈殿合成については、同じ量のDOPC、DOTAP、及びポリマーを4mlのエタノールに共溶解し、40mlの蒸留脱イオン化ヌクレアーゼフリー水に滴下して加え、その後、5時間穏やかに攪拌して、エタノールを蒸発させる。DSPEは、挿入後プロセスを介して脂質コーティングに導入される:DSPE脂質は、蒸留脱イオン化ヌクレアーゼフリー水中に1mMで0.5mg/mlの粒子に添加され、懸濁液は25℃で16時間攪拌される。粒子は回収され、遠心分離により1回洗浄され、新鮮な水に再懸濁され、使用するまで4℃で保存される。無脂質PVA安定化粒子は、有機エマルション又はポリマーのみを含む溶液が2% w/vol PVA水溶液に分散されることを除いて、同様のプロセスにより調製される。

各粒子バッチの分画を真空オーブンで乾燥させ、乾燥質量を測定して粒子濃度(mg/ml)を決定する。動的光散乱(DLS)及びゼータ電位の測定は、ZetaPALS動的光散乱検出器(Brookhaven Instruments社)を使用して粒径及び表面電荷を決定するために使用される。取り込まれた脂質の割合及び脂質表面コーティングに存在する脂質の得られたモル%を見積もるために、脂質被覆粒子は、カルボキシフルオレセイン標識DSPE脂質(DSPE-CF)の挿入後の前に、粒子に取り込まれた脂質の総量を測定するために、上記のナノ沈殿に1モル%のDOPE-ローダミンをトレーサーとして添加して調製される。次に、2%トリトンX-100で15分間処理することにより、脂質を粒子表面から取り除き、上澄みを、ローダミン及びフルオレセインの両方のシグナルについて測定して、取り込まれた脂質の量を定量する。

脂質被覆ナノ粒子の表面構造を極低温電子顕微鏡法(cryoEM)で調べるために、粒子懸濁液(3uL)を1.2/1.3μmの穴あき炭素被覆銅グリッド(電子顕微鏡科学)上にブロットし、Leicaプランジ冷凍機を使用して、液体エタン中で試料をすぐに冷凍し、粒子を氷中に埋め込む。試料を極低温ホルダーに移し、JEOL 2200FS透過型電子顕微鏡を使用して、放出電流185μA、倍率40000倍で画像化する。

IL-12mRNAナノ粒子の調製。合成IL-12mRNAは、Kavanaughらによって記載された方法を使用して調製される(Blood、2006; 107:1963〜1969頁)。簡潔に述べると、T7プロモーター、オープンリーディングフレーム(GFP、811ヌクレオチド又はホタルルシフェラーゼ、1714ヌクレオチド)、及びpoly-Aテールを有する線状化プラスミドDNAが、Message Machine T7 Ultra転写キット(Ambion社)を使用したインビトロ転写の鋳型として使用される。

代替的には、増強GFP(EGFP)は、インビトロmRNA転写(IVT)に使用されるpGEM4Z/EGFP/A64ベクターのIL-12遺伝子に置き換えられる。柔軟なリンカー(InvivoGen社、San Diego、CA、USA)によって結合されたIL-12のp35及びp40サブユニットを含むIL-12elastiカセットが使用される。このコンストラクトは、両サブユニットの同等の発現を提供し、IL-12p70のアンタゴニストとして機能するp40の過剰発現及びp40ホモダイマーの生成を防ぐ。

mRNA産物はLiClで沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、NanoDrop分光光度計で定量する。RNAのサイズ、純度、完全性はAgilient Bioanalyzer 2100で確認される。これらのmRNA転写物でエレクトロポレーションされたRMA細胞株は、これらのmRNAの機能をインビトロで確認するためにも使用される。製造業者のプロトコルに従って、Label IT(登録商標)核酸標識キット(Mirus Bio LLC社)を使用して、mRNAを蛍光Cy3タグで標識する。

RNAのローディング及び放出。最初にヌクレアーゼフリー水で粒子懸濁液を1.5mg/mlに希釈し、次に200μlの希釈懸濁液を穏やかなボルテックスの下で、4μgのRNAを含む100μlに滴下して加えることにより、IL-12mRNAが脂質被覆ナノ粒子の表面にロードされる。次に、ローテーター上にバイアルを4℃で2時間インキュベートして、RNAを吸着させる。結合したRNAは、蛍光プレートリーダー(SPECTRAmax、Molecular Devices社)を使用して粒子を遠心分離した後、上清に残っているCy3標識又はリボグリーン染色RNAの蛍光を測定することによって間接的に決定される。粒子に結合したRNAは、上清で検出されたRNAの量を、RNA溶液を含むが粒子を含まない同一に処理された対照バイアルで測定された量から差し引くことによって決定される。粒子の結合速度と能力を評価するために、粒子濃度を適した濃度(例えば、1mg/ml)に固定する一方で、結合時間とRNA量を変化させる。結合効率は、粒子に結合した溶液中に最初に存在するRNAのパーセンテージとして定義される。ローディングは、粒子のmgあたりのRNA結合量(μg)として定義される。

結合RNAの放出動態は、Suらによる記載のように決定される(Molecular Pharmaceutics 8巻、3号(2011年6月6日):774〜787頁)。10%FBSを含むRPMI 1640培養液中のナノ粒子からの結合RNAの放出動態を決定するためには、粒子吸着ポリI:C(1.87μgポリI:Cを含む70μg粒子)のアリコートを140μlの血清含有培地に再懸濁し、穏やかな混合の下、37℃でインキュベートする。各指定時点で、アリコートを取り除き、粒子をヌクレアーゼフリー水で1回洗浄してから、消化緩衝液(100mM酢酸ナトリウム、2%トリトンX-100及び1mg/ml Poly(L-アスパラギン酸))に再懸濁して粒子を溶解し、任意の脂質-RNA又はpoly-1-RNA複合体を破壊する。その後、粒子に残存するRNA量は、上記のようにリボグリーンで染色した後の蛍光を測定することによって決定され、放出されたRNA量は、元の量から残存RNA量を差し引くことによって計算される。

(実施例2)
再分極化剤IL-12の乳管内投与。
乳首の準備。対象が脱衣した後、臨床医は研究する乳房の乳首をクリーニングする。これには、わずかな粒状のゲル又は軟膏で乳首をきれいに拭いて、死んだ皮膚細胞及び蓄積した油を緩めて除去することが含まれる。これは病院で医療前によく使われるクレンザーのことである。その後、乳首に何らかの麻酔クリームを塗布する。

乳首麻酔。0.1〜0.2mLの青色色素と混合した1mLのリドカインを非常に小さな針で乳首の根本に注入する。

管識別。色素の注射後、カテーテル配置の前に、管開口部を更に識別して拡張するために、小さな柔軟なワイヤーを開口部に約1/2インチ挿入する。管が識別されたら、結び目を付けた縫合糸の小片を管に挿入して、それをマークする。これは、少なくとも3つの管開口部に行われ、5つほど行われる。臨床医が少なくとも3つの管開口部を見つけることができない場合は、対象は研究を続けることができず、中断される。これらの対象は新しく登録された対象に置き換えられる。

カテーテル配置、ナノ粒子の滴下注入(IL-12)、及びX線検査。すべての乳頭管開口部がマークされると、臨床医は、各マークされるようマークされた乳管に、管口からカテーテルを挿入して配置させる。カテーテルが設置されたなら、臨床医は任意選択でゆっくりと(30秒以上)1mL未満の放射線不透過性色素を管に滴下注入し、管を画像化させてもよい。

色素の滴下注入後、同定された管の数に応じて、IL-12ナノ粒子の懸濁液(1X106)を最大2mLまで(通常0.5〜2mLの範囲)ゆっくりと(1分以上)各管に注入する。浸潤がんを含む乳房のみが治療される。細胞は、治療すべき管の数に応じて、バッチ又はセットで最大10mLまでの容量で、発症した乳管に乳管内投与される。同定された発症した管又は小葉の数に基づいて、管ごとに用量を均等に分配する試みがなされる。

カテーテルは通常、各管の内におよそ1〜5分間留める。処置中、対象は視覚的アナログスケールを使用して痛みを評価するよう問われる。色素及びナノ粒子が滴下注入された後、管内への改変細胞の適切な注入を示すために画像が撮られる。発症した管の数が2管より多い場合、乳管内療法の手順はセットで行われてもよい。カテーテルは、最初の管のセット、例えば隣接する2つの管から取り除かれ、これらの管は各々、結んだ縫合材料の小片でマークされる。この時点で、痛み評価用の痛みスケールを使用して対象の痛みを評価する。

その後、マークされた残りの管に新しいカテーテルが挿入される。次の半分の乳首管にカニューレを挿入し、色素と細胞を注入した後、フルオロスコープで別の画像を撮影して、管を記録する。対象は再び痛みを評価するよう問われる。カテーテルが取り除かれ、管は結んだ縫合材料の小片で個別にマークされる。ベンゾイン軟膏と透明なプラスチックドレッシング(生体閉塞性)を乳首に付けて、手術までマーカーを固定する。全体の手順は0.5〜1.5時間かかる。手順の写真が撮られる。

痛みの評価中に対象が乳房のグレード3又は4の痛みを報告し、IL-12を含むナノ粒子の注入後10分以内にそれが解消しない場合、その対象についての研究関連手順は中止される。本明細書に記載される採血及び追跡評価並びに病理学的評価は、プロトコルに従って行われる。この場合、統計上の目的で、研究グループの対象は置き換えられる。

最初のX線検査の穿孔が認められない場合は、副作用が直ちに評価される。対象が有害な影響を報告しなければ、残りの管にカニューレが挿入され、ナノ粒子が投与される。研究に関連する採血と評価、及び以下で記載する病理学的評価は、プロトコルごとに実行される。

インビトロアッセイ-サイトカイン放出。対象の血清サイトカインレベルを測定して、対象のTAMの炎症状態の変化を決定する。IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、IL12、IL17A、IFNγ、TNFα、及びGM-CSFの血清サイトカインレベルは、Qiagen社、Germantown、MDから市販されているヒト炎症性サイトカイン多検体ELISArrayキットMEH-004Aを使用して、ナノ粒子の乳管内送達前、0日目で、及びナノ粒子の乳管内投与後、4時間、8時間、12時間、24時間、36時間、48時間、及び72時間でアッセイされる。IL-13分泌の変化は、Miltenyi Biotec及びThermo Fischer等の市販のIL-13分泌ELISAアッセイや、R&D Biosystems社からのヒトIL-13Luminexパフォーマンスアッセイを使用して決定される。サイトカイン分泌は、アッセイの線形範囲になるように希釈されたサンプルで測定される。時間依存性に増加する炎症促進性サイトカイン及びケモカインのレベルは、対象におけるM1様炎症促進性マクロファージの増加の指標となる。IL-4、IL-13及びIL-10レベルの時間依存性の減少は、M2マクロファージの数及び/又は活性の減少の指標となる。

本発明の前述の議論は、例示及び説明の目的で提示されたものである。上記は、本発明を本明細書に開示された形態に限定することを意図するものではない。本発明の記載は、1つ又は複数の実施形態及び特定の変形及び変更の記載を含むものであるが、他の変形及び変更は、例えば、本開示を理解した後の、当業者の技術及び知識の範囲内であり得るように、本発明の範囲内であり得る。代替、交換、及び/又は同等の構造、機能、範囲、又は工程は、そのような代替、交換、及び/又は同等の構造、機能、範囲、又は工程が本明細書に開示されているか否かにかかわらず、請求されるものについて許される範囲で代替の実施形態を含む権利を取得することを意図しており、特許性のある主題を公に捧げることを意図していない。

本明細書に開示されるエンドキシフェン遊離塩基及びその塩を含む組成物は、合成的に調製されたエンドキシフェン並びに単離されたエンドキシフェンを用いて調製されてもよいことが理解されるべきである。更に、対象の投薬は、組成物中に存在する(Z)-エンドキシフェンの量に基づくことを理解されたい。

本明細書で参照されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願の各々が、参照によりその全体が取り込まれることが具体的及び個別に示されている場合と同じ程度に、その全体が参照により取り込まれる。

排他的所有権又は特権が請求される本発明の実施形態は、以下に規定される。

Claims

M2分極化マクロファージを再分極化させることができる再分極化剤、若しくはマクロファージのM2分極化を遮断することができる遮断剤、又はその両方を含む組成物を、対象に乳管内送達することを含む、乳房障害を有する対象を治療する方法。
乳房障害を有する対象における化学療法に対する感受性の増加を促進する方法であって、再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を対象に乳管内投与することを含み、組成物の投与が化学療法に対する感受性の増加を促進する、方法。
再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物を対象に乳管内投与することを含む、乳房障害を有する対象におけるM2マクロファージの選択的減少のための方法。
M2マクロファージ表現型が、M2a表現型、M2b表現型、及びM2c表現型、又はそれらの組み合わせのいずれか1つ又は複数である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物の乳管内投与が、
a. M2マクロファージの減少;
b. M1マクロファージの増加;
c. M1/M2-マクロファージ恒常性;
d. 抗炎症性サイトカイン、ケモカイン又は成長因子の放出の減少;
e. 炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、又は成長因子の放出の増加;
f. マクロファージの殺腫瘍活性の増加;
g. TMEへの細胞傷害性Tリンパ球浸潤の増加;及び
h. T細胞活性化の増加
の1つ又は複数をもたらす、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物の乳管内投与が、
a. F4/80+マクロファージ;
b. Grl-マクロファージ;
c. CD63+マクロファージ
d. CD206+マクロファージ;
e. CD200R細胞/マクロファージ;
f. MARCO+マクロファージ;
g. CD68+/CD68+マクロファージ;
h. CD68+/CD163+マクロファージ;
i. Tie2R+細胞/マクロファージ;
j. CD11b+/VEGF-R1+マクロファージ;
k. CCR2+骨髄細胞/マクロファージ;
l. MerTK+マクロファージ;
m. CD11b^low/MHCII^high/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+マクロファージ;
n. CD11b+Grl-/F4/80+マクロファージ;
o. CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6C^low/F4/80+マクロファージ;
p. CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-マクロファージ;
q. CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-マクロファージ;及び
r. CD45+/F480+/Tie2-/CD31-マクロファージ
からなる群から選択されるマクロファージ集団のいずれか1つ又は複数の減少をもたらす、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物の乳管内投与が、
a. CD11b^high/MHCII^highマクロファージ;
b. HLA-DRα+マクロファージ;
c. CD64+マクロファージ;
d. CD86+マクロファージ;
e. CD80+マクロファージ;
f. CD68+/CD80+マクロファージ;
g. CD64+マクロファージ;及び
h. Ly6C^high/CX3CR1^high/CCR2-/CD62L-/CD43^low(Ly6C^high)マクロファージ
からなる群から選択されるマクロファージ集団のいずれか1つ又は複数の増加をもたらす、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方の乳管内投与が、対象における、
a. 腫瘍血管新生;
b. 腫瘍浸潤;
c. 転移;
d. 免疫抑制;
e. 化学療法抵抗性;並びに
f. 抗炎症性サイトカイン、ケモカイン及び成長因子の放出
のいずれか1つ又は複数を減少させる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
再分極化剤が、フェンレチニド(4-ヒドロキシ(フェニル)レチンアミド、4-HPR);IL-12;IFNγ、miR127、miR155、及びmiR223、フェルモキシトール、阻害剤:CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、アルギナーゼ1(Arg1)、M2マクロファージスカベンジャー受容体(A、B、MARCO等);ヒストンデアセチラーゼ(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6シグナル伝達経路; IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6; (miRNA-146a)等のmiRNA-146ファミリーメンバー、let7ファミリーメンバー(let-7c等)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187;CCR-CCl2軸シグナル伝達; CCL2/MCP-1合成;胎盤成長因子(PlGF)(HRG)及びC/EBPβ(PI3Kγ欠失); AMPKα1(メトホルミン)、p50-p50NFκB、NADPHオキシダーゼ(NOX)(NOX 1及びNOX 2)、Rbpj、Notchシグナル伝達経路;CD40及びCD40Lの活性剤;IRF1、IRF5、STAT1(IFNγ、バディメザン(DMXAA)等)及びSTAT3;核因子カッパB活性化因子、イミキモド等のトール様受容体(TLR)アゴニスト、合成非メチル化シトシン-グアニン(CpG)オリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODNs)、p65-p50NFκB、MyD88、miR127、miR155、並びにmiR223、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に規定の組成物。
1つ又は複数のHDACiが、TMP195、MC1568、TMP269、(アリールオキソプロペニル)ピロリルヒドロキサメート)、トリコスタチンA、トラポキシンB、塩酸ツバスタチンA(抗HDAC7)、パノビノスタット、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)クラスI及びクラスII阻害剤ボリノスタット(ボリンザ(登録商標)Merck)、ロミデプシン(イストダックス(登録商標));デプシペプチド、FK-228)、ベリノスタット(PXD-101)、パノビノスタット(LBH589)、ダシノスタット(LAQ824)、SB939、チダミド、汎HDAC阻害剤(ギビノスタット(ITF2357)、PCI 2478、R306465(JNJ-16241199)、レスミノスタット(4SC-201) 等)、バルプロ酸、酪酸、フェニル酪酸、AN9/ピバネックス、クラスI選択的HDAC阻害剤ベンズアミド若しくはアミノアナライド(例えば、CI-994、エンチノスタット(SNDX-275/MS-275)等、モセチノスタット(MGCD0103)、アベキシノスタット(PCI-24781)、キシノスタット(JNJ-26481585)、HBI-8000、ケベトリン、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、並びにスルフォラファン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
MARCO阻害剤が、抗MARCO抗体(ab103311、モノクローナルED31、PLK-1、ABN 1389等)、抗MARCO ScFv、Fab、Fab'、及びFab2、抗MARCO ScFv mRNA、抗MARCO miRNA、MARCOアンチセンスRNA、MARCO siRNA、抗MARCO DNA、抗MARCOオリゴヌクレオチド、抗MARCOペプチド阻害剤、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
1つ又は複数の遮断剤が、抗CSF-1阻害剤、抗CSF-1R阻害剤、抗MCP-1阻害剤、抗IL-4阻害剤(パスコリズマブ、ピタキンラ、及びデュピルマブ等)、抗IL-13阻害剤(アンルキンズマブ、レブリキズナブ、及びトラロキヌマブ等)、デュプリマブ等の抗IL-4/IL-13二重阻害剤、STAT3阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブ、WP1066、及びレスベラトロール等)、並びにSTAT6阻害剤(フェンレチニド(4-HPR)、レフルノミド、TMX264、及びAS1217499等)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
追加の治療剤を更に含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
追加の治療薬が、チェックポイント阻害剤、抗ホルモン剤、ステロイド、アントラサイクリン、甲状腺ホルモン補充薬、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル又はカルボプラチン及びPEG化リポソームドキソルビシン等)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、キメラ抗原受容体/ T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、並びにその他の養子細胞療法からなる群から選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の組成物。
抗ホルモン剤が、タモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、若しくはCH498、アナストロゾール、エキセメスタン並びにレトロゾール、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
抗PD-1(ニボルマブ等)、抗PD-1L(アテゾリズマブ(MPDL3280)、アベルマブ(MSB0010718C)、デュルバルマブ、MDX-1105等)、抗CTLA4(例えば、イピリムマブ)、並びに抗LAG-3(IMP321、BMS-986016、及びGSK2831781等)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイント阻害剤を更に含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の組成物。
ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、¹⁹Fパーフルオロカーボンナノ粒子、他の磁気レポーター遺伝子、例えばメタロタンパク質ベースのMRIプローブからなる群から選択される造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物。
リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、又はエキソソームとして製剤化される、請求項1から18のいずれか一項に記載の組成物。
分極化剤若しくは遮断剤又はその両方が、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、又はエキソソーム中に含まれる、請求項19に記載の組成物。
分極化剤若しくは遮断剤又はその両方が、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセル、又はエキソソーム上に含まれる、請求項19又は請求項20に記載の組成物。
ナノ粒子が脂質ナノ粒子である、請求項19から21のいずれか一項に記載の組成物。
ナノ粒子が細胞標的化剤で更にコーティングされている、請求項19から22のいずれか一項に記載の組成物。
細胞標的化剤がM2マクロファージ選択的細胞表面分子を標的とする、請求項23に記載の組成物。
M2マクロファージ特異的細胞表面分子が、IL-13Rα、CD163、CD206、CD200R、MerTK、スカベンジャー受容体A、スカベンジャー受容体B、MARCO、及びF4/80からなる群から選択される、請求項24に記載の組成物。
デポー製剤として製剤化される、請求項1から25のいずれか一項に記載の組成物。
対象に、単位用量あたり1×10⁴〜1×10⁸のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はエキソソームを含む組成物を乳管内投与する、請求項19から26のいずれか一項に記載の方法。
再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物が、単回用量又は複数回用量で投与される、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
乳房障害が乳がんである、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
乳がんが、非浸潤性乳管癌(DCIS)、非浸潤性小葉癌(LCIS)、浸潤性(又は浸潤型)小葉癌(ILC)、浸潤性(又は浸潤型)乳管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞(腺嚢胞)癌、低悪性度腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液性(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、又は微小乳頭癌からなる群から選択される、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
対象に化学療法、放射線療法、又は細胞療法を投与することを更に含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
化学療法、放射線療法、若しくは細胞療法、又はそれらの組み合わせが、腫瘍サイズ又は免疫抑制又はその両方を減少させる、請求項31に記載の方法。
再分極化剤若しくは遮断剤又はその両方を含む組成物、1つ又は複数の容器、包装材料、ラベル又は添付文書、及び任意選択でデバイスを含む製品。
デバイスが、針及び注射器、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、浸透圧ポンプ、又はカプセル化デバイスである、請求項33に記載の製品。
追加の治療剤を更に含む、請求項33又は請求項34に記載の製品。