CN108976291B - 一种改善糖尿病和老年性痴呆的十六肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改善糖尿病和老年性痴呆的十六肽，该十六肽的氨基酸序列如下所示：Arg‑Asn‑Pro‑Phe‑Val‑Phe‑Ala‑Pro‑Thr‑Leu‑Leu‑Thr‑Val‑Ala‑Ala‑Arg，缩写为RNPFVFAPTLLTVAAR，分子量1773.11Da，纯度为95.2%。本发明的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。体外二肽基肽酶4(DPP‑4)抑制活性检测表明，本发明的多肽对DPP‑4有显著抑制作用，其50%抑制浓度（IC50）为181.16μg/mL。本发明提供一种具有体外DPP‑4抑制活性的所述十六肽，可用于改善糖尿病和老年性痴呆的。

Description

一种改善糖尿病和老年性痴呆的十六肽
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种改善糖尿病和老年性痴呆的十六肽。
背景技术
糖尿病是一种慢性病，是由于体内胰岛素不足引起“蛋白质”、“脂肪”、“碳水化合物”等物质代谢紊乱的疾病，主要特点是慢性高血糖。研究发现有许多天然的抗糖尿病有效成分，譬如：银杏叶提取物、植物多糖等。然而生物活性多肽的降血糖方面的研究较少。已有的一些研究表明，生物活性肽能有效改善糖尿病的作用。例如，在王军波等的研究中，海洋胶原肽能够缓解高胰岛素血症大鼠的胰岛β细胞的结构损伤，增加颗粒的分泌，减少脂滴的形成，显著提高胰岛素的生物学活性；显著降低的空腹胰岛素水平，对空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作用。在黄凤杰等的研究中，鲨鱼肝活性肽S-8300有抗氧化作用，通过清除自由基保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢，延缓胰岛β细胞的衰竭，在一定程度上能够治疗糖尿病。
二肽基肽酶4(DPP-4)是一种由766个氨基酸组成跨膜蛋白/多肽酶，相对分子质量为110kDa，在人体中的作用是分解蛋白质/多肽。一种被DPP-4分解的多肽叫做胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，它可以通过刺激胰岛素、抑制升糖素、抑制胃排空和让胰岛β细胞重生的方式来降低血糖。基于此，通过抑制DPP-4的活性，可以较好地达到治疗糖尿病。目前，研究DPP-4活性抑制剂是治疗糖尿病的主要方向之一。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年性痴呆，是一种严重的、慢性神经退行性疾病，以记忆和认知功能的进行性减退为主要临床症状，最终导致痴呆和死亡。它严重影响老龄人群的健康和生存质量，也给患者的家庭和社会带来沉重的负担。AD的主要病理特征是β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque，SP)和神经细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)。最近有研究发现DPP-4抑制剂(利格列汀)可以减少Aβ诱导的SK-N-MC细胞内神经毒性、氧化损伤和细胞凋亡，激活Akt，抑制GSK-3β的活性，从而提高胰岛素信号通路的活性，起到保护神经的作用。在动物模型中，DPP-4抑制剂(维达列汀和沙格列汀)可以提高外周与中枢血液中GLP-1的浓度，改善小鼠学习和记忆能力。因此，DPP-4抑制剂可通过提高GLP-1水平,改善脑内GLP-1信号通路和脑内糖代谢,提高AD小鼠学习记忆能力,改善神经退行性病变症状。
发明内容
本发明选取二肽基肽酶4(DPP-4)为研究对象，测定合成肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外DPP-4抑制活性的合成多肽，可应用于改进糖尿病和保护阿尔茨海默病(AD)样神经退行性改变。
本发明提供的一种改善糖尿病和老年性痴呆的十六肽，该十六肽的氨基酸序列为Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg，缩写为RNPFVFAPTLLTVAAR。
进一步地，所述十六肽在250-1000μg/mL浓度范围内，对DPP-4的抑制率是69％-108％。
本发明所述十六肽RNPFVFAPTLLTVAAR，分子量1773.11Da，纯度为95.2％，序列为：Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg。其中，
Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；
Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Phe表示英文名称为Phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Val表示英文名称为Valine，中文名称为颉氨酸的氨基酸的相应残基；
Phe表示英文名称为Phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；
Val表示英文名称为Valine，中文名称为颉氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。
进一步地，所述十六肽RNPFVFAPTLLTVAAR对DPP-4的50％抑制浓度(IC50)为181.16μg/mL。
本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
本发明通过研究合成肽对DPP-4的抑制作用来确定其对糖尿病和老年性痴呆的保护作用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明首次合成了该肽，并且检测了合成多肽对二肽基肽酶4(DPP-4)的抑制活性，所述合成多肽对糖尿病和老年性痴呆具有潜在的保护作用。
附图说明
图1a为合成多肽Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg的HPLC图。
图1b为合成多肽Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg的MS图。
图2a～图2c为合成多肽Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg不同浓度对DPP-4的抑制活性对比图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此，需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。
多肽固相合成
选用高分子树脂(中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg的特征，先将Arg的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Asn的氨基和Arg的羧基缩水反应，处理后，再添加Pro，Asn的氨基和Pro的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Arg氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Phenomenex C18，尺寸4.6*150mm，流动相A:含有0.1％(体积浓度)三氟乙酸(TFA)的水；流动相B:含有0.09％(体积浓度)TFA的溶液(80％乙腈+20％水)；20min内B相由14.0％上升到24.0％，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，纯度达到95％以上(本实例95.2％)，并经MS鉴定结构(如图1a、图1b所示)。
合成多肽对DPP-4的体外抑制活性
用DPP-4试剂盒检测。
1试剂的配制
1)底物溶液：共200μL，用缓冲液稀释至2.5mL，分装使用。
2)酶液：共100μL，用缓冲液稀释至5mL，分装使用。
3)阳性抑制剂(西格列汀)：共50μL，用缓冲液稀释至0.5mL，分装使用。
4)样品溶液，用缓冲液配制成梯度浓度样品溶液。
2实验步骤
1)反应容器为黑色96孔板，孔板中加入25μL底物溶液和25μL样品溶液，对照组用缓冲液代替底物溶液，阳性对照组用阳性抑制剂代替样品溶液，37℃摇床反应10min。
2)加入25μL底物溶液，反应后的15～30min期间，每隔1min测量一次FLUFLU(荧光峰)(FLU，λex＝360/λem＝460)。
斜率＝(FLU2–FLU1)/(T2–T1)＝FLU/minute
相对抑制率(％)＝(对照组斜率–实验组斜率)/对照组斜率×100％。
应用实施例1
黑色96孔板中加入25μL底物溶液和25μL十六肽溶液(250μg/mL)，对照组用缓冲液(DPP-4溶液)代替底物溶液，阳性对照组用西格列汀溶液(250μg/mL)，37℃摇床反应10min。加入25μL底物溶液，反应后的15～30min期间，每隔1min测量一次FLU(FLU，λex＝360/λem＝460)，计算相对抑制率。由图2a可知，十六肽对DPP-4的抑制率是69％。
应用实施例2
黑色96孔板中加入25μL底物溶液和25μL十六肽溶液(500μg/mL)，对照组用缓冲液(DPP-4溶液)代替底物溶液，阳性对照组用西格列汀溶液(500μg/mL)，37℃摇床反应10min。加入25μL底物溶液，反应后的15～30min期间，每隔1min测量一次FLU(FLU，λex＝360/λem＝460)，计算相对抑制率。由图2b可知，十六肽对DPP-4的抑制率是93％。
应用实施例3
黑色96孔板中加入25μL底物溶液和25μL十六肽溶液(1000μg/mL)，对照组用缓冲液(DPP-4溶液)代替底物溶液，阳性对照组用西格列汀溶液(1000μg/mL)，37℃摇床反应10min。加入25μL底物溶液，反应后的15～30min期间，每隔1min测量一次FLU(FLU，λex＝360/λem＝460)，计算相对抑制率。由图2c可知，十六肽对DPP-4的抑制率是108％，高于同等条件下西格列汀的抑制率98％。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种改善糖尿病和老年性痴呆的十六肽
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 十六肽(RNPFVFAPTLLTVAAR)
<400> 2
Arg Asn Pro Phe Val Phe Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Ala Ala Arg
1 5 10 15

Claims (2)

1.一种十六肽在制备抑制DPP-4药物中的应用，该十六肽的氨基酸序列为Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg，缩写为RNPFVFAPTLLTVAAR，其特征是所述十六肽对DPP-4的50％抑制浓度(IC50)为181.16μg/mL。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述十六肽在250-1000μg/mL浓度范围内，对DPP-4的抑制率是69％-108％。
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