KR102003619B1 - 제2형 진성 당뇨병 및 이의 합병증의 치료를 위한 펩티드 - Google Patents

제2형 진성 당뇨병 및 이의 합병증의 치료를 위한 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생명 공학기술에 관한 것이다. 식 H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-As-Leu-Ser-Lys-Gln-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH를 갖는 엑세나타이드 유사체(exenatide analogue)가 제시되어 있다. 본 발명은 진성 당뇨병을 치료하고 예방 조치를 취할 뿐만 아니라 당뇨병성 신경병증, 근위축증 및 각막내피염과 같은 제2형 진성 당뇨병 합병증을 치료하고 예방 조치를 취할 수 있다.

Description

제2형 진성 당뇨병 및 이의 합병증의 치료를 위한 펩티드{PEPTIDE FOR TREATMENT OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS AND ITS COMPLICATIONS}
본 발명은 진성 당뇨병(diabetes mellitus)의 치료 및 예방, 뿐만 아니라 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 근위축증(muscular dystrophy) 및 각막내피염(endotheliopathy)과 같은 제2형 진성 당뇨병 합병증의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있는, 하기 식(formula)을 갖는 신규한 엑세나타이드 유사체(exenatide analogue)에 관한 것이다:
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ar-Leu-Phe-Ile-Glu-T-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH.
본 발명은 의학 및 약학에 관한 것으로서, 제2형 진성 당뇨병, 뿐만 아니라, 당뇨병성 신경병증, 근위축증 및 각막내피염과 같은 이의 합병증의 예방 및 치료를 위한 약품(drug product)으로서 사용될 수 있다.
제2형 진성 당뇨병(DM 2 또는 비-인슐린-의존성 진성 당뇨병)은 주로 탄수화물 대사의 방해에서 나타나는 만성의 다체계적 질병(multisystemic desease)이다. 고혈당증(hyperglycemia)은 비정상적인 변화의 결과로서 발달한다. 게다가, 인슐린 발생의 원인이 되는 분화된 췌장샘 세포의 기능 장애를 나타낸다. 제2형 진성 당뇨병에 걸린 환자의 치사율의 주요 원인은 첫째로 대혈관 합병증(관상동맥, 대뇌동맥 및 말초동맥의 손상)의 발달이다. 또한, DM 2는 대사 증후군(metabolic syndrome)(인슐린-내성 또는 증후군 X)의 발달을 위한 주요 구성요소들 중 하나이다[1]. 최근에, DM 2가 알츠하이머 치매 발달의 병리학적 마커(pathological marker)라는 것을 나타내는 여러 관찰들이 더욱 많아지고 있다[2].
2013년말 현재 WHO 데이타에 따르면, 전 세계에서 3억 4천7백만명의 사람들이 당뇨병으로 고통을 당하고 있다[3]. 2004년에는 혈액 중의 높은 당 함량으로 인하여 3백4십만명의 사람들이 사망하였다[4]. 당뇨병 합병증에 의해 야기된 치명적인 경우(fetal case)의 수는 2010년에 동일한 수준으로 유지되었다[5]. WHO 예측에 따르면, 당뇨병은 2030년까지 7번째로 중요한 치사율의 원인이 될 것이다[4]. 선진국에서 제1형 DM이 환자의 10 내지 15%에서 발견될 수 있으며, 제2형 DM이 85 내지 90%에서 발견될 수 있는 것으로 여겨진다. 그러나, 최근에, 선진국에서 제2형 DM의 빈도는 매우 빠르게 성장하는 반면, 제1형 DM에 걸린 환자들의 수는 유의미하게 변하지 않았다. 최신 WHO 데이타에 따르면, 전세계에서 제1형 DM 및 제2형 DM의 비율은 제2형 DM의 빈도의 증가 쪽으로 변하였다[5].
진성 당뇨병의 가장 빠르고 가장 흔한 합병증은 작은 혈관(혈관의 맥관(vasa vasorum), 신경혈관(vasa nervorum))의 손상과 관련된 신경계 장애에 의해 특징되는 당뇨병성 신경병증이다[6]. 이러한 합병증이 작업능력 감소(work decrement)를 야기시킬 뿐만 아니라, 환자의 심각한 불능화 손상 및 사망의 발달을 종종 야기시킨다. 병리학적 과정은 모든 신경 섬유, 즉, 감각 신경 섬유, 운동 신경 섬유 및 식물(vegetal) 신경 섬유에 영향을 미친다. 다른 저자의 데이타에 따르면, 당뇨병성 신경병증은 진성 당뇨병에 걸린 환자들 중 90 내지 100%에서 관찰될 수 있다. 진성 당뇨병으로 인한 신경계 손상의 빈도는 질병의 기간에 직접적으로 비례하며, 일부 경우에, 이는 당뇨병의 주요 임상 증상의 출현에 앞선다. 이에 따라, 진성 당뇨병이 발병된 환자들 중 5%는 질병의 과정에서 성장하는 신경계 손상의 증상을 가지고 25년의 당뇨병 기간까지 60%에 도달한다.
진성 당뇨병으로 인해 신경계의 모든 부분이 병에 걸린다: 중추신경계(뇌병증(encephalopathy), 척수병(myelopathy)), 말초 신경계(다발신경병증 및 단일신경병증), 및 말초 식물 신경계(자율 신경병증).
상술된 것을 고려하여, 일상업무에서 제2형 당뇨병 자체 및 이의 합병증의 치료를 위한 약품(medical product)의 개발 및 구현(implementation)이 촉망된다는 것은 명백하다.
제2형 진성 당뇨병 및 이의 합병증의 약물 치료는 현재 여러 그룹으로 조합되는 항고혈당 약물을 기초로 한 것이다:
- 제1 그룹은 두 가지 타입의 약품, 즉 티아졸리딘디온(로시글리타존 및 피오글리타존), PPARγ-효능제, 핵 감마 수용체 및 비구아니드의 자극제(메트포르민, 시오포르, 아반다메트, 바고메트, 글루코파지, 메트포감마)를 포함한다. 이러한 그룹의 약품은 인슐린에 대한 세포의 민감성을 향상시키고, 인슐린 내성 및 장관 세포에 의한 글루코오스 피흡수성(glucose absorbability)을 감소시키며, 이는 이러한 것들이 종종 과체중의 사람들에게 처방되는 이유이다.
- 제2 그룹의 항고혈당 약물은 또한, 두 가지 타입의 약품, 즉, 자체 인슐린의 발생을 자극시켜 이의 효능을 증가시키는 2차 설포닐우레아(마니닐, 디아베톤, 아마릴, 글루레노름, 글리비네스(Glibinese)-지연제(retard)), 및 췌장샘에 의해 인슐린 합성을 향상시키고 또한 식후 피크(postprandial peak)(식사 후 당 수준의 증가)를 감소시키는 나테글리나이드(스타르릭스))를 포함한다.
- 제3 그룹의 항고혈당 약물은 식사로 수용된 다당류를 분열시키는 알파글루코시다아제 효소를 차단함으로써 장관 세포에 의한 글루코오스 피흡수성을 감소시키는 아카르보오스(글루코바이)를 포함한다.
DM 2 합병증의 치료 및 예방에서의 신규한 개발은 직접 인크레틴 미메틱, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체의 효능제, 및 타입 4의 디펩티딜 펩티다아제의 간접 블로킹제(indirect blocking agent)를 포함한다. 직접 인크레틴 미메틱은 엑세나타이드(Byetta), 리라글루타이드(liraglutide)(Viktoza), 알비글루타이드(albiglutide) 및 둘라글루타이드(dulaglutide)와 같은 약물을 포함한다. 간접 블로킹제는 시타글립틴(Sitagliptin)(Januvia), 삭사글립틴(Saxagliptin)(Onglyza), 리나글립틴(Linagliptin)(Trajenta) 및 빌다글립틴(Vildagliptin)(Galvus)을 포함한다.
인크레틴-유사 약품 그룹이 특별한 관심을 나타내고 있다.
GLP-1과 같은 인크레틴은 베타 세포 작용성을 개선시키고, 글루카곤의 분비의 적절치 않은 증가를 억제하고, 인슐린의 글루코오스-의존성 분비의 증가를 유발시킨다. 인크레틴 수용체(GLP-1R)의 미메틱(mimetic)인, 엑세나타이드(엑센딘-4)는 비-인슐린-의존성 진성 당뇨병 및 이의 합병증의 효율 및 예방적 치료(preventive treatment)가 사람에 대한 임상 시험에 의해 입증된 약물들 중 하나이다.
엑세나타이드는 엑센딘-4로서 최초로 알려진 폴리펩티드이며, 헬로데르마 수스펙텀 도마뱀(Heloderma suspectum lizard)의 독으로부터의 추출 방법 및 (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG-PSSGAPPPS-NH2)의 아미노산 서열은 1992년 4월에 최초로 공개되었다[7]. 인크레틴 펩티드의 대표예로서, 엑센딘-4는 넓은 효능 범위, 예를 들어, 인슐린 분비에 있어서 글루코오스-의존성 증가, 글루코오스 처리 개선, 식욕의 하향-조절, 위로부터의 식사 움직임(meal movement)의 둔화, 등을 갖는다.
고혈당증과 함께 제2형 진성 당뇨병에 걸린 환자에게 엑세나타이드의 사용은 글루카곤의 과도한 분비를 억제하지만, 엑세나타이드는 저혈당증에 대한 규칙적인 글루카곤 반응에 영향을 미치지 못한다.
메트포르민, 및/또는 설포닐우레아를 기초로 한 약품과 병용한 엑세나타이드 치료법은 금식 상태에서 혈액 중 글루코오스 함량, 혈액 중 식후 글루코오스 함량, 뿐만 아니라, 글리코실화된 헤모글로빈 수치(HbA1c)의 감소를 야기시켜, 이러한 환자들에 대한 혈당 조절(glycemic control)을 개선시킨다.
엑세나타이드의 사용 분야는 공지되어 있다. 이에 따라, USA 특허 [8]에는 GLP-1 내인성 호르몬의 효율을 초과하는 효율을 갖는 인슐린 발생의 자극을 위한 엑세나타이드의 용도가 기재되어 있다. 본 발명의 설명에서 제공된 예들은 엑세나타이드가 진성 당뇨병의 치료를 위해 효율적이라는 것을 입증하고 있다.
엑세나타이드의 다른 치료 효과, 즉, 체중 감소[9], 위 운동 활성 감소[9] 및 위 배출 감소의 둔화[10, 11], 뿐만 아니라, 엑세나타이드의 근수축 및 이뇨 효과[12, 13, 14]가 후에 나타났다. 다낭 난소(polycystic ovary)의 치료[15, 16, 17], 신장병(nephropathy)의 치료 및 예방[18, 19], 심부정맥(cardiac arrhythmia)의 예방 및 치료[20]를 위한, 골수 세포 분화[21]를 위한, 임산부의 진성 당뇨병의 치료[22. 23], 트리글리세라이드 수준의 조절 및 이상지질혈증의 치료[24, 25], 글루카곤 분비의 억제[26, 27]를 위한, 비-인슐린 생성 세포를 인슐린 생성 세포로의 분화[28]를 위한 엑세나타이드의 용도가 기재되어 있다. 출원[29]에는 중추신경계에 영향을 미치게 하기 위한 엑세나타이드, 이의 효능제 및 길항제의 용도가 기재되어 있다. 특허[30, 31]에는 식품 섭취의 감소를 위한 엑세나타이드 및 인크레틴 수용체의 다른 길항제의 용도가 기재되어 있다. 출원[32]에는 안정화된 엑세나타이드 조성물이 기재되어 있다. 특허[33, 34]에는 엑세나타이드(엑센딘 및 이의 효능제)의 신규한 적용이 기재되어 있다.
상기에 언급된 모든 양태들은 DM 2의 예방 및 치료를 위한 엑세나타이드의 높은 효율을 명시하고 있다. 그러나, 당뇨병성 신경병증, 근위축증 및 각막내피염과 같은 제2형 진성 당뇨병에서 일어나는 합병증들은 엑세나타이드 및 모든 다른 상술된 항고혈당 약물(antihyperglycemic drug) 둘 모두로의 치료 동안 해결되지 않는다.
그것은 당뇨병성 신경병증, 근위축증 및 각막내피염과 같은, 제2형 진성 당뇨병의 과정에서 일어나는 합병증들의 치료에서 효과적인 엑세나타이드의 신규한 유사체를 생성시키기 위한 과제가 존재하는 이유이다.
청구된 발명과 가장 가까운 유사 문헌은 프로토타입으로서 선택된 미국특허 제5424286호[8]로서, 여기에서, 인슐린 발생의 자극을 위한 인크레틴 미메틱(incretin mimetic)의 사용이 청구된 발명과 유사하다.
알려진 발명의 주요 단점은 당뇨병성 신경병증, 근위축증 및 각막내피염과 같은 진성 당뇨병의 이러한 합병증의 예방 및 치료를 가능하게 하는 인크레틴 미메틱(엑세나타이드)의 치료 효과가 존재하지 않는다는 것이다.
이에 따라, 청구된 발명의 기술적 결과는 당뇨병성 신경병증, 근위축증 및 각막내피염과 같은 이러한 당뇨병 합병증들의 예방 및 치료일 것이다.
청구된 발명의 기술적 결과는 당뇨병성 신경병증, 근위축증 및 각막내피염의 예방 및 치료를 가능하게 하는 치료 효과를 갖는, 하기 식에 따른 조성물의 사용에 의해 달성된다:
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH
본 발명은 하기 도면에서 구현된다.
도 1은 시험 생성물의 영향 하에서 말초 혈액 중의 글루코오스 농도(M ± m, mmol/1)이다. 첫번째 컬럼은 생성물 주사의 개시 전의 포인트이며, 두번째 컬럼은 치료 마지막날(80일)이다.
* - 시험 생성물이 투여된 그룹 및 대조군에서의 통계적으로 유의미한 차이, p < 0.05를 갖는 본페로니 시험(Bonferroni test);
# - 기준선과 치료 마지막날(생성물 주사 80일째 날) 사이의 그룹에서의 통계적으로 유의미한 차이, p < 0.05를 갖는 t-시험.
도 2는 알코올 신경병증에 걸린 랫트에서 촉각 이질통증(tactile allodynia)에 대한 10 ppb의 용량에서의 D-펩티드의 영향이다. 동물에는 연구 계획에 따라 100일 동안 D-펩티드가 주사되었다. 촉각 이질통증은 생성물 주사 1일째, 및 일일 주사의 50일째 및 100일째에 알코올 신경병증의 모델링(modeling) 이전에 평가되었다. 데이타는 앞발 위축(paw withdrawal)의 평균 한계값(g)(M±m)으로서 제공된다.
도 3은 시험 생성물의 80일 주사 후 장간막 동맥 내막(mesenteric artery intima) 두께(㎛)이다.
# - 인택 그룹(intact group)과의 차이(p<0.05);
* - 대조군과의 차이(p<0.05, 본페로니 시험);
** - 대조군과의 차이(p<0.001, 본페로니 시험).
청구된 화합물의 합성은 실시예 1 내지 실시예 5에 기술된다.
실시예 1.
Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-OH의 합성
6.0 g의 2-클로로트리틸 수지(1.5 mM/g 용량)를 고체상 합성 반응기에서 45 ml의 DCM 중에 현탁시키고, 5분 동안 유지시키고, 수지를 여과하고, 2×30 ml의 DCM으로 세척하였다. 30 ml의 DCM 중에 용해된 2.95 g(9.9 mM)의 Fmoc-Gly-OH 및 6 ml(36 mM)의 DIPEA의 용액을 수지에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 2×30 ml의 DCM으로 세척하고, 2×30 ml의 DCM/메탄올/DIPEA 혼합물(17:2:1)로 10분 동안 처리하고, 2×30 ml의 DCM 및 3×30 ml의 DMF로 세척하였다. DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 반응기에 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.67 g(20.0 mM)의 Fmoc-Ser(tBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 DMF에 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 DMF에 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.67 g(20.0 mM)의 Fmoc-Ser(tBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 DMF에 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 DMF에 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 6.75 g(20.0 mM)의 Fmoc-Pro-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 DMF에 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 DMF에 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 3.50 g(20.0 mM)의 Fmoc-Gly-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 DMF 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF 및 3×30 ml의 DCM으로 세척하였다. 수지를 DCM 중에 용해된 10×30 ml의 트리플루오로아세트산의 1% 용액으로 처리한 후에, 얻어진 용액들을 30 ml의, 메탄올 중 10% 피리딘 용액을 함유한 플라스크에서 합하였다. 혼합물을 ~ 50 ml까지 비등시키고, 200 ml의 물을 잔부에 첨가하였다. 수득된 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 건조시켰다. 6.4 g(91%)의, HELC에 따른 97% 순도의 생성물을 수득하였다.
실시예 2
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(CF3COOH)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-OH의 합성
6.0 g의 2-클로로트리틸 수지(1.5 mM/g 용량)를 고체상 합성 반응기에서 45 ml의 DCM 중에 현탁시키고, 5분 동안 유지시키고, 수지를 여과하고, 2×30 ml의 DCM로 세척하였다. 2.95 g(9.9 mM) Fmoc-Gly-OH 용액 및 30 ml의 DCM 중에 용해된 6 ml(36 mM)의 DIPEA를 수지에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 2×30 ml의 DCM으로 세척하고, 2×30 ml의 DCM/메탄올/DIPEA 혼합물(17:2:1)로 10분 동안 처리하고, 2×30 ml의 DCM 및 3×30 ml의 DMF로 세척하였다. DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 반응기에 로딩하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 11.93 g(20.0 mM)의 Fmoc-Asn(Trt)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 DMF에 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 9.37 g(20.0 mM)의 Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.07 g(20.0 mM)의 Fmoc-Leu-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 10.53 g(20.0 mM)의 Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 8.51 g(20.0 mM)의 Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.07 g(20.0 mM)의 Fmoc-Ile-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.75 g(20.0 mM)의 Fmoc-Phe-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.07 g(20.0 mM)의 Fmoc-Leu-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 8.66 g(20.0 mM)의 Fmoc-Arg-OH.HCl, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 6.79 g(20.0 mM)의 Fmoc-Val-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 6.23 g(20.0 mM)의 Fmoc-Ala-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 8.51 g(20.0 mM)의 Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 8.51 g(20.0 mM)의 Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 8.51 g(20.0 mM)의 Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF 및 3×30 ml의 DCM으로 세척하였다. 수지를 10×30 ml의, DCM 중에 용해된 1% 트리플루오로아세트산 용액으로 처리한 후에, 얻어진 용액을 메탄올 중 30 ml의 10% 피리딘 용액을 함유한 플라스크에서 합하였다. 혼합물을 ~ 50 ml까지 비등시키고, 200 ml의 물을 잔부에 첨가하였다. 수득된 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 건조시켰다. HELC에 따라 21.8 g(80%)의 95% 순수한 생성물을 수득하였다.
실시예 3.
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Gly-OH의 합성
6.0 g의 2-클로로트리틸 수지(1.5 mM/g 용량)를 고체상 합성 반응기에서 45 ml의 DCM 중에 현탁시키고, 5분 동안 유지시키고, 수지를 여과하고, 2×30 ml의 DCM으로 세척하였다. 30 ml의 DCM 중에 용해된 2.95 g(9.9 mM)의 Fmoc-Gly-OH 및 6 ml(36 mM)의 DIPEA를 함유한 용액을 수지에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 2×30 ml의 DCM으로 세척하고, 2×30 ml의 DCM/메탄올/DIPEA 혼합물(17:2:1)로 10분 동안 처리하고, 2×30 ml의 DCM 및 3×30 ml의 DMF로 세척하였다. DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 반응기에 로딩하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 12.21 g(20.0 mM)의 Fmoc-Gln(Trt)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 9.37 g(20.0 mM)의 Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.67 g(20.0 mM)의 Fmoc-Ser(tBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.07 g(20.0 mM)의 Fmoc-Leu-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 8.23 g(20.0 mM)의 Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.67 g(20.0 mM)의 Fmoc-Ser(tBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.95 g(20.0 mM)의 Fmoc-Thr(tBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.75 g(20.0 mM)의 Fmoc-Phe-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 7.95 g(20.0 mM)의 Fmoc-Thr(tBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 5.95 g(20.0 mM)의 Fmoc-Gly-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 8.51 g(20.0 mM)의 Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 5.95 g(20.0 mM)의 Fmoc-Gly-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×30 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 30 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×30 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 9.95 g(20.0 mM)의 Boc-His(Trt)-OH, 2.98 g(22.0 mM)의 HOBt 및 3.42 ml(22.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×30 ml의 DMF 및 3×30 ml의 DCM으로 세척하였다. 수지를 DCM 중에 용해된 10×30 ml의 1% 트리플루오로아세트산 용액으로 처리한 후에, 얻어진 용액을 메탄올 중 30 ml의 10% 피리딘 용액을 함유한 플라스크에서 합하였다. 혼합물을 ~ 50 ml까지 비등시키고, 200 ml의 물을 잔부에 첨가하였다. 수득된 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 건조시켰다. HELC에 따라 20.9 g(85%)의 95% 순수한 생성물을 수득하였다.
실시예 4.
14-글리신-엑센딘-4 (헬로데르마 수스펙텀(Heloderma suspectum))-(1-39)-펩티딜-옥타-D-아르기닐-글리신의 합성
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH
2.0 g의 2-클로로트리틸 수지(1.5 mM/g 용량)를 고체상 합성 반응기에서 15 ml의 DCM 중에서 현탁시키고, 5분 동안 유지시키고, 수지를 여과하고, 2×10 ml의 DCM으로 세척하였다. 10 ml의 DCM 중에 용해된 0.98 g(3.3 mM)의 Fmoc-Gly-OH 및 2 ml(12 mM)의 DIPEA를 함유한 용액을 수지에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 2×30 ml의 DCM으로 세척하고, 2×10 ml의 DCM/메탄올/DIPEA 혼합물(17:2:1)로 10분 동안 처리하고, 2×10 ml의 DCM 및 3×10 ml의 DMF로 세척하였다. DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 반응기에 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, 10 ml의 20% DMF 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 2.60 g(6.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 0.98 g(7.2 mM)의 HOBt 및 1.12 ml(7.2 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 2.60 g(6.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 0.98 g(7.2 mM)의 HOBt 및 1.12 ml(7.2 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 3.46 g(8.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 3.46 g(8.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 3.46 g(8.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 10시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 4.33 g(10.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.62 g(12.0 mM)의 HOBt 및 1.88 ml(12.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 4.33 g(10.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.62 g(12.0 mM)의 HOBt 및 1.88 ml(12.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
10 ml의 DMF 중에 용해된 4.33 g(10.0 mM)의 Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.62 g(12.0 mM)의 HOBt 및 1.88 ml(12.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 3.07 g(8.0 mM)의 Fmoc-Ser(tBu)-OH, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 2.70 g(8.0 mM)의 Fmoc-Pro-OH, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 2.70 g(8.0 mM)의 Fmoc-Pro-OH, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 2.70 g(8.0 mM)의 Fmoc-Pro-OH, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 2.49 g(8.0 mM)의 Fmoc-Ala-OH, 1.35 g(10.0 mM)의 HOBt 및 1.56 ml(10.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 5.90 g(8.0 mM)의 Fmoc-GlyProSer(tBu)Ser(tBu)Gly-OH(실시예 1로부터의 생성물), 1.62 g(12.0 mM)의 HOBt 및 1.88 ml(12.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 11.35 g(4.0 mM)의 Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)Glu(OtBu)AlaValArg(HCl)LeuPheIleGlu(OtBu)Trp(Boc)LeuLys(Boc)Asn(Trt)Gly-OH(실시예 2로부터의 생성물), 0.81 g(6.0 mM)의 HOBt 및 0.95 ml(6.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반하고, 여과하고, 3×10 ml의 DMF로 세척하고, DMF 중에 용해된 10 ml의 20% 디에틸아민 용액을 첨가하고, 20분 동안 유지시키고, 여과하고, 5×10 ml의 DMF로 세척하였다.
30 ml의 DMF 중에 용해된 9.94 g(4.0 mM)의 Boc-His(Trt)Gly-Glu(OtBu)GlyThr(tBu)PheThr(tBu)Ser(tBu)Asp(OtBu)LeuSer(tBu)Lys(Boc)Gln(Trt)Gly-OH(실시예 3으로부터의 생성물), 0.81 g(6.0 mM)의 HOBt 및 0.95 ml(6.0 mM)의 DIC의 냉각된(4℃) 용액을 반응기에 로딩하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 6×20 ml의 DMF, 4×20 ml의 DCM로 세척하고, 건조시키고, 50 ml의 TFA/TIS/EDT/H20 혼합물(97:1:1:1)을 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 유지시키고, 여과하고, 3×20 ml의 트리플루오로아세트산으로 세척하고, 합한 여액을 ~ 20 ml까지 비등시키고, 60 ml의 무수 에테르를 잔부에 첨가하였다. 수득된 침전물을 여과하고, 필터 상에서 에테르로 세척하고, 건조시켰다. 수득된 생성물을 50 ml의 물로 용해시키고, 혼합물을 냉동시키고, 동결건조시켰다. 동결건조물을 40 ml의 물로 용해시키고, Amberlite IRA-400(CI 형태) 이온 교환 수지 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 물로 세척하고, 생성물을 함유한 분획들을 ~ 50 ml까지 비등시키고, Water X-Bridge C18 역상 컬럼, 10 ㎛, 127Å, 50×250 mm에 적용하였다. 50 ml/분의 용리제 흐름에서 용리를 수행하였다: 시기 A: 0.1% HCl/H20, B: 아세토니트릴. 구배: 90분 동안 0% (B)-70% (B). 주요 생성물을 함유한 분획들을 합하고, ~ 50 ml까지 비등시키고, 냉동시키고, 동결건조시켰다. 3.9 g(20%)의 97.5% 순수한 생성물(HELC)을 수득하였다. 질량 스펙트럼: C231H374N82O70에 대한 이론치 MH+ 5420.98, MH+ 5420.80이 얻어졌다. 아미노산 분석: 알라닌 2.02 (2), 아르기닌 9.0 (9), 아스파르트산 + 아스파라긴 2.05 (2), 글루탐산 + 글루타민 5.80 (6), 글리신 7.25 (7), 히스티딘 1.02 (1), 이소루신 1.03 (1), 루신 2.96 (3), 라이신 2.07 (2), 페닐알라닌 2.05 (2), 프롤린 4.10 (4), 세린 4.85 (5), 트레오닌 1.90 (2), 및 발린 1.02 (1).
실시예 5.
코리네박테륨 아세토아시도필룸 균주를 사용한 H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH의 합성
1.1. Cg10278 유전자 코딩 PBP1a의 결실을 위한 pBS△Cg10278 벡터의 설계
C. 아세토아시도필룸 ATCC 13032의 게놈 서열 및 Cg1278 유전자 코딩 PBP1a 페니실린-결합 단백질의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다[GenBank, 목록 번호(inventory number) BA000036 (version BA000036.3 GI: 42602314, locus_tag=≪NCg 10274≫)]. P1, P2, P3 및 P4 프라이머를 이러한 서열을 참조로 하여 합성하였다. PCR을 이용하여, 통상적인 방법[Saito H. and Miura K.I., Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72:619-629]으로 제조된 C. 아세토아시도필룸 ATCC 13869 균주의 기질로서 염색체 DNA, 및 프라이머 P1, P2, P3 및 P4를 사용하여, 5' 측면으로부터의 분절(약 1tpn) 및 3' 측면으로부터의 분절(약 1tpn)을 각각 PBP1a를 코딩하는 Cg10278로부터 수득하였다. 이후에, PCR을 이용하고 기질로서 DNA 분절 및 P1 및 P4 프라이머 모두를 사용하여, 서로 결합된 두 개의 분절들로 이루어진 DNA 분절(약 2 tpm)을 수득하였다. 제한 효소 BamH I 및 Xba I 각각의 인식 사이트를 적용하였다. Pyrobest DNA 폴리머라아제(Takara Bio에 의해 제작됨) 및 제조업체에 의해 제안된 조건을 PCR을 위해 사용하였다. 이러한 DNA 분절을 BamH I 및 Xba I 제한 효소로 처리하고, Cg0278 유전자의 결실(deletion)을 위한 pBS△Cg10278 벡터의 획득을 위하여, 이를 WO 2005/113744호에 기술된 BamH I-Xba I pBS4 사이트에 첨가하였다. DNA 결찰 키트 Ver. 2.1(Takara Bio에 의해 제작됨) 및 제조업체에 의해 제안된 조건을 결찰(ligation)을 위해 사용하였다.
1.2. PBP1a-없는(less) 균주의 설계
WO 2004/029254호에 기술된 C. 아세토아시도필룸 YDK010 균주를 설계된 pBS△Cg10278 벡터로 형질전환시켰다. C. 아세토아시도필룸 YDK010 균주는 C. 아세토아시도필룸 AJ12036(FERM BP-734)의 PS2 세포 상부 층 단백질이 결여된 균주이다[WO 2004/029254]. 균주를 Cg1278 유전자가 결여된 YDK010△PBP1a 균주를 수득할 목적을 위해 WO 2005/113744호 및 WO 2006/057450호의 설명에 따라 얻어진 형질전환체(transformant)들로부터 선택하였다.
하기에 기술된 실시예는 수득된 펩티드의 약리학적 시험에 관한 것이다.
본 연구의 목적은 수컷 랫트에 스트렙토조신(Streptozocin; STZ) 및 니코틴아미드의 1회 주사에 의해 유발된 화학적 실험 당뇨병의 모델을 기초로 하여 합병증에서 청구된 화합물(하기에서 "D-펩티드"로서 지칭됨)의 항고혈당 활성 및 예방 및 치료 효과의 발견(revelation)이다[35].
비교를 위하여 하기 약품을 사용하였다:
1. BAXTER Pharmaceutical Solutions의 Byetta®(DM 2 합병증의 예방 및 치료를 위한 참조 약품으로서)는 피하 주사용 투명 용액, 250 ㎍/1 ml: 사전 충전된 시린지 1.2 ml이다.
2. 합성 엑세나타이드 물질
3. 메트포르민(Siofor® 500)(비구아나이드의 통상적인 항고혈당 제품으로서).
적용된 시약 및 물질
글리코실화된 헤모글로빈 수준의 결정을 위한 시약의 키트("Phosphosorb" LLC, Russia).
적용된 장비
1. 실험실 의학적 투약 기구, 10 내지 100 ㎕.
2. 실험실 의학적 투약 기구, 100 내지 1,000 ㎕.
3. 미량 원심분리기 Z 216 MK(Hermle Laboitechnik GmbH, Germany).
4. 글루코오스 계량기 OneTouch UltraEasy®(LifeScan, USA).
5. Dipsticks OneTouch Ultra®(LifeScan, USA).
6. Von Frey hairs(Stoelting, USA).
동물
Figure 112017025775110-pct00001
동물의 적응 및 선택
연구의 개시 전에, 실험 동물(laboratory animal)을 케이지(cage)에서 그룹 관리에서의 적응을 위해 7일 동안 수용하였다. 이러한 기간 동안, 동물들을 육안 검사를 이용하여 임상 상태에 대해 매일 제어하였다. 검사에서 이상(abnormality)이 검출된 동물들을 실험 그룹에 포함시키지 않았다. 본 연구를 시작하기 전에, 실험에 대해 포함 기준을 충족하는 동물들을 그룹핑하였다.
그룹핑(GROUPING)
동물들의 선택을 변형된 블록 랜덤화(modified block randomization) 방법을 이용하여 수행하였다[36]. 이러한 목적을 위하여, 농장으로부터 배달된 모든 동물들을 랜덤화 블록 셀(randomization block cell)에 무작위적으로 넣었다(랜덤화 블록의 셀의 수량은 실험에서의 그룹의 수량에 의해 나누어질 수 있다). 이후에, 난수 생성기(random number generator)(통계 프로그램 Statistica 6.0)를 이용하여, 동물을 갖는 셀의 데이타 함유 숫자 및 이들의 상응하는 그룹 번호의 리스트를 획득하였으며, 여기에, 후속하여 동물들을 넣었다[36].
동물들의 식별(IDENTIFICATION OF ANIMAL)
케이지 라벨에는 동물들의 성별, 수량, 실험 개시 일자 및 그룹명이 포함되어 있다. 꼬리에 마크(mark)를 적용함으로써 본 연구를 위해 선택된 각 동물에 개개 번호를 배정하였다.
동물들을 실험 및 생물학적 클리닉(clinic)(vivaria)의 배열, 비치(equipping) 및 관리와 관련하여 1973년 7월 6일자의 USSR의 보건부(Ministry of Healthcare)에 의해 수립된 규칙(rule) 및 GOST R 53434-2009에 따른 표준 조건 하에서 유지시켰다.
동물들을 투명한 표준 플라스틱 케이지에서 침구(bedding) 상에 5마리의 개체의 그룹으로 유지시켰다. 케이지는 공급 공동(feeding cavity)을 구비한 강철 스크린으로 덮혀져 있다. 한 마리 동물에 대한 바닥 면적은 440 cm2로 구성되었다(허용 가능한 최소 면적은 250 ㎠이다).
1977년 8월 12일자 USSR 번호 755의 보건부의 명령(Order)에 의해 승인된 규제에 따른 GOST R 50258-92에 따라 준비된 "동물 관리를 위한 공급물(Feed for animal management)" ΠΚ-120-Ι을 강철 케이지 스크린의 공급 공동으로 임의적으로 첨가하였다(글루코오스 수준을 측정할 때, 동물들에게 18시간 동안 사료가 제공되지 않는다). 수의 증서(veterinary certificate) No. 247 No. 0294922("Aller Petfood" LLC, Russia), 뿐만 아니라, 지역 인증 센터로부터의 인증(certificate of conformity) No. POCRU.ΠP98.H00093/0051289, 2011년 5월 17일부터 2014년 5월 16일까지의 유효기간.
동물들에게
Figure 112017025775110-pct00002
에 따라 정제되고 GOST 51232-98 "Drinking water. General requirements for organization and quality control methods"을 기초로 한
Figure 112017025775110-pct00003
에 따라 관능 성질, pH 값, 건조 잔부, 환원 물질, 이산화탄소, 니트레이트 및 니트라이트, 암모니아, 클로라이드, 설페이트, 칼슘 및 중금속에 의해 제한된 물을 공급하였다. 강철 핸드 리프팅 커버(steel hand lifting cover)를 갖는 표준 음료통에서 물은 임의적으로 공급되었다.
목재 펠릿 6 mm("ZooSPb" LLC, Russia)를 침구로서 사용하였다. 동물들을 제어된 환경 조건(19.5 내지 21℃의 온도 및 61 내지 75%의 상대 습도) 하에서 유지시켰다. 광 요법(light regime)은 12시간 낮 및 12시간 밤을 포함하였다. 시간 당 대략 15 용적의 부지(premises), 0.15 부피% 이하의 CO2 농도, 0.001 mg/ℓ 이하의 암모니아를 제공하는 환기 체계(ventilation regime)를 조정하였다. 공기 온도 및 습도를 매일 기록하였다. 이러한 파라미터들의 유의미한 편차가 진행 기간(carry-on period) 동안 및 실험 과정에서 관찰되지 않았다.
연구 설계(STUDY DESIGN)
연구 그룹의 특징, 시험 물질의 투여 경로 및 기간
Figure 112017025775110-pct00004
실험 스케쥴에 따라, 동물들에게 0일 째에 시트레이트 완충제(pH=6.5) 중에 미리 희석된 65 ppm의 용량으로 스트렙토조토신(Streptozotocin; STZ)의 복부로의 단일 주사를 이용하여 실험적 진성 당뇨병을 유발시켰다. 모든 동물들에게 2시간 전에 230 ppm(5% 용액)의 용량으로 니코티노미드(nicotinomide)를 복부로 주사하였다[35, 37].
말초 혈액에서의 글루코오스 수준을 병리학 유도(pathology induction) 전에 금식 중인 랫트(밤에 동물에게 사료를 공급하지 않음)에서 측정하고, 이후에, 병리학 유도 후 1일, 3일 및 9일에 측정하였다. 시험 물질의 주사 개시 후에, 글루코오스 수준을 10일 마다, 그리고 안락사한 날에 측정하였다. 체중 기록을 글루코오스 수준 측정과 동일한 날에 수행하였다. 이질통증 시험(allodynia test)을 실험 동안 약품 주사 후 60일째, 70일째, 및 80일째에 수행하였다. 알코올 신경병증의 경우에, 촉감 반응성 시험(tactile responsiveness test)을 약품 주사 후 1일째, 50일째, 및 100일째에 수행하였다.
안락사한 날에 동물의 글리코실화된 헤모글로빈 수준을 결정하기 위해 정맥혈의 샘플을 채취하였다. 병리형태학적 연구를 위해 하기 장기들을 또한 채취하였다: 좌골 신경(sciatic nerve), 장간막의 동맥(mesentery artery)의 일부, 망막 동맥(retina artery)의 일부, 비장근(gastrocnemius muscle)의 일부, 및 췌장샘(pancreatic gland).
실험 및 작업 스케쥴
Figure 112017025775110-pct00005
실시예 6. 실험 동물들의 혈액 중의 글루코오스의 결정
랫트의 말초 혈액에서 글루코오스 수준 측정을 글루코오스 옥시다아제 시험에 의해 글루코오스 계측기 OneTouch® 및 딥스틱스(dipsticks) OneTouch®를 이용하여 수행하였다. 글루코오스 수준 측정 전날 밤에 랫트에게 사료를 공급하지 않고 물만을 공급하였다. 측정 공정은 하기와 같다: 요구되는 마크를 갖는 동물을 케이지에서 꺼내고, 이의 꼬리를 살균제로 처리하고, 정맥을 시린지 니들을 이용하여 천공시키고, 혈액 방울이 유출될 때 딥스틱을 구비한 글루코오스 계측기를 적소에 배치시켰다. 얻어진 데이타를 초기 카드에 입력하였다.
도 1에서, 글루코오스 농도 감소에 대한 일반적인 경향이 시험 생성물의 적용의 백그라운드에서 관찰되는 것을 알 수 있다. 반복된 측정과 함께 이원분산분석(Two-way analysis of variance; ANOVA)은 말초 혈액 중의 글루코오스 농도에 대한 시험 생성물의 통계학적으로 유의미한 영향을 나타내었다(F4.25=3.49, p=0.02). 추가의 그룹간 비교에서는, 대조군과 비교하여 생성물 주사 20일째날로부터 개시하여 메트포르민이 주사된 그룹(p<0.05, 본페로니 시험(Bonferroni test)) 뿐만 아니라 생성물 주사 40일째날로부터 개시하여 청구된 펩티드(D-펩티드)가 주사된 그룹(p<0.05, 본페로니 시험)의 유의미한 차이를 나타내었다.
치료전(포인트 "0") 및 치료 마지막날(80일째)의 글루코오스 베이스라인 간의 대응 비교(paired comparison)에서는 메트포르민(p=0.017, t-시험) 및 D-펩티드(p=0.011, t-시험)이 주사된 그룹에서 통계적으로 유의미한 차이를 나타내었다(도 1).
최종적으로, 청구된 D-펩티드가 주사 40일째날로부터 개시하여 80일의 기간의 치료 동안 항고혈당 효과를 갖는다고 결론지어질 수 있다. 인크레틴-유사 생성물, 엑세나타이드는, 또한, 주사 50일째날로부터 개시하여 항고혈당 효과를 나타내었으며, 이의 세기는 D-펩티드 보다 더욱 낮았다. Byetta®의 주사에서는 말초 혈액 중의 글루코오스 수준에 대한 영향을 나타내지 않았지만, 참조 생성물 메트포르민은 예상되는 바와 같이 치료 20일째날로부터 개시하여 항고형당 성질들을 나타내었다.
실시예 7. 말초 혈액 중 글리코실화된 헤모글로빈의 결정
정맥혈 중 글리코실화된 헤모글로빈의 결정을 랫트 혈액 용혈물에서 글리코실화된 헤모글로빈 분획 및 비-글리코실화된 헤모글로빈 분획의 친화력 크로마토그래피의 방법에 의해 시약의 키트 "Diabetes Test, HbA1c"("Phosphosorb" LLC, Russia)를 이용하여 수행하였다.
동물 적혈구의 용혈물에서 글리코실화된 헤모글로빈의 결정을 위한 혈액 샘플을 시험 생성물의 일일 주사의 81째날에 실험 동물들의 꼬리 정맥으로부터 채취하였다. 수득된 데이타는 표 1에 제공되어 있다.
표 1 - 동물 혈액 중 글리코실화된 헤모글로빈의 함량, %, M ± m
Figure 112017025775110-pct00006
표 1의 데이타에서, HbA1c 농도의 4배까지의 통계학적으로 유의미한 증가가 인택 그룹(intact group)과의 비교에서 대조군 동물에서 관찰된다는 것을 나타낼 수 있다(p=0.0002, t-시험). 측정 데이타는 실험적 병리학의 명백한 발달을 특징으로 나타낸다.
HbA1c 농도의 통계학적으로 유의미한 감소는 시험 생성물의 적용의 백그라운드에서 밝혀졌다(F4.17=11.83, p<O.0001). 추가의 그룹간 비교에서는 청구된 D-펩티드(p<0.0001) 및 메트포르민(p<0.0001)이 투여된 그룹들에서 최대 치료 효과를 나타내었으며, 이러한 효과는 Byetta® 및 엑세나타이드(각각 p=0.0018 및 p=0.0015)로의 치료가 수행된 그룹들에서 명백하지 않았다.
실시예 8. 당뇨병성 신경병증에 걸린 랫트에 대한 촉감 이질통증의 평가
랫트를 금속 와이어로 제조된 격자 바닥(grating floor)을 갖는 플라스틱 케이지에 넣고, 방향 반응을 없애기 위해 이러한 케이지에서 5분 동안 남겨 두었다. 촉감 반응성의 평균 유효 문턱값의 결정을 8개의 표준 본 프레이 헤어(standard von Frey hairs)로 이루어진 키트(Stoelting, USA)를 이용하여 문헌[Chaplan et al. [38]]의 방법에 의해 수행하였다. 헤어 벤딩(hair bending)에 위해 요구되는 최소 힘으로서 표현되는 헤어 조도(hair coarseness)는 0.692에서 28.840 g까지의 절대값으로 대수적으로 증가된다.
각 랫트의 문턱값을 초기에 왼쪽 앞발 상에서 결정하고, 이후에 오른쪽 앞발 상에서 결정하였다. 헤어 단부로 헤어 벤딩을 위해 요구되는 힘으로 앞발의 발바닥 표면 중간을 접촉시키고, 이를 이러한 위치에서 6초 내지 8초 동안 유지시켰다. 접촉 동안 동물이 이의 앞발을 갑자기 위축(withdrawal)하거나 헤어의 제거 이후에 급격한 앞발 구부림(sharp paw bending)이 이어지는 경우에 양성 반응(positive response)이 기록되었다.
시험을 3.630 g의 힘에 해당하는 헤어의 적용으로부터 개시하였다. 이후에, 자극(헤어)을 증가하고 감소하는 순서로 사용하였다. 최소 조도를 갖는 헤어를 양성 반응의 경우에 사용하였고, 가장 큰 조도를 갖는 헤어를 음성 반응의 경우에 사용하였다. 감수성 문턱값의 초기 결정 후에 동일한 원리에 따라 4개 이상의 헤어를 사용하였다.
촉감 반응성의 정신생리학적 평균 유효 문턱값을 딕손의 문헌[Dixon [39]]에 기술된 방법에 의해 계산하였다.
표 2는 촉감 이질통증의 발달 정도에 대해 시험 생성물의 80일 주사의 영향의 연구에 대한 실험의 결과를 나타낸다.
약물의 60일 주사에 의한 완전한 실험에서, 대조군에서 촉감 이질통증의 징후(manifestation)는 최대(F1;14=669.8, p<0.0001)이었는데, 이는 겉보기 통증 증후군(apparent pain syndrome)을 갖는 당뇨병성 신경병증의 입증된 모델을 명시하는 것이다.
촉감 이질통증의 발현에 대한 인자 "약품의 주사"의 유의성을 결정할 수 있는 반복된 측정과 함께 이원분산분석에 의한 통계학적 처리를 얻어진 결과의 추가 평가를 위해 수행하였다(F4.43=10.93; p<0.0001). 추가 그룹간 비교(본페로니 시험)에는 주사 60일째날로부터 개시하여 D-펩티드가 투여된 그룹에서 촉감 이질통증 세기의 감소를 나타내었다. 표 3은 사용된 모든 물질에 대한 F-기준 수치를 나타낸다. 후속 그룹간 비교(본페로니 시험)에서는 단지 청구된 D-펩티드가 투여된 그룹에서 유의미한 영향을 나타내었다.
표 2 - 랫트의 촉감 이질통증에 대한 시험 생성물의 영향. 시험 생성물의 주사 전에 촉감 이질통증을 평가하였다. 데이타는 앞발 위축 문턱값의 평균 값으로서 제공된다(g)(M±m).
Figure 112017025775110-pct00007
표 3 - 시험 생성물의 주사의 백그라운드에 대한 촉감 이질통증의 발현에 의한 통계학적 데이타 처리의 결과
Figure 112017025775110-pct00008
이에 따라, 시험 생성물의 효과 연구에서는 하기를 나타내었다: Byetta®, 엑세나타이드 및 메트포르민은 지시제의 개개 비교에서 이질통증 징후 세기를 약간 감소시켰다. 그러나, 추가 그룹간 비교에서는 통계학적으로 유의미한 영향을 나타내지 못하였다. 주사 60일째날로부터 개시하여 청구된 D-펩티드의 주사는 당뇨병성 신경병증으로부터 고통당하는 랫트 상에서 촉감 이질통증 징후를 유의미하게 감소시켰다(표 2 및 표 3). 이러한 관찰은 장기 치료(치료 60일째날로부터 개시함)의 경우에, 가장 널리 퍼진 합병증 DM 2 중 하나, 청구된 D-펩티드의 신경보호 작용에 의해 아마도 조절되는 말초 당뇨병성 신경병증과 관련한 특정 치료 효과가 존재한다는 결론을 가능하게 한다.
실시예 9. 알코올 신경병증으로 고통당하는 랫트 상에서의 촉감 이질통증의 평가
촉감 이질통증의 평가를 실시예 7에서와 동일한 방식으로 수행하였다. 알코올 신경병증(촉감 이질통증)의 증상들을 강제 음주 방법(method of forced drinking)[40]에 따라 랫트에 의한 30% 알코올 소비의 8주째(55일 내지 60일)로부터 개시하여 관찰되었으며(F1;12=26.25; p=0.0003; 도 2), 이는 겉보기 통증 증후군을 갖는 알코올 신경병증의 입증된 모델을 지시하는 것이다.
촉감 이질통증의 발달 정도에 대한 인자 "약품의 주사"의 유의성을 결정할 수 있는 반복된 측정을 갖는 이원분산분석에 의한 통계학적 처리를 얻어진 결과의 추가 평가를 위해 수행하였다(F1.10=8.79; p<0.014). 추가 그룹간 비교(post hoc)에서는 상응하는 측정 포인트에의 대조군과 비교하여, 주사 100일째날에 청구된 D-펩티드로 처리된 그룹에서의 촉감 이질통증 세기의 감소를 나타내었다(p<0.05; 본페로니 시험; 도 2).
상기된 것을 모두 요약하면, 청구된 D-펩티드가 알코올 및 당뇨병 말초 신경병증 동안 발달된 신경퇴행 과정에 대한 신경보호 성질을 갖는다는 것으로 결론지어질 수 있다.
병리형태학적 연구
모든 실험 동물들을 연구의 마지막에 병리형태학적 연구로 수행하였다.
병리형태학적 연구는 부검, 맨눈검사(macroscopic examination), 하기 내부 장기의 조직학적 검사를 포함한다: 좌골 신경의 중앙 부분, 장간막 동맥의 일부, 비장근의 일부, 췌장샘. 부검을 병리학자의 직접적인 관리 하에서 수행하였다. 특정 조직의 샘플을 절단하고, 10% 중성 포르말린 용액에 넣고, 24시간 동안 안구(eye bulb)를 Davidson 록(Davidson lock)으로 고정시키고, 이후에, 물질을 5 내지 7 ㎛의 일련의 파라핀 섹션들의 두께를 갖는 조직학적 및 조직화학적 시편들의 생산을 위해 표준 처리로 수행하였다. 현미경 검사를 위한 조직 및 장기 섹션들을 해마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 신경 조직 샘플을 해마톡실린 및 에오신, Nissl 방법에 의한 톨루이딘 블루, 및 van Gieson 방법에 의한 피크로-푹신(picro-fuchsin)으로 염색하였다. 미엘린 섬유 및 미엘린 감쇠 산물을 나타내기 위하여, 냉동된 마이크로톰(microtome) 상에서 얻어진 신경의 십자 및 종방향 섹션들을 Lieson 방법에 의한 수단 블랙(Sudan black)으로 염색하였다[41, 42, 43]. 핵을 헤말룸(hemalum)으로 대조염색하였다. 비장근의 샘플을 해마톡실린, 에오신 및 van Gieson 방법에 의한 피크로-푹신으로 염색하였다.
조직학적 시편의 형태학적 검사를 100, 200 및 400 배율을 갖는 광학 현미경 Carl Zeiss(Germany)를 이용하여 수행하였다. 현미경 사진을 디지털 카메라 Axio Scope Al(Germany)을 이용하여 수행하였다. 형태 계측(Morphometry)을 소프트웨어 Axio Vision Rel. 4.8. 및 이미지 에디터(image editor) PhotoM 1.21를 이용하여 반자동적으로 그리고 수동으로 수행하였다.
시험 물질의 작용을 평가하기 위해, 하기에 대한 이의 영향의 비교 조직학적 평가를 수행하였다:
1. 섬 면적(islets area)의 측정을 수행하는 췌장샘 인슐린 기구(pancreatic gland insular apparatus);
2. 망막의 근육 타입 미세순환 혈류(세동맥 및 모세혈관)의 동맥, 모세관 직경 및 동맥 내막 두께의 형태적 측정이 수행되는 장간막 동맥;
3. 좌골 신경 상태;
4. 신체 근조직 상태.
실시예 10. 랫트의 장간막 동맥 내막의 상태 평가
도 3은 랫트의 장간막 동맥 내막의 상태에 대한 시험 물질의 영향에 대한 데이타를 나타낸 것이다. 인택 그룹 및 대조군의 대응 비교에서 혈관 내막 두께의 유의미한 증가가 대조군에서 일어난다는 것을 나타내었다(p<0.0001 , t-시험). 이러한 두께는 증가하며, 혈관 내막 팽창은 각막내피염 과정의 발달을 입증한다. 추가의 일원 분산 분석(ANOVA)에서는, 시험 물질의 장기간 주사가 랫트의 장간막 동맥의 혈관 내막 두께의 증가를 방지한다는 것을 나타내었다(F4.25=12.87; p=0.0001). 그룹간 비교에서는 대조군과 비교하여 모든 그룹에서 혈관 내막 두께의 유의미한 감소를 나타내었다(p<0.05, 본페로니 시험). 청구된 D-펩티드가 투여된 그룹에서 최대 효과가 관찰되었다(p<0.0001, 본페로니 시험).
실시예 11. 좌골 신경 조직의 상태 평가
신경 조직의 입증된 병리형태학적 변화를 기초로 하여, STZ-유도 제2형 진성 당뇨병의 모델링이 신경 줄기의 두께 및 직경의 감소, 미엘린초의 변형 및 팽창, 병에 걸린 신경 섬유, 세포간 조직 부종, 신경상막 및 신경주막에서 지질의 비정상적 축적, 뿐만 아니라, 신경섬유내 결합 조직의 성장에 의해 특징된 당뇨병성 신경병증의 겉보기 상태에 의해 달성되는 것으로 결론지어질 수 있다.
개개 섬유들은 수포변성(hydropic degeneration)의 상태를 갖는다. 연속적인 미엘린 감쇠를 나타내는 작은 수단친화성 과립들의 응집물은 탈수초의 초점에서 관찰되었다.
메트포르민의 주사는 신경 조직에 대한 치료 효과를 가지지 않았다. 신경 줄기 및 섬유의 심각한 병소, 미엘린초의 초점 변셩과 함께 명백한 다형핵 침투에서 나타나는 신경주막 및 신경상막, 뿐만 아니라, 섬유의 팽창 및 변형, 병이 걸리지 않은 미엘린 섬유의 기저막에 인접한 수단친화성 그래뉼(sudanophilic granule)로서 미엘린 감쇠 생성물의 발생이 이러한 그룹의 조직 샘플들에서 관찰되었다.
Byetta® 및 엑세나타이드를 주사하였을 때, 단지 신경주막 및 신경상막에서 지질의 유의미하지 않은 축적이 관찰되었다. 이러한 그룹에서 변성 현상이 실질적으로 보다 적거나 전혀 일어나지 않는다는 것은 명백하다. 반대로, 청구된 D-펩티드의 주사는 양성 치료 효과를 가지는 반면, 인택트 동물(intact animal)의 그룹으로부터의 좌골 신경 구조에서의 겉보기 형태학적 차이는 나타나지 않았다.
신경 조직 지시제의 병리형태학적 분석 동안에, 신경 줄기 두께가 인택트의 동물과 비교하여 대조군에서 유의미하게 감소되었고(p<0.0001; t-시험), 이는 조직에서 퇴행성 변화를 나타낼 수 있고 병리학 발달의 병리형태학적 상태에 의해 입증된다는 것이 결정되었다(표 4).
표 4 - 시험 물질의 작용 하에서 신경 조직의 형태 계량학적 지시제
Figure 112017025775110-pct00009
상기에서 주지된 바와 같이, 메트포르민이 투여된 그룹에서 신경 조직 샘플의 병리형태학적 상태는 신경 줄기 부종 및 이의 두께의 과도한 증가를 나타내는데, 이는 병리학 향상을 시사하지만, 치료 효과를 시사하는 것은 아니다. 상술된 그룹을 포함하지 않은 통계학적 분석을 이와 관련하여 수행하였다. 일원 분산 분석(ANOVA)은 신경 줄기 두께에 대한 시험 물질 주사의 유의미한 영향을 나타내었다(p=0.007). 또한, 그룹간 비교(post hoc)에서는 대조군과 비교하여 청구된 D-펩티드가 투여된 그룹에서 신경 줄기 두께의 유의미한 증가를 확인해 주었다(p<0.01; 본페로니 시험).
신경내막 결합 조직 면적으로서 이러한 병리형태학적(pathomorphometric) 지시제의 분석에서 신경내막 결합 조직의 유의미한 성장이 병리학 모델링에서 일어났다는 것이 입증되었으며(p<0.0018; t-시험), 이는 수복 징후에 비해 퇴행 징후의 우성을 지시할 수 있다[Karpova and Krishtop, 2013]. 일원 분산 분석(ANOVA)의 수행은 신경내막 결합 조직 구역에 대한 시험 물질의 주사의 유의미한 영향을 나타내었다(F4.25=8.58; p=0.0002). 추가의 그룹간 비교(post hoc)에서는 모든 그룹에서 신경내막 결합 조직 구역의 유의미한 감소를 확인하였다(p<0.01 ; 본페로니 시험). 청구된 D-펩티드가 투여된 그룹에서 최대 효과가 나타났으며(p=0.0002; 본페로니 시험)(표 4), 이는 신경 조직의 수복 과정의 향상으로서 처리될 수 있다.
실시예 12. 근육 조직(비장근)의 상태 평가
비장근의 횡문 근육 조직의 입증된 병리형태학적 변화를 기초로 하여, 실험적 DM 2 진행이 근 섬유의 세선화(thinning) 및 변형, 주변 결합 조직의 중간 정도의 성장, 일부 경우에, 위축된 섬유의 콜라겐성 결합 조직으로의 치환, 뿐만 아니라, 근육 세포 핵(근육핵)의 양의 증가에 의해 특징되는 근위축증의 겉보기 상태에 의해 동반된다고 결론지어질 수 있다. 중간 정도의 염증성 침윤은 섬유 위축을 갖는 동물 상의 근내막 및 근주막의 결합 조직에서 발견되었다.
병이 걸린 근 섬유의 치환 및 중간 정도의 림프구성 침윤을 갖는 결합 조직의 국부적 성장(focal growth)은 Byetta® 및 엑세나타이드가 투여된 그룹에서 관찰되었다. 섬유 및 간질 조직(interstitial tissue)의 최소 국부적 염증성 침윤은 근핵 비율의 증가의 백그라운드 상에 메트포르민이 투여된 그룹에서 관찰되었다.
입증된 병리학의 백그라운드에서, 청구된 D-펩티드의 주사는 근육 조직 상의 명백한 치료 작용을 갖는다. 병리학적 변화는 단일 경우에 이러한 그룹에서 발견되었고, 대조군과 비교하여 최소이었다.
근 섬유의 단면적을 분석할 때, 실험적 제2형 DM의 진행이 근위축증 징후로서 치료될 수 있는 섬유에서의 근육핵의 양의 감소(약 70%)와 동시에 근육 조직 섬유의 단면적의 유의미한 감소(p<O.0001; t-시험)에 의해 동반된다는 것이 규명되었다. 일원 분산 분석(ANOVA)의 수행은 근 섬유의 단면적에 대한 시험 물질의 주사의 유의미한 영향을 나타내었다(F4.22=13.67; p=0.0001). 추가의 그룹간 비교(post hoc)에서는, Byetta®가 투여된 그룹(p=0.051; 본페로니 시험)을 제외하고 모든 그룹에서 근 섬유의 단면적에서의 유의미한 증가를 확인하였다(p<0.01 ; 본페로니 시험). 엑세나타이드(p=O.0001; 본페로니 시험) 및 청구된 D-펩티드(p=0.0004; 본페로니 시험)가 투여된 그룹들에서 최대 효과가 나타났다(표 5).
표 5 - 시험 물질의 작용 하에서 비장근의 근 섬유의 단면적(M±m)
Figure 112017025775110-pct00010
실시예 13. 췌장샘 인슐린 기구
표 6은 실험 동물의 췌장샘 인슐린 기구에 대한 시험 물질의 영향에 대한 요약된 데이타를 나타낸 것이다. 인택트 그룹 및 대조군의 대응 비교에서, 랑게르한섬의 유의미한 감소가 대조군에서 일어남을 나타내었다(p<0.0001, t-시험). 인슐린 기구 영역에서 이러한 감소는 또한 말초 혈액 중 글루코오스 수준의 증가와 관련이 있는 병리학의 발달을 시사한다. 실험 그룹과 대조군의 대응 비교에서는 췌장샘 섬의 면적에 대한 모든 시험 물질의 주사의 통계학적으로 유의미한 영향을 나타내었다(표 7). 이러한 관찰에서는, 시험 물질의 장기간 주사가 섬 면적의 증가를 야기시키고, 이에 따라, 췌장샘 인슐린 기구의 수복 과정을 촉진시킨다는 것이 시사된다.
표 6 - 시험 생성물의 80일 주사 후 췌장샘 인슐린 기구의 상태의 형태 계량학적 지시제
Figure 112017025775110-pct00011
표 7. 시험 생성물의 다회 주사 후 췌장샘 섬의 면적에 대한 데이타의 통계학적 처리 결과(스튜던트 테스트(Student's test))
Figure 112017025775110-pct00012
이에 따라, 기관 및 조직의 병리형태학적 분석에서, 스트렙토조토신-유도 제2형 진성 당뇨병의 모델링이 각막내피염, 췌장샘 인슐린 기구 면적의 감소, 뿐만 아니라, 넓적다리 근육에서의 당뇨병성 말초 신경병증 및 척추측만증(dystrophic change)의 발달의 겉보기 상태에 의해 동반된다는 것이 나타났다.
청구된 D-펩티드의 80일 주사 후에 최대 및 분명한 치료 효과가 관찰되었다. 이러한 화합물의 주사는 제2형 진성 당뇨병의 합병증, 예를 들어, 당뇨병성 신경병증, 근위축증, 각막내피염과 관련하여 양성 치료 작용을 가지고, 췌장샘 인슐린 기구에서 수복 과정에 대한 바람직한 영향을 갖는다. 조직학적 샘플의 분석은 임상 데이타와 상호 관련이 있다. 특히, 실험 동물에서 이질통증 징후 및 적혈구에서 글리코실화된 헤모글로빈 함량의 감소의 출현에서 분명한 치료 효과가 관찰되었다. 메트포르민과 유사한 이러한 화합물의 분명한 항고혈당 작용이 또한 주목되었다.
상기를 고려하여, 청구된 D-펩티드가 제2형 진성 당뇨병 합병증, 특히, 당뇨병성 신경병증의 치료 및 예방을 위한 매우 효과적인 제제이고 알코올 신경병증과 관련한 신경보호 작용을 갖는다는 것으로 결론지어질 수 있다.
참고문헌의 리스트:
Figure 112017025775110-pct00013
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SEQUENCE LISTING <110> Daphot Enterprises Limited <120> PEPTIDE FOR TREATMENT OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS AND ITS COMPLICATIONS <130> D31478WO <140> PCT/IB2015/001614 <141> 2015-08-04 <150> RU2014134341 <151> 2014-08-21 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 48 <212> PRT <213> Corynebacterium acetoacidophilum <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(47) <223> D amino acids <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Gly Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly 35 40 45 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 9-fluorenylmethyloxycarbonyl <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> tButyl <400> 3 Gly Pro Ser Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 9-fluorenylmethyloxycarbonyl <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(3) <223> O-tert-butyl <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> CF3COOH <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> O-tert-butyl <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> tert-butyloxycarbonyl <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> tert-butyloxycarbonyl <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> triphenylmethyl <400> 4 Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> tert-Butyloxycarbonyl <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> triphenylmethyl <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> O-tert-butyl <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> tert-butyl <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> tert-butyl <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> O-tert-butyl <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> tert-butyl <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> tert-butyloxycarbonyl <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> triphenylmethyl <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Lys Gln Gly 1 5 10

Claims (2)

  1. 하기 식으로 표현되는 화합물:
    H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH.
  2. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는, 제2형 당뇨병(type 2 diabetes), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy) 또는 제2형 당뇨병의 합병증의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
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