CN109021075B

CN109021075B - 一种降血糖十肽

Info

Publication number: CN109021075B
Application number: CN201811015827.4A
Authority: CN
Inventors: 张学武; 姚雨杉; 范晓丹; 胡双飞
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN109021075A

Abstract

本发明公开了一种降血糖十肽，所述十肽的氨基酸序列如下所示：Leu‑Arg‑Ser‑Glu‑Leu‑Ala‑Ala‑Trp‑Ser‑Arg，缩写为LRSELAAWSR，分子量1188.35Da，纯度为95.2%。本发明的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。体外α‑淀粉酶和α‑葡萄糖苷酶的抑制活性检测表明，对2种酶都有良好抑制作用，对α‑淀粉酶的50%抑制浓度（IC50）为313.6μg/mL，对α‑葡萄糖苷酶的50%抑制浓度（IC50）为134.23μg/mL。本发明提供一种降血糖十肽，可应用于生物制药领域。

Description

一种降血糖十肽

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种降血糖十肽。

背景技术

糖尿病是一种慢性病，是由于体内胰岛素不足引起的蛋白质、脂肪、碳水化合物代谢紊乱，主要特点是慢性高血糖。研究发现有许多天然的抗糖尿病有效成分，譬如：银杏叶提取物、植物多糖等。生物活性多肽的降血糖方面的研究较少。已有的一些研究表明，生物活性肽能有效改善糖尿病的作用。例如，在王军波等的研究中，海洋胶原肽能够缓解高胰岛素血症大鼠的胰岛β细胞的结构损伤，增加颗粒的分泌，减少脂滴的形成，显著提高胰岛素的生物学活性；显著降低的空腹胰岛素水平，对空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作用。在黄凤杰等的研究中，鲨鱼肝活性肽S-8300有抗氧化作用，通过清除自由基保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢，延缓胰岛β细胞的衰竭，在一定程度上能够治疗糖尿病。

人体中淀粉等糖类物质的消化吸收，需要依赖α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶这两种关键酶。因此，抑制这两种关键酶的活性便能减缓碳水化合物降解为单糖的速度，以达到调控餐后血糖升高过快的目的。

发明内容

本发明选取α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶为研究对象，测定合成肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外降血糖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。

本发明所述的一种降血糖十肽缩写为LRSELAAWSR，分子量1188.35Da，纯度为95.2％，序列为：Leu-Arg-Ser-Glu-Leu-Ala-Ala-Trp-Ser-Arg。其中，

Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；

Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；

Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；

Glu表示英文名称为Glutamic acid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；

Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；

Trp表示英文名称为Tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基；

Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。

进一步地，所述十肽对α-淀粉酶有抑制活性，IC50值为313.6μg/mL。

进一步地，所述十肽对α-葡萄糖苷酶的50％抑制浓度(IC50)为134.23μg/mL。

进一步地，所述十肽在浓度2.5-5mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率是77％-81％。

进一步地，所述十肽在浓度1-2.5mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率是120％-128％。

本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。

本发明通过研究合成肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用来确定其降血糖作用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明首次合成了该肽，并且检测了合成多肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，所述合成多肽具有降血糖能力。

附图说明

图1a为合成多肽Leu-Arg-Ser-Glu-Leu-Ala-Ala-Trp-Ser-Arg的HPLC图。

图1b为合成多肽Leu-Arg-Ser-Glu-Leu-Ala-Ala-Trp-Ser-Arg的MS图。

图2a为合成多肽Leu-Arg-Ser-Glu-Leu-Ala-Ala-Trp-Ser-Arg对α-淀粉酶的抑制活性曲线。

图2b为合成多肽Leu-Arg-Ser-Glu-Leu-Ala-Ala-Trp-Ser-Arg对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此，需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。

多肽固相合成

选用高分子树脂(中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列Leu-Arg-Ser-Glu-Leu-Ala-Ala-Trp-Ser-Arg的特征，先将Leu的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Leu的氨基和Arg的羧基缩水反应，处理后，再添加Ser，Arg的氨基和Ser的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Arg氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Phenomenex C18，尺寸4.6*150mm，流动相A:含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的水；流动相B:含有0.09％TFA(v/v)的溶液(80％乙腈+20％水)；20min内B相由14.0％上升到24.0％，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，要求纯度达到97.04％以上，并经MS鉴定结构(如图1所示)。

合成多肽对α-淀粉酶的体外抑制活性

1试剂的配制

1)0.2M磷酸缓冲液：称取Na2HPO4 2.84g、KH2PO4 2.72g分别溶于100mL蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至pH＝6.9，搅拌过程用pH计测量实时酸碱度。

2)1U/mL淀粉酶溶液：取淀粉酶4μL，与1996μL蒸馏水混合，配成2mL酶液。

3)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉，溶于99mL缓冲液中。

4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同剂量的样品溶液(0～10mg/mL)，溶剂为10％DMSO。

5)DNS终止反应液：称取1g DNS，12g酒石酸钠钾于锥型瓶中，加入87mL0.4MNa2CO3溶液。

6)阿卡波糖溶液：用于阳性对照，称取一定量阿卡波糖配制成不同浓度梯度的溶液(0～8mg/mL)。

2实验步骤

1)1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。

2)实验组用移液枪吸取抑制剂(0～10mg/mL)20μL与酶液10μL于试管中混合，对照组缓冲液20μL与酶液10μL混合，阳性对照组取阿卡波糖(0～8mg/mL)20μL与酶液10μL混合，于37℃摇床反应15min。

3)加入经预处理的淀粉溶液500μL，于37℃摇床反应5min。

4)加入DNS溶液600μL，100℃水浴15min。

5)反应结束后，用移液枪吸取200μL反应液，于540nm测吸光度,实验组与对照组分别用A_实验组与A_对照组表示。

合成多肽对α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性

1试剂的配制

2)P-NPG溶液：底物溶液，称取0.003765g p-NPG,溶于15mL蒸馏水中。

3)0.2U/mLα葡萄糖苷酶液：吸取已分装的酶液(200U/ml)5μL，用蒸馏水配成5mL。

4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同浓度的样品溶液(0～10mg/mL)，溶剂为10％DMSO。

5)0.2M Na2CO3：称取0.848g Na2CO3，溶于40mL蒸馏水中。

2实验步骤

1)于96孔板中反应，实验组、背景组、对照组、阳性对照组添加试剂如表1所示，于37℃摇床反应20min。

表1样品的添加量

2)各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μL Na2CO3溶液终止反应。

3)于405nm测吸光度。

应用实施例1

取1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。实验组用移液枪吸取十肽(2.5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL于试管中混合，对照组缓冲液20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，阳性对照组取阿卡波糖(5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，于37℃摇床反应15min。加入经预处理的淀粉溶液500μL，于37℃摇床反应5min。加入DNS溶液600μL，100℃水浴15min。反应结束后，用移液枪吸取200μL反应液，于540nm测吸光度，计算抑制率。由图2a可知，十肽对α-淀粉酶的抑制率是77％。

应用实施例2

取1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。实验组用移液枪吸取十肽(5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL于试管中混合，对照组缓冲液20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，阳性对照组取阿卡波糖(5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，于37℃摇床反应15min。加入经预处理的淀粉溶液500μL，于37℃摇床反应5min。加入DNS溶液600μL，100℃水浴15min。反应结束后，用移液枪吸取200μL反应液，于540nm测吸光度，计算抑制率。由图2a可知，十肽对α-淀粉酶的抑制率是81％。

应用实施例3

于96孔板中添加实验组(十肽(2.5mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、背景组(十肽(2.5mg/mL)20μL与缓冲液10μL)、对照组(缓冲液10μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、阳性对照组(阿卡波糖溶液(2.5mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)，于37℃摇床反应20min。各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μLNa2CO3溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图2b可知，十肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是128％，是阿卡波糖抑制率(50％)的2倍。

应用实施例4

于96孔板中添加实验组(十肽(1mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、背景组(十肽(1mg/mL)20μL与缓冲液10μL)、对照组(缓冲液10μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、阳性对照组(阿卡波糖溶液(1mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)，于37℃摇床反应20min。各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μLNa2CO3溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图2b可知，十肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是120％，是阿卡波糖抑制率(28％)的4倍。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种降血糖十肽

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 十肽(LRSELAAWS)

<400> 2

Leu Arg Ser Glu Leu Ala Ala Trp Ser Arg

1 5 10

Claims

1.一种降血糖十肽，其特征是该十肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Ser-Glu-Leu-Ala-Ala-Trp-Ser-Arg，缩写为LRSELAAWSR。

2.权利要求1 所述的降血糖十肽在制备降血糖药物中的应用，其特征在于所述十肽对α-淀粉酶有抑制活性，IC50值为313.6μg/mL。

3.权利要求1所述的降血糖十肽在制备降血糖药物中的应用，其特征在于所述十肽对α-葡萄糖苷酶的50%抑制浓度（IC50）为134.23μg/mL。

4.权利要求1 所述的降血糖十肽在制备降血糖药物中的应用，其特征在于所述十肽在浓度2.5-5 mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率是77%-81%。

5.权利要求1 所述的降血糖十肽在制备降血糖药物中的应用，其特征在于所述十肽在浓度1-2.5mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率是120%-128%。