CN106574233A - 用于治疗2型糖尿病及其并发症的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术。提供了具有式H‑His‑Gly‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Leu‑Ser‑Lys‑Gln‑Glu‑Glu‑Glu‑Glu‑Ala‑Val‑Arg‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu‑Trp‑Leu‑Lys‑Asn‑Gly‑Gly‑Pro‑Ser‑Ser‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑Gly‑OH的艾塞那肽类似物。本发明允许对糖尿病治疗和采取预防措施，以及对2型糖尿病并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病治疗和采取预防措施。

Description

用于治疗2型糖尿病及其并发症的肽
本发明涉及具有下式的新的艾塞那肽(exenatide)类似物：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH，其可以用于治疗和预防糖尿病，以及用于治疗和预防2型糖尿病的并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病(endotheliopathy)。
本发明涉及医学和药学，并且可以用作用于预防和治疗2型糖尿病及其并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病的药物产品。
2型糖尿病(DM2或非胰岛素依赖型糖尿病)是慢性多系统疾病，其最主要的表现是糖类代谢紊乱。由于异常变化的结果，发生高血糖症。除此之外，出现了负责胰岛素产生的特化胰腺细胞的机能障碍。患有2型糖尿病的患者死亡的主要原因首先是发生大血管并发症(冠状动脉、大脑动脉和周围动脉的损伤)。而且，DM2是发生代谢综合征(胰岛素抵抗(insulin-resistant)或综合征X)的主要组成之一[1]。最近，表明DM2是阿尔茨海默症发生的病理学标记的观察结果的数量越来越多[2]。
根据2013年底WHO的数据，世界上有3.47亿人患有糖尿病[3]。2004年，340万人由于血液中的糖含量高而死亡[4]。2010年，糖尿病并发症引起的死亡病例保持在相同水平[5]。根据WHO的预计，在2030年以前，糖尿病会成为死亡的第七个重要原因。确信的是，在发达国家的10-15％的患者中可以发现1型DM，而在85-90％的患者中可以发现2型DM。但是在近些年，发达国家中2型DM的频率增长很快，而1型DM患者的数目没有显著改变。根据最近的WHO数据，世界上1型和2型DM的比例已经向2型DM的频率增加而改变[5]。
糖尿病的最早和最频繁的并发症是糖尿病性神经病变[6]，其特征是与小血管(滋养血管(vasa vasorum)，神经滋养血管(vasa nervorum))损伤相关的神经系统障碍。该并发症不仅导致工作减退，而且常常导致发生严重的失能损伤和患者死亡。病理过程影响所有神经纤维：感觉神经纤维、运动神经纤维和植物神经纤维。根据不同作者的数据，可以在90-100％的糖尿病患者中观察到糖尿病性神经病变。由于糖尿病的神经系统损伤的频率与疾病的持续时间成正比，并且在某些情况下，它在糖尿病的主要临床体征之前出现。因此，5％的糖尿病患者发作已经具有神经系统损伤症状，所述神经系统损伤症状在25年的糖尿病持续时间之前在患病过程中增长高达60％。
由于糖尿病，神经系统的所有部分均受到影响：中枢神经系统(脑病、脊髓病)、周围神经系统(单发性神经病变和多发性神经病变)和周围植物神经系统(自主性神经病变)。
考虑到上述内容，明显的是，在日常实践中用于治疗2型糖尿病本身及其并发症的医药产品的开发和实施是有前途的。
2型糖尿病以及其并发症的医学治疗目前基于组合为以下几组的抗高血糖药物：
-第一组包括两类医药产品-噻唑烷二酮类(罗格列酮和吡格列酮)，PPARγ-核γ受体的激动剂、刺激剂；和双胍类(二甲双胍(Metformin)、西奥福(Siofor)、文达敏(Avandamet)、巴戈美特(Bagomet)、格华止(Glucophage)、美特福伽马(Metfogamma))。该组的医药产品提高了细胞对胰岛素的敏感性，减少了胰岛素抵抗和肠道细胞的葡萄糖吸收性，这就是为什么它们常作为处方用于超重的人。
-第二组抗高血糖药物也包括两类医药产品-刺激自身胰岛素产生，从而增加其效率的继发性磺酰脲类(优降糖(Maninil)、磺酰丁脲(Diabeton)、阿马里尔(Amaril)、糖适平(Glurenorm)、格列比尼阻滞剂(Glibinese-retard))；以及提高胰腺的胰岛素合成而且降低餐后峰值(进食后糖水平的增加)的美格列脲(meglitinides)(瑞格列奈(Repaglinide)(诺和龙(Novonorm))和那格列奈(Nateglinide)(使糖立释(Starlix)))。
-第三组抗高血糖药物包括阿卡波糖(拜糖平(Glucobay))，所述阿卡波糖(拜糖平(Glucobay))通过阻止α葡萄糖苷酶减少肠道细胞的葡萄糖吸收性，所述α葡萄糖苷酶分解进食接收的多糖。
治疗和预防DM2并发症的新开发包括直接的肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的激动剂和间接的4型二肽基肽酶的阻滞剂。直接的肠降血糖素类似物包括这样的医药产品如艾塞那肽(百泌达(Byetta))、利拉鲁肽(Viktoza)、阿必鲁肽和度拉糖肽。间接的4型二肽基肽酶的阻滞剂包括西他列汀(捷诺维(Januvia))、沙格列汀(安立泽(Onglyza))、利拉利汀(糖渐平(Trajenta))和维达列汀(佳维乐(Galvus))。
肠降血糖素样医药产品组展示了特别的兴趣。
肠降血糖素如GLP-1改善β细胞的功能，抑制胰高血糖素不适当提高的分泌，以及促进提高胰岛素的葡萄糖依赖型分泌。艾塞那肽(毒蜥外泌肽-4(exendin-4))是肠降血糖素受体(GLP-1R)的类似物，是已通过对人的临床试验证明了对非胰岛素依赖型糖尿病及其并发症的功效和预防性治疗的医药产品之一。
艾塞那肽是最初被称为毒蜥外泌肽-4的多肽，其提取方法来自1992年4月首次公布了从希拉毒蜥(Heloderma suspectum)蜥蜴的唾液中提取毒蜥外泌肽-4的方法和毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG-PSSGAPPPS-NH2)[7]。作为肠降血糖素肽的代表，毒蜥外泌肽-4具有广泛的效能范围，如胰岛素分泌的葡萄糖依赖型提高，葡萄糖加工改进，食欲的下调、减慢来自胃的食物移动等。
对伴有高血糖症的2型糖尿病患者使用艾塞那肽抑制胰高血糖素的超量分泌，但是艾塞那肽不影响对高血糖症的常规胰高血糖素反应。
与二甲双胍和/或基于磺酰脲类的医药产品组合的艾塞那肽治疗导致在禁食状态下血液中葡萄糖含量的减少，餐后血糖含量减少，以及糖基化血红蛋白值(HbAlc)减少，改善了对这些患者的血糖控制。
存在已知的使用艾塞那肽的领域：因此，美国专利[8]公开了使用艾塞那肽刺激胰岛素产生，效率超过GLP-1内源激素的效率。本发明中提供的例子的描述证明了艾塞那肽对治疗糖尿病是有效的。
之后揭示了艾塞那肽的其他治疗作用：减重[9]、减弱胃蠕动活动和减慢胃排空[10,11]，以及艾塞那肽的肌肉收缩作用和利尿作用[12,13,14]。描述了使用艾塞那肽治疗多囊性卵巢[15,16,17]、治疗和预防肾病变[18,19]、预防和治疗心律失常[20]、用于骨髓细胞分化[21]、治疗妊娠期糖尿病[22,23]、调节甘油三酯水平和治疗血脂异常[24,25]、抑制胰高血糖素分泌[26,27]、用于使非胰岛素产生细胞分化为胰岛素细胞[28]。申请[29]描述了使用艾塞那肽、其激动剂和拮抗剂影响中枢神经系统。专利[30,31]描述了使用艾塞那肽和肠降血糖素受体的其他拮抗剂用于减少食物吸收。申请[32]描述了稳定的艾塞那肽组合物。专利[33,34]描述了艾塞那肽(毒蜥外泌肽及其拮抗剂)的新应用。
上述的所有方面表明艾塞那肽对预防和治疗DM2的高效。然而，2型糖尿病中发生的并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病在用艾塞那肽及所有其他上述的抗高血糖药物的治疗过程中没有解决。
这是为什么存在创造在治疗2型糖尿病过程中发生的并发症中有效的新的艾塞那肽类似物的任务，所述并发症，如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病。
要求保护的发明的最接近的类似物是选择作为原型的美国专利5424286[8]，其中刺激产生胰岛素的降血糖素类似物的用途与要求保护的发明相似。
已知的发明的主要缺点是肠降血糖素类似物(艾塞那肽)缺少允许预防和治疗这样的糖尿病并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病的治疗作用。
因此，要求保护的发明的技术效果将是预防和治疗这样的糖尿病并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病。
要求保护的发明的技术效果通过使用根据下式的化合物(composition)实现：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH，其具有允许预防和治疗糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病的治疗作用。
在下图中体现本发明。
图1是在测试产品影响下的外周血中的葡萄糖浓度，M±m，mmol/l。第一个柱是开始注射产品之前的点，第二个柱是治疗的最后一天(第80天)。
*-施用测试产品组和对照组的组间在统计学上有显著性差异，事后检验(Bonferroni test)p<0.05；
#-基线和治疗的最后一天(产品注射的第80天)之间的组中在统计学上有显著性差异，t-检验p<0.05。
图2是10ppb剂量的D-肽对患有酒精神经病变的大鼠的触觉异常性疼痛(tactileallodynia)的影响。根据研究计划，用D-肽注射动物，持续100天。在建立酒精神经病变模型之前，在注射产品第1天，以及每日注射的第50天和第100天评价触觉异常性疼痛。以缩足的平均阈值(g)(M±m)给出数据。
图3是注射测试产品80天后的肠系膜动脉内膜厚度，μm。
#-与未处理组的差异(p<0.05)；
*-与对照组的差异(p<0.05，事后检验)；
**-与对照组的差异(p<0.001，事后检验)。
实施例1-5中描述了要求保护的化合物的合成。
实施例1
Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-OH的合成
在固相合成反应器中将6.0g 2-氯三苯甲基树脂(1.5mM/g容量)悬浮于45ml DCM中，保持5min；过滤树脂并且用2×30ml DCM洗涤树脂。将2.95g(9.9mM)Fmoc-Gly-OH和6ml(36mM)DIPEA溶解于30ml DCM中的溶液添加至树脂，并且在室温下搅拌60min。过滤树脂并且用2×30ml DCM洗涤树脂用2×30ml DCM/甲醇/DIPEA混合物(17:2:1)处理树脂10min，并且用2×30ml DCM和3×30ml DMF洗涤树脂。将溶解于DMF的30ml的20％二乙胺溶液添加至反应器，保持20min，过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.67g(20.0mM)Fmoc-Ser(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂并且用6×30ml DMF洗涤树脂，将30ml 20％二乙胺溶液添加至DMF、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，将30ml 20％二乙胺溶液添加至DMF、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.67g(20.0mM)Fmoc-Ser(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂并且用6×30ml DMF洗涤树脂，将30ml20％二乙胺溶液添加至DMF、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，将30ml 20％二乙胺溶液添加至DMF、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将6.75g(20.0mM)Fmoc-Pro-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂并且用6×30ml DMF洗涤树脂，将30ml20％二乙胺溶液添加至DMF、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，将30ml 20％二乙胺溶液添加至DMF、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将3.50g(20.0mM)Fmoc-Gly-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂并且用6×30ml DMF和3×30ml DCM洗涤树脂。然后，用10×30ml的溶解于DCM中的1％三氟乙酸溶液处理树脂，将产生的溶液合并于含有30ml 10％吡啶的甲醇溶液的烧瓶中。将混合物煮沸降至～50ml，将200ml水添加至残余物中。将获得的沉淀物过滤，用水洗涤并且干燥。根据HELC，获得了6.4g(91％)纯度为97％的产物。
实施例2
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(CF3COOH)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-OH的合成
在固相合成反应器中将6.0g 2-氯三苯甲基树脂(1.5mM/g容量)悬浮于45ml DCM中，保持5min；过滤树脂并且用2×30ml DCM洗涤树脂。将2.95g(9.9mM)Fmoc-Gly-OH和6ml(36mM)DIPEA溶解于30ml DCM中的溶液添加至树脂，并且在室温下搅拌60min。过滤树脂、用2×30ml DCM洗涤树脂、用2×30ml DCM/甲醇/DIPEA混合物(17:2:1)处理树脂10min并且用2×30ml DCM和3×30ml DMF洗涤树脂。将30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液负载到反应器中、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，将30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液添加至反应器中、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将11.93g(20.0mM)Fmoc-Asn(Trt)-OH、2.98g(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，将30ml 20％二乙胺溶液添加至DMF、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤、用5×30ml DMF洗涤。
将9.37g(20.0mM)Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.07g(20.0mM)Fmoc-Leu-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将10.53g(20.0mM)Fmoc-Trp(Boc)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将8.51g(20.0mM)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.07g(20.0mM)Fmoc-Ile-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.75g(20.0mM)Fmoc-Phe-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.07g(20.0mM)Fmoc-Leu-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将8.66g(20.0mM)Fmoc-Arg-OH.HCl、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将6.79g(20.0mM)Fmoc-Val-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将6.23g(20.0mM)Fmoc-Ala-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将8.51g(20.0mM)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将8.51g(20.0mM)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将8.51g(20.0mM)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF和3×30ml DCM洗涤树脂。然后，用10×30ml的溶解于DCM中的1％三氟乙酸溶液处理树脂，将产生的溶液合并于含有30ml的10％吡啶的甲醇溶液的烧瓶中。将混合物煮沸降至～50ml，将200ml水添加至残余物中。将获得的沉淀物过滤，用水洗涤并且干燥。根据HELC，获得了21.8g(80％)纯度为95％的产物。
实施例3
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Gly-OH的合成
在固相合成反应器中将6.0g 2-氯三苯甲基树脂(1.5mM/g容量)悬浮于45ml DCM中，保持5min；过滤树脂并且用2×30ml DCM洗涤树脂。将2.95g(9.9mM)Fmoc-Gly-OH和6ml(36mM)DIPEA溶解于30ml DCM中的溶液添加至树脂，并且在室温下搅拌60min。过滤树脂，用2×30ml DCM洗涤树脂，用2×30ml DCM/甲醇/DIPEA混合物(17:2:1)处理树脂10min，并且用2×30ml DCM和3×30ml DMF洗涤树脂。将30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液负载到反应器中、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将12.21g(20.0mM)Fmoc-Gln(Trt)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将9.37g(20.0mM)Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.67g(20.0mM)Fmoc-Ser(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.07g(20.0mM)Fmoc-Leu-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将8.23g(20.0mM)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.67g(20.0mM)Fmoc-Ser(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.95g(20.0mM)Fmoc-Thr(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.75g(20.0mM)Fmoc-Phe-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将7.95g(20.0mM)Fmoc-Thr(tBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将5.95g(20.0mM)Fmoc-Gly-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将8.51g(20.0mM)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将5.95g(20.0mM)Fmoc-Gly-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF洗涤树脂，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×30ml DMF洗涤，添加30ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×30ml DMF洗涤。
将9.95g(20.0mM)Boc-His(Trt)-OH、2.98g(22.0mM)HOBt和3.42ml(22.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×30ml DMF和3×30ml DCM洗涤树脂。然后，用10×30ml的溶解于DCM中的1％三氟乙酸溶液处理树脂，将产生的溶液合并于含有30ml的10％吡啶的甲醇溶液的烧瓶中。将混合物煮沸降至～50ml，将200ml水添加至残余物中。将获得的沉淀物过滤，用水洗涤并且干燥。根据HELC，获得了20.9g(85％)纯度为95％的产物。
实施例4
14-甘氨酸-毒蜥外泌肽-4(希拉毒蜥)-(l-39)-肽基-八-D-精氨酰基-甘氨酸H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH的合成
在固相合成反应器中将2.0g 2-氯三苯甲基树脂(1.5mM/g容量)悬浮于15ml DCM中，保持5min；过滤树脂并且用2×10ml DCM洗涤树脂。将0.98g(3.3mM)Fmoc-Gly-OH和2ml(12mM)DIPEA溶解于10ml DCM中的溶液添加至树脂，并且在室温下搅拌60min。过滤树脂，用2×30ml DCM洗涤树脂，用2×10ml DCM/甲醇/DIPEA混合物(17:2:1)处理树脂10min，并且用2×10ml DCM和3×10ml DMF洗涤树脂。将10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液添加至反应器中、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将2.60g(6.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl,0.98g(7.2mM)HOBt和1.12ml(7.2mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌2小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将2.60g(6.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl、0.98g(7.2mM)HOBt和1.12ml(7.2mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌4小时。过滤树脂并且用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将3.46g(8.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌3小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将3.46g(8.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌4小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将3.46g(8.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌10小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将4.33g(10.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl、1.62g(12.0mM)HOBt和1.88ml(12.0mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将4.33g(10.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl、1.62g(12.0mM)HOBt和1.88ml(12.0mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将4.33g(10.0mM)Fmoc-D-Arg-OH.HCl、1.62g(12.0mM)HOBt和1.88ml(12.0mM)DIC溶解于10ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌16小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将3.07g(8.0mM)Fmoc-Ser(tBu)-OH、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将2.70g(8.0mM)Fmoc-Pro-OH、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将2.70g(8.0mM)Fmoc-Pro-OH、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将2.70g(8.0mM)Fmoc-Pro-OH、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将2.49g(8.0mM)Fmoc-Ala-OH、1.35g(10.0mM)HOBt和1.56ml(10.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将5.90g(8.0mM)Fmoc-GlyProSer(tBu)Ser(tBu)Gly-OH(来自实施例1的产物)、1.62g(12.0mM)HOBt和1.88ml(12.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌12小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将11.35g(4.0mM)Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)Glu(OtBu)AlaValArg(HCl)LeuPheIleGlu(OtBu)Trp(Boc)LeuLys(Boc)Asn(Trt)Gly-OH(来自实施例2的产物)、0.81g(6.0mM)HOBt和0.95ml(6.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌24小时。过滤树脂，用6×10ml DMF洗涤树脂，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、搅拌5min、过滤、用3×10ml DMF洗涤，添加10ml的溶解于DMF中的20％二乙胺溶液、保持20min、过滤并且用5×10ml DMF洗涤。
将9.94g(4.0mM)Boc-His(Trt)Gly-Glu(OtBu)GlyThr(tBu)PheThr(tBu)Ser(tBu)Asp(OtBu)LeuSer(tBu)Lys(Boc)Gln(Trt)Gly-OH(来自实施例3的产物)、0.81g(6.0mM)HOBt和0.95ml(6.0mM)DIC溶解于30ml DMF中的冷却的(4℃)溶液负载到反应器中并且在室温下搅拌24小时。过滤树脂，用6×20ml DMF、4×20ml DCM洗涤树脂、干燥，添加50ml TFA/TIS/EDT/H2O混合物((97:1:1:1)、在室温下保持4小时、过滤、用3×20ml三氟乙酸洗涤，将合并的滤液煮沸降至～20ml，将60ml干醚添加至残余物。过滤获得的沉淀物、在过滤器上用醚洗涤，并且干燥。将获得的产物溶解于50ml水中，将混合物冷冻以及冻干。将冻干产物溶解于40ml水，以及应用于安伯来特(Amberlite)IRA-400(Cl形式)离子交换树脂柱。用水洗涤柱，将含有产物的级分煮沸降至～50ml，并且应用于Water X-Bridge C18反相柱，10μm，50×250mm。以50ml/min的洗脱液流量进行洗脱。A相：0.1％HCl/H2O，B相：乙腈。梯度：在70min期间0％(B)-70％(B)。将含有主要产物的级分合并，煮沸降至～50ml，冷冻和冻干。获得了3.9g(20％)纯度为97.5％的产物(HELC)。质谱：对于C231H374N82O70，理论值为：MH+5420.98，获得的实际值为：MH+5420.80。氨基酸分析：丙氨酸2.02(2)、精氨酸9.0(9)、天冬氨酸+天冬酰胺2.05(2)、谷氨酸+谷氨酰胺5.80(6)、甘氨酸7.25(7)、组氨酸1.02(1)、异亮氨酸1.03(1)、亮氨酸2.96(3)、赖氨酸2.07(2)、苯丙氨酸2.05(2)、脯氨酸4.10(4)、丝氨酸4.85(5)、苏氨酸1.90(2)和缬氨酸1.02(1)。
实施例5
使用嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)菌株合成H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH。
1.1编码PBPla的Cgl0278基因缺失的pBSΔCgl0278载体的设计
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13032的基因组序列和编码PBPla青霉素结合蛋白的Cgl0278基因的核苷酸序列是已知的(基因库(GenBank)，库存编号BA000036(版本BA000036.3GI：42602314，locus_tag＝《NCg10274》))。参考该序列合成P1、P2、P3和P4引物。在PCR的帮助下，使用染色体DNA作为以常规方法制备的嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13869菌株模板(matrix)(Saito H.和Miura K.I.,Biochim.Biophys.Acta,1963,72:619-629)和使用引物P1、P2、P3和P4，从编码PBPla的Cgl0278分别获得来自5’侧的片段(约1tpn)和来自3’侧的片段(约1tpn)。然后在PCR的帮助下，以及使用两个DNA片段作为模板以及使用P1和P4引物，获得了由两个相互结合的片段组成的DNA片段(约2tpn)。分别应用了用于限制酶BamH I和Xba I的识别位点。使用PyrobestDNA聚合酶(由Takara Bio制造)和制造商推荐的条件进行PCR。用BamH I和Xba I限制酶处理该DNA片段，以及为了获得缺失Cgl0278基因的pBSΔCgl0278载体的目的，将其添加至WO2005/113744中描述的BamH I-Xba I pBS4位点。使用DNA连接试剂盒版本2.1(由TakaraBio制造)和制造商推荐的条件进行连接。
1.2缺PBPla菌株的设计
用设计的pBSΔCgl0278载体转化WO 2004/029254中描述的嗜乙酰乙酸棒杆菌YDK010菌株。嗜乙酰乙酸棒杆菌YDK010菌株是缺少嗜乙酰乙酸棒杆菌AJ12036(FERM BP-734)(WO 2004/029254)的PS2细胞顶层蛋白的菌株。为了获得缺失Cgl278基因的YDK010ΔPBPla，从根据WO 2005/113744和WO 2006/057450的描述所获得的转化体中选择菌株。
以下显示的实施例涉及获得的肽的药理学测试。
本研究的目的是在通过向雄性大鼠单次注射链脲菌素(STZ)和烟酰胺诱导的化学实验性糖尿病模型的基础上[35]，揭示要求保护的化合物(下文中称为“D-肽”)的抗高血糖活性和在并发症中的预防和治疗作用。
使用以下医药产品进行比较：
1.百泌达(作为用于预防和治疗DM2并发症的参比医药产品)是用于皮下注射的透明溶液，250μg/1ml：BAXTER Pharmaceutical Solutions公司的预填充注射器1.2ml。
2.合成的艾塞那肽物质
3.二甲双胍(500)(作为常规的双胍类抗高血糖产品)。
使用的试剂和材料
用于确定糖基化血红蛋白水平的试剂盒("Phosphosorb"LLC,俄罗斯)。
使用的设备
1.实验室医学给药装置，10-100μl。
2.实验室医学给药装置，100-1000μl。
3.微型离心机Z 216MK(Hermle Laboitechnik GmbH,德国)。
4.葡萄糖仪OneTouch(LifeScan,美国)。
5.试纸OneTouch(LifeScan,美国)。
6.纤毛机械刺激针(Von Frey hairs)(Stoelting,美国)。
动物
动物的适应和选择
在研究开始前，将实验动物保持7天，用于适应笼子中的组管理。在这期间，通过肉眼检查的方式，每天控制动物的临床状态。在检查中检测到的具有异常的动物不被包括在实验组内。在开始实验之前，将符合入选至实验的标准的动物分组。
分组
使用修改的区组随机化的方法进行选择动物[36]。为了该目的，将从农场中递送的所有动物随机地放入随机区块小室(随机区块小室的数量是可以被实验中组的数量整除的)。然后，使用随机数发生器(统计程序Statistica 6.0)，获得含有具有动物的小室数目和它们相应的组号的数据清单，其中随后将动物放入[36]。
动物的鉴别
笼标签包括动物的性别、数量，实验开始日期和组名。通过在尾部涂上标记，为选择用于研究的每只动物分配独立的编号。
建立的关于布置、装备和管理实验性和生物诊所(植物园(vivaria))的规则，以及GOST R 53434-2009，使动物保持在标准条件下。
在标准透明塑料笼中，在垫料上以5只个体为小组保持动物；用具有饲喂穴(feeding cavity)的钢网覆盖笼子。每只动物的占地面积包括440cm2(最小允许面积为250cm2)。
将根据由苏联卫生部于1977年8月12日第755号令批准的规则，按照GOST R50258-92制备的“用于动物管理的饲料(Feed for animal management)”ΠK-120-O随意添加至钢笼网的饲喂穴(当测量葡萄糖水平，停止饲喂动物18小时)。兽医证书号247编号0294922(("Aller Petfood"LLC,俄罗斯)，以及合格证书号POCRU.riP98.H00093/0051289，有效期从2011年5月17日至2014年5月16日。
向动物供给根据SOP OЖ-OC-4纯化的，并且在GOST 51232-98“饮用水.组织和质量控制方法的一般要求(Drinking water.General requirements for organization andquality control methods)”的基础上，通过根据SOP AБ-38中的感官特性、pH值、干残渣、减少的物质、二氧化碳、硝酸盐和亚硝酸盐、氨、氯化物、硫酸盐、钙和重金属定量的水。随意供给在具有钢制手提盖的标准饮水器中的水。
将木屑颗粒6mm("ZooSPb"LLC,俄罗斯)用作垫料。使动物保持在控制的环境条件(温度为19.5-21℃，相对湿度为61-75％)下。光照管理包括12小时光照和12小时黑暗。调整提供每小时大约15个处所体积、不高于0.15vol.％的CO2浓度、不高于0.001mg/1的氨的通风管理。每日记录气温和湿度。在继续期间和在实验期间观察到这些参数没有显著的偏差。
研究设计
研究组的特性、测试物质的施用途径和持续时间
根据实验计划，动物在第0天经历用之前以柠檬酸缓冲液(pH＝6.5)稀释的65ppm的剂量，经腹部单次注射链脲菌素，来诱导实验性糖尿病。在此之前的2小时，用烟酰胺以230ppm的剂量(5％溶液)经腹部注射所有动物[35,37]。
在病理学诱导之前，对空腹大鼠(对动物停止饲喂一夜)测量外周血中的葡萄糖水平，然后在病理学诱导后的1天、3天和9天测量外周血中的葡萄糖水平。在开始注射测试物质后，每10天和在处死日测量葡萄糖水平。在葡萄糖测量的相同日，进行体重记录。在实验过程中，在注射医药产品的第60天、第70天和第80天进行异常性疼痛测试。在酒精神经病变的情况下，在注射医药产品的第1天、第50天和第100天进行触摸反应性测试。
取静脉血样品以确定在处死日动物的糖基化血红蛋白的水平。还取以下器官用于病理形态学研究：坐骨神经、部分肠系膜动脉、部分视网膜动脉、部分腓肠肌和胰腺。
实验和操作计划
注释-
*-在额外注射STZ后的第1天、第2天、第3天、第9天、第10天和第14天也进行了葡萄糖水平测量。
实施例6测定实验动物的血液中的葡萄糖
使用葡萄糖仪和试纸通过葡萄糖氧化酶测试进行大鼠外周血中的葡萄糖水平测量。在葡萄糖水平测量之前，大鼠停止饲喂但是不停止喂水一夜。测量过程如下：将具有要求的标记的动物从笼中移走，用杀菌剂处理其尾部，使用注射器针头刺破静脉，当血滴流出时，将具有试纸的葡萄糖仪放在适当的位置。将获得的数据存入初始卡片。图1中可见，在应用测试产品的背景下，观察到葡萄糖浓度减少的总趋势。用重复测量值进行的双因素方差分析(ANOVA)揭示了外周血中测试产品对葡萄糖浓度的统计学上显著的影响(F4.25＝3.49,p＝0.02)。进一步的组间比较显示了与对照组相比，用二甲双胍注射的组从注射产品的第20天开始具有显著性差异(p<0.05，事后检验)，用要求保护的肽(D-肽)注射的组从注射产品的第40天开始具有显著性差异(p<0.05，事后检验)。
治疗之前的葡萄糖基线(点“0”)和治疗的最后一天(第80天)之间的成对比较，在用二甲双胍(p＝0.017，t-检验)和D-肽(p＝0.011，t-检验)注射的组中显示了统计学上的显著性差异(图1)。
最后，可以得出结论，在持续时间为从注射的第40天开始的80天的治疗期间，要求保护的D-肽具有抗高血糖作用。肠降血糖素样产品艾塞那肽，从注射的第50天开始也显示了抗高血糖作用，虽然其强度低于D-肽的强度。百泌达的注射显示，其对外周血中的葡萄糖水平没有影响，但是参比产品二甲双胍如预期的，从治疗的第20天开始显示抗高血糖特性。
实施例7外周血中糖基化血红蛋白的测定
使用“糖尿病测试，HbAlc”试剂盒("Phosphosorb"LLC,俄罗斯)，通过对大鼠血液溶血产物中糖基化和非糖基化血红蛋白级分的亲和色谱法，进行静脉血中的糖基化血红蛋白的测定。
在每天注射测试产品的第81天，从实验动物的尾静脉采集血液样品，用于测定动物血红细胞溶血产物中的糖基化血红蛋白。表1提供了获得的数据。
表1-动物血液中糖基化血红蛋白的含量，％，M±m
注释：
#-与未处理组相比差异是统计学上显著的，对自变量的t-检验p<0.05，
*-与对照组相比差异是统计学上显著的，事后检验p<0.05。
在表1的数据中可见，在对照组动物中观察到与未处理组相比，HbAlc浓度统计学上显著地提高了4倍(p＝0.0002，t-检验)。测量数据具有实验病理学明显发展的特征。
在测试产品的应用的背景下确定HbAlc浓度的统计学上显著减少(F4.17＝11.83，p<0.0001)。进一步的组间比较揭示了在施用了要求保护的D-肽的组(p<0.0001)和二甲双胍组(p<0.0001)中的最大治疗效果，而这种效果在经历用百泌达和艾塞那肽治疗的组中没有如此明显(分别是p＝0.0018和p＝0.0015)。
实施例8对具有糖尿病性神经病变的大鼠的触觉异常性疼痛评价
将大鼠放入具有由金属丝制成的格栅地板的塑料笼内，并且将大鼠留在该笼内5分钟以消除定向响应。使用由8种标准纤毛机械刺激针(Stoelting,美国)组成的试剂盒通过Chaplan等人的方法确定触觉响应性的平均有效阈值[38]。毛发弯曲所需的毛发粗度表示为最小力，其随绝对值0.692至28.840g对数地增加。
首先对每只大鼠的左足测定阈值，然后测定右足的阈值。毛发末端以毛发弯曲所需要的力接触足的跖面中部，并且留在该位置6-8秒。在接触过程中，如果动物突然缩回它的足，或者在移开毛发后，足强烈弯曲，则记录为阳性反应。
从对应于3.630g的力的毛发应用开始测试。然后以增加的和减少的顺序使用刺激物(毛发)。在阳性反应的情况下，使用具有最小粗度的毛发，同时，在阴性反应的情况下，使用具有最大粗度的毛发。在初始测定敏感度阈值之后，根据相同的原则，使用4根更多的毛发。
通过Dixon描述的方法计算触觉反应性精神生理平均有效阈值[39]。
表2表示注射测试产品80天对触摸异常性疼痛的发展程度影响的研究结果。
在注射医药产品后60天前完成的实验中，对照组中的触摸异常性疼痛的表现是最大的(F1；14＝669.8,p<0.0001)，这表明具有明显疼痛综合征的糖尿病性神经病变模型的建立。
进行用重复测量值进行双因素方差分析的统计处理，用于进一步评估获得的结果，该统计处理允许测定因素“医药产品的注射”对触摸异常性疼痛表达的意义(F4.43＝10.93；p<0.0001)。进一步的组间比较(事后检验)显示在从注射第60天开始施用D-肽的组中，触摸异常性疼痛强度减少。表3显示所有使用的物质的F-标准值。随后的组间比较(事后检验)证实了仅在施用了要求保护的D-肽的组中的显著影响。
表2-测试产品对大鼠触摸异常性疼痛的影响。在注射测试产品之前评估触摸异常性疼痛。以缩足阈值的平均值给出数据(g)(M±m)。
注释-
#-与未处理组相比差异是统计学上显著的，对自变量的t-检验p<0.05，
*-与对照组相比差异是统计学上显著的，事后检验p<0.05。
表3-在注射测试产品的背景下通过触摸异常性疼痛表达的统计数据处理的结果
指示剂 F-标准值 P-值
对照组 Fl；14＝669.8 <0.0001
百泌达 Fl；14＝5.78 0.03
艾塞那肽 Fl；14＝4.66 0.04
D-肽 Fl；14＝22.52 0.0003
二甲双胍 Fl；14＝2.87 0.01
因此，测试产品的作用的研究显示如下：在指示剂的个体比较中，百泌达、艾塞那肽和二甲双胍轻微地减少异常性疼痛表现强度，然而进一步的组间比较没有证实统计学上显著的影响。从注射的第60天开始，要求保护的D-肽的注射显著减少患有糖尿病性神经病变的大鼠的异常性疼痛表现(表2-3)。该观察结果使得得出结论：在长期治疗的情况下(从注射的第60天开始)，存在与最普遍的并发症DM2之一，糖尿病性周围神经病变相关的一定的治疗作用，所述糖尿病性周围神经病变可能受要求保护的D-肽的神经保护作用的制约。
实施例9对患有酒精神经病变的大鼠的触摸异常性疼痛的评估
以与实施例7相同的方式进行触摸异常性疼痛的评估。根据表明建立了具有明显的疼痛综合征的酒精神经病变模型的强制饮用方法[40]，从大鼠消耗30％酒精的第8周(56-60天)开始，观察酒精神经病变的症状(触摸异常性疼痛)(F1；12＝26.25；p＝0.0003；图2)。
进行用重复测量值进行的双向方差分析的统计处理，用于进一步评估获得的结果，所述统计处理允许测定因素“医药产品的注射”对触摸异常性疼痛的发展程度的意义(F1.10＝8.79；p<0.014)。进一步的组间比较(事后检验(post hoc))显示，在注射的第100天，与在对应测量点的对照组相比，用要求保护的D-肽处理的组中触摸异常性疼痛强度减少(p<0.05；事后检验；图2)。
总结所有前述内容，可以得出结论，要求保护的D-肽具有与在酒精神经病变和糖尿病性周围神经病变期间发展的神经退行过程相关的神经保护特性。
病理形态学研究
在实验结束，对所有实验动物进行病理形态学研究。
病理形态学研究包括尸体剖验、宏观检查，对以下内脏的组织学检查：坐骨神经的中心部分、视网膜动脉、部分肠系膜动脉、部分腓肠肌、胰腺。在病理学家的直接监督下进行尸体剖验。将特定组织的样本切下，并且放入10％中性福尔马林溶液中，同时将眼球用戴维森锁(Davidson lock)固定24小时，然后材料经过标准处理用于产生具有5-7μm的系列石蜡切片厚度的组织学和组织化学标本。用苏木精和伊红对用于显微镜检查的组织和器官切片染色。通过Nissl方法用苏木精和伊红、甲苯胺蓝，和通过van Gieson方法用苦味酸酸性品红(picro-fuchsin)对神经组织样本染色。为了揭示髓磷脂纤维和髓磷脂分解产物，通过Lieson方法用苏丹黑(Sudan black)对在冷冻切片机上获得的神经横截面和纵截面染色[41,42,43]。用矾紫对细胞核复染。通过van Gieson方法用苏木精、伊红和苦味酸酸性品红对腓肠肌样本染色。
使用光学显微镜Carl Zeiss(德国)以100、200和400的放大倍数进行组织样本的形态学检查。使用数码照相机Axio Scope Al(德国)进行显微照相术。使用软件AxioVision Rel.4.8和图像编辑器PhotoM 1.21半自动地和手动地进行形态测量。
为了评估测试物质的作用，对它们对以下的影响进行了比较组织学评价：
1.胰腺的胰岛部分(Pancreatic gland insular apparatus)，在此处进行了胰岛面积(islet area)的测量；
2.视网膜的肌型动脉和微循环血流(小动脉和毛细血管)，肠系膜动脉，在此处进行了毛细血管直径和动脉内膜厚度的形态测量；
3.坐骨神经状态；
4.骨骼肌系统(somatic musculature)的状态。
实施例10大鼠肠系膜动脉内膜的状态评估
图3示出了关于测试物质对大鼠肠系膜动脉内膜状态的影响的数据。在未处理组和对照组的成对比较中显示，对照组中发生血管内膜厚度显著增加(p<0.0001，t-检验)。这种厚度增加和血管内膜肿胀证实了内皮细胞病过程的发展。进一步的单因素方差分析(ANOVA)显示了长期注射测试物质防止了大鼠肠系膜动脉的血管内膜厚度的增加(F4.25＝12.87；p＝0.0001)。组间对比显示，与对照组相比，所有组中的血管内膜厚度显著减小(p<0.05，事后检验)。在施用了要求保护的D-肽的组中，观察到最大作用(p<0.0001，事后检验)。
实施例11坐骨神经组织的状态评估
基于在神经组织中确定的病理形态学改变可以得出结论：STZ诱导的2型糖尿病的建模伴随糖尿病性神经病变的明显病症，该病症的特征是神经干的厚度和直径减小，髓鞘的变形和肿胀、受影响的神经纤维、间质组织水肿、神经外膜和神经束膜中脂质的异常积累，以及神经内结缔组织的生长。
单根纤维处于水样变性的状态。在脱髓鞘病灶处观察到表明持续的髓鞘降解的小嗜苏丹颗粒(small sudanophilic granules)的聚集体。
注射二甲双胍对神经组织不具有治疗作用。在该组的组织样本中观察到：明显的多形核细胞浸润伴随局灶性髓鞘变性中所表现的神经干和神经纤维、神经束膜和神经外膜的重度损伤，以及纤维的肿胀和变形，髓鞘降解产物如与未受影响的髓鞘纤维的基膜相邻的嗜苏丹颗粒的发生。
当注射和艾塞那肽时，仅观察到神经束膜和神经内膜中脂质的显著积累。明显的是，该组中的退化现象大幅度降低或完全不发生。相反，注射要求保护的D-肽具有正面的治疗作用，然而没有显示与未处理组动物的坐骨神经的结构上的明显的形态学差异。
在神经组织指标的病理形态学分析过程中确定的是，与未处理动物相比，对照组中的神经干厚度显著减小(p<0.0001；t-检验)，这可以表明组织中的退行性改变，并且可以由病理学发展的病理形态学状态证明(表4)。
表4-在测试物质的作用下神经组织的形态测量指标
注释：
#-与未处理组的差异(p<0.05)；
*-与对照组的差异(p<0.05)；
**-与对照组的差异(p<0.01)。
如上所述，在施用了二甲双胍的组中神经组织样本的病理形态学状态表明神经干水肿及其厚度的过度增加，这意味着病理增强，而不是治疗作用。在这方面进行不包含上述组的统计分析。单因素方差分析(ANOVA)揭示了注射测试物质对神经干厚度的显著影响(F3.34＝4.83；p＝0.007)。进一步的组间比较(事后检验)证实了与对照组相比，施用要求保护的D-肽的组中神经干厚度的显著增加(p<0.01；事后检验)。
在这样的病理形态测量指标如神经内膜结缔组织面积的分析中确定的是，在病理学建模时存在的神经内结缔组织显著生长(p<0.0018；t-检验)，这可能表明了退行性表现的优势超过修复表现[Karpova和Krishtop,2013]。执行单因素方差分析(ANOVA)显示注射测试物质对神经内结缔组织面积的显著影响(F4.25＝8.58；p＝0.0002)。进一步组间比较(事后检验)证实了在所有组中神经内结缔组织面积的显著减小(p<0.01；事后检验)。在施用了要求保护的D-肽(p＝0.0002；事后检验)(表4)的组中记录了最大作用，其可以被看作是神经组织中增强的修复过程。
实施例12肌肉组织(腓肠肌)的状态评估
基于腓肠肌的横纹肌组织中确定的病理形态学改变可以得出结论：实验性DM2进展伴随肌肉萎缩症的明显症状，其特征是肌肉纤维变薄和变形、周围结缔组织的中度生长、在某些情况下萎缩的纤维取代胶原结缔组织，以及肌细胞核(肌细胞核(myonuclei))数量的增加。在具有纤维萎缩的动物的肌内膜和肌束膜的结缔组织中发现了中度的炎性浸润。
在施用了和艾塞那肽的组中观察到结缔组织的局灶性生长并取代受影响的肌纤维和中度的淋巴细胞性浸润。在肌细胞核比增加的背景下，在施用了二甲双胍的组中观察到最小的纤维和间质组织的局灶性炎性浸润。
在确定的病理学的背景下，注射要求保护的D-肽对肌肉组织具有明显的治疗作用。在这些组的单个病例中发现了病理学改变，并且与对照组相比病理学改变是轻微的。
当分析肌纤维的截面积时，确定的是实验性2型DM的进展伴随肌肉组织纤维截面积的显著减小(p<0.0001；t-检验)，并且纤维内肌细胞核的数量同时减少(约70％)，这可以作为肌肉萎缩症的标志。单因素方差分析(ANOVA)的执行显示了注射测试物质对肌纤维截面积的显著影响(F4.22＝13.67；p＝0.0001)。进一步的组间比较(事后检验)证实了在所有组中肌纤维的截面积显著增加(p<0.01；事后检验)，除了施用了的组以外(p＝0.051；事后检验)。在施用了艾塞那肽(p<0.0001；事后检验)和要求保护的D-肽(p＝0.0004；事后检验)的组中记录了最大的作用(表5)。
表5-在测试物质的作用下腓肠肌的肌纤维的截面积，(M±m)
注释：
#-与未处理组的差异(p<0.05)；
*-与对照组的差异(p<0.05)；
**-与对照组的差异(p<0.0001)。
实施例13胰腺的胰岛部分(Pancreatic gland insular apparatus)
表6示出了关于测试物质对测试动物的胰腺的胰岛部分的影响的总结数据。在未处理组和对照组中的成对比较显示，朗格汉斯氏岛(Langerhans islets)的显著减少发生于对照组中(p<0.0001，t-检验)。这种岛状器官面积的减小意味着病理的发展，也与外周血中葡萄糖水平的提高相关。对照组与实验组的成对比较揭示了注射所有测试物质对胰岛面积的统计学上显著影响(表7)。该观察结果表明长期注射测试物质导致胰岛面积的增加，因此促进胰腺的胰岛部分的修复过程。
表6-在注射测试产品80天后胰腺的胰岛部分的状态的形态测量指标
注释：
#-与未处理组的差异(p<0.05)；
*-与对照组的差异(p<0.05，t-检验)；
表7.多次注射测试产品之后的胰岛面积的数据的统计处理结果(学生检验)
组 P-值
对照组 p<0.0001#
百泌达 P＝0.019*
艾塞那肽 P＝0.04
D-肽 P＝0.011*
二甲双胍 P＝0.001*
注释：
#-与未处理组大鼠比较(p<0.001)
*-与对照组大鼠比较(p<0.05)
因此，在器官和组织的病理形态学分析中揭示了，链脲菌素诱导的2型糖尿病的建模伴随内皮细胞病、胰腺的胰岛部分的面积减小以及糖尿病性周围神经病变发展的明显症状和大腿横纹肌中的营养不良性改变。
在注射要求保护的D-肽80天后，观察到最大的和明显的治疗效果。该化合物的注射对于2型糖尿病的并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症、内皮细胞病具有积极的治愈作用，并且对胰腺的胰岛部分的修复过程具有有利的影响。组织样本的分析与临床数据有关。特别地，从实验动物的异常性疼痛体征的表现和红细胞中糖基化血红蛋白含量减少观察到明显的治愈作用。还注意到了该化合物与二甲双胍相当的明显的抗高血糖作用。
考虑到前述内容，可以得出结论：要求保护的D-肽是用于治疗2型糖尿病并发症尤其是糖尿病性神经病变的高效药剂，并且其具有对于酒精神经病变的神经保护作用。
参考文献清单：
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Claims (2)

1.一种嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)菌株，其是H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH的生产者。
2.一种由下式表示的化合物：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH，
其具有用于治疗和预防2型糖尿病及其并发症的治疗作用，所述并发症如糖尿病性神经病变、肌肉萎缩症和内皮细胞病。
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