CN101569690A - 复合植物多肽的制备方法及其医药用途 - Google Patents

Abstract

一种复合植物多肽的制备方法及其医药用途，是以豆科植物为主要原料，低温提取多肽，配以枸杞、大枣，其重量百分比为：豆科植物提取多肽80－90％，枸杞、大枣提取液10－20％，其制备方法包括：处理匀浆，细胞破碎、酶解，提取过滤，按比例添加枸杞、大枣提取液，混匀后喷雾干燥，得医药制剂；其医药用途是用于调节亚健康人群转变为健康人群，防上亚健康人群向疾病方向发展。本发明采用生物技术，从天然豆类植物细胞中提取一种植物小分子多肽，能增加细胞膜Na⁺、K⁺－ATP酶活性，有利于机体合成ATP，给提供细胞能源及动力，促进细胞内外物质交换能力，加速新陈代谢，排出体内堆积的酸性物质和超氧自由基，调动细胞活力，提高细胞钠－钾ATP酶的活性，抗氧化。

Description

复合植物多肽的制备方法及其医药用途

技术领域：

本发明属于中药药品、生化药品、保健食品领域，具体涉及一种复合植物多肽的制备方法及其医药用途。

背景技术

由于世界经济高速发展，社会节奏日益加快，心理压力不断加大，环境污染危害严重，导致多数人处于亚健康状态。亚健康是介于健康与疾病之间的一种生理功能低下的身体状态，即：非健康、非患病状态，亦称“第三状态，灰色状态或病前状态”。WHO的一项全球性调查表明，真正健康的人仅占5％，患有疾病的人占20％，而75％的人处于亚健康状态。

发生亚健康的身体表现：神经精神方面：精神不振，头昏头沉，记忆力减退，失眠多梦或嗜睡等；消化系统表现：食谷不振，消化不良，大便干结等；心脑血管表现：头痛头晕，心慌气短，心悸胸闷等；运动系统表现：疲劳，腰膝酸软，手足麻木，易感冒，性功能减退，抵抗力降低等。

发生亚健康的阶段：(1)心身失调阶段：疲劳，失眠，情绪不稳定；(2)浅临床阶段：能力(活力、反应能力、适应能力)减退，出现四高(高血脂、高血糖、高血粘、高血压)。

发生亚健康的原因：(1)社会环境因素：生活节奏加快，竞争日趋激烈，心理压力增大，超负荷运转，透支体力、精力、情感，这一高度紧张状态导致机体功能失调；(2)不良的生活方式：体力劳动减少，运动匮乏；膳食不平衡，添加剂过多，绿色食品减少；夜生活增加；吸烟、酗酒、药物滥用；健康保险系数越来越小；(3)环境污染：噪音、电磁波，烟尘、汽车尾气污染；生态环境破坏等影响。

机体处于亚健康状态时，细胞膜上Na⁺、K⁺-ATP酶活性受抑制或失活，不能满足细胞内外钾、钠离子的交换，影响膜电位而引起收缩功能降低；降低葡萄糖、脂肪酸和乳酸等分子跨膜转运，影响细胞内代谢功能，阻碍膜上H⁺和乳酸根转运、Cl^-/HCO₃ ^-、Na⁺/H⁺等膜内外离子交换，降低Na⁺、Ca²⁺-ATP酶活性，使Ca²⁺输送受阻，超氧自由基增多，改变膜上多肽类、儿茶酚胺激素受体的构型等等，从而引起人体的亚健康状态，最终导致各种疾病的发生与发展。

植物多肽是生物体内重要的低分子物质，具有许多生理功能，除作为RNA、DNA的前体外，也作为生物化学过程的调节物质参与体内代谢，在细胞结构、代谢、和调节功能方面起着重要作用。

发明内容：

本发明的目是弥补上述现有技术存的不足，提供一种能增加细胞膜Na⁺、K⁺-ATP酶活性，有利于机体合成ATP，给提供细胞能源及动力，促进细胞内外物质交换能力，加速新陈代谢，排出体内堆积的酸性物质和超氧自由基，调动细胞活力，提高细胞钠-钾ATP酶的活性，抗氧化，综合调节亚健康人群心身失调阶段的疲劳，失眠，等症状，促使亚健康向健康转化的复合植物多肽的制备方法及其医药用途。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：该复合植物多肽的制备方法，是以豆科植物为主要原料，低温提取多肽，配以枸杞、大枣，其重量百分比为：豆科植物提取多肽：80-90％、枸杞、大枣提取液：10-20％，其制备方法包括：处理匀浆，细胞破碎、酶解，提取过滤，按比例添加枸杞、大枣提取液，混匀后喷雾干燥，得医药制剂；

复合植物多肽的制备方法按如下工艺步骤：

1.取豆科植物种子，挑选、清洗、淋水、浸泡5-6小时；

2.将软化的豆科植物种子加入其重量的5-10倍40-60℃的蒸馏水，于高压均质机中，破碎植物细胞5-10分钟，用6.0mol/L HCl溶液，控制pH值4-6，底物质量浓度为0.5-1％，酶液用量占豆科植物种子重量的10-20％，高压均质5-10分钟，冷却至室温，3000r/min离心5分钟，上清液70-90℃灭酶30-50分钟，减压浓缩，得到多肽浓缩液；

3.将离心剩余残渣加入3-5倍的40-60℃蒸馏水，进行2次高压均质，方法与上一步骤相同；

4.枸杞、大枣按1∶5比例，清洗，浸泡，水煎，过滤，浓缩至比重为1.12～1.2；

5.将多肽浓缩液与枸杞、大枣浓缩液按重量百分80-90％∶10-20％混匀，喷雾干燥，制成颗粒剂、片剂或胶囊。

所述豆科植物是黑豆、红豆、扁豆、大豆、绿豆、豌豆。

所述酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、磷酸二酯酶。

一种复合植物多肽的医药用途，采用豆科植物为主要原料，低温提取多肽，配以枸杞、大枣提取液制得的医药制剂，用于调节亚健康人群心身失调阶段的疲劳，失眠等症状，有效地改善亚健康状况，增强机体的储备力、抵抗力、恢复力，促使亚健康人群向健康转化，防止亚健康人群向疾病方向发展。

本发明采用生物技术，从天然豆类植物细胞中提取一种植物小分子多肽，能增加细胞膜Na⁺、K⁺-ATP酶活性，有利于机体合成ATP，给提供细胞能源及动力，促进细胞内外物质交换能力，加速新陈代谢，排出体内堆积的酸性物质和超氧自由基，调动细胞活力，提高细胞钠-钾ATP酶的活性，抗氧化，综合调节亚健康人群心身失调阶段的疲劳，失眠，等症状，促使亚健康向健康转化，提高人们的健康水平和生活质量。

复合植物多肽制剂的用法用量：颗粒剂每5g/袋，20袋/盒，

早晚各一次，每次1-2袋，温开水冲服。

本发明的特点：

1.本发明得到的复合植物多肽对亚健康引起的各种症状，有调节、转化的作用。

2.本发明制备复合植物多肽采用酶对豆科植物种子均质液进行选择性受控水解，其生产工艺简单，成本低。

3.本发明得到的复合植物多肽对小鼠有较强的抗疲劳作用、能提高缺氧耐受力。

4.本发明得到的复合植物多肽可增加小鼠细胞膜上Na⁺、K⁺-ATP酶活性。

5.本发明得到的复合植物多肽急性毒性实验结果表明，本产品无毒副作用，安全可靠。

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，而不应该是对本发明范围的限制：

实施例一：

取绿豆100kg，挑选、清洗、淋水、浸泡5-6小时，加入绿豆重量5倍50℃的蒸馏水，于高压均质机中，破碎植物细胞5分钟，用6.0mol/L HCl溶液，控制pH值4.5，木瓜蛋白酶底物质量浓度为0.7％，木瓜蛋白酶液用量15％，高压均质6分钟，冷却至室温，3000r/min离心5分钟，上清液70℃灭酶50分钟，减压浓缩，得到多肽浓缩液；

将离心剩余残渣加入3-5倍的50℃蒸馏水，进行2次高压均质，方法与以上步骤相同。

枸杞大枣提取液：枸杞4-6kg、大枣4-6kg，清洗，加入5-9倍水浸泡2-4小时，水煎，过滤，浓缩至比重为1.12；

将多肽浓缩液与枸杞、大枣浓缩液充分混匀，喷雾干燥，制成颗粒剂或片剂、胶囊；

颗粒剂的包装：5g/袋，20袋/盒。

用法用量：早晚各一次，每次1袋，温开水冲服。

一、植物复合多肽对小鼠抗疲劳、提高缺氧耐受力的作用

试验分组：

选用SPF级KM健康小白鼠150只，体重18-22g，雄性。随机分为5组，每组10只，分为正常对照组、复合植物多肽低剂量组、复合植物多肽中剂量组、复合植物多肽高剂量组、洋参口服液(广东省顺德康复来保健品有限公司出品)对照组。50只供游泳耐受试验、爬杆试验；50只供提高缺氧耐受力试验；50只供血清尿素氮、肝糖原、乳酸测定。试验分组、灌胃剂量、给药途径相同。

灌胃剂量：

小鼠的等效剂量为人体推荐量的10倍，即每日0.33g/kg体重(中剂量)，上、下各设一个剂量组：0.99g/kg体重(高剂量)和0.03g/kg体重(低剂量)。胶囊内粉末以1％的灭菌的阿拉伯制成三种混悬液，灌胃给药；洋参口服液组以康复来洋参口服液，20ml/kg体重，正常对照组以15ml/kg无菌水灌胃。每天给药一次，连续灌胃30天后进行游泳耐受试验、爬杆试验，提高缺氧耐受力试验、采血，分离血清，测定尿素氮、肝糖原、乳酸各项指标。

试验步骤

游泳耐受试验：末次给予受试物30分钟后，置小鼠在游泳箱中游泳，水深30cm，水温25℃±0.5℃，鼠尾根部负荷5％体重的铅皮。记录小鼠从游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间；

爬杆试验：爬杆架，直径0.8-1cm、长约25cm的有机玻璃圆棒(经120目砂纸打磨)，上端定于木板上，下端悬空，距地面约20cm。试验时，将爬杆架置于水温25℃、深约10cm的水盆中。末次给予受试物30分钟后，将小鼠放在有机玻璃棒上，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃棒上跌落下来的时间，第三次落水时终止试验，累计三次的时间作为爬杆时间。

缺氧耐受力试验：于末次灌胃后1小时，将各组小时放入盛有5g钠石灰的250ml磨口瓶内(每瓶1只)，用凡士林封口，盖严，以呼吸停止为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。

血清尿素氮测定：末次给受试物30分钟后，在温度为30℃的水中游泳90min，小鼠拔眼球采血0.5mL。分离血清测定，按照试剂盒说明书操作。

肝糖原测定：末次给样后30分钟，在温度为30℃的水箱中游泳90分钟，立即处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏□100mg，按试剂盒说明书操作。

乳酸测定：游泳末次给样30分钟后负重2％(体重)在温度30℃的水中游泳90分钟后停止，安静15分钟后小鼠拔眼球采血，分离血清，按乳酸测定试剂盒说明书操作

脏器/体重比值测定：小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。

数据处理：

游泳时间为计量资料，爬杆时间为计量资料、方差分析。以上试验数据均采用统计学软件方差分析方法进行统计。

试验结果

运动耐力测定指标

1.负重游泳试验

表1复合植物多肽对小鼠负重游泳试验的影响(x±SD)n＝10

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	游泳时间(分钟)	P
				正常对照		16.04±7.05
低剂量	0.03	30.45±8.94	＜0.05*＜0.05▲
				中剂量	0.33	46.31±15.46	＜0.01*＜0.01▲
高剂量	0.99	43.15±12.02	＜0.01*＜0.01▲
				洋参口服液	0.30	17.70±7.06	＞0.05*

注：*与正常对照组比较；▲与洋参口服液组比较

根据小鼠负重游泳试验的P值，复合植物多肽低剂量组与正常对照和洋参口服液比较(P＜0.05)有显著性差别，说明低剂量具有抗疲劳作用；复合植物多肽中、高剂量组与正常对照和洋参口服液组比较(P＜0.01)有高度显著性差别，说明中、高剂量抗疲劳作用较强。

2.爬杆试验

表2复合植物多肽对小鼠爬杆试验的影响(x±SD)n＝10

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	爬杆时间(分钟)	P
				正常对照		5.72±2.78
低剂量	0.03	9.07±3.19
				中剂量	0.33	11.60±2.55	＜0.01*
高剂量	0.99	18.03±7.73	＜0.01*＜0.01▲
				洋参口服液	0.30	10.96±4.44	＜0.05*

根据小鼠爬杆试验的P值，复合植物多肽中剂量组与正常对照比较(P＜0.01)有高度显著性差别：复合植物多肽高剂量组与正常对照和洋参口服液组比较(P＜0.01)均有高度显著性差别，说明高剂量有较强抗疲劳作用。

3.缺氧耐受力试验

表3复合多肽对小鼠常压缺氧耐受力的作用(x±SD)n＝10

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	存活时间(分钟)	P
				正常对照		40.15±7.19
低剂量	0.03	42.34±9.87
				中剂量	0.33	49.35±10.84	＜0.05*
高剂量	0.99	51.33±11.28	＜0.01*＜0.05▲
				洋参口服液	0.30	47.39±9.76	＜0.05*

注：*与正常对照组比较；▲与洋参口服液组比较

复合多肽对小鼠常压缺氧耐受力试验结果表明：中、高剂量组与正常对照组比较，P＜0.05、P＜0.01，说明中、高剂量组有较强的缺氧耐受力。

4.血清尿素氮

表4复合植物多肽对小鼠血清尿素氮的影响(x±SD)n＝10

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	尿素氮mg/dl	P
				正常对照		15.248±3.039
低剂量	0.03	14.459±2.653
				中剂量	0.33	12.405±1.841	＜0.05*＜0.05▲
高剂量	0.99	10.132±2.224	＜0.01*＜0.01▲
				洋参口服液	0.30	15.301±2.921

注：*与正常对照组比较；▲与洋参口服液组比较

根据小鼠血清尿素氮试验的P值，复合植物多肽中剂量组与正常对照和洋参口服液组比较(P＜0.05)有显著性差别，复合植物多肽高剂量组与正常对照和洋参口服液组比较(P＜0.01)有高度显著性差别，说明高剂量抗疲劳作用较强。

5.肝糖原

表5复合植物多肽对小鼠肝糖原的影响(肝组织x±SD)n＝10

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	肝糖原mg/100g	P
				正常对照		638.256±40.953
低剂量	0.03	793.245±24.959

中剂量	0.33	747.878±21.776	＜0.05*
				高剂量	0.99	830.106±13.498	＜0.05*
洋参口服液	0.30	772.598±49.892

根据小鼠肝组织中肝糖原试验的P值，复合植物多肽中、高剂量组与正常对照比较(P＜0.05)均有显著性差别，肝糖原含量明显高于对照组，说明中、高剂量有促进糖原储备或减少糖原消耗的作用。

6.血清乳酸

表6复合植物多肽对小鼠血清乳酸的影响(x±SD)n＝10

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	乳酸mmol/L	P
				正常对照		8.538±0.749
低剂量	0.03	7.735±0.490
				中剂量	0.33	6.982±0.287	＜0.05*
高剂量	0.99	6.516±0.212	＜0.05*
				洋参口服液	0.30	8.100±0.379

根据小鼠血清乳酸试验的P值，复合植物多肽中、高剂量组乳酸减少，与正常对照比较(P＜0.05)均有显著性差别，说明中、高剂量均有抗疲劳作用。

7.体重

表7复合植物多肽对小鼠体重的影响(g x±SD)n＝10

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	初始体重(g)	试验结束体重(g)
				正常对照		19.260±1.299	32.181±3.594
低剂量	0.03	18.850±1.256	33.400±4.390
				中剂量	0.33	18.350±1.160	33.948±2.487
高剂量	0.99	19.040±1.341	34.295±3.567
				洋参口服液	0.30	18.530±1.277	31.264±1.071

试验前、后各组之间体重比较(P＞0.05)均无显著性差别，说明复合植物多肽对小鼠体重无影响。

8.小鼠脏器/体重比值

表8复合植物多肽对小鼠脏器/体重比值的影响

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	脾/体重比值	胸腺/体重比值
				正常对照		0.281±0.093	0.179±0.066
低剂量	0.03	0.267±0.135	0.222±0.184
				中剂量	0.33	0.477±0.496	0.161±0.065
高剂量	0.99	0.265±0.161	0.130±0.064
				洋参口服液	0.30	0.386±0.123	0.132±0.054

各组之间脏器/体重比值比较(P)0.05)均无显著性差别，说明复合植物多肽对小鼠脏器/体重比值无影响。

二、小鼠红细胞膜上Na⁺、K⁺-ATP酶

取KM种健康小鼠80只，每组16只，试验分组、灌胃剂量、方法同前，灌胃30天后，每组1/2小鼠采血，分离红细胞膜；每组剩余小鼠于水温20℃游泳30分钟，采血，分离红细胞膜，按红细胞膜Na⁺、K⁺-ATP酶活性测定说明书操作。

表9复合植物多肽对小鼠红细胞膜Na⁺、K⁺-ATP酶活性的影响

(μmol.pi/10⁷RBC/h x±SD)n＝16

组别	灌胃剂量(g.kg-1)	游泳前	游泳后
				正常对照		0.0032±0.0015	0.0031±0.0019
低剂量	0.03	0.0054±0.0021	0.0061±0.0034*
				中剂量	0.33	0.0063±0.0028	0.0119±0.0048▲
高剂量	0.99	0.0082±0.0056	0.0157±0.0073▲
				洋参口服液	0.30	0.0058±0.0024	0.0054±0.0027*

与正常对照组比较*P＜0.05，▲P＜0.01，复合植物多肽中、高剂量组与正常对照比较均有显著性差别，说明中、高剂量红细胞膜Na⁺、K⁺-ATP酶活性增强。

三、急性毒性实验

取小鼠20只，观察10g.kg^-1，灌胃给药，0.2ml/20g所产生的毒性反应和死亡情况，7日内无异常反应、无死亡。小鼠急性毒性试验结果是人用量的833.3倍。植物复合多肽急性毒性实验结果表明，本产品安全可靠。

根据以上试验结果，说明复合植物多肽对小鼠运动耐力、红细胞膜Na⁺、K⁺-ATP酶活性明显增强；肝组织中肝糖原增多、血清尿素氮、血清乳酸明显减少，无毒性作用。以上试验结果表明：复合植物多肽是一种具有综合调节亚健康向健康方向转化，提高人们的健康水平和生活质量的功能性食品或药品。

实施例二：分别取黑豆、红豆、扁豆、大豆、豌豆等豆科植物种子，各按上述实施例一的方法制备复合植物多肽，经动物试验观察，也有综合调节亚健康的作用。

实施例三：分别取黑豆、红豆、扁豆、大豆、豌豆等豆科植物种子，各按上述实施例一的方法，将木瓜蛋白酶改用为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶取代，进行酶解所制备复合多肽，经动物试验观察，也有综合调节亚健康的作用。

Claims (5)

1、一种复合植物多肽的制备方法，是以豆科植物为主要原料，低温提取多肽，配以枸杞、大枣提取液，其重量百分比为：豆科植物提取多肽80-90％，枸杞、大枣提取液10-20％，其制备方法包括：处理匀浆，细胞破碎、酶解，提取过滤，按比例添加枸杞、大枣提取液，混匀后喷雾干燥，得医药制剂。

2、据权利要求1所述复合植物多肽的制备方法，其特征是按如下方法步骤：

(1).取豆科植物种子，挑选、清洗、淋水、浸泡5-6小时；

(2).将软化的豆科植物种子加入其重量的5-10倍40-60℃的蒸馏水，于高压均质机中，破碎植物细胞5-10分钟，用6.0mol/L HCl溶液，控制pH值4-6，底物质量浓度为0.5-1％，酶液用量占豆科植物种子重量10-20％，高压均质5-10分钟，冷却至室温，3000r/min离心5分钟，上清液70-90℃灭酶30-50分钟，减压浓缩，得到多肽浓缩液；

(3).将离心剩余残渣加入3-5倍的40-60℃蒸馏水，进行2次高压均质，方法与以上步骤相同；

(4).枸杞、大枣按1∶5比例，清洗，浸泡，水煎，过滤，浓缩至比重为1.12～1.2；

(5).将多肽浓缩液与枸杞、大枣浓缩液按重量百分80-90％∶10-20％混匀，喷雾干燥，制成颗粒剂、片剂或胶囊。

3、据权利要求2所述复合植物多肽的制备方法，其特征是所述豆科植物是黑豆、红豆、扁豆、大豆、绿豆或豌豆。

4、据权利要求2所述复合植物多肽的制备方法，其特征是所述酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或磷酸二酯酶。

5、一种复合植物多肽的医药用途，采用豆科植物为主要原料，低温提取多肽，配以枸杞、大枣提取液制得的医药制剂，用于调节亚健康人群心身失调阶段的疲劳，失眠等症状，有效地改善亚健康状况，增强机体的储备力、抵抗力、恢复力，促使亚健康人群向健康转化，防止亚健康人群向疾病方向发展。