CN112040941A - 诱导免疫应答的原位方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于在患有乳腺癌的受试者中诱导免疫应答的导管内方法和组合物。导管内施用的所述组合物包含能够诱导抗原呈递细胞原位成熟和成熟抗原呈递细胞向淋巴结迁移的一种或多种生物活性剂。所述导管内方法和组合物诱导效应免疫细胞的活化，并增加肿瘤细胞死亡。

Description

诱导免疫应答的原位方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月15日提交的临时申请第62/643618号的权益，该临时申请明确地通过引用整体并入本文。
发明背景
先天免疫细胞，诸如树突细胞(DC)、巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞，通过识别“非自身”肿瘤相关抗原(TAA)参与癌症免疫监督。这些细胞引发针对TAA的获得性免疫细胞(诸如T细胞和B细胞)。这导致直接和间接的抗癌效应子功能、抗TAA抗体的产生、癌细胞的杀伤以及随后的能够排斥具有相应TAA的肿瘤细胞的免疫力。因此，由先天免疫细胞针对TAA引发(priming)获得性免疫细胞是至关重要的里程碑，其完全依赖于先天免疫细胞的抗原呈递和抗原感知能力。抗原呈递细胞(APC)正确地呈递“非自身”TAA以引发及激活获得性免疫细胞的能力是激活强效抗癌免疫力的绝对先决条件。APC包括树突细胞(DC)、巨噬细胞和B淋巴细胞(B细胞)，其中DC是“专业的”APC。
为了帮助环境感知和实现快速先天免疫力相关功能，DC拥有细胞表面受体和细胞内受体的多样性库，诸如各种清除或吞噬受体如CD91、整联蛋白、CD36、表面模式识别受体(PRR)、toll样受体(TLR)和细胞内PRR样NOD样受体(NLR)。基于DC的PRR有助于检测(以及随后DC刺激)危险信号如病原体相关分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)。
DC还配备了抗原处理机制。经典地，细胞内抗原由主要组织相容性复合体(MHC)I类呈递系统呈递，而细胞外抗原(通过吞噬作用或胞饮作用捕获的)优先被处理用于MHC II类呈递。然而，DC能够“交叉呈递”抗原，即在DC中，细胞外抗原也可以进入MHC I类呈递系统，而细胞内抗原片段也可存在于MHC II类分子(由自噬介导的)。
一般来说，DC以两种主要状态存在，即稳态未成熟树突细胞(iDC)和完全成熟DC，这种分类部分基于表型水平和功能水平上发生的变化。当DC上调表面共刺激分子诸如CD54、CD80、CD83、CD86和ICOS L以及MHC II类分子和CD40时，就达到了表型成熟。在功能水平上受刺激的DC分泌细胞因子，其中炎性或免疫刺激性细胞因子(例如，IL-12,IL-6,IL-1β)和免疫抑制性细胞因子(例如，IL-10,TGF-β)之间的平衡由“自身”抗原或异常的“非自身”或“外来”抗原(诸如TAA或病原体)存在的环境背景决定。
在正常健康的条件下，DC以未成熟或稳态(iDC)存在，并通过阻止获得性免疫细胞攻击具有“自身”抗原的宿主细胞来维持免疫耐受性。iDC表现出持续的吞噬(内吞)活性，并持续向T细胞呈现“自身”抗原，所述T细胞被极化以促进耐受性或免疫抑制，而不是被极化至效应子状态。此类iDC通常组成型表达低水平的CD40(Ma等人Semin Immunol.2009Oct；21(5):265–272)。
这种免疫耐受性是通过免疫检查点途径的混合物活跃诱导和维持的，并且完全缺乏由DC提供的共刺激信号，例如，基于DC的配体如OX-40L、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)向T细胞的呈递，导致T细胞无反应或免疫抑制性T细胞或调节性T细胞(Treg)的分化。
另一方面，当DC遇到肿瘤抗原、病原体或具有PAMP(部分通过PRR检测的)的实体时，它们离开吞噬清除功能，降解“非自身”实体来源的蛋白质，以产生加载在MHC I类和II类分子上的合适的抗原肽，上调共刺激分子，并成为成熟DC，推测抗原呈递功能迁移到淋巴结以向T细胞和B细胞呈递抗原的。
因此，活化和成熟的DC同时提供三组T细胞刺激信号(合适的抗原-MHC复合物(信号1，由T细胞通过T细胞受体的复合物/TCRs-CD3检测的)、表型成熟配体，即共刺激分子(信号2，由T细胞受体检测的，如CD28、CD40L)和合适的引发免疫刺激和效应T细胞表型的细胞因子或因子(信号3，通过各自的细胞因子同源受体检测的))，帮助激活相互作用的T细胞中的效应子谱，从而使它们极化，用于抗原特异性消除“非自身”实体。DC也可使用其他功能性免疫刺激因子来引发效应子功能。这种DC的成熟和活化对于原初T细胞的活化和分化以及免疫应答的增强至关重要。
在肿瘤微环境(TME)中，癌细胞主动抑制稳态DC(也称为肿瘤浸润性DC或肿瘤浸润性树突细胞，“TIDC”)，并使其保持在有利于肿瘤的未成熟状态。TIDC状态的特征通常是：(1)完全缺乏或存在可忽略量的加工良好的癌症抗原(受损的信号1产生)，(2)缺乏或少量的表型成熟配体或共刺激分子(信号2的消融)，和/或(3)完全缺乏或少量存在功能刺激/免疫刺激细胞因子，如IL-12p70(消融的信号3)。
在癌细胞采用的免疫逃避策略当中，一种策略是下调或丢失抗原(信号1)。另一个是共刺激分子(信号2)的低表达。较低的癌细胞相关抗原水平或较低的共刺激分子表达导致不稳定的DC-T细胞相互作用和受损的T细胞免疫力。除了抗原和共刺激分子下调外，癌细胞还通过分泌免疫抑制因子如IL-10,VEGF,TGF-β和PGE2直接诱导不成熟的TIDC状态，从而进一步损害稳定的DC-T细胞相互作用(信号4)。
在过去的几年里，基于DC的疫苗已经越来越多地应用于癌症患者的临床治疗。然而，大多数抗癌疗法，包括基于树突细胞的疫苗，倾向于诱导非免疫原性或免疫原性极低的癌细胞死亡，不能获得足够的DC刺激而且使DC保持在不成熟状态。例如，某些化疗药物如顺铂或某些抗肿瘤疫苗制备方法如冻融，实际上可能导致DC的次优激活，从而导致某种“边缘(limbo)”状态，这种状态可被称为“半成熟”DC，其要么缺乏共刺激信号(例如，CD40、CD86)，要么缺乏合适的免疫刺激细胞因子(例如，IL-12p70)。因此，半成熟DC表现出的信号少于成功/最佳T细胞活化所需的全部三种信号，从而表现出与T细胞的不稳定界面，导致抗癌免疫力的主动消融和克隆性T细胞无能。具有表型成熟差异的半成熟DC能够分泌一种或多种少数配合的细胞因子，如IL-10、IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子(信号4)。iDC和半成熟DC一起倾向于促进T细胞无反应或T细胞耗竭，对癌细胞的耐受性，甚至积极的促肿瘤发生活性。
虽然已经有一些人尝试通过全身性递送成熟剂如脂多糖和细胞因子诸如GM-CSF来使DC体内成熟(Smedt等人，Exp.Med.9，第184卷，1413-1424,1996；Bobanga等人Vaccines(Basel).2013Dec；1(4):444–462)，但许多人试图使用各种体外和离体方法产生完全成熟的DC，所述方法包括分离受试者的血液和DC(美国专利第5,851,756号、第5,994,126号和第5,475,483号、美国专利第5,866,115号、美国专利第6,228,640号、U.S.6,251,665号、美国专利第6,121,044号、U.S.8,932,575、U.S.7,972,847和U.S.8691570)。已经使用这些基于树突细胞的疫苗进行了治疗乳腺癌的研究，所述疫苗是通过将癌症抗原体外或离体地装载到自体DC上而制备的(Park等人Cancer Res Treat.2011Mar；43(1):56–66；Maillard等人Cancer Research 64,5934–5937,2004)。这种基于DC的疫苗的体外或离体制剂面临着与大规模生产、有效保存、保质期和分销相关的管理和监管挑战。(Kalinski等人ImmunolRes.2011Aug；50(0):235–247)。另外，交叉呈递抗原的能力在不同的DC亚群、DC发育和成熟阶段之间存在差异，并且受DC活化和成熟条件的影响。虽然DC成熟的早期阶段通常被认为是抗原摄取和其交叉呈递的最佳阶段，但肿瘤细胞交叉呈递的有效性会受到DC成熟中所用因子的选择显著影响。(同上)。
另外，这些抗癌疗法通常通过血管内或皮下途径递送。然而，施用途径会影响治疗的效果。(Bouvier等人Front Immunol.2011；2:71)。本公开提供了用于动员受试者的内源性免疫细胞(诸如DC)用于抗原呈递和诱导免疫应答以对抗乳腺癌的新型原位方法，避免了收集受试者的血液和分离APC的需要，以及与DC的离体培养、抗原呈递细胞和基于树突细胞的疫苗的体外大规模生产、保存、保存期和分配相关的挑战。本公开有利地活化并分化至完全成熟的肿瘤驻留iDC和半成熟DC，允许肿瘤抗原有效地呈递至T细胞、天然杀伤细胞和B细胞，并诱导免疫应答和抗肿瘤免疫力。
概述
提供该概述是为了以简化的形式介绍将在下面的详细描述中进一步描述的概念的选择。该概述不旨在表明所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
本文提供了在受试者中诱导免疫应答的方法，包括向受试者的母乳管导管内施用有效量的包含一种或多种生物活性剂的组合物，其中所述组合物诱导乳腺中抗原呈递细胞的原位成熟。在一些实施方案中，包含在组合物中的所述一种或多种生物活性剂是选自由以下组成的组的1型-极化剂(polarizing agent)：TLR激动剂(例如，TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(Ampligen)(polyI:polyC(12)U；HemispherxBiopharma)和用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly-ICLC,
Figure BDA0002747880170000051
)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(glucanopynosyl lipoid A)(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7-和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特(3M)和瑞喹莫特(Resiquimod)(R848；3M))；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、DAMP诸如高迁移率族盒-1蛋白(HMGB1)、细胞因子(诸如TNFα、IFNγ、I型IFN诸如IFNα或IFNβ、IL-1β、IL-2、IL-12)、趋化因子(诸如IL-1β、CCL2或CCR7配体诸如CCL19、CCL21)和生长因子、mi-RNA诸如miR-155、共刺激分子激动剂(诸如CD-40激动剂(例如抗CD40抗体诸如RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927)、OX-40激动剂(例如抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)、环糊精诸如2-羟基丙基-β-环糊精及其组合。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。
一方面，本公开提供了包含本文公开的一种或多种生物活性剂的组合物诱导抗原呈递细胞向受试者内淋巴结的迁移。在一些实施方案中，免疫应答包括活化效应T细胞、效应NK细胞、效应B细胞或其组合。在某些实施方案中，免疫应答包括抗肿瘤T细胞效应性反应、NK细胞效应性反应或B细胞抗肿瘤效应性反应或其组合。
在一些实施方案中，效应T细胞包括细胞毒性CD8+T细胞、CD4+Th1细胞、记忆T细胞、滤泡辅助T(Tfh)细胞或其组合。在其他实施方案中，免疫应答包括免疫抑制的减少。在至少一个实施方案中，受试者的肿瘤尺寸减小。
一方面，本公开提供了所述组合物还包含有效量的生物活性剂，所述生物活性剂能够诱导内向抗原呈递细胞(inbound antigen presenting cells)募集至受试者的乳管或乳腺组织，所述生物活性剂选自由以下组成的组：细胞因子和趋化因子(诸如IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1q、CCL1(CCR1配体)、CCL2(CCR2配体)、CCL5(CCR5配体)、CCL20(CCR6配体)、CXCL3(CXCR3配体)、CXCL4(CXC4配体)和CXCL1(CXCR1配体))、DAMP诸如HMGB1，以及TLR激动剂(如TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U；Hemispherx Biopharma)和用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly-ICLC,
Figure BDA0002747880170000061
))、TLR4激动剂诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷、TLR7/8激动剂诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特(3M)和瑞喹莫特(R848；3M))、TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)。
在某些实施方案中，能够诱导内向抗原呈递细胞的募集的1型极化剂或生物活性剂或两者是TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
另一方面，本公开提供了所述组合物还包含有效量的复极化剂，其能够将M2极化的巨噬细胞样DC(“M2-DC”)复极化为1型极化的DC(“DC1”)，所述复极化剂选自由以下组成的组：芬维A胺(4-羟基(苯基)视黄酰胺，4-HPR)；IL-12；IFNγ、miR127、miR155和miR223、纳米氧化铁(Ferumoxytol)；以下物质的抑制剂：CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、精氨酸酶1(Arg1)、M2巨噬细胞清除剂受体(诸如A、B、MARCO)、组蛋白脱乙酰基酶(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6信号传导途径；IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、miRNA-146家族成员诸如(miRNA-146a)、let7家族成员(诸如let-7c)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187、CCR-CCl2轴信号传导、CCL2/MCP-1、胎盘生长因子(PlGF)(HRG)和C/EBPβ(PI3Kγ缺失)、AMPKα1(二甲双胍)、p50–p50 NFκB、NADPH氧化酶(NOX)(NOX 1和NOX 2)诸如GKT137831、Rbpj、Notch信号传导途径；CD40和CD40L、IRF1、IRF5、STAT1(诸如IFNγ、伐地美生(DMXAA))和STAT3的激活剂/激动剂、核因子κB激活剂、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9的toll样受体(TLR)激动剂，诸如咪喹莫特、合成的未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)，(poly I:C)、C792，来菲莫特(MGN1703)、SD-101(Dynavax)、SD-101(Dynavax)、IMO-2125(Idera)、p65–p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155和miR223或其组合。
另一方面，本公开提供了所述组合物还包含有效量的能够减少或防止抗原呈递细胞经历DC向巨噬细胞转化的阻断剂，其中所述阻断剂选自由以下组成的组：CSF-1抑制剂、CSF-1R抑制剂、MCP-1抑制剂、IL-4抑制剂(诸如帕考珠单抗、皮特克拉(pitrakinra)和杜匹鲁单抗)、IL-10抑制剂、IL-13抑制剂(诸如安芦珠单抗、来瑞珠单抗和曲洛克木单抗)、IL-4/IL-13双重抑制剂诸如杜匹鲁单抗、类前列腺素抑制剂(诸如PGE3的抑制剂)、STAT3抑制剂(诸如索拉非尼、舒尼替尼、WP1066和白藜芦醇)和STAT6抑制剂(诸如芬维A胺(4-HPR)、来氟米特、TMX264和AS1217499)或其组合。
在又一另外方面，所述方法包括向受试者施用有效量的额外治疗剂，其选自由以下组成的组：抗激素类(例如，抗雌激素或抗雌激素受体，诸如他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬(bazedofoxifene)、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、细胞毒性剂诸如烷化剂(如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类(诸如多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆(patupilone)、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚(Gossypol)、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类，小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔(selinexor)、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156、替莫唑胺、环磷酰胺、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星，米托蒽醌，奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、Tyrphostin AG 490、Janus活化激酶2/信号转导子和转录激活子-3(JAK2/STAT3)抑制剂、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨)、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、玻玛西林、帕博西尼、抗IL-10抑制剂、抗TGF-β抑制剂、检查点抑制剂(如PD-1抑制剂诸如抗PD-1抗体(例如纳武单抗)、PD-1L抑制剂诸如抗PD-1L(例如阿特朱单抗(MPDL3280)、阿维单抗(MSB0010718C)、德瓦鲁单抗、MDX-1105)、CTLA-4抑制剂诸如抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗)、LAG-3抑制剂诸如抗LAG-3抗体(例如IMP321、BMS-986016和GSK2831781)、OX-40激动剂诸如MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383、TIM抑制剂和IDO抑制剂)、CCR4抑制剂、FoxP3抑制剂、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继细胞疗法，或其组合。
所述额外治疗剂可存在于单独的组合物中。在一些实施方案中，所述额外治疗剂包含在含有一种或多种生物活性剂、能够诱导APC募集的生物活性剂、复极化剂或阻断剂或其任意组合的任何组合物中。
在某些实施方案中，向受试者导管内施用有效量的包含TLR9激动剂和OX-40激动剂的组合物。在一些实施方案中，TLR9激动剂是范围为每单位剂量0.01μg/mL至20mg/mL、0.1μg/mL至15mg/mL、1μg/mL至10mg/mL、10μg/mL至5mg/mL、50μg/mL至1mg/mL的CPG-ODN，OX-40激动剂抗体的范围为每单位剂量0.01mg/mL至50mg/mL,0.1mg/mL至40mg/mL,0.5mg/mL至30mg/mL和1mg/mL至25mg/mL。
在某些实施方案中，向受试者导管内施用有效量的包含TLR3激动剂和IFNα的组合物。在一些实施方案中，TLR3激动剂是范围为每单位剂量0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL和1μg/mL至20μg/mL的Poly(I:C)，并且IFNα的范围为每单位剂量1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL和50μg/mL至150μg/mL。
在某些实施方案中，向受试者施用有效量的包含αDC混合物TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b和Poly(I:C)的组合物。在一些实施方案中，TNFα的范围为每单位剂量0.05μg/mL至150μg/mL、0.1μg/mL至100μg/mL和0.5μg/mL至50μg/mL；IL-1β的范围为每单位剂量0.01μg/mL至20μg/mL、0.1μg/mL至15μg/mL、0.5μg/mL至10μg/mL和1μg/mL至10μg/mL；IFNγ的范围为每单位剂量1μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至80μg/mL、25μg/mL至75μg/mL和50μg/mL至75μg/mL；IFNα的范围为每单位剂量1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL和50μg/mL至150μg/mL；以及Poly(I:C)的范围为每单位剂量0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL和1μg/mL至20μg/mL。
另一方面，本公开提供了诱导受试者中抗原呈递细胞迁移的方法，其包括向受试者的母乳管导管内施用有效量的包含一种或多种生物活性剂的组合物，其中包含在所述组合物中的至少一种生物活性剂能够诱导抗原呈递细胞迁移至受试者中的淋巴结。
在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂是选自由以下组成的组的1型极化剂：TLR激动剂(例如，TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U；Hemispherx Biopharma)和用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly-ICLC,
Figure BDA0002747880170000101
)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特(3M)和瑞喹莫特(R848；3M))；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、DAMP诸如HMGB1、细胞因子(诸如TNFα、IFNγ、I型IFN诸如IFNα或IFNβ、IL-1β、IL-2、IL-12p70)、趋化因子(诸如IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCL19、CCL21或任何CCR7配体)和生长因子、mi-RNA诸如miR-155、共刺激分子激动剂(诸如CD-40激动剂(例如抗CD40抗体诸如RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927)、OX-40激动剂(例如抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)、环糊精诸如2-羟基丙基-β-环糊精及其组合。
在某些实施方案中，能够诱导抗原呈递细胞向受试者中的淋巴结迁移的所述至少一种生物活性剂是IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCR7配体诸如CCL19和CCL21、LMP1、LMP1-CD40、LMP1-OX40激动剂、CD40L、MMP9、DAMP诸如HMGB1或其组合。在某些实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。
在一些实施方案中，迁移至淋巴结的抗原呈递细胞会活化细胞毒性CD8+T细胞、CD4+Th1细胞、记忆T细胞、记忆B细胞、Thf细胞、NK细胞或其任意组合。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物在受试者中诱导抗肿瘤免疫应答。抗肿瘤免疫应答包括由活化的细胞毒性CD8+T细胞、CD4+Th1细胞、NK细胞、B细胞或其组合引起的乳腺肿瘤浸润。在一些实施方案中，受试者乳腺肿瘤的尺寸减小。
另一方面，本公开提供了用于诱导或增加受试者乳腺肿瘤细胞中的免疫性细胞死亡的方法，其包括向受试者施用有效量的细胞毒性剂，以及导管内施用有效量的包含一种或多种生物活性剂的组合物。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：替莫唑胺、环磷酰胺(包括低剂量或节律化的环磷酰胺)、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、TyrphostinAG 490(JAK2/STAT3抑制剂)或其组合。
在某些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂是选自由以下组成的组的1型极化剂：TLR激动剂(例如，TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U；Hemispherx Biopharma)和用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly-ICLC,
Figure BDA0002747880170000111
)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特(3M)和瑞喹莫特(R848；3M))；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、细胞因子(诸如TNFα、IFNγ、I型IFN诸如IFNα或IFNβ、IL-1β、IL-2、IL-12)、趋化因子(诸如IL-1β、CCL2、CCL19、CCL21或任何CCR7配体)和生长因子、mi-RNA诸如miR-155、共刺激分子激动剂(诸如CD-40激动剂(例如抗CD40抗体诸如RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927)、OX-40激动剂(例如抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)、环糊精诸如2-羟基丙基-β-环糊精及其组合。
在某些情况下，可能需要向乳管和乳腺组织新募集原初APC(“内向APC”)，以有效地呈递肿瘤抗原。在某些实施方案中，所述方法还包括导管内施用有效量的能够诱导内向抗原呈递细胞募集至受试者的乳管或乳腺组织的生物活性剂，所述生物活性剂选自细胞因子和趋化因子诸如IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1Q、CCL1(CCR1配体)、CCL2(CCR2配体)、CCL5(CCR5配体)、CCL20(CCR6配体)、CXCL3(CXCR3配体)、CXCL4(CXCR4配体)和CXCL1(CXCR1配体)、DAMP诸如HMGB1，以及TLR激动剂(如TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U；Hemispherx Biopharma)和用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly-ICLC,
Figure BDA0002747880170000121
)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)、TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特(3M)和瑞喹莫特(R848；3M))、TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676、(poly I:C)、C792、来菲莫特(MGN1703)、SD-101(Dynavax)、IMO-2125(Idera)等)或其组合。
在某些实施方案中，所述细胞毒性剂包含奥沙利铂，并且包含一种或多种生物活性剂的组合物包含：(i)TLR3激动剂poly(I:C)和IFNα；(ii)TLR9激动剂(CpG-ODN)和OX-40激动剂抗体；或(iii)TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b和Poly(I:C)。在一些实施方案中，通过静脉内或导管内向受试者施用所述细胞毒性剂。本公开提供了在导管内施用所述细胞毒性剂和包含一种或多种生物活性剂的组合物时，受试者的肿瘤尺寸减小。
一方面，本公开提供了将所述组合物以单剂或多剂导管内施用。可以每天一次、每天数次(两次、三次、四次等)、隔天、每2天、3天、5天、7天、14天、15天、每3周、28天、每月、每季度、每6个月和每年一次施用所述组合物。
在一些实施方案中，所述组合物还包含成像剂、染料或造影剂，所述造影剂选自由以下组成的组：钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因，诸如基于金属蛋白的MRI探针。
在一些实施方案中，本文公开的导管内施用的组合物包含药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，所述组合物被配制成脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质颗粒、囊泡或胶束。在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂包含在(包封在)脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡或胶束中。在其他实施方案中，所述一种或多种生物活性剂包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡或胶束中。在至少一个实施方案中，所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒还涂覆有细胞靶向剂。在一些实施方案中，所述细胞靶向剂选自由以下组成的组：DEC-205、Clec9A(DNGR-1)、DC-SIGN、C1q、BDCA1、BDCA2、BDCA3和BDCA4。
一方面，本公开提供了包含本文公开的组合物、一个或多个容器、包装材料、标签或包装插页以及任选地装置的制品。在一些实施方案中，所述装置是针和注射器、套管、导管、微导管、渗透泵或封装装置。
在一些实施方案中，所述制品还包含选自由以下组成的组的额外治疗剂：检查点抑制剂、抗激素类(例如，抗雌激素或抗雌激素受体，诸如他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、细胞毒性剂诸如烷化剂(如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类(诸如多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类，小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156、替莫唑胺、环磷酰胺、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星，米托蒽醌，奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、Tyrphostin AG 490(JAK2/STAT3抑制剂)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨)、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、玻玛西林(abemaciclib)、帕博西尼、抗IL-10抑制剂、抗TGF-β抑制剂、检查点抑制剂(诸如抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4抑制剂、抗FoxP3抑制剂、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继细胞疗法或其组合。
发明详述
本公开提供了用于在患有乳腺癌的受试者中诱导免疫应答的新方法，该方法通过将向有此需要的受试者的乳腺/乳管导管内施用包含一种或多种生物活性剂的组合物来实施。所述生物活性剂在原位动员受试者的内源性免疫细胞来对抗乳腺癌。与当前的方法相反，其中在受试者中动员免疫细胞需要施用体外或离体成熟的抗原呈递细胞或离体制备的表达嵌合抗原和共刺激抗原的CAR-T细胞的基于DC的疫苗，本公开提供了受试者乳腺中的未成熟和/或半成熟DC同时原位局部暴露于一种或多种导管内递送的生物活性剂和受试者特异性肿瘤抗原，这导致成熟APC诸如DC随后产生IL-12p70、呈递抗原和诱导Th1主导反应的能力的强烈增强(Vieira等人，J Immunol,164:4507-12,2000,Maillard等人，CancerResearch,64,5934–5937,2004)，更具体地说，受试者的癌症特异性CTL反应。
如本文中所用，术语“导管内”和“导管内地”是指一种治疗方法，其中本文公开的组合物通过乳突上的乳头中的导管孔递送到受试者的至少一个母乳管(breast milkduct)，以到达乳房的内部深度。本领域技术人员将会理解，本文公开的导管内方法包括通过受试者乳腺中母乳导管的天然孔递送本文公开的组合物。本公开的有利方面在于，导管内递送通常以非侵入性或微创方式实现，不涉及故意破坏受试者的皮肤或组织或细胞层，并且组合物通过位于受试者中靠近受影响乳腺组织的乳房乳头中受试者自身的天然乳管开口(导管孔)递送。
一方面，导管内施用是指将本公开的组合物施加到乳突乳头，由此组合物通过乳头中的导管孔递送至至少一个母乳管。乳腺乳头和导管孔特别适于将本文公开的组合物，诸如包含一种或多种生物活性剂、复极化剂、极化阻断剂、细胞毒性剂或治疗剂或其组合的组合物接收到导管中。在另一个方面，导管内施用是指将组合物通过乳突乳头中的导管孔直接导管内递送到母乳管的内腔中。
乳腺病症，诸如乳腺癌，通常源于个体的乳管中(WellingsSR.Pathol.Res.Prac.1980；166:515-535；Love和Barsky.Cancer.2004，第101卷(9):1947-1957)。因此，非常希望将利用本文公开的组合物(作为非限制性实例，包含一种或多种生物活性剂的组合物)的治疗局部递送至母乳管(乳腺管)内的受影响部位。此类组合物的导管内施用提供了局部的、有效的、易于施用的疗法，该疗法通过减少对本文公开的组合物的全身暴露来消除全身治疗的副作用。这将具有额外的好处，即降低瞄靶脱肿瘤效应(on-target-off-tumor effect)的可能性/风险。通过导管内施用向乳腺导管的局部递送将减少组合物的转运时间，并使APC诸如DC、M1巨噬细胞和B细胞等更快地暴露于所述组合物和邻近的肿瘤细胞，从而提高细胞毒性活性和功效，同时由于转运时间较短，还降低药物失活和/或降解的可能性。
本文所公开的导管内方法的一个特别有利方面是，当暴露于受试者特异性肿瘤抗原时，所述APC原位活化和成熟，并且导管内递送一种或多种生物活性剂伴随着成熟的载有抗原的APC向引流淋巴结(以及如果存在的话，向异位和三级淋巴结)迁移，以向效应免疫细胞诸如T细胞、NK细胞和B细胞呈递抗原。本文公开的组合物的导管内施用在受试者中诱导增加的抗原呈递和免疫应答。在各个方面，本公开提供了将本文公开的组合物导管内施用至有此需要的受试者的母乳管导致出现以下情况中的任一种或多种：肿瘤特异性效应免疫细胞诸如T细胞(例如，细胞毒性CD8+T细胞和辅助T细胞(CD4+Th1细胞))、NK细胞、B细胞的活化以及向受试者的乳管或乳腺组织迁移或动员，T细胞诸如CD4+T辅助细胞、细胞毒性CD8+T细胞、Tfh细胞和NK细胞的效应细胞功能增强(诸如肿瘤细胞死亡增加)、记忆T细胞和B细胞形成增加、Treg减少、免疫抑制减少和血管抑制(angiostatic)反应。
适于在患有乳腺癌的受试者中诱导免疫应答的生物活性剂包括但不限于形成活化T细胞的免疫刺激性APC(“DC1”)的I型极化剂，诸如TLR激动剂(例如，TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U；HemispherxBiopharma)和用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly-ICLC,
Figure BDA0002747880170000161
)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(glucanopynosyl lipoid A)(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特(3M)和瑞喹莫特(R848；3M))；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、DAMP诸如HMGB1、细胞因子(诸如TNFα、IFNγ、I型IFN诸如IFNα或IFNβ、IL-1β、IL-2、IL-12)、趋化因子和生长因子、mi-RNA、共刺激分子激动剂(诸如CD28激动剂、CD-40激动剂(例如抗CD40抗体诸如RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927)、OX-40激动剂(例如抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)、2-羟基丙基-β-环糊精等。
在某些实施方案中，所述组合物包含I型IFN诸如IFNα或IFNβ和TLR3激动剂。在至少一个实施方案中，所述组合物包含IFNα-2b和TLR3激动剂，诸如聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)。在另一个实施方案中，所述组合物包含TNFα、IL-1β和IFNγ作为生物活性剂。
在某些实施方案中，包含一种或多种1型极化剂的组合物还包含IFNα和/或Poly(I:C)。
在某些实施方案中，所述组合物包含1型极化剂的混合物(“αDC混合物”或“α-1型极化剂”)，其包含IL-1、TNF-α、IFN-α、IFN-γ和Poly(I:C)。在至少一个实施方案中，所述αDC混合物包含TNFα/Il-1β/IFNγ/IFNα-2b/Poly I:C。α-I型极化剂或αDC混合物诱导DC完全成熟，以形成1型极化DC(“DC1”)，其：活化效应细胞诸如细胞毒性T淋巴细胞(CD8+T细胞；“CTL”)和CD4+Th1辅助T细胞(“CD4+Th1细胞”)，对次级淋巴器官趋化因子有反应，并产生高白细胞介素-12p70(IL-12p70)产生能力。αDC混合物诱导DC成熟以形成对CD40配体(CD40L)信号传导非常敏感的DC1，其基础是成熟DC1提高了IL-12p70的产量。CD4+T辅助-1细胞(CD4+Th1细胞)和CD8+T细胞表达CD40L，这种与DC1上CD40的相互作用对于在体内扩增和维持Th1偏向的免疫力似乎很重要。
在一些实施方案中，所述组合物包含TLR9配体诸如CpG-ODN和CD134(OX-40)激动剂诸如激动性的抗OX-40抗体(例如MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)或OX-40L的诱导剂作为生物活性剂。OX-40是共刺激分子，提供持久免疫应答和产生免疫T细胞记忆所需的共刺激信号。OX40信号最终导致T细胞活化增强、T细胞存活延长、记忆反应产生、T细胞耐受性的阻止以及调节性T细胞免疫抑制活性降低(Croft等人Immunol Rev.2009May；229(1):173–191；Sagiv-Barfi等人Science TranslationalMedicine31 Jan 2018：第10卷，第426期，eaan4488)。
在至少一个实施方案中，所述组合物包含TLR9配体CpG-ODN、IL-12(诸如IL-12p70)和OX-40的激动剂。
CpG-ODN可分为A类、B类和/或C类(Krieg等人J Clin Invest.2007May 1；117(5):1184–1194)。A类(D型)CpG ODN(CpG-A ODN)可包含中心回文非甲基化磷酸二酯(PO)CpG序列和经PS修饰的3’聚G尾，其中EC50为1.5μM。A类CpG-ODN刺激诸如pDC等APC，诱导IFN-α产生。示例性的A类CpG-ODN包括ODN 2216(5’-ggGGGACGA:TCGTCgggggg-3’(20聚体))。B类CpG-ODN可包含具有一个或多个CpG二核苷酸的完整的未甲基化的核酸酶抗性硫代磷酸酯(PS)骨架(其中EC50为0.4μM)，诸如ODN 7909(CpG2006；5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’(24聚体))。B类CpG-ODN强烈活化B细胞，但微弱刺激pDC中的IFN-α分泌。C类CpG-ODN可包含完整的未甲基化的核酸酶抗性硫代磷酸酯(PS)骨架和回文基序(CpG-ODN)，其能够以0.8μM的EC50动员APC诸如pDC以及B细胞。此类TLR9 CpG-ODN能够诱导pDC的IFNα产生和B细胞刺激以及IFNα介导的T细胞活化。示例性C类CpG-ODN包括但不限于M362(5’-tcgtcgtcgttc:gaacgacgttgat-3’(25聚体))或CpG 2395(5’-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3’(22聚体))。
在一些实施方案中，TLR激动剂可以是来自dSLIM家族的寡核苷酸，例如，MGN 1703(Witting等人Critical Reviews in Oncology/Hematology.第94卷，第1期，2015年4月，第31-44页)。
在其他实施方案中，导管内递送的组合物包含一种或多种生物活性剂诸如IFN-α和单磷酰基脂质A(MPL)。
本文公开的生物活性剂原位诱导受试者的未成熟和半成熟的APC至完全成熟。因此，在一个方面，本公开有利地提供了本文公开的方法和组合物原位诱导受试者自身的未成熟和/或半成熟的APC至完全成熟，以在与导管内施用的组合物接触时形成负载有免疫刺激性抗原的抗原呈递细胞(DC1)，所述组合物包含本文公开的一种或多种生物活性剂和受试者乳腺肿瘤中的肿瘤抗原。
在一些实施方案中，被动员的免疫细胞是APC。
在一些实施方案中，所述APC是乳腺组织驻留APC或乳腺肿瘤相关APC，或两者。为了本公开的目的，APC可以是本领域已知的任何抗APC，诸如DC、巨噬细胞诸如M1极化巨噬细胞和B细胞。在一些实施方案中，APC是DC或其祖细胞。APC可以是任何未成熟或稳定状态DC(iDC)。DC可以是骨髓来源、脾来源或单核细胞来源的DC细胞。在一些实施方案中，APC是乳腺组织驻留DC或肿瘤相关DC诸如TIDC。DC亚群在本领域中是已知的，并且可通过各种标志物和方法来识别(Collins等人Immunology.2013Sep；140(1):22–30；Worah等人，2016,CellReports 16,2953–2966)。DC包括但不限于髓样或常规DC(mDC；诸如BDCA-3+(CD141+)DC、BDCA1+(CD1c+)DC)、浆细胞样DC(pDC；诸如BDCA-2+DC)、CD14+DC、朗格汉斯细胞(LC)等。肿瘤相关DC的实例包括、但不限于，TIDC诸如肿瘤相关mDC、肿瘤相关单核细胞来源的DC、肿瘤相关pDC、肿瘤相关iDC或肿瘤相关半成熟DC。本领域技术人员将理解，DC命名法已经并将继续发展，并且本公开包括所有已鉴定的DC。
研究表明，肿瘤中的APC有功能缺陷，并导致抗肿瘤免疫应答差(Palucka等CancerJ.2013；19(6))。肿瘤滥用骨髓可塑性，将DC从T细胞刺激性DC亚群(DC1)重新定向分化成免疫抑制性DC亚群(调节性DC)，所述免疫抑制性DC可干扰抗肿瘤免疫力(Gabrilovich等人Nat Rev Immunol(2012)12:253–68；Janco等人J Immunol.2015Apr 1；194(7):2985–2991)。研究还表明，肿瘤细胞也可以通过分泌免疫抑制因子如iNOS、IL-6、IL-10、VEGF、TGF-β和前列腺素-E2(PGE2)直接诱导未成熟的TIDC状态，从而进一步损害稳定的DC-T细胞相互作用。例如，肿瘤来源的抑制因子诸如精氨酸酶、PGE2和IL-10已在人原发性肿瘤培养物中被鉴定为负责抑制皮肤DC和单核细胞来源的DC发育和活化的因子(Sombroek等人JImmunol(2002)168:4333–43)。
另外，IL-10具有免疫抑制作用，因为其能够诱导“DC向巨噬细胞”的转化(即，将完全发育的DC转化为具有功能性M2特征的未成熟巨噬细胞样细胞，其具有未成熟CD14+BDCA3+DC-SIGN+CD16+表型和巨噬细胞样形态，这是一种免疫抑制性IL-10(高)对比免疫刺激性IL-12p70(低)的释放的失衡)、T细胞抑制分子B7-H1/PDL-1的高表达水平以及同种异体Th细胞和CD8+(细胞毒性)T细胞的较低引发效率、以低亲合力结合表位/MHC复合物(De Gruijl等人J Immunol(2006)176:7232–42Fortsch D等人J Immunol 2000,165:978–987；Gerlini G等人Am J Pathol(2004)165:1853–63；van de Ven等人Front.Immunol.，2013年11月25日)。因此，这些未成熟和半成熟的TI DC采取M2巨噬细胞样极化状态(“M2巨噬细胞样DC”或“M2-DC”)，具有非常类似于肿瘤相关M2极化巨噬细胞的免疫抑制功能，导致T细胞活化低(例如，细胞毒性CD8+T细胞效应功能降低)和肿瘤细胞死亡减少。
TIDC诸如M2-DC往往表现出抗原呈递能力的功能障碍、吞噬和内吞活性的抑制、异常的运动能力和各种其他不成熟的特征。另外，肿瘤细胞以免疫抑制的调节性DC(例如CCR6DC和小鼠CD11b+CD11c+MHC-II+CD24+CD64lowF4/80low DC的人等同物)被募集到肿瘤中的方式改变TME(Kenkel等人Cancer Res.017年8月1日；77(15):4158-4170)。
不希望受任何理论或机制所束缚，一方面，本公开提供了用于将肿瘤相关的M2-DC和调节性DC转化为免疫刺激性DC(DC1)的导管内方法和组合物。
在一些实施方案中，包含本文公开的一种或多种生物活性剂的组合物包含复极化剂。合适的复极化剂可以包括、但不限于：芬维A胺(4-羟基(苯基)视黄酰胺，4-HPR)；IL-12；IFNγ、miR127、miR155和miR223、纳米氧化铁；以下物质的抑制剂：CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、精氨酸酶1(Arg1)、M2巨噬细胞清除剂受体(诸如A、B、MARCO)；组蛋白脱乙酰基酶(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6信号传导途径；IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、miRNA-146家族成员诸如(miRNA-146a)、let7家族成员(诸如let-7c)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187、CCR-CCl2轴信号传导；CCL2/MCP-1合成；胎盘生长因子(PlGF)(HRG)和C/EBPβ(PI3Kγ缺失)；AMPKα1(二甲双胍)、p50–p50 NFκB、NADPH氧化酶(NOX)(NOX 1和NOX 2)、Rbpj、Notch信号传导途径；CD40和CD40L的激活剂；IRF1、IRF5、STAT1(诸如IFNγ、伐地美生(DMXAA))和STAT3；核因子κB激活剂、TLR3、TLR4和TLR9的toll样受体(TLR)激动剂，诸如咪喹莫特、合成的未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)、(poly I:C)、C792，来菲莫特(MGN1703)、SD-101(Dynavax)、SD-101(Dynavax)、IMO-2125(Idera)；p65–p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155和miR223或其组合。本领域技术人员将理解，所述一种或多种生物活性剂也可以用作复极化剂。
一方面，本公开提供了本文公开的导管内方法和组合物，其减少或防止DC向巨噬细胞的转化(“M2转化”)。在一些实施方案中，包含本文公开的一种或多种生物活性剂的所述组合物包含阻断剂。用于阻止或减少DC向巨噬细胞的M2转化的合适阻断剂包括，但不限于，CSF-1抑制剂、CSF-1R抑制剂、MCP-1抑制剂、IL-4抑制剂(诸如帕考珠单抗、皮特克拉和杜匹鲁单抗)、IL-10抑制剂、IL-13抑制剂(诸如安芦珠单抗、来瑞珠单抗和曲洛克木单抗)、IL-4/IL-13双重抑制剂诸如杜匹鲁单抗、类前列腺素抑制剂(诸如PGE3的抑制剂)、STAT3抑制剂(诸如索拉非尼、舒尼替尼、WP1066和白藜芦醇)和STAT6抑制剂(诸如芬维A胺(4-HPR)、来氟米特、TMX264和AS1217499)或其组合。
M2-DC至DC1的复极化或者M2转化的减少或阻止可通过将本文公开的一种或多种生物活性剂以导管内方式与复极化剂或阻断剂或两者一起共递送到有此需要的受试者的母乳管中来实现。所述一种或多种生物活性剂和复极化剂和/或阻断剂可包含在单一组合物或分开的组合物中。可以以任何顺序将此类分开的组合物共同输送到受试者的乳管中。例如，包含复极化剂或阻断剂或两者的组合物可在导管内递送包含本文公开的一种或多种生物活性剂的组合物后1分钟至30分钟内、30分钟至6小时内、6小时至12小时内以及24小时内30米至6小时内、6小时至12小时内和24小时内被递送。作为另一个实例，可将每种分开的组合物组合以递送给受试者。
本领域技术人员将认识到，本文公开的导管内方法和组合物可以增加免疫刺激性DC相对于免疫抑制调节性DC或M2-DC的比率。
在某些情况下，可能需要向乳管和乳腺组织新募集原初抗APC(“内向APC”)，以有效地呈递肿瘤抗原。此类内向APC可以是外周APC，诸如循环APC、骨髓来源的APC、脾来源的APC等。因此，本公开提供了：在一些实施方案中，在导管内施用包含能够募集或诱导APC迁移至受试者乳管的一种或多种生物活性剂的组合物时，APC是新近募集或新募集至受试者的乳管或乳腺组织的内向APC。此类新募集的APC被暴露于受试者特异性肿瘤抗原，并在乳管和/或乳腺组织中被诱导原位分化为完全成熟的载有抗原的APC，以用于有效的抗原呈递和增强免疫应答。此类导管内方法允许最佳的抗原摄取和肿瘤抗原在接近受影响部位的原位交叉呈递。另外，本文公开的原位方法消除了对收集受试者血液和分离APC、选择非受试者特异性肿瘤抗原的需要以及与APC的大量生产、保存、保存期限和分配相关的挑战。
在一些实施方案中，APC为内向APC。内向DC亚群的实例包括循环原初mDC(诸如BDCA-1+(CD1c+)、BDCA-3+(CD141+)和BDCA-4+DC)、PDC(诸如BDCA-2+DC)及其祖细胞。此类内向抗APC原位暴露于受试者特异性肿瘤抗原，并通过吞噬作用、胞饮作用等摄入肿瘤抗原。可如上所述阻止新募集的内向APC经历M2转化或成为调节性DC。
适用于新募集内向APC的生物活性剂的非限制性实例包括IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或其任意组合。在至少一个实施方案中，所述组合物包含MIP3α、MIP1α和RANTES。在另一个实施方案中，所述组合物包含HMGB1、TLR激动剂，如TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U；HemispherxBiopharma)和用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly-ICLC,
Figure BDA0002747880170000231
)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(glucanopynosyl lipoid A)(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7/TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特(3M)和瑞喹莫特(R848；3M))；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、用于诱导循环iDC和外周组织iDC向母乳管和乳腺组织的趋化性的生物活性剂。HMGB1为DAMP，这是一种由濒死或坏死细胞释放或由活化的巨噬细胞分泌的“危险信号”，其可作为人单核细胞来源的iDC的化学引诱剂。用于募集iDC的生物活性剂还包括C1q、CCL1(CCR1配体)、CCL2(CCR2配体)、CCL5(CCR5配体)、CCL20(CCR6配体)、CXCL3(CXCR3配体)、CXCL4(CXCR4配体)和CXCL1(CXCR1配体)。CXCL3能够与pDC上的CXCR3结合，但不与不表达CXCR3的MoDC或血液DC结合(Villablanca等人，Histol Histopathol(2008)23:897-910)。
本领域技术人员将理解，募集内向APC的生物活性剂也能够诱APC完全成熟。在一些实施方案中，当到达受试者的乳管时，内向APC可进一步暴露于本文公开的特异性诱导APC完全成熟的组合物。
诱导至完全成熟的APC同时提供三组T细胞刺激信号(合适的抗原-MHC复合物(信号1，由T细胞通过T细胞受体/TCR-CD3的复合物检测的)、表型成熟配体即共刺激分子(信号2，通过T细胞受体检测的，如CD28、CD40L、OX-40(CD134、TNFRSF4))以及合适的细胞因子或因子诸如引发免疫刺激和效应T细胞表型的IL-12p70、IL-18、IL-23(信号3，通过相应的细胞因子同源受体如IL-12受体检测的)，帮助活化与T细胞相互作用的效应子谱，从而使它们极化，以用于肿瘤细胞的受试者肿瘤抗原特异性消除。在通过B细胞核NK细胞激发效应子功能中，DC还可以使用其它功能性免疫刺激因子。
在一些实施方案中，成熟DC是CCR7+DC、CD80+DC、CD86+DC、CD40+DC、OX-40+DC或其任意组合。在其他实施方案中，成熟DC表现出表型标志物CD11c+HLA-DR+、CD11c+MHCII高或CD11b+CD11c+CD86高MHC-II高。
用本文公开的组合物导管内施用的获自受试者的DC1可释放极少或不释放免疫抑制性细胞因子诸如IL-10、TGF-β、IL-4和IL-13。当例如在体外通过ELISA测试时，DC1可释放炎性细胞因子诸如IL-18和/或IL-23和/或IL-27。在一些实施方案中，活化的成熟DC释放IL-12p70。在其他实施方案中，所述活化的成熟DC释放IFNα。
可通过测定从受试者获得的样品中(i)一种或多种成熟标志物诸如CD40、CD80、CD83、CD86、OX-40和CCR7或其组合的增加，和(ii)细胞因子(信号3)释放的增加，诸如IL-6、IL-12p70、IL-18、IL-23、IL-27、TNFα或其组合的水平的升高，来测量至免疫刺激性APC诸如DC1的成熟和/或复极化。受试者的样品可以是任何样品，例如，所述样品可以是血液、血清、血浆、组织、乳头抽吸液、导管灌洗液、淋巴液等。可以使用本领域已知的任何方法，例如通过ELISA、ELISPOT等测定组织样品中APC释放的细胞因子IL-6、IL-8、IL-12p-70和TNFα的水平。在至少一个实施方案中，测量的细胞因子是IL-12p70。
肿瘤微环境可对内源性APC诸如DC等向淋巴结的迁移产生负面影响(N.Seyfizadeh等人，Critical Reviews in Oncology/Hematology 107(2016)100–110)。一方面，本公开有利地提供了本文公开的导管内方法和组合物诱导成熟的载有抗原的免疫刺激性APC诸如DC1，从乳腺组织或乳腺癌迁移至引流淋巴结(以及如果存在，迁移至异位淋巴结和三级淋巴结)，用于抗原呈递以及T细胞、NK细胞和B细胞的引发。因此，在一些实施方案中，在导管内施用本文公开的组合物时，DC向次级淋巴器官(诸如引流淋巴结)、异位和/或三级淋巴结的迁移增加。在一些实施方案中，从乳腺组织迁移到引流淋巴结的APC是CCR7+APC、CD80+APC、CD86+APC、CD40+APLC、OX-40L+APC或其任意组合中的任一种。APC的迁移可按照淋巴结趋化因子梯度进行。适于诱导活化的APC向淋巴结迁移的趋化因子可以是IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCR7配体诸如CCL19、CCL21、CD40L、肽聚糖、MMP9、DAMP诸如HMGB1或其组合。
在一些实施方案中，诱导活化的APC向淋巴结迁移的组合物包含IL-1β、IL-6、MIP-3β的混合物作为生物活性剂。
在其他实施方案中，诱导活化的APC向淋巴结迁移的组合物包含TLR激动剂诸如CpG-ODN和iquimod，趋化因子诸如CCL2、CCL19、CCL21或其他CCR7配体。在又一些其他实施方案中，诱导活化的APC向淋巴结迁移的组合物包含CpG-ODN和肽聚糖作为生物活性剂。在又一些其他实施方案中，诱导活化的APC向淋巴结迁移的组合物包含CpG-ODN和基质金属蛋白酶诸如MMP9作为生物活性剂。在一些实施方案中，所述CpG-ODN可以与其他分子诸如爱泼斯坦-巴尔病毒LMP1蛋白或肽、CD40蛋白或肽、OX-40肽等融合。
在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物通过用RNA疫苗原位转染APC、从而导致包含天然爱泼斯坦-巴尔病毒LMP1蛋白或肽序列的蛋白质表达来诱导APC(乳腺组织和肿瘤驻留APC以及通过本文公开的方法诱导至完全成熟的新募集的内向APC)的迁移。此类LMP1蛋白可以是融合蛋白，诸如LMP1与结合抗肿瘤效应T细胞的共刺激分子的融合蛋白(例如，LMP1-CD40融合蛋白、LMP1-OX-40L融合蛋白)。在一些实施方案中，RNA疫苗包括报告RNA，诸如编码荧光蛋白诸如绿色或黄色荧光蛋白的报告RNA。
可使用正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)结合计算机断层扫描(CT)、使用荧光(例如，绿色荧光和黄色荧光蛋白质)、生物发光、磁共振成像(MRI)、细胞MRI等的光学成像技术来在体内监测APC的迁移。
一方面，本公开提供了本文公开的导管内方法和组合物诱导增加的通过APC进行的向效应免疫细胞诸如T细胞、B细胞和NK细胞的抗原呈递。在一些实施方案中，抗原呈递可通过新募集原初APC和使乳腺组织驻留APC和肿瘤组织驻留APC复极化来增加。
在其他实施方案中，可通过用诱导肿瘤细胞死亡的细胞毒性剂预处理受试者来增强通过内向APC、乳腺组织驻留APC和肿瘤相关APC的抗原呈递。肿瘤细胞死亡的增加可以是由任何细胞死亡方式引起的，例如细胞凋亡(半胱天冬酶依赖性的)、程序性坏死(necroptosis)(由TNF受体在半胱天冬酶的化学抑制后引发，即不依赖于半胱天冬酶的)、程序性坏死和免疫学细胞死亡(“ICD”)。Belizario等人在Mediators Inflamm.2015；2015:128076；Vanden Berge等人Mol Cell Oncol.2015年10月-12月；2(4):e975093)中描述了细胞凋亡、坏死和坏死细胞死亡方式。
化学治疗药物通常通过诱导细胞凋亡来杀死肿瘤细胞，所述细胞凋亡可伴随着自噬，或者在后期伴随着细胞坏死。在ICD，免疫原性是由濒死细胞的暴露或几种能够激活免疫系统的不同组分(诸如巨噬细胞、NK细胞和DC)的分子的释放来决定的(Cirone M等人Oncoimmunology.2012年10月1日；1(7):1218-1219；Bezu等人Front Immunol.2015；6:187)。
增加的细胞死亡产生更高数量的肿瘤相关抗原和分子，所述抗原和分子有助于APC的抗原呈递。濒死的肿瘤细胞可以发出一系列危险信号，即DAMP，所述信号决定了特定髓系免疫效应子的募集和激活，从而触发了第一线的先天反应(Krysko等人Nat RevCancer.2012年12月；12(12):860-75)。此类DAMP包括代谢变化(ATP向细胞外空间的排出)、细胞表面的变化(诸如钙网蛋白在质膜上的暴露)和细胞周围微环境的变化(诸如染色质结合蛋白HMGB1的细胞核和细胞外流，最终引发抗癌免疫应答(Bezu等人，FrontImmunol.2015；6:187)。这些DAMP将抗原呈递细胞(APC)募集到活性ICD部位，并刺激死亡细胞相关抗原的摄取、加工和呈递，最终导致获得性免疫应答的引发。这种免疫应答涉及复杂层次的免疫效子，包括DC诸如产生白细胞介素-1β的单核细胞来源的树突状细胞(DC)、产生白细胞介素-17的γ/δT细胞和产生干扰素-γ(IFN-γ)的常规CD8+α/βT细胞等。Ma Y等人；J.Exp.Med.2011。从濒死细胞释放的内源性受体信号可结合Toll样受体(TLR)，以诱导这种先天免疫应答。例如，存在于DC表面上的TLR3、TLR4和TLR9识别其内源性配体HMGB1(Tian等人Nature Immunology第8卷，第487–496页(2007))，所述内源性配体从濒死肿瘤细胞中释放，这引发了MyD88(髓样分化初级应答基因)依赖性信号传导途径，该途径对ICD的感知至关重要。HMGB1引起的TLR4/MyD88途径抑制吞噬体与溶酶体之间的融合，从而促进肿瘤抗原加工和抗原呈递，这是诱导针对癌细胞的细胞免疫应答的再刺激或动员所必需的。
细胞毒性剂可通过任何递送途径递送，包括口服、肠胃外、静脉内、腹膜内、皮下、肌内等。在一些实施方案中，细胞毒性剂可静脉内或导管内施用。导管内施用细胞毒性剂，然后导管内施用本文公开的组合物。在其他实施方案中，受试者可在用包含一种或多种生物活性剂的组合物治疗期间或之后服用本文公开的细胞毒性剂。可在一个或多个周期中施用本文公开的细胞毒性剂和组合物。暴露于本文公开的此类组合物有利地使肿瘤细胞对随后递送的细胞毒性剂敏感。利用细胞毒性剂和本文公开的组合物的治疗增加了APC的抗原呈递和免疫应答。由于细胞毒性剂的全身暴露较低，导管内施用的细胞毒性剂减少了任何旁观者效应。
可将细胞毒性剂单独地或与一种或多种其他生物活性剂组合递送，所述其他生物活性剂可诱导IFN产生、HMGB1释放和激活DC上的TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9途径中的一种或多种。可使用的TLR9激动剂的实例包括但不限于抗TLR-9激动剂抗体和抗体片段，诸如ScFv、合成DNA和含有CpG基序(CpG ODN)的寡核苷酸诸如TTAGGG聚体、来菲托木(MGN1703)、SD-101(Dynavax)和IMO-2125(Idera)等。
适于增加肿瘤细胞死亡的细胞毒性剂可包括但不限于烷化剂(诸如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类药物(诸如多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类、小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156，或其组合。
可用于诱导免疫细胞死亡的细胞毒性剂包括但不限于替莫唑胺、环磷酰胺(包括低剂量或节律化的环磷酰胺(例如，以50mg/d的剂量)、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、TyrphostinAG 490、Janus活化激酶2/信号转导子和转录激活子-3(JAK2/STAT3)抑制剂或其组合。
细胞死亡可通过本领域已知的方法诸如细胞凋亡测定，例如通过对组织活检物进行TUNNEL技术来测量。肿瘤尺寸的减小可通过乳房x线摄影、CT-SCAN和MRI来确定。
一方面，本公开提供了本文公开的导管内方法和组合物还包含佐剂。合适的佐剂可以是无机盐、乳剂和脂质体，例如PLGA脂质体、皂苷类、热休克蛋白诸如HSP70、VSSP、BCG和DETOX。
一方面，本公开提供了本文公开的方法和组合物在受试者中诱导免疫应答。免疫应答可以是抗体和免疫细胞介导的反应中的任一种或多种，诸如T细胞效应子功能(例如通过CD4+辅助T细胞和细胞毒性CD8+T细胞的活化、T细胞介导的细胞毒性)、B细胞效应子功能诸如肿瘤抗原靶向抗体形成、NK细胞效应子功能、记忆T细胞和B细胞的形成、Treg的减少、免疫抑制的减少(例如通过抑制检查点途径分子诸如CTLA4，PD-1、PD1-L1、TIM、LAG3或激活OX-40/OX-40L途径)、血管抑制性反应(新生血管形成的抑制)，以及肿瘤细胞死亡的诱导或增加(Park等人，Cancer Res Treat.2011年3月；43(1):56–66)。
因此，本文公开的方法将解决不适当或不充分的抗原呈递和/或向次级淋巴器官诸如淋巴结，以及如果存在的话，向异位和三级淋巴结的迁移，以向T细胞和B细胞呈递抗原的问题。内向APCS，诸如被阻止进行M2转化或成为M2-DC的新募集的iDC、乳腺组织驻留DC和肿瘤相关DC，将能够加工肿瘤抗原并被活化和更高效地呈递肿瘤抗原。因此，对本文公开的导管内施用的组合物的暴露也将使肿瘤细胞对随后用细胞毒性剂进行的治疗敏感。
一方面，本公开提供了本文公开的组合物和方法动员效应免疫细胞。在一些实施方案中，所动员的免疫细胞是效应细胞诸如T细胞、B细胞和NK细胞。肿瘤抗原特异性T细胞、B细胞和NK细胞由成熟的载有抗原的APC动员，所述APC迁移至引流淋巴结、异位淋巴结和第三淋巴结，用于在导管内递送本文公开的组合物时呈递抗原。
另一方面，本公开提供了在导管内施用包含能够诱导或增强T细胞迁移的一种或多种生物活性剂的组合物时，诱导或增强浸润性的抗肿瘤T细胞向受试者乳管或乳腺组织迁移的方法和组合物。这种T细胞迁移可以沿着输入淋巴系统和/或在血液中进行。不希望受任何理论或机制的束缚，在一些实施方案中，包含这种一种或多种生物活性剂的组合物包括但不限于CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL27、CXCL1和CX3CL1或其任意组合。在至少一个实施方案中，在包含一种或多种生物活性剂的组合物中，至少一种生物活性剂诱导T细胞迁移。此类T细胞可以浸润乳腺肿瘤，帮助杀伤肿瘤。
另一方面，本发明提供了在导管内施用包含能够诱导或增强NK细胞迁移的一种或多种生物活性剂的组合物时，诱导或增强NK细胞向受试者乳管或乳腺组织迁移的方法和组合物。在一些实施方案中，包含此类一种或多种生物活性剂的组合物包括但不限于IL-12、IL-15、IL-18、低剂量IL-2或其组合。在一些实施方案中，包含一种或多种生物活性剂的组合物还包含miR-30c-1、miR-27a、miR-548q、miR362-5p、miR628-5p和miR152或其任意组合。包含这种miRNA有助于NK细胞介导的细胞毒性。
活化的抗肿瘤效应免疫细胞对肿瘤组织的浸润与乳腺癌的积极结果相关。
一方面，如表1所述，本公开提供了包含本文公开的一种或多种生物活性剂的组合物被配成以单位剂量导管内施用。
表1.导管内组合物中一种或多种生物活性剂的单位剂量的示例性实施方案
编号 生物活性剂 单位剂量的示例性实施方案
1 TNFα 0.01μg/mL至200μg/mL
2 IL-1β 0.01μg/mL至20μg/mL
3 IFNγ 1μg/mL至100μg/mL
4 IFNα 1μg/mL至300μg/mL
5 Poly(I:C) 1μg/mL至50μg/mL
6 CpG-ODNs 0.01μg/mL至20mg/mL
7 OX-40激动剂 0.01mg/mL至50mg/mL
导管内组合物中TNFα的单位剂量的范围可为0.05μg/mL至150μg/mL、0.1μg/mL至100μg/mL和0.5μg/mL至50μg/mL。在一些实施方案中，所述组合物以0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL的单位剂量包含TNFα。
导管内组合物中IL-1β的单位剂量的范围可为0.01μg/mL至20μg/mL、0.1μg/mL至15μg/mL、0.5μg/mL至10μg/mL和1μg/mL至10μg/mL。在一些实施方案中，所述组合物以0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的单位剂量包含IL-1β。
导管内组合物中IFNγ的单位剂量的范围可为1μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至80μg/mL、25μg/mL至75μg/mL和50μg/mL至75μg/mL。在一些实施方案中，本文公开的组合物以1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL的单位剂量包含IFNγ。
导管内组合物中IFNα的单位剂量的范围可为1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL和50μg/mL至150μg/mL。在一些实施方案中，本文公开的组合物以1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL和300μg/mL的单位剂量包含IFNα。
导管内组合物中TLR3激动剂诸如Poly(I:C)的单位剂量的范围可为0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL和1μg/mL至20μg/mL。在一些实施方案中，所述组合物以0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL的单位剂量包含Poly(I:C)。
导管内组合物中TLR9激动剂诸如CpG-ODN的单位剂量的范围可为0.01μg/mL至20mg/mL、0.1μg/mL至15mg/mL、1μg/mL至10mg/mL、10μg/mL至5mg/mL、50μg/mL至1mg/mL。在一些实施方案中，所述组合物以0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、和20mg/mL的单位剂量包含CpG-ODN。
导管内组合物中OX-40激动剂诸如抗OX-40抗体的单位剂量的范围可为0.01mg/mL至50mg/mL、0.1mg/mL至40mg/mL、0.5mg/mL至30mg/mL和1mg/mL至25mg/mL。在一些实施方案中，所述组合物以0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL和50mg/mL的单位剂量包含OX-40激动剂。
另一方面，本公开提供了包含一种或多种生物活性剂的组合物还包含额外治疗剂。这种额外治疗剂可以是用于治疗乳腺病症的任何药剂。
示例性的额外治疗剂包括但不限于检查点抑制剂、旨在降低乳腺癌受试者的雌激素的抗激素类药物(例如，抗雌激素或抗雌激素受体，诸如他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、细胞毒性剂诸如烷化剂(如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类(诸如多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类，小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156、替莫唑胺、环磷酰胺、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星，米托蒽醌，奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、Tyrphostin AG 490、Janus活化激酶2/信号转导子和转录激活子-3(JAK2/STAT3)抑制剂、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨)、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、玻玛西林、帕博西尼、抗IL-10抑制剂、抗TGF-β抑制剂、检查点抑制剂(诸如抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4抗体、抗FoxP3抗体、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继细胞疗法，或其组合。
肿瘤浸润性调节性T细胞(T-reg；CD4+/CD25+/Foxp3+T细胞)与乳腺癌的最坏结果相关(Shou et al.BMC Cancer.2016；16(1):687)。研究表明，雌激素通过扩大T-reg区室而促进免疫耐受性(Prieto和Rosenstein.Immunology.2006年5月；118(1):58-65；Polanczyket al.International Immunology，第19卷，第3期，第337–343页)。本公开有利地提供了用于减少乳腺癌受试者中T-reg的导管内方法和组合物。因此，在一些实施方案中，所述额外治疗剂是旨在降低乳腺癌受试者中雌激素的一种或多种抗激素类药物(例如，抗雌激素或抗雌激素受体)，并且选自他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑。
在一些实施方案中，所述额外治疗剂是检查点抑制剂中的一种或多种，包括选自由以下组成的组的检查点抑制剂：抗PD-1抗体(例如纳武单抗)、抗PD-1L(例如阿特朱单抗(MPDL3280)、阿维单抗(MSB0010718C)、德瓦鲁单抗、MDX-1105)、抗CTLA4(例如，伊匹单抗)、抗LAG-3(诸如IMP321、BMS-986016和GSK2831781)、OX-40激动剂、TIM抑制剂和IDO抑制剂或其组合。
本公开提供了用于实施本公开的所述一种或多种生物活性剂、复极化剂、DC向巨噬细胞的阻断剂和额外治疗剂，作为非限制性实例，可以是小分子抑制剂、小分子活化剂、基因、DNA、多核苷酸、寡核苷酸(ODN)、适体、树枝状大分子、拷贝DNA(cDNA)、裸RNA、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA(ASR)、沉默RNA(siRNA)、长的非编码RNA(lncRNA)、蛋白质、多肽、肽、拟肽(peptidomimetics)、诱饵序列、DNA疫苗、RNA疫苗、自扩增mRNA复制子、抗体(人的、人源化的、嵌合的、单克隆的、多克隆的、单特异性的、双特异性的，等)和抗体片段、糖类、多糖、基因疗法(诸如CRISPR/Cas9介导的基因编辑)等。本领域技术人员应当理解，当包括权利要求在内的本公开涉及抗体时，本申请人意图抗体范围包括可用于实施本公开的抗体片段。
用于实施本发明的蛋白质、多肽和肽可以从天然来源分离，可以是合成的，或者是重组产生的多肽。肽和蛋白质可在体外或体内重组表达。用于实施本发明的蛋白质、肽和多肽可使用本领域已知的任何方法来制备和分离。用于实施本发明的蛋白质、多肽和肽还可使用本领域公知的化学方法完整或部分地合成。参见例如，Caruthers(1980)NucleicAcids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；Banga,A.K,Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing andDelivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.,Lancaster,Pa。例如，肽合成可使用各种固相技术(参见，例如，Roberge(1995)Science 269:202；Merrifield(1997)MethodsEnzymol.289:3-13)进行，并且可以例如根据制造商提供的说明使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。
生物活性剂、复极化剂和DC向巨噬细胞转化的阻断剂(例如，蛋白质、多肽、基因、DNA、核苷酸序列)的序列可根据需要从公开可得和商购可得的资源中确定或是本领域中已知的，诸如从NCBI Genbank和序列浏览器。
蛋白质、肽和多肽可以与其他部分诸如聚乙二醇(PEG)缀合。例如，IFNα可以是聚乙二醇化的或可用天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸缀合。
多核苷酸可以以各种形式递送。在一些实施方案中，可使用呈线性形式或插入质粒(诸如表达质粒)的裸多核苷酸。在其他实施方案中，可使用活载体，诸如病毒或细菌载体。可存在有助于将DNA转录成RNA和/或将RNA翻译成多肽的一种或多种调控序列。在一些情况下，诸如在多核苷酸是信使RNA(mRNA)分子的情况下，不需要与转录过程相关的调控序列(例如启动子)，并且在没有启动子的情况下可以实现蛋白质表达。本领域技术人员可根据情况需要包括合适的调控序列。
在一些实施方案中，多核苷酸存在于表达盒中，其中所述多核苷酸可操作地连接至调控序列，所述调控序列将允许多核苷酸在施用了本发明组合物的受试者中表达。表达盒的选择取决于对其施用所述组合物的受试者以及对于所表达的多肽所需的特征。
通常地，表达盒包括在受试者中起作用并且可以是组成型或诱导型的启动子；核糖体结合位点；如果需要，起始密码子(ATG)；编码目标多肽的多核苷酸；终止密码子；和任选地3’末端区域(翻译和/或转录终止子)。可以包括额外的序列，诸如编码信号肽的区域。编码目标多肽的多核苷酸可以与表达盒中的任何其它调控序列同源或异源。要与目标多肽一起表达的序列，诸如信号肽编码区，通常位于编码要表达的蛋白质的多核苷酸附近，并置于适当的阅读框中。将由编码要单独表达或与要表达的任何其它序列(例如信号肽)一起表达的蛋白质的多核苷酸构成的开放阅读框架置于启动子的控制之下，使得在对其施用所述组合物的受试者中发生转录和翻译。
另一方面，本公开提供了本文公开的组合物还可包含药学上可接受的载体。
要选择的载体可部分地由具体的生物活性剂确定并用于导管内施用。载体例如由Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑(1980)进行了描述。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下通常对受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。
合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。
在一些方面，缓冲剂包含在所述组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。例如，在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中更详细地描述了示例性方法。
制剂可包括水溶液、醇溶液或水醇溶液。
在一些实施方案中，组合物的载体可包含疏水性物质诸如液体疏水性物质的连续相。连续相可以是基本上纯的疏水物质或疏水物质的混合物。另外，载体可以是水在疏水物质中的乳液或水在疏水物质混合物中的乳液，只要疏水物质构成连续相即可。
可用于本文所述组合物的疏水物质是药学上可接受的物质。载体优选为液体，但在大气温度下不是液体的某些疏水物质可被液化，例如通过加温，并且在本发明中也是有用的。在一个实施方案中，疏水载体可以是磷酸盐缓冲盐水。
油或油包水乳液是用于本公开的特别合适的载体。油应该是药学上可接受的。合适的油包括例如矿物油(尤其是轻质或低粘度矿物油，诸如
Figure BDA0002747880170000361
6VR)、植物油(例如，大豆油)、坚果油(例如，花生油)或其混合物。在一个实施方案中，油是矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯，市售为
Figure BDA0002747880170000362
ISA 51。还可以使用动物脂肪和人造疏水聚合材料，特别是在大气温度下为液体或相对容易液化的材料。
在本文所述组合物被描述为无水脂质体悬浮液(“无水”)的实施方案中，，这些“无水”组合物的疏水载体可能仍然含有少量的水，只要水存在于载体的非连续相中即可。例如，所述组合物的单个组分可能具有结合水，所述结合水不能通过诸如冻干或蒸发的过程完全除去，并且某些疏水载体可能含有少量溶解在其中的水。通常，被描述为“无水”的本发明组合物包含，例如，基于所述组合物的载体组分的总重量的重量/重量，少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的水。
另一方面，本公开提供了本文公开的组合物被配制成脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束。因此，在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂、复极化剂、阻断剂、额外治疗剂或其任意组合包含在(包封在)脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束中。在其他实施方案中，所述一种或多种生物活性剂、复极化剂、阻断剂、额外治疗剂或其任意组合包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的表面上。在又一些其他实施方案中，所述一种或多种生物活性剂、复极化剂、阻断剂、额外治疗剂或其任意组合可包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束中或其表面上。
制备脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的方法在本领域是公知的。
脂质体是包含捕获的含水体积的完全封闭的脂质膜。脂质体可以是单层囊泡(具有单一双层膜)或以多层膜双层为特征的多层囊泡，其中每个双层与下一双层可被或可以不被水层隔开。如本文和权利要求书中所用，术语“脂质体”旨在涵盖所有此类如上所述的囊泡结构，包括但不限于在本领域中被描述为“泡囊(niosomes)”、“传递体(transfersomes)”和“病毒体(virosomes)”的那些。脂质体颗粒的两亲性结构使得亲水性和疏水性药物的包封成为可能。
关于脂质体的一般性论述可见于Akbarzadeh等人，Nanoscale Research Letters2013,8:102；Gregoriadis G.，Immunol.Today,11:89-97,1990；和Frezard,F.,Braz.J.Med.Bio.Res.,32:181-189,1999中。在本发明的实践中可使用任何合适的制备脂质体的方法，或者可从商业来源获得脂质体。脂质体通常通过用水溶液水合将形成脂质双层的脂质体组分(例如磷脂和胆固醇)来制备，所述水溶液可以是纯水或溶于水的一种或多种组分的溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS),、无磷酸盐的盐水或任何其他生理相容的水溶液。
脂质体组合物可以例如通过使用天然脂质、合成脂质、鞘脂、醚脂质、甾醇、心磷脂、阳离子脂质和用聚(乙二醇)和其他聚合物改性的脂质来获得。合成脂质可包括以下脂肪酸成分；月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、花生酰基、油酰基、亚油酰基、瓢儿菜基(Erucoyl)或这些脂肪酸的组合。特别适用于制备脂质体的脂质包括但不限于磷脂、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、三油酸甘油酯、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛精(tricaprylin)、三油精(triolein)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、(1,2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基铵)丙烷)(DOTAP)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油酰基-3-(2-羟基乙基)氯化咪唑啉鎓(DOTIM)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)。
阳离子合成脂质诸如DOTAP和DOTIM可用于制备对肿瘤脉管系统和乳腺导管具有亲和力的阳离子脂质体。在一些实施方案中，使用阳离子合成脂质制备脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质颗粒、囊泡、胶束。
尽管本发明中可以使用任何脂质体，包括由古细菌脂质制成的脂质体，但在至少一个实施方案中，磷脂和未酯化的胆固醇用于脂质体制剂中。胆固醇用于稳定脂质体，任何其他稳定脂质体的化合物都可以替代胆固醇。其他脂质体稳定化合物是本领域技术人员已知的。例如，饱和磷脂产生具有更高转变温度的脂质体，表明稳定性增加。
优选用于脂质体制备的磷脂是具有至少一个选自由以下组成的头基的那些磷脂：磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸胆碱和磷酸肌醇。在一些实施方案中，脂质体包含为94-100％磷脂酰胆碱的脂质。此类脂质可以卵磷脂
Figure BDA0002747880170000391
90G形式商购获得。当未酯化的胆固醇也用于脂质体制剂时，胆固醇的用量相当于磷脂重量的约10％。如果使用除胆固醇外的化合物来稳定脂质体，本领域技术人员可容易地确定组合物中所需的量。
在其他实施方案中，可将脂质体组分或脂质体组分的混合物，例如磷脂(例如
Figure BDA0002747880170000392
90G)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、三油精、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛精、三油精、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)溶解在有机溶剂诸如氯仿和甲醇的混合物中，随后过滤(例如，PTFE 0.2μm过滤器)和干燥(例如旋转蒸发)以除去溶剂。
所得脂质混合物的水合作用可通过例如将脂质混合物注入水溶液或超声处理脂质混合物和水溶液来实现。在脂质体的形成过程中，脂质体组分围绕一定体积的水溶液形成单双分子层(单层)或多双分子层(多层)，脂质体组分通过该水溶液水合。
在其他实施方案中，可将脂质体与包含连续疏水相的载体组合。
如果载体仅由疏水物质或疏水物质的混合物组成(例如使用100％矿物油载体)，则可简单地将脂质体与疏水物质混合，或者如果有多种疏水物质，则将脂质体与它们中的任何一种或组合混合。相反，如果包含疏水物质的连续相的载体包含不连续的水相，则载体通常将采取水相于疏水相中的乳液形式，诸如油包水乳液。此类组合物可包含乳化剂来稳定乳液并促进脂质体均匀分布。为了促进脂质体在载体中均匀分布，即使使用无水载体，乳化剂也是有用的。典型的乳化剂包括甘露醇油酸酯(ArlacelTM A)、卵磷脂(例如，S100卵磷脂)、磷脂、TweenTM 80和SpansTM 20、80、83和85。在一些实施方案中，疏水物质与乳化剂的体积比(v/v)在约5:1至约15:1的范围内。在至少一个实施方案中，该比例约为10:1。
可将脂质体加入到最终的乳液中，或者它们可在乳化前存在于水相或疏水相中。在一些实施方案中，随后可将脂质体脱水，诸如通过冷冻干燥或冻干。
可在配制过程的不同阶段引入所述一种或多种生物活性剂。可将不止一种类型的生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)掺入到组合物中(例如，抗体和小分子抑制剂或siRNA和mRNA、多肽和RNA疫苗等)。
在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)存在于用于水合用于形成脂质体的脂质双层的组分(例如一种或多种磷脂和胆固醇)的水溶液中。在这种情况下，所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)将被包封在脂质体中，存在于其含水内部。如果所得脂质体不经洗涤或干燥，从而存在于最终与包含疏水物质连续相的载体混合的残留水溶液，则最终产品中的脂质体外可能存在额外的极化剂或阻断剂。
在一种相关技术中，在用水溶液水合之前，可将所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)与用于形成脂质体的脂质双层的组分混合。还可将所述一种或多种生物活性剂添加到预先形成的脂质体中，在这种情况下，可将所述一种或多种生物活性主动装载到脂质体中(即被包封)，或在脂质体的表面上(例如结合到脂质体表面上)，或者抗原可保留在脂质体的外部。在此类实施方案中，在添加所述一种或多种生物活性剂之前，预形成的脂质体可以是空的脂质体(例如不包含包封的一种或多种生物活性剂和/或复极化剂或阻断剂)，或者预形成的脂质体可包含掺入脂质体中或与脂质体结合的一种或多种生物活性剂。这些步骤可以在与包含疏水物质连续相的载体混合之前进行。
在一种替代方法中，相反地，可在将载体与脂质体组合之前、期间或之后，将所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)与包含疏水物质连续相的载体混合。如果载体是乳液，则可在乳化之前将所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)与水相或疏水相之一或两者混合。或者，可在乳化之后将所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)与载体混合。在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)可存在于脂质体内，也可存在于包含疏水物质连续相的载体内。
如果包含一种或多种生物活性剂的组合物还包含额外的治疗剂，则可如上所述组合所述额外的治疗剂。
可将稳定剂诸如糖诸如蔗糖、抗氧化剂诸如α-生育酚，或保持生物活性或改善化学稳定性以延长所述一种或多种生物活性剂的保存期的防腐剂添加到此类组合物中。其他赋形剂可包括盐诸如氯化钠(NaCl)和氯化钙、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾。
在一个实施方案中，为了配制本发明的组合物，将S100卵磷脂和胆固醇的均匀混合物(例如10:1w:w)在一种或多种生物活性剂(例如αDC混合物、TLR3激动剂Poly(I:C)和IFNα以及TLR9激动剂CpG-ODNS和OX-40激动剂)存在的情况下(任选在磷酸盐缓冲液中)水合，以形成包封有一种或多种生物活性剂的脂质体。然后可以任选地通过手动微型挤出机挤出脂质体制剂，并任选地将其与额外治疗剂或成像剂混合。然后可将该悬浮液冻干并在包含疏水物质连续相的载体中复原，以形成无水脂质体悬浮液。
在一些实施方案中，可通过水合至少一种脂质组分与一种或多种生物活性剂的均匀混合物来配制所述组合物，以形成复极化剂、阻断剂或两者包封的脂质体，所述至少一种脂质组分选自由以下组成的组：三油精、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛精、三油精、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂(0.01mg/ml至0.2mg/ml)、脑磷脂(0.005mg/ml至0.05mg/ml)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)(例如，10:1w:w)。
在其他实施方案中，可通过在一种或多种生物活性剂存在的情况下任选地在磷酸盐缓冲液中水合选自下述的至少两种脂质组分的均匀混合物来配制所述组合物，以形成包封有一种或多种生物活性剂的脂质体：三油精、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DOPG)、胆固醇、三辛精、三油精、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、卵磷脂(0.01mg/ml至0.2mg/ml)、脑磷脂(0.005mg/ml至0.05mg/ml)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱(EPC)、琥珀酸二钠六水合物(DSH)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)(例如，10:1w:w)。
在一些实施方案中，可通过在一种或多种生物活性剂存在的情况下，任选在磷酸盐缓冲液中，水合二油酰-磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇的均匀混合物(例如10:1w:w)来配制所述组合物，以形成被所述一种或多种生物活性剂包封的脂质体。
一个方面，本公开提供了包含一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)的组合物被配制成纳米颗粒。在一些实施方案中，这样的纳米颗粒可以是脂质纳米颗粒(例如经修饰的脂质体)。纳米尺度的经修饰的脂质体已被证明具有优异的药代动力学特性，可用于递送DNA、反义寡核苷酸、siRNA、蛋白质和化学治疗剂。因此，在一些实施方案中，所述一种或多种生物活性剂(和/或复极化剂或阻断剂)包含在脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，将所述一种或多种生物活性剂装载在纳米颗粒(例如，脂质颗粒，诸如实施例1中所示的脂质包被的纳米颗粒)或脂质体的表面上。
其他合适的纳米颗粒包括聚合物纳米颗粒(例如使用可生物降解的合成聚合物，诸如聚交酯-聚乙交酯共聚物、聚丙烯酸酯和聚己内酯，或天然聚合物，诸如白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原和壳聚糖制造的)、聚合物胶束、水凝胶纳米颗粒、树枝状聚合物、贵金属纳米颗粒(诸如金纳米颗粒)等。
在一些实施方案中，所述组合物包含平均(average)或平均(mean)直径不大于约1000纳米(nm)，诸如不大于约900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm和100nm中的任一种的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均或平均直径不大于约200nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均或平均直径不大于约150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均或平均直径不大于约100nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均或平均直径为约20至约400nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均或平均直径为约40至约200nm。在一些实施方案中，纳米颗粒是可无菌过滤的。
在一些实施方案中，一种或多种生物活性剂从纳米颗粒和脂质体响应性聚合物或水凝胶中的释放可通过pH、温度、射频或磁场的变化来触发。
一方面，本公开提供了脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束被配制用于靶向药物递送。这种靶向特异性是通过用一种或多种靶向APC诸如DC、M1巨噬细胞和B细胞的细胞靶向剂缀合纳米颗粒和脂质体来实现的。适用于本发明目的的细胞靶向剂可以是任何APC特异性细胞表面分子。当期望M2-DC向免疫原性DC1复极化时，细胞靶向剂可以是任何M2-DC选择性细胞表面分子。本公开提供了用一种或多种M2-DC选择性细胞表面分子涂覆纳米颗粒和脂质体。本领域技术人员将认识到，M2-DC选择性细胞表面分子可能只存在于M2-DC上，但也可能存在于其他DC上。然而，合适的M2-DC选择性细胞表面分子是只在M2-DC上表达或在M2-DC上的表达水平比在非M2-DC上高的那些分子。适用于本发明目的的M2-DC选择性细胞表面分子包括但不限于C1q蛋白。适用于本公开的其它细胞靶向剂包括但不限于APC上的细胞表面分子，诸如DEC-205、Clec9A(DNGR-1)、DC-SIGN、BDCA1、BDCA2、BDCA3和BDCA4。
本文所述的纳米颗粒可存在于干制剂(诸如冻干组合物)中或悬浮在生物相容性介质中。合适的生物相容性介质包括但不限于水、缓冲水性介质、盐水、缓冲盐水、任选地缓冲的氨基酸溶液、任选地缓冲的蛋白质溶液、任选地缓冲的糖溶液、任选地缓冲的维生素溶液、任选地缓冲的合成聚合物溶液、含脂质乳液等。
纳米颗粒可以通过本领域已知的任何方法制备(参见Pal等人，Journal ofApplied Pharmaceutical Science 01(06)；2011:228-234；Hu Y等人Nanoparticles.NanoLetters.2007；7:3056–3064；Hu YH等人Biomacromolecules.2009；10:756–765；Lynn DM,Langer R.Journal of the American Chemical Society.2000；122:10761-10768。
所述一种或多种生物活性剂、极化剂、阻断剂和额外治疗剂的添加可通过任何已知的合适方式实现。作为非限制性实例，可将线性或作为质粒和盒的DNA序列添加到脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束中，如Goncalves等人、Su等人所述。
本公开提供了脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的脂质与核酸的比率(LNR)范围为30:1至2.5:1。在一些实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的LNR范围为25:1至5:1。在至少一个实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的LNR范围为20:1至10:1。
本公开提供了脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的脂质与蛋白质的比率(LPR)范围为30:1至1:1。在一些实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的LNR范围为25:1至5:1。在至少一个实施方案中，脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的LNR范围为20:1至10:1。
本公开提供了本公开的脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡和胶束的小分子药物与脂质的比率(D/L)通常为每mg脂质至少0.05、0.1、0.2、0.35、0.5或至少0.65mg的药物。就摩尔比而言，根据本公开的D/L比是每摩尔脂质至少约0.02至约5摩尔、至少约0.1至约2摩尔以及约0.15至约1.5摩尔的药物。
一方面，本公开提供了包含一种或多种生物活性剂的组合物还包含成像剂、染料或造影剂。合适的成像剂可以是钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因，诸如基于金属蛋白的MRI探针。本文公开的成像剂、染料和造影剂的添加提供了额外的有利方面，即跟踪本文公开的组合物的导管内递送和APC的迁移，所述APC吞噬、胞饮或通过其他机制吸收这些组合物。
在一些实施方案中，组合物被配制成贮库制剂、缓释制剂、控释制剂。
本文公开的组合物适于对受试者的乳腺导管进行导管内施用。
一方面，本公开提供了可通过本领域已知的任何方法将本文公开的组合物导管内递送到受试者的一个或多个乳腺管中。这些方法包括但不限于使用注射器/针((Krause等人.J.Vis.Exp.2013；(80):50692)、微针(例如，实心微针、涂覆有药物的微针、空心微针和溶解微针)、套管、微插管、导管、微导管和探针的注射。
适用于药物透皮给药的微针可用于本公开的实践(Kim等人.Adv Drug DelivRev.2012年11月；64(14):1547–1568，整体并入)。
作为非限制性实例，在一些实施方案中，可将本文公开的组合物导管内施用至受试者的母乳管(breast milk duct)，其包括将本文公开的包含在装置的处理室中的组合物与乳腺的乳头接触，并对组合物施加正压，使得组合物由于正压而经由乳腺管孔压入母乳中。优选地，组合物被压入一个或多个乳腺管。在其他实施方案中，组合物被压入2至5个乳腺管、4至8个乳腺管或7至11个乳腺管。
例如，美国专利6,413,228公开了导管进入装置，其能够收集导管流体并向导管注入清洗液。为了本公开的目的，这种装置可被适当地适配或配置用于本公开的组合物的导管内递送。
作为导管内施用的替代方法，可将小泵安装在乳腺管内或安装在乳头表面上通过导管连通来将组合物缓慢连续地施用到乳腺管区域，例如，可将泵安装在输乳窦内，用于施用其中的组合物并使组合物扩散到乳腺管的其余部分，或者可将泵安装在乳头表面上，与导管连通。可将安装在乳头表面的泵塑形为例如大头钉(或顶针形部分，其具有顶部或大头钉部分，其余部分在乳头表面上，其中一部分延伸到需要治疗或有需要治疗风险的导管中)。该泵机械装置可包括例如DurosTM渗透(微)泵(Viadur)(由Johnson&Johnson,IntelliDrug收购的Alza Corp制造)、
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(Durect Corp.)、Ivomec
Figure BDA0002747880170000462
bolus等，由强生公司收购，IntelliMedicine，Alzet(Durect公司)，Ivomec SR丸药等(Herrlich等人.Advanced Drug Delivery Reviews.2012，第1617-1626页)。
渗透泵也可以基本上像美国专利第5,531,736号、美国专利第5,279,608号、美国专利第5,562,654号、美国专利第5,827,538号、美国专利第5,798,119号、美国专利第5,795,591号、美国专利第4,552,561号或美国专利第5,492,534号中描述的泵那样组装或配置，在尺寸和体积进行了适当的修改，以用于向乳腺管进行施用，例如用于放置在管(例如输乳窦)中或放置在乳头表面上。尖端(进入管)能够旋转，以适应乳头表面上不同位置的乳腺管。单个平头泵可具有一个或多个放置在平头下面的尖端，以便进入特定的一个或多个乳腺管，例如需要进入乳腺中的两个或多个管之时。如此配置并装载有本文公开的用于导管内施用的适当配制的组合物的泵可以施用所述的组合物，但也可含有和施用除本文公开的组合物之外的药剂，以用于治疗乳腺管中的癌前或癌症疾患的适当治疗目的。可以想象，该泵可被配置为向位于乳腺中的所有乳腺管进行施用，其中对尺寸和体积进行了一定改变。
在另一方面，本文公开的组合物的导管内递送可以通过离子电渗疗法来辅助，所述离子电渗疗法包括向乳腺施加电流，所述电流有助于细胞迁移到乳腺管中和/或管内。
本文公开的组合物的时间安排和剂量大小通常被设计成降低毒性结果的风险或使毒性结果降至最低和/或提高功效，诸如使受试者例如，随着时间的推移更快和更多地暴露于组合物中。施用的数量和频率将由患者的疾患、年龄、体重、肿瘤尺寸和分期、表面积和受试者疾病的严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可由主治医生决定。
医学领域的技术人员可通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗来容易地确定最佳剂量和施用方案。组合物可以在这些剂量下多次施用。因此，该方法可包括一段时间内的单剂量或多剂量，或者例如通过输注的连续剂量。在一些实施方案中，剂量可以是单个单位剂量。在其他实施例中，单个剂量可以是分割单位剂量。如本文中所用，术语“分割单位剂量”是指被分割的单位剂量，使得其在一天(包括超过一天)中被施用超过一次。因为用于本发明目的的分割单位剂量被认为是单一的，即一个单位剂量。分割剂量的示例性方法包括第一天施用25％的剂量，第二天施用剩余的剂量。在另一个实方案中，单位剂量可以分成2份，每份50％，在连续2天内递送。在又一个实施方案中，可隔天分2次给予分割的单位剂量。在又一个实施方案中，单位剂量可以分成3份，在连续3天内平均施用。
一方面，可以以每单位剂量1x104至1x108个脂质体微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒或囊泡的浓度导管内施用本公开提供了包含脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒和囊泡中任一种的组合物。
一方面，本发明提供给受试者施用本文公开的组合物，其中以表2中提供的剂量范围导管内施用所述一种或多种生物活性剂。
表2.示例性生物活性剂量范围。
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Figure BDA0002747880170000481
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用组合物，所述组合物以范围为0.05μg/mL至150μg/mL、0.1μg/mL至100μg/mL和0.5μg/mL至50μg/mL的单位剂量包含TNFα。在一些实施方案中，所述组合物以0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL的单位剂量施用包含TNFα的组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用组合物，所述组合物以范围为每单位剂量0.01μg/mL至20μg/mL、0.1μg/mL至15μg/mL、0.5μg/mL至10μg/mL和1μg/mL至10μg/mL的单位剂量包含IL-1β。在一些实施方案中，所述组合物以0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的单位剂量施用包含IL-1β。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用组合物，所述组合物以范围为1μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至80μg/mL、25μg/mL至75μg/mL和50μg/mL至75μg/mL的单位剂量包含IFNγ。在一些实施方案中，本文公开的组合物以1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL的单位剂量包含IFNγ。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用组合物，所述组合物以范围为1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL和50μg/mL至150μg/mL的单位剂量包含IFNα。在一些实施方案中，本文公开的组合物以1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL和300μg/mL的单位剂量包含IFNα。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用组合物，所述组合物以范围为0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL和1μg/mL至20μg/mL的单位剂量包含TLR3激动剂诸如Poly(I:C)的组合物。在一些实施方案中，所述组合物以0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL的单位剂量包含Poly(I:C)。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用组合物，所述组合物以范围为0.01μg/mL至20mg/mL、0.1μg/mL至15mg/mL、1μg/mL至10mg/mL、10μg/mL至5mg/mL、50μg/mL至1mg/mL的单位剂量包含TLR9激动剂诸如CpG-ODN。在一些实施方案中，所述组合物以0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL和20mg/mL的单位剂量包含CpG-ODN。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用有效量的组合物，所述组合物以范围为0.01mg/mL至50mg/mL、0.1mg/mL至40mg/mL、0.5mg/mL至30mg/mL和1mg/mL至25mg/mL的单位剂量包含OX-40激动剂诸如抗OX-40抗体。在一些实施方案中，所述组合物以0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL和50mg/mL的单位剂量包含OX-40激动剂。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用有效量的包含αDC混合物(TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα和Poly(I:C))的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用包含所述αDC混合物的组合物，其中一个单位剂量的所述组合物包含：范围为0.05μg/mL至150μg/mL、0.1μg/mL至100μg/mL和0.5μg/mL至50μg/mL的TNFα；范围为0.01μg/mL至20μg/mL、0.1μg/mL至15μg/mL、0.5μg/mL至10μg/mL和1μg/mL至10μg/mL的IL-1β；范围为1μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至80μg/mL、25μg/mL至75μg/mL和50μg/mL至75μg/mL、1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL和50μg/mL至150μg/mL的IFNγ；以及范围为0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL和1μg/mL至20μg/mL的Poly(I:C)。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用包含TLR9激动剂CpG-ODN和OX-40激动剂抗体的组合物，其中一个单位剂量的组合物包含范围为0.01μg/mL至20mg/mL、0.1μg/mL至15mg/mL、1μg/mL至10mg/mL、10μg/mL至5mg/mL、50μg/mL至1mg/mL的CPG-ODN，以及范围为0.01mg/mL至50mg/mL、0.1mg/mL至40mg/mL、0.5mg/mL至30mg/mL和1mg/mL至25mg/mL的OX-40激动剂抗体。
在一些实施方案中，本公开提供了向受试者导管内施用包含TLR3激动剂Poly(I:C)和IFNα的组合物，其中一个单位剂量的所述组合物包含范围为0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL和1μg/mL至20μg/mL的Poly(I:C)，以及范围为1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL和50μg/mL至150μg/mL的IFNα。
本文公开的方法包括将一个或多个连续剂量的组合物施用到可能已经接受第一剂量的受试者的乳腺管中，和/或施用第一剂量和一个或多个后续剂量。根据特定的时间表和参数以特定的量施用剂量。
在另一方面，导管内施用第一剂量，并通过任何合适的方式施用任何后续剂量，包括导管内、通过注射和输注，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjectval injection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、眼球筋膜下注射、眼球后注射、球周注射或后巩膜旁递送(posterior juxtascleral delivery)。在一些实施方案中，它们通过胃肠外、肺内和鼻内施用，如果需要局部治疗，还可通过病变内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸腔内、颅内或皮下施用。
在一些实施方案中，所述方法通常包括导管内施用本文公开的第一剂量的组合物，从而减少疾病负担。随后可以在相对于第一剂量的特定时间窗内施用后续剂量的组合物，或者向已经接受第一剂量的受试者施用后续剂量的组合物。在一些实施方案中，第一剂量相对较低。施用的组合物的量和组合物的给药时间被设计成改善一种或多种结果，诸如APC的成熟(乳腺组织驻留、肿瘤组织驻留或内向APC)、完全成熟的载有抗原的APC向引流淋巴结的迁移(如果存在的话，向异位和/或三级淋巴结迁移)增加，T细胞、B细胞和/或NK细胞的任何效应细胞功能的活化，T细胞、B细胞和/或NK细胞的任一种对乳腺肿瘤浸润的增加，T-reg的减少、免疫抑制的减少、肿瘤尺寸的减小和促炎细胞因子、趋化因子的增加、M2-DC的复极化、M2-转化的减少或阻止、细胞毒性T-淋巴细胞的募集和其他免疫应答。
在一些实施方案中，本文公开的方法涉及以比第一/初始剂量增加的数量并因此更高的剂量施用后续剂量的组合物。
当给药方案涉及多个剂量时，每个剂量可以每天一次、每天数次(两次、三次、四次等)、隔天、每2天、3天、5天、7天、14天、15天、每3周、28天、每月、每季度、每6个月和每年一次施用。
在一些方面，从初始(第一)剂量开始到下一次剂量开始，测量初始剂量之后的给药时间安排。在其他实施方案中，初始剂量之后的给药时间安排从初始(第一)剂量完成时开始测量。
本公开包括初始剂量可以是分割的单位剂量，随后是此后施用的第二剂量。在一些实施方案中，第二剂量或后续剂量可以是分割的单位剂量。作为非限制性实例，可以在三天内施用分割的单位剂量，并在第二天施用第二单位剂量，或者可以在一年后施用第二单位剂量。初始剂量旨在通过暗示受试者以前从未接受过细胞疗法的剂量，或者甚至受试者以前从未接受过表达相同重组受体或靶向相同抗原的相同细胞的剂量，对需要这样的剂量的受试者产生任何限制。
通常，可以以每单位剂量1x104至1x108个脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒或囊泡中的任一种导管内施用本文所述的组合物。
联合治疗
本公开设想了本文公开的导管内方法还包括联合治疗。一方面，导管内方法还包括向受试者施用一种或多种额外治疗剂或疗法。可通过本领域已知的任何合适的方式向受试者施用额外治疗剂，包括但不限于导管内、局部、口服、经鼻、通过注射或输注的肠胃外、皮下等。额外治疗剂可以包含在本文公开的组合物中，或者可以独立配制。治疗剂和/或疗法的施用顺序可以是任何施用顺序。例如，可将本文公开的组合物与额外治疗剂共同施用，或者可以首先施用额外治疗剂，或者可以在施用本公开的组合物之后施用额外治疗剂。
额外治疗剂可以是对本发明的目的有用的任何治疗剂。
示例性额外治疗剂包括但不限于检查点抑制剂、用于减少患有乳腺癌的受试者中的雌激素的抗激素(例如，抗雌激素或抗雌激素受体，诸如他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、细胞毒性剂诸如烷化剂(诸如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类(诸如多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类、小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156、替莫唑胺、环磷酰胺、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星，米托蒽醌，奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、Tyrphostin AG 490(JAK2/STAT3抑制剂)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨)、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、玻玛西林、帕博西尼、抗IL-10抑制剂、抗TGF-β抑制剂、检查点抑制剂(诸如PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4抑制剂、抗FoxP3抑制剂、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继细胞疗法，或其组合。
其他疗法可包括手术、放射疗法、化学疗法、针灸、过继细胞疗法等。本文公开的方法可用作主要疗法、新辅助疗法(例如，在手术(诸如乳房切除术或乳房肿瘤切除术)或化学疗法之前)或辅助疗法(仅出于说明目的，在化学疗法或用其他过继细胞疗法的方法治疗之后)。
制品
本文还提供了制品，诸如试剂盒和装置，用于施用本文公开的用于过继细胞疗法的细胞和组合物，以及用于储存和施用所述细胞和组合物。
制品包括本文公开的组合物、一个或多个容器、包装材料和标签或包装插页，其通常包括向受试者施用细胞的说明。
容器包含一个或多个单位剂量的待施用的组合物。在一些实施方案中，制品包括一个或多个容器，每个容器包含单个单位剂量的组合物。单位剂量可以是以第一剂量向受试者施用的脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒和囊泡的量或数量，或者是以第一或一个或多个后续剂量施用的纳米颗粒、脂质体等的两倍数量(或更多)。其可以是结合施用方法向受试者施用的纳米颗粒、脂质体等的最低剂量或可能的最低剂量。
在一些实施方案中，每个容器单独包含单位剂量的组合物，其中包含相同或基本相同数量的以下物质的任一种：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒和囊泡。因此，在一些实施方案中，每个容器包括相同或近似或基本相同数量的以下物质的任一种：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒和囊泡。在一些实施方案中，单位剂量包括1X104个或更多的以下物质的任一种：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒和囊泡。在一些实施方案中，单位剂量包括1X104至1X108个以下物质的任一种：脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒和囊泡。
在一些实施方案中，制品还包括额外治疗剂诸如检查点抑制剂、用于减少患有乳腺癌的受试者中的雌激素的抗激素(例如，抗雌激素或抗雌激素受体，诸如他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、细胞毒性剂诸如烷化剂(诸如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类(诸如多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类、小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156、替莫唑胺、环磷酰胺、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星，米托蒽醌，奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、Tyrphostin AG 490(JAK2/STAT3抑制剂)、Janus活化激酶2/信号转导子和转录激活子-3(JAK2/STAT3)抑制剂、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨)、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、玻玛西林、帕博西尼、抗IL-10抑制剂、抗TGF-β抑制剂、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、玻玛西林、帕博西尼、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其它过继性细胞疗法。抗激素可选自由以下组成的组：顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652。检查点抑制剂可选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗OX40等。
在一些实施方案中，制品还包括选自由以下组成的组的成像剂、染料或造影剂：钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒。
合适的容器包括但不限于例如瓶子、小瓶、注射器和柔性袋，诸如输液袋。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料制成。在一些实施方案中，容器具有一个或多个端口，例如无菌接入端口，例如，用于将管或导管连接到一个或多个管，例如，用于经十二指肠乳头(transpapillary)递送和/或用于转移到其他容器诸如细胞培养和/或储存袋或其他容器和从其他容器转移的目的的连接。
所述制品还可包括包装插页或标签，其带有一条或多条识别信息和/或使用说明。在一些实施方案中，信息或说明表明内容物可以或应该用于治疗乳腺病症和/或为此提供说明。标签或包装插页可以指示制品的内容物将用于治疗乳腺病症。在一些实施方案中，标签或包装插页提供了治疗受试者(例如患有乳腺病症的受试者)的说明，所述治疗通过包括第一和一个或多个后续剂量的细胞的导管内给药的方法进行，例如根据所提供方法的任何实施方案。在一些实施方案中，说明书规定以第一剂量施用一个单位剂量，例如制品中单个容器的内容物，随后在指定的时间点或在指定的时间窗内和/或在检测到受试者中一种或多种因子或结果的存在或不存在或量或程度之后施用一个或多个后续剂量。
如本文中所用，除非上下文另有规定，否则术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
如本文中所用，术语“约”是指可测量的值，诸如数量、持续时间等，意在包括与指定值相差±20％或在一些情况下相差±10％，或在一些情况下相差±5％，在一些情况下相差±1％，以及在一些情况下相差±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所公开的方法。
如本文中所用，术语“活化”是指细胞已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”是指，除其它以外，是正在进行细胞分裂的T细胞。
如本文中所用，术语“辅助疗法”是指继主要疗法之后的疗法，以及对有复发风险的受试者施用的疗法。这些受试者是有乳腺病症史，并接受了另一种治疗模式的治疗的受试者。在乳腺癌的情况下辅助系统治疗通常在初次治疗后不久开始，以延迟复发、延长生存期或治愈受试者。如本文所用的“主要治疗”是指在受试者中最初诊断出乳腺病症时的一线治疗。非限制性的示例性主要疗法可包括手术、广泛的化学疗法和放射疗法。
如本文中所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆或单克隆的，多链或单链的，或完整的免疫球蛋白，并且可来源于天然来源或重组来源。抗体诸如IgG通常是免疫球蛋白分子的四聚体。
如本文中所用，术语“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分或其重组变体，并且是指抗原结合结构域，例如完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶标诸如抗原的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、scFv、线性抗体、单结构域抗体诸如SDab(VL或VH)、骆驼VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了其所源自的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本文中所用scFv可以以任意顺序具有VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N末端和C末端，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
如本文所用，术语“受试者”、“患者”和“个体”可在本文中互换使用，指哺乳动物诸如人。哺乳动物还包括宠物动物，诸如狗、猫、实验室动物，诸如大鼠、小鼠，以及农场动物，诸如牛和马。除非另有说明，否则哺乳动物可以是任何性别(gender)或性别(sex)。
如本文中所用，“施用途径”或“递送途径”是指将组合物递送至受试者的途径，通常指施用组合物的位置(例如口服、静脉等)或作用的目标(例如局部、肠内、胃肠外等)。“施用途径”或“递送途径”在本公开中可以互换使用。
实施例
实施例1
脂质包被的CpG-ODN和CpG-ODN+OX-40激动剂抗体纳米颗粒的合成
脂质包被的纳米颗粒的制备。如Su等人(Molecular Pharmaceutics 8，第3期(2011年6月6日):774-787)所述合成具有poly-1核心的脂质包被的纳米颗粒。简言之，具有poly-1核的脂质包被的纳米颗粒将通过两种不同的方法合成：双乳液/溶剂蒸发方法或溶剂扩散/纳米沉淀策略。对于双乳液合成，将30mg poly-1(或PLGA，用于对pH不敏感的对照颗粒)和2mg磷脂DOPC、DOTAP和DSPE-PEG以7:2:1的摩尔比共同溶解在1ml二氯甲烷中。然后将200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入到冰上的混合物中，在1分钟的7W的超声波处理步骤中，使用探针尖超声波仪(Misonix XL2000,Farmingdale,NY)形成第一乳液。然后将初级乳液分散在6ml蒸馏的去离子无核酸酶水中，在12W下超声处理5分钟，然后在25℃下在振荡器上放置18小时以蒸发有机溶剂。对于纳米沉淀合成，将相同量的DOPC、DOTAP和聚合物共溶于4ml乙醇中，滴加到40ml蒸馏的去离子无核酸酶水中，然后温和搅拌5小时以蒸发乙醇。通过后插入方法将DSPE引入脂质涂层：将DSPE脂质以1mM至0.5mg/ml的颗粒加入蒸馏的去离子无核酸酶水中，并将悬浮液在25℃搅拌16小时。将收集颗粒并通过离心洗涤一次，重悬浮在新鲜水中，并在4℃储存直至使用。除将有机乳液或仅含聚合物的溶液分散到2％w/vol的PVA水溶液中外，将通过类似的方法制备无脂质的PVA稳定的颗粒。
将每批颗粒的一部分在真空烘箱中干燥，以通过测量干质量来确定颗粒浓度(mg/ml)。将动态光散射(DLS)和ζ电位测量用于使用ZetaPALS动态光散射检测器(BrookhavenInstruments)测定粒度和表面电荷。为了估计掺入的脂质的百分比和脂质表面涂层中存在的脂质的最终mol％，将通过如上所述的纳米沉淀制备脂质包裹的颗粒，在后插入用羧基荧光素标记的DSPE脂质(DSPE-CF)之前，加入1mol％的DOPE-罗丹明作为示踪剂，用于测量掺入颗粒中的脂质总量。然后，通过用2％triton X-100处理15分钟，将脂质从颗粒表面剥离，并测量上清液的罗丹明和荧光素信号，以定量掺入的脂质量。
为了通过冷冻电子显微镜术(cryoEM)研究脂质包被的纳米颗粒的表面结构，将颗粒包埋在冰中，方法是通过在1.2/1.3μm多孔碳包覆铜网(Electron MicroscopySciences)上印迹颗粒悬浮液(3uL)，并立即使用Leica插入式冷冻机器在液态乙烷中冷冻样本。样品将被转移到低温容器中，并使用JEOL 2200FS透射电子显微镜以185μA的发射电流和40 000倍的放大率成像。
CpG-ODN装载。然后将可从Invivogen,USA获得的CpG-ODN(1.5mL,200μg/mL,pH＝5.7)涂覆在纳米颗粒上。将沉积1至3层。组装后，通过离心(15000rpm,25min)收集上清液。用UV-Vis分光光度法测定上清液中CpG的量。262nm和278nm处的吸光度将用于表征CpG。装载到颗粒上的CpG的量将通过与添加的原始材料相比减去上清液中的CpG的量来计算。
OX-40激动剂抗体装载。对于同样载有OX-40激动剂抗体的CpG-ODN纳米颗粒，OX-40激动剂抗体将沉积在纳米颗粒的表面(2mL，200mg/mL)，用于涂覆在纳米颗粒上。将沉积1至3层。抗体的量将通过与添加的原始材料相比减去上清液中的抗体量来确定。
实施例2
α-1型极化纳米颗粒的合成
包封α-1型极化生物活性剂(αDC混合物)的纳米颗粒将根据由Kocbek等人J.Control.Release,120,18–26(2007)描述的方法来制备。临床级Poly(I:C)可作为印多莫德(Rintatolimod)或安普利近
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简而言之，将400μLαDC混合物(TNFα(500μg/mL)、IL-1β(2.5μg)、IFNγ(1250μg/mL)、PEG-IFNα-2b(1250μg/mL)和Poly I:C)(100μg/mL))加入到含有200mg聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA,Sigma-Aldrich)的乙酸乙酯中。然后将混合物以20,000rpm(Homogeniser,IKA)搅拌，同时超声处理(超声波浴:500W,30kHz,BRANSON)。乳化3分钟后，将8mL聚乙烯醇(PVA，5％)水溶液加入到水/油乳液中，形成水/油/水双乳液，并将其搅拌5分钟。为了固化纳米颗粒，将通过用200mL 0.1％PVA水溶液以500rpm搅拌双乳液2小时来蒸发有机溶剂。为了完全去除乙酸乙酯，将在40℃下使用旋转蒸发器将纳米颗粒的分散体浓缩至大约一半的体积。将所得纳米颗粒以3000rpm离心20分钟，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。颗粒的平均尺寸将使用粒度分析仪(ELS-Z,Otsuka)来测量。
对于一些批次，包含生物活性剂IFNα-2b、Poly(I:C)、TNFα、IL-1β、IFNγ、PEG-IFNα和Poly I:C的纳米颗粒将使用本实施例中描述的方法单独制备。将包含单种生物活性剂的纳米颗粒组合以产生生物活性剂的混合物。
在含有0.1％SDS和0.1N NaOH的裂解缓冲液中裂解纳米颗粒后，将测定生物活性剂的浓度。将在260nm处测定TNFα、IL-1β、IFNγ、PEG-IFNα-2b和Poly I:C的量。
实施例3
生物活性剂TLR9激动剂CpG-ODN和OX-40激动剂的导管内施用
治疗方案。本研究的主要目的是评估TLR9激动剂CpG-ODN和OX-40激动剂(例如，MOXR0916)(统称为“药物”)导管内施用与安慰剂相比的安全性和耐受性。本研究的第二个目的是评估(i)受试者中免疫细胞的动员、抗原呈递，以及(ii)通过评估治疗后的总体反应率和无进展生存期来评估初步疗效。
八十八(88)名患有乳腺癌的受试者将随机接受安慰剂或药物治疗。所有受试者将在第1-2天接受放射疗法。在第2、9、16和23天，向受试者导管内施用(如下所述)安慰剂(队列1；n＝8)或1mg(队列2；n＝20)、5mg(队列3；n＝20)以及10mg(队列4；n＝20)和20mg(队列5；n＝20)的TLR9激动剂CpG-ODN。在第3、10、30、60、90、120和160天，将向队列2、3、4和5中的受试者导管内施用安慰剂(n＝5)或10mg/mL(n＝5)、100mg/mL(n＝5)和200mg/mL(n＝5)的抗OX-40抗体，队列1中的受试者将接受安慰剂。
TLR9激动剂将为临床级C类CpG-ODN M362(5’-tcgtcgtcgttc:gaacgacgttgat-3’(25聚体))或CpG-ODN 2395(5’-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3’(22聚体))。OX-40抗体将为激动剂，其模拟能够激活T细胞的OX-40配体。
乳头准备。受试者脱去衣服后，临床医生将清洁待研究乳腺上的乳头。这包括用微颗粒状凝胶或软膏将乳头擦拭干净，以疏松和去除任何死皮细胞和积聚的油脂。这是医院在医疗操作之前经常使用的清洁剂。之后，会在乳头上涂一些麻木膏。
乳头麻醉剂。将1ml与0.1-0.2mL蓝色染料混合的利多卡因用一根非常小的针注射到乳头基部。
乳头管识别。在注射染料后并在放置导管之前，将一根小的柔性导线插入开口约1/2英寸，以进一步识别和扩张乳头管开口。一旦乳头管被识别，将一小块打结的缝合材料插入乳头管以标记其。这将在至少3个乳头管开口和多达5个乳头管开口上进行。如果临床医生无法找到至少3个乳头管开口，受试者将无法继续研究，并将退出研究。这些受试者将被新纳入的受试者替换。
导管放置，CpG-ODN和抗OX-40抗体的滴注，以及x射线检查。一旦所有乳头管开口都被标记，临床医生将通过乳头管孔将导管插入并放置到个如此标记的被标记乳腺管中。一旦导管就位，临床医生就可任选地缓慢地(超过30秒)将少于1mL的不透射线的染料滴入乳头管中，以允许乳头管成像。
在染料滴注后，根据识别的乳腺管数量，在第2、9、16和23天，将最多2mL(通常在0.5mL至2mL的范围内)的第一组合物缓慢地(超过1分钟)导管内递送至受试者的每个乳腺管，所述第一组合物包含C类CpG-ODN TLR9激动剂。在第3、10、30、60、90、120和160天，向受试者的每个乳腺管导管内施用包含具有潜在免疫刺激活性的OX-40激动剂抗体的第二组合物。OX-40抗体模拟OX-40配体来激活T细胞。只有含有癌症的乳房才会得到治疗。根据待治疗乳腺管数量，将组合物分批或成组地以高达10mL的体积导管内施用到乳腺管中。
将尝试根据已识别的受影响乳腺管或小叶的数量，逐个乳腺管均匀分配剂量。
导管通常会在每个乳腺管中停留约1-5分钟。在手术过程中，受试者被要求使用视觉模拟量表评估他们的疼痛。滴注入染料和纳米颗粒后，将拍摄一张图像，以证明经修饰的细胞已充分注入乳腺管。当受影响的乳腺管数量多于2个时，导管内治疗程序可以成组进行。将导管(catheter)从第一组乳腺管(duct)例如2个相邻的乳腺管(duct)中取出，并且这些乳腺管(duct)将各自用一小块打结的缝合材料标记。此时，将使用疼痛量表对受试者进行疼痛评估。
随后，将新的导管(catheter)插入到剩余的被标记乳腺管(duct)中。在乳头管的下一半已经被插入导管，并且染料和细胞将被注入后，将用荧光镜拍摄另一幅图像以记录乳腺管。受试者将被再次要求评估他们的疼痛。将移除导管，并用一小块打结的缝合材料单个标记乳腺管(duct)。将安息香软膏和透明塑料敷料(生物封闭性的)放置在乳头上，以原位保持标记物直至手术。整个过程需要0.5至1.5小时。将拍摄手术过程的照片。
如果在疼痛评估过程中，受试者报告乳腺出现3级或4级疼痛，且在输注组合物后10分钟内未缓解，则将停止该受试者的研究相关程序。抽血和随访评估以及本文所述的病理评估将按照方案进行。在这种情况下，出于统计目的，研究组中的受试者被替换。
如果首次X射线检查发现穿孔，将立即评估副作用。如果受试者没有报告任何不良反应，将对剩余的乳腺管进行插管并施用纳米颗粒。将根据方案进行如下所述的研究相关的抽血和评估以及病理评估。
在研究给药的第2天，在安慰剂或药物给药之前，将检查给药前和以下时间点的生命体征(收缩压/舒张压、脉搏、温度、呼吸频率)和潮热红发生情况：剂量施用后1、2、4、8和12小时时。给药前和第一剂量施用后4小时进行12导联ECG。将在剂量施用前10±1分钟收集用于生物标志物和药代动力学(PK)分析的血样，以建立基线。
在第9、16、23、30、60、90、120、160天和研究结束时，将检查生命体征(收缩压/舒张压、脉搏、温度、呼吸频率)和潮热红发生。还将在剂量施用前60分钟内进行ECG、血液学、血清化学、凝血和验尿，并在研究药物施用前10±1分钟收集用于PK分析的血样。
肿瘤活检将在治疗前、治疗中和治疗后进行。在治疗前、治疗期间和治疗后，还将对肿瘤引流淋巴结进行系列活检。将使用RECIST v1.1评估肿瘤反应。组织活检物将用于组织中存在的免疫细胞和细胞因子的免疫表型分型。
每个剂量组的安全性和耐受性将通过临床评估、受试者报告和整个研究期间的积极随访来确定。将记录和评估所有不良事件，无论其严重程度如何。
APC的成熟和免疫应答。受试者中APC诸如pDC的成熟和免疫应答将通过测量细胞因子诸如IL-12p70、IFNα和IL6的释放、APC上成熟标志物诸如CCR7以及APC上共刺激分子诸如OX-40L、CD40的表达增加，以及导致效应免疫细胞诸如T细胞、B细胞和NK细胞活化的抗原呈递增加来确定。统计分析将使用微软Excel(Microsoft,Redmond,WA)和SPSS v18.0(SPSS,Chicago,IL)进行。将确定CD11c+HLA-DR+DC和CD123+HLA-DR+DC(pDC)的存在，并计算它们的比例。免疫细胞和细胞因子释放的数据将通过配对t检验进行分析。使用不同组的免疫细胞变化的数据将通过双尾t检验进行检验。免疫细胞变化将使用皮尔逊相关系数进行分析。p值<0.05被认为是统计学上显著的。
体外测定-细胞因子释放。将测量受试者的血清细胞因子水平，以确定受试者中免疫细胞刺激的变化。IL6、IL8、MIP-1α、MIP1β、IL10、IL12p70、IL17A、IFNα、IFNγ、TNFα、Il-23、IL-27和GM-CSF的血清细胞因子水平将在第2天导管内递送第一组合物CpG-ODN之前，以及在导管内施用组合物CpG-ODN之后于4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时和72小时时，使用商购可得的ELISA试剂盒诸如来自Qiagen,Germantown,MD的HumanInflammatory Cytokines Multi-Analyte ELISArray试剂盒MEH-004A进行测定。IL-13分泌的变化将使用商购可得的IL-13分泌ELISA测定法诸如来自Miltenyi Biotec和ThermoFischer的那些或来自R&D Biosystems的人IL-13Luminex Performance测定法来测定。细胞因子分泌将在稀释至测定的线性范围内的样品中进行测量。促炎细胞因子和趋化因子诸如IL12p70、IL-23、IL-27、IFNα和IL6的时间依赖性水平升高将指示受试者中APC诸如pDC的活化和成熟。
免疫细胞的动员
APC。与对照相比，成熟的载有抗原的APC(诸如DC、M1巨噬细胞和B细胞)预计会以更高的水平存在于经药物治疗的受试者的乳腺组织中，并预计会迁移到引流淋巴结以向效应细胞呈递抗原。因此，预计经药物治疗的受试者的引流淋巴结中的成熟APC的检测水平高于安慰剂受试者中的成熟APC的检测水平。将通过免疫组织化学(IHC)或流式细胞术(按照制造商的说明，例如Bio-Rad,AbCam)对肿瘤活检样品测试成熟APC的存在。肿瘤活检样品将利用APC成熟标志物，使用诸如针对趋化导向和迁移速度调节分子CCR7、CD40、CD83、CD86、OX-40L、CD209等的FITC或PE标记的抗体(可从Bio-RAD,Invitrogen,Biolegend,R&DSystems,AbCam和BD Biosciences获得)进行免疫表型分型或染色。
一系列淋巴结活检物将用于确定APC的迁移。表达CCR7、CD40、CD83和OX-40L的DC可通过对活检组织进行免疫组织化学或流式细胞术来检测。将从活检淋巴结样品中制备单细胞悬液(SSC)。细胞计数和活力将使用改良的Neubauer血细胞计数器和台盼蓝染色进行测量。样品将利用APC成熟标志物诸如针对CCR7、CD40、CD83、CD86、OX-40L的FITC或PE标记的抗体(可从Bio-RAD,Invitrogen,Biolegend,R&D Systems,AbCam和BD Biosciences获得)进行免疫表型分型或染色。
T细胞。引流淋巴结驻留T细胞预计由肿瘤抗原呈递和通过成熟的载有抗原的APC进行的细胞因子信号传导激活。引流淋巴结中T细胞的活化将通过测量受试者淋巴结中CD4+Th1细胞、CD8+细胞毒性T细胞、Tfh细胞的水平来确定。将从活检淋巴结样品中制备单细胞悬液(SSC)。细胞计数和活力将使用改良的Neubauer血细胞计数器和台盼蓝染色进行测量。样品将用针对CD3、CD4、CD8、CD56、CD19、CD-28、CD69、CD40L、OX-40、CD134和CD137的PE-或FITC标记的抗体(Invitrogen)进行免疫表型分型或染色，并在于LSR II流式细胞仪(BDBiosciences,San Jose,Ca)上进行分析之前用1％低聚甲醛固定，数据将使用WinList(Verity Software House,Topsham,ME)进行处理。
活化的T细胞对乳腺肿瘤组织的浸润将使用肿瘤活检组织，通过IHC或流式细胞术，通过用如上所述的CD4+Th1细胞和CD8+CTL的T细胞标志物进行免疫表型分型或染色来确定。
B细胞、浆细胞、浆母细胞。活化的B细胞对乳腺肿瘤组织的浸润将通过使用肿瘤活检组织来确定，受试者的外周血单核细胞(PBMC)将如上所述通过IHC或流式细胞术，通过用针对B细胞标志物(基于Freiburg分类)、CD19别藻蓝蛋白-Cy7、CD20-PE、IgD FITC、IgM PE-Cy5、CD38 PE-Cy7、Igκ别藻蓝蛋白、IgλPE、IgG PE-Cy5、CD20-Cy5 PE、CD27 PE、CD21别藻蓝蛋白、CD40 FITC、CD86PE-Cy5、早期活化标志物CD69 FITC(Becton Dickinson)和IgA FITC(Miltenyi Biotec)的PE或FITC标记的抗体进行免疫表型或染色来进行免疫表型分型。
经药物治疗的受试者的乳腺肿瘤组织预计具有更大的B细胞浸润，以及更多数量的浆细胞和浆母细胞，表达活化和记忆B细胞标志物，例如C80+B细胞、CD86+B细胞、CD40L活化的B细胞和/或CD20+B细胞(记忆细胞)的增加。浸润性B细胞的存在与乳腺癌患者的阳性结果相关(Tsou等人，Cancer Research.doi:10.1158/0008-5472.CAN-16-0431；Mehmoud等人Breast Cancer Res Treat 2012；132:545–53)。
NK细胞。与经安慰剂治疗的受试者相比，经药物治疗的受试者中引流淋巴结驻留NK细胞预计会被成熟的载有抗原的APC活化，并与更多数量的活化T细胞形成免疫突触。大多数淋巴结驻留NK细胞被称为CD56brightCD16dim/-NK细胞(Sta Maria等人Magn ResonInsights.2014；7:15–2)。与经安慰剂治疗的受试者相比，在经药物治疗的受试者中，活化的NK细胞预计会以更高的数量浸润到乳腺肿瘤组织中。活化的NK细胞对乳腺肿瘤组织的浸润将使用肿瘤活检组织来确定，将通过IHC或流式细胞术，通过利用针对成熟标志物诸如CD27、CD56、CD57、CD62L、CD94以及NKG2D、CD16的PE或FITC标记的抗体进行免疫表型分型或染色来就NK细胞对受试者的外周血细胞进行免疫表型分型。
经药物治疗的受试者的乳腺肿瘤预计具有更多数量的一个或多个浸润性溶细胞NK细胞亚群，例如CD57+、CD27high和CD56dimCD16+NK细胞。
在这项研究中，将如Mamessier等人(J Immunol，2013年3月1日，190(5)2424-2436)所述，对受试者的外周血样品分析CD56dimCD16+(溶细胞的)、CD56brightCD16(未成熟)和CD56-CD16+、CD56brightCD16+和CD56dimCD16-(未成熟)NK细胞亚群的水平。简言之，根据制造商的说明，利用NK细胞StemSep系统(StemCell Technology)从受试者的外周血单核细胞(PBMC)中负分离NK细胞。分选细胞的纯度和活力将被确定为>94％。将NK细胞在经辐照的PBMC(用作饲养细胞)上于补充有IL-2(1000U/ml；Proleukin；Chiron)和PHA(1/1000；Life Technologies)的RPMI 1640/10％FCS中孵育15天。在第6天和第10天，用补充有IL-2的新鲜RPMI 1640/10％FCS替换三分之一的培养基。
将200μL新鲜全血或从受试者乳腺组织、外周血和骨髓中分离的1×106个细胞与适当的PE或FITC标记的抗体在摇摆平台上孵育30分钟。用OptiLyse B(Beckman Coulter)裂解RBC。在BD FACSCanto(BD Biosciences)上分析样品。在分析样品之前和之后，随时间使用光电倍增管七色设置珠(BD Biosciences)对来自FACSCanto的荧光强度进行标准化，以防止与外部或内部因素相关的荧光强度的变化性。选通策略包括基于前向散射面积/前向散射高度参数消除双重峰(doublet)，然后消除死亡细胞(7-氨基放线菌素D+)，然后选择CD45+CD3-CD33-HLA-DR-CD56+/-细胞。
与从经安慰剂治疗的受试者获得的PBMC相比，从经药物治疗的受试者获得的PBMC预计具有更高水平的溶细胞性NK细胞(例如，CD56dimCD16+溶细胞性NK细胞、更多数量的CD57+NK细胞和/或CD27high NK细胞)。虽然外周血和脾脏中约90％的NK细胞是CD56dimCD16+NK细胞，但研究表明，NK细胞的未成熟CD56brightCD16-和CD56dimCD16-细胞亚群是从外周血中募集的，并在乳腺肿瘤中增加，表明未成熟的NK细胞优先被募集到乳腺肿瘤中(Mamessier等人)。本公开的方法预计将活化淋巴结驻留NK细胞，将自体溶细胞NK细胞从淋巴结和外周血动员到乳腺肿瘤组织，并绕过癌症患者中观察到的具有严重副作用的不良临床结果，包括血管渗漏和与使用细胞因子离体活化和扩增自体NK细胞相关的逻辑问题。
实施例4
APC至引流淋巴结的体内迁移
可在HBCx22和HBCx34患者来源的异种移植物(PDX)小鼠模型中测量APC诸如DC、M1巨噬细胞和B细胞至引流淋巴结的体内迁移。
已如前所述(Cottu等人Breast Cancer Res Treat 2012；133:595–606)从未经治疗的早期LBC建立HBCx22和HBCx34 PDX模型。两种肿瘤模型都对内分泌疗法(ET)有反应。已在患者的肿瘤和衍生的异种移植物上建立了Luminal B状态，并根据低PR/高Ki67表达进行评估。为了从这些异种移植物中建立激素抵抗模型，将在6至8个月期间用不同的ET(包括他莫昔芬)治疗荷瘤小鼠。在肿瘤逃逸时，将抗性肿瘤在瑞士裸鼠体内重新移植三个连续代，并接受在其下将出现抗性的疗法。当肿瘤成功地经历了这三代，并且表现出由对照组与治疗组之间相似的肿瘤生长模式定义的抗性表型时，就建立了抗性异种移植物。
通过用针和注射器将FITC标记的CpG-ODN 2395VaccigradeTM或ODN 2395-FITC((5’-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3’)和OX-40激动剂抗体(InvivoMab克隆OX-86，可从Bio-Cell获得)导管内注射到小鼠的乳腺管中，在这些小鼠中测量APC向引流淋巴结的体内迁移。24小时后，如实施例4所述，对腋窝下的淋巴结(腋窝淋巴结)进行解剖并通过免疫组织化学或流式细胞术测量其APC。与对照小鼠的淋巴结相比，ODN处理的小鼠的淋巴结预计显示出更高水平的完全成熟的APC(例如，CCR7+、CD40+CDOX40L+、CD80+、CD86+和其它成熟APC中的一种或多种)。
实施例5
α-1型极化生物活性剂的导管内施用
治疗方案。本研究的主要目的是评估在患有乳腺癌的受试者中与ICD化学疗法结合的α-1型极化生物活性剂(TNFα/Il-1β/IFNγ/IFNα-2b/Poly I:C)的“αDC混合物”的导管内施用的安全性和耐受性。
招募80名患有乳腺癌的妇女进行研究，并随机接受导管内安慰剂或包含αDC混合物的组合物(“药物”)。本研究的第二目的是评估(i)受试者中免疫细胞的动员、抗原呈递和(ii)通过评估治疗后的总体反应率和无进展生存期评估初步疗效。
患有乳腺癌的受试者被随机分配接受安慰剂或药物治疗。所有受试者在第1天接受ICD诱导性细胞毒性药物奥沙利铂(85mg/m2 IV)的化学治疗，输注时间超过2小时。
在用细胞毒性剂预治疗后的第1天，受试者将接受安慰剂或以表3中的剂量接受药物。
表3.αDC混合物单位剂量
Figure BDA0002747880170000681
在第8天，受试者将再次接受安慰剂或所述药物，但不接受奥沙利铂预治疗。安慰剂和药物将如上所述进行导管内施用。该给药方案将每两周重复，至少4次。在研究期结束时，受试者将再接受6至18个月的监测。
在研究给药的第1天，在使用安慰剂或药物给药之前，将检查给药前和给药后时间点：1小时、2小时、4小时、8小时和12小时时的生命体征(收缩压/舒张压、脉搏、温度、呼吸频率)。给药前和第一剂量施用后4小时进行12导联ECG。将在给药前10±1分钟收集用于生物标志物和药代动力学(PK)分析的血液样品，以建立基线。
从第8天开始，在研究期间，将在每次给药的当天(给药前)定期检查生命体征(收缩压/舒张压、脉搏、温度、呼吸频率)。还将在给药前60分钟内进行ECG、血液学、血清化学、凝血和验尿，并在研究药物给药前10±1分钟收集用于PK分析的血液样品。
每个剂量组的安全性谱和耐受性将通过临床评估、受试者报告和整个研究期间的积极随访来确定。将记录和评估所有不良事件，无论其严重程度如何。
将如实施例4所述对APC诸如DC的成熟和免疫细胞诸如T细胞、B细胞和NK细胞的动员进行测定。如实施例5所述，将测定APC向淋巴结的迁移。受试者的肿瘤尺寸将通过乳房x线照相术、CT扫描和/或MRI来测定。
实施例6
APC向引流淋巴结的迁移
在静息的DC中，TLR3和TLR9位于早期内体和其他细胞内区室，但在配体刺激下迁移至LAMP1+内体。TLR3与TLR3配体诸如双链RNA、例如Poly I:C(例如印塔罗德)结合，而TLR9与未甲基化的CpG DNA结合。在C57/Bl6小鼠中，通过导管内递送，例如通过用针和注射器将TLR3配体(可从Invivogen获得的Poly I:C HMW荧光素)或TLR9配体CpG-ODN(可从Invivogen获得的5’-tcgtcgttcggcgc:gcgccg-3’(22聚体))和CCR7配体CCL19和CCL21(可从R&D biosystems获得)注射到小鼠的乳腺管中，可以测量APC诸如DC向引流淋巴结的体内迁移。对CCR7配体进行EGFP或FITC标记，以跟踪APC在体内的迁移。24小时后，将解剖腋窝下的淋巴结(腋窝淋巴结)，并通过免疫组织化学或流式细胞术测量CCR7+APCs。
实施例7
APC向引流淋巴结的体内迁移
如上所述，在HBCx22和HBCx34患者来源的异种移植物(PDX)小鼠模型中测量APC诸如DC向引流淋巴结的体内迁移。用针和注射器将TLR9激动剂FITC标记的CpG-ODN2395VaccigradeTM或ODN 2395-FITC((5’-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3’)和OX-40激动剂抗体(可从Bio-Cell获得的InvivoMab克隆OX-86)导管内注射到PDX小鼠的一个或多个母乳管中。24小时后，解剖腋窝下的淋巴结(腋窝淋巴结)并测量CCR7+APC。
出于说明和描述的目的，已经呈现了本发明的前述论述。前述内容并不旨在将本发明限定于本文公开的一种或多种形式。尽管本发明的描述已经包括一个或多个实施方案的描述以及某些变化和修改，但在理解本公开之后，其他变化和修改也在本发明的范围内，例如，这可在本领域技术人员的技能和知识范围内。本发明旨在获得在允许的范围内包括替代实施方案的权利，包括替代的、可互换的和/或等同于所要求保护的结构、功能、范围或步骤，无论此类替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤是否在本文中公开，并且不打算公开奉献任何可专利的主题。
本文中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用整体并入。
虽然已经图示和描述了说明性实施方案，但应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变。

Claims (50)

1.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，包括向受试者的乳腺导管以导管内方式施用有效量的包含一种或多种生物活性剂的组合物，其中所述组合物诱导抗原呈递细胞的原位成熟。
2.如权利要求1所述的方法，其中包含在所述组合物中的所述一种或多种生物活性剂为选自由以下组成的组的1型极化剂：TLR激动剂(例如，TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(Ampligen)(polyI:polyC(12)U)以及用聚L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly-ICLC))；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特和瑞喹莫特(R848))；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、DAMP诸如HMGB1、细胞因子(诸如TNFα、IFNγ、I型IFN诸如IFNα或IFNβ、IL-1β、IL-2、IL-12)、趋化因子(诸如IL-1β、CCL2或CCR7配体诸如CCL19、CCL21)和生长因子、mi-RNA诸如miR-155、共刺激分子激动剂(诸如CD-40激动剂(例如抗CD40抗体诸如RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927)、OX-40激动剂(例如抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)、环糊精诸如2-羟基丙基-β-环糊精及其组合。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物诱导所述抗原呈递细胞向所述受试者的淋巴结迁移。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括效应T细胞、效应NK细胞、效应B细胞的活化或其组合。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括抗肿瘤T细胞效应性应答、NK细胞效应性应答或B细胞抗肿瘤效应性应答或其组合。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述效应T细胞包括细胞毒性CD8+T细胞、CD4+Th1细胞、记忆T细胞、Tfh细胞或其组合。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括免疫抑制的减少。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的肿瘤尺寸减小。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含有效量的生物活性剂，所述生物活性剂能够诱导内向抗原呈递细胞募集至所述受试者的乳管或乳腺组织，所述生物活性剂选自由以下组成的组：细胞因子和趋化因子(诸如IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1q、CCL1(CCR1配体)、CCL2(CCR2配体)、CCL5(CCR5配体)、CCL20(CCR6配体)、CXCL3(CXCR3配体)、CXCL4(CXCR4配体)和CXCL1(CXCR1配体)、DAMP诸如HMGB1，以及TLR激动剂(如TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U和用聚L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly-ICLC)、TLR4激动剂诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷、TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特和瑞喹莫特(R848))、TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够诱导内向抗原呈递细胞募集的1型极化剂或生物活性剂或两者是TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含有效量的复极化剂，其能够将M2-DC复极化为1型极化的DC(DC1)，所述复极化剂选自由以下组成的组：芬维A胺(4-羟基(苯基)视黄酰胺，4-HPR)；IL-12；IFNγ、miR127、miR155和miR223、纳米氧化铁(ferumoxytol)、以下物质的抑制剂：CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、精氨酸酶1(Arg1)、M2巨噬细胞清除剂受体(诸如A、B、MARCO)、组蛋白脱乙酰基酶(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6信号传导途径；IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、miRNA-146家族成员诸如(miRNA-146a)、let7家族成员(诸如let-7c)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187、CCR-CCl2轴信号传导、CCL2/MCP-1、胎盘生长因子(PlGF)(HRG)和C/EBPβ(PI3Kγ缺失)、AMPKα1(二甲双胍)、p50–p50 NFκB、NADPH氧化酶(NOX)(NOX 1和NOX 2)诸如GKT137831、Rbpj、Notch信号传导途径；CD40和CD40L、IRF1、IRF5、STAT1(诸如IFNγ、伐地美生(DMXAA))和STAT3的激活剂/激动剂、核因子κB激活剂，TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9的toll样受体(TLR)激动剂，诸如咪喹莫特、合成的未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)、(poly I:C)、C792、来菲莫特(MGN1703)、SD-101(Dynavax)、SD-101(Dynavax)、IMO-2125(Idera)；p65–p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155和miR223或其组合。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含有效量的能够减少或防止DC向巨噬细胞转化的阻断剂，其中所述阻断剂选自由以下组成的组：CSF-1抑制剂、CSF-1R抑制剂、MCP-1抑制剂、IL-4抑制剂(诸如帕考珠单抗(pascolizumab)、皮特克拉(pitakinra)和杜匹鲁单抗(dupilumab))、IL-10抑制剂、IL-13抑制剂(诸如安芦珠单抗(anrukinzumab)、来瑞珠单抗(lebrikizunab)和曲洛克木单抗(tralokinumab))、IL-4/IL-13双重抑制剂诸如杜匹鲁单抗、类前列腺素抑制剂(诸如PGE3的抑制剂)、STAT3抑制剂(诸如索拉非尼、舒尼替尼、WP1066和白藜芦醇)和STAT6抑制剂(诸如芬维A胺(4-HPR)、来氟米特、TMX264和AS1217499)或其组合。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的额外治疗剂，所述额外治疗剂选自由以下组成的组：抗激素类(例如，抗雌激素或抗雌激素受体，诸如他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、细胞毒性剂诸如烷化剂(诸如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类(诸如多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆(patupilone)、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚(glossypol)、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类、小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156、替莫唑胺、环磷酰胺、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星，米托蒽醌，奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、Tyrphostin AG 490、Janus活化激酶2/信号转导子和转录激活子-3(JAK2/STAT3)抑制剂、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨)、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、abemaciclib、帕博西尼、抗IL-10抑制剂、抗TGF-β抑制剂、检查点抑制剂(如PD-1抑制剂诸如抗PD-1抗体(例如纳武单抗)、PD-1L抑制剂诸如抗PD-1L(例如，阿特朱单抗(MPDL3280)、阿维单抗(MSB0010718C)、德瓦鲁单抗、MDX-1105)、CTLA-4抑制剂诸如抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗)、LAG-3抑制剂诸如抗LAG-3抗体(例如，IMP321、BMS-986016和GSK2831781)、OX-40激动剂诸如MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383、TIM抑制剂、IDO抑制剂)、CCR4抑制剂、FoxP3抑制剂、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继细胞疗法，或其组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述额外治疗剂包含在权利要求1至13中任一项的组合物中。
16.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述细胞毒性剂诱导肿瘤细胞死亡。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述受试者导管内施用有效量的包含TLR9激动剂和OX-40激动剂的组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述TLR9激动剂是范围为每单位剂量0.01μg/mL至20mg/mL、0.1μg/mL至15mg/mL、1μg/mL至10mg/mL、10μg/mL至5mg/mL或50μg/mL至1mg/mL的CPG-ODN，并且所述OX-40激动剂抗体的范围为每单位剂量0.01mg/mL至50mg/mL、0.1mg/mL至40mg/mL、0.5mg/mL至30mg/mL或1mg/mL至25mg/mL。
19.如前述权利要求1至18中任一项所述的方法，其中向所述受试者导管内施用有效量的包含TLR3激动剂和IFNα的组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述TLR3激动剂是范围为每单位剂量0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL或1μg/mL至20μg/m的Poly(I:C)，并且所述IFNα的范围为每单位剂量1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL或50μg/mL至150μg/mL。
21.如前述权利要求1至16中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用有效量的包含TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b和Poly(I:C)的组合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述TNFα的范围为每单位剂量0.05μg/mL至150μg/mL、0.1μg/mL至100μg/mL或0.5μg/mL至50μg/mL；IL-1β的范围为每单位剂量0.01μg/mL至20μg/mL、0.1μg/mL至15μg/mL、0.5μg/mL至10μg/mL或1μg/mL至10μg/mL；IFNγ的范围为每单位剂量1μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至80μg/mL、25μg/mL至75μg/mL或50μg/mL至75μg/mL；IFNα为每单位剂量1μg/mL至300μg/mL、10μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至200μg/mL或50μg/mL至150μg/mL；以及Poly(I:C)的范围为每单位剂量0.01μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至40μg/mL、0.5μg/mL至25μg/mL或1μg/mL至20μg/mL。
23.一种诱导受试者中抗原呈递细胞迁移的方法，所述方法包括向所述受试者的乳腺导管以导管内方式施用有效量的包含一种或多种生物活性剂的组合物，其中所述组合物中包含的至少一种生物活性剂能够诱导所述抗原呈递细胞迁移至所述受试者的淋巴结。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种生物活性剂是选自由以下组成的组的1型极化剂：TLR激动剂(例如，TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(polyAU)安普利近(polyI:polyC(12)U)和用聚L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly-ICLC)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特和瑞喹莫特(R848)；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、DAMP诸如HMGB1、细胞因子(诸如TNFα、IFNγ、I型IFN诸如IFNα或IFNβ、IL-1β、IL-2、IL-12p70)、DAMP诸如HMBG1、趋化因子(诸如IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCL19、CCL21或任何CCR7配体)和生长因子、mi-RNA诸如miR-155、共刺激分子激动剂(诸如CD-40激动剂(例如抗CD40抗体诸如RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927)、OX-40激动剂(例如抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)、环糊精诸如2-羟基丙基-β-环糊精及其组合。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中能够诱导所述抗原呈递细胞向所述受试者的淋巴结迁移的所述至少一种生物活性剂为IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCR7配体诸如CCL19和CCL21、LMP1、LMP1-CD40、LMP1-OX40激动剂、CD40L、MMP9、DAMP诸如HMBG1或其组合。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中迁移至淋巴结的所述抗原呈递细胞激活细胞毒性CD8+T细胞、CD4+Th1细胞、记忆T细胞、记忆B细胞、Thf细胞、NK细胞、B细胞或其任意组合。
28.如权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述方法在所述受试者中诱导抗肿瘤免疫应答。
29.如权利要求23至28中任一项所述的方法，其中抗肿瘤免疫应答包括通过活化的细胞毒性CD8+T细胞、CD4+Th1细胞、NK细胞、B细胞或其组合的乳腺肿瘤浸润。
30.如权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述受试者的乳腺肿瘤的尺寸得以减小。
31.一种用于诱导或增加受试者乳腺肿瘤细胞的免疫细胞死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性剂，并且导管内施用有效量的包含一种或多种生物活性剂的组合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：替莫唑胺、环磷酰胺(包括低剂量或节律性的环磷酰胺)、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、tyrphostin AG490(JAK2/STAT3抑制剂)或其组合。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种生物活性剂是选自由以下组成的组的1型极化剂：TLR激动剂(例如，TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(polyAU)安普利近(polyI:polyC(12)U)和用聚L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly-ICLC)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷)；TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特和瑞喹莫特(R848)；TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676等)、DAMP诸如HMGB1、细胞因子(诸如TNFα、IFNγ、I型IFN诸如IFNα或IFNβ、IL-1β、IL-2、IL-12)、趋化因子(诸如IL-1β、CCL2、CCL19、CCL21或任何CCR7配体)和生长因子、mi-RNA诸如miR-155、共刺激分子激动剂(诸如CD-40激动剂(例如抗CD40抗体诸如RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927)、OX-40激动剂(例如抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383)、环糊精诸如2-羟基丙基-β-环糊精及其组合。
34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述方法还包括导管内施用有效量的生物活性剂，所述生物活性剂能够诱导内向抗原呈递细胞募集至所述受试者的乳管或乳腺组织，所述生物活性剂选自由以下组成的组：细胞因子和趋化因子诸如IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1Q、CCL1(CCR1配体)、CCL2(CCR2配体)、CCL5(CCR5配体)、CCL20(CCR6配体)、CXCL3(CXCR3配体)、CXCL4(CXCR4配体)和CXCL1(CXCR1配体)、DAMP诸如HMGB1，以及TLR激动剂(如TLR3激动剂(诸如Poly(I:C)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)安普利近(polyI:polyC(12)U；和用聚L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly-ICLC)；TLR4激动剂(诸如吡喃葡聚糖基类脂A(G100)、GSK1795091、单磷酰脂质A(MPL)和基于MPL的激动剂诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)、脂多糖(LPS)和阿片类药物诸如美沙酮、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷、TLR7激动剂和TLR8激动剂，诸如咪唑并喹啉(咪喹莫特和瑞喹莫特(R848)、TLR9激动剂诸如(CpG-ODN诸如PF-3512676、(poly I:C)、C792、来菲莫特(MGN1703)、SD-101、IMO-2125等)或其组合。
35.如权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂包含奥沙利铂，并且其中包含一种或多种生物活性剂的所述组合物包含(i)TLR3激动剂poly(I:C)和IFNα；(ii)TLR9激动剂(CpG-ODN)和OX-40激动剂抗体；或(iii)TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b和Poly(I:C)。
36.如权利要求31至35中任一项所述的方法，其中向所述受试者静脉内或导管内施用细胞毒性剂。
37.如权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述受试者的肿瘤尺寸得以减小。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中以单剂量或多剂量导管内施用所述组合物。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物每天一次、每天数次(两次、三次、四次等)、隔天、每2天、每3天、每5天、每7天、每14天、每15天、每3周、每28天、每月、每季度、每6个月和每年施用所述组合物。
40.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的成像剂、染料或造影剂：钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因，诸如基于金属蛋白的MRI探针。
41.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
42.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制为脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质颗粒、囊泡或胶束。
43.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种生物活性剂包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡或胶束中。
44.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种生物活性剂包含在脂质体、微粒、微球、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、脂质颗粒、囊泡或胶束上。
45.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒。
46.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒还涂覆有细胞靶向剂。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述细胞靶向剂选自由以下组成的组：DEC-205、Clec9A(DNGR-1)、DC-SIGN、C1q、BDCA1、BDCA2、BDCA3和BDCA4。
48.一种制品，其包含根据权利要求1至47中任一项的组合物、一个或多个容器、包装材料、标签或包装插页以及任选地装置。
49.如权利要求48所述的制品，其中所述装置是针和注射器、套管、导管、微导管、渗透泵或封装装置。
50.如权利要求48或权利要求49所述的制品，所述制品还包含选自由以下组成的组的额外治疗剂：检查点抑制剂、抗激素类(例如，抗雌激素或抗雌激素受体，诸如他莫昔芬、顺式-他莫昔芬、内西芬、去甲基他莫昔芬、拉索昔芬、雷洛昔芬、苯并噻吩、苯卓昔芬、阿佐昔芬、米泼昔芬、左美洛昔芬、屈洛昔芬、氯米芬、艾多昔芬、托瑞米芬、EM652和ERA-923、氟维司群、ARN-810或CH498、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)、甾类、蒽环类、甲状腺激素替代药物、细胞毒性剂诸如烷化剂(诸如替莫唑胺和环磷酰胺)、蒽环类(诸如多柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星、伊达比星等)、蒽二酮类诸如米托蒽醌、铂类药物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奥马铂、恩洛铂等)、紫杉烷类(诸如紫杉醇)、抗有丝分裂药物、博莱霉素、硼替佐米、帕图匹隆、钙网蛋白、广谱细胞死亡剂诸如棉酚、茶多酚诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、7-溴靛玉红-3’-肟(7BIO)-、致癌性RAS、大环内酯类、小檗碱(一种源自植物的异喹啉生物碱)、UMI-77、雷公藤内酯醇和塞林诺尔、胞外核苷酸酶的广谱抑制剂，诸如ARL67156、替莫唑胺、环磷酰胺、马磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星，米托蒽醌，奥沙利铂、紫杉醇、博莱霉素、硼替佐米、溶瘤病毒、帕图匹隆、Tyrphostin AG 490(JAK2/STAT3抑制剂)、DNA低甲基化剂(诸如阿扎胞苷或地西他滨)、胸苷酸靶向药物(诸如多西他赛、吉西他滨)、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗-艾美坦辛、帕妥珠单抗、abemaciclib、帕博西尼、抗IL-10抑制剂、抗TGF-β抑制剂、检查点抑制剂(诸如抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4抑制剂、抗FoxP3抑制剂、细胞疗法诸如嵌合抗原受体/T细胞(CAR-T)疗法和其他过继细胞疗法，或其组合。
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