KR20200103764A - 유방 장애의 관내 치료 방법 - Google Patents

유방 장애의 관내 치료 방법 Download PDF

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KR20200103764A
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스티븐 씨 퀘이
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아토사 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 유방 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 관내 방법 및 조성물에 관한 것이다. 조성물은 종양 미세 환경에서 M2 대식세포를 M1 대식세포로 재분극화하고, M2 대식세포를 감소 시키며, M1 대식세포를 증가시키고/시키거나, 대상체의 화학 요법에 대한 민감도를 증가시킬 수 있는 재분극화제 및 분극화 차단제를 포함한다.

Description

유방 장애의 관내 치료 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 22일에 제출된 미국 출원 제62/609665호를 우선권으로 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
유방암은 인간의 암 사망의 두 번째 주요 원인이다. 유방암 진단 및 치료의 발전에도 불구하고, 이 질환의 유병률은 1940년 이후 매년 약 1%의 비율로 꾸준히 증가하고 있다. 오늘날, 북미에 사는 여성이 일생 동안 유방암에 걸릴 가능성은 8명당 1명이다. 최근에 조기 진단 및 치료가 진척되어 상당히 개선된 결과가 얻어짐에도 불구하고, 화학 요법에 대한 종양 저항성 및 전이는 사망의 중요한 원인으로 남아있다.
적대적 종양 미세 환경(TME: tumor microenvironment)의 존재는 투여된 약물의 표적 세포에 대한 접근 및 종양 탈출에서 불량한 결과를 초래하였다. TME에는 높은 조직 압력, 저산소증, 영양 부족(예를 들어, 글루코스 및 기타 대사산물 감소로 인한), 락테이트 생성 및 산증 증가, 조절 CD4+ T-세포(T-reg)의 침윤 증가, 골수 유래 억제 세포(MDSC), 및 종양 관련 대식세포(TAM), 면역 억제성 사이토카인(예를 들어, IL-10 및 TGF-β)의 존재, 및 활성화된 T-세포에 의해 발현된 면역 억제 수용체(예를 들어, CTLA4 및 PD-1)를 표적으로 하는 리간드의 발현, 및 감소된 T-세포 증식과 같은 상태가 포함되고, 이것은 면역 억제성 미세환경을 생성하여 종양이 면역 인식으로부터 스스로를 보호하고 내성을 유지하고, 제거를 회피하도록 할 수 있다.
종양 미세 환경(TME)은 전이성 확산을 촉진하기 위해 종양 진행과 함께 진화하는 복잡한 구조이다. 고형 종양에서, 종양 덩어리의 5% 내지 40%는 TAM으로 이루어진다. TAM은 CSF-1 및 CCL-2(MCP-1)에 의해 동원된, 종양 미세 환경에서 가장 풍부한 면역 억제 세포 집단을 나타낼 수 있다(Sica et al. 2006, Eur J Cancer., 42, 717-727).
유방에 존재하는 대식세포는 조직 손상에 대한 센서로서 작용하는데 중요하고, 조직 항상성 및 면역성을 유지한다. 대식세포는 염증의 중요한 매개자이며, 유방 발달 과정의 중요한 조절자이다. 전염증성 인자와 항염증성 인자 사이의 균형은 TME 내의 대식세포 기능 조절에 중요하다. 염증 및 종양 발달 동안, 순환 단핵구는 염증 부위 및 TME로 동원되고, 여기서 특정 사이토카인 및 성장 인자의 존재에 의해 지시되는 대식세포 표현형을 채택한다. 일단 종양 미세 환경에 동원되면, 대식세포는 TME 내에서 과다한 자극에 반응하고 다양한 하위세트로 분화(분극화)된다. 인간에서, 대식세포 분극체는 고전적으로 활성화된 살미생물성 및 전염증성 M1 대식세포로부터 대안적으로 활성화된 항염증성 및 면역 억제성 M2 대식세포에 이르기까지 2개의 극단에 걸쳐 있는 연속체이다.
M1 대식세포는 인터페론 감마(IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드(LPS) 자극에 의해 분극화되고, IL-6, IL-12, 반응성 산소종(ROS), 반응성 질소(RN) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)와 같은 전염증성 사이토카인을 분비한다. 인간 M1 대식세포의 검증된 세포 표면 마커는 높은 수준의 CD14, C16, CD64, CD86 및 HLA-DRα를 포함한다. M1 대식세포는 일반적으로 병원체 및 세포를 제거하는 역할을 한다.
이와 대조적으로, M2 대식세포는 일반적으로 항염증성 사이토카인을 생성하고, 조직 재형성 및 복구, 혈관신생, 면역 억제 및 조절 T-세포의 동원에 관여한다. M2 대식세포는 M2a, M2b, M2c 대식세포로 더 나눌 수 있다. M2a 대식세포는 IL-4 또는 IL-13 자극으로부터 발생하고, 매트릭스 재형성 사이토카인을 방출한다. CD200R 및 CD86의 상승된 발현은 M2a 대식세포의 검증된 세포 표면 마커이다. M2b 대식세포는 IL-1β 또는 LPS 자극과 함께 면역 복합체의 인식에 의해 발생하고, M2a 대식세포와 같이 상처 치유에 관여한다. 면역 억제 M2c 대식세포는 IL-10, TGFβ, 글루코코르티코이드 또는 면역 복합체 풍부 환경의 결과이다. M2c 대식세포는 IL-10과 같은 추가 면역 억제성 사이토카인 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP; 예를 들어, MMP-9)와 같은 매트릭스 재형성 인자를 생성한다. 상승된 CD163 발현은 M2c 분극화의 검증된 마커이다.
TAM 표현형은 TAM에 대한 전사체 연구에 기초하여 M1 및 M2 표현형에 전형적으로 할당된 마커의 조합을 포함하는 것으로 생각된다(J. Xue, S.V. Schmidt, J. Sander et al., Immunity, Vol. 40, no. 2, pp. 274-288, 2014). 그러나, TAM은 TME에서의 그의 기능을 기초로 하여 전형적으로 종양 유래 락트산 또는 TME에서 상이한 세포로부터의 면역 억제성 사이토카인, 예를 들어 IL-4, IL-10 및 IL-13의 분비 또는 B 세포 유래 면역글로불린에 의해 야기되는 M2 유사 분극 상태와 관련된다(Brady et al. Mediators of Inflammation. Volume 2016 (2016), Article ID 4549676).
일반적으로 항염증성, 면역 억제성 및 종양원성임에도 불구하고, 면역 반응을 활성화함으로써 TAM을 살종양화하고 종양 성장을 억제하려는 시도가 이루어지고 있다(Wynn et al. Nature 2013, 496:445-455). 유방암에서 대식세포 대 CD8+ 세포의 낮은 비율은 종양에 대한 T-세포 활성을 억제하는데 있어서 대식세포에 대한 주요한 역할을 제안하는 생존을 예측한다(Ruffell, B. et al. P.N.A.S. USA. 2012; 109, 2796-2801). CD8+ 및 기억 T-세포와 같은 특정 백혈구 세포 하위세트에 의한 종양의 침윤은 상이한 암에서의 유리한 결과와 관련이 있으며, 이것은 면역 관여가 암 성장 및 확산을 제한할 수 있음을 시사한다(Noy R, Pollard JW. Immunity, 2014; 41:49-61). 항-PD-1과 같은 체크포인트 억제제를 사용한 종양에서의 T-세포 활성의 향상은 흑색종 및 폐암을 치료하는 임상 시험에서 어느 정도 성공적인 것으로 밝혀졌다.
TAM을 M1 활성화된 대식세포로 재분극화함으로써 TAM을 재프로그래밍하거나 교육하는 것은 예를 들어 CD40, I1-12 사이토카인 등의 체계적으로 전달된 항체 매개 공동 자극에 의해 연구되고 있지만(Casetta L, Pollard JW. Cell Research (2017) 27:963-964); Georgoudaki et al. Cell Reports. 2016. 15, 2000-2011; Guerriero et al. Nature 2017. 543;428-432; US9,139,652; US9,795,570; US20170266131; US20170056430; US20160220692; US20150297679; US20150252115; 및 US20150080940), 유방암과 같은 유방 장애의 치료 및 대식세포 항상성의 유지를 위한 신규한 전략에 대한 의학적 요구가 여전히 충족되지 않은 상태이다. 본 발명은 유방 장애를 갖는 대상체를 치료하고, 화학 요법에 대한 민감도를 개선하고, 대식세포 항상성을 촉진하는 신규한 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 유방 장애를 갖는 대상체를 치료하는 신규한 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 M2 분극화된 대식세포를 재분극화할 수 있는 재분극화제, 또는 대식세포의 M2 분극화를 차단할 수 있는 차단제, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체에게 관내로 전달하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유방 장애를 갖는 대상체에서 화학 요법에 대한 민감도 증가를 촉진하는 신규한 방법을 제공하며, 상기 방법은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체에게 관내로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물의 관내 투여는 화학 요법에 대한 민감도 증가를 촉진한다.
적어도 하나의 실시양태에서, 본 발명은 유방 장애를 갖는 대상체에서의 M2 대식세포의 선택적 감소 방법을 제공하고, 상기 방법은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체에게 관내로 투여하는 단계를 포함한다.
조성물의 관내 투여는 M2 대식세포 감소, M1 대식세포 증가, 항염증성 사이토카인 감소, 전염증성 사이토카인 증가, 세포독성 T-림프구의 동원 및 T-림프구 활성화 중 하나 이상을 초래한다.
일부 실시양태에서, M2 대식세포 표현형은 M2a 표현형, M2b 표현형 및 M2c 표현형 중 어느 하나 이상, 또는 이들의 조합이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에서 개시되는 조성물의 관내 투여로 인해 F4/80+ 대식세포; Grl- 대식세포; CD206+ 대식세포; CD200R 세포/대식세포; CD63+ 대식세포; CD68+/CD68+ 대식세포; CD68+/CD163+ 대식세포; MARCO+ 대식세포; Tie2R+ 세포/대식세포; CD11b+/VEGF-R1+ 대식세포; CCR2+ 골수 세포/대식세포; MerTK+ 대식세포; CD11blow/MHCIIhigh/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+ 대식세포; CD11b+Grl-/F4/80+ 대식세포; CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+ 대식세포; CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C- 대식세포; CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31- 대식세포; 및 CD45+/F480+/Tie2-/CD31- 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된 대식세포 집단 중 어느 하나 이상, 또는 이들의 조합이 감소한다는 사실을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명은 본원에서 개시되는 조성물의 관내 투여로 인해 CD11bhigh/MHCIIhigh 대식세포; HLA-DRα+ 대식세포; CD86+ 대식세포; CD80+ 대식세포; CD68+/CD80+ 대식세포; CD64+ 대식세포; 및 Ly6Chigh/CX3CR1high/CCR2-/CD62L-/CD43low(Ly6Chigh) 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된 대식세포 집단 중 어느 하나 이상, 또는 이들의 조합이 감소한다는 사실을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 펜레티나이드(4-히드록시(페닐)레틴아미드, 4-HPR); IL-12; IFNγ; miR127; miR155; miR223; 페루목시톨; CD40L; 다음의 억제제: CSF-1, CSF-1R, IL-10, IL-10R, TGFβ, 아르기나제 1(Arg1), M2 대식세포 스캐빈저 수용체(예를 들어, A, B, MARCO), 히스톤 데아세틸라제(HDACi), DICER, IRF4/STAT4/STAT6 신호전달 경로, IL-4, IL-13, IL-17, PPARγ, KLF4, KLF6, miRNA-146 패밀리 구성원(예를 들어, miRNA-146a), let7 패밀리 구성원(예를 들어, let-7c), miRNA-9, miRNA-21, miRNA-47, miRNA-187; CCR-CC12 축 신호전달, CCL2/MCP-1 합성, 태반 성장 인자(PlGF)(HRG) 및 C/EBRβ(RI3Kγ 결실), AMPKα1(메트포르민), p50-p50 NFκB, NADPH 옥시다제(NOX)(NOX 1 및 NOX 2), 노치 신호전달 경로 및 Rbpj; 다음의 활성화제: CD40, CD40L, IRF1, IRF5, STAT1(예를 들어, IFNγ, 바디메잔(DMXAA)), STAT3, 핵 인자 카파 B 활성화제, 톨-유사 수용체(TLR) 아고니스트, 예를 들어 이미퀴모드, 합성 비메틸화 시토신-구아닌(CpG) 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG-ODN), p65-p50 NFκB, MyD88, miR127, miR155 및 miR223, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재분극화제를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 항-CSF-1 억제제, 항-CSF-1R 억제제, 항-MCP-1 억제제, 항-IL-4 억제제(예를 들어, 파스콜리주맙, 피타킨라 및 듀필루맙), 항-IL-13 억제제(예를 들어, 안루킨주맙, 레브리키주납 및 트랄로키누맙), 항-IL-4/IL-13 이중 억제제, 예를 들어 듀플리맙, STAT3 억제제(예를 들어, 소라페닙, 수니티닙, WP1066 및 레스베라트롤) 및 STAT6 억제제(예를 들어, 펜레티나이드(4-HPR), 레플루노미드, TMX264 및 AS1217499) 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 차단제를 제공한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 HDACi는 TMP195, MC1568, TMP269, (아릴옥소프로페닐)피롤릴 히드록사메이트), 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 튜바스타틴 A 히드로클로라이드(항-HDAC7), 파노비노스타트, 수베로일아닐리드 히드록삼산(SAHA), 클래스 I 및 클래스 II 억제제 보리노스타트(Volinza® Merck), 로미뎁신(Istodax®); 뎁시펩티드, FK-228, 벨리노스타트(PXD-101), 파노비노스타트(LBH589), 다시노스타트(LAQ824), SB939, 치다마이드(Chidamide), pan-HDAC 억제제(예를 들어, 기비노스타트(ITF2357), PCI 2478, R306465(JNJ-16241199), 레스미노스타트(4SC-201)), 발프로산, 부티르산, 페닐부티레이트, AN9/피바넥스, 클래스 I 선택적 HDAC 억제제 벤즈아미드 또는 아미노 아날리드(예를 들어, CI-994, 엔티노스타트(SNDX-275/MS-275), 모세티노스타트(MGCD0103), 아벡시노스타트(PCI-24781), 퀴시노스타트(JNJ-26481585), HBI-8000, 케베트린, CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ME-344, 및 술포라판 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, MARCO 억제제는 항-MARCO 항체(예를 들어, ab103311, 단일 클론 ED31, PLK-1, ABN 1389), 항-MARCO ScFv, Fab, Fab' 및 Fab2, 항-MARCO ScFv mRNA, 항-MARCO miRNA, MARCO 안티센스 RNA, MARCO siRNA, 항-MARCO DNA, 항-MARCO 올리고뉴클레오티드, 항-MARCO 펩티드 억제제 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 체크포인트 억제제, 항호르몬제, 스테로이드, 안트라사이클린, 갑상선 호르몬 대체 약물, 티미딜레이트 표적화 약물(예를 들어, 도세탁셀, 겜시타빈, 파클리탁셀 또는 카르보플라틴 및 페길화 리포솜 독소루비신), DNA 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈), 트라스투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 아베마시클립, 팔보시클립, 키메라 항원 수용체/T-세포(CAR-T) 요법과 같은 세포 요법 및 기타 입양 세포 요법 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항호르몬제는 타목시펜, 시스-타목시펜, 엔독시펜, 데스메틸타목시펜, 라소폭시펜, 랄록시펜, 벤조티오펜, 바제도폭시펜, 아르족시펜, 미프록시펜, 레보르멜록시펜, 드롤록시펜, 클로미펜, 이독시펜, 토레미펜, EM652 및 ERA-923, 풀베스트란트, ARN-810 또는 CH498, 아나스트로졸, 엑세메스탄 및 레트로졸, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 항-PD-1(예를 들어, 니볼루맙), 항-PD-1L(예를 들어, 아테졸리주맙(MPDL3280), 아벨루맙(MSB0010718C), 두르발루맙, MDX-1105), 항-CTLA4(예를 들어, 이필리무맙) 및 항-LAG-3(예를 들어, IMP321, BMS-986016 및 GSK2831781), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 개시되는 조성물이 가돌리늄 킬레이트, 초상자성 산화철 나노 입자(SPION), 19F 퍼플루오로카본 나노 입자 및 다른 자성 리포터 유전자, 예를 들어 금속 단백질 기반 MRI 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택되는 영상화제, 염료 또는 조영제를 추가로 포함한다는 사실을 제시한다.
한 측면에서, 본 발명은 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 및 엑소솜으로서 제제화된 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 및 엑소솜에 포함된다. 다른 실시양태에서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀 상에 포함된다.
적어도 하나의 실시양태에서, 나노 입자는 지질 나노 입자이다. 일부 실시양태에서, 나노 입자는 세포 표적화제로 코팅된다. 세포 표적화제는 M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자이다. 특정 실시양태에서, M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자는 IL-13Rα, CD163, CD206, CD200R, MerTK, 스캐빈저 수용체 A, 스캐빈저 수용체 B, MARCO 및 F4/80으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 데포 제제로 제제화된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 관내로 투여하는 것을 제시하고, 여기서 조성물은 단위 용량당 1 × 104 내지 1 × 108 개의 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 또는 엑소솜을 포함한다. 대상체에게는 본원에서 개시되는 조성물을 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여할 수 있다.
한 측면에서, 유방 장애는 유방암이다. 일부 실시양태에서, 유방암은 유관 상피내암종(DCIS), 소엽 상피내암종(LCIS), 침습성(또는 침윤성) 소엽 암종(ILC), 침습성(또는 침윤성) 유관 암종(IDC), 미세 침습성 유방 암종(MIC), 염증성 유방암, ER-양성(ER+) 유방암, 프로게스테론 수용체 양성(PR+) 유방암, ER+/PR+ 유방암, ER-음성(ER-) 유방암, HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(즉, ER-/PR-/Her2- 유방암; "TNBC"), 아데노이드 낭성(선낭성) 암종, 저등급 선편평세포 암종, 수질 암종, 점액성(또는 콜로이드) 암종, 유두 암종, 관상 암종, 화생성(metaplastic) 암종 또는 미세 유두 암종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유방암이다.
일부 실시양태에서, 방법은 화학 요법, 방사선 요법 또는 세포 요법을 대상체에게 수행하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학 요법, 방사선 요법 또는 세포 요법, 또는 이들의 조합은 대상체에서 종양 크기 또는 면역 억제, 또는 둘 모두를 감소시킨다.
다른 실시양태에서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물의 관내 투여는 대상체에서 M1-분극화된 대식세포의 살종양 활성; 전염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 방출; 세포독성 T-림프구 동원; 및 T-세포 활성화 중 어느 하나 이상을 증가시킨다.
또 다른 실시양태에서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두의 관내 투여는 대상체에서 종양 혈관신생; 종양 침습; 전이; 면역 억제; 및 항염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 방출 중 어느 하나 이상을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물, 하나 이상의 용기, 포장 재료, 라벨 또는 포장 삽입물, 및 선택적으로 장치를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 일부 실시양태에서, 장치는 바늘 및 주사기, 캐뉼라, 카테터, 마이크로카테터, 삼투 펌프 또는 캡슐화 장치이다. 다른 실시양태에서, 제조 물품은 본원에서 개시되는 것들과 같은 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
일반적으로, 대식세포 활성화를 조절하고, TME에서 M2 대식세포를 재분극시키고, 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법 및 세포 요법과 같은 요법에 대한 민감도를 개선하기 위해 사용될 수 있는 조성물이 본원에서 개시된다. 이러한 조성물은 M2 대식세포를 M1 대식세포로 재분극시키거나 침윤 단핵구 및 대식세포의 M2 대식세포로의 분극화를 차단할 수 있는 재분극화제 및 분극화 차단제를 포함한다. 또한, 본원에서 개시되는 조성물을 대상체의 하나 이상의 유방 유관(breast duct)에 관내로 투여함으로써 유방 장애를 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에서 제공된다.
대식세포 및 TAM - 분극화 및 표현형
유방에 존재하는 대식세포(CD11bhigh/MHCIIhigh)는 조직 손상에 대한 센서로서 작용하는데 중요하고, 조직 항상성 및 면역성을 유지한다. 대식세포는 염증의 중요한 매개자이며, 유방 발달 과정의 중요한 조절자이다. 전염증성 인자와 항염증성 인자 사이의 균형은 TME 내의 대식세포 기능 조절에 중요하다. TME는 다양한 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 방출하여 순환 단핵구를 TME로 동원하고, 여기서 단핵구는 성숙하여 대식세포를 형성한다. 일단 종양 미세 환경에 동원되면, 대식세포는 TME 내에서 과다한 자극에 반응하고 다양한 하위세트로 분화한다. 인간에서, 대식세포 분극체는 고전적으로 활성화된 전염증성 M1 대식세포로부터 대안적으로 활성화된 항염증성 M2 대식세포에 이르기까지 2개의 극단에 걸쳐 있는 연속체이다.
M1 표현형에 대한 대식세포의 분극화는 다양한 전사 인자 및 마이크로 RNA(miRNA)뿐만 아니라, GM-CSF, IFNγ, TNFα, IL-1β 및 LPS와 같은 염증 신호에 의해 시험관 내에서 조절된다. 인터페론 조절 인자는 대식세포 분극화의 표현형을 결정한다. IFNγ는 인터페론 조절 인자 1(IRF1) 및 STAT1을 사용하여 인터페론 조절 경로를 통해 대식세포를 M1 표현형으로 분극화한다. LPS는 톨-유사 수용체 패밀리(예를 들어, TLR-4)를 통해 M1 표현형을 유도한다. miRNA는 mRNA 분해 속도에 영향을 미치기 때문에 전사 후 유전자 발현을 조절하는 22개 뉴클레오티드 길이의 작은 비코딩 RNA이다. 몇몇 miRNA는 M1-분극화된 대식세포, 특히 miRNA-155, miRNA-125, miRNA-127, miRNA-17, miRNA-20, miRNA-106a 및 miRNA-378에서 고도로 발현되는 것으로 나타났다. 이들 miRNA의 억제는 M1-분극화를 감소시키는 것으로 언급된다.
고전적으로 활성화된 대식세포는 CXCL9, CXCL10(IP-10으로도 알려짐), IFN 조절 인자-1 및 사이토카인 신호전달-1의 억제제(SOCS1)를 표적으로 하는 STAT1 전사 인자의 유도를 개시한다. M1 대식세포는 IL-6, IL-12, IL-23과 같은 전염증성 사이토카인, 효소 NADPH 옥시다제 NOX1 및 NOX2의 활성에 의해 생성된 반응성 산소종(ROS), 반응성 질소종(RN), 및 세포를 사멸시키는 종양 괴사 인자 알파(TNFα)를 분비한다. M1 대식세포는 일반적으로 병원체 및 세포를 제거하는 작용을 하는 고도의 포식 활성을 보인다.
IL-12는 Th17 세포의 활성화 및 클론 확장을 유도하고, 이것은 많은 양의 IL-17을 분비하여 염증에 추가로 기여한다. 이들 특성은 M1 대식세포가 전이를 제어하고, 종양 성장을 억제하고, 미생물 감염을 제어할 수 있게 한다. 연구는 종양 부위로의 전염증성 M1 대식세포의 침윤 및 동원이 고형 종양 환자에서 보다 나은 예후 및 보다 높은 전체 생존율과 상관관계가 있음을 시사한다.
인간 M1 대식세포의 검증된 세포 표면 마커는 높은 수준의 CD14, C16, CD64, CD86 및 HLA-DRα를 포함한다.
M1 대식세포와 대조적으로, M2 대식세포는 일반적으로 항염증성 사이토카인을 생성하고, 조직 재형성 및 복구, 혈관신생, 면역 억제 및 조절 T-세포의 동원을 유도한다. M2 대식세포는 M2a, M2b, M2c 대식세포로 더 나눌 수 있다. M2a 대식세포는 IL-4 또는 IL-13 자극에 의해 발생하고, 매트릭스 재형성 사이토카인을 방출한다(Gunthner and Anders. Mediators of Inflammation. Vol. 2013 (2013), Article ID 731023). IL-4는 IRF4 및 STAT6 신호전달을 통해 인터페론 조절 경로를 사용하여 대식세포를 M2-표현형으로 분극화한다. CD200R 및 CD86의 발현 상승은 M2a 대식세포의 검증된 세포 표면 마커이다. M2b 대식세포는 IL-1β 또는 LPS 자극과 함께 면역 복합체의 인식에 의해 발생하고, M2a 대식세포와 같이 상처 치유에 관여한다. 면역 억제 M2c 대식세포는 IL-10, TGFβ, 글루코코르티코이드 또는 면역 복합체 풍부 환경의 결과이다. IL-10은 STAT3 신호전달 경로를 사용하여 대식세포를 M2-표현형으로 분극화한다(Gunthner and Anders. Mediators of Inflammation. Vol. 2013 (2013), Article ID 731023). M2c 대식세포는 IL-10과 같은 추가의 면역 억제성 사이토카인 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP; 예를 들어, MMP-9)와 같은 매트릭스 재형성 인자를 생성한다. 상승된 CD163 발현, ARG1, RETNLB, IL4R, CHIA, CD68은 M2c 분극화의 검증된 마커이다.
몇몇 miRNA, 특히 miRNA-9, miRNA-21, miRNA147, miRNA-187, miRNA-146 패밀리 구성원, 예를 들어 (miRNA-146a), 및 let7 패밀리 구성원(예를 들어, let-7c)은 M2-분극화된 대식세포에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 이들 miRNA의 억제는 감소된 M2-분극화라고 언급된다. 연구에 따르면, miRNA-처리 효소인 DICER의 결핍은 전염증성 사이토카인 및 T-세포 동원 케모카인의 향상된 발현을 특징으로 하는 IFNγ 매개된 M1 유사 표현형으로의 TAM의 재분극화를 야기하고, let-7에 의한 구조는 M2 대식세포 표현형을 부분적으로 회복시키는 것으로 밝혀졌다(Squadrito and Palma. Cell Cycle. 2016, VOL. 15, NO. 23, 3149-3150). TAM에서의 DICER 불활성화는 암 면역 요법, 즉 PD1 체크포인트 차단 및 CD40 아고니스트 항체의 효능을 향상시켜, 마우스에서 완전한 종양 퇴행을 초래한다(상기 문헌). M2 대식세포의 추가의 마커는 아르기나제1(Arg1), 대식세포 스캐빈저 수용체 A, B 및 MARCO, Tie2R+, Grl-, F4/80+, MerTK+, CD206+ 및 CD200R을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
TAM은 TAM에 대한 전사체 연구에 기초하여 M1 대식세포 및 M2 대식세포 표현형에 전형적으로 할당되는 마커의 조합을 표현형으로 포함하는 것으로 생각된다(Xue et al. Immunity. 2014. 40(2): 274-288). M2 유사 대식세포 집단 하위세트, 예를 들어 CD11b+Grl-/F4/80+ 대식세포, CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+ 대식세포, CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C- 대식세포, CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31- 대식세포; 및 CD45+/F480+/Tie2-/CD31- 대식세포가 유방암에서 발견되었다(Nielsen and Schmid. Mediators of Inflammation. Vol. 2017, Article ID. 9624760). 그러나, TME에서의 기능에 기초하여, TAM이 전형적으로 종양 유래 락트산 또는 TME에서 상이한 세포로부터의 면역 억제성 사이토카인, 예를 들어 IL-4, IL-10 및 IL-13의 분비 또는 B 세포 유래 면역글로불린에 의해 야기되는 M2 유사 분극 상태와 관련이 있다는 것이 널리 인정되고 있다(Brady et al. Mediators of Inflammation. Vol. 2016 (2016), Article ID 4549676). 본 개시내용의 목적을 위해, 본 발명은 일부 M1 유사 표현형 마커를 또한 나타낼 수 있는 TAM(본 개시내용에서 상호 교환 가능하게 사용되는 "M2 대식세포", "M2-분극화된 대식세포" 또는 "TAM")을 비롯한 M2 유사 TAM의 재분극화를 제공한다. M2 대식세포 집단은 본 발명의 목적을 위해 M2 대식세포의 임의의 하위세트(M2a, M2b, 및 M2c) 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
이종성 TAM 집단은 이들 영역에서의 저산소증 수준에 기초하여 종양 내의 별개의 구획에서 발견된다. TME에 동원된 염증성 단핵구는 MHCIIlow 및 MHCIIhigh TAM을 생성시키지만, 저산소 영역 내부의 TAM은 주로 MHCIIlow이고 M2-마커의 발현 증가와 관련된다. CD68+/CD68+ 대식세포, CD68+/CD163+ 대식세포, CD11b+/VEGF-R1+ 대식세포, CCR2+ 골수세포/대식세포, CD11blow/MHCIIhigh/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+ 대식세포, CD11b+Grl-/F4/80+ 대식세포, CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+ 대식세포, CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C- 대식세포, CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31- 대식세포; 및 CD45+/F480+/Tie2-/CD31- 대식세포와 같은 TAM의 M2 유사 대식세포 집단은 유방암에서 상승한 것으로 발견되었다(Nielsen and Schmid. Mediators of Inflammation. Vol. 2017, Article ID. 9624760).
치료 방법
한 측면에서, 유방 장애를 갖는 대상체를 치료하는 신규한 방법이 본원에서 제공되고, 상기 방법은 M2 분극화된 대식세포를 재분극화할 수 있는 재분극화제, 또는 대식세포의 M2 분극화를 차단할 수 있는 차단제(이하 "차단제"), 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체의 유방 유관에 관내로 전달하는 단계를 포함한다. 본원에서 개시되는 방법에서의 관내 전달은 비침습적으로 또는 최소 침습적으로 수행되며, 전형적으로 치료를 시행하는 임상의에 의해 피부를 손상하는 것을 수반하지 않는다. 대신에, 조성물은 유방 유두(mammary papilla)의 젖꼭지(nipple)에서 대상체 자신의 천연 유관 구멍(ductal orifice)을 통해 대상체에게 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관내 및 "관내로"는 유방의 보다 안쪽의 깊은 부분에 도달하도록 유방 유두 상의 젖꼭지 내의 유즙관 개구부(milk duct opening)(유관 구멍)를 통해 대상체의 적어도 하나의 유방 유즙관의 내강으로 전달되는 치료 방법을 지칭하는 것이다.
한 측면에서, 관내 투여는 유방 유두의 젖꼭지에 본 개시내용의 조성물을 적용하는 것을 지칭하며, 조성물은 젖꼭지로부터 젖꼭지의 유관 구멍을 통해 적어도 하나의 유방 유즙관으로 전달된다. 유방 젖꼭지 및 유관 구멍은 재분극화제, 분극화 차단제 및 치료제를 유관 내로 수용하기에 특유하게 적합하다. 또 다른 측면에서, 관내 투여는 조성물을 유방 유두의 젖꼭지 내의 유관 구멍을 통해 유방 유즙관의 내강 직접 관내 전달하는 것을 지칭한다. 본원에서 개시되는 바와 같은 관내 방법은 대상체의 유방에서 유방 유즙관의 천연 구멍을 통해 본원에서 개시되는 조성물의 전달을 포함한다는 것을 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 본 발명의 유리한 측면은 관내 전달이 전형적으로 대상체의 피부 또는 조직 또는 세포층의 의도적인 손상을 수반하지 않고, 이환된 유방 조직에 근접하여 조성물을 전달한다는 것이다.
유방암과 같은 유방 장애는 일반적으로 개인의 유즙관에서 발생한다(Wellings SR. Pathol. Res. Prac. 1980; 166:515-535; Love and Barsky. Cancer. 2004, vol 101(9):1947-1957). 따라서, 요법의 국소 전달, 예를 들어, 재분극화제 또는 차단제, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 유방 유즙관(유방 유관) 내의 이환된 부위에 근접하여 전달하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 조성물의 관내 투여는 재분극화제 및/또는 차단제를 포함하는 조성물에 대한 전신 노출을 감소시킴으로써 전신 치료의 부작용을 제거하는 국소적이고 효과적이며 투여하기 쉬운 요법을 제공한다. 이것은 종양 이외의 표적에 대해 작용하는 효과(on-target-off-tumor effect)의 가능성/위험을 감소시키는 추가적인 이점을 가질 것이다. 관내 투여에 의해 유방 유관으로의 국소 전달은 통과 시간을 감소시키고, TME 내의 M2 대식세포를 조성물에 대해 보다 빠르게 노출시킴으로써, 세포 독성 활성 및 효능을 향상시키면서 M2 대식세포에 대한 보다 짧은 통과에 의해 약물 불활성화 및/또는 분해 가능성을 감소시킬 것이다. 본원에서 개시되는 방법의 특별한 이점은 유방 조직에서 대식세포의 생체내 변환이다.
본원에서 개시되는 조성물의 관내 투여는 M2 대식세포의 감소, M1 대식세포의 증가, 항염증성 인자의 감소, 전염증성 인자의 증가, 및 세포독성 T-림프구의 동원 증가 중 하나 이상의 발생을 유도한다. 일부 실시양태에서, M2 대식세포 대 M1 대식세포의 비가 변경된다. M1 대식세포의 수는 M2 대식세포에 비해 증가된다. 일부 실시양태에서, 재분극은 대식세포 분극 상태와 관련하여 M1/M2 대식세포 항상성을 회복시킨다.
일부 실시양태에서, 재분극된 M2 대식세포 표현형은 M2a 표현형, M2b 표현형, M2c 표현형 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, CD68+/CD163+ 대식세포, CD11b+/VEGF-R1+ 대식세포, CCR2+ 골수세포/대식세포, CD68+/CD68+ 대식세포, CD11blow/MHCIIhigh/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+ 대식세포, CD11b+Grl-/F4/80+ 대식세포, CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+ 대식세포, CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C- 대식세포, CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31- 대식세포; 및 CD45+/F480+/Tie2-/CD31- 대식세포와 같은 TAM의 M2 유사 대식세포 집단은 본원에서 개시되는 조성물 및 방법에 의해 재분극된다. 그 결과, 상기 M2 대식세포의 수가 감소한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 관내 투여는 CD11bhigh/MHCIIhigh 대식세포; HLA-DRα+ 대식세포, CD86+ 대식세포, CD80+ 대식세포, CD68+/CD80+ 대식세포, CD64+ 대식세포, 또는 Ly6Chigh/CX3CR1high/CCR2-/CD62L-/CD43low(Ly6Chigh) 대식세포와 같은 대식세포 집단 중 어느 하나 이상의 대식세포 집단의 수의 증가를 초래한다.
다른 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 관내 투여는 전염증 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자(예를 들어, IL-1, IL-1β, IL-17, IFNγ, ROS, RN, TNFα, GM-CSF) 등의 증가를 유도한다. 다른 실시양태에서, 조성물의 관내 투여는 항염증성 인자, 예를 들어 사이토카인 및 케모카인(예를 들어, IL-4, IL-13, IL-10, CSF-1), 성장 인자(예를 들어, VEGF 및 TGFβ와 같은 혈관신생 성장 인자) 및 조직 재형성 인자(예를 들어, MMP, 예를 들어 MMP9) 등의 감소를 유도한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 목적에 적합한 다른 공지된 전염증성 및 항염증성 인자가 있음을 인식할 것이다. 전염증성 및 면역 억제성 마커와 같은 분극화/활성화 마커의 변화는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어 ELISA, IHC, qPCR 및 문헌 [Xue et al. in Immunity, vol. 40, no. 2, pp. 274-288, 2014]에 기재된 전사체 기반 분석을 사용하여 검출될 수 있다.
M2 대식세포의 M1 대식세포로의 전환은 균형을 M1 대식세포의 살종양 이펙터 기능을 활성화하는 보다 전염증성인 상태로 이동시킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, TAM은 종양원성으로부터 살종양성 대식세포로 재분극된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 투여는 M2 대식세포의 종양원성 기능을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 투여는 종양 혈관신생을 감소시킨다. M2 대식세포는 새로운 혈관신생을 촉진하여 종양 조직 영양물질을 제공하고 혈관 내피 성장 인자(VEGF-A) 및 태반 성장 인자(PlGF)와 같은 혈관신생 성장 인자의 방출을 통해 정상 유방 조직의 휴지 상태로부터 새로운 혈관 형성으로 혈관신생 스위치를 켜서 종양 전이를 돕는다.
다른 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 투여는 종양 침습을 감소시킨다. M2 대식세포는 혈관 내로의 종양 세포 침입을 촉진하는 VEGF-A와 같은 혈관신생 성장 인자를 방출한다. 또한, SPARC 또는 CCL8과 같은 대식세포 유래 카텝신은 세포외 매트릭스 단백질에 대한 종양 세포 부착을 향상시키고, 종양 세포 이동을 촉진한다. M2 대식세포는 대식세포의 침윤 증가 및 종양 세포 이동을 촉진하는 자가 분비 루프에서 (예를 들어, 종양 세포에 의한 CSF-1 및 CSF-R 생산을 통해) 종양 세포를 관여시키는 그의 능력을 통해 전이를 촉진한다. 화학 요법이 거대전이 병변을 제거한 경우에도, 몇몇 약물 내성 종양 세포가 결국 약물 내성 전이성 병변으로 재발하게 된다. 폐 연구에서 CCR2+ 대식세포의 절제가 전이 부담을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 투여는 전이를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 투여는 CCR2+ 대식세포를 감소시킨다.
추가의 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 투여는 면역 억제를 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물의 투여는 세포독성 T-림프구의 동원 및 활성화를 증가시킨다.
적어도 하나의 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 대상체에서 유방 질환 부담을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 유방 장애를 갖는 대상체의 유방에서 대식세포 항상성을 복원하거나 촉진하기 위한 신규한 방법이 본원에서 제공되고, 상기 방법은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체의 하나 이상의 유방 유관에 관내로 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 유방 장애를 갖는 대상체에서 암 요법에 대한 민감도 증가를 촉진하는 신규한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체에게 관내로 투여하는 단계를 포함한다. 대식세포는 화학 저항성에서 핵심적인 역할을 수행한다(Nielson and Schmid. Mediators of Inflammation. Vol. 2017. Article ID. 9624760). TME에서의 M2 대식세포는 일반적으로 사용되는 화학 요법제 겜시타빈의 일차 대사 효소인 시티딘 데아미나제의 발현을 유도한다. 본원에서 개시되는 관내 방법을 사용하여 M2 대식세포를 M1 대식세포로 재프로그래밍하면, 종양 세포의 화학 요법 및 증가된 T-세포 및 M1 대식세포 매개 세포독성에 대한 민감도가 증가한다.
일부 실시양태에서, 방법은 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법, 예를 들어 세포 요법(예를 들어, CAR-T 요법 또는 범용 T-세포 요법)을 대상체에게 전달하는 단계를 포함한다. 암 요법에 대한 증가된 민감도는 종양 세포 사멸을 증가시킨다. 대상체에서 종양 세포 사멸은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 이것은 조직 생검에서 아폽토시스 검출 검정(TUNEL 검정, R&D Systems)과 같은 검정에 의해 검출될 수 있다. 종양 세포 사멸을 검출하는 비침습적 방법은 대상체에서 종양의 성장에 수반되는 감소된 락테이트 데히드로게나제 및/또는 혈액 샘플(액체 생검)에서 ctDNA(순환 종양 세포 유래 DNA)의 감소의 측정을 포함한다(Chang et al. Molecular Oncology, 2016; 10 (1): 157). 또한, MRI 및 가돌리늄 기반 표적 조영제(Krishnan et al. RSNA Radiology. March 2008, vol. 246, Issue 3), 13C 자기 공명 분광법 및 분광 영상화를 사용하여 글루코스 유사체, 2-18플루오로-2-데옥시-글루코스(18FDG) 및 과분극된 [1-13C]피루베이트의 흡수에 대한 PET 기반 측정(Whitney et al. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 16 (2008); p658)을 사용하여 대상체의 종양 세포 사멸을 비침습적으로 검출할 수 있다.
또 다른 측면에서, 유방 장애를 갖는 대상체에서 M2 대식세포의 선택적 감소를 위한 신규한 방법이 본원에서 제공되고, 상기 방법은 재프로그래밍제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 유효량의 약학적 조성물을 대상체에게 관내로 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유방 장애"는 유방암을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유방암"은 유방 세포의 임의의 악성 종양을 의미한다. 유방암은 전암, 초기 암, 비전이성 암, 전이전(pre-metastatic) 암, 국소 진행성 암 및 전이성 암의 단계를 포함하는 임의의 단계의 유방암일 수 있다. 유방암에는 여러 가지 유형이 존재한다. 예시적인 유방암은 유관 상피내암종(DCIS), 소엽 상피내암종(LCIS), 침습성(또는 침윤성) 소엽 암종(ILC), 침습성(또는 침윤성) 유관 암종(IDC), 미세 침습성 유방 암종(MIC), 염증성 유방암, ER-양성(ER+) 유방암, 프로게스테론 수용체 양성(PR+) 유방암, ER+/PR+ 유방암, ER-음성(ER-) 유방암, HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(즉, ER-/PR-/Her2- 유방암; "TNBC"), 아데노이드 낭성(선낭성) 암종, 저등급 선편평세포 암종, 수질 암종, 점액성(또는 콜로이드) 암종, 유두 암종, 관상 암종, 화생성 암종 또는 미세 유두 암종을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 단일 유방암 종양은 이들 유형의 임의의 조합 또는 혼합물일 수 있거나, 또는 침습성 암과 상피내암의 혼합물일 수 있다.
DCIS는 가장 흔한 비침습성 유방암이다. 이것은 유방 유관의 내벽을 감싸는 세포(들)을 포함한다. DCIS에서, 세포는 유관의 벽을 넘어 주변 유방 조직으로 퍼지지 않는다. 5명의 새로운 유방암 사례 중 약 1명의 사례가 DCIS일 것이다. 여러 바이오마커는 DCIS와 관련이 있다. 예시적인 바이오마커는 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, Ki-67, 사이클린 D1, 사이클린 A, 사이클린 E, p16, p21, p27, p53, Bcl-2, Bax, 서바이빈, c-myc, Rb, VEGF, HPR1, HER1, HER2, HER3, HER4, CD10, SPARC, COX-2, 기저 사이토케라틴, CK5/6, CK14 및 CK17, 표피 성장 인자 수용체, Tn, ER+ 및 c-kit를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. DCIS는 IDC에 대한 비절대적(non-obligate) 전구체인 것으로 언급된다. DCIS 세포에서 특정 HGF 및 섬유모세포 활성화 단백질(FAP) 보조제를 분비하는 암 관련 섬유모세포(CAF)와 같은 기질 세포가 관여하면, 상기 세포는 침윤성이 되어 IDC로 발전한다.
LCIS는 전암성 신생물이다. 이것은 침윤성 암에 대한 소인을 나타낼 수 있다. LCIS는 상피내(유관 또는 소엽) 유방암의 단지 약 15%만을 차지하다. LCIS 바이오마커는 E-카드헤린, ER, PgR, c-erbB-2, p53 및 Ki-67을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
IDC는 가장 침습적인 유방암이다. 그 명칭이 적용되는 바와 같이, 이것은 유방 유관에서 시작한 후, 주변 지방 조직을 침범하는 암종이다. 약 8 내지 10개의 침습성 유방암은 침윤성 유관 암종이다. IDC는 종종 암 조직을 절제하기 위한 수술 및 방사선 요법으로 치료된다. 또한, 면역 요법(예를 들어, 타목시펜 및 트라스투주맙)과 조합된 화학 요법은 종종 IDC를 치료하기 위해 사용된다. 종양이 4 cm보다 크면, 급치 유방 절제술을 시행할 수 있다. IDC에 대한 바이오마커는 탄수화물 항원, 예를 들어 Tn, Tf, 시알릴-Tn, 루이스 x, 루이스 a, 루이스 y 및 강글리오사이드, 예를 들어 GM3, GD3, 9-0-아세틸 GD3, 9-0-아세틸 GT3, N-글리콜리-GM3을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
ILC는 유방의 소엽에서 발생하고 주변 조직을 침범한 암이다. 침습성 유방암 10명 중 약 1명이 ILC이다. ILC는 암 조직을 절제하기 위한 수술 및 방사선 요법에 의해 치료된다. 또한, 화학 요법 및 면역 요법(예를 들어, 타목시펜 및 트라스투주맙)의 조합이 종종 ILC를 치료하기 위한 보조 요법으로서 사용된다. 암 관련 섬유모세포(CAF)에 의해 방출되는 성장 인자 및 사이토카인의 도움으로 침습적인 IDC와 마찬가지로, ILC도 CAF 관련 단백질인 FAP-α, FSP-1/S100A4 및 PDGFR-β에 의해 도움을 받는다.
염증성 유방암은 모든 유방암의 약 1% 내지 3%를 차지하다. 염증성 유방암에서, 암 세포는 피부의 림프관을 차단하여 유방이 빨갛게 변하고 따뜻하게 느껴지도록 만든다. 이환된 유방은 보다 커지거나, 보다 딱딱해지거나, 보다 부드러워지거나 또는 보다 가려워질 수 있다. 염증성 유방암은 화학 요법, 면역 요법, 방사선 요법, 및 경우에 따라 수술로 치료된다.
에스트로겐 수용체 양성(ER+) 유방암은 암성 세포의 표면에 에스트로겐 수용체가 존재한다는 특징이 있다. ER+ 암 세포의 성장은 에스트로겐(호르몬 의존성 또는 호르몬 민감성 유방암)의 이용 가능성과 관련이 있다. 대약 모든 유방암의 80%가 ER+ 유방암이다. ER+ 유방암의 치료 옵션에는 에스트로겐을 차단하는 화학 치료제(예를 들어, 타목시펜)가 포함된다.
삼중 음성 유방암은 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 수용체의 부재를 특징으로 하며, 진단된 유방암의 약 10% 내지 20%에서 발생한다. TNBC는 매우 공격적일 수 있으며, 대상체는 재발의 위험이 있다. 치료 옵션은 일반적으로 신보조 화학 요법(그러나, 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 또는 트라스투주맙과 같은 항-HER2는 아님)에 이어, 종괴 절제술과 같은 수술을 포함한다. 또한, TNBC는 매우 다양한 군의 암이며, 2개의 기저형(BL1 및 BL2), 면역 조절(IM), 중간엽(M), 중간엽 줄기 유사(MSL) 및 내강 안드로겐 수용체 (LAR) 서브타입을 포함하는 독특한 유전자 발현 및 존재를 나타내는 적어도 6개의 TNBC 아형으로 재분류형되었다(그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Lehrmann et al. J. Clin. Invest. 2011, 121(7), 2750-2767] 참조). 특이적으로 TNBC 아형을 표적으로 할 수 있는 돌연변이 및 마커가 설명되었다(상기 문헌). TNBC에 대한 추가의 바이오마커는 표피 성장 인자 수용체, 폴레이트 수용체-α, 혈관 내피 성장 인자, c-Myc, C-kit 및 기저 사이토케라틴, 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제-1, p53, 티로시나제 키나제, m-TOR, 열 및 충격 단백질 및 TOP-2A를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 더욱이, 종양 주변의 기질 세포(암 관련 섬유모세포(CAF) 및 면역 세포, 예를 들어 종양 관련 대식세포(TAM) 및 종양 관련 호중구(TAN))는 세포외 매트릭스의 침착 증가 및 다양한 전섬유 형성 성장 인자, 예를 들어 TGF 베타, bFGF, 및 암 세포 증식, 침습 및 전이에 영향을 미치는 기타 인자(예를 들어, 상피에서 중간엽으로의 전이 촉진에 의한), 예를 들어 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), EGF, HGF, MCP-1, CSF-1, VEGF, 사이토카인, 예를 들어 IL1, IL-8, TNF-알파, 효소, 예를 들어 MM2, MMP7, MMP8, MMP9, MMP12, MMP13 및 COX2의 방출에 의해 치료 약물 투과에 대한 장벽 생성에서 중요한 역할 수행한다. TAM은 사이토카인 및 케모카인(예를 들어, IL-10, TGF-베타, CCL17, CCL22, 및 CCL24)을 분비함으로써 항-종양 면역 반응을 추가로 억제하고, 이것은 T-reg 세포의 동원 및 면역 억제성 미세 환경의 생성에 유리하다.
일부 실시양태에서, 대상체의 유방 장애는 유방암 또는 엽상 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 유방암은 전암, 초기 암, 비전이성 암, 전이전 암, 국소 진행성 암 및 전이성 암이다.
다른 실시양태에서, 대상체는 유관 상피내암종(DCIS), 소엽 상피내암종(LCIS), 침습성(또는 침윤성) 소엽 암종(ILC), 침습성(또는 침윤성) 유관 암종(IDC), 미세 침습성 유방 암종(MIC), 염증성 유방암, ER-양성(ER+) 유방암, 프로게스테론 수용체 양성(PR+) 유방암, ER+/PR+ 유방암, ER-음성(ER-) 유방암, HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(즉, ER-/PR-/Her2- 유방암; "TNBC"), 아데노이드 낭성(선낭성) 암종, 저등급 선편평세포 암종, 수질 암종, 점액성(또는 콜로이드) 암종, 유두 암종, 관상 암종, 화생성 암종 또는 미세 유두 암종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유방암을 갖는다.
조성물
재분극화제
한 측면에서, 본 개시내용은 M2 대식세포를 재분극화할 수 있는 재분극화제를 포함하는 조성물을 제공한다. 임의의 이론 또는 메커니즘에 매이기를 원하지 않으면서, 재분극화제를 포함하는 조성물은 TAM을 M2 대식세포 활성화 페이스에서 M1 대식세포 활성화 페이스로 재분극화하거나 전환시킨다.
재분극화제는 M1 대식세포 표현형을 촉진하는 임의의 작용제일 수 있다. 재분극화제의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다:
펜레티나이드(4-히드록시(페닐)레틴아미드, 4-HPR); IL-12; IFNγ; LPS, 페루목시톨, 히스티딘 풍부 당단백질(HRG); miRNA-155, miRNA-125, miRNA-127, miRNA-17, miRNA-20, miRNA-106a 및 miRNA-378;
콜로니 자극 인자-1(CSF-1) 및 CSF-1 수용체(CSF-1R)의 억제제;
IL-10(예를 들어, IL-12 및 그의 활성화제), IL-10 수용체(IL-10R)의 억제제;
TGFβ의 억제제(예를 들어, 트라베데르센 [AP12009], Lucanix® [벨라겐푸마투셀-L], 디시테르타이드, 레르델리무맙, 메텔리무맙, 프레솔리무맙, LY2382770 등(또한, TGFβ 억제제에 대한 추가의 예에 대해서는 문헌 [Neuzillet et al. Pharmacology & Therapeutics, Vol. 147, March 2015, Pages 22-31] 참조);
아르기나제 1(Arg1)의 억제제, 예를 들어 CB-1158;
M2 대식세포 스캐빈저 수용체의 억제제(예를 들어, A, B, MARCO, 예를 들어 항-MARCO 항체, ScFv 등);
히스톤 데아세틸라제의 억제제(HDACi);
인터페론 조절 인자-4(IRF4), 신호 변환자 및 전사 활성화제 4 및 6(STAT4; STAT6) 신호전달 경로의 억제제, 예를 들어 펜레티나이드(4-HPR), 레플루노미드, TMX264 및 AS1217499;
IL-4의 억제제(예를 들어, 피타킨라, 파스콜리주맙, 듀필루맙, 포르모모네틴, 부데소나이드, 로카글라마이드, 메소프 람, GIT-27) 및 IL-4R;
항-IL-4/IL-13 억제제, 예를 들어 두플리맙;
IL-13의 억제제(레브리키주맙, 안루킨주맙, 레브리키주납 및 트랄로키누맙 및 및 IL-13R(알파)2 디코이) 및 IL-13R의 억제제;
IL-17의 억제제(예를 들어, 세큐키누맙) 및 IL-17R의 억제제(예를 들어, 브로달루맙, 익세키주맙, 비메키주맙, ALX-0761, CJM112, CNTO 6785, LY3074828 및 SCH-900117);
퍼옥시솜 증식제-활성화된 수용체 감마(PPARγ)의 억제제(예를 들어, 로시글리타존, 피오글리타존);
크뤼펠 유사 인자 4(KLF4) 및 크뤼펠 유사 인자 6(KLF6)의 억제제;
마이크로RNA-처리 효소 DICER의 억제제;
miRNA-9, miRNA-21(예를 들어, AC1MMYR2), miRNA147, miRNA-187, miRNA-146 패밀리 구성원, 예를 들어 (miRNA-146a), let7 패밀리 구성원(let-7c)의 억제제;
CCR-CC12 축 신호전달 억제제;
CCL2/MCP-1 합성 억제제;
태반 성장 인자(PlGF) 및 C/EBRβ 억제제(RI3Kγ 결실);
AMPKα1 억제제(예를 들어, 메트포르민);
p50-p50 NFκB의 억제제(예를 들어, 디코이 NFκB p50(NLS) 억제제 펩티드 세트 - Novus Biologicals);
NADPH 옥시다제 1 및 2(NOX 1 및 NOX 2)의 억제제, 예를 들어 ML-171, GSK2795039, 가교된 테트라히드로이소퀴놀린 등;
노치(Notch) 신호전달 경로의 억제제, 예를 들어 RPB-J의 억제제;
CD40의 활성화제, 예를 들어 활성화 항체, 예를 들어 CP-870,893, 다세투주무맙, ChiLob7/4, 백신 등 및 CD40L(예를 들어, AdcuCD40L);
인터페론 조절 인자-1(IRF1), 인터페론 조절 인자-5(IRF5)의 활성화제; 신호 변환자 및 전사 활성화제 1(STAT1), 예를 들어 IFNγ, 바디메잔(DMXAA; 신호 변환자 및 전사 활성화제 3(STAT3);
톨-유사 수용체(TLR) 아고니스트(예를 들어, 이미퀴모드, 합성 비메틸화 시토신-구아닌 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG-ODN), TLR4 리간드); 및
p65-p50 NFκB 및 MyD88의 활성화제;
또는 이들의 임의의 조합물.
일부 실시양태에서, 조성물은 적합한 재분극화제로서 하나 이상의 HDACi를 포함한다. 적합한 HDACi의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: TMP195, MC1568, TMP269, (아릴옥소프로페닐)피롤릴 히드록사메이트, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 튜바스타틴 A 히드로클로라이드(항-HDAC7), 파노비노스타트, 수베로일아닐리드 히드록삼산(SAHA), 클래스 I 및 클래스 II 억제제 보리노스타트(Volinza®; Merck), 로미뎁신(Istodax®); 뎁시펩티드, FK-228), 벨리노스타트(PXD-101), 파노비노스타트(LBH589), 다시노스타트(LAQ824), SB939, 치다마이드, pan-HDAC 억제제(예를 들어, 기비노스타트(ITF2357), PCI 2478, R306465(JNJ-16241199), 레스미노스타트(4SC-201)), 발프로산, 부티르산, 페닐부티레이트, AN9/피바넥스, 클래스 I 선택적 HDAC 억제제 벤즈아미드 또는 아미노 아날리드(예를 들어, CI-994, 엔티노스타트(SNDX-275/MS-275), 모세티노스타트(MGCD0103), 아벡시노스타트(PCI-24781), 퀴시노스타트(JNJ-26481585), HBI-8000, 케베트린, CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ME-344, 및 술포라판. 적어도 하나의 실시양태에서, 적합한 HDACi는 TMP195이다.
MARCO는 인간 유방암에서 면역 억제성 TAM에 의해 발현된다. M2 대식세포, 특히 면역 억제성 TAM의 재프로그래밍 또는 재분극화가 매우 바람직하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재분극화제는 MARCO 억제제이다. MARCO 억제제는 항-MARCO 항체(예를 들어, ab103311, 단일 클론 ED31, PLK-1, ABN 1389), 항-MARCO ScFv, Fab, Fab' 및 Fab2, 항-MARCO ScFv mRNA, 항-MARCO miRNA, MARCO 안티센스 RNA, MARCO siRNA, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 적어도 하나의 실시양태에서, 항-MARCO 억제제는 항-MARCO 항체 또는 ScFv이다.
한 측면에서, 본 발명은 항-MARCO 항체 또는 ScFv를 포함하는 조성물을 대상체의 유방 유관에 관내로 투여하여 M2 대식세포에서 항체-의존성 세포 사멸(ADCC)을 유도할 수 있음을 개시한다.
적어도 하나의 실시양태에서, 재분극화제는 IL-12이다.
차단제
한 측면에서, 본 개시내용은 침윤성 단핵구, 유방 조직 상주 대식세포, M1 대식세포가 분극화하여 TME에서 M2-분극화된 대식세포가 되는 것을 차단할 수 있는 분극화 차단제를 포함하는 조성물을 제공한다. 임의의 이론 또는 메카니즘에 매이기를 원하지 않으면서, 차단제를 포함하는 조성물의 관내 투여는 TME에서 M2 대식세포의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, M1 대식세포가 증가된다. 다른 실시양태에서, M2 대식세포 대 M1 대식세포의 비가 변경된다. 또 다른 실시양태에서, 차단제의 투여는 전염증성 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자 등, 예를 들어 IFNγ, IL-1, IL-1β, TNF-α, GM-CSF를 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 차단제의 투여는 항염증성 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 및 성장 인자 등, 예를 들어 IL-4, IL-13, IL-10, TGFβ, VEGF, MMP를 감소시킨다.
또한, 유방암 모델에서 CSF-1 및 CSF-1 수용체(CSF-1R)의 차단은 TME 내로의 단핵구 및 대식세포 침윤을 감소시키고 종양에서 세포독성 CD8+ T-세포를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이것은 CSF-1 및 CSF-1R 억제가 종양에서 CD8+ T-세포 증가와 상관 관계가 있음을 시사한다.
본 개시내용의 목적에 적합한 M2 분극화 차단제는 침윤성 단핵구, 유방 조직 상주 대식세포, M1 대식세포가 분극화하여 M2-분극화된 대식세포가 되는 것을 차단하는 임의의 분극화 차단제일 수 있다. 그 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: 항-CSF-1 억제제, 항-CSF-1R 억제제, 항-MCP-1 억제제, 항-IL-4 억제제(예를 들어, 파스콜리주맙, 피타킨라 및 듀필루맙), 항-IL-13 억제제(예를 들어, 레브리키주맙, 안루킨주맙, 레브리키주납 및 트랄로키누맙), 항-IL-4/IL-13 억제제, 예를 들어 듀플리맙, STAT3 억제제(예를 들어, 소라페닙, 수니티닙, WP1066 및 레스베라트롤) 및 STAT6 억제제(예를 들어, 펜레티나이드(4-HPR), 레플루노미드, TMX264 및 AS1217499)
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 재분극화제가 분극화 차단제로서 기능할 수 있음을 인식할 것이다.
본 개시내용의 목적에 적합한 재분극화제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 재분극시키는 임의의 유형의 재분극화제일 수 있다. 마찬가지로, 본 개시내용의 목적에 적합한 분극화 차단제는 대식세포가 분극화하여 M2 대식세포가 되는 것을 차단하는 임의의 유형의 재분극화제일 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 차단제는 소분자 억제제, 소분자 활성화제, 유전자, DNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드(ODN), 앱타머, 덴드리머, 카피 DNA(cDNA), 네이키드 RNA, 메신저 RNA(mRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 RNA(ASR), 사일렌서 RNA(siRNA), 긴 비코딩 RNA(lncRNA), 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티도미메틱, 디코이 서열, DNA 백신, RNA 백신, 자가 증폭 mRNA 레플리콘, 항체(인간, 인간화, 키메라, 단일 클론, 다클론, 단일특이적, 이중특이적 항체 등), 단일쇄 가변 단편(ScFv), Fab 단편, Fab', Fab2, 사카라이드, 폴리사카라이드, 유전자 요법(예를 들어, CRISPR/Cas9-매개 유전자 편집) 등일 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해 사용되는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 천연 공급원으로부터 단리되거나, 합성되거나, 또는 재조합 방식으로 생성된 폴리펩티드일 수 있다. 펩티드 및 단백질은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 재조합 방식으로 발현될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조 및 단리될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 관련 기술 분야에 잘 알려진 화학적 방법을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa.]을 참조한다. 예를 들어, 펩티드 합성은 다양한 고체상 기술을 사용하여 수행될 수 있고(예를 들어, 문헌 [Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13] 참조), 자동 합성은 예를 들어 ABI 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 제조업체가 제공한 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다.
재분극화제 및 분극화 차단제에 대한 서열(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 유전자, DNA, 뉴클레오티드 서열)은 공개적으로 및 상업적으로 이용 가능한 자원으로부터 필요에 따라 결정되거나, 또는 NCBI Genbank 및 서열 뷰어로부터 관련 기술 분야에 공지되어 있을 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 다양한 형태로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 네이키드 폴리뉴클레오티드는 선형 형태로, 또는 플라스미드, 예를 들어 발현 플라스미드에 삽입되어 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 박테리아 벡터와 같은 살아있는 벡터가 사용될 수 있다. DNA의 RNA로의 전사 및/또는 RNA의 폴리펩티드로의 번역을 돕는 하나 이상의 조절 서열이 존재할 수 있다. 메신저 RNA(mRNA) 분자인 폴리뉴클레오티드에서와 같은 일부 경우에, 전사 과정과 관련된 조절 서열(예를 들어, 프로모터)이 필요하지 않으며, 프로모터 부재 하에 단백질 발현이 수행될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상황에 따라 적합한 조절 서열을 포함시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에 존재하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 조성물이 투여되는 대상체에서 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있게 하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 발현 카세트의 선택은 조성물이 투여되는 대상체뿐만 아니라, 발현된 폴리펩티드에 바람직한 특징에 따라 결정된다.
전형적으로, 발현 카세트는, 대상체에서 기능적이고 구성적이거나 유도성일 수 있는 프로모터; 리보솜 결합 부위; 필요한 경우 시작 코돈(ATG); 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 정지 코돈; 및 선택적으로 3' 말단 영역(번역 및/또는 전사 종결인자)를 포함한다. 신호 펩티드를 코딩하는 영역과 같은 추가의 서열이 포함될 수 있다. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에서 임의의 다른 조절 서열과 상동성이거나 이종성일 수 있다. 신호 펩티드 코딩 영역과 같이 관심 폴리펩티드와 함께 발현되는 서열은 전형적으로 발현되고 적절한 판독 프레임으로 배치되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 인접하여 위치한다. 단독으로 또는 발현되는 임의의 다른 서열(예를 들어, 신호 펩티드)과 함께 발현되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 개방 판독 프레임은 전사 및 번역이 조성물이 투여되는 대상체에서 일어나도록 하기 위해 프로모터의 제어 하에 위치한다.
일부 실시양태에서, 재분극화제 또는 차단제는 M2 대식세포에서 CRISPR-Cas9-보조 카세트 교환에 의한 계내 유전자 편집에 사용되는 CRISPR-Cas9-보조 카세트를 포함한다.
조성물은 M2 대식세포를 재분극화하거나 침윤성 단핵구 및 대식세포의 M2 대식세포로의 분극화을 차단하는데 효과적인 양의 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함할 것이다.
담체
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다는 사실을 제시한다.
선택되는 담체는 특정 재분극화제 또는 차단제에 의해 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정될 수 있다. 담체는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 다음을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성화제.
적합한 보존제는 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 염화벤즈알코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다.
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학적 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
제제는 수용액을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물의 담체는 소수성 물질의 연속상, 예를 들어 액체 소수성 물질을 포함할 수 있다. 연속상은 본질적으로 순수한 소수성 물질 또는 소수성 물질의 혼합물일 수 있다. 또한, 담체는 소수성 물질이 연속상을 구성하는 경우 소수성 물질 중의 물의 에멀젼 또는 소수성 물질의 혼합물 내의 물의 에멀젼일 수 있다.
본원에서 설명되는 바와 같은 조성물에 유용한 소수성 물질은 약학적으로 허용되는 물질이다. 담체는 바람직하게는 액체이지만, 대기 온도에서 액체가 아닌 특정 소수성 물질은 예를 들어 가온에 의해 액화될 수 있으며, 또한 본 발명에 유용하다. 한 실시양태에서, 소수성 담체는 포스페이트 완충 염수일 수 있다.
오일 또는 유중수 에멀젼이 본 발명에서 사용하기에 특히 적합한 담체이다. 오일은 약학적으로 허용되는 것이어야 한다. 적합한 오일은 예를 들어 미네랄 오일(특히 Drakeol® 6VR과 같은 가벼운 또는 저점도 미네랄 오일), 식물성 오일(예를 들어, 대두유), 견과유(예를 들어, 땅콩유) 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 오일은 몬타나이드(Montanide)® ISA 51로서 상업적으로 입수 가능한 미네랄 오일 용액 내의 만나이드 올레에이트이다. 동물성 지방 및 인공적인 소수성 중합체 물질, 특히 대기 온도에서 액체이거나 또는 비교적 쉽게 액화될 수 있는 물질이 또한 사용될 수 있다.
조성물이 무수성 리포솜 현탁액("무수성")인 것으로 설명되는 실시양태에서, 이러한 "무수성" 조성물의 소수성 담체는 물이 담체의 비연속상에 존재하는 경우에 소량의 물을 계속 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물의 개별 성분은 동결건조 또는 증발과 같은 공정에 의해 완전히 제거되지 않을 수 있는 결합수를 가질 수 있으며, 특정 소수성 담체는 그 안에 용해된 소량의 물을 함유할 수 있다. 일반적으로, "무수성"으로 설명되는 본 발명의 조성물은 예를 들어 조성물의 담체 성분의 총 중량의 중량/중량 기준으로 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 미만의 물을 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 및 엑소솜으로서 제제화된다는 사실을 제시한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물은 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 및 엑소솜에 포함된다. 다른 실시양태에서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물은 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 및 엑소솜 상에 포함된다. 엑소솜은 문헌 [Tang et al. (FASEB J. 2016 Sep; 30(9):3097-3106)]에 기재된 바와 같이 대상체의 전염증성 단핵구, 말초 혈액 유래 단핵구 및 M1 대식세포로부터 수거될 수 있다.
리포솜, 나노 입자, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 및 엑소솜의 제조 방법은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있다.
리포솜은 포획된 수성 부피를 함유하는 완전히 폐쇄된 지질막이다. 리포솜은 단일 라멜라 소포(단층 이중막을 갖는) 또는 다중막 이중층을 특징으로 하는 다중 라멜라 소포일 수 있고, 각각의 이중층은 다음 층으로부터 수성층에 의해 분리되거나 분리되지 않을 수 있다. 본원에서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리포솜"은 비제한적으로 관련 기술 분야에서 "니오솜", "트랜스퍼솜" 및 "비로솜"으로 설명되는 것을 포함하는, 상기 설명된 모든 소포성 구조를 포함하는 것으로 의도된다. 리포솜 입자의 양친매성 구조는 친수성 및 소수성 약학적 약물의 캡슐화를 가능하게 한다.
리포솜을 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 리포솜에 대한 일반적인 논의는 문헌 [Akbarzadeh et al. Nanoscale Research Letters 2013, 8:102; Gregoriadis G. Immunol. Today, 11:89-97, 1990; 및 Frezard, F., Braz. J. Med. Bio. Res., 32:181-189, 1999]에서 볼 수 있다. 리포솜을 제조하기 위한 임의의 적합한 방법이 본 발명의 실시에 사용될 수 있거나, 리포솜은 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 리포솜은 전형적으로 순수한 물 또는 물에 용해된 하나 이상의 성분의 용액, 예를 들어 포스페이트 완충 염수(PBS), 포스페이트가 없는 염수 또는 다른 생리학적으로 적합한 수용액일 수 있는 수용액으로 지질 이중층(예를 들어, 인지질 및 콜레스테롤)을 형성하는 리포솜 성분을 수화함으로써 제조된다.
리포솜 조성물은 예를 들어 천연 지질, 합성 지질, 스핑고지질, 에테르 지질, 스테롤, 카르디오리핀, 양이온성 지질 및 폴리(에틸렌 글리콜) 및 다른 중합체로 개질된 지질을 사용하여 얻을 수 있다. 합성 지질은 하기 지방산 성분을 포함할 수 있다: 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 아라키도일, 올레오일, 리놀레오일, 에루코일 또는 이들 지방산의 조합물. 리포솜을 제조하는데 특히 적합한 지질은 인지질, 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 트리올레인, 디팔미토일포스파티딜 글리세롤(DPPG), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 디스테아로일포스파디딜 글리세롤(DSPG), 디올레오일포스파디딜콜린(DOPG), 콜레스테롤, 트리카프릴린, 트리올레인, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민 나트륨 염(MPEG-DSPE), 레시틴, 세팔린, 스핑고미엘린, 에그 포스파티딜콜린(EPC), 숙신산이나트륨 6수화물(DSH), (1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모늄)프로판)(DOTAP), 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 및 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
DOTAP 및 DOTIM과 같은 양이온성 합성 지질은 종양 혈관계 및 유방 유관에 대한 친화성을 갖는 양이온성 리포솜의 제조에 유용하다. 일부 실시양태에서, 리포솜, 나노 입자, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀의 제조는 양이온성 합성 지질을 사용하여 제조된다.
고세균 지질로 제조된 리포솜을 포함하는 임의의 리포솜이 본 발명에서 사용될 수 있지만, 적어도 하나의 실시양태에서, 인지질 및 에스테르화되지 않은 콜레스테롤이 리포솜 제제에 사용된다. 콜레스테롤은 리포솜을 안정화하기 위해 사용되며, 리포솜을 안정화하는 임의의 다른 화합물이 콜레스테롤을 대체할 수 있다. 다른 리포솜 안정화 화합물은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 포화 인지질은 증가된 안정성을 나타내는 보다 높은 전이 온도를 갖는 리포솜을 생성한다.
리포솜 제조에 바람직하게 사용되는 인지질은 포스포글리세롤, 포스포에탄올아민, 포스포세린, 포스포콜린 및 포스포이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤드기를 갖는 것이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 94-100% 포스파티딜콜린인 지질을 포함한다. 이러한 지질은 레시틴 포스포리폰(Phospholipon)® 90 G에서 상업적으로 입수할 수 있다. 에스테르화되지 않은 콜레스테롤이 리포솜 제제에 또한 사용될 때, 콜레스테롤은 인지질 중량의 약 10%에 해당하는 양으로 사용된다. 콜레스테롤 이외의 다른 화합물이 리포솜을 안정화하기 위해 사용되는 경우, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 조성물에 필요한 양을 쉽게 결정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 리포솜 성분 또는 리포솜 성분의 혼합물, 예를 들어 인지질(예를 들어, 포스포리폰® 90G), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 트리올레인, 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 디스테아로일포스파디딜 글리세롤(DSPG), 디올레오일포스파디딜콜린(DOPG), 콜레스테롤, 트리카프릴린, 트리올레인, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민 나트륨 염(MPEG-DSPE), 레시틴, 세팔린, 스핑고미엘린, 에그 포스파티딜콜린(EPC), 숙신산이나트륨 6수화물(DSH), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 및 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)이 유기 용매, 예를 들어 클로로포름과 메탄올의 혼합물에 용해된 후, 여과되고(예를 들어, PTFE 0.2 ㎛ 필터), 용매를 제거하기 위해 예를 들어 회전 증발에 의해 건조될 수 있다.
생성된 지질 혼합물의 수화는 예를 들어 지질 혼합물을 수용액에 주입하거나, 지질 혼합물 및 수용액을 초음파로 처리함으로써 수행될 수 있다. 리포솜의 형성 동안, 리포솜 성분은 리포솜 성분이 수화되는 일정 부피의 수용액을 둘러싸고 있는 단일 이중층(단일 라멜라) 또는 다중 이중층(다중 라멜라)을 형성한다.
다른 실시양태에서, 리포솜은 연속적인 소수성 상을 포함하는 담체와 조합될 수 있다.
담체가 소수성 물질 또는 소수성 물질의 혼합물(예를 들어, 100% 미네랄 오일 담체의 사용)로만 구성된 경우, 리포솜은 소수성 물질과 단순히 혼합될 수 있거나, 또는 다수의 소수성 물질이 존재하는 경우에는 임의의 하나의 소수성 물질 또는 그의 조합물과 혼합될 수 있다. 소수성 물질의 연속상을 포함하는 담체가 불연속 수성 상을 함유하는 경우에, 담체는 전형적으로 유중수 에멀젼과 같은 소수성 상 내의 수성 상의 에멀젼 형태를 취할 것이다. 이러한 조성물은 에멀젼을 안정화하고, 리포솜의 균일한 분포를 촉진하기 위해 유화제를 함유할 수 있다. 유화제는 담체에 리포솜의 균일한 분포를 촉진하기 위해 물이 없는 담체가 사용되는 경우에도 유용할 수 있다. 전형적인 유화제는 만나이드 올레에이트(Arlacel™ A), 레시틴(예를 들어, S100 레시틴), 인지질, 트윈(Tween)™ 80 및 스판스(Spans)™ 20, 80, 83 및 85를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 물질 대 유화제의 부피비(v/v)는 약 5:1 내지 약 15:1의 범위이다. 적어도 하나의 실시양태에서, 상기 비는 약 10:1이다.
리포솜은 완성된 에멀젼에 첨가될 수 있거나, 유화 전에 수성 상 또는 소수성 상으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 이어서 냉동 건조 또는 동결건조에 의해 탈수될 수 있다.
재분극화제, 차단제 또는 둘 모두는 제제화 공정의 다양한 상이한 단계에서 도입될 수 있다. 하나 초과의 유형의 재분극화제 또는 차단제가 조성물에 포함될 수 있다(예를 들어, 항체 및 소분자 억제제 또는 siRNA 및 mRNA, 폴리펩티드 및 RNA 백신 등).
일부 실시양태에서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 리포솜의 지질 이중층을 형성하는 데 사용되는 성분(예를 들어, 인지질(들) 및 콜레스테롤)을 수화하기 위해 사용되는 수용액에 존재한다. 이 경우, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 리포솜에 캡슐화되어, 그의 수성인 내부에 존재하게 될 것이다. 생성된 리포솜이 세척되거나 건조되지 않고, 따라서 소수성 물질의 연속상을 포함하는 담체와 궁극적으로 혼합되는 잔류 수용액이 존재하는 경우에, 추가의 분극화제 또는 차단제가 최종 생성물에서 리포솜 외부에 존재할 수 있다.
관련 기술에서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 수용액으로 수화하기 전에, 리포솜의 지질 이중층을 형성하기 위해 사용되는 성분과 혼합될 수 있다. 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 또한 예비 형성된 리포솜에 첨가될 수 있으며, 이 경우 항원은 리포솜에 능동적으로 로딩되거나, 리포솜의 표면에 결합되거나, 또는 항원은 리포솜의 외부에 남아있을 수 있다. 이러한 실시양태에서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 첨가하기 전에, 예비 형성된 리포솜은 빈 리포솜이거나(예를 들어, 캡슐화된 분극화제 또는 차단제를 함유하지 않음), 예비 형성된 리포솜은 리포솜 내에 혼입되거나 이와 회합된 분극화제 또는 차단제를 함유할 수 있다. 이들 단계는 소수성 물질의 연속상을 포함하는 담체와 혼합되기 전에 실시될 수 있다.
대안적인 접근법에서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 담체가 리포솜과 조합되기 전, 동안 또는 후에 소수성 물질의 연속상을 포함하는 담체와 혼합될 수 있다. 담체가 에멀젼인 경우, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 유화 전에 수성 상 또는 소수성 상 중 하나 또는 둘 모두와 혼합될 수 있다. 대안적으로, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 유화 후에 담체와 혼합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 리포솜 내에 및 또한 소수성 물질의 연속상을 포함하는 담체에 존재할 수 있다.
분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 추가의 치료제를 추가로 포함하는 경우, 추가의 치료제는 상기 기재된 바와 같이 조합될 수 있다.
안정화제, 예를 들어 수크로스와 같은 당, 알파-토코페롤과 같은 항산화제, 또는 생물학적 활성을 유지하거나 화학적 안정성을 개선하여 재분극화제 및 차단제의 보관 수명을 연장시키는 보존제를 상기 조성물에 첨가할 수 있다. 다른 부형제는 염, 예를 들어 염화나트륨(NaCl) 및 염화칼슘, 인산이나트륨 탈수물, 인산이수소칼륨을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 제제화하기 위해, S100 레시틴 및 콜레스테롤의 균질 혼합물(예를 들어, 10:1 w:w)은 선택적으로 포스페이트 완충제 내에서 재분극화제 또는 차단제(예를 들어, 항-MARCO ScFV 또는 항-MARCO 항체, IL-12 mRNA 또는 TMP195)의 존재 하에 수화되어 캡슐화된 재분극화제 또는 차단제가 존재하는 리포솜을 형성한다. 이어서, 리포솜 제제는 선택적으로 수동 소형 압출기를 통해 압출될 수 있고, 선택적으로 추가의 치료제 또는 영상화제와 혼합될 수 있다. 이어서,상기 현탁액은 동결건조되고, 소수성 물질의 연속상을 포함하는 담체에서 재구성되어 무수 리포솜 현탁액을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 트리올레인, 디팔미토일포스파티딜 글리세롤(DPPG), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 디스테아로일포스파디딜 글리세롤(DSPG), 디올레오일포스파디딜콜린(DOPG), 콜레스테롤, 트리카프릴린, 트리올레인, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민 나트륨 염(MPEG-DSPE), 레시틴(0.01 mg/ml 내지 0.2 mg/ml), 세팔린(0.005 mg/ml 내지 0.05 mg/ml), 스핑고미엘린, 에그 포스파티딜콜린(EPC), 숙신산이나트륨 6수화물(DSH), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)(예를 들어, 10:1 w:w)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질 성분의 균질 혼합물을 선택적으로 포스페이트 완충제 내에서 재분극화제, 차단제 또는 둘 모두와 함께 수화하여, 재분극화제, 차단제 또는 둘 모두로 캡슐화된 리포솜을 형성함으로써 제제화될 수 있다.
다른 실시양태에서, 조성물은 트리올레인, 디팔미토일포스파티딜 글리세롤(DPPG), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 디스테아로일포스파디딜 글리세롤(DSPG), 디올레오일포스파디딜콜린(DOPG), 콜레스테롤, 트리카프릴린, 트리올레인, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민 나트륨 염(MPEG-DSPE), 레시틴(0.01 mg/ml 내지 0.2 mg/ml), 세팔린(0.005 mg/ml 내지 0.05 mg/ml), 스핑고미엘린, 에그 포스파티딜콜린(EPC), 숙신산이나트륨 6수화물(DSH), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)(예를 들어, 10:1 w:w)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 지질 성분의 균질 혼합물을 선택적으로 포스페이트 완충제 내에서 재분극화제, 차단제 또는 둘 모두의 존재 하에 수화하여, 재분극화제, 차단제 또는 둘 모두로 캡슐화된 리포솜을 형성함으로써 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 디올레오일-포스파티딜콜린(DOPC)과 콜레스테롤(예를 들어, 10:1 w:w)의 균질 혼합물을 선택적으로 포스페이트 완충제 내에서 재분극화제, 차단제 또는 둘 모두의 존재 하에 수화하여, 재분극화제, 차단제 또는 둘 모두로 캡슐화된 리포솜을 형성함으로써 제제화될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 나노 입자로서 제제화되는 것을 제시한다. 일부 실시양태에서, 상기 나노 입자는 지질 나노 입자(예를 들어, 변형된 리포솜)일 수 있다. 나노 스케일에서 변형된 리포솜은 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 단백질 및 화학치료제의 전달을 위한 우수한 약동학적 프로파일을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 일부 실시양태에서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 지질 나노 입자에 포함된다. 다른 실시양태에서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 나노 입자(예를 들어, 실시예 1에서 제시되는 바와 같은 지질 코팅된 나노 입자와 같은 지질 입자) 또는 리포솜의 표면 상에 로딩된다.
다른 적합한 나노 입자는 중합체성 나노 입자(예를 들어, 생분해성 합성 중합체, 예를 들어 폴리락티드-폴리글리콜라이드 공중합체, 폴리아크릴레이트 및 폴리카프로락톤, 또는 천연 중합체, 예를 들어 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐 및 키토산을 사용하여 제조됨), 중합체 미셀, 하이드로겔 나노 입자, 덴드리머, 귀금속 나노 입자(예를 들어, 금 나노 입자) 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 1000 나노미터(nm) 이하, 예를 들어 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 및 100 nm 이하 중 임의의 크기의 평균 또는 중간 직경을 갖는 나노 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노 입자의 평균 또는 중간 직경은 약 200 nm 이하이다. 일부 실시양태에서, 나노 입자의 평균 또는 중간 직경은 약 150 nm 이하이다. 일부 실시양태에서, 나노 입자의 평균 또는 중간 직경은 약 100 nm 이하이다. 일부 실시양태에서, 나노 입자의 평균 또는 중간 직경은 약 20 내지 약 400 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노 입자의 평균 또는 중간 직경은 약 40 내지 약 200 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노 입자는 멸균 여과 가능하다.
일부 실시양태에서, 나노 입자 반응성 및 리포솜 반응성 중합체, 또는 하이드로겔로부터 재분극화제 및 차단제의 방출은 pH, 온도, 무선 주파수 또는 자기장의 변화에 의해 유발될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 나노 입자 및 리포솜이 표적 특이적 약물 전달을 위해 제제화되는 것을 제시한다. 이러한 표적 특이성은 M2 대식세포를 표적으로 하는 하나 이상의 세포 표적화제와 나노 입자 및 리포솜을 접합시킴으로써 달성된다. 본 발명의 목적에 적합한 세포 표적화제는 임의의 M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자일 수 있다. 본 개시내용은 나노 입자 및 리포솜이 하나 이상의 M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자로 코팅되는 것을 제시한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자가 M2 대식세포 상에만 독점적으로 존재할 수 있지만, 비-M2 대식세포에도 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 그러나, 적합한 M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자는 M2 대식세포에서만 독점적으로 발현되거나 또는 비-M2 대식세포보다 M2 대식세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 것이다. 본 발명의 목적에 적합한 M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자는 IL-1Rα, CD163, CD206, CD200R, MerTK, 스캐빈저 수용체 A, 스캐빈저 수용체 B, MARCO 및 F4/80을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본원에서 설명되는 나노 입자는 건조 제제(예를 들어, 동결 건조 조성물)로 존재하거나, 생체 적합성 매질에 현탁될 수 있다. 적합한 생체 적합성 매질은 물, 완충된 수성 매질, 염수, 완충된 염수, 선택적으로 완충된 아미노산 용액, 선택적으로 완충된 단백질 용액, 선택적으로 완충된 당 용액, 선택적으로 완충된 비타민 용액, 선택적으로 완충된 합성 중합체, 지질 함유 에멀젼 등을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
나노 입자는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다(문헌 [Pal et al., Journal of Applied Pharmaceutical Science 01 (06); 2011: 228-234; Hu Y et al. Nanoparticles. Nano Letters. 2007; 7:3056-3064; Hu YH et al. Biomacromolecules. 2009; 10:756-765; Lynn DM, Langer R. Journal of the American Chemical Society. 2000; 122:10761-10768] 참조).
분극화제 및 차단제의 첨가는 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 비제한적인 예로서, 문헌 [Goncalves et al., Su et al.]에 기재된 바와 같이, DNA 서열은 선형 또는 플라스미드 및 카세트로서 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 및 엑소솜에 첨가될 수 있다.
본 개시내용은 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀의 지질 대 핵산 비(LNR)가 30:1 내지 2.5:1의 범위인 것을 제시한다. 일부 실시양태에서, 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀의 LNR의 범위는 25:1 내지 5:1이다. 적어도 하나의 실시양태에서, 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀의 LNR의 범위는 20:1 내지 10:1이다.
본 개시내용은 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀의 지질 대 단백질 비(LPR)가 30:1 내지 1:1의 범위인 것을 제시한다. 일부 실시양태에서, 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀의 LNR의 범위는 25:1 내지 5:1이다. 적어도 하나의 실시양태에서, 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀의 LNR의 범위는 20:1 내지 10:1이다.
본 개시내용은 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 미셀의 소분자 약물 대 지질(D/L) 비가 전형적으로 지질 1 mg당 적어도 0.05, 0.1, 0.2, 0.35, 0.5, 또는 적어도 0.65 mg의 약물인 것을 제시한다. 몰비의 측면에서, 본 발명에 따른 D/L 비는 지질 1몰당 적어도 약 0.02 내지 약 5, 적어도 약 0.1 내지 약 2, 및 약 0.15 내지 약 1.5몰의 약물이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 분극화제, 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 영상화제, 염료 또는 조영제를 추가로 포함한다는 것을 제시한다. 적합한 영상화제는 가돌리늄 킬레이트, 초상자성 산화철 나노 입자(SPION), 19F 퍼플루오로카본 나노 입자 및 다른 자성 리포터 유전자, 예를 들어 금속 단백질 기반 MRI 프로브일 수 있다. 본원에서 개시되는 영상화제, 염료 및 조영제의 첨가는 본원에서 개시되는 조성물의 관내 전달 및 이들 조성물을 포식하는 대식세포의 이동을 추적한다는 추가의 이점을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 분극화제 또는 차단제, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 추가의 치료제를 추가로 포함한다는 것을 제시한다. 상기 추가의 치료제는 유방 장애의 치료에 유용한 임의의 약제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 체크포인트 억제제, 항호르몬제, 스테로이드, 안트라사이클린, 갑상선 호르몬 대체 약물, 티미딜레이트 표적화 약물(예를 들어, 도세탁셀, 겜시타빈, 파클리탁셀 또는 카르보플라틴 및 페길화 리포솜 독소루비신), DNA 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈), 트라스투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 아베마시클립, 팔보시클립, 키메라 항원 수용체/T-세포(CAR-T) 요법과 같은 세포 요법, 및 기타 입양 세포 요법 중 하나 이상이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 타목시펜, 시스-타목시펜, 엔독시펜, 데스메틸타목시펜, 라소폭시펜, 랄록시펜, 벤조티오펜, 바제도폭시펜, 아르족시펜, 미프록시펜, 레보르멜록시펜, 드롤록시펜, 클로미펜, 이독시펜, 토레미펜, EM652 및 ERA-923, 풀베스트란트, ARN-810 또는 CH498, 아나스트로졸, 엑세메스탄 및 레트로졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항호르몬제이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-PD-1(예를 들어, 니볼루맙), 항-PD-1L(예를 들어, 아테졸리주맙(MPDL3280), 아벨루맙(MSB0010718C), 두르발루맙, MDX-1105), 항-CTLA4(예를 들어, 이필리무맙), 항-LAG-3(예를 들어, IMP321, BMS-986016 및 GSK2831781) 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 체크포인트 억제제이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 데포 제제로 제제화된다.
본원에서 개시되는 조성물은 대상체의 유방 유관에 대한 관내 투여에 적합하다.
전달 방식; 장치
한 측면에서, 본 개시내용은 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물이 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 대상체의 하나 이상의 유방 유관에 관내로 전달될 수 있다는 것을 제시한다. 상기 방법은 주사기/바늘을 사용한 주사(Krause et al. J. Vis. Exp. 2013; (80): 50692); 캐뉼라, 카테터, 프로브 및 미국 특허 제6,413,228호; 제6,689,070호; 제6,638,727호, 특허 출원 PCT/US2015/010808에 개시된 것, 지연 방출(time-release) 캡슐 및 캡슐화 장치 등을 포함한다.
비제한적인 예로서, 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 세포 또는 조성물은 (a) 장치의 치료 챔버 내에 함유된 변형된 세포를 포함하는 조성물을 유방의 젖꼭지와 접촉시키는 단계; 및 (b) 조성물에 양압을 가하는 단계에 의해 대상체의 유방 유즙관에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 양압으로 인해 유방 유관 내로 강제로 투입된다. 바람직하게는, 조성물은 하나 이상의 유방 유관 내로 강제로 투입된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 2 내지 5개의 유방 유관 내로, 4 내지 8개의 유방 유관 내로, 또는 7 내지 11개의 유방 유관 내로 강제로 투입된다.
예를 들어, 미국 특허 제6,413,228호는 유관 유체를 수집하고 유관에 세척 유체를 주입할 수 있는 유관 접근 장치를 개시하고 있다. 이러한 장치는 본 발명의 조성물의 관내 전달을 위해 본 개시내용의 목적에 적합하게 조정되거나 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 캐뉼라 또는 마이크로캐뉼라이다.
관내 투여에 대한 대안적인 방법으로서, 작은 펌프가 유관에 또는 젖꼭지의 표면에 설치되고, 여기서 펌프는 변형된 세포를 유관 영역에 천천히 연속적으로 투여하기 위해 유관에 접근할 수 있고, 예를 들어, 펌프는 그 내부에 변형된 세포를 투여하고 세포를 유관의 나머지 부분에 확산시키기 위해 유관동(lactiferous sinus)에 설치될 수 있거나, 펌프는 유관에 접근할 수 있는 상태로 젖꼭지 표면에 설치될 수 있다. 젖꼭지 표면에 설치된 펌프는 예를 들어 압정(tack) 또는 상단 또는 압정 부분을 갖는 골무형(thimble-shaped) 부분 및 치료를 필요로 하거나 또는 치료를 필요로 할 위험이 있는 유관 내로 연장되는 부분을 갖는 젖꼭지 표면 상의 나머지 부분과 같은 형상일 수 있다. 펌프 메커니즘은 예를 들어 존슨 & 존슨(Johnson & Johnson)에 의해 인수된 알자 코퍼레이션(Alza Corp)에 의해 제조된 두로스(Duros)™ 삼투압 (마이크로)펌프(Viadur), 인텔리드러그(IntelliDrug), 알제트(Alzet)®(Durect Corp.), 이보멕(Ivomec) SR® 볼러스 등 포함할 수 있다(Herrlich et al. Advanced Drug Delivery Reviews. 2012, pages 1617 - 1626).
삼투 펌프는 또한 본질적으로 미국 특허 제5,298,487호, 미국 특허 제5,531,736호, 미국 특허 제5,279,608호, 미국 특허 제5,562,654호, 미국 특허 제5,827,538호, 미국 특허 제5,798,119호, 미국 특허 제5,795,591호, 미국 특허 제4,552,561호 또는 미국 특허 제5,492,534호에 설명된 펌프와 같이 조립되거나 구성될 수 있고, 유방의 유관에 투여하기 위해, 예를 들어 유관(예를 들어, 유관동) 내로의 배치를 위해 또는 젖꼭지 표면 상에 배치하기 위해 크기 및 부피를 적절하게 변형할 수 있다. (유관에 접근하는) 끝부분은 젖꼭지 표면 상에 다양한 위치의 유관을 수용하기 위해 회전할 수 있다. 단일 압정 헤드(tack-head) 펌프에서, 특정 유관 또는 유관들에 접근하기 위해 하나 이상의 끝부분이 압정 헤드 아래에 배치될 수 있고, 여기서 예를 들어 유방의 2개 이상의 유관이 접근될 필요가 있다. 상기와 같이 구성되고 관내 투여를 위해 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 적절히 제제화된 조성물이 로딩된 펌프는 설명된 바와 같은 조성물을 투여할 수 있지만, 유방 유관에서 전암 또는 암 병태의 치료를 위한 적절한 치료 목적을 위해 본원에서 개시되는 조성물 이외의 다른 약제를 함유하고 투여할 수도 있다. 생각할 수 있는 바로는, 펌프는 유방에 위치한 모든 유관에 대해 약간의 크기 및 부피를 변경하여 투여하도록 구성될 수 있다.
캡슐화 장치는 또 다른 매력적인 방법이고, 마이크로 캡슐화 및 거대 캡슐화 장치를 포함한다. 영양소 및 치료제의 선택적 투과를 허용하는 반투과성 합성 나노 다공성 막으로 세포를 둘러싸서 세포를 면역 분리하는 자가 폴딩 면역 보호 캡슐화 장치가 개발되었다. 이러한 캡슐화 장치는 파우치, 섬유, 비드, 및 세포가 수용되는 반투과성 재료로 제조된 임의의 장치를 포함한다. 이러한 장치는 치료를 위해 구성될 수 있으며, 예를 들어 세포를 유관 내에 방출시키기 위해 생분해성 물질로 제조될 수 있다.
본 발명의 목적에 유용한 장치는 이식 가능할 수 있다. 예를 들어, 스테판(Stephan) 등은 조성물의 전달을 위한 생체중합체 임플란트를 기술한 바 있다(Stephan et al. Nature Biotechnology, 2015, 33, 97-101). 한 측면에서, 예를 들어 캐뉼라, 마이크로 캐뉼라, 카테터, 비드, 캡슐화 장치와 같이 이식 가능한 장치가 본원에서 제공된다. 이식 가능한 장치는 예를 들어 세포 및 본 발명의 조성물을 이환된 조직에 근접하여 방출하고 그들의 정상 세포에 대한 노출을 감소시키도록 구성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서 개시되는 조성물의 관내 전달은 유방의 유관 내로의 및/또는 유관 내의 세포의 이동을 돕는 전류를 유방에 인가하는 것을 포함하는 이온영동(iontophoresis)에 의해 도움을 받을 수 있다.
투여
본원에서 개시되는 조성물의 투여 시기 및 크기는 일반적으로 예를 들어 시간이 지남에 따라 조성물에 대한 대상체의 보다 빠르고 증가된 노출을 제공하는 것과 같은 독성 결과의 위험을 감소시키거나 독성 결과를 최소화하고/하거나 효능을 개선하도록 설계된다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 연령, 체중, 종양 크기 및 병기, 표면적 및 대상체 질환의 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 진료 의사에 의해 결정될 수 있다.
환자의 질병 징후를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 최적의 투여량 및 투여 요법이 의약 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 조성물은 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 일정 시간에 걸친 단일 용량 또는 다중 용량 또는 예를 들어 주입에 의한 연속적인 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 단일 단위 용량일 수 있다. 다른 실시양태에서, 단일 용량은 분할 단위 용량일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분할 단위 용량"은 1일 초과를 포함하여 하루 동안 1회 초과로 투여되도록 분할된 단위 용량을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위한 분할 단위 용량은 단일, 즉 1개의 단위 용량으로 간주된다. 용량을 분할하는 예시적인 방법은 첫날에 용량의 25%를 투여하고 다음 날에 나머지를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단위 용량은 50%가 2일 연속 전달되도록 2개로 분할될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 분할 단위 용량은 격일로 2회 제공될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단위 용량은 3일 연속 동일하게 투여되도록 3개로 분할될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 엑소솜 중 임의의 것을 포함하는 조성물이 단위 용량당 1 × 104 내지 1 × 108 개의 리포솜 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 또는 엑소솜의 농도로 관내 투여되는 것을 제시한다.
본원에서 개시되는 방법은 하나 이상의 연속적인 용량의 세포를 제1 용량을 받았을 수 있는 대상체의 유방 유관에 투여하고/하거나, 제1 및 하나 이상의 후속 용량을 투여하는 것을 포함한다. 용량은 특정 양으로, 및 특정 시간 계획 및 파라미터에 따라 투여된다.
또 다른 측면에서, 제1 용량은 관내로 투여되고, 임의의 후속 용량은 관내, 주사 및 주입, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 안구 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하(subconjectval) 주사, 결막하(subconjuntival) 주사, 테논낭하(sub-Tenon) 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사, 또는 후방 공막 부근 전달을 포함하는 임의의 적절한 수단에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 요망되는 경우 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 흉강내, 두개내 또는 피하 투여가 포함된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 일반적으로 본원에서 개시되는 조성물의 제1 용량을 관내로 투여함으로써 질환 부담을 감소시키는 것을 포함한다. 이어서, 제1 용량과 관련하여 특정 기간 동안 후속 용량의 조성물이 투여되거나 또는 제1 용량을 투여한 대상체에게 후속 용량을 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 용량은 비교적 적다. 투여되는 조성물의 양 및 조성물의 투여 타이밍은 면역 억제의 감소, 종양 크기의 감소 및 전염증성 사이토카인, 케모카인, M1 대식세포로의 M2-재분극화, 및 세포독성 T-림프구의 동원의 증가 등과 같은 하나 이상의 결과를 개선하도록 설계된다.
일부 실시양태에서, 후속 용량의 조성물을 제1/초기 용량보다 더 증가된 횟수로 투여함으로써 보다 많은 용량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 개시된다.
투여 요법이 다중 용량을 포함하는 경우, 각각의 용량은 매일, 하루에 수회(2회, 3회, 4회 등), 격일, 2일마다, 3일마다, 5일마다, 7일마다, 14일마다, 15일마다, 28일마다, 매월, 분기마다, 6개월마다 및 매년 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 초기 용량 후 투여 타이밍은 초기(제1) 용량의 개시로부터 다음 용량의 개시까지로 측정된다. 다른 실시양태에서, 초기 용량 후 투여 타이밍은 초기(제1) 용량의 완료로부터 측정된다.
본 발명은 초기 용량이 분할 단위 용량이고 이후에 제2 용량이 투여될 수 있음을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 또는 후속 용량은 분할 단위 용량일 수 있다. 비제한적인 예로서, 분할 단위 용량은 3일에 걸쳐 투여될 수 있고, 제2 단위 용량은 바로 다음날에 투여되거나 또는 1년 후에 투여될 수 있다. 초기 용량은 대상체가 일정 용량의 세포 요법을 이전에 투여받은 적이 없거나 또는 심지어 대상체가 동일한 재조합 수용체를 발현하거나 동일한 항원을 표적으로 하는 동일한 세포의 일정 용량을 이전에 투여받지 않은 것을 시사함으로써 이러한 용량을 필요로하는 대상체와 관련하여 임의의 제한을 생성하도록 의도된다.
일반적으로, 본원에서 설명되는 바와 같은 조성물은 단위 용량당 임의의 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 또는 엑소솜의 1x104 내지 1 x 108개의 농도로 관내 투여될 수 있다.
병용 요법
본 발명은 본원에서 개시되는 관내 방법이 병용 요법을 추가로 포함한다는 것을 고려한다. 한 측면에서, 관내 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가의 치료제 또는 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 치료제는 관내, 국소, 경구, 비내, 주사 또는 주입에 의한 비경구, 피하 등을 포함하지만 이로 제한되지는 않는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 본원에서 개시되는 조성물에 포함될 수 있거나 또는 독립적으로 제제화될 수 있다. 치료제 및/또는 요법의 투여 순서는 임의의 투여 순서일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시되는 조성물은 추가의 치료제와 공동 투여될 수 있거나, 추가의 치료제가 먼저 투여될 수 있거나 또는 본 발명의 조성물이 투여된 후에 추가의 치료제가 투여될 수 있다.
추가의 치료제는 본 발명의 목적에 유용한 임의의 것일 수 있다.
예시적인 추가의 치료제는 체크포인트 억제제, 항호르몬제, 스테로이드, 안트라사이클린, 갑상선 호르몬 대체 약물, 티미딜레이트 표적화 약물(예를 들어, 도세탁셀, 겜시타빈, 파클리탁셀 또는 카르보플라틴 및 페길화 리포솜 독소루비신), DNA 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈), 트라스투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 아베마시클립, 팔보시클립, 키메라 항원 수용체/T-세포(CAR-T) 요법과 같은 세포 요법 및 기타 입양 세포 요법을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
추가의 요법은 수술, 방사선 조사, 화학 요법, 침술, 비-경유두적(non-transpapillary) 입양 세포 요법 등을 포함할 수 있다. 본원에서 개시되는 방법은 1차 요법, 신보조(neoadjuvant) 요법(예를 들어, 수술(예를 들어, 유방 절제술 또는 종괴 절제술) 또는 화학 요법 전에), 또는 보조 요법(단지 예시의 목적을 위해, 화학 요법 또는 입양 세포 요법의 다른 방법을 사용한 치료 후에)으로서 사용될 수 있다.
제조 물품
입양 세포 요법을 위해 본원에서 개시되는 세포 및 조성물의 투여를 위한, 및 세포 및 조성물의 보관 및 투여를 위한 제조 물품, 예를 들어 키트 및 장치가 또한 본원에서 제공된다.
제조 물품은 본원에서 개시되는 조성물, 하나 이상의 용기, 포장 재료, 및 세포를 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 일반적으로 포함하는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
용기는 투여되는 조성물의 하나 이상의 단위 용량을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제조 물품은 각각 조성물의 단일 단위 용량을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 단위 용량은 제1 용량에서 대상체에게 투여되는 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 엑소솜 중 임의의 것의 양 또는 수, 또는 제1 또는 후속 용량(들)으로 투여되는 나노 입자, 리포솜 등의 수의 2배(또는 그 초과)일 수 있다. 투여 방법과 관련하여 대상체에게 투여되는 것은 나노 입자, 리포솜 등의 최저 용량 또는 가능한 최저 용량일 수 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 용기는 동일하거나 실질적으로 동일한 수의 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 엑소솜 중 임의의 것을 함유하는 조성물의 단위 용량을 개별적으로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 각각의 용기는 동일하거나 또는 대략 또는 실질적으로 동일한 수의 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 엑소솜 중 임의의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1x104개 이상의 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 엑소솜 중 임의의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1 × 104 내지 1 × 108 개의 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 및 엑소솜 중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제조 물품은 추가의 치료제, 예를 들어 체크포인트 억제제, 항호르몬제, 스테로이드, 안트라사이클린, 갑상선 호르몬 대체 약물, 티미딜레이트 표적화 약물(예를 들어, 도세탁셀, 겜시타빈, 파클리탁셀 또는 카르보플라틴 및 페길화 리포솜 독소루비신), DNA 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈), 트라스투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 아베마시클립, 팔보시클립, 키메라 항원 수용체/T-세포(CAR-T) 요법과 같은 세포 요법 및 기타 입양 세포 요법을 추가로 포함한다. 항호르몬제는 타목시펜, 시스-타목시펜, 엔독시펜, 데스메틸타목시펜, 라소폭시펜, 랄록시펜, 벤조티오펜, 바제도폭시펜, 아르족시펜, 미프록시펜, 레보르멜록시펜, 드롤록시펜, 클로미펜, 이독시펜, 토레미펜, EM652로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제조 물품은 가돌리늄 킬레이트, 초상자성 산화철 나노 입자(SPION), 19F 퍼플루오로카본 나노 입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 영상화제, 염료 또는 조영제를 추가로 포함한다.
적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 가요성 백, 예를 들어 주입 백을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 예를 들어 튜빙 또는 캐뉼레이션을 하나 이상의 튜브에 연결하기 위한, 예를 들어 경유두적 전달을 위한 및/또는 세포 배양 및/또는 보관 백 또는 다른 용기들과 같은 다른 용기로의 전달 및 상기 용기로부터의 전달을 위한 하나 이상의 포트, 예를 들어 멸균 접근 포트를 갖는다.
제조 물품은 하나 이상의 식별 정보 부분 및/또는 사용 설명서가 있는 포장 삽입물 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 확인 정보 또는 사용 설명서는 내용물이 유방 장애를 치료하고/하거나 그에 대한 설명서를 제공하는데 사용될 수 있거나 사용해야 한다는 것을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 제조 물품의 내용물이 유방 장애를 치료하기 위해 사용되는 것임을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 라벨 또는 포장 삽입물은 예를 들어 본원에서 제공되는 방법의 임의의 실시양태에 따라 제1 및 하나 이상의 후속 용량의 세포를 관내 투여하는 것을 포함하는 방법을 통해, 대상체, 예를 들어 유방 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 설명서를 제공한다. 일부 실시양태에서, 설명서는 제1 용량으로 하나의 단위 용량, 예를 들어 제조 물품 내의 개개의 단일 용기의 내용물을 투여한 후, 지정된 시점에 또는 특정 기간 내에 및/또는 대상체에서 하나 이상의 인자 또는 결과의 존재 또는 부재 또는 양 또는 정도의 검출 후에 하나 이상의 후속 용량을 투여하는 것을 명시한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 양, 일시적 지속 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭하고, 명시된 값으로부터 ± 20% 또는 일부 경우에 ± 10%, 또는 일부 경우에 ± 5%, 또는 일부 경우에 ± 1%, 또는 일부 경우에 ± 0.1%의 변동을 포함하는 의미이고, 그 이유는 상기 변형이 개시된 방법을 수행하기에 적합하기 때문이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기 위해 충분히 자극된 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생성, 및 검출 가능한 이펙터 기능과 관련될 수 있다. "활성화된 T-세포"라는 용어는 다른 무엇보다도 세포 분열을 겪고 있는 T-세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "보조 요법"은 1차 요법 후에 시행되고 재발 위험이 있는 대상체에게 투여되는 요법을 지칭한다. 이들은 유방 질환의 병력이 있고 또 다른 치료 방식으로 치료받은 대상체이다. 유방암의 경우에 보조 전신 요법은 일반적으로 재발을 지연시키거나, 생존을 연장하거나, 대상체를 치유하기 위해 1차 요법 직후에 시작된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "1차 요법"은 대상체에서 유방 장애의 초기 진단시 치료의 제1 선을 지칭한다. 비제한적인 예시적인 1차 요법은 수술, 광범위한 화학 요법 및 방사선 요법을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 본원에서 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 인간과 같은 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 또한 개, 고양이와 같은 애완 동물, 래트, 마우스와 같은 실험 동물, 및 소 및 말과 같은 농장 동물을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 포유동물은 임의의 성별일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 개시내용의 조성물의 "투여 경로"또는 "전달 경로"는 본 개시내용의 조성물을 대상체에게 전달하기 위한 경로를 지칭한다.
실시예
실시예 1
지질 코팅 나노 입자의 합성
지질 코팅 나노 입자의 제조. 폴리-1 코어를 갖는 지질 코팅된 나노 입자는 문헌 [Su et al. Molecular Pharmaceutics 8, no. 3 (June 6, 2011):774-787]에 기재된 바와 같이 합성하였다. 간략하게 설명하면, 폴리-1 코어를 갖는 지질 코팅된 나노 입자는 이중 에멀젼/용매 증발법 또는 용매 확산/나노 침전 전략이라는 두 가지의 상이한 공정을 통해 합성되었다. 이중 에멀젼 합성의 경우, 30 mg의 폴리-1(또는 pH 비민감성 제어 입자의 경우 PLGA) 및 7:2:1의 몰비의 2 mg의 인지질 DOPC, DOTAP 및 DSPE-PEG를 1 ml의 디클로로메탄(DCM)에 함께 용해시켰다. 이어서, 200 ㎕의 포스페이트 완충 염수(PBS)를 프로브 팁 초음파 처리기(Misonix XL2000, 미국 뉴욕주 파밍데일 소재)를 사용하여 7 W에서 1분의 초음파 처리 단계 동안 얼음 상의 혼합물에 첨가하여 제1 에멀젼을 형성하였다. 이어서, 1차 에멀젼을 12 W에서 5분 동안 초음파로 처리하여 증류되고 탈이온화된 뉴클레아제 미함유 물 6 ml에 분산시킨 후, 25℃에서 18시간 동안 진탕기에 두고 유기 용매를 증발시켰다. 나노 침전 합성의 경우, 동일한 양의 DOPC, DOTAP 및 중합체를 4 ml의 에탄올 내에 함께 용해시키고, 증류되고 탈이온화된 뉴클레아제 미함유 물 40 ml에 적가한 후, 5시간 동안 부드럽게 교반하여 에탄올을 증발시켰다. DSPE는 삽입 후 공정을 통해 지질 코팅에 도입되었다: DSPE 지질은 증류되고 탈이온화된 뉴클레아제 미함유 물에서 1 mM 내지 0.5 mg/ml의 입자로 첨가되고, 현탁액은 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 입자를 수집하고, 원심분리를 통해 1회 세척하고, 새로운 물에 재현탁시키고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 지질 미함유 PVA 안정화 입자는 유기 에멀젼 또는 중합체 함유 용액만을 2% w/vol PVA 수용액에 분산시키는 것을 제외하고는 유사한 공정에 의해 제조하였다.
각각의 입자 배치의 분획을 건조 질량을 측정함으로써 입자 농도(mg/ml)를 결정하기 위해 진공 오븐에서 건조시켰다. 동적 광 산란(DLS) 및 제타 전위 측정은 ZetaPALS 동적 광 산란 검출기(Brookhaven Instruments)를 사용하여 입자 크기 및 표면 전하를 결정하기 위해 사용하였다. 지질 표면 코팅에 포함된 지질의 백분율 및 존재하는 생성된 지질의 몰%를 추정하기 위해, 지질 봉입된 입자는 카르복시플루오레세인(DSPE-CF)으로 표지된 DSPE-지질의 후속 삽입 전에 입자에 혼입된 지질의 총량을 측정하기 위한 트레이서로서 1 몰% DOPE-로다민을 첨가하여 상기 기재된 바와 같이 나노 침전에 의해 제조하였다. 이어서, 지질을 15분 동안 2% 트리톤 X-100으로 처리함으로써 입자 표면으로부터 제거하고, 혼입된 지질의 양을 정량하기 위해 상청액을 로다민 및 플루오레세인 신호 둘 모두에 대해 측정하였다.
저온 전자현미경(cryoEM)에 의해 지질 코팅된 나노 입자의 표면 구조를 조사하기 위해, 1.2/1.3 ㎛의 구멍이 많은 탄소 코팅 구리 그리드(Electron Microscopy Sciences) 상에 입자 현탁액(3 ㎕)을 블로팅하여 입자를 얼음에 삽입하고, 샘플을 즉시 레이카(Leica) 급속 냉동기를 사용하여 액체 에탄 내에서 냉동하였다. 샘플을 극저온 홀더로 옮기고, 185 μA 방출 전류 및 40000배율에서 JEOL 2200FS 투과 전자 현미경을 사용하여 영상화하였다.
IL-12 mRNA 나노 입자의 제조. 합성 IL-12 mRNA는 문헌 [Kavanaugh et al. Blood. 2006; 107:1963-1969]에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다. 간략하게 설명하면, T7 프로모터, 개방 판독 프레임(GFP, 811개의 뉴클레오티드 또는 반딧불이 루시퍼라제, 1714개의 뉴클레오티드) 및 폴리-A 꼬리를 갖는 선형화된 플라스미드 DNA를 메시지 머신(Message Machine) T7 울트라 전사 키트(Ambion)를 사용한 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용하였다.
대안적으로, 향상된 GFP(EGFP)는 pGEM4Z/EGFP/A64 벡터에서 IL-12 유전자로 대체되고, 이것은 시험관내 mRNA 전사(IVT)에 사용되었다. 가요성 링커(InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 함께 연결된 IL-12의 p35 및 p40 서브유닛을 함유하는 IL-12elasti 카세트가 사용되었다. 이 구축물은 두 서브유닛의 동일한 발현을 제공하고, p40의 과다발현 및 IL-12p70의 길항제로서 작용하는 p40 동종이량체의 생성을 방지한다.
mRNA 생성물을 LiCl로 침전시키고, 뉴클레아제 미함유 물에 재현탁시키고, NanoDrop 분광광도계로 정량하였다. RNA 크기, 순도 및 완전성은 애질런트 생물분석기(Agilent Bioanalyzer) 2100으로 확인하였다. 이러한 mRNA 전사체로 전기천공된 RMA 세포주를 또한 사용하여 시험관 내에서 이들 mRNA의 기능성을 확인할 수 있다. mRNA는 제조사의 프로토콜에 따라 레이블 아이티(Label IT)® 핵산 표지 키트(Mirus Bio LLC)를 사용하여 형광 Cy3 태그로 표지하였다.
RNA 로딩 및 방출. IL-12 mRNA는 먼저 입자 현탁액을 뉴클레아제 미함유 물에 1.5 mg/ml로 희석한 다음, 200 ㎕의 희석된 현탁액을 서서히 볼텍싱하면서 4 ㎍의 RNA를 함유하는 100 ㎕에 적가하여 지질 코팅된 나노 입자의 표면에 로딩하였다. 이어서, 바이알을 회전자 상에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하여 RNA가 흡착되도록 하였다. 결합된 RNA는 형광 플레이트 판독기(SPECTRAmax, Molecular Devices Corp.)를 사용하여 입자의 원심 분리 후 상청액에 남아있는 Cy3 표지된 또는 리보그린 염색된 RNA의 형광을 측정함으로써 간접적으로 결정하였다. 입자에 결합된 RNA는 입자가 없지만 RNA 용액을 함유하는 동일하게 처리된 대조군 바이알에서 측정된 양으로부터 상청액에서 검출된 RNA의 양을 뺌으로써 결정하였다. 입자의 결합 동역학 및 능력을 평가하기 위해, 입자 농도는 적합한 농도(예를 들어, 1 mg/ml)로 고정되는 반면, 결합 시간 및 RNA 양은 변경하였다. 결합 효율은 입자에 결합된 용액에 초기에 존재하는 RNA의 백분율로 정의된다. 로딩은 입자 1 mg당 결합된 RNA의 양(㎍)으로 정의된다.
결합된 RNA의 방출 동역학은 문헌 [Su et al. Molecular Pharmaceutics 8, no. 3(June 6, 2011): 774-787]에 의해 기술된 바와 같이 결정되었다. 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배양 배지에서 나노 입자로부터 결합된 RNA의 방출 동역학을 결정하기 위해, 입자 흡착된 폴리 I:C(1.87 ㎍의 폴리 I:C를 함유하는 70 ㎍의 입자)의 분취액을 140 ㎕의 혈청 함유 배지에 재현탁시키고, 부드럽게 혼합하면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 각각의 지정된 시점에, 분취액을 제거하고, 입자를 용해시키고 지질-RNA 또는 폴리-1-RNA 복합체를 파괴하기 위해 분해 완충제(100 mM 아세트산나트륨, 2% 트리톤 X-100 및 1 mg/ml 폴리(L-아스파르트 산))에 재현탁시키기 전에 뉴클레아제 미함유 물로 1회 세척하였다. 입자에 남아있는 RNA의 양은 상기 설명한 바와 같이 리보그린으로 염색한 후에 형광을 측정함으로써 결정되고, 방출된 RNA의 양은 원래의 양으로부터 남아있는 RNA의 양을 빼서 계산되었다.
실시예 2
재분극화제 IL-12의 관내 투여.
젖꼭지 준비. 대상체의 옷을 벗긴 후, 임상의는 연구할 유방의 젖꼭지를 깨끗하게 하였다. 이것은 약간 과립상 겔 또는 연고로 젖꼭지를 깨끗하게 닦아서 임의의 죽은 피부 세포 및 축적된 오일을 느슨하게 만들어 제거하는 것을 포함하였다. 이것은 의료 절차 전에 병원에서 자주 사용되는 클렌저이다. 그런 다음, 약간의 마취 크림을 젖꼭지에 도포하였다.
젖꼭지 마취제. 0.1-0.2 mL의 청색 염료와 혼합된 1 mL의 리도카인을 젖꼭지의 기저부에 매우 작은 바늘로 주사하였다.
유관 확인. 염료 주입 후 및 카테터 배치 전에, 유관의 개구부를 확인하고 확장시키기 위해 작고 유연한 와이어를 개구부 내에 약 1/2인치 삽입하였다. 유관이 확인되면, 유관을 표시하기 위해 작은 조각의 매듭이 있는 봉합사 물질을 유관 내에 삽입하였다. 이는 적어도 3개의 유관 개구부에서, 많게는 5개까지 수행되었다. 임상의가 적어도 3개의 유관 개구부를 찾을 수 없는 경우에는, 대상체는 연구를 계속할 수 없어 제외되었다. 이들 대상체는 새로 등록된 대상체로 대체될 것이다.
카테터 배치, 나노 입자(IL-12)의 주입 및 X-선 검사. 모든 젖꼭지 유관 개구부가 표시되면, 임상의는 카테터를 삽입하고, 유관 구멍을 통해 상기와 같이 표시된 각각의 유방 유관에 카테터를 위치시켰다. 카테터가 제자리에 배치되면, 임상의는 선택적으로 1 mL 미만의 방사선 비투과성(radio-opaque) 염료를 유관에 천천히(30초에 걸쳐) 주입하여 유관의 영상화가 가능하도록 만들 수 있다.
염료 주입 후 및 확인된 유관의 수에 따라, 최대 2 mL(일반적으로 0.5 내지 2 mL)의 IL-12 나노 입자(1x106)의 현탁액을 각각의 유관에 천천히 (1분에 걸쳐) 주입하였다. 침습성 암을 포함한 유방만 치료되었다. 세포는 치료되는 유관의 수에 따라 배치 또는 세트로 10 mL까지의 부피로 이환된 유방 유관에 관내 투여된다. 확인된 이환된 유관 또는 소엽의 수에 기초하여 용량을 유관별로 균일하게 분배하려고 시도하였다.
카테터는 일반적으로 약 1-5분 동안 각각의 유관에 유지되었다. 절차 동안, 대상체에게 시각적 아날로그 척도를 사용하여 자신의 통증을 평가하도록 요청하였다. 염료 및 나노 입자가 주입된 후, 유관 내로 변형된 세포의 적절한 주입을 입증하기 위해 이미지를 촬영하였다. 이환된 유관의 수가 2개를 초과하는 경우, 유관내 치료 절차는 세트로 수행될 수 있었다. 카테터는 제1 유관 세트, 예를 들어 2개의 인접한 유관로부터 제거될 수 있고, 이들 유관은 각각 작은 조각의 매듭이 있는 봉합사 물질로 표시되었다. 이 시점에서, 대상체는 통증 평가를 위해 통증 척도를 사용하여 통증에 대해 평가되었다.
이어서, 새로운 카테터를 표시된 나머지 유관에 삽입하였다. 젖꼭지 유관의 다음 절반에 캐뉼라를 삽입하고 염료 및 세포가 주입된 후, 유관을 기록하기 위해 형광 투시경을 사용하여 또 다른 이미지를 촬영하였다. 대상체에게 자신의 통증을 평가하도록 다시 요청하였다. 카테터가 제거되고, 유관은 각각 작은 조각의 매듭이 있는 봉합사 물질로 개별적으로 표시되었다. 수술 때까지 마커를 제자리에 유지하기 위해 벤조인 연고 및 투명한 플라스틱 드레싱(생체 폐쇄성)을 젖꼭지에 두었다. 전체 절차는 0.5 내지 1.5 시간이 소요되었다. 절차 과정의 사진을 촬영하였다.
통증 평가 동안, 대상체가 IL-12를 포함하는 나노 입자의 주입 후 10분 이내에 해결되지 않는 유방에서의 등급 3 또는 등급 4 통증을 보고하면, 해당 대상체에 대한 연구 관련 절차를 중단하였다. 본원에서 설명되는 바와 같은 병리학적 평가뿐만 아니라 혈액 채취 및 후속 평가를 프로토콜에 따라 수행하였다. 이 경우, 대상체는 통계적 목적을 위해 연구 그룹에서 대체되었다.
초기 X-선 검사 천공이 발견되지 않으면, 부작용을 즉시 평가하였다. 대상체가 임의의 별다른 효과를 보고하지 않으면, 나머지 유관에서 캐뉼라를 삽입하고, 나노 입자를 투여하였다. 본원에서 설명되는 바와 같은 병리학적 평가뿐만 아니라 연구 관련 혈액 채취 및 평가를 프로토콜에 따라 수행하였다.
시험관내 검정 - 사이토카인 방출. 대상체의 혈청 사이토카인 수준은 대상체에서 TAM의 염증 상태의 변화를 결정하기 위해 측정되었다. IL1A, IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, IL17A, IFNγ, TNFα 및 GM-CSF의 혈청 사이토카인 수준은 제0일에 나노 입자의 관내 전달 전에 및 나노 입자의 관내 투여 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 72시간 후에 미국 메릴랜드주 저먼타운 소재의 퀴아겐(Qiagen)에서 상업적으로 이용 가능한 인간 염증 사이토카인 다중 분석물(Human Inflammatory Cytokines Multi-Analyte) ELISArray 키트 MEH-004A를 사용하여 검정하였다. IL-13 분비의 변화는 밀테니이 바이오텍 앤드 써모 피셔(Miltenyi Biotec and Thermo Fischer) 또는 알&디 시스템즈(R&D Biosystems)의 인간 IL-13 루미넥스 성능 검정(Luminex Performance Assay)과 같은 상업적으로 이용 가능한 IL-13 분비 ELISA 검정을 사용하여 결정되었다. 사이토카인 분비는 검정의 선형 범위에 존재하도록 희석된 샘플에서 측정되었다. 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 시간 의존적 증가 수준은 대상체에서 M1 유사 전염증성 대식세포의 증가를 나타낼 것이다. IL-4, IL-13 및 IL-10 수준의 시간 의존적 감소는 M2 대식세포의 수 및/또는 활성의 감소를 나타낼 것이다.
본 발명의 상기 논의는 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 전술한 내용은 본 발명을 본원에서 개시된 형태(들)로 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 설명이 하나 이상의 실시양태 및 특정 변형 및 수정에 대한 설명을 포함하였지만, 다른 변형 및 수정은 예를 들어 본 개시내용을 이해한 후 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 기술 및 지식 내에 있을 수 있는 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있다. 임의의 특허 가능한 대상을 공개적으로 제공하는 것을 의도하지 않으면서, 대안적인, 상호 교환 가능한 및/또는 등가의 구조, 기능, 범위 또는 단계가 본원에 개시되었는지와는 무관하게 상기 대안적인, 상호 교환 가능한 및/또는 등가의 구조, 기능, 범위 또는 단계를 비롯하여 허용되는 정도로 대안적인 실시양태를 포함하는 권리를 얻는 것이 의도된다.
본원에서 개시되는 엔독시펜 유리 염기 및 이의 염을 포함하는 조성물은 합성 방식으로 제조된 엔독시펜뿐만 아니라, 단리된 엔독시펜으로 제조될 수 있음을 이해하여야 한다. 대상체의 투여는 조성물에 존재하는 (Z)-엔독시펜의 양에 기초한다는 것을 추가로 이해하여야 한다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 그 전체가 참고로 포함된다.
배타적 재산 또는 특권이 청구되는 본 발명의 실시양태는 다음과 같이 정의된다.

Claims (35)

  1. 유방 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, M2 분극화된 대식세포를 재분극화할 수 있는 재분극화제, 또는 대식세포의 M2 분극화를 차단할 수 있는 차단제, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체에게 관내로 전달하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
  2. 유방 장애를 갖는 대상체에서 화학 요법에 대한 민감도 증가를 촉진하는 방법으로서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체에게 관내로 투여하는 단계를 포함하고, 조성물의 투여는 화학 요법에 대한 민감도 증가를 촉진하는 것인, 상기 대상체에서 화학 요법에 대한 민감도 증가를 촉진하는 방법.
  3. 유방 장애를 갖는 대상체에서의 M2 대식세포의 선택적 감소 방법으로서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물을 대상체에게 관내로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서의 M2 대식세포의 선택적 감소 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, M2 대식세포 표현형이 M2a 표현형, M2b 표현형 및 M2c 표현형 중 어느 하나 이상, 또는 이들의 조합인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물의 관내 투여는 다음 중 하나 이상을 초래하는 것인 방법:
    a. M2 대식세포의 감소;
    b. M1 대식세포의 증가;
    c. M1/M2 대식세포 항상성;
    d. 항염증성 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자의 방출 감소;
    e. 전염증성 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자의 방출 증가;
    f. 대식세포의 살종양 활성의 증가;
    g. TME 내로의 세포독성 T-림프구 침윤의 증가; 및
    h. T-세포 활성화의 증가.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물의 관내 투여는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 대식세포 집단 중 어느 하나 이상의 감소를 초래하는 것인 방법:
    a. F4/80+ 대식세포;
    b. Grl- 대식세포;
    c. CD63+ 대식세포
    d. CD206+ 대식세포;
    e. CD200R 세포/대식세포;
    f. MARCO+ 대식세포;
    g. CD68+/CD68+ 대식세포;
    h. CD68+/CD163+ 대식세포;
    i. Tie2R+ 세포/대식세포;
    j. CD11b+/VEGF-R1+ 대식세포;
    k. CCR2+ 골수세포/대식세포;
    l. MerTK+ 대식세포;
    m. CD11blow/MHCIIhigh/CCR2+/F4/80+/CD64+/MerTK+ 대식세포;
    n. CD11b+Grl-/F4/80+ 대식세포;
    o. CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6Clow/F4/80+ 대식세포;
    p. CD11b+/F4/80+/MHCII+/Ly6C- 대식세포;
    q. CD45+/CD11b+/F4/80+/Tie2+/CD31- 대식세포; 및
    r. CD45+/F480+/Tie2-/CD31- 대식세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물의 관내 투여는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 대식세포 집단 중 어느 하나 이상의 증가를 초래하는 것인 방법:
    a. CD11bhigh/MHCIIhigh 대식세포;
    b. HLA-DRα+ 대식세포;
    c. CD64+ 대식세포;
    d. CD86+ 대식세포;
    e. CD80+ 대식세포;
    f. CD68+/CD80+ 대식세포;
    g. CD64+ 대식세포; 및
    h. Ly6Chigh/CX3CR1high/CCR2-/CD62L-/CD43low(Ly6Chigh) 대식세포.
  8. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두의 관내 투여는 다음 중 어느 하나 이상을 대상체에서 감소시키는 것인 방법:
    a. 종양 혈관신생;
    b. 종양 침습;
    c. 전이;
    d. 면역 억제;
    e. 화학 저항성; 및
    f. 항염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 방출.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 재분극화제는 펜레티나이드(4-히드록시(페닐)레틴아미드, 4-HPR); IL-12; IFNγ, miR127, miR155, 및 miR223, 페루목시톨, 다음의 억제제: CSF-1, CSF-1R, IL-10, IL-10R, TGFβ, 아르기나제 1(Arg1), M2 대식세포 스캐빈저 수용체(예를 들어, A, B, MARCO); 히스톤 데아세틸라제(HDACi), DICER, IRF4/STAT4/STAT6 신호전달 경로; IL-4, IL-13, IL-17, PPARγ, KLF4, KLF6; miRNA-146 패밀리 구성원(예를 들어, miRNA-146a), let7 패밀리 구성원(예를 들어, let-7c), miRNA-9, miRNA-21, miRNA-47, miRNA-187; CCR-CC12 축 신호전달, CCL2/MCP-1 합성; 태반 성장 인자(PlGF)(HRG) 및 C/EBRβ(RI3Kγ 결실); AMPKα1(메트포르민), p50-p50 NFκB, NADPH 옥시다제(NOX)(NOX 1 및 NOX 2), Rbpj, 노치 신호전달 경로; CD40 및 CD40L의 활성화제; IRF1, IRF5, STAT1(예를 들어, IFNγ, 바디메잔(DMXAA)) 및 STAT3; 핵 인자 카파 B 활성화제, 톨-유사 수용체(TLR) 아고니스트, 예를 들어 이미퀴모드, 합성 비메틸화 시토신-구아닌(CpG) 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG-ODN), p65-p50 NFκB, MyD88, miR127, miR155 및 miR223, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 HDACi는 TMP195, MC1568, TMP269, (아릴옥소프로페닐)피롤릴 히드록사메이트), 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 튜바스타틴 A 히드로클로라이드(항-HDAC7), 파노비노스타트, 수베로일아닐리드 히드록삼산(SAHA), 클래스 I 및 클래스 II 억제제 보리노스타트(Volinza® Merck), 로미뎁신(Istodax®); 뎁시펩티드, FK-228, 벨리노스타트(PXD-101), 파노비노스타트(LBH589), 다시노스타트(LAQ824), SB939, 치다마이드, pan-HDAC 억제제(예를 들어, 기비노스타트(ITF2357), PCI 2478, R306465(JNJ-16241199), 레스미노스타트(4SC-201)), 발프로산, 부티르산, 페닐부티레이트, AN9/피바넥스, 클래스 I 선택적 HDAC 억제제 벤즈아미드 또는 아미노 아날리드(예를 들어, CI-994, 엔티노스타트(SNDX-275/MS-275), 모세티노스타트(MGCD0103), 아벡시노스타트(PCI-24781), 퀴시노스타트(JNJ-26481585), HBI-8000, 케베트린, CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ME-344, 및 술포라판, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, MARCO 억제제는 항-MARCO 항체(예를 들어, ab103311, 단일 클론 ED31, PLK-1, ABN 1389), 항-MARCO ScFv, Fab, Fab' 및 Fab2, 항-MARCO ScFv mRNA, 항-MARCO miRNA, MARCO 안티센스 RNA, MARCO siRNA, 항-MARCO DNA, 항-MARCO 올리고뉴클레오티드, 항-MARCO 펩티드 억제제, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 차단제는 항-CSF-1 억제제, 항-CSF-1R 억제제, 항-MCP-1 억제제, 항-IL-4 억제제(예를 들어, 파스콜리주맙, 피타킨라 및 듀필루맙), 항-IL-13 억제제(예를 들어, 안루킨주맙, 레브리키주납 및 트랄로키누맙), 항-IL-4/IL-13 이중 억제제, 예를 들어 듀플리맙, STAT3 억제제(예를 들어, 소라페닙, 수니티닙, WP1066 및 레스베라트롤) 및 STAT6 억제제(예를 들어, 펜레티나이드(4-HPR), 레플루노미드, TMX264 및 AS1217499), 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 추가의 치료제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제는 체크포인트 억제제, 항호르몬제, 스테로이드, 안트라사이클린, 갑상선 호르몬 대체 약물, 티미딜레이트 표적화 약물(예를 들어, 도세탁셀, 겜시타빈, 파클리탁셀 또는 카르보플라틴 및 페길화 리포솜 독소루비신), DNA 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈), 트라스투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 아베마시클립, 팔보시클립, 키메라 항원 수용체/T-세포(CAR-T) 요법과 같은 세포 요법, 및 기타 입양 세포 요법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항호르몬제는 타목시펜, 시스-타목시펜, 엔독시펜, 데스메틸타목시펜, 라소폭시펜, 랄록시펜, 벤조티오펜, 바제도폭시펜, 아르족시펜, 미프록시펜, 레보르멜록시펜, 드롤록시펜, 클로미펜, 이독시펜, 토레미펜, EM652 및 ERA-923, 풀베스트란트, ARN-810 또는 CH498, 아나스트로졸, 엑세메스탄 및 레트로졸, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1(예를 들어, 니볼루맙), 항-PD-1L(예를 들어, 아테졸리주맙(MPDL3280), 아벨루맙(MSB0010718C), 두르발루맙, MDX-1105), 항-CTLA4(예를 들어, 이필리무맙), 및 항-LAG-3(예를 들어, IMP321, BMS-986016 및 GSK2831781), 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 체크포인트 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 가돌리늄 킬레이트, 초상자성 산화철 나노 입자(SPION), 19F 퍼플루오로카본 나노 입자, 및 다른 자성 리포터 유전자, 예를 들어 금속 단백질 기반 MRI 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택되는 영상화제, 염료 또는 조영제를 추가로 포함하는 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 리포솜, 나노 입자, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 또는 엑소솜으로서 제제화되는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 또는 엑소솜 내에 포함되는 것인 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두는 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포, 미셀 또는 엑소솜 상에 포함되는 것인 조성물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 나노 입자는 지질 나노 입자인 조성물.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 나노 입자는 세포 표적화제로 추가로 코팅되는 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 세포 표적화제는 M2 대식세포 선택적 세포 표면 분자를 표적으로 하는 것인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, M2 대식세포 특이적 세포 표면 분자는 IL-13Rα, CD163, CD206, CD200R, MerTK, 스캐빈저 수용체 A, 스캐빈저 수용체 B, MARCO 및 F4/80으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 데포 제제로 제제화되는 것인 조성물.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단위 용량당 1 × 104 내지 1 × 108 개의 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로 구체, 나노 캡슐, 나노 입자, 나노 구체, 지질 입자, 소포 또는 엑소솜을 포함하는 조성물을 관내로 투여받는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여되는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유방 장애는 유방암인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암은 유관 상피내암종(DCIS), 소엽 상피내암종(LCIS), 침습성(또는 침윤성) 소엽 암종(ILC), 침습성(또는 침윤성) 유관 암종(IDC), 미세 침습성 유방 암종(MIC), 염증성 유방암, ER-양성(ER+) 유방암, 프로게스테론 수용체 양성(PR+) 유방암, ER+/PR+ 유방암, ER-음성(ER-) 유방암, HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(즉, ER-/PR-/Her2- 유방암; "TNBC"), 아데노이드 낭성(선낭성) 암종, 저등급 선편평세포 암종, 수질 암종, 점액성(또는 콜로이드) 암종, 유두 암종, 관상 암종, 화생성 암종 또는 미세 유두 암종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 요법, 방사선 요법 또는 세포 요법을 대상체에게 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 화학 요법, 방사선 요법 또는 세포 요법, 또는 이들의 조합은 종양 크기 또는 면역 억제, 또는 둘 모두를 감소시키는 것인 방법.
  33. 재분극화제 또는 차단제 또는 둘 모두를 포함하는 조성물, 하나 이상의 용기, 포장 재료, 라벨 또는 포장 삽입물, 및 선택적으로 장치를 포함하는 제조 물품.
  34. 제33항에 있어서, 장치는 바늘 및 주사기, 캐뉼라, 카테터, 마이크로카테터, 삼투 펌프 또는 캡슐화 장치인 제조 물품.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제조 물품.
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