CN108251485A - 一种功能性混合植物肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种功能性混合植物肽及其应用，该技术方案首先设计了植物蛋白原料的混配方案，并优选了参与酶解的复合酶体系，而后以特定的亚临界条件执行酶解，再进行三级过滤，从而获得三种不同分子量的肽溶液；将三种肽溶液按比例复配后，经减压浓缩、喷雾干燥即到粉状的混合植物肽产品。该技术方案可控制产品的肽分子量大小和不同肽段的添加量，为植物多肽产品的精细化发展奠定了基础。在此基础上，本发明基于实验手段考察了上述混合植物肽的保健功能，动物实验表明，口服该产品有助于增强免疫力、提升抗氧化能力，同时，对化学性肝损伤具有一定的保护效果。基于以上有益的性质，本发明确定了利用其制备相关保健制剂的用途，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及功能性食品技术领域，进一步涉及植物蛋白的酶解和分离技术，具体涉及一种功能性混合植物肽及其应用。
背景技术
植物蛋白资源来源丰富，具有产量高、价格低的优势，通过酶法水解植物蛋白制备植物多肽粉，符合现代食品生物工业的发展要求，具有广阔的应用前景。研究发现，植物蛋白酶解物及其生物活性肽类物质，不仅能作为氨基酸供体，在体内具有优良的消化吸收性能，也是一类生理调节剂，在体内参与机体免疫调节、降血压、促进矿物质吸收、抗血栓等。
除了序列特征之外，多肽的微观结构、分子量等特征对其生理性能也具有直接影响，因此，要实现对多肽产品性能的控制，首先要在植物蛋白酶解、分离工艺中实现对肽分子大小、不同肽段添加量的可控化。现有技术中，针对植物蛋白的酶解、分离手段较为粗放，难以对酶解程度或截留对象实现精准控制，因而所获得的产品普遍存在着分子量较大、不同肽段混杂的问题，这直接影响了产品性能。具体来看，有研究者披露了固态发酵与液体酶解相结合的生产蛋白肽的方法，该方法采用豆粕与鱼或鱼类下脚料来制备蛋白肽，蛋白分子量较大，且动物和植物肽的配比不可调控；另有研究者披露了植物蛋白肽的提取方法，但该方法不能梯度截留不同分子量的肽，因而生理功能单一；此外，还有研究者所披露的植物蛋白肽制备方法，所得产物普遍较为粗糙，仅用于动物饲料中。
另外，现有技术中对植物多肽的性能研究并不充分，尤其是对于成分较为明确的植物多肽产品，有必要获得确切的生理调节性能，从而为其作为保健品的应用奠定基础。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种功能性混合植物肽及其应用，以解决现有技术中植物多肽的常规制备方法难以控制所得产品肽分子大小和不同肽段添加量的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是如何提升植物多肽产品的保健效果。
本发明要解决的再一技术问题是如何拓展植物多肽产品在制备保健制剂方面的用途范围。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种功能性混合植物肽，该功能性混合植物肽是通过以下方法制备的：
1)取大豆分离蛋白0～5重量份、玉米蛋白0～5重量份、绿豆蛋白0～5重量份、大米分离蛋白0～5重量份、豌豆分离蛋白0～5重量份混合，得到混合料，其中至少有2种成分的用量不为0；将所述混合料与水按1:1的质量比混合均匀，过匀浆机，得到混合原料浆液；
2)取碱性蛋白酶0～3重量份、木瓜蛋白酶0～3重量份、胰蛋白酶0～3重量份、无花果蛋白酶0～3重量份、胰凝乳蛋白酶0～3重量份、菠萝蛋白酶0～3重量份混合，得到复合蛋白酶，其中至少有2种蛋白酶的用量不为0；
3)将所述混合原料浆液、所述复合蛋白酶与水三者混合，得到复合蛋白酶质量浓度为8～10％、混合原料浆液质量浓度为8～10％的混合物，调整所述混合物pH为6.5～7.5，而后在亚临界条件下，以压力0.6～0.8MPa、温度45～55℃的条件酶解2～3h；
4)将步骤3)所得的酶解产物升温至85～90℃，保持10～15min，而后冷却至常温；
5)将步骤4)所得产物进行微滤分离，其截留分子量为5～8kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅰ；取肽溶液Ⅰ进行超滤分离，其截留分子量为2～5kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅱ；取肽溶液Ⅱ进行纳滤分离，其截留分子量为500～2000Da，取滤过物即为肽溶液Ⅲ；
6)取肽溶液Ⅰ0～5重量份、肽溶液Ⅱ0～5重量份、肽溶液Ⅲ0～5重量份混合，得到混合肽溶液，在85～95℃条件下将所述混合肽溶液减压浓缩至1/2～1/3体积，再将浓缩产物进行喷雾干燥，得到所述功能性混合植物肽。
作为优选，步骤6)中所述喷雾干燥的喷雾压力为15～20MPa，进风温度为120～160℃，出风温度为80～90℃，控制水分含量10～15％。
作为优选，步骤6)中肽溶液Ⅰ、肽溶液Ⅱ、肽溶液Ⅲ的用量均不为0。
作为优选，步骤5)中所述微滤分离是利用孔径为0.45μm的滤器完成的。
同时，本发明还提供了上述功能性混合植物肽用于制备缓解化学性肝损伤的保健制剂的应用。其中，所述缓解化学性肝损伤的保健制剂，是指对化学性肝损伤具有保护作用或缓解作用的保健制剂。
作为优选，所述保健制剂缓解昆明小鼠因接触四氯化碳所导致的血清ALT、AST含量升高。
同时，本发明还提供了上述功能性混合植物肽用于制备抗氧化保健制剂的应用。其中，所述抗氧化保健制剂，是指有助于提升机体抗氧化能力的保健制剂。
作为优选，所述抗氧化保健制剂降低昆明小鼠肝脏中MDA含量并提升其中T-AOC含量。
同时，本发明还提供了上述功能性混合植物肽用于制备增强免疫力保健制剂的应用。其中，所述增强免疫力保健制剂，是指有助于提升机体免疫力的保健制剂。
在以上技术方案中，所述保健制剂是指具有保健功效并调节人体机能的产品，包括但不限于保健食品、营养品、膳食补充剂等。
在以上技术方案中，作为植物蛋白原料的大豆分离蛋白、玉米蛋白、绿豆蛋白、大米分离蛋白、豌豆分离蛋白均为常规产品，可自市面购得，亦可依据本领域的一般技术常识自行制得。而碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶均属于本领域的常规酶类，可自市面购得。
本发明提供了一种功能性混合植物肽及其应用，该技术方案以制备方法对其进行了表征，该方法首先设计了植物蛋白原料的混配方案，并优选了参与酶解的复合酶体系，而后以特定的亚临界条件执行酶解，再进行三级过滤，从而获得三种不同分子量的肽溶液；将三种肽溶液按比例复配后，经减压浓缩、喷雾干燥即到粉状的混合植物肽产品。该技术方案以植物蛋白为原料，通过亚临界酶解技术，结合三级膜分离技术，可控制产品的肽分子量大小和不同肽段的添加量，为植物多肽产品的精细化发展奠定了基础。
在此基础上，本发明基于实验手段考察了上述混合植物肽的保健功能，动物实验表明，口服该产品有助于增强免疫力、提升抗氧化能力，同时，对化学性肝损伤具有一定的保护效果。基于以上有益的性质，本发明确定了利用其制备相关保健制剂的用途，具有良好的应用前景。本发明产品可用于调节亚健康状态，抑制亚健康人群向疾病方向发展，具有平衡营养、协同增效的作用。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。
实施例1
一种功能性混合植物肽，是通过以下方法制备的：
1)取大豆分离蛋白1重量份、豌豆分离蛋白5重量份混合，得到混合料；将所述混合料与水按1:1的质量比混合均匀，过匀浆机，得到混合原料浆液；
2)取碱性蛋白酶1重量份、菠萝蛋白酶3重量份混合，得到复合蛋白酶；
3)将所述混合原料浆液、所述复合蛋白酶与水三者混合，得到复合蛋白酶质量浓度为8％、混合原料浆液质量浓度为8％的混合物，调整所述混合物pH为6.5，而后在亚临界条件下，以压力0.6MPa、温度45℃的条件酶解2h；
4)将步骤3)所得的酶解产物升温至85℃，保持10min，而后冷却至常温；
5)将步骤4)所得产物进行微滤分离，其截留分子量为5～8kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅰ；取肽溶液Ⅰ进行超滤分离，其截留分子量为2～5kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅱ；取肽溶液Ⅱ进行纳滤分离，其截留分子量为500～2000Da，取滤过物即为肽溶液Ⅲ；
6)取肽溶液Ⅰ1重量份、肽溶液Ⅱ3重量份、肽溶液Ⅲ5重量份混合，得到混合肽溶液，在85℃条件下将所述混合肽溶液减压浓缩至1/2体积，再将浓缩产物进行喷雾干燥，得到所述功能性混合植物肽。
实施例2
本实施例用于考察以上实施例1所提供的功能性混合植物肽对动物免疫能力的影响。
动物实验评价方法：二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应(耳肿胀法)。
具体操作：
①灌胃：将昆明种小鼠随机均分为阴性对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组，每组10只。给试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组大鼠每日灌胃受试物，剂量分别为0.25，0.50，0.75g/kgBW(按混合植物肽粉重计，配制灌胃液浓度0.52g/mL)，分别相当于人体推荐每公斤体重日摄入量的5、10、20倍；空白对照组则灌胃同体积的蒸馏水。每日1次，连续30d。同时，各组大鼠均自由摄食与饮水。
②致敏：30d后，每鼠腹部皮肤用婴儿理发器脱毛，范围约3cm×3cm，用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。
试验结果：
如表1所示，在二硝基氟苯致敏作用下，口服特定浓度混合植物肽的实验动物其左右耳重量差值较空白组具有一定程度的提升，这表明口服实施例1混合植物肽对动物免疫力具有一定的辅助促进效果。
表1小鼠耳肿胀试验结果
实施例3
本实施例用于考察以上实施例1所提供的功能性混合植物肽对化学性肝损伤的保护作用。
动物实验评价方法：以CCl4致化学性肝损伤模型大鼠的血清生化指标测试。
具体操作：
①灌胃：将昆明种小鼠随机均分为阴性对照组、模型对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组，每组8只。给试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠每日灌胃受试物，剂量分别为1.08，2.17，4.33g/kgbw(按混合植物肽粉重计，配置灌胃液浓度0.13g/mL)，分别相当于人体推荐每公斤体重日摄入量的5、10、20倍；空白对照组和模型对照组则灌胃同体积的蒸馏水。每日1次，连续30d。同时，各组大鼠均自由摄食与饮水。除空白对照组外，其余4组大鼠隔夜禁食16h后，于第31天均按5mL/kg剂量灌胃2％浓度的CCl4溶液(精制菜油配制)，4h后继续给予受试物。灌胃CCl4溶液后48h，股静脉放血处死老鼠，分离血清，测定ALT、AST、TG水平，并取肝脏观察病理损伤情况。
②血清生化指标测定：大鼠股静脉取血后，静置，3000r/min离心10min后得血清，采用速率法以丙氨酸氨基转移酶(ATP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)测定试剂盒操作方法，采用紫外可见分光光度计测定血清ALT、AST和TG值。
如表2所示，对于CCl4致化学性肝损伤的实验动物，口服混合植物肽有助于降低其肝脏血清中ALT、AST含量，且效果与剂量在一定范围内具有正相关性；这表明口服实施例1的混合植物肽，可对CCl4致化学性肝损伤起到一定的辅助缓解作用。
表2口服混合植物肽对实验动物血清中ALT、AST、TG含量的影响
与阴性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01
实施例4
本实施例用于考察以上实施例1所提供的功能性混合植物肽的抗氧化能力。
动物实验评价方法：肝脏匀浆中MDA、T-AOC含量测定。
具体操作：
①灌胃：动物分组与喂养40只老龄(12月龄)雄性昆明小鼠和10只少龄(1月龄)雄性昆明小鼠(18～22g)，适应性喂养5d后将老龄小鼠被随机分成4组(每组10只)：老龄模型组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组。少龄雄性昆明小鼠作为对照组，其中老龄模型组和少龄对照组每日灌胃生理盐水，其他各组每日分别灌胃剂量分别为1.08，2.17，4.33g/kgbw(按混合植物肽粉重计，配置灌胃液浓度0.13g/mL)，连续灌胃30d，喂养普通饲料。
②MDA和T-AOC的测定：如表3所示，口服混合植物肽后，老龄小鼠肝脏中T-AOC含量得到显著提升，其中剂量为4.33g/kgbw的实验组其T-AOC含量甚至接近少龄组水平；同时，肝脏中MDA含量呈下降趋势。由此可见，口服实施例1的混合植物肽可辅助提升机体抗氧化能力。
表3口服混合植物肽对实验动物肝脏中MDA、T-AOC含量的影响
实施例5
一种功能性混合植物肽，是通过以下方法制备的：
1)取大豆分离蛋白5重量份、玉米蛋白5重量份、绿豆蛋白5重量份、大米分离蛋白1重量份、豌豆分离蛋白1重量份混合，得到混合料；将所述混合料与水按1:1的质量比混合均匀，过匀浆机，得到混合原料浆液；
2)取碱性蛋白酶3重量份、木瓜蛋白酶3重量份、胰蛋白酶1重量份、无花果蛋白酶1重量份、胰凝乳蛋白酶2重量份、菠萝蛋白酶3重量份混合，得到复合蛋白酶；
3)将所述混合原料浆液、所述复合蛋白酶与水三者混合，得到复合蛋白酶质量浓度为10％、混合原料浆液质量浓度为10％的混合物，调整所述混合物pH为7.5，而后在亚临界条件下，以压力0.8MPa、温度55℃的条件酶解3h；
4)将步骤3)所得的酶解产物升温至90℃，保持15min，而后冷却至常温；
5)将步骤4)所得产物进行微滤分离，其截留分子量为5～8kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅰ；取肽溶液Ⅰ进行超滤分离，其截留分子量为2～5kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅱ；取肽溶液Ⅱ进行纳滤分离，其截留分子量为500～2000Da，取滤过物即为肽溶液Ⅲ；
6)取肽溶液Ⅰ5重量份、肽溶液Ⅲ1重量份混合，得到混合肽溶液，在95℃条件下将所述混合肽溶液减压浓缩至1/3体积，再将浓缩产物进行喷雾干燥，得到所述功能性混合植物肽。
其中：步骤6)中所述喷雾干燥的喷雾压力为20MPa，进风温度为160℃，出风温度为90℃，控制水分含量15％；步骤5)中所述微滤分离是利用孔径为0.45μm的滤器完成的。
实施例6
一种功能性混合植物肽，是通过以下方法制备的：
1)取大豆分离蛋白0～5份、玉米蛋白0～5份、绿豆蛋白0～5份、大米分离蛋白0～5份、豌豆分离蛋白0～5份中的两种或几种，每种原料按比例混合，再与水按质量比1:1混合后，搅拌均匀，过匀浆机，得到混合原料浆液；
2)碱性蛋白酶0～3份、木瓜蛋白酶0～3份、胰蛋白酶0～3份、无花果蛋白酶0～3份、胰凝乳蛋白酶0～3份、菠萝蛋白酶0～3份中的两种或几种，混合均匀，备用；
3)在亚临界条件下，压力为0.6～0.8MPa，温度为45～55℃，时间为2～3h，复合蛋白酶浓度8～10％(E/S质量比)，底物浓度8～10％(固液比，底物为上述混合原料浆液)，pH6.5～7.5；
4)亚临界酶解结束后，升温至85～90℃，加热10～15min，使酶失活，终止酶解反应，冷却，备用；
5)①将上述酶解溶液通过0.45μm微滤分离，截留分子量为5～8kDa肽溶液Ⅰ；②取一定比例肽溶液Ⅰ，通过超滤膜系统过滤，截留2～5kDa肽溶液Ⅱ；③取一定比例肽溶液Ⅱ，通过纳滤膜系统过滤，截留分子量500～2000Da的肽溶液Ⅲ；
6)取肽溶液Ⅰ0～5份，肽溶液Ⅱ0～5份，肽溶液Ⅲ0～5份，混合均匀，在85～95℃条件下，减压浓缩至体积的1/2～1/3。再经过高压喷雾干燥处理，喷雾压力为15～20MPa，进风温度为120～160℃、出风温度为80～90℃，控制水分含量10～15％，得粉状混合植物肽。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种功能性混合植物肽，其特征在于该功能性混合植物肽是通过以下方法制备的：
1)取大豆分离蛋白0～5重量份、玉米蛋白0～5重量份、绿豆蛋白0～5重量份、大米分离蛋白0～5重量份、豌豆分离蛋白0～5重量份混合，得到混合料，其中至少有2种成分的用量不为0；将所述混合料与水按1:1的质量比混合均匀，过匀浆机，得到混合原料浆液；
2)取碱性蛋白酶0～3重量份、木瓜蛋白酶0～3重量份、胰蛋白酶0～3重量份、无花果蛋白酶0～3重量份、胰凝乳蛋白酶0～3重量份、菠萝蛋白酶0～3重量份混合，得到复合蛋白酶，其中至少有2种蛋白酶的用量不为0；
3)将所述混合原料浆液、所述复合蛋白酶与水三者混合，得到复合蛋白酶质量浓度为8～10％、混合原料浆液质量浓度为8～10％的混合物，调整所述混合物pH为6.5～7.5，而后在亚临界条件下，以压力0.6～0.8MPa、温度45～55℃的条件酶解2～3h；
4)将步骤3)所得的酶解产物升温至85～90℃，保持10～15min，而后冷却至常温；
5)将步骤4)所得产物进行微滤分离，其截留分子量为5～8kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅰ；取肽溶液Ⅰ进行超滤分离，其截留分子量为2～5kDa，取滤过物即为肽溶液Ⅱ；取肽溶液Ⅱ进行纳滤分离，其截留分子量为500～2000Da，取滤过物即为肽溶液Ⅲ；
6)取肽溶液Ⅰ0～5重量份、肽溶液Ⅱ0～5重量份、肽溶液Ⅲ0～5重量份混合，得到混合肽溶液，在85～95℃条件下将所述混合肽溶液减压浓缩至1/2～1/3体积，再将浓缩产物进行喷雾干燥，得到所述功能性混合植物肽。
2.根据权利要求1所述的一种功能性混合植物肽，其特征在于步骤6)中所述喷雾干燥的喷雾压力为15～20MPa，进风温度为120～160℃，出风温度为80～90℃，控制水分含量10～15％。
3.根据权利要求1所述的一种功能性混合植物肽，其特征在于步骤6)中肽溶液Ⅰ、肽溶液Ⅱ、肽溶液Ⅲ的用量均不为0。
4.根据权利要求1所述的一种功能性混合植物肽，其特征在于步骤5)中所述微滤分离是利用孔径为0.45μm的滤器完成的。
5.权利要求1所述功能性混合植物肽用于制备缓解化学性肝损伤的保健制剂的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述保健制剂缓解昆明小鼠因接触四氯化碳所导致的血清ALT、AST含量升高。
7.权利要求1所述功能性混合植物肽用于制备抗氧化保健制剂的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述抗氧化保健制剂降低昆明小鼠肝脏中MDA含量并提升其中T-AOC含量。
9.权利要求1所述功能性混合植物肽用于制备增强免疫力保健制剂的应用。
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