CN110590905A - 一种降血糖六肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降血糖六肽及其应用，所述合成六肽的氨基酸序列如下所示：Met‑Ser‑Tyr‑Leu‑Pro‑Arg，缩写为MSYLPR，分子量765.94Da，纯度为98.46%。本发明的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。体外α‑葡萄糖苷酶和二肽基肽酶4(DPP‑4)抑制活性检测表明，该肽对两种酶都有显著抑制作用，对α‑葡萄糖苷酶的50%抑制浓度（IC50）为1.1108mg/mL(1.4503μmol/ml)，对DPP‑4的50%抑制浓度（IC50）为1.4564mg/mL(1.9015μmol/ml)。本发明提供一种具有潜在体外降血糖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。

Description

一种降血糖六肽

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种降血糖六肽。

背景技术

糖尿病是一种慢性病，是由于体内胰岛素不足引起的蛋白质、脂肪、碳水 化合物代谢紊乱，主要特点是慢性高血糖。研究发现有许多天然的抗糖尿病有 效成分，譬如：银杏叶提取物、植物多糖等。生物活性多肽的降血糖方面的研 究较少。已有的一些研究表明，生物活性肽能有效改善糖尿病的作用。例如， 在王军波等的研究中，海洋胶原肽能够缓解高胰岛素血症大鼠的胰岛β细胞的 结构损伤，增加颗粒的分泌，减少脂滴的形成，显著提高胰岛素的生物学活性； 显著降低的空腹胰岛素水平，对空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作 用。在黄凤杰等的研究中，鲨鱼肝活性肽S-8300有抗氧化作用，通过清除自 由基保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢，延缓胰岛β细胞的衰竭，在一定程度上 能够治疗糖尿病。

人体中淀粉等糖类物质的消化吸收，需要依赖α-葡萄糖苷酶，抑制这种 关键酶的活性便能减缓碳水化合物降解为单糖的速度，以达到调控餐后血糖升 高过快的目的。二肽基肽酶4(DPP-4)是一种由766个氨基酸组成跨膜蛋白/多 肽酶，相对分子质量为110kDa，在人体中的作用是分解蛋白质/多肽。一种被 DPP-4分解的多肽叫做GLP-1，它可以通过刺激胰岛素、抑制升糖素、抑制胃 排空和让胰岛β细胞重生的方式来降低血糖。基于此，通过抑制DPP-4的活 性，可以较好地达到治疗糖尿病。目前，研究DPP-4抑制剂是治疗糖尿病的 主要方向之一。

因此，本发明提供了一种降血糖六肽，该合成多肽具有降血糖能力。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种降血糖六肽。

本发明选取α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶4(DPP-4)为研究对象，测定合成 肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外降血糖活性的合成多 肽，可应用于生物制药领域。

本发明提供的一种降血糖六肽，该六肽的氨基酸序列为 Met--Ser--Tyr--Leu--Pro—Arg，缩写为MSYLPR。

进一步地，所述六肽MSYLPR对α-葡萄糖苷酶有抑制活性，IC50值为 1.1108mg/mL。

进一步地，所述六肽MSYLPR对二肽基肽酶4有抑制活性，IC50值为 1.4564mg/mL。

本发明所述的合成多肽缩写为MSYLPR，分子量765.94Da，纯度为98.46％， 序列为：Met-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg。其中，

Met表示英文名称为Methionine，中文名称为蛋氨酸的氨基酸的相应残基；

Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；

Tyr表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基；

Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；

Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；

Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；

本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理 的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分 子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作 用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后， 去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加 氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。

本发明通过研究该六肽对α-葡萄糖苷酶和DPP-4的抑制作用来评价其降 血糖作用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明首次合成了该肽，并且检测了合成多肽对α-葡萄糖苷酶和二肽基 肽酶4(DPP-4)的抑制活性，所述合成多肽具有一定的降血糖能力。

附图说明

图1a为合成多肽Met-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg的HPLC图。

图1b为合成多肽Met-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg的MS图。

图2a为合成多肽Met-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

图2b为合成多肽Met-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg对DPP-4的抑制活性。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不 限于此。

多肽固相合成

选用高分子树脂(中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列 Met-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg的特征，先将Met的羧基以共价键的形式与一个树脂 相连，然后Met的氨基和Ser的羧基缩水反应，处理后，再添加Tyr，Ser的 氨基和Tyr的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Arg氨基酸 后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为 Phenomenex C18，尺寸4.6*150mm，流动相A:含有0.1％三氟乙酸(TFA)的 乙腈；流动相B:含有0.1％TFA的水；25min内B相由95.0％下降到30.0％， 流速1.0mL/min，检测波长214nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品， 要求纯度达到98％以上(如图1a所示)，并经MS鉴定结构(如图1b所示)。

合成多肽对α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性

1试剂的配制

1)0.2M磷酸缓冲液：称取Na₂HPO₄ 2.84g、KH₂PO₄ 2.72g分别溶于100mL 蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至pH＝6.9，搅拌过 程用pH计测量实时酸碱度。

2)P-NPG溶液：底物溶液，称取0.03765g p-NPG，溶于25mL蒸馏水中。

3)0.2U/mLα葡萄糖苷酶液：吸取已分装的酶液(200U/ml)5μL，用蒸馏 水配成5mL。

4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同浓度的样品溶液(0-10mg/mL)， 溶剂为水。

5)0.2M Na₂CO₃：称取0.848g Na₂CO₃，溶于40mL蒸馏水中。

2实验步骤

1)于96孔板中反应，实验组、背景组、对照组、阳性对照组添加试剂如表1 所示，于37℃摇床反应20min。

表1样品的添加量

2)各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去 除，加入140μL Na₂CO₃溶液终止反应。

3)用酶标仪于405nm测吸光度。

4)抑制率—浓度曲线的绘制：所得数据用OriginPro 9.1软件作非线性拟合， 选择Origin Basic Function范围内的Logistic函数，置信区间选择95％，输出 数据采用Find Y from X。做出抑制率—浓度曲线，可求出IC50值。

Logistic函数公式如下：

A₁为y的最小值，A₂为y的最大值，P＝3,X0为y＝50％处x的值。

合成多肽对DPP-4的体外抑制活性

用Sigma DPP-4抑制剂筛选试剂盒(MAK203)检测。

1试剂的配制

1)底物溶液：原200μL，用缓冲液稀释至2.5mL，分装使用。

2)酶液：原100μL，用缓冲液稀释至5mL，分装使用。

3)阳性抑制剂(西格列汀)：原50μL，用缓冲液稀释至0.5mL，分装使用。

4)样品溶液，用缓冲液配制成梯度浓度样品溶液。

2实验步骤

1)反应容器为黑色96孔板，孔板中加入50μL酶溶液和25μL样品溶液， 对照组用缓冲液代替底物溶液，阳性对照组用阳性抑制剂代替样品溶液，37℃ 摇床反应10min。

2)加入25μL底物溶液，反应后的15-30min期间，每隔1min测量一次荧 光FLU(FLU，λex＝360/λem＝460)。作出荧光值--时间(min)曲线，用以下 式子求出曲线斜率。其中，FLU2和FLU1分别为同一孔中最后一次和第一次 测量的荧光值。

斜率＝(FLU2–FLU1)/(T2–T1)＝FLU/minute

相对抑制率(％)＝(对照组斜率–实验组斜率)/对照组斜率×100％

3)抑制率—浓度曲线的绘制：所得数据用OriginPro 9.1软件作非线性拟合， 选择Origin Basic Function范围内的Logistic函数，置信区间选择95％，输出 数据采用Find Y from X。做出抑制率—浓度曲线，可求出IC50值。

Logistic函数公式如下：

A₁为y的最小值，A₂为y的最大值，P＝3,X0为y＝50％处x的值。

应用实施例1

由图1a显示的峰面积百分比可知，六肽的纯度为98.46％，符合合成肽的 纯度要求。于96孔板中添加实验组(六肽(2mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷 酶酶液10μL)、背景组(六肽(2mg/mL)20μL与缓冲液10μL)、对照 组(缓冲液10μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、阳性对照组(阿卡波糖溶 液(2mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)，于37℃摇床反应20min。 各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除， 加入140μL Na₂CO₃溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图 2a可知，六肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是94.15％，约为阿卡波糖抑制率(60.13％)的1.6倍。

应用实施例2

由图1a显示的峰面积百分比可知，六肽的纯度为98.46％，符合合成肽的 纯度要求。于96孔板中添加实验组(六肽(1.5mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷 酶酶液10μL)、背景组(六肽(1.5mg/mL)20μL与缓冲液10μL)、对照 组(缓冲液10μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、阳性对照组(阿卡波糖溶 液(1.5mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)，于37℃摇床反应20min。 各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除， 加入140μLNa₂CO₃溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图 2a可知，六肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是78.72％，约为阿卡波糖抑制率 (48.67％)的1.6倍。

应用实施例3

由图1a显示的峰面积百分比可知，六肽的纯度为98.46％，符合合成肽的 纯度要求。于96孔板中添加实验组(六肽(1mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷 酶酶液10μL)、背景组(六肽(1mg/mL)20μL与缓冲液10μL)、对照 组(缓冲液10μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、阳性对照组(阿卡波糖溶 液(1mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)，于37℃摇床反应20min。 各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除， 加入140μL Na₂CO₃溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图 2a可知，六肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是39.24％，与阿卡波糖抑制率 (40.22％)相近。

应用实施例4

由图1a显示的峰面积百分比可知，六肽的纯度为98.46％，符合合成肽的 纯度要求。于黑色96孔板中加入50μL酶溶液和25μL六肽溶液(4mg/mL)， 对照组用缓冲液(DPP-4溶液)代替底物溶液，37℃摇床反应10min。加入25 μL底物溶液，反应后的15-30min期间，每隔1min测量一次FLU(FLU， λex＝360/λem＝460)，计算相对抑制率。由图2b可知，六肽对DPP-4的相 对抑制率是77.92％，96.42

应用实施例5

由图1a显示的峰面积百分比可知，六肽的纯度为98.46％，符合合成肽的纯度 要求。黑色96孔板中加入50μL酶溶液和25μL六肽溶液(2mg/mL)，对 照组用缓冲液(DPP-4溶液)代替底物溶液，37℃摇床反应10min。加入25 μL底物溶液，反应后的15-30min期间，每隔1min测量一次FLU(FLU， λex＝360/λem＝460)，计算相对抑制率。由图2b可知，六肽对DPP-4的抑 制率是74.35％。

应用实施例6

由图1a显示的峰面积百分比可知，六肽的纯度为98.46％，符合合成肽的纯度 要求。黑色96孔板中加入50μL酶溶液和25μL六肽溶液(1mg/mL)，对 照组用缓冲液(DPP-4溶液)代替底物溶液，37℃摇床反应10min。加入25 μL底物溶液，反应后的15-30min期间，每隔1min测量一次FLU(FLU， λex＝360/λem＝460)，计算相对抑制率。由图2b可知，六肽对DPP-4的抑 制率是39.04％。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本 发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等 均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种降血糖六肽

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 1

Met Ser Tyr Leu Pro Arg

1 5

Claims (5)

1.一种降血糖六肽，其特征在于，该六肽的氨基酸序列为Met--Ser--Tyr--Leu--Pro—Arg，缩写为MSYLPR。

2.根据权利要求1所述的一种降血糖六肽，其特征在于，所述六肽MSYLPR对α-葡萄糖苷酶有抑制活性，IC50值为1.1108mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种降血糖六肽，其特征在于，所述六肽MSYLPR对二肽基肽酶4有抑制活性，IC50值为1.4564mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种降血糖六肽，其特征在于，所述六肽MSYLPR的分子量为765.94Da，纯度为98.46%。

5.根据权利要求1所述的一种降血糖六肽的应用。