CN114752644A - 一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法，涉及食品加工技术领域。制备方法包括如下步骤：(1)将赤小豆粉碎过筛，得到赤小豆粉碎料；(2)向赤小豆粉碎料中加水调节pH，超声浸提，离心后取上清液调节pH值并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；(3)将蛋白冻干粉配置成蛋白溶液，调节pH值后进行酶解，得酶解液，灭酶、离心后取上清液冻干，得多肽冻干粉，所述的酶解采用的酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的至少两种构成的双酶组合。本发明方法采用双酶组合方式，赤小豆多肽得率高，对环氧合酶‑2(COX‑2)具有良好的抑制效果；反应条件温和、耗时短，可大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法。
背景技术
赤小豆(V.umbellata)是我国传统的药食同源性杂粮豆类，是优质的可持续蛋白质来源，豆类的高质量蛋白质使它们成为一种重要的植物源生物活性肽。生物活性肽是蛋白质的小片段，主要是由肽和氨基酸组成的混合物。众多研究表明生物活性肽具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗血栓形成、抗高血压、免疫调节或金属螯合等生物活性。生物活性肽作为抗氧化剂可以稳定自由基并中和它们的有害影响，从而防止氧化应激作用产生的一些疾病症状。但是在蛋白质中，这些肽段不表现生物活性，只有通过用酶、酸、碱或发酵处理水解而被激活并表现出生物活性，其中酶解法被认为是生产活性肽最有效的方法。此外，由于不同蛋白酶的特异性，在水解蛋白质时，作用位点不同，酶解产物也不同，从而可得到不同活性的产物。
木瓜蛋白酶(Papain)，又称木瓜酶，木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。木瓜蛋白酶是番木瓜(Carieapapaya)中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有活性高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。因此，采用木瓜蛋白酶水解蛋白质，具有广阔的应用前景。
如专利CN107557420A公开了一种亚麻籽粕多肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)粉碎、过筛得粉碎料；(2)超声辅助浸提，得固体湿粕；(3)烘干、除溶剂；(4)加水调制亚麻籽粕混合液；(5)采用两步酶解法对亚麻籽粕混合液进行酶解；(6)采用UHT对酶解液灭菌；(7)对灭菌的酶解液进行液、固分离，得亚麻籽粕多肽液；(8)真空浓缩得多肽浓缩液；(9)对多肽浓缩液进行干燥，得亚麻籽粕多肽粉。专利中对脱毒脱脂后的亚麻籽粕进行酶解反应，利用碱性蛋白酶与中性蛋白酶两步水解得到亚麻籽粕多肽。但是得到的亚麻籽粕多肽对DPPH自由基清除能力一般，抗氧化效果不好。
再如专利CN114181989A公开了一种制备多功能性大豆肽粉的高转化率酶解法，具体步骤为：(1)使用微粉化红外线加热系统对大豆分离蛋白进行微粉化处理，得到微粉化的大豆分离蛋白；(2)使用改性剂对蛋白酶进行改性处理，得到蛋白酶混合液；(3)把微粉化大豆分离蛋白与去离子水混合后，添加蛋白酶混合液进行酶解；(4)将酶解液先后经过陶瓷膜、超滤膜、纳滤设备进行浓缩，得到大豆多肽浓缩液；(5)使用喷雾干燥机对大豆多肽浓缩液进行喷雾干燥，得到大豆多肽粉。发明中采用六种蛋白酶同时加入到微粉化大豆分离蛋白中，并且对六种蛋白酶进行改性处理，制备方法比较繁琐。
因此，急需一种制备方法简单、多肽得率高以及抗氧化性强的赤小豆多肽制备方法。
发明内容
针对现有技术方案的不足，本发明旨在提供一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)向步骤(1)得到的赤小豆粉碎料中加水后调节pH，超声浸提，离心后取上清液调节pH值并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成蛋白溶液，调节pH值后进行酶解，得酶解液，灭酶、离心后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
上述步骤(2)中所述的赤小豆粉碎料与水的质量比为1:15，所述的浸提时间为10-60min。
上述步骤(3)中所述的酶解采用的酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的至少两种构成的双酶组合。
所述的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶的添加量分别为6000-10000U/g。
优选地，所述的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶的添加量分别为8000U/g。
步骤(3)中所述的赤小豆蛋白溶液的浓度为3-7％。
在一些优选实施方案中，所述的酶解采用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。
进一步地，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的添加量之比为0.75-1.25:1。
再进一步地，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的添加量之比为1:1。
在另一些优选实施方案中，所述的酶解采用的酶为木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶。
进一步地，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与酸性蛋白酶的添加量之比为0.75-1.25:1。
再进一步地，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与酸性蛋白酶的添加量之比为1:1。
所述的酶解过程中双酶组合的添加方式为分步添加或同时添加。
步骤(3)中所述的pH值为5.5-7。
优选地，步骤(3)中所述的pH值为7。
步骤(3)所述的灭酶条件为：沸水中灭酶10-20min。
步骤(3)所述的离心条件为：转速4500-5000rpm，时间8-15min。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、采用双酶组合的方式，赤小豆多肽的得率高；
第二、反应条件温和、耗时短，可大规模生产；
第三、赤小豆多肽对COX-2具有良好的抑制效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是赤小豆多肽对DPPH自由基的清除能力测试结果。
图2是赤小豆多肽对ABTS自由基的清除能力测试结果。
图3是赤小豆多肽对COX-2的抑制率测试结果。
具体实施方式
以下，根据本发明具体的实施形态进行说明。但是本发明不仅限定于该说明，在不脱离本发明的范围内，根据业者的知识，进行各种变更、修正及改良后而得的结果。
以下实施例中所述的木瓜蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司、中性蛋白酶和酸性蛋白酶购自北京博奥拓达科技有限公司。
实施例1一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为55℃下向蛋白溶液中先加入木瓜蛋白酶8000U/g，反应3h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入中性蛋白酶8000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
实施例2一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为55℃下向蛋白溶液中先加入木瓜蛋白酶6000U/g，反应3h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入中性蛋白酶10000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
实施例3一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为55℃下向蛋白溶液中先加入木瓜蛋白酶10000U/g，反应3h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入中性蛋白酶6000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
实施例4一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为55℃下向蛋白溶液中先加入木瓜蛋白酶8000U/g，反应3h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入酸性蛋白酶8000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
实施例5一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为55℃下向蛋白溶液中先加入中性蛋白酶8000U/g，反应3h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入酸性蛋白酶8000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
实施例6一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为55℃下向蛋白溶液中同时加入木瓜蛋白酶8000U/g和中性蛋白酶8000U/g，反应6h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
实施例7一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提10min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为3.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为5.5；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为40℃下向蛋白溶液中先加入木瓜蛋白酶8000U/g，反应2h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入中性蛋白酶8000U/g，反应2h；将得到的酶解液在沸水中灭酶10min；灭酶后的酶解液离心(4500rpm，8min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
实施例8一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提60min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为7.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为6；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为70℃下向蛋白溶液中先加入木瓜蛋白酶10000U/g，反应4h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入中性蛋白酶10000U/g，反应4h；将得到的酶解液在沸水中灭酶20min；灭酶后的酶解液离心(4800rpm，15min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
对比例1一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，酶解方式为55℃下向蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶16000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
对比例2一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为3；对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，酶解方式为55℃下向蛋白溶液中加入酸性蛋白酶16000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
对比例3一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中1的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，酶解方式为55℃下向蛋白溶液中加入中性蛋白酶16000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
对比例4一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过50目筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)将步骤(1)得到的赤小豆粉碎料与去离子水混合，粉碎料与去离子水的质量比为1:15，用10％(m/m)的NaOH溶液调节pH为9.0，40℃下超声辅助浸提20min，离心(5000rpm，10min)后取上清液用10％(m/m)的柠檬酸调节pH值至4.5，并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成质量分数为5.0％的赤小豆蛋白溶液，用10％(m/m)氢氧化钠溶液和10％(m/m)柠檬酸溶液调节pH值为7；采用双酶组合的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解得到酶解液，双酶组合的方式为55℃下向蛋白溶液中先加入木瓜蛋白酶12000U/g，反应3h后进行灭酶，然后继续向灭酶后的溶液加入中性蛋白酶4000U/g，反应3h；将得到的酶解液在沸水中灭酶15min；灭酶后的酶解液离心(5000rpm，10min)后取上清液冻干，得多肽冻干粉。
将实施例1-5和对比例1-4得到的赤小豆多肽进行测试，其含量和得率如表1所示。
表1实施例1-8和对比例1-4得到的赤小豆多肽含量和得率结果
| 项目 | 多肽冻干粉的含量(％) | 多肽冻干粉的得率(％) |
| 实施例1 | 69.56±7.23 | 69.22±3.21 |
| 实施例2 | 58.82±3.27 | 54.32±3.36 |
| 实施例3 | 52.72±6.80 | 64.63±1.45 |
| 实施例4 | 61.10±3.24 | 66.14±3.54 |
| 实施例5 | 51.65±3.47 | 34.52±4.34 |
| 实施例6 | 56.29±5.25 | 54.28±2.58 |
| 实施例7 | 53.31±4.22 | 66.30±3.33 |
| 实施例8 | 58.28±4.35 | 42.38±2.50 |
| 对比例1 | 47.69±3.41 | 48.32±3.87 |
| 对比例2 | 48.39±4.20 | 34.27±2.44 |
| 对比例3 | 42.66±6.32 | 46.39±3.29 |
| 对比例4 | 49.34±4.27 | 42.38±4.28 |
根据上表1的检测数据可以看出，本申请实施例1-3中采用分步加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的方式对赤小豆蛋白溶液进行酶解，根据测试结果可以看出木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的加入量之比对多肽的含量以及得率均有比较显著的影响，实施例1中木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加量之比为1:1，得到的多肽的含量以及得率均明显高于实施例2-3；实施例4-5分别采用分步加入添加量之比1:1的木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶、添加量之比1:1的中性蛋白酶和酸性蛋白酶以及添加量之比1:1的木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶，得到的多肽的含量以及得率较实施例1均出现一定程度的降低，说明蛋白酶的种类对多肽的收率和含量均有明显影响；实施例7-8中均分步加入添加量之比为1:1的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，对酶解过程中的pH值进行了调整，也会影响多肽的提取；对比例1-3中采用一种蛋白酶进行酶解，对比例4中改变木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的质量比不在本申请保护范围内，得到的多肽得率和收率明显降低，说明只有采用合适的蛋白酶控制其质量比和pH值才能明显提高多肽的得率和收率。
本申请还对赤小豆多肽进行抗氧化测试和环氧化酶-2抑制率的测试，以实施例1制备的赤小豆多肽为例进行相关检测，检测结果见附图1-3。
测试方法为：
(1)DPPH自由基清除率的测定
称取20.0mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，DPPH浓度配制为2×10-4mol/L；1.0mg/mL的Vc溶液作为阳性对照。
取1.0mL的待测液(或阳性对照)与1.0mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A管)；取1.0mL的无水乙醇与1.0mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(B管)；取1.0mL的无水乙醇与1.0mL的待测液(或阳性对照)混匀(C管)；
反应30min后，在517nm下测A、B、C管吸光度值。
清除率计算公式为：
(2)ABTS自由基清除率的测定
ABTS水溶液配置：精密称取38.41mg ABTS，溶解定容于10mL水中；K2S2O8水溶液配置：精密称取66.20mg K2S2O8溶解定容于100mL水中；母液配置：将ABTS水溶液和K2S2O8水溶液等体积混合，低温避光反应12～16h；ABTS工作液：将母液用无水乙醇稀释至在734nm处的OD值为0.7±0.02，现用现配。阳性对照选用1.0mg/mL的Vc溶液，0-4℃下避光保存，现配现用。
取0.2mL待测样品(或阳性对照)与0.8mL的ABTS工作液混匀(A管)；取0.2mL去离子水与0.8mL的ABTS工作液混匀(A0管)；
室温条件下避光反应30min，用酶标仪测定其在734nm下的吸光值。
清除率计算公式为：
(3)环氧化酶-2抑制率测定
按照环氧化酶-2(COX-2)抑制剂筛选试剂盒说明操作，检测赤小豆多肽在不同浓度(2.0、1.0、0.5mg/mL)浓度条件下对COX-2的抑制能力。
结论：
以1.0mg/mL的Vc作为阳性对照，比较实施例1赤小豆多肽的DPPH自由基清除能力，实验结果如图1显示，赤小豆多肽具有良好的DPPH自由基清除能力，在2.5mg/mL的浓度条件下，对DPPH自由基的清除率高于90％，赤小豆多肽对DPPH自由基清除的IC50值为0.60mg/mL。
同样以1.0mg/mL的Vc作为阳性对照，比较实施例1赤小豆多肽的ABTS自由基清除能力，实验结果如图2所示，与DPPH清除率对比，发现赤小豆多肽的ABTS自由基清除能力更强，即在1.0mg/mL的浓度条件下，ABTS自由基清除率高于90％，赤小豆对ABTS自由基清除的IC50值为0.17mg/mL。
在本研究中，以DPPH和ABTS自由基清除能力为指标，结果证明赤小豆多肽具有天然的抗氧化能力。
利用COX-2抑制剂筛选试剂盒来检测实施例1赤小豆多肽对COX-2的抑制率，根据图3的检测结果来看，赤小豆多肽对COX-2有一定的抑制作用，并且随着提取物浓度的上升，对COX-2的抑制率也有所上升。赤小豆多肽在浓度为0.5mg/mL时抑制率可达到80％以上。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。
因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种具有抗氧化作用的赤小豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)将赤小豆粉碎并过筛，得到赤小豆粉碎料；
(2)向步骤(1)得到的赤小豆粉碎料中加水后调节pH，超声浸提，离心后取上清液调节pH值并对其再次离心，收集再次离心的沉淀，经水洗冻干后得蛋白冻干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛋白冻干粉配置成浓度为3-7％的蛋白溶液，调节pH值后进行酶解，得酶解液，灭酶、离心后取上清液冻干，得多肽冻干粉，
所述的酶解采用的酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的至少两种构成的双酶组合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶的添加量分别为6000-10000U/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酶解采用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的添加量之比为0.75-1.25:1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的添加量之比为1:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酶解采用的酶为木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与酸性蛋白酶的添加量之比为0.75-1.25:1。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的木瓜蛋白酶与酸性蛋白酶的添加量之比为1:1。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酶解过程中双酶组合的添加方式为分步添加或同时添加。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法得到的赤小豆多肽在抗氧化产品中的应用。
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