CN111936152A - 乳腺病症的导管内治疗方法 - Google Patents

乳腺病症的导管内治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗患有乳腺病症的受试者的导管内方法和组合物。组合物包含能够使肿瘤微环境中的M2巨噬细胞向M1巨噬细胞再极化、减少M2巨噬细胞、增加M1巨噬细胞和/或增加受试者对化学疗法的敏感性的再极化剂和极化阻断剂。

Description

乳腺病症的导管内治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月22日提交的美国申请第62/609665号的权益，所述美国申请通过引用整体并入本文。
背景
乳腺癌是人类癌症死亡的第二大原因。尽管在乳腺癌的诊断和治疗方面取得了进展，但自1940年以来，这种疾病的患病率一直以每年约1％的速度稳步上升。如今，生活在北美的女性一生中患乳腺癌的可能性是八分之一。尽管近期在早期诊断和治疗方面取得了进展，并显著改善了预后，但肿瘤对化学疗法的抗性和转移仍然是死亡的重要原因。
恶性肿瘤微环境(TME)的存在导致施用的药物难以到达靶细胞并导致肿瘤逃逸。TME包括诸如高组织压力、缺氧、营养饥饿(例如，由于葡萄糖和其他代谢物减少)、乳酸生成增加和导致的酸中毒、调节性CD4+T细胞(T-reg)、髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)浸润增加、免疫抑制性细胞因子(诸如IL-10和TGF-β)的存在以及靶向由活化的T细胞表达的免疫抑制性受体的配体(如CTLA4和PD-1)的表达，以及T细胞增殖减少等状况，这有助于创造免疫抑制微环境，使肿瘤保护自己免受免疫识别，保持耐受性，并避免消除。
肿瘤微环境(TME)是复杂的结构，其随着肿瘤的进展而演变，以促进转移性扩散。在实体瘤中，肿瘤块的5％-40％由TAM组成。TAM可代表肿瘤微环境中最丰富的免疫抑制性细胞群，其由CSF-1和CCL-2(MCP-1)募集(Sica等人2006,Eur J Cancer.,42,717-727)。
乳腺中的常驻巨噬细胞对于充当组织损伤的传感器和维持组织稳态和免疫是非常重要的。巨噬细胞是炎症的关键介导物，也是乳房发育过程的重要调节因子。促炎因子与抗炎因子之间的平衡是调节TME内的巨噬细胞功能的关键。在炎症和肿瘤发展过程中，循环单核细胞被募集到炎症部位和TME，在那里它们采用由特定细胞因子和生长因子的存在决定的巨噬细胞表型。一旦被募集到肿瘤微环境，巨噬细胞对TME内过多的刺激做出反应，并分化(极化)成不同的亚群。在人中，巨噬细胞极化是连续的过程，其跨越了从经典活化的杀微生物和促炎性M1巨噬细胞到交替活化的抗炎和免疫抑制性M2巨噬细胞的两个极端。
M1巨噬细胞被干扰素γ(IFNγ)或脂多糖(LPS)刺激极化，并分泌促炎性的细胞因子，诸如IL-6、IL-12、活性氧(ROS)、活性氮(RN)和肿瘤坏死因子α(TNFα)。人M1巨噬细胞的有效细胞表面标志物包括高水平的CD14、C16、CD64、CD86和HLA-DRα。M1巨噬细胞通常用于清除病原体和细胞。
相反，M2巨噬细胞通常产生抗炎性的细胞因子，并参与组织重塑和修复、血管生成、免疫抑制和调节性T细胞的募集。M2巨噬细胞可进一步分为M2a、M2b、M2c巨噬细胞。M2a巨噬细胞由IL-4或IL-13刺激产生，并释放基质重塑细胞因子。CD200R和CD86的升高的表达是M2a巨噬细胞的有效细胞表面标志物。M2b巨噬细胞由免疫复合物的识别结合IL-1β或LPS刺激产生，与M2a巨噬细胞一样，它们参与伤口愈合。免疫抑制性M2c巨噬细胞是富含IL-10、TGFβ、糖皮质激素或免疫复合物的环境的产物。M2c巨噬细胞产生进一步的免疫抑制细胞因子诸如IL-10和基质重塑因子诸如基质金属蛋白酶(MMP；例如，MMP-9)。升高的CD163表达是M2c极化的有效标志物。
基于对TAM的转录组学研究(J.Xue,S.V.Schmidt,J.Sander等人，Immunity，第40卷，第2期，第274-288页，2014)，TAM表型被认为包括典型地分配给M1和M2表型的标志物的组合。然而，TAM通常与M2样极化状态相关，所述极化状态是由肿瘤来源的乳酸或免疫抑制性细胞因子(诸如来自TME中不同细胞的IL-4、IL-10和IL-13)或基于其在TME中的功能的B细胞来源的免疫球蛋白的分泌引起的(Brady等人Mediators of Inflammation.第2016卷(2016)，文章ID 4549676)。
尽管TAM通常具有抗炎性、免疫抑制性和致瘤性，但人们正在尝试通过激活免疫反应来使TAM具有杀肿瘤性和抑制肿瘤生长(Wynn等人Nature 2013,496:445–455)。乳腺癌中巨噬细胞与CD8+细胞的低比率预示着存活，这表明巨噬细胞在抑制T细胞抗肿瘤的活性中起主要作用(Ruffell，B.等人P.N.A.S.USA.2012；109,2796-2801)。特定白细胞亚群(诸如CD8+和记忆T细胞)对肿瘤的浸润与不同癌症的良好预后相关，这表明免疫参与(immuneengagement)可以限制癌症的生长和扩散(Noy R,Pollard JW.Immunity,2014；41:49-61)。在治疗黑色素瘤和肺癌的临床试验中，已发现使用检查点抑制剂(诸如抗PD-1)增强肿瘤中的T细胞活性在一定程度上是成功的。
通过例如全身递送抗体介导的CD40、IL-12细胞因子等的共刺激，正在研究通过使TAM再极化至M1活化的巨噬细胞来对TAM进行重编程或教育(Casetta L,Pollard JW.CellResearch(2017)27:963-964)；Georgoudaki等人Cell Reports.2016.15,2000-2011；Guerriero等人Nature 2017.5543；428-432；US9,139,652；US9,795,570；US20170266131；US20170056430；US20160220692；US20150297679；US20150252115和US20150080940)，对于治疗乳腺病症诸如乳腺癌和维持巨噬细胞稳态的新颖策略仍有未满足的医学需求。本发明提供了用于治疗患有乳腺病症的受试者、提高对化学疗法的敏感性和促进巨噬细胞稳态的新型方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供治疗患有乳腺病症的受试者的新型方法，该方法包括向受试者导管内递送包含能够使M2极化的巨噬细胞再极化的再极化剂(repolarizingagent)或能够阻断巨噬细胞的M2极化的阻断剂或两者的组合物。
另一方面，本发明提供了促进患有乳腺病症的受试者对化学疗法的增强敏感性的新型方法，其包括：向受试者导管内施用包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物，其中导管内施用该组合物促进对化学疗法的增强敏感性。
在至少一个实施方案中，本发明提供了在患有乳腺病症的受试者中选择性减少M2巨噬细胞的方法，其包括向受试者导管内施用包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物。
所述组合物的导管内施用导致以下的一种或多种结果：M2巨噬细胞减少、M1巨噬细胞增加、抗炎性的细胞因子减少、促炎性的细胞因子增加、细胞毒性T淋巴细胞的募集和T淋巴细胞活化。
在一些实施方案中，M2巨噬细胞表型是M2a表型、M2b表型和M2c表型中的任一种或多种，或其组合。
一方面，本发明提供了本文公开的组合物的导管内施用导致选自由以下组成的组的巨噬细胞群的任一种或多种的减少:F4/80+巨噬细胞；Grl-巨噬细胞；CD206+巨噬细胞；CD200R细胞/巨噬细胞；CD63+巨噬细胞；CD68+/CD68+巨噬细胞；CD68+/CD163+巨噬细胞；MARCO+巨噬细胞；Tie2R+细胞/巨噬细胞；CD11b+/VEGF-R1+巨噬细胞；CCR2+骨骼细胞/巨噬细胞；MerTK+巨噬细胞；CD11b低/MHCII高/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+巨噬细胞；CD11b+Grl-/F4/80+巨噬细胞；CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6C低/F4/80+巨噬细胞；CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-巨噬细胞；CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-巨噬细胞以及CD45+/F480+/Tie2-/CD31-巨噬细胞,或其组合。
另一方面，本发明提供了本文公开的组合物的导管内施用导致选自由以下组成的组的巨噬细胞群中的任一种或多种的增加：CD11b低/MHCII高巨噬细胞；HLA-DRα+巨噬细胞；CD86+巨噬细胞；CD80+巨噬细胞；CD68+/CD80+巨噬细胞；CD64+巨噬细胞以及Ly6C高/CX3CR1高/CCR2-/CD62L-/CD43低(Ly6C高)巨噬细胞，或其组合。
一方面，本发明提供了再极化剂，其选自由以下组成的组：芬维A胺(4-羟基(苯基)维甲酰胺，4-HPR)；IL-12；IFNγ；miR127；miR155；miR223；纳米氧化铁(ferumoxytol)；CD40L；以下物质的抑制剂：CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、精氨酸酶1(Arg1)、M2巨噬细胞清道夫受体(诸如A、B、MARCO)、组蛋白脱乙酰基酶(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6信号传导途径、IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、miRNA-146家族成员(诸如(miRNA-146a)、let7家族成员(诸如let-7c)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187；CCR-CCl2轴信号传导、CCL2/MCP-1合成、胎盘生长因子(PlGF)(HRG)和C/EBPβ(PI3Kγ缺失)、AMPKα1(二甲双胍)、p50–p50NFκB、NADPH氧化酶(NOX)(NOX 1和NOX 2)、Notch信号传导途径和Rbpj；以下物质的激活剂：CD40、CD40L、IRF1、IRF5、STAT1(诸如IFNγ、伐地美生(vadimezan)(DMXAA))、STAT3、核因子κB激活剂、toll样受体(TLR)激动剂(诸如咪喹莫特(Imiquimod))、合成非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)、p65–p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155和miR223，或其组合。
一方面，本发明提供了选自由以下组成的组的阻断剂：抗CSF-1抑制剂、抗CSF-1R抑制剂、抗MCP-1抑制剂、抗IL-4抑制剂(诸如帕考珠单抗、皮特克拉(pitrakinra)和杜比单抗)、抗IL-13抑制剂(诸如安芦珠单抗、来瑞珠单抗(Lebrikizumab)和曲洛克木单抗(tralokinumab))、抗IL-4/IL-13双重抑制剂(诸如杜普利单抗)、STAT3抑制剂(诸如索拉非尼、舒尼替尼、WP1066和白藜芦醇)和STAT6抑制剂(诸如芬维A胺(4-HPR)、来氟米特、TMX264和AS1217499)或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种HDACi选自由以下组成的组：TMP195、MC1568、TMP269、(芳基氧代丙烯基)吡咯基异羟肟酸酯)、曲古抑菌素A、trapoxin B、盐酸吐巴司他丁A(抗HDAC7)、帕比司他、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)I类和II类抑制剂伏立诺司他(
Figure BDA0002618985480000051
Merck)、罗米司他
Figure BDA0002618985480000052
缩酚酸肽,FK-228)、贝林司他(PXD-101)、帕比司他(LBH589)、达西司他(LAQ824)、SB939、西达本胺(Chidamide)、泛HDAC抑制剂(诸如吉维司他(ITF2357)、PCI 2478、R306465(JNJ-16241199)、雷斯米司他(4SC-201))、丙戊酸、丁酸，苯丁酸、AN9/Pivanex、I类-选择性HDAC抑制剂苯甲酰胺类或氨基analides(诸如CI-994、恩替司他(SNDX-275/MS-275)、莫西司他(MGCD0103)、阿贝司他(PCI-24781)、奎司司他(JNJ-26481585)、HBI-8000、凯维特林(Kevetrin)、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344和莱菔硫烷(Sulforaphane)或其组合。
在其他实施方案中，MARCO抑制剂选自由以下组成的组：抗MARCO抗体(诸如ab103311、单克隆ED31、PLK-1、ABN 1389)、抗MARCO ScFv、Fab、Fab’和Fab2、抗MARCO ScFvmRNA、抗MARCO miRNA、MARCO反义RNA、MARCO siRNA、抗MARCO DNA、抗MARCO寡核苷酸、抗MARCO肽抑制剂或其组合。
在一些实施方案中，本文公开的组合物还包含药学上可接受的载体。
一个方面，本发明提供组合物还包含另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：检查点抑制剂、抗激素剂(anti-hormonal)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨、紫杉醇或卡铂和聚乙二醇化脂质体多柔比星)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、曲妥珠单抗、阿多-曲妥珠单抗美坦辛(ado-trastuzumab emtansine)、培妥珠单抗、阿博西尼(abemaciclib)、帕博西尼、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继细胞疗法，或其组合。
在一些实施方案中，抗激素剂选自由以下组成的组：他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬(bazedofoxifene)、阿佐昔芬(arzoxifene)、米泼昔芬(miproxifene)、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑或其组合。
在一些实施方案中，检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗-PD-1(诸如纳武单抗)、抗-PD-1L(诸如阿特朱单抗(atezolizumab)(MPDL3280)、阿维单抗(Avelumab)(MSB0010718C)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、MDX-1105)、抗-CTLA4(诸如伊匹单抗(Ipilimumab))和抗-LAG-3(诸如IMP321、BMS-986016和GSK2831781)或其组合。
另一方面，本发明提供了本文公开的组合物还包含成像剂、染料或造影剂，其可选自由以下组成的组：钆螯合剂、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其它磁性报告基因，诸如基于金属蛋白的MRI探针。
一方面，本发明提供了包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物，其被配制成脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体。在一些实施方案中，将再极化剂或阻断剂或两者包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体中。在其他实施方案中，再极化剂或阻断剂或两者都包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束上。
在至少一个实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，用细胞靶向剂涂覆纳米颗粒。细胞靶向剂是M2-巨噬细胞选择性细胞表面分子。在某些实施方案中，M2-巨噬细胞选择性细胞表面分子选自由以下组成的组：IL-13α、CD163、CD206、CD200R、MerTK、清道夫受体A、清道夫受体B、MARCO和F4/80。在一些实施方案中，前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物被配制成贮库制剂。
在一个方面，本公开提供了向受试者导管内施用包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物，其中所述组合物包含每单位剂量1x 104至1x 108个脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡或外来体。可以以单剂量或多剂量向受试者施用本文公开的组合物。
一方面，乳腺病症是乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是选自由以下组成的组的乳腺癌：原位导管癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)、原位小叶癌(lobular carcinomain situ，LCIS)、侵袭性(或浸润性)小叶癌(invasive(or infiltrating)lobularcarcinoma，ILC)、侵袭性(或浸润性)导管癌(invasive(or infiltrating)ductalcarcinoma，IDC)、微侵入性乳腺癌(microinvasive breast carcinoma，MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕激素受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即ER-/PR-/Her2-乳腺癌)；“TNBC”)、腺样囊性(腺囊性)癌(adenoid cystic(adenocystic)carcinoma)、低级腺鳞状细胞癌(low-gradeadenosquamatous carcinoma)、髓样癌(medullary carcinoma)、粘液(或胶质)癌(mucinous(or colloid)carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、管状癌(tubularcarcinoma)、化生癌(metaplastic carcinoma)或微乳头状癌(micropapillarycarcinoma)。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用化学疗法、放射疗法或细胞疗法。在一些实施方案中，化学疗法、放射疗法或细胞疗法或其组合减小了受试者的肿瘤大小或免疫抑制或两者。
在其他实施方案中，包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物的导管内施用在受试者中增强了以下任一方面或多个方面：M1极化巨噬细胞的杀瘤活性；促炎性的细胞因子、趋化因子和生长因子的释放；细胞毒性T淋巴细胞募集；和T细胞活化。
在其他实施方案中，再极化剂或阻断剂或两者的导管内施用在受试者中减弱了以下方面的任一方面或多个方面：肿瘤血管生成；肿瘤侵袭；转移；免疫抑制；以及抗炎性的细胞因子、趋化因子和生长因子的释放。
在另一方面，本发明提供了制品，其包含含有再极化剂或阻断剂或两者的组合物、一个或多个容器、包装材料、标签或包装插页以及任选地装置。在一些实施方案中，所述装置是针和注射器、套管、导管、微导管、渗透泵或封装装置。在其他实施方案中，制品还包含额外的治疗剂，诸如本文公开的那些。
具体实施方式
总的来说，本文公开了可用于调节巨噬细胞活化、使TME中的M2巨噬细胞再极化并提高对疗法诸如化学疗法、放射疗法、免疫疗法和细胞疗法的敏感性的组合物。此类组合物包含能够使M2巨噬细胞向M1巨噬细胞再极化或阻断浸润性单核细胞和巨噬细胞向M2巨噬细胞的极化的再极化剂和极化阻断剂。此外，本文提供了通过向受试者的一个或多个乳腺导管导管内施用本文公开的组合物来治疗患有乳腺病症的受试者的方法。
巨噬细胞和TAM-极化和表型
乳腺中的驻留巨噬细胞(CD11b高/MHCII高)对于作为组织损伤的传感器和维持组织稳态和免疫力是非常重要的。巨噬细胞是炎症的关键介导物，也是乳房发育过程的重要调节因子。促炎因子与抗炎因子之间的平衡是调节TME内的巨噬细胞功能的关键。TME释放各种细胞因子、趋化因子和生长因子，将循环单核细胞募集到TME，在那里它们成熟形成巨噬细胞。一旦进入肿瘤微环境，巨噬细胞对TME内过多的刺激做出反应，并分化成不同的亚群。在人中，巨噬细胞极化是连续的过程，其跨越了从经典活化的促炎性M1巨噬细胞到交替活化的抗炎性M2巨噬细胞的两个极端。
巨噬细胞向M1表型的极化在体外由诸如GM-CSF、IFNγ、TNFα、IL-1β和LPS等炎性信号以及各种转录因子和微小RNA(miRNA)调节。干扰素调节因子决定巨噬细胞极化的表型。IFNγ通过使用干扰素调节因子1(IRF1)和STAT1的干扰素调节途径使巨噬细胞极化成M1表型。LPS通过Toll样受体家族(诸如TLR-4)诱导M1表型。miRNA是长度为22个核苷酸的小的非编码RNA，其转录后调节基因表达，因为它们影响mRNA降解的速率。已显示几种miRNA在M1极化的巨噬细胞中高度表达，尤其是miRNA-155、miRNA-125、miRNA-127、miRNA-17、miRNA-20、miRNA-106a和miRNA-378。据说抑制这些miRNA会减少M1极化。
经典地活化的巨噬细胞启动STAT1转录因子的诱导，所述转录因子靶向CXCL9、CXCL10(也称为IP-10)、IFN调节因子-1以及细胞因子信号传导阻抑物-1(suppressor ofcytokine signaling-1，SOCS1)。M1巨噬细胞分泌促炎性的细胞因子诸如IL-6、IL-12、IL-23、由NADPH氧化酶NOX1和NOX2活性产生的活性氧(ROS)、活性氮(RN)和肿瘤坏死因子α(TNFα)杀伤细胞。M1巨噬细胞具有高度吞噬功能，通常用于清除病原体和细胞。
IL-12诱导分泌大量IL-17的Th17细胞的活化和克隆扩增，这进一步促成炎症。这些特性使M1巨噬细胞能够控制转移、抑制肿瘤生长和控制微生物感染。研究表明，促炎性M1巨噬细胞向肿瘤部位的浸润和募集与实体瘤患者更好的预后和更高的总生存率相关。
人M1巨噬细胞的有效细胞表面标志物包括高水平的CD14、C16、CD64、CD86和HLA-DRα。
与M1巨噬细胞相反，M2巨噬细胞通常产生抗炎性的细胞因子，并诱导组织重塑和修复、血管生成、免疫抑制和调节性T细胞的募集。M2巨噬细胞可进一步分为M2a、M2b、M2c巨噬细胞。M2a巨噬细胞由IL-4或IL-13刺激产生，并释放基质重塑细胞因子(Gunthner和Anders.Mediators of Inflammation.第2013卷(2013)，论文ID 731023)。IL-4通过IRF4和STAT6信号传导，利用干扰素调节途径使巨噬细胞极化为M2表型。CD200R和CD86的升高的表达是M2a巨噬细胞的有效细胞表面标志物。M2b巨噬细胞由免疫复合物的识别结合IL-1β或LPS刺激产生，与M2a巨噬细胞一样，它们参与伤口愈合。免疫抑制性M2c巨噬细胞是富含IL-10、TGFβ、糖皮质激素或免疫复合物的环境的产物。IL-10利用STAT3信号通路使巨噬细胞极化为M2表型(Gunthner和Anders.Mediators of Inflammation.第2013卷(2013)，论文ID731023)。M2c巨噬细胞产生另外的免疫抑制细胞因子诸如IL-10和基质重塑因子诸如基质金属蛋白酶(MMP；例如，MMP-9)。升高的CD163表达、ARG1、RETNLB、IL4R、CHIA、CD68是M2c极化的有效标志物。
已显示几种miRNA在M2极化的巨噬细胞中高度表达，尤其是miRNA-9、miRNA-21、miRNA147、miRNA-187、miRNA-146家族成员诸如(miRNAs-146a)和let7家族成员(诸如let-7c)。这些miRNA的抑制被称为减少的M2极化。研究表明，miRNA加工酶DICER的缺乏导致TAM再极化为IFNγ介导的M1样表型(其特征在于促炎性的细胞因子和T细胞募集趋化因子的表达增强)，并且利用let-7的挽救部分恢复了M2巨噬细胞表型(Chaftrito和PalmaCellCycle.2016，第15卷，第23期，3149–3150)。TAM中的DICER失活大大增强了癌症免疫疗法(即PD1检查点阻断和CD40激动性抗体)的功效，导致小鼠中肿瘤完全消退。(同上)M2巨噬细胞的另外的标志物包括但不限于精氨酸酶1(Arg1)、巨噬细胞清道夫受体A、B和MARCO、Tie2R+、Grl-、F4/80+、MerTK+、CD206+和CD200R。
基于对TAM的转录组学研究，TAM被认为在表型上包括通常分配M1巨噬细胞和M2巨噬细胞表型的标志物的组合(Xue等人Immunity.2014.40(2):274-288)。已在乳腺癌中发现M2样巨噬细胞群亚群，诸如CD11b+Grl-/F4/80+巨噬细胞、CD45+/CD11b+/LY6G-/LY6Clow/F4/80+巨噬细胞、CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-巨噬细胞、CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-巨噬细胞；和CD45+/F480+/Tie2-/CD31-巨噬细胞(Nielsen和Schmid.Mediators ofInflammation.第2017卷，论文ID.9624760)。然而，基于其在TME中的功能，人们普遍接受TAM通常与M2样极化状态有关，所述极化状态是由肿瘤来源的乳酸或免疫抑制性细胞因子(诸如来自TME中不同细胞的IL-4、IL-10和IL-13)或B细胞来源的免疫球蛋白的分泌引起的(Brady等人Mediators of Inflammation.第2016卷(2016)，论文ID 4549676)。出于本公开的目的，本发明提供了M2样TAM的再极化，所述TAM包括可能也显示一些M1样表型标志物的TAM(在本公开中可互换使用的“M2-巨噬细胞”、“M2极化的巨噬细胞”或“TAM”)。出于本发明的目的，M2巨噬细胞群可以是M2巨噬细胞的任何亚群(M2a、M2b和M2c)或其任意组合。
基于这些区域的缺氧水平，在肿瘤内不同的区室中发现了异质的TAM群。被招募至TME的炎性单核细胞产生MHCII低和MHCII高TAM，但缺氧区域中的TAM主要是MHCII低，并与M2标志物的表达增加相关。发现TAM的M2样巨噬细胞群，诸如CD68+/CD68+巨噬细胞、CD68+/CD163+巨噬细胞、CD11b+/VEGF-R1+巨噬细胞、CCR2+髓样细胞/巨噬细胞、CCD11b低/MHCII高/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+巨噬细胞、CD11b+Grl-/F4/80+巨噬细胞、CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+巨噬细胞、CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-巨噬细胞、CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-巨噬细胞和CD45+/F480+/Tie2-/CD31-巨噬细胞以及CD45+/F480+/Tie2-/CD31-巨噬细胞在乳腺癌中升高(Nielsen和Schmid.Mediators of Inflammation.第2017卷，文章ID.9624760)。
治疗方法
一方面，本文提供了治疗患有乳腺病症的受试者的新型方法，该方法包括向受试者乳腺导管中导管内递送包含能够使M2极化的巨噬细胞再极化的再极化剂或能够阻断巨噬细胞的M2极化的极化阻断剂(下文中称为“阻断剂”)或两者的组合物。在本文公开的方法中，导管内递送是以非侵入性或最小侵入性方式实现的，并且通常不涉及临床医生递送治疗而采用的皮肤破裂。相反，将所述组合物经由受试者自身在乳房乳头的乳头中的天然导管孔向受试者施用。
如本文中所用，术语“导管内的”和“导管内地”是指一种治疗方法，其中将本文公开的组合物通过乳房乳头上的乳头中的乳管开口(导管孔)递送至受试者的至少一个乳腺乳管的内腔中，以到达乳腺的内部深度。
一方面，导管内施用是指将本公开的组合物施加于乳房乳头的乳头，将组合物从所述乳头通过乳头中的导管孔递送至至少一个乳导管。乳房乳头和导管孔特别适合将再极化剂、极化阻断剂和治疗剂接收到导管中。在另一个方面，导管内施用是指将组合物通过乳房乳头的乳头内的导管孔直接导管内递送到乳导管的内腔中。本领域技术人员将会理解，本文公开的导管内方法包括通过受试者乳腺中的乳导管的天然孔递送本文公开的组合物。本发明的一个有利方面是，导管内递送通常不涉及对受试者皮肤或组织或细胞层的故意破坏，并且将组合物递送至受累乳腺组织附近。
乳腺病症，诸如乳腺癌，通常起源于个体的乳导管(WellingsSR.Pathol.Res.Prac.1980；166:515-535；Love和Barsky.Cancer.2004，第101卷(9):1947-1957)。因此，非常需要在乳导管(乳腺导管)内的受累部位附近局部递送疗法，例如包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物。此类组合物的导管内施用提供了局部的、有效的、易于施用的疗法，所述疗法通过减少对包含再极化剂和/或阻断剂的组合物的全身暴露来消除全身性治疗的副作用。这将具有降低中靶脱瘤效应(on-target-off-tumor effect)的概率/风险的额外益处。通过导管内施用局部递送至乳腺导管将减少运输时间，并由此使TME中的M2巨噬细胞更快地暴露于组合物，从而提高细胞毒性活性和功效，同时还降低由于至M2巨噬细胞的较短运输时间而导致的药物失活和/或降解的可能性。本文公开的方法的一个特别有利方面是乳腺组织中巨噬细胞的体内转导。
本文公开的组合物的导管内施用导致出现以下的一种或多种情况：M2巨噬细胞减少、M1巨噬细胞增加、抗炎因子减少、促炎因子增加和细胞毒性T淋巴细胞的募集增加。在一些实施方案中，M2巨噬细胞与M1巨噬细胞的比率被改变。M1巨噬细胞的数量相对于M2巨噬细胞增加。在一些实施方案中，再极化恢复了M1/M2巨噬细胞在巨噬细胞极化状态方面的稳态。
在一些实施方案中，再极化的M2巨噬细胞表型是M2a表型、M2b表型、M2c表型或其组合。在一些实施方案中，TAM的M2样巨噬细胞群诸如CD68+/CD163+巨噬细胞、CD11b+/VEGF-R1+巨噬细胞、CCR2+髓样细胞/巨噬细胞、CD68+/CD68+巨噬细胞、CD11b低/MHCII高/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+巨噬细胞、CD11b+Grl-/F4/80+巨噬细胞、CD45+/CD11b+/LY6g-/LY6Clow/F4/80+巨噬细胞、CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-巨噬细胞、CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-巨噬细胞和CD45+/F480+/Tie2-/CD31-巨噬细胞通过本文公开的组合物和方法再极化。结果，此类M2巨噬细胞的数量减少了。
在一些实施方案中，本文公开的组合物的导管内施用导致任何一种或多种巨噬细胞群的数量增加，所述巨噬细胞群是例如CD11b高/MHCII高巨噬细胞、HLA-DRα+巨噬细胞、CD86+巨噬细胞、CD80+巨噬细胞、CD68+/CD80+巨噬细胞、CD64+巨噬细胞或Ly6C高/CX3CR1高/CCR2-/CD62L-/CD43低(Ly6C高)巨噬细胞。
在其他实施方案中，本文公开的组合物的导管内施用导致促炎因子诸如细胞因子、趋化因子和生长因子(例如，IL-1、IL-1β、IL-17、IFNγ、ROS、RN、TNFα、GM-CSF)等增加。在其他实施方案中，所述组合物的导管内施用导致抗炎因子诸如细胞因子和趋化因子(诸如IL-4、IL-13、IL-10、CSF-1)、生长因子(诸如血管生成生长因子如VEGF和TGFβ)和组织重塑因子(诸如MMP，诸如MMP9)等减少。本领域技术人员将会认识到，还有其他已知的促炎和抗炎因子适用于本公开的目的。极化/活化标志物诸如促炎和免疫抑制标志物的变化可使用本领域已知的任何方法检测，例如使用ELISA、IHC、qPCR和Xue等人在Immunity，第40卷，第2期，第274–288页,2014中描述的基于转录组的分析来检测。
M2-巨噬细胞向M1-巨噬细胞的转换将平衡转移向更加促炎的状态，激活M1-巨噬细胞的杀肿瘤效应物功能。因此，在一些实施方案中，使TAM从致瘤性巨噬细胞再极化为杀肿瘤巨噬细胞。在其他实施方案中，施用本文公开的组合物降低了M2巨噬细胞的致瘤功能。
在一些实施方案中，施用本文公开的组合物减少了肿瘤血管生成。M2巨噬细胞通过释放血管生成生长因子，诸如血管内皮生长因子(VEGF-A)和胎盘生长因子(PlGF)，将血管生成开关从正常乳腺组织中的静止状态打开到长出新血管，促进新血管生成，从而提供肿瘤组织营养并帮助肿瘤转移。
在其他实施方案中，施用本文公开的组合物减少了肿瘤侵袭。M2巨噬细胞释放血管生成生长因子，诸如促进肿瘤细胞进入血管的VEGF-A。另外，巨噬细胞来源的组织蛋白酶诸如SPARC或CCL8增强肿瘤细胞对细胞外基质蛋白的粘附并促进肿瘤细胞迁移。M2巨噬细胞通过其在自分泌回路中与肿瘤细胞结合的能力(例如，通过肿瘤细胞产生CSF-1和CSF-R)来促进转移，从而促进巨噬细胞的浸润和肿瘤细胞的迁移。即使在化学疗法已消除了大转移性病变的情况下，少数耐药肿瘤细胞最终会作为耐药转移性病变复发。肺部研究表明，CCR2+巨噬细胞的消融减少了转移负担。因此，在一些实施方案中，施用本文公开的组合物减少了转移。在一些实施方案中，施用本文公开的组合物减少了CCR2+巨噬细胞。
在另外的实施方案中，施用本文公开的组合物降低了免疫抑制。在另外的实施方案中，施用本文公开的组合物增加了细胞毒性T淋巴细胞的募集和活化。
在至少一个实施方案中，本文公开的方法降低了受试者的乳腺疾病负荷。
另一方面，本文提供了用于恢复或促进患有乳腺病症的受试者乳腺中的巨噬细胞稳态的新型方法，其包括向受试者的一个或多个乳腺导管导管内施用包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物。
另一方面，本文提供了促进患有乳腺疾病的受试者对癌症治疗的敏感性增加的新型方法，其包括:向受试者导管内施用包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物。巨噬细胞在化学抗性中起着关键作用(Nielson和Schmid.Mediators of Inflammation.第2017卷论文ID9624760)。TME中的M2巨噬细胞诱导胞苷脱氨酶的表达，所述胞苷脱氨酶是常用化学治疗剂吉西他滨的主要代谢酶。使用本文公开的导管内方法将M2巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞增加了肿瘤细胞对化学疗法和增强的T细胞和M1巨噬细胞介导的细胞毒性的易感性。
在一些实施方案中，所述方法包括向受试者递送化学疗法、放射疗法、免疫疗法诸如细胞疗法(诸如CAR-T疗法或通用T细胞疗法)。对癌症疗法的敏感性增强导致肿瘤细胞死亡的增加。受试者中的肿瘤细胞死亡可通过本领域已知的任何方法来测量。例如，这可通过测定，诸如组织活检中的凋亡检测测定(TUNEL测定，R&D Systems)来检测。检测肿瘤细胞死亡的非侵入性方法包括测量伴随受试者肿瘤生长的乳酸脱氢酶减少和/或血液样品(液体活组织检查)中ctDNA(循环肿瘤细胞来源的DNA)的减少(Chang等人Molecular Oncology,2016；10(1):157)。受试者中的肿瘤细胞死亡还可使用MR成像和钆基靶向造影剂(Krishnan等人RSNA Radiology.2008年3月，第246卷，第3期)、葡萄糖类似物2-18氟-2-脱氧葡萄糖(18FDG)和使用13C磁共振光谱和光谱成像进行的超极化[1-13C]丙酮酸盐摄取的基于PET的测量(Whitney等人Proc.Intl.Soc.Mag.Reson.Med.16(2008)；第658页)来进行非侵入性检测。
另一方面，本文提供了选择性减少患有乳腺病症的受试者中的M2巨噬细胞的新型方法，其包括向受试者导管内施用有效量的包含重编程剂或阻断剂或两者的药物组合物。
如本文中所用，“乳腺病症”是指乳腺癌。如本文中所用，“乳腺癌”是指乳腺细胞的任何恶性肿瘤。乳腺癌可处于乳腺癌的任何阶段，包括癌变前期、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症、局部晚期癌症和转移性癌症。存在几种类型的乳腺癌。示例性乳腺癌包括但不限于原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵袭性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵袭性(或浸润性)导管癌(IDC)、微侵入性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕激素受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即,ER-/PR-/Her2-乳腺癌)；“TNBC”)、腺样囊性(腺囊性)癌、低级腺鳞状细胞癌、髓样癌、粘液(或胶质)癌、乳头状癌、管状癌、化生癌或微乳头状癌。单个乳腺癌肿瘤可以是这些类型的任意组合或混合物，或者是侵袭性和原位癌症的混合物。
DCIS是最常见的非侵袭性乳腺癌。其涉及乳腺导管内衬的一个或多个细胞。在DCIS中，细胞还未扩散出导管壁进入周围的乳腺组织中。约1/5的新乳腺癌病例将为DCIS。几种生物标志物与DCIS相关。示例性生物标志物包括但不限于雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、Ki-67、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、存活素、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基底细胞角蛋白、CK5/6、CK14和CK 17、表皮生长因子受体、Tn、ER+和c-kit。DCIS被认为是IDC的非强制性前体。基质细胞，诸如分泌某些HGF和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的癌相关成纤维细胞(CAF)的参与有助于DCIS细胞成为侵袭性的，并发展成IDC。
LCIS是癌前肿瘤。其可预示着对侵入性癌症的易感性。LCIS仅占原位(导管或小叶)乳腺癌的15％左右。LCIS生物标志物包括但不限于E-钙粘蛋白、ER、PgR、c-erbB-2、p53和Ki-67。
IDC是最具侵袭性的乳腺癌。顾名思义，其为从乳腺导管开始，然后侵入周围脂肪组织的癌症。约8到10种侵入性乳腺癌是浸润性导管癌。IDC通常通过手术切除癌组织和放射疗法进行治疗。另外，化疗结合免疫疗法(例如，他莫昔芬和曲妥珠单抗)通常用于治疗IDC。如果肿瘤大于4cm，则可以进行根治性乳房切除术。IDC的生物标志物包括但不限于碳水化合物抗原，诸如Tn、Tf、唾液酸-Tn、Lewis x、Lewis a、Lewis y和神经节苷脂类诸如GM3、GD3、9-0-乙酰基GD3、9-0-乙酰基GT3、N-glycoly-GM3。
ILC是在乳腺小叶中发展并且已经侵入周围组织的癌症。约1/10的侵入性乳腺癌是ILC。通过手术切除癌组织和放射疗法来治疗ILC。另外，化学疗法和免疫疗法的组合(例如，他莫昔芬和曲妥珠单抗)经常被用作治疗ILC的辅助疗法。像借助于肿瘤相关成纤维细胞(CAF)释放的生长因子和细胞因子而具有侵袭性的IDC一样，ILC也受到CAF相关蛋白FAP-α、FSP-1/S100A4和PDGFR-β的辅助。
炎性乳腺癌约占所有乳腺癌的约1％至3％。在炎性乳腺癌中，癌细胞阻塞皮肤中的淋巴管，导致乳腺变红并感到温热。受累乳房可能变得更大或更硬、更嫩或痒。炎性乳腺癌通过化学疗法、免疫疗法、放射疗法以及在某些情况下通过手术来治疗。
雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌的特征在于癌细胞表面上存在雌激素受体。ER+癌细胞的生长与雌激素的可用性相关(激素依赖性或激素敏感性乳腺癌)。约80％的所有乳腺癌是ER+乳腺癌。ER+乳腺癌的治疗选项包括阻断雌激素的化学治疗剂(例如，他莫昔芬)。
三阴性乳腺癌的特征在于缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2受体，约占10％-20％的确诊乳腺癌。TNBC可能非常具有攻击性，受试者有复发的风险。治疗方案通常包括新辅助化学疗法(但不包括抗雌激素药物诸如他莫昔芬或抗HER2药物诸如曲妥珠单抗)，随后进行手术诸如乳房肿瘤切除术(lumpectomy)。另外，TNBC是一个高度多样化的癌症组，并已被细分为至少6个表现出独特的基因表达和肿瘤起源的TNBC亚型，包括2个基底样的(BL1和BL2)、1个免疫调节性的(IM)、1个间充质性的(M)、1个间充质干细胞样的(MSL)和1个腔内雄激素受体(LAR)类的亚型(Lehrmann等人J.Clin.Invest.2011，121(7)，2750–2767)(通过引用整体并入本文)。已经描述了可以特异性靶向TNBC亚型(同上)的突变和标志物。TNBC的其他生物标志物包括但不限于表皮生长因子受体、叶酸受体-α、血管内皮生长因子、c-Myc、C-kit和基底细胞角蛋白、聚(ADP-核糖)聚合酶-1、p53、酪氨酸酶激酶、m-TOR、热激蛋白和TOP-2A。另外，肿瘤周围的基质细胞(癌症相关成纤维细胞(CAF)和免疫细胞诸如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤相关中性粒细胞(TAN))通过增加细胞外基质的沉积和释放各种促纤维化生长因子诸如TGFβ、bFGF和其他影响癌细胞增殖、侵袭和转移的因子(例如通过促进上皮-至-间充质转变)(诸如成纤维细胞活化蛋白(FAP)、EGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、细胞因子诸如IL1、IL-8、TNF-α、酶诸如MM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13和COX2)，在形成治疗药物渗透的屏障中发挥重要作用。TAM通过分泌有利于T-reg细胞的募集和免疫抑制性微环境的产生的细胞因子和趋化因子(例如IL-10、TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24)来进一步抑制抗肿瘤免疫反应。
在一些实施方案中，受试者的乳腺病症是乳腺癌或叶状肿瘤。在其他实施方案中，乳腺癌是癌变前、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症、局部晚期癌症或转移性癌症。
在其他实施方案中，受试者患有选自由以下组成的组的乳腺癌：原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵袭性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵袭性(或浸润性)导管癌(IDC)、微小侵袭性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕激素受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即ER-/PR-/Her2-乳腺癌)；“TNBC”)、腺样囊性(腺囊性)癌、低级腺鳞状细胞癌、髓样癌、粘液(或胶质)癌、乳头状癌、管状癌、化生癌或微乳头状癌。
组合物
再极化剂
一方面，本公开提供了包含能够使M2巨噬细胞再极化的再极化剂的组合物。不希望受任何理论或机制的束缚，包含再极化剂的组合物使TAM从M2-巨噬细胞活化期再极化或转换为M1-巨噬细胞活化期。
再极化剂可以是促进M1-巨噬细胞表型的任何试剂。再极化剂的实例包括，但不限于，芬维A胺(4-羟基(苯基)维甲酰胺，4-HPR)；IL-12；IFNγ；LPS、纳米氧化铁、富含组氨酸的糖蛋白(HRG)；miRNA-155、miRNA-125、miRNA-127、miRNA-17、miRNA-20、miRNA-106a和miRNA-378；
集落刺激因子-1(CSF-1)和CSF-1受体(CSF-1R)的抑制剂；
IL-10(诸如IL-12及其激活剂)、IL-10受体(IL-10R)的抑制剂；
TGFβ的抑制剂(诸如trabedersen[AP12009]、
Figure BDA0002618985480000191
[belagenpumatescel-L]、地司特泰(disitertide)、乐地单抗(Lerdelimumab)、美替木单抗(Metelimumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、LY2382770等(关于TGFβ抑制剂的其他实例，另见Neuzillet等人Pharmacology&Therapeutics，第147卷，2015年3月，第22-31页)；
精氨酸酶1(Arg1)的抑制剂，诸如CB-1158；
M2巨噬细胞清道夫受体的抑制剂(诸如A、B、MARCO(诸如抗MARCO抗体、ScFv等))；
组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂(HDACi)；
干扰素调节因子-4(IRF4)、信号转导子和转录激活子4和6(STAT4；STAT6)信号通路的抑制剂，诸如芬维A胺(4-HPR)、来氟米特、TMX264和AS1217499；
IL-4的抑制剂(诸如皮特克拉、帕考珠单抗、杜比单抗、芒柄花素、布地奈德、罗加酰胺、中普拉姆、GIT-27)和IL-4R；
抗IL-4/IL-13抑制剂，如杜比单抗；
IL-13(来瑞珠单抗、安芦珠单抗、lebrikizunab和曲洛克木单抗以及IL-13R(α)2诱饵)和IL-13R的抑制剂；
IL-17和IL-17R的抑制剂，前者诸如苏金单抗(secukinumab)，后者诸如布罗达单抗(brodalumab)、伊赛珠单抗(ixekizumab)、bimekizumab、ALX-0761、CJM112、CNTO 6785、LY3074828和SCH-900117；
过氧化物酶体增殖物激活受体γ的抑制剂(诸如罗格列酮、吡格列酮)；
Krüppel样因子4(KLF4)和Krüppel样因子6(KLF6)的抑制剂；
微小RNA加工酶DICER的抑制剂；
miRNA-9、miRNA-21(诸如AC1MMYR2)、miRNA147、miRNA-187、miRNA-146家族成员(诸如miRNA-146a)、let7家族成员(诸如let-7c)的抑制剂；
CCR-CCl2轴信号传导的抑制剂；
CCL2/MCP-1合成的抑制剂；
胎盘生长因子(PlGF)和C/EBPβ(PI3Kγ缺失)的抑制剂；
AMPKα1的抑制剂(诸如二甲双胍)；
p50–p50 NFκB的抑制剂(诸如诱饵NFkB p50(NLS)抑制剂肽组–NovusBiologicals)；
NADPH氧化酶1和2(NOX 1和NOX 2)的抑制剂，诸如M1-171、GSK2795039、桥联四氢异喹啉等；
Notch信号传导途径的抑制剂，例如RPB-J的抑制剂；
CD40的激活剂，诸如激活抗体，例如CP-870、893、达西珠单抗、ChiLob7/4、疫苗等)和CD40L(诸如AdcuCD40L)；
干扰素调节因子-1(IRF1)、干扰素调节因子-5(IRF5)的激活剂；信号转导子与转录活化子1(STAT1)，诸如IFNγ、vadimezan(DMXAA；信号转导子与转录活化子3(STAT3)；
toll样受体(TLR)激动剂(诸如咪喹莫特、合成的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)、TLR4配体)；和
p65–p50 NFκB和MyD88的激活剂；
或其任意组合。
在一些实施方案中，所述组合物包含HDACi的一种或多种作为合适的再极化剂。合适的HDACi的实例包括但不限于TMP195、MC1568、TMP269、(芳基氧代丙烯基)吡咯基异羟肟酸酯、曲古抑菌素A、trapoxin B、盐酸吐巴司他丁A(抗HDAC7)、帕比司他、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)I类和II类抑制剂伏立诺司他(
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Merck)、罗米司他
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缩酚酸肽,FK-228)、贝林司他(PXD-101)、帕比司他(LBH589)、达西司他(LAQ824)、SB939、西达本胺(Chidamide)、泛HDAC抑制剂(诸如吉维司他(ITF2357)、PCI 2478、R306465(JNJ-16241199)、雷斯米司他(4SC-201))、丙戊酸、丁酸、苯丁酸、AN9/Pivanex、I类-选择性HDAC抑制剂苯甲酰胺类或amino analides(诸如CI-994、恩替司他(SNDX-275/MS-275)、莫西司他(MGCD0103)、阿贝司他(PCI-24781)、奎司司他(JNJ-26481585)、HBI-8000、凯维特林(Kevetrin)、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344和莱菔硫烷。在至少一个实施方案中，合适的HDACi是TMP195。
在人乳腺癌中MARCO由免疫抑制性TAM表达。M2巨噬细胞，特别是免疫抑制性TAM的重编程或再极化是非常需要的。因此，在一些实施方案中，再极化剂是MARCO抑制剂。MARCO抑制剂可以是抗MARCO抗体(诸如ab103311、单克隆ED31、PLK-1、ABN 1389)、抗MARCO ScFv、Fab、Fab’和Fab2、抗MARCO ScFv mRNA、抗MARCO miRNA、MARCO反义RNA、MARCO siRNA或其任意组合。在至少一个实施方案中，抗MARCO抑制剂是抗MARCO抗体或ScFv。
一个方面，本发明公开了向受试者的乳腺导管导管内施用包含抗MARCO抗体或ScFv的组合物能够在M2巨噬细胞中诱导抗体依赖性细胞死亡(ADCC)。
在至少一个实施方案中，再极化剂是IL-12。
阻断剂
一方面，本公开提供了包含极化阻断剂的组合物，所述极化阻断剂能够在TME中阻断浸润性单核细胞、乳腺组织驻留巨噬细胞、M1巨噬细胞变成M2极化巨噬细胞的极化。不希望受任何理论或机制的束缚，导管内施用包含阻断剂的组合物减少了TME中的M2巨噬细胞的数量。在一些实施方案中，M1巨噬细胞增加。在其他实施方案中，M2巨噬细胞与M1巨噬细胞的比率被改变。在其他实施方案中，阻断剂的施用导致促炎因子诸如细胞因子、趋化因子和生长因子等(诸如IFNγ、IL-1、IL-1β、TNF-α、GM-CSF)的增加。在其他实施方案中，施用阻断剂导致抗炎因子诸如细胞因子、趋化因子和生长因子等(诸如IL-4、IL-13、IL-10、TGFβ、VEGF、MMP)减少。
另外，在乳腺癌模型中阻断CSF-1和CSF-1受体(CSF-1R)已显示，肿瘤中单核细胞和巨噬细胞向TME的浸润减少，肿瘤中细胞毒性CD8+T细胞增加。这表明抑制CSF-1和CSF-1R与肿瘤中CD8+T细胞增加相关。
适用于本公开的目的的M2极化阻断剂可以是阻断浸润性单核细胞、乳腺组织驻留巨噬细胞、M1巨噬细胞极化变成M2极化巨噬细胞的任何极化阻断剂。实例包括但不限于抗CSF-1抑制剂、抗CSF-1R抑制剂、抗MCP-1抑制剂、抗IL-4抑制剂(诸如帕考珠单抗、皮特克拉(pitrakinra)和杜比单抗)、抗IL-13抑制剂(诸如来瑞珠单抗、安芦珠单抗、lebrikizunab和曲洛克木单抗(tralokinumab)、抗IL-4/IL-13抑制剂(诸如杜普利单抗)、STAT3抑制剂(诸如索拉非尼、舒尼替尼、WP1066和白藜芦醇)和STAT6抑制剂(诸如芬维A胺(4-HPR)、来氟米特、TMX264和AS1217499)。
本领域技术人员将认识到，再极化剂可以起到极化阻断剂的作用。
适用于本公开的目的的再极化剂可以是将M2巨噬细胞再极化为M1巨噬细胞的任何类型的再极化剂。同样地，适用于本公开的目的的极化阻断剂可以是任何类型的阻止巨噬细胞极化变成M2巨噬细胞的再极化剂。作为非限制性实例，此类试剂可以是小分子抑制剂、小分子激活剂、基因、DNA、多核苷酸、寡核苷酸(ODN)、适体、树状聚合物、拷贝DNA(cDNA)、裸RNA、信使核糖核酸(mRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA(ASR)、沉默者RNA(siRNA)、长的非编码RNA(lncRNA)、蛋白质、多肽、肽、拟肽、诱饵序列、DNA疫苗、RNA疫苗、自扩增mRNA复制子、抗体(人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、双特异性抗体等)、单链可变片段(ScFv)、Fab片段、Fab’、Fab2、糖类、多糖、基因疗法(诸如CRISPR/Cas9介导的基因编辑)等。
用于实施本发明的蛋白质、多肽和肽可以从天然来源分离而来，可以是合成的，或者是重组产生的多肽。可在体外或体内重组表达肽和蛋白质。用于实施本发明的蛋白质、肽和多肽可用本领域已知的任何方法来制备和分离。用于实施本发明的蛋白质、多肽和肽也可使用本领域公知的化学方法来全部或部分合成。参见，例如，Caruthers(1980)NucleicAcids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；Banga,A.K,Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing andDelivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.,Lancaster,Pa。例如，肽合成可以使用各种固相技术(参见例如，Roberge(1995)Science 269:202；Merrifield(1997)MethodsEnzymol.289:3-13)来进行，并且可以例如按照造商提供的说明，使用ABI431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动合成。
可根据需要从公开的和商购可得的资源或本领域已知的资源(如从NCBI Genbank和序列查看器(sequence viewer))来确定再极化剂和极化阻断剂的序列(例如，蛋白质、多肽、基因、脱氧核糖核酸、核苷酸序列)。
可以以各种形式递送多核苷酸。在一些实施方案中，可以线性形式或插入质粒(诸如表达质粒)形式使用裸多核苷酸。在其他实施方案中，可使用活载体，诸如病毒或细菌载体。可存在一个或多个有助于将DNA转录成RNA和/或将RNA翻译成多肽的调控序列。在一些情况下，诸如在多核苷酸是信使RNA(mRNA)分子的情况下，不需要与转录过程相关的调控序列(例如启动子)，并且在启动子不存在的情况下可以实现蛋白质表达。本领域技术人员可根据情况需要包括合适的调控序列。
在一些实施方案中，多核苷酸存在于表达盒中，在所述表达盒中，多核苷酸与调控序列可操作地连接，所述调控序列将允许多核苷酸在向其施用本发明组合物的受试者中表达。表达盒的选择取决于向其施用组合物的受试者以及表达多肽所需的特征。
通常地，表达盒包括在受试者中起作用的并且可以是组成型的或诱导型的启动子；核糖体结合位点；起始密码子(ATG)(如果需要)；编码目标多肽的多核苷酸；终止密码子；和任选地3’末端区域(翻译和/或转录终止子)。可包含额外的序列，诸如编码信号肽的区域。编码目标多肽的多核苷酸可以与表达盒中的任何另外的调控序列同源或异源。要与目标多肽一起表达的序列，诸如信号肽编码区，通常位于编码要表达的蛋白质的多核苷酸附近，并被置于适当的阅读框架中。由编码要单独表达的或与要表达的任何其它序列(例如信号肽)一起表达的蛋白质的多核苷酸构成的开放阅读框架被置于启动子的控制之下，使得在向其施用该组合物的受试者中发生转录和翻译。
在一些实施方案中，再极化剂或阻断剂包含CRISPR-Cas9辅助盒，其用于在M2巨噬细胞中通过CRISPR-Cas9辅助盒交换进行原位基因编辑。
组合物将以有效地使M2巨噬细胞再极化或阻断浸润性单核细胞和巨噬细胞向M2巨噬细胞的极化的量包含极化剂或阻断剂或两者。
载体
另一方面，本公开提供了包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物还可包含药学上可接受的载体。
待选择的载体可部分由特定的再极化剂或阻断剂和/或施用方法决定。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体通常在所用的剂量和浓度下对受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属配合物(诸如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
合适的防腐剂可以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。
在一些方面，缓冲剂包含在组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。在例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中更详细地描述了示例性的方法。
制剂可包括水溶液。
在一些实施方案中，组合物的载体可包含疏水物质的连续相，诸如液体疏水物质。连续相可以是基本上纯的疏水物质或疏水物质的混合物。另外，载体可以是水在疏水物质中的乳液或水在疏水物质混合物中的乳液，只要疏水物质构成连续相即可。
可用于本文所述组合物的疏水物质是药学上可接受的那些物质。载体优选为液体，但是某些在大气温度下不是液体的疏水物质可以例如通过加热进行液化，并且在本发明中也是有用的。在一个实施方案中，疏水载体可以是磷酸盐缓冲盐水。
油或油包水乳液是用于本发明的特别合适的载体。油应该是药学上可接受的。合适的油包括例如矿物油(尤其是轻质或低粘度矿物油，诸如
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6VR)、植物油(例如，大豆油)、坚果油(例如，花生油)或其混合物。在一个实施方案中，油是矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯，其可以以
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ISA 51商购获得。还可使用动物脂肪和人造疏水聚合材料，特别是在大气温度下为液体或相对容易液化的那些材料。
在组合物被描述为无水脂质体悬浮液(“无水”)的本文的实施方案中，只要水存在于载体的非连续相中，这些“无水”组合物的疏水载体可能仍然含有少量的水。例如，组合物的单个组分可能具有结合水，所述结合水可能不能通过诸如冻干或蒸发的过程完全除去，并且某些疏水载体可能含有少量溶解在其中的水。通常，被描述为“无水”的本发明组合物包含，例如，基于组合物载体组分总重量的重量/重量，少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的水。
另一方面，本公开提供了包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物，其被配制成脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体。因此，在一些实施方案中，包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体中。在其他实施方案中，包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体的表面上。如Tang等人(FASEB J.2016年9月；30(9):3097–3106)所述，可从受试者的促炎单核细胞、外周血来源的单核细胞和M1巨噬细胞中收获外来体。
制备脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体的方法在本领域是公知的。
脂质体是包含截留的水性体积的完全封闭的脂质膜。脂质体可以是单层小囊泡(具有单个双层膜)或以多层膜双层为特征的多层小囊泡，每个双层可以与相邻的双层间隔水层或可以不与相邻的双层间隔水层。如本文和权利要求书中所用，术语“脂质体”旨在涵盖如上所述的所有此类小囊泡结构，包括但不限于本领域中描述为“囊泡体(niosome)”、“转移体(transfersome)”和“病毒体”的那些小囊泡结构。脂质体颗粒的两亲性结构使得亲水性和疏水性药物均能够被包封。
制备脂质体的方法在本领域是公知的。脂质体的一般性论述可见于Akbarzadeh等人Nanoscale Research Letters 2013,8:102；Gregoriadis G.Immunol.Today,11:89-97,1990和Frezard,F.,Braz.J.Med.Bio.Res.,32:181-189,1999中。在本发明的实践中可使用任何合适的制备脂质体的方法，或者可从商业来源获得脂质体。脂质体通常通过用水溶液水合将形成脂质双层的脂质体组分(例如磷脂和胆固醇)来制备，所述水溶液可以是纯水或一种或多种溶于水的组分的溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、无磷酸盐盐水或任何其它生理相容的水溶液。
脂质体组合物可以例如通过使用天然脂质、合成脂质、鞘脂、醚脂质、甾醇、心磷脂、阳离子脂质和用聚(乙二醇)和其它聚合物修饰的脂质来获得。合成脂质可包括以下脂肪酸成分；月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、花生酰基、油酰基、亚油酰基、芥酰基或这些脂肪酸的组合。特别适用于制备脂质体的脂质包括但不限于磷脂、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、三油酸甘油酯、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛酸甘油酯、三油酸甘油酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油酰-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉鎓(DOTIM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)。
阳离子合成脂质诸如DOTAP和DOTIM可用于制备对肿瘤脉管系统和乳腺导管具有亲和力的阳离子脂质体。在一些实施方案中，使用阳离子合成脂质制备脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束。
尽管本发明中可以使用任何脂质体，包括由古细菌脂质制成的脂质体，但在至少一个实施方案中，将磷脂和未酯化的胆固醇用于脂质体制剂中。胆固醇用于稳定脂质体，任何其他稳定脂质体的化合物都可以代替胆固醇。其他脂质体稳定化合物是本领域技术人员已知的。例如，饱和磷脂产生具有更高转变温度(表明稳定性增加)的脂质体。
优选用于制备脂质体的磷脂是那些具有至少一个选自由以下组成的组的头部基团的那些磷脂：磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸胆碱和磷酸肌醇。在一些实施方案中，脂质体包含为94-100％磷脂酰胆碱的脂质。此类脂质可以以卵磷脂
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90G商购获得。当未酯化的胆固醇也用于脂质体制剂时，胆固醇的用量相当于磷脂重量的约10％。如果使用除胆固醇外的化合物来稳定脂质体，则本领域技术人员可以容易地确定组合物中所需的量。
在其它实施方案中，可将脂质体组分或脂质体组分的混合物，诸如磷脂(例如
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90G)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、三油酸甘油酯、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛酸甘油酯、三油酸甘油酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷-乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)溶解在有机溶剂(诸如氯仿和甲醇的混合物)，然后过滤(例如PTFE 0.2μm过滤器)和干燥，例如通过旋转蒸发，以除去溶剂。
所得脂质混合物的水合可通过例如将脂质混合物注射到水溶液中或超声处理脂质混合物和水溶液来实现。在脂质体的形成过程中，脂质体组分形成包围一定体积的水溶液的单个双层(单层的)或多个双层(多层的)，脂质体组分用该水溶液水合。
在其他实施方案中，可将脂质体与包含连续疏水相的载体组合。
如果载体仅由疏水物质或疏水物质的混合物(例如使用100％矿物油载体)组成，则可将脂质体简单地与疏水物质混合，或者如果有多种疏水物质，则与它们中的任一种或组合混合。相反，如果包含疏水物质的连续相的载体包含不连续的水相，则载体通常将采取疏水相中水相的乳液形式，诸如油包水乳液。此类组合物可含有乳化剂以稳定乳液并促进脂质体的均匀分布。为了促进脂质体在载体中的均匀分布，即使使用无水载体，乳化剂也是有用的。典型的乳化剂包括二缩甘露醇油酸酯(ArlacelTM A)、卵磷脂(例如，S100卵磷脂)、磷脂、TweenTM 80和SpansTM20、80、83和85。在一些实施方案中，疏水物质与乳化剂的体积比(v/v)在约5:1至约15:1的范围内。在至少一个实施方案中，该比率约为10:1。
可将脂质体添加到最终的乳液中，或者它们可以在乳化之前存在于水相或疏水相中。在一些实施方案中，然后可将脂质体脱水，诸如通过冷冻干燥或冻干。
可在配制过程中的不同阶段引入再极化剂、阻断剂或两者。可将一种以上类型的再极化剂或阻断剂掺入组合物中(例如，抗体和小分子抑制剂或siRNA和mRNA、多肽和核酸疫苗等)。
在一些实施方案中，极化剂或阻断剂或两者都存在于用于水合用于形成脂质体的脂质双层的组分(例如，一种或多种磷脂和胆固醇)的水溶液中。在该情况下，极化剂或阻断剂或两者将被包封在脂质体中，存在于其含水内部。如果所得脂质体未被洗涤或干燥，以致存在残留水溶液，其最终与包含疏水物质的连续相的载体混合，则有可能在最终产品的脂质体外部存在额外的极化剂或阻断剂。
在相关技术中，在与水溶液水合之前，可将极化剂或阻断剂或两者与用于形成脂质体的脂质双层的组分混合。还可将极化剂或阻断剂或两者都加入到预先形成的脂质体中，在该情况下，可主动地将抗原加载到脂质体中，或者与脂质体的表面结合，或者抗原可保留在脂质体的外部。在此类实施方案中，在加入极化剂或阻断剂或两者之前，预形成的脂质体可以是空的脂质体(例如，不含包封的极化剂或阻断剂)，或者预形成的脂质体可包含掺入脂质体或与脂质体结合的极化剂或阻断剂。这些步骤可以在与包含疏水物质的连续相的载体混合之前进行。
在一个替代方法中，在将载体与脂质体组合之前、期间或之后，可以相反地将极化剂或阻断剂或两者与包含疏水物质的连续相的载体混合。如果载体是乳液，则在乳化之前，可将极化剂或阻断剂或两者与水相或疏水相之一或两者混合。或者，可在乳化之后将极化剂或阻断剂或两者与载体混合。在一些实施方案中，极化剂或阻断剂或两者可存在于脂质体中，也可以存在于包含疏水物质的连续相的载体中。
如果包含极化剂或阻断剂或两者的组合物还包含另外的治疗剂，则可以如上所述组合所述另外的治疗剂。
可将保持生物活性或提高化学稳定性以延长再极化剂和阻断剂的保质期的稳定剂诸如糖(诸如蔗糖)、抗氧化剂诸如α-生育酚，或防腐剂添加到此类组合物中。其他赋形剂可包括盐，诸如氯化钠(NaCl)和氯化钙、无水磷酸氢二钠(disodium phosphatedehydrate)、磷酸二氢钾。
在一个实施方案中，为了配制本发明的组合物，在再极化剂或阻断剂(诸如抗MARCO ScFV或抗MARCO抗体、IL-12mRNA或TMP195)存在的情况下任选地在磷酸盐缓冲液中水合S100卵磷脂和胆固醇(例如，10:1w:w)的均匀混合物，以形成具有包封的再极化剂或阻断剂的脂质体。然后可任选地通过手动微型挤出机挤出脂质体制剂，并任选地将其与另外的治疗剂或成像剂混合。然后可将该悬浮液冻干并在包含疏水物质的连续相的载体中复原，以形成无水的脂质体悬浮液。
在一些实施方案中，可通过任选地在磷酸盐缓冲液中水合至少一种脂质组分与再极化剂、阻断剂或两者的均匀混合物以形成包封有再极化剂、阻断剂或两者的脂质体来配制组合物，所述脂质组分选自由以下组成的组：三油酸甘油酯(triolein)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dipalmytoilphospatidylglycerol，DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛酸甘油酯、三油酸甘油酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂(0.01mg/ml至0.2mg/ml)、脑磷脂(0.005mg/ml至0.05mg/ml)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)(例如，10:1w:w)。
在其它实施方案中，所述组合物可通过在再极化剂、阻断剂或两者存在的情况下，任选地在磷酸盐缓冲液中水合至少两种脂质组分以形成包封有再极化剂、阻断剂或两者的脂质体来配制组合物，所述脂质组分选自由以下组成的组：三油酸甘油酯、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛酸甘油酯(tricaprylin)、三油酸甘油酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂(0.01mg/ml至0.2mg/ml)、脑磷脂(0.005mg/ml至0.05mg/ml)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)(例如，10:1w:w)。
在一些实施方案中，可以通过在再极化剂、阻断剂或两者的存在下，任选地在磷酸盐缓冲液中，水合二油酰-磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇(例如，10:1w:w)的均匀混合物，以形成包封有再极化剂、阻断剂或两者的脂质体来配制所述组合物。
一方面，本公开提供了包含极化剂或阻断剂或两者的组合物被配制成纳米颗粒。在一些实施方案中，这样的纳米颗粒可以是脂质纳米颗粒(诸如经修饰的脂质体)。已证明纳米尺度的经修饰的脂质体在递送DNA、反义寡核苷酸、siRNA、蛋白质和化学治疗剂方面具有优异的药代动力学特征谱。因此，在一些实施方案中，极化剂或阻断剂或两者都包含在脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，将极化剂或阻断剂或两者加载到纳米颗粒(例如，脂质颗粒，诸如实施例1所示的脂质包覆纳米颗粒)或脂质体的表面上。
其他合适的纳米颗粒包括聚合物纳米颗粒(例如，使用可生物降解的合成聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚丙烯酸酯和聚己内酯，或天然聚合物，诸如白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原和壳聚糖制造的)、聚合物胶束、水凝胶纳米颗粒、树状聚合物、贵金属纳米颗粒(诸如金纳米颗粒)等。
在一些实施方案中，组合物包含平均(average)或平均(mean)直径不大于约1000纳米(nm)，诸如不大于约900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm和100nm中的任何一个的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均直径不大于约200纳米。在一些实施例中，纳米颗粒的平均直径不大于约150纳米。在一些实施例中，纳米颗粒的平均直径不大于约100纳米。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均直径为约20至约400nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均直径为约40至约200nm。在一些实施方案中，纳米颗粒是无菌过滤的。
在一些实施方案中，再极化剂和阻断剂从纳米颗粒和脂质体响应性聚合物或水凝胶中的释放可由pH、温度、射频或磁场的变化触发。
一方面，本公开提供了将纳米颗粒和脂质体配制用于靶向药物递送。这种靶特异性通过将纳米颗粒和脂质体与一种或多种靶向M2巨噬细胞的细胞靶向剂缀合来实现。适用于本发明的目的的细胞靶向剂可以是任何M2-巨噬细胞选择性细胞表面分子。本公开提供了用一种或多种M2巨噬细胞选择性细胞表面分子包覆纳米颗粒和脂质体。本领域技术人员将认识到，M2-巨噬细胞选择性细胞表面分子可以仅存在于M2-巨噬细胞上，但也可以存在于非M2巨噬细胞上。然而，合适的M2-巨噬细胞选择性细胞表面分子是仅在于M2-巨噬细胞上表达或在M2-巨噬细胞上的表达水平高于在非M2-巨噬细胞上的表达水平的那些分子。适用于本发明的目的的M2巨噬细胞选择性细胞表面分子包括但不限于IL-13Rα、CD163、CD206、CD200R、MerTK、清道夫受体A、清道夫受体B、MARCO和F4/80。
本文所述的纳米颗粒可存在于无水制剂(诸如冻干组合物)中，或者悬浮在生物相容性介质中。合适的生物相容性介质包括但不限于水、缓冲的水性介质、盐水、缓冲盐水、任选地缓冲的氨基酸溶液、任选地缓冲的蛋白质溶液、任选地缓冲的糖溶液、任选地缓冲的维生素溶液、任选地缓冲的合成聚合物溶液、含脂质乳液等。
纳米颗粒可以通过本领域已知的任何方法(参见Pal等人，Journal of AppliedPharmaceutical Science 01(06)；2011:228-234；Hu Y等人Nanoparticles.NanoLetters.2007；7:3056–3064；Hu YH等人Biomacromolecules.2009；10:756–765；Lynn DM,Langer R.Journal of the American Chemical Society.2000；122:10761-10768)制备。
极化剂和阻断剂的添加可以通过任何已知的合适方法来实现。作为非限制性实例，可以如Goncalves等人所描述的，将DNA序列以线性形式或作为质粒和盒添加到脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体中。
本公开提供了脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束的脂质与核酸的比率(lipid to nucleic acid ratio，LNR)范围为30:1至2.5:1。在一些实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束的LNR范围为25:1至5:1。在至少一个实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束的LNR范围为20:1至10:1。
本公开提供了脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束的脂质与蛋白质的比率(lipid to protein ratio，LPR)范围为30:1至1:1。在一些实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束的LNR范围为25:1至5:1。在至少一个实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束的LNR范围为20:1至10:1。
本公开提供了本发明的脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和胶束的小分子药物与脂质的比率(drug to lipid，D/L)通常为每mg脂质至少0.05、0.1、0.2、0.35、0.5或至少0.65mg药物。就摩尔比而言，根据本发明的D/L比率为每摩尔脂质至少约0.02至约5、至少0.1至约2以及约0.15至约1.5摩尔的药物。
一方面，本公开提供了包含极化剂或阻断剂或两者的组合物还包含成像剂、染料或造影剂。合适的成像剂可以是钆螯合剂、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因，诸如基于金属蛋白的MRI探针。本文公开的成像剂、染料和造影剂的添加提供了跟踪本文公开的组合物的导管内递送和吞噬这些组合物的巨噬细胞的迁移的额外有利方面。
另一方面，本公开提供了包含极化剂或阻断剂或两者的组合物还包含另外的治疗剂。这种另外的治疗剂可以是用于治疗乳腺病症的任何药剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是检查点抑制剂、抗激素剂、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨、紫杉醇或卡铂和聚乙二醇化脂质体多柔比星)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、曲妥珠单抗、阿多-曲妥珠单抗美坦辛、培妥珠单抗、阿博西尼、帕博西尼、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法以及其他过继性细胞疗法中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是选自由以下组成的组的抗激素剂的一种或多种：他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是检查点抑制剂中的一种或多种，包括选自由以下组成的组的检查点抑制剂：抗-PD-1(诸如纳武单抗)、抗-PD-1L(诸如阿特朱单抗(MPDL3280)、阿维单抗(MSB0010718C)、德瓦鲁单抗MDX-1105)、抗-CTLA4(例如伊匹单抗)和抗-LAG-3(诸如IMP321、BMS-986016和GSK2831781)或其组合。
在一些实施方案中，组合物被配制成贮库制剂。
本文公开的组合物适于对受试者的乳腺导管进行导管内施用。
递送方式；装置
一方面，本公开提供了包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物可通过本领域已知的任何方法导管内递送到受试者的一个或多个乳腺导管中。这些方法包括但不限于使用注射器/针头的注射(Krause等人J.Vis.Exp.2013；(80):50692)；插管、导管、探针以及美国专利6,413,228、6,689,070、6,638,727、专利申请PCT/US2015/010808中公开的那些方法、时间释放胶囊和封装装置等。
作为一个非限制性实例，在一些实施方案中，可将本文公开的细胞或组合物施用于受试者的乳腺乳管，包括(a)将包含在装置的处理室室内的包含经修饰的细胞的组合物与乳腺的乳头接触；以及(b)在组合物上施加正压。在一些实施方案中，组合物由于正压而被迫进入乳腺导管。优选地，组合物被压入一个或多个乳腺导管中。在其它实施方案中，组合物被压入2至5个乳腺导管、4至8个乳腺导管或7至11个乳腺导管中。
例如，美国专利6,413,228公开了导管进入装置，其能够收集导管流体并向导管注入清洗流体。出于本公开的目的，这种装置可经适当地调整或配置以用于本发明组合物的导管内递送。
在一些实施方案中，该装置是插管或微插管。
作为导管内施用的一种替代方法，可在导管内或乳头表面安装小泵，该小泵可以接近导管，用于将经修饰的细胞缓慢连续地施用到导管区域，例如，可在泌乳窦内安装泵，用于施用其中的经修饰的细胞，并使细胞扩散到导管的其余部分，或者可将泵安装在乳头表面，该泵可以接近导管。安装在乳头表面的泵可以成形为例如像大头钉(或套筒形部分，其具有顶部或大头钉部分，其余部分在乳头表面上，其一部分延伸到需要治疗或有需要治疗的风险的导管中)。泵机构可以包括，例如，DDurosTM渗透(微)泵(Viadur)(由Johnson&Johnson,IntelliDrug收购的Alza Corp制造)、IntelliDrug,
Figure BDA0002618985480000351
(Durect Corp.)、Ivomec
Figure BDA0002618985480000352
bolus等(Herrlich等人Advanced Drug Delivery Reviews.2012，第1617-1626页)。
渗透泵也可以基本上按照美国专利第5,531,736号、第5,279,608号、第5,562,654号、号5,827,538、第5,798,119号、第5,795,591号、第4,552,561号或美国专利第5,492,534号中描述的泵进行组装或配置，在尺寸和体积上进行了适当的修改，用于对乳腺的导管进行施用，例如用于放置在导管(例如泌乳窦)中或放置在乳头表面上。尖端(进入导管)可以旋转，以适应乳头表面上不同位置的导管。单个钉头泵可具有一个或多个位于钉头下方的尖端，以便进入特定的一个或多个导管，例如，需要进入乳腺中的两个或多个导管的地方。如此配置并装载有适当配制的组合物(包含用于导管内施用的极化剂或阻断剂或两者)的泵，可施用所述组合物，但也可含有并施用除本文公开的组合物之外的用于治疗乳腺导管中的癌前或癌症病症的适当治疗目的的剂。可以想象，该泵可被配置为对位于乳腺中的所有导管进行施用，具有一些尺寸和体积变化。
封装装置是另一种有吸引力的方法，包括微囊化和宏封装装置。已经开发了自折叠免疫保护封装装置，其中通过用合成半透性纳米多孔膜包围细胞来免疫隔离细胞，该膜允许营养物和治疗剂的选择性渗透。此类封装装置包括小袋、纤维、珠粒和任何由半透性材料制成的装置，细胞被容纳在该装置中。此类装置可被配置用于治疗，例如，可用可生物降解的材料制备，以便在导管内释放细胞。
可用于本发明目的的装置可以是可植入的。例如，Stephan等人已经描述了用于递送组合物的生物聚合物植入物(Stephan等人Nature Biotechnology,2015,33,97-101。一方面，本文提供了可植入的装置，例如插管、微插管、导管、微导管、珠粒、封装装置等。例如，可植入装置可被配置成将本发明的细胞和组合物释放到受累组织附近，并减少它们对正常细胞的暴露。
在另一方面，本文公开的组合物的导管内递送可用离子导入(iontophoresis)来辅助，所述离子导入包括向乳腺施加电流，该电流帮助细胞迁移到乳腺的导管中和/或导管内。
给药
本文公开的组合物的给药时间安排和剂量大小通常被设计成降低毒性后果的风险或使毒性结果最小化和/或提高功效，例如随着时间的推移，使受试者更快和更多地暴露于组合物。施用的量和频率将由诸如患者的病情、年龄、体重、肿瘤尺寸和分期、表面积和受试者疾病的严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可由主治医生决定。
医学领域的技术人员可通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗来容易地确定最佳剂量和给药方案。可以在这些剂量下多次施用组合物。因此，该方法可包括一段时间内的单剂量或多剂量，或者例如通过输注的连续剂量。在一些实施方案中，剂量可以是单个单位剂量。在其他实施方案中，单个剂量可以是分开的单位剂量。如本文中所用，术语“分割的单位剂量”是指单位剂量被分割，使得其在一天内(包括超过一天)施用超过一次。出于本发明的目的，分割的单位剂量被认为是单一的，即一个单位剂量。分割剂量的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量，并在第二天施用剩余的剂量。在另一个实施方案中，可将单位剂量分割成2份(每份50％)以在连续2天内递送。在又一个实施例中，可在两个交替的日子给予分割的单位剂量。在另一个实施方案中，可将单位剂量分成3份，在连续3天内平均施用。
一个方面，本发明提供了以每单位剂量1x 104至1x 108个脂质体微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡或外来体的浓度导管内施用包含脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和外来体中的任何一种的组合物。
本文公开的方法包括将一个或多个连续剂量的细胞施用到可能已经接受第一剂量的受试者的乳腺导管中，和/或施用第一剂量和一个或多个后续剂量。以特定的量并根据特定的时间表和参数施用剂量。
另一方面，导管内施用第一剂量，任何后续剂量通过任何合适的方式施用，包括导管内、通过注射和通过输注，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经间隔注射、巩膜下注射、巩膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjectval injection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、筋膜囊下注射、眼球后注射、眼球周注射或后巩膜旁递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则通过病变内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸腔内、颅内或皮下施用。
在一些实施方案中，该方法通常包括导管内施用本文公开的第一剂量的组合物，从而减少疾病负担。随后可在相对于第一剂量的特定时间窗内施用后续剂量的组合物，或者向已经接受第一剂量的受试者施用后续剂量的组合物。在一些实施例中，第一剂量相对较低。施用的组合物的量和组合物的剂量的时间安排被设计成改善一个或多个结果，诸如免疫抑制的减少、肿瘤尺寸的减小和促炎性的细胞因子、趋化因子、至M1巨噬细胞的M2再极化、细胞毒性T淋巴细胞的募集等的增加。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括以比第一/初始剂量增加的数量，从而以更高的剂量，施用后续剂量的组合物。
当给药方案涉及多个剂量时，可以每天施用(一天施用几次(两次、三次、四次等))、隔天施用、每2天施用、每3天施用、每5天施用、每7天施用、每14天施用、每15天施用、每28天施用、每月施用、每季施用、每6个月施用和每年施用一个剂量。
在一些方面，从初始(第一)剂量的开始到下一剂量的开始，测量初始剂量之后的剂量时间安排。在其他实施方案中，初始剂量之后的剂量时间安排是从初始(第一)剂量完成开始测量的。
本发明包括初始剂量可以是分割的单位剂量，随后是此后施用的第二剂量。在一些实施方案中，第二或后续剂量可以是分割的单位剂量。作为非限制性实例，可以在三天内施用分割的单位剂量，并且第二单位剂量在第二天施用，或者可以在一年后施用。初始剂量旨在通过暗示受试者以前从未接受过细胞疗法的剂量，或者甚至受试者以前从未接受过表达相同重组受体或靶向相同抗原的相同细胞的剂量，对需要这种剂量的受试者产生任何限制。
通常，可以以每单位剂量1x 104至1x 108个脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡或外来体中的任一种导管内施用本文所述的组合物。
联合治疗
本发明设想了本文公开的导管内方法还包括联合治疗。一方面，导管内方法还包括向受试者施用一种或多种另外的治疗剂或疗法。可通过本领域已知的任何合适的方式受试者施用于向另外的治疗剂，所述方式包括但不限于导管内、局部、口服、经鼻、通过注射或输注的肠胃外、皮下等。另外的治疗剂可以包含在本文公开的组合物中，或者可以独立配制。治疗剂和/或疗法的施用顺序可以是任何施用顺序。例如，可将本文公开的组合物与另外的治疗剂共同施用，或者可以首先施用另外的治疗剂，或者可以在施用本发明的组合物之后施用另外的治疗剂。
另外的治疗剂可以是对本发明的目的有用的任何治疗剂。
示例性另外的治疗剂包括但不限于检查点抑制剂、抗激素剂、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨、紫杉醇或卡铂和聚乙二醇化脂质体多柔比星)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、曲妥珠单抗、阿多-曲妥珠单抗美坦辛、培妥珠单抗、阿博西尼、帕博西尼、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法以及其它过继性细胞疗法。
另外的疗法可包括手术、辐照、化学疗法、针灸、非经乳头(non-transpapillary)过继细胞疗法等。本文公开的方法可用作主要疗法、新辅助疗法(例如，手术(诸如乳房切除术或乳房肿瘤切除术)或化学疗法之前)或辅助疗法(仅出于说明目的，在化学疗法或利用过继性细胞疗法的其他方法的治疗后)。
制品
本文还提供了制品，诸如试剂盒和装置，用于施用本文公开的用于过继性细胞疗法的细胞和组合物，以及用于储存和施用细胞和组合物。
制品包括本文公开的组合物、一个或多个容器、包装材料和标签或包装插页，通常包括向受试者施用细胞的说明。
容器包含一个或多个单位剂量的待施用的组合物。在一些实施例中，制品包括一个或多个容器，每个容器包含单个单位剂量的组合物。单位剂量可以是要以第一剂量向受试者施用的脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和外来体中的任一种的量或数量，或者是以第一剂量或一个或多个后续剂量施用的纳米颗粒、脂质体等的量或数量的两倍(或更多)。其可以是结合施用方法向受试者施用的纳米颗粒、脂质体等的最低剂量或可能的最低剂量。
在一些实施方案中，每个容器单独包含单位剂量的组合物，该组合物包含相同或基本相同数量的以下任何物质：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和外来体。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或近似或基本相同数量的以下的任一种：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和外来体。在一些实施方案中，单位剂量包括1X 104个或更多的以下的任一种：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、外来体。在一些实施方案中，单位剂量包括1X 104至1X 108个以下的任一种：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡和外来体。
在一些实施方案中，制品还包含另外的治疗剂，例如检查点抑制剂、抗激素剂、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨、紫杉醇或卡铂和聚乙二醇化脂质体多柔比星)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、曲妥珠单抗、阿多-曲妥珠单抗美坦辛、培妥珠单抗、阿博西尼、帕博西尼、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其它过继性细胞疗法。抗激素剂可以选自由以下组成的组：他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬(bazedofoxifene)、阿佐昔芬(arzoxifene)、米泼昔芬(miproxifene)、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652。
在一些实施方案中，制品还包括成像剂、染料或造影剂，其选自钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒。
合适的容器包括但不限于例如瓶子、小瓶、注射器和柔性袋，诸如输液袋。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。在一些实施例中，容器具有一个或多个端口，例如无菌接入端口，例如，用于将管道或插管连接到一个或多个管，例如，用于经乳头递送和/或用于与其他容器(诸如细胞培养物和/或储存袋或其他容器)之间转移的连接。
该制品还可包括具有一条或多条识别信息和/或使用说明的包装插页或标签。在一些实施方案中，信息或说明指示内容物可以或应该用于治疗乳腺病症和/或为其提供说明。标签或包装插页可指示制品的内容物将用于治疗乳房病症。在一些实施方案中，标签或包装插页提供了治疗受试者(例如，患有乳腺病症的受试者)的说明，所述治疗通过包括导管内施用第一剂量和一个或多个后续剂量的细胞的方法进行，例如，根据所提供的方法的任何实施方案进行。在一些实施方案中，说明书规定以第一剂量施用一个单位剂量，例如制品中单个容器的内容物，随后在指定的时间点或指定的时间窗内和/或在检测到受试者中一种或多种因素或结果的存在或不存在或量或程度之后施用一个或多个后续剂量。
如本文中所用，除非上下文另有规定，否则术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数所指物。
如本文中所用，术语“约”是指可测量的值，诸如量、时间持续等，意味着包括与指定值相差±20％或在某些情况下相差±10％，或在某些情况下相差±5％，在某些情况下相差±1％，以及在某些情况下相差±0.1％，因为此类变化适合于执行所公开的方法。
如本文中所用，“活化”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞状态。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”是指，除其它以外，正在进行细胞分裂的T细胞。
如本文中所用，“辅助疗法”是指继主要疗法之后，并对有复发风险的受试者施用的疗法。这些受试者是有乳腺病症史，并接受过另一种治疗方式的治疗的受试者。乳腺癌的辅助系统疗法通常在主要疗法之后不久开始，延迟复发、延长生存期或治愈患者。如本文中所用，“主要疗法”是指在受试者中对乳腺病症进行初步诊断后的第一线治疗。非限制性示例性主要疗法可包括手术、广泛的化学治疗和放射治疗。
如本文中所用，术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物诸如人。哺乳动物还包括诸如狗、猫等的宠物动物、诸如大鼠、小鼠等的实验室动物以及诸如牛和马等的农场动物。除非另有说明，否则哺乳动物可以是任何性别。
如本文中所用，本公开的“施用途径”或“递送途径”组合物是指将本公开的组合物递送至受试者的途径。
实施例
实施例1
脂质包覆的纳米颗粒的合成
脂质包覆的纳米颗粒的制备。将如Su等人(Molecular Pharmaceutics 8,no.3(June 6,2011):774-787)所描述的那样合成具有聚-1芯的脂质包覆纳米颗粒。简言之，具有聚-1芯的脂质包覆的纳米颗粒将通过两种不同的方法合成：双乳液/溶剂蒸发方法或溶剂扩散/纳米沉淀策略。对于双乳液合成，将30mg poly-1(或PLGA(对于对pH不敏感的对照颗粒))和2mg磷脂DOPC、DOTAP和DSPE-PEG(以7:2:1的摩尔比存在)共溶于1ml二氯甲烷(DCM)中。然后将200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入到混合物中，使用探针尖超声仪(MisonixXL2000，Farmingdale，NY)在冰上，在7W下进行1分钟的超声处理步骤，以形成第一乳液。然后将初级乳液分散到6ml蒸馏的去离子无核酸酶水中，在12W下超声处理5分钟，然后在25℃下振荡18小时以蒸发有机溶剂。对于纳米沉淀合成，将相同量的DOPC、DOTAP和聚合物共溶于4ml乙醇中，滴加到40ml蒸馏的去离子无核酸酶水中，然后轻轻搅拌5小时以蒸发乙醇。将通过插入后过程DSPE引入脂质包衣：将DSPE脂质以1mM至0.5mg/ml的颗粒加入蒸馏的去离子无核酸酶水中，并将悬浮液在25℃下搅拌16小时。将收集颗粒并通过离心洗涤一次，再悬浮在新鲜水中，并在4℃下储存直至使用。除将仅含聚合物的有机乳液或溶液分散到2％w/vol的PVA水溶液中外，将通过类似的方法制备无脂质的PVA稳定化的颗粒。
将每个颗粒批次的一部分将在真空烘箱中干燥，通过测量干质量来确定颗粒浓度(mg/ml)。将动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)和ζ电位测量用于使用ZetaPALS动态光散射检测器(Brookhaven Instruments)来测定颗粒尺寸和表面电荷。为了估计掺入的脂质的百分比和存在于脂质表面包衣中的指质的所得mol％，通过如上所述的纳米沉淀制备脂质包裹的颗粒，在用羧基荧光素标记的DSPE脂质(DSPE-CF)的插入后之前，加入1mol％的DOPE-罗丹明作为示踪剂，用于测量掺入颗粒中的脂质总量。然后，用2％tritonX-100处理15分钟，从颗粒表面剥离脂质，并测量上清液中的罗丹明和荧光素信号，以定量掺入的脂质量。
为了通过低温电子显微镜(cryoEM)研究脂质包覆纳米颗粒的表面结构，将通过在1.2/1.3μm多孔碳包覆铜网格(Electron Microscopy Sciences)上吸附颗粒悬浮液(3uL)并用Leica活塞冷冻机将样品在液态乙烷中立即冷冻，从而将颗粒包埋在冰中。将样品转移到致冷保持件，并使用JEOL2200FS透射电子显微镜在185μA发射电流和40 000倍放大倍率下成像。
IL-12mRNA纳米颗粒的制备。使用Kavanaugh等人(Blood.2006；107:1963-1969)描述的方法制备合成IL-12基因。简言之，使用Message Machine T7 Ultra Transcription试剂盒(Ambion)，将具有T7启动子、开放阅读框架(GFP，811个核苷酸或萤火虫荧光素酶，1714个核苷酸)和多聚腺苷酸尾的线性化质粒DNA用作模板进行体外转录。
或者，用pGEM4Z/EGFP/A64载体中的IL-12基因替换增强型GFP(EGFP)，所述载体用于体外mRNA转录(IVT)。将使用包含通过柔性接头(InvivoGen,San Diego,CA,USA)连接在一起的IL-12的p35和p40亚单位的IL-12elasti盒。该构建体提供了两种亚单位的同等表达，并防止p40的过度表达和p40同二聚体的产生，所述同二聚体表现出IL-12p70的拮抗剂的行为。
用LiCl沉淀mRNA产物，将其重悬浮在无核酸酶的水中，用NanoDrop分光光度计定量。将用Agilient Bioanalyzer 2100测定RNA的尺寸、纯度和完整性。用这些mRNA转录物电穿孔的RMA细胞系也将用于在体外验证这些mRNA的功能。根据制造商的方案，使用Label
Figure BDA0002618985480000431
nucleic acid labeling剂盒(Mirus Bio LLC)，用荧光Cy3标签标记mRNA。
RNA的加载和释放。通过首先在无核酸酶水中将颗粒悬浮液稀释至1.5mg/ml，然后在温和涡旋下将200μl稀释的悬浮液滴加至含有4μg RNA的100μl中，来将IL-12mRNA加载到脂质包覆盖纳米颗粒的表面。然后将小瓶在4℃旋转器上孵育2小时，以允许RNA吸附。结合的RNA将通过使用荧光板读取器SPECTRAmax,Molecular Devices Corp.)在颗粒离心后测量上清液中剩余的Cy3标记的或核绿(ribogreen)染色的RNA的荧光来间接测定。结合到颗粒上的RNA将通过从含有RNA溶液但不含颗粒的相同处理的对照小瓶中测得的量减去上清液中检测到的RNA的量来测定。为了评估颗粒的结合动力学和容量，将颗粒浓度固定在合适的浓度(例如，1mg/ml)，同时改变结合时间和RNA量。结合效率将被定义为最初存在于溶液中的与颗粒结合的RNA的百分比。加载将被定义为每mg颗粒所结合的RNA的量(μg)。
如由Su等人(Molecular Pharmaceutics 8，第3期(2011年6月6日):774-787)所述，测定结合的RNA的释放动力学。为了测定结合的RNA从含有10％FBS的RPMI 1640培养基中的纳米颗粒释放的释放动力学，将颗粒吸附的poly I:C(含1.87μg poly I:C的70μg颗粒)的等分试样重新悬浮于含140μl含血清的培养基中，并轻轻混合下于37℃进行孵育。在每个指定的时间点，取出等分试样，用无核酸酶的水洗涤颗粒一次，然后重悬浮于消化缓冲液(100mM乙酸钠、2％triton X-100和1mg/ml聚(L-天冬氨酸))中，以溶解颗粒并破坏任何脂质-RNA或聚-1-RNA复合物。然后通过如上在核绿染色后测量荧光来确定颗粒上剩余的RNA的量，并且通过从原始量中减去剩余的RNA的量来计算释放的RNA的量。
实施例2
再极化剂IL-12的导管内施用。
乳头准备。在受试者脱去衣服后，临床医生将清洁要研究的乳腺上的乳头。这包括用微颗粒状凝胶或软膏擦拭清洁的乳头，以疏松和去除任何死皮细胞和积聚的油脂。这是在医疗程序前医院常用的清洁剂。之后，将一些麻木霜涂在乳头上。
乳头麻醉。用很小的针将1mL与0.1-0.2mL蓝色染料混合的利多卡因注射入乳头基部。
导管识别。在染料注射之后和导管放置之前，将小的柔性导线插入开口约1/2英寸，以进一步识别和扩张导管开口。一旦导管被识别，便将一小块打结的缝合材料插入导管中以标记其。这将在至少3个管道开口和多达5个管道开口上进行。如果临床医生无法找到至少3个导管开口，受试者将无法继续研究，并将退出研究。这些受试者将被新纳入的受试者替代。
导管放置、纳米颗粒(IL-12)的滴注和x线检查。一旦所有的乳头导管开口都被标记，临床医生将通过导管孔将导管插入并放置到所标记的每个标记的乳腺导管中。一旦导管就位，临床医生就可任选地缓慢地(超过30秒)将少于1mL的不透射线的染料滴入导管中，以允许导管成像。
在滴注染料后，根据确定的导管数量，将最高达2mL(通常在0.5至2mL的范围内)的IL-12纳米颗粒悬浮液(1X106)缓慢(超过1分钟)注射入每个导管。只有含有浸润性癌的乳房才将被治疗。根据待治疗导管的数量，将细胞分批或成组地以高达10mL的体积导管内施用至受累乳腺导管中。将根据已识别的受累导管或小叶的数量，尝试按导管平均分配剂量。
导管通常会在每个乳腺导管中停留约1-5分钟。在手术过程中，受试者被要求使用视觉模拟量表来评估他们的疼痛。在滴注染料和纳米颗粒后，将拍摄图像，以证明经修饰的细胞已充分输注入导管。当受累导管数量超过2个导管时，导管内治疗程序可以成组进行。将导管从第一组乳腺导管(例如2个相邻的乳腺导管)中取出，并且这些乳腺导管将各自用一小块打结的缝合材料标记。此时，受试者将使用疼痛评估量表进行疼痛评估。
随后，将新的导管插入剩余的标记导管中。在下一半的乳头导管已被插入导管后，染料和细胞将被注入，用荧光镜拍摄另一个图像以记录乳腺导管。受试者将再次被要求评估他们的疼痛。取出导管，并用一小块打结的缝合材料分别标记乳腺导管。将安息香软膏和透明塑料敷料(bio-occlusive)放置在乳头上，以将标记物保持在原位，直至手术。整个过程需要0.5至1.5小时。将对该过程进行拍照。
如果在疼痛评估期间，受试者报告乳腺出现3级或4级疼痛，且在输注含IL-12的纳米颗粒后10分钟内疼痛仍未消退，则将中断该受试者的研究相关程序。本文所述的抽血和随访评估以及病理评估将按照方案进行。在这种情况下，出于统计目的，替换研究组中的受试者。
如果未发现最初的x线检查穿孔，将立即评估副作用。如果受试者没有报告任何不良反应，则对剩余的乳腺导管进行插管并使用纳米颗粒进行施用。研究相关的抽血和评估以及如下所述的病理评估将按照方案进行。
体外测定—细胞因子释放。将测量受试者的血清细胞因子水平，以确定受试者中TAM的炎症状态的变化。将在第0天在纳米颗粒导管内递送之前，以及在纳米颗粒导管内施用后4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时和72小时使用可从Qiagen,Germantown,MD商购获得的Human Inflammatory Cytokines Multi-Analyte ELISArray试剂盒MEH-004A测定IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、IL12、IL17A、IFNγ、TNFα和GM-CSF的血清细胞因子水平。将使用商购可得的IL-13分泌ELISA测定，诸如来自Miltenyi Biotec andThermo Fischer的那些测定和来自R&D Biosystems的人IL-13Luminex性能测定来测定IL-13分泌的变化。将在稀释至在测定的线性范围的样品中测定细胞因子的分泌。促炎性的细胞因子和趋化因子的时间依赖性水平升高将指示受试者中M1样促炎巨噬细胞的增加。IL-4、IL-13和IL-10水平的时间依赖性降低表明M2巨噬细胞的数量和/或活性降低。
本发明的上述论述是为了说明和描述的目的而提出的。前述内容并不旨在将本发明限制在本文公开的一种或多种形式。尽管本发明的描述已经包括一个或多个实施方案的描述以及某些变化和修改，但在理解本公开之后，其他变化和修改也在本发明的范围内，例如，在本领域技术人员的技能和知识范围内。本发明旨在获得在允许的范围内包括替代实施方案的权利，包括替代的、可互换的和/或与所要求保护的结构、功能、范围或步骤等同的结构、功能、范围或步骤，无论这些替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤是否在本文中公开，并且无意公开地致力于任何可申请专利的主题。
应当理解，本文公开的包含无内西芬的碱及其盐的组合物可以用合成制备的内西芬以及分离的内西芬制备。还应理解，受试者的给药基于组合物中存在的(Z)-内西芬的量。
本文中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入，其程度如同每个单独出版物、专利或专利文件被具体和单独地指出通过引用整体并入一样。

Claims (35)

1.一种治疗患有乳腺病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者导管内递送包含能够使M2极化的巨噬细胞再极化的再极化剂或能够阻断巨噬细胞的M2极化的阻断剂或两者的组合物。
2.一种促进患有乳腺病症的受试者对化学疗法的敏感性增加的方法，所述方法包括:向所述受试者导管内施用包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物，其中所述组合物的施用促进对化学疗法的敏感性增加。
3.一种在患有乳腺病症的受试者中选择性减少M2巨噬细胞的方法，所述方法包括向所述受试者导管内施用包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述M2巨噬细胞表型是M2a表型、M2b表型和M2c表型或其组合中的任一种或多种。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含再极化剂或阻断剂或两者的所述组合物的导管内施用导致以下的一种或多种结果:
a.M2巨噬细胞减少；
b.M1巨噬细胞增加；
c.M1/M2巨噬细胞稳态；
d.抗炎性的细胞因子、趋化因子或生长因子的释放减少；
e.促炎性的细胞因子、趋化因子或生长因子的释放增加；
f.巨噬细胞的杀肿瘤活性增加；
g.细胞毒性T淋巴细胞向TME中的浸润增加；以及
h.T细胞活化增加。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物的所述导管内施用导致选自由以下组成的组的巨噬细胞群的任一种或多种的减少:
a.F4/80+巨噬细胞；
b.Grl-巨噬细胞；
c.CD63+巨噬细胞
d.CD206+巨噬细胞；
e.CD200R细胞/巨噬细胞；
f.MARCO+巨噬细胞；
g.CD68+/CD68+巨噬细胞；
h.CD68+/CD163+巨噬细胞；
i.Tie2R+细胞/巨噬细胞；
j.CD11b+/VEGF-R1+巨噬细胞；
k.CCR2+髓样细胞/巨噬细胞；
l.MerTK+巨噬细胞；
m.CD11b低/MHCII高/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+巨噬细胞；
n.CD11b+Grl-/F4/80+巨噬细胞；
o.CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6C柢/F4/80+巨噬细胞；
p.CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C-巨噬细胞；
q.CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31-巨噬细胞；和
r.CD45+/F480+/Tie2-/CD31-巨噬细胞。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含再极化剂或阻断剂或两者的组合物的所述导管内施用导致选自由以下组成的组的巨噬细胞群的任一种或多种的增加：
a.CD11b高/MHCII高巨噬细胞；
b.HLA-DRα+巨噬细胞；
c.CD64+巨噬细胞；
d.CD86+巨噬细胞；
e.CD80+巨噬细胞；
f.CD68+/CD80+巨噬细胞；
g.CD64+巨噬细胞；和
h.Ly6C高/CX3CR1高/CCR2-/CD62L-/CD43低(Ly6C高)巨噬细胞。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中导管内施用再极化剂或阻断剂或两者在受试者中减少了以下的任何一种或多种：
a.肿瘤血管生成；
b.肿瘤侵袭；
c.转移；
d.免疫抑制；
e.化学抗性；和
f.抗炎性的细胞因子、趋化因子和生长因子的释放。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述再极化剂选自由以下组成的组：芬维A胺(4-羟基(苯基)维甲酰胺，4-HPR)；IL-12；IFNγ；miR127；miR155；miR223；纳米氧化铁；以下物质的抑制剂：CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、精氨酸酶1(Arg1)、M2巨噬细胞清道夫受体(诸如A、B、MARCO)、组蛋白脱乙酰基酶(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6信号传导途径、IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、miRNA-146家族成员诸如(miRNA-146a)、let7家族成员(诸如let-7c)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187；CCR-CCl2轴信号传导、CCL2/MCP-1合成、胎盘生长因子(PlGF)(HRG)和C/EBPβ(PI3Kγ缺失)、AMPKα1(二甲双胍)、p50–p50 NFκB、NADPH氧化酶(NOX)(NOX 1和NOX 2)、Rbpj和Notch信号传导途径；以下物质的激活剂：CD40、CD40L、IRF1、IRF5、STAT1(诸如IFNγ、伐地美生(DMXAA))、STAT3、核因子κB激活剂、toll样受体(TLR)激动剂(诸如咪喹莫特)、合成的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)、p65–p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155和miR223，或其组合。
10.如权利要求9所述的组合物，其中一种或多种HDACi选自由以下组成的组：TMP195、MC1568、TMP269、(芳基氧代丙烯基)吡咯基异羟肟酸酯)、曲古抑菌素A、trapoxin B、盐酸吐巴司他丁A(抗HDAC7)、帕比司他、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)I类和II类抑制剂伏立诺司他(
Figure FDA0002618985470000031
Merck)、罗米司他(
Figure FDA0002618985470000032
)；缩酚酸肽,FK-228)、贝林司他(PXD-101)、帕比司他(LBH589)、达西司他(LAQ824)、SB939、西达本胺、泛HDAC抑制剂(诸如吉维司他(ITF2357)、PCI 2478、R306465(JNJ-16241199)、雷斯米司他(4SC-201))、丙戊酸、丁酸，苯丁酸、AN9/Pivanex、I类-选择性HDAC抑制剂苯甲酰胺类或amino analides(诸如CI-994、恩替司他(SNDX-275/MS-275)、莫西司他(MGCD0103)、阿贝司他(PCI-24781)、奎司司他(JNJ-26481585)、HBI-8000、凯维特林、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344和莱菔硫烷或其组合
11.如根据权利要求9所述的组合物，其中所述MARCO抑制剂选自由以下组成的组：抗MARCO抗体(诸如ab103311、单克隆ED31、PLK-1、ABN 1389)、抗MARCO ScFv、Fab、Fab’和Fab2、抗MARCO ScFv mRNA、抗MARCO miRNA、MARCO反义RNA、MARCO siRNA、抗MARCO DNA、抗MARCO寡核苷酸、抗MARCO肽抑制剂或其组合。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中一种或多种阻断剂选自由以下组成的组：抗CSF-1抑制剂、抗CSF-1R抑制剂、抗MCP-1抑制剂、抗IL-4抑制剂(诸如帕考珠单抗、皮特克拉和杜比单抗)、抗IL-13抑制剂(诸如安芦珠单抗、来瑞珠单抗和曲洛克木单抗)、抗IL-4/IL-13双重抑制剂(诸如杜普利单抗)、STAT3抑制剂(诸如索拉非尼、舒尼替尼、WP1066和白藜芦醇)和STAT6抑制剂(诸如芬维A胺(4-HPR)、来氟米特、TMX264和AS1217499)或其组合。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。
14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含另外的治疗剂。
15.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：检查点抑制剂、抗激素剂、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨、紫杉醇或卡铂和聚乙二醇化脂质体多柔比星)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、曲妥珠单抗、阿多-曲妥珠单抗美坦辛、培妥珠单抗、阿博西尼、帕博西尼、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继性细胞疗法。
16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗激素剂选自由以下组成的组：他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑或其组合。
17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的检查点抑制剂：抗-PD-1(诸如纳武单抗)、抗-PD-1L(诸如阿特朱单抗(MPDL3280)、阿维单抗(MSB0010718C)、德瓦鲁单抗、MDX-1105)、抗-CTLA4(诸如伊匹单抗)和抗-LAG-3(诸如IMP321、BMS-986016和GSK2831781)或其组合。
18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含成像剂、染料或造影剂，选自由以下组成的组：钆螯合剂、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其它磁性报告基因，诸如基于金属蛋白的MRI探针。
19.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束或外来体。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述极化剂或所述阻断剂或两者包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束和外来体中。
21.如权利要求19或权利要求20所述的组合物，其中所述极化剂或所述阻断剂或两者包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡、胶束或外来体上。
22.如权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒。
23.如权利要求19至22中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒还包覆有细胞靶向剂。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述细胞靶向剂靶向M2-巨噬细胞选择性细胞表面分子。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述M2-巨噬细胞特异性细胞表面分子选自由以下组成的组：IL-13Rα、CD163、CD206、CD200R、MerTK、清道夫受体A、清道夫受体B、MARCO和F4/80。
26.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成贮库制剂。
27.如权利要求19至26中任一项所述的方法，其中向所述受试者导管内施用每单位剂量包含1x104至1x108个脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、小囊泡或外来体的组合物。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述再极化剂或所述阻断剂或两者的所述组合物以单剂量或多剂量施用。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺病症是乳腺癌。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌选自由以下组成的组：原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵袭性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵袭性(或浸润性)导管癌(IDC)、微侵袭性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕激素受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即ER-/PR-/Her2-乳腺癌)；“TNBC”)、腺样囊性(腺囊性)癌、低级腺鳞状细胞癌、髓样癌、粘液(或胶质)癌、乳头状癌、管状癌、化生癌或微乳头状癌。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用化学疗法、放射疗法或细胞疗法。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述化学疗法、放射疗法或细胞疗法或其组合减少了肿瘤尺寸或免疫抑制或两者。
33.一种制品，其包括含有再极化剂或阻断剂或两者的组合物、一个或多个容器、包装材料、标签或包装插页以及任选地装置。
34.如权利要求33所述的制品，其中所述装置是针和注射器、套管、导管、微导管、渗透泵或封装装置。
35.如权利要求33或权利要求34所述的制品，其包含另外的治疗剂。
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