CN109475588A - 一种包含小豆栽培种的用于改善肌肉功能或用于增强运动能力的组合物 - Google Patents

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Abstract

根据本发明所述的小豆栽培种通过促进mRNA或蛋白质表达，提高参与肌肉功能的基因的活性，促进肌肉细胞分化的肌肉质量增加，可以增加肌肉质量和改善肌肉功能或增强能力；可以预防、治疗或改善由各种疾病引起的运动能力的下降，肌肉功能的下降，肌肉流失等；同时由于其作为一种天然物质不会对身体产生任何副作用，它还可以有效地用于药品或食品等。

Description

一种包含小豆栽培种的用于改善肌肉功能或用于增强运动能 力的组合物
技术领域
本申请要求于2016年5月2日提交的韩国专利申请No.10-2016-0054290和2017年5月2日提交的韩国专利申请No.10-2017-0056162的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本发明涉及一种用于改善肌肉功能或用于增强运动能力的组合物，其包含作为活性成分的红豆提取物，红豆衍生蛋白和红豆衍生肽。
背景技术
由肌肉质量逐渐减少引起的肌肉萎缩(Muslce atrophy)是指肌肉无力和肌肉退化(Cell，119(7)：907-910,2004)。肌肉萎缩是由不活动、氧化应激、慢性炎症等引起的，且肌肉萎缩削弱肌肉功能和运动能力(Clinical Nutrition，26(5)：524-534,2007)。
在这方面，确定肌肉功能的最重要因素是肌肉质量，其通过肌肉蛋白质合成和蛋白质降解的平衡来维持。当蛋白质降解超过蛋白质合成时发生肌肉萎缩(TheInternational Journal of Biochemistry and Cell Biology,37(10):1985-1996,2005)。
肌肉大小由引起肌肉的合成代谢(anabolism)或分解代谢(catabolism)的细胞内信号通路(signaling pathways)控制。当肌肉蛋白质合成的信号反应超过肌肉蛋白质降解的信号反应时，肌肉蛋白质合成增加，从而肌肉蛋白质增加导致肌肉大小增大(肥大)(hypertrophy)或肌纤维数量增多(增生)(hyperplasia)(The Korea Journal of SportsScience,20(3):1551-1561,2011)。
肥大诱导因子通过肌细胞中的磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K,phosphatidylinositol-3kinase)/Akt途径(pathway)的刺激来磷酸化下游蛋白质(downstream proteins)，从而触发蛋白质合成。其中，PI3K/Akt信号传导的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR,mammaliantarget of rapamycin)的活化被认为是整合各种细胞内生长信号的主要生长信号机制。mTOR的活化能够通过活化两个下游靶点(downstream targets)，即4E结合蛋白(4EBP1,4E-binding protein)和磷酸化70-kDa核糖体S6激酶(p70S6K,phosphorylated 70-kDaribosomal S6kinase))来诱导肌肉蛋白质合成，从而促进肌肉质量的增加(The KoreaJournal of Sports Science,20(3):1551-1561,2011；The International Journal ofBiochemistry and Cell Biology,43(9):1267-1276,2011)。
相反，当一种叉头框(FoxO,forhead box)转录因子(transcription factor)从细胞的细胞质迁移到细胞核时，它会增加E3泛素连接酶因子atrogin-1和MuRF-1的表达，这些因子参与蛋白质降解(Disease Models&Mechanisms,6:25-39,2013)。当atrogin-1和MuRF-1的表达水平增加时，肌肉中的蛋白质降解增加并且肌肉质量减少。因此，mTOR的活化，atrogin-1和MuRF-1表达的抑制会通过增加肌肉蛋白质的量来增加肌肉质量。
此外，肌肉细胞分化和肌肉形成可以通过各种肌肉调节因子(muscle regulatoryfactors)来控制。其中，MyoD通过诱导肌细胞生成素表达促进成肌细胞(myoblast)成为肌管(myotube)的过程。通过这个过程形成的肌纤维形成束并最终形成肌肉。(Cellular andMolecular Life Sciences,70:4117-4130,2013)。
作为一种有代表性的豆科植物，红豆(Vigna angularis)是一种属于双子叶植物豆科(Fabaceae)植物豇豆属(Vigna spp.)的一年生植物，是继豆类后第二重要的豆类植物。据了解，红豆含有丰富的维生素B1，当其与大米混合制作米饭时，它补充大米中稀缺的维生素，同时不仅对脚气病有效，而且对恢复疲劳也有效。红豆中含有的皂甙具有帮助纤维排出，释放有毒物质，促进排便，清洁肠道，改善肾脏疾病或宿醉的作用(Korean Journalof Food Science and Technology,42(6):693-698,2010)。此外，据报道，虽然红豆具有抗氧化(Journal of Food Lipids 11(4):278-286,2004)，抗糖尿病(Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,68(12):24212426,2004)，抗菌(PhytotherapyResearch 20(2):162164,2006)和美白(International Journal of MolecularSciences,12(10):7048-7058,2011)等功效，但是目前并没有有关其有改善肌肉功能的报道。
因此，本发明人已经寻求开发植物提取物衍生的治疗剂，用于治疗与肌肉功能减少相关的疾病，例如肌肉萎缩。结果，本发明人已经证实红豆或豆科植物的提取物可以增加与肌肉蛋白质合成和肌肉细胞中肌肉质量增加相关的蛋白质表达和磷酸化水平，并且已经证实根据本发明所述的红豆或红豆提取物可作为一种用于预防或治疗肌肉疾病或用于改善肌肉功能的组合物的活性成分，从而完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的发明人一直在寻找一种可以安全地应用以改善肌肉功能或增强运动能力的天然物质，结果证实红豆具有改善肌肉功能或增强运动能力的活性。
因此，本发明的一个方面在于提供一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的组合物，其包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
本发明的另一方面在于提供一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的组合物，其包含作为活性成分的红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
本发明的另一方面在于提供一种用于改善肌肉功能的组合物，其包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
本发明的另一方面在于提供一种用于改善肌肉功能的组合物，其包含作为活性成分的红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物，其包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物，其包含作为活性成分的红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于改善肌肉功能的组合物，其包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于改善肌肉功能的组合物，其包含作为活性成分的红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
因此，本发明提供了一种用于预防或治疗肌肉疾病，改善肌肉功能或增强运动能力的组合物，其包括作为活性成分的红豆提取物、红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
根据本发明所述的红豆提取物促进mRNA转录水平和参与了肌肉细胞中的肌肉功能、肌肉质量调节或肌肉细胞分化的因子的蛋白水平，从而通过肌肉质量的增加改善了肌肉功能或运动能力，与此同时，其还具有预防、治疗或改善减少的运动能力，降低的运动功能，肌肉流失及由各种疾病引起的其它问题。而且，因为根据本发明所述的红豆提取物、红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽是天然物质且不会对身体产生任何副作用，所以其可有效地用作药品、食品等的成分。
附图说明
图1显示了在L6肌肉细胞中用乙醇提取物红豆处理后，测量mTOR活性的结果。
图2显示了在L6肌肉细胞中用乙醇提取物红豆处理后，测量p-p70S6K和p-4EBP1蛋白的表达水平的结果，所述p-p70S6K和p-4EBP1是mRNA转译(translation)相关的生物标志物。
图3显示了在L6肌肉细胞中用乙醇提取物红豆处理后，测量MuRF-1和atrogin-1的mRNA表达水平的结果，所述MuRF-1和atrogin-1是促进肌肉蛋白质降解的生物标志物。
图4显示了在L6肌肉细胞中用乙醇提取物红豆处理后，测量MyoD和肌细胞生成素(myogenin)的mRNA表达水平的结果，MyoD和肌细胞生成素是肌肉分化的生物标志物。
图5显示了在L6肌肉细胞中用热水提取物红豆处理后，测量mTOR活性的结果。
图6显示了在L6肌肉细胞中用亚临界提取物红豆处理后，测量mTOR的表达水平的结果。
图7显示了分别在L6肌肉细胞中通过酶促反应用红豆蛋白和红豆肽处理后，测量mTOR的表达水平的结果。
图8显示了在L6肌肉细胞中用红豆肽处理后，测量p-p70S6K和p-4EBP1蛋白表达水平的结果，所述p-p70S6K和p-4EBP1是mRNA转译(translation)相关的生物标志物。
图9显示了在L6肌肉细胞中用红豆肽处理后，测量MyoD和肌细胞生成素(myoenin)的mRNA表达水平的结果，所述MyoD和肌细胞生成素是肌肉分化的生物标志物。
图10显示了在L6肌肉细胞中用乙醇提取物黑豆处理后，测量mTOR活性的结果。
图11显示了在COS-7肾细胞中用乙醇提取物红豆处理后，测量PGC-1α活性的结果。
图12显示在L6肌肉细胞中用乙醇提取物红豆处理后，测量PGC-1α，ERRα，NRF-1和Tfam的mRNA表达水平的结果，所述PGC-1α，ERRα，NRF-1和Tfam为线粒体生物合成生物标志物。
图13显示了分别在L6肌肉细胞中通过酶促反应用红豆蛋白和红豆肽处理后，测量PGC-1α的表达水平的结果。
图14显示了在L6肌肉细胞中用红豆肽处理后，测量PGC-1α，ERRα，NRF-1和Tfam的mRNA表达水平的结果，所述PGC-1α，ERRα，NRF-1和Tfam为线粒体生物合成生物标志物。
图15显示了在COS-7肾细胞中用乙醇提取物黑豆处理后，测量PGC-1α活性的结果。
图16显示了在诱导肌肉萎缩的小鼠中用乙醇提取物红豆处理后，测量肌肉强度的结果。
图17显示了在诱导肌肉萎缩的小鼠中用乙醇提取物红豆处理后，测量耐力的结果(a：运动时间，b：运动距离)。
图18显示了在诱导肌肉萎缩的小鼠中用乙醇提取物红豆处理后，测量胫骨前肌的重量的结果。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物，其包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
如本文所用，术语“红豆(Vigna angularis)”是指红豆(V.angularisW.F.Wight)，黑豆(V.angularis var.Angularis)或其它植物的干种子，其属于豆科(Fabaceae)豇豆属(Vigna spp.)，单独使用或组合使用。
如本文所用，术语“红豆提取物”是指通过提取红豆获得的提取物。生产红豆提取物的方法包括用至少一种溶剂提取红豆，所述至少一种溶剂选自水、C1至C6有机溶剂、亚临界流体和超临界流体。更具体地，溶剂可以选自具有1至6个碳原子的醇(alcohol)、丙酮(acetone)、醚(ether)、苯(benzene)、氯仿(chloroform)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、二氯甲烷(methylene chloride)、己烷(hexane)、环己烷(cyclohexane)和石油醚(petroleumether)中的至少一种。
更具体地，提取物优选但不限于通过一种工艺制造的提取物，所述工艺包括以下步骤：
1)用提取溶剂提取红豆；
2)过滤步骤1)的提取物；以及
3)在减压下浓缩步骤2)的过滤的提取物，然后对浓缩的提取物进行干燥。
在上述方法中，步骤1)的红豆可包括但不限于栽培的或市售的红豆。
在上述方法中，作为红豆提取物的提取方法，可以使用本领域的常规方法，例如过滤、热水提取、浸渍提取、回流冷却提取、超声提取、超高压提取和亚临界提取。针对上述提取方法，在进行超高压提取时，优选在100-500MPa的压力下进行提取。
在上述方法中，优选使用步骤3)中的减压下的浓缩，但不限于真空减压浓缩器或真空旋转蒸发器。此外，干燥可以优选包括但不限于减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
此外，本发明提供一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物，其包含作为活性成分的红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
如本文所用，术语“红豆衍生蛋白质”可通过以下步骤i)至v)获得：
i)将干燥的红豆粉碎，然后用己烷作为溶剂进行萃取；
ii)除去步骤i)中获得的己烷提取物，并将水加入到残留物中，残留物的pH值为7.0-10.0；
iii)通过离心步骤ii)中留下的残留溶液获得上清液；
iv)将步骤iii)中获得的上清液的pH值保持在2.0至6.0；以及
v)离心步骤iv)中留下的上清液后，得到沉淀物，其为红豆衍生蛋白质。
如本文所用，术语“红豆衍生肽”是指通过处理蛋白质水解酶从红豆中分离的红豆蛋白质。具体地，红豆衍生肽可通过以下方法步骤i)至vii)获得：
i)将干燥的红豆粉碎，然后用己烷作为溶剂进行萃取；
ii)除去步骤i)中获得的己烷提取物，并将水加入到残留物中，残留物的pH值为7.0-10.0；
iii)通过离心步骤ii)中留下的残留溶液获得上清液；
iv)将步骤iii)中获得的上清液的pH值保持在2.0至6.0；以及
v)离心步骤iv)中留下的上清液后，得到沉淀物，其为红豆衍生蛋白质；
vi)在步骤v)中获得的红豆衍生蛋白质中加入水解酶进行酶反应，然后过滤除去沉淀物；以及
vii)冻干在步骤vi)中除去沉淀物的滤液，以获得肽。
如本文所用，术语“水解酶”是选自碱性蛋白酶(Alcalase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)、复合蛋白酶(Protamex)和蛋白酶-NP(Protease-NP)的至少一种蛋白酶。
如本文所用，术语“肌肉疾病”是由肌肉功能减少、肌肉萎缩或肌肉退化引起的肌肉疾病，并且优选是本领域已报道的疾病。肌肉萎缩或肌肉退化是由遗传因素、后天因素、衰老等引起的。肌肉萎缩的特征在于肌肉(尤其在于骨骼肌或随意肌和心肌)质量的逐渐流失，肌肉无力和退化。与肌肉萎缩相关的疾病的实例可包括张力缺乏(atony)、肌肉萎缩(muscular atrophy)、肌营养不良(muscular dystrophy)、肌肉退化、肌无力、恶病质(cachexia)和肌肉减少症(sarcopenia)等。本发明的组合物具有增加肌肉质量的效果，同时肌肉的种类不受限制。
如本文所用，术语“肌肉”是指综合意义上的肌肉和肌腱。术语“肌肉功能”是指肌肉通过其收缩发挥力量的能力，同时它包括肌肉力量以克服阻力发挥最大收缩力的能力；肌肉耐力，即肌肉在给定体重下能够重复收缩和放松的时间和次数的能力；肌肉敏捷性，即肌肉在短时间内发挥强大力量的能力。肌肉功能与肌肉质量成正比。表述“改善肌肉功能”意味着肌肉功能在更优选的方向上得到改善。
如本文所用，术语“运动能力”是指当日常生活或运动中的肢体动作分为跑步、跳跃、投掷、游泳等时，其由肌肉力量、敏捷性和耐力等因素限制时的肢体动作的速度、力量、准确度、持续时间和技巧的程度。表达“增强运动能力”是指改善或提高运动能力。
当本发明的组合物是一种用于增强运动能力的药物组合物时，它可用于预防或治疗由于运动能力退化引起的疾病。这些疾病的实例包括退行性疾病、线粒体疾病、耐力功能障碍、敏捷性功能障碍、嗜睡、肌肉流失和抑郁症等。本发明的组合物具有提高运动能力的作用，并且不限制运动的类型和种类。
就根据本发明所述的用于改善肌肉功能的药物组合物而言，其可用于预防或治疗由于肌肉萎缩或肌肉退化引起的肌肉疾病。肌肉萎缩或肌肉退化是由遗传因素、后天因素、衰老等引起的。肌肉萎缩的特征在于肌肉质量逐渐丧失，肌肉(特别是骨骼肌或随意肌和心肌)无力和退化。与此相关的疾病的实例可包括张力缺乏(atony)、肌肉萎缩(muscularatrophy)、肌营养不良(muscular dystrophy)、肌肉退化、肌无力、恶病质(cachexia)和肌肉减少症(sarcopenia)等。本发明的组合物具有增加肌肉质量的效果，并且肌肉的种类不受限制。
就根据本发明所述的用于增强运动能力的药物组合物而言，其可用于预防或治疗由运动能力退化引起的疾病。与此相关的疾病的实例线粒体病症、耐力功能障碍、敏捷性功能障碍、嗜睡、肌肉流失和抑郁症。本发明的组合物具有提高运动能力的效果，并且不限制运动的类型和种类。
本发明的药物组合物可以进一步含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的实例还可以包括用于口服给药的载体或用于肠胃外给药的载体。口服给药的载体可包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。用于肠胃外给药的载体可包括水、适当的油、盐溶液、葡萄糖水溶液、乙二醇等。此外，载体还可包括稳定剂和防腐剂。稳定剂的合适实例包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。防腐剂的合适实例包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。其它药学上可接受的载体可参见以下文献(Remington's Pharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。
本发明的药物组合物可以通过任何方法施用于包括人在内的哺乳动物。例如，它可以口服给药或胃肠外给药，并且肠胃外给药可以是，但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、外用、舌下或直肠给药。
根据如上所述的给药途径，本发明的药物组合物可以配制成口服给药或肠胃外给药的制剂。根据本发明的组合物可以通过使用至少一种缓冲液(例如，盐溶液或PBS)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如，EDTA或谷胱甘肽)、填充剂、增量剂、粘合剂、佐剂(例如氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂、稀释剂或赋形剂来配制。
用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液或胶囊，并且这种固体制剂可以通过将本发明的药物组合物与至少一种赋形剂混合来制备，所述赋形剂如淀粉(包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉)、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、右旋糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇麦芽糖醇、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或明胶。例如，片剂或糖衣片剂可以通过以下方式来获得，即将活性成分与固体赋形剂混合，粉碎混合物，向粉碎的混合物中加入合适的佐剂，然后将混合物加工成颗粒混合物。
除了简单的赋形剂外，还可以使用硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。用于口服给药的液体制剂对应于悬浮剂、内用液体、乳液、糖浆等，并且除了作为简单稀释剂的水或液体石蜡之外，液体制剂还可以包括几种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。在某些情况下，可以加入交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠作为崩解剂，同时可以进一步添加抗凝剂、润滑剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
至于肠胃外给药，本发明的药物组合物可以与合适的肠胃外载体一起以注射剂、药剂或透皮给药制剂和鼻吸入剂的剂型通过本领域已知的方法配制。注射剂需要大致进行灭菌，并且需要保护其免受微生物(例如细菌和真菌)的污染。用于注射剂的合适载体的实例可包括但不限于溶剂或分散介质，包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、其混合物，和/或植物油。更优选地，Hanks'溶液、林格液、磷酸盐缓冲盐水(PBS,phosphate buffered saline)或含有三乙醇胺的无菌注射用水，或等渗溶液(如10％乙醇，40％丙二醇或5％右旋糖)可用作合适的载体。为了保护注射剂免受微生物污染，注射剂可以进一步含有各种抗生素和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸和硫柳汞。在大多数情况下，注射剂可进一步含有等渗剂，例如糖或氯化钠。
透皮剂或制剂的形式包括软膏、霜剂、洗剂、凝胶、外用溶液、糊剂、搽剂和气雾剂。术语“经皮给药”是指通过外用给予皮肤将有效量的药物组合物中含有的活性成分递送到皮肤中。
在吸入剂的情况下，使用合适的推进剂，例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，可以从加压包装或喷雾器以气溶胶喷雾的形式方便地递送根据本发明使用的化合物。在加压气溶胶的情况下，单元剂量可以通过提供递送测定量的阀来确定。例如，用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒可以配制成含有化合物和适当粉末材料的粉末混合物，例如乳糖或淀粉。用于肠胃外给药的制剂在药物化学的众所周知的文献中有所描述(Remington's Pharmaceutical Science,15th Edition,1975.MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,Chapter 87:Blaug,Seymour)。
当含有有效量的红豆提取物、红豆蛋白、红豆肽时，本发明的药物组合物可以提供改善肌肉功能或提高运动能力的优选效果。如本文所用，术语“有效量”是指表现出比阴性对照更大的反应的量，优选足以改善肌肉功能或增强运动能力的量。本发明的药物组合物可含有0.01-99.99％的红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽，剩余的量为药学上可接收的载体。本发明的药物组合物中含有的红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽的有效量可以根据制备组合物的配方而变化。
根据本发明所述的药物组合物的总有效量可以以单剂量(single dose)施用于患者，或者可以通过分次治疗方案(fractionated treatment protocol)长期以多剂量(multiple dose)给药。在本发明的药物组合物中，活性成分的含量可以根据疾病的严重程度而变化。当肠胃外给药时，基于红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽，其以每天每千克体重0.01至50mg，更优选0.1至30mg的量给药，并且当口服施用时，它可以一次给药或分成多剂量给药，以红豆提取物、红豆蛋白为基础，优选以每天每公斤体重0.01至100mg，更优选以0.01至10mg的量给药。然而，关于红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽的剂量，尽管红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽的有效剂量取决于各种因素，包括给药途径和治疗次数，以及患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病的严重程度、饮食和排泄率，本领域技术人员也可以根据用于改善肌肉功能或用于增强运动能力的特定用途来确定红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽的合适的有效量。只要本发明的药物组合物呈现出本发明的效果，其就不特别限于制剂的形式、给药途径和给药方法。
本发明的药物组合物可单独使用或与其它方法结合使用，所述其它方法采用手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法或生物反应控制器。
本发明的药物组合物可以以外用制剂的剂型提供，所述外用制剂含有作为活性成分的红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽。
当本发明的药物组合物用作外用制剂时，其还可含有皮肤病学领域常用的佐剂，例如脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、浓缩剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子乳化剂或非离子乳化剂、填充剂、多价螯合剂、螯合剂、防腐剂、维生素、阻滞剂、润湿剂、精油、染料、色素、亲水或亲脂活性剂、脂质囊泡，或外用皮肤制剂中常规使用的任何其它成分。另外，上述成分可以以美容中常用的量引入。
当本发明的药物组合物用作皮肤外用制剂时，其可为软膏剂、贴剂、凝胶剂、乳膏剂和喷雾剂，但不限于此。
此外，本发明提供了一种用于改善肌肉功能或增强运动能力的食品组合物。
当本发明的食品组合物是一种用于改善肌肉功能的食品组合物时，其可用于预防或改善本领域中报道的疾病，如由肌肉功能减少、肌肉萎缩或肌肉退化引起的肌肉疾病。肌肉萎缩或肌肉退化是由遗传因素、后天因素、衰老等引起的，同时肌肉萎缩的特征在于肌肉质量的逐渐流失，肌肉(特别是骨骼肌或随意肌和心肌)无力和退化。与肌肉萎缩或肌肉退化相关的疾病的实例可包括张力缺乏(atony)、肌肉萎缩(muscular atrophy)、肌营养不良(muscular dystrophy)、肌肉退化、肌无力、恶病质(cachexia)和肌肉减少症(sarcopenia)等。本发明的组合物具有增加肌肉质量的作用，且肌肉的类型不受限制。肌肉功能与肌肉质量成正比，同时表述“改善肌肉功能”意味着肌肉功能以有利的方式得到改善。
当本发明的食品组合物是一种用于增强运动能力的食品组合物时，其可以用于预防或治疗由运动能力退化引起的疾病。这些疾病的实例包括退行性疾病、线粒体疾病、耐力功能障碍、敏感性功能障碍、嗜睡、肌肉流失、抑郁症等。本发明的组合物具有提高运动能力的效果，并且运动的类型和种类不受限制。
本发明的食品组合物包括所有食物类型，包括功能性食物(functional food)、营养补充剂(nutritional supplement)、保健食品(health food)、食品添加剂(foodadditives)和动物饲料，并且食品组合物由人或动物(包括牲畜)摄取。可以根据本领域已知的常规方法以各种形式制备上述类型的食品组合物。
可以根据本领域已知的常规方法以各种形式制造上述类型的食品组合物。食品组合物可以通过将红豆提取物和红豆肽添加到日常食品中来制造，所述日常食品包括但不限于饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例如，罐装水果、瓶装食品、果酱、橘子酱等)、鱼类，肉类及其加工产品(如火腿、香肠、咸牛肉等)、面包、面条(如乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖浆、乳制品(如黄油、奶酪等)、食用植物油、人造黄油、植物蛋白、甑煮食品、冷冻食品和各种调味料(如豆瓣酱、酱油、调味酱等)。或者，营养补充剂可以通过将红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽添加到胶囊、片剂、丸剂等中来制造，但不限于此。关于保健功能食品，红豆提取物可以例如由液化、造粒、包囊或粉碎来提取，使得红豆提取物本身可以以不限于茶、汁和饮料的形式(作为保健饮料)供人们饮用。另外，可将红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽制成粉末或浓缩液的形式，以用作食品添加剂。另外，通过将红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽与一种活性成分混合来制得一种组合物，其中所述活性成分已知具有改善肌肉功能或增强运动能力的效果。
当本发明的用于改善肌肉功能或增强运动能力的食品组合物被用作保健饮料组合物时，其可以含有作为普通饮料中的添加剂的多种调味剂或天然碳水化合物等。上述碳水化合物包括单糖如葡萄糖和果糖；双糖如麦芽糖和蔗糖；多糖如糊精和环糊精；糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。甜味剂包括天然甜味剂，如索马甜和甜叶菊提取物；合成甜味剂如糖精和阿斯巴甜。每100毫升本发明组合物中天然碳水化合物的比例通常约为0.01克至0.04克，优选为约0.02克至0.03克。
红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽可作为一种活性成分包含在一种用于改善肌肉功能或增强运动能力的食品组合物中，且其量为足以获得改善肌肉功能或增强运动能力效果的量，且其量不限于此。然而，相对于组合物的总重量，红豆提取物、红豆蛋白或红豆肽的量优选为0.01-100wt％。通过混合红豆提取物和另一种已知具有改善肌肉功能或增强运动能力效果的活性成分来制得本发明的食品组合物。
此外，本发明的保健食品可以含有各种营养素、维生素、电解质、香料、着色剂、果胶酸、果胶酸盐、海藻酸、海藻酸盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇或碳酸化剂。另外，本发明的保健食品可以含有用于制造天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉。这些成分可以独立使用或组合使用。这种添加剂的比例不是关键的，但比例范围通常为相对每100重量份的本发明组合物，0.01至0.1重量份的所述添加剂。
在下文中，将参考实施例，实验实施例和制备实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例，实验实施例和制备实施例用于说明本发明，且本发明不限于以下实施例，实验实施例和制备实施例。
实施例1：红豆提取物的制备
1-1红豆甲醇提取物的制备
将干燥的红豆(Vigna angularis W.F.Wight)用混合器粉碎，将100g粉碎的红豆粉浸入1L的100％甲醇中，在室温下静置24小时，将获得提取物的该过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的红豆甲醇提取物。
1-2红豆乙醇提取物的制备
将干燥的红豆(Vigna angularis W.F.Wight)用混合器粉碎，将100g粉碎的红豆粉分别浸入1L的100％、70％、50％、或30％的乙醇中，在室温下静置24小时，将获得该提取物的过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的红豆乙醇提取物。
1-3红豆乙酸乙酯提取物的制备
将干燥的红豆(Vigna angularis W.F.Wight)用混合器粉碎，将100g粉碎的红豆粉浸入1L的100％乙酸乙酯中，在室温下静置24小时，将获得该提取物的过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的红豆乙酸乙酯提取物。
1-4红豆己烷提取物的制备
将干燥的红豆(Vigna angularis W.F.Wight)用混合器粉碎，将100g粉碎的红豆粉浸入1L的100％己烷中，在室温下静置24小时，将获得该提取物的过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的红豆乙烷提取物。
1-5红豆热水提取物的制备
将干燥的红豆(Vigna angularis W.F.Wight)用混合器粉碎，将100g粉碎的红豆粉浸入1L的水中，在80℃下搅拌2小时以获得提取物。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的红豆热水提取物。
1-6红豆超高压提取物的制备
将干燥的红豆(V.angularis W.F.Wight)用混合器粉碎，然后将76mL的18％乙醇置于聚乙烯(polyethylene)包装中并密封，然后使用超高压提取装置(Frescal MFP-7000；Mitsubishi Heavy Industries，Tokyo，Japan)提取。作为超高压提取条件，提取压力设定为320MPa，提取时间设定为5分钟。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的红豆超高压提取物。
1-7红豆亚临界提取物的制备
将干燥的红豆(V.angularis W.F.Wight)用混合器粉碎，然后将50g粉碎的红豆与1L的水一起置于亚临界萃取装置(Biovan,Gyeonggi,Republic of Korea)中并密封。密封完成后，将反应器的温度升高至200℃，当反应器的温度达到200℃时，保持该温度达20分钟之久，以进行提取。20分钟之后，将提取物转移至其中装有冷却水的储罐，将提取物快速冷却至30℃，然后在3600rpm下离心30分钟，以分离漂浮的残留物，从而获得上清液。使用冻干机(ilShinLab Co.Ltd.,Seoul,Republic of Korea)来完全去除溶剂，以获得红豆亚临界提取物。
实施例2：红豆衍生蛋白和红豆衍生肽的分离
2-1红豆衍生蛋白的分离
将干燥的红豆(V.angularis W.F.Wight)粉碎，向1L己烷中加入1kg粉碎的红豆，在室温下搅拌提取4小时。除去己烷提取物后，向残留物中加入水，并在pH9,25下静置30分钟。将混合物在6,000rpm下离心30分钟，得到上清液，将上清液在pH4.5,25下静置30分钟。然后在6,000rpm下离心30分钟，得到沉淀的蛋白质。将沉淀的蛋白质溶解在水中，中和后，使用冻干机(ilShin Lab Co.Ltd.,Seoul,Republic ofKorea)去除所有的水，得到分离的红豆蛋白。
2-2用碱性蛋白酶(Alcalase)处理制备红豆肽
向实施例2-1中获得的红豆蛋白中加入蛋白酶1％碱性蛋白酶(Novozymes，Bagsvaerd，Denmark)，并在50℃下进行6小时的酶反应。6小时后，酶在90℃下灭活20分钟，然后用Whatman No.2滤纸过滤除去沉淀物。用冻干机(ilShin Lab Co.Ltd.,Seoul,Republic of Korea)完全去除过滤后的液体中的水，通过碱性蛋白酶处理得到红豆肽。
2-3用风味蛋白酶(Flavourzyme)处理制备红豆肽
以与实施例2-2相同的方式，处理风味酶(Novozymes)代替碱性蛋白酶，通过风味蛋白酶处理获得红豆肽。
2-4用中性蛋白酶(Neutrase)处理制备红豆肽
以与实施例2-2相同的方式，处理中性蛋白酶(Novozymes)代替碱性蛋白酶，通过中性蛋白酶处理获得红豆肽。
2-5用复合蛋白酶(Protamex)处理制备红豆肽
以与实施例2-2相同的方式，处理复合蛋白酶(protamex)代替碱性蛋白酶，通过复合蛋白酶处理获得红豆肽。
2-6用蛋白酶-NP(Protease-NP)处理制备红豆肽
以与实施例2-2相同的方式，处理蛋白酶-NP(Protease-NP)(Bioland,Asan,Republicof Korea)代替碱性蛋白酶，通过蛋白酶-NP处理获得红豆肽。
实施例3：黑豆提取物的制备
3-1黑豆甲醇提取物的制备
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)用混合器粉碎，将100g粉碎的黑豆粉浸入1L的100％甲醇中，在室温下静置24小时，将获得该提取物的过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的黑豆甲醇提取物。
3-2黑豆乙醇提取物的制备
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)用混合器粉碎，将100g粉碎的黑豆粉分别浸入1L的100％、70％、50％、或30％的乙醇中，在室温下静置24小时，将获得该提取物的过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的黑豆乙醇提取物。
3-3黑豆乙酸乙酯提取物的制备
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)用混合器粉碎，将100g粉碎的黑豆粉浸入1L的100％乙酸乙酯中，在室温下静置24小时，将获得该提取物的过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的黑豆乙酸乙酯提取物。
3-4黑豆己烷提取物的制备
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)用混合器粉碎，将100g粉碎的黑豆粉浸入1L的100％己烷中，在室温下静置24小时，将获得该提取物的过程重复3次。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的黑豆乙烷提取物。
3-5黑豆热水提取物的制备
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)用混合器粉碎，将100g粉碎的黑豆粉加入1L的水中，在80℃下搅拌2小时以获得提取物。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的黑豆热水提取物。
3-6黑豆超高压提取物的制备
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)用混合器粉碎，然后将76mL的18％乙醇置于聚乙烯(polyethylene)包装中并密封，然后使用超高压提取装置(Frescal MFP-7000；Mitsubishi Heavy Industries，Tokyo，Japan)提取。作为超高压提取条件，提取压力设定为320MPa，提取时间设定为5分钟。将得到的提取物用Whatman No.2滤纸在减压下过滤，并用真空旋转冷凝器浓缩过滤的提取物，得到其中已去除溶剂成分的黑豆超高压提取物。
3-7黑豆亚临界提取物的制备
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)用混合器粉碎，然后将50g粉碎的黑豆与1L的水一起置于亚临界萃取装置(Biovan,Gyeonggi,Republic of Korea)中并密封。密封完成后，将反应器的温度升高至200℃，当反应器的温度达到200℃时，保持该温度达20分钟之久，以进行提取。20分钟之后，将提取物转移至其中装有冷却水的储罐，将提取物快速冷却至30℃，然后在3600rpm下离心30分钟，以分离漂浮的残留物，从而获得上清液。使用冻干机(ilShin Lab Co.Ltd.,Seoul,Republic of Korea)来完全去除溶剂，以获得黑豆亚临界提取物。
实施例4：黑豆衍生蛋白和黑豆衍生肽的分离
4-1黑豆衍生蛋白的分离
将干燥的黑豆(V.angularis var.angularis)粉碎，向1L己烷中加入1kg粉碎的黑豆，在室温下搅拌提取4小时。除去己烷提取物后，向残留物中加入水，并在pH9,25下静置30分钟。将混合物在6,000rpm下离心30分钟，得到上清液，将上清液在pH4.5,25下静置30分钟。然后在6,000rpm下离心30分钟，得到沉淀的蛋白质。将沉淀的蛋白质溶解在水中，中和后，使用冻干机(ilShin Lab Co.Ltd.,Seoul,Republic ofKorea)去除所有的水，得到分离的黑豆蛋白。
4-2用碱性蛋白酶(Alcalase)处理制备黑豆肽
向实施例2-1中获得的黑豆蛋白中加入蛋白酶1％碱性蛋白酶(Novozymes，Bagsvaerd，Denmark)，并在50℃下进行6小时的酶反应。6小时后，酶在90℃下灭活20分钟，然后用Whatman No.2滤纸过滤除去沉淀物。用冻干机(ilShin Lab Co.Ltd.,Seoul,Republic of Korea)完全去除过滤的液体，通过碱性蛋白酶处理得到黑豆肽。
4-3用风味蛋白酶(Flavourzyme)处理制备黑豆肽
以与实施例4-2相同的方式，处理风味酶(Novozymes)代替碱性蛋白酶，通过风味蛋白酶处理获得黑豆肽。
4-4用中性蛋白酶(Neutrase)处理制备黑豆肽
以与实施例4-2相同的方式，处理中性蛋白酶(Novozymes)代替碱性蛋白酶，通过中性蛋白酶处理获得黑豆肽。
4-5用复合蛋白酶(Protamex)处理制备黑豆肽
以与实施例4-2相同的方式，处理复合蛋白酶(protamex)(Novozymes)代替碱性蛋白酶，通过复合蛋白酶处理获得黑豆肽。
4-6用蛋白酶-NP(Protease-NP)处理制备黑豆肽
以与实施例4-2相同的方式，处理蛋白酶-NP(Bioland,Asan,Republic of Korea)代替碱性蛋白酶，通过蛋白酶-NP处理获得黑豆肽。
实验实施例1：评价红豆乙醇提取物的肌肉生成活性
已知mTOR蛋白在磷酸化和活化时，可诱导参与肌细胞PI3K/Akt信号通路的肌肉蛋白质合成和肌肉质量增加的蛋白质活化。因此，用mTOR夹心ELISA试剂盒(Mtor SandwichELISA kit)(Cell Signaling Techonology,Beverly,MA,USA)来证实mTOR活性以确定红豆乙醇提取物在诱导肌肉生成中的活性。
将浓度为1×105个细胞/mL的成肌细胞L6细胞(ATCC；Manassas，VA，USA)与含有10％胎牛血清(FBS；Hyclone，Logan，UT，USA)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’smodified Eagle’s media)(DMEM；Hyclone)接种在6孔板上并培养24小时。培养后，取出孔中的培养基，用含有2％马血清(HS；Hyclone)的DMEM(Hyclone)代替培养基，将细胞进一步培养6天以将L6细胞分化成肌管(myotube)。随后，用所述细胞处理浓度为40μg/mL的通过实施例1-2中的100％乙醇制得的红豆乙醇提取物，并培养12小时。培养后，通过细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer)的处理裂解细胞。通过Bradford方法(Bio-Rad LaboratoriesInc.，Hercules，CA，USA)定量获得的细胞裂解产物中的蛋白质，并将其定量至1mg/mL的浓度，将50μL细胞裂解产物分配到附有抗mTOR抗体的微孔中，并在37℃下培养2个小时。培养后，用洗涤缓冲液(washing buffer)洗涤细胞4次，用检测抗体(deteciton antibody)处理细胞，在37℃下培养1小时，用洗涤缓冲液洗涤4次，接着加入偶联二抗的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)并在37℃下培养30分钟。最后，用洗涤缓冲液洗涤4次后，向每个孔中加入TMB底物，在37℃下培养10分钟，然后通过加入停止液(stop solution)终止TBM反应。两分钟后，在450nm处测量吸光度，并测量用红豆乙醇提取物处理的肌管中的mTOR水平。结果显示在图1中。
结果，如图1所示，用红豆乙醇提取物处理后，L6肌肉细胞中mTOR的活性显著增加(**p<0.01)。这表明本发明的红豆乙醇提取物具有增强肌肉细胞中肌肉生成的优异能力。
实验实施例2：评价红豆乙醇提取物的肌肉蛋白质合成因子的mRNA转录水平
将浓度为2×105个细胞/mL的成肌细胞L6细胞(ATCC)与含有10％FBS(Hyclone)的DMEM接种到6孔板上并进行培养。当细胞密度达到约80-85％时，去除孔中的培养基，用含有2％HS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)代替培养基，以将L6细胞分化为肌管(myotube)。6天后，用DMEM(Hyclone)代替培养基，其中更换通过实施例1-2中的100％乙醇制得的25μg/ml,50μg/ml或40μg/ml的红豆乙醇提取物并培养24小时。此时，用0.01％DMSO而非样品处理的组被用作对照组。24小时后，在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich St.Louis，MO，USA)的NP-40缓冲液(ELPIS-Biotech，Daejeon，Republic)(ELPS-Biotech,Daejeon,Korea)中收获并裂解细胞以获得细胞裂解物。获得的细胞裂解物以13,000rpm离心10分钟，获得上清液。用Bradford定量上清液中的蛋白质浓度，将恒定浓度的蛋白质加热5分钟，在10％SDS-PAG凝胶(gel)上显色，并用SDS-PAG电泳分离细胞内蛋白质。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后，分别以1:1000至2.5％的牛血清白蛋白(BSA)的比例稀释抗p-p70S6K抗体，抗t-p70S6K抗体，抗p-4EBP1抗体，抗t-4EBP1抗体或抗α-微管蛋白抗体(Cell SignalingTechnology)，同时转移到硝酸纤维素膜上的蛋白质作为一抗在室温下反应20小时。一抗反应后，硝酸纤维素膜用Tris缓冲盐水吐温20(Tris-buffer Saline Tween 20,TBST)洗涤三次，洗涤时间长达10分钟。然后，将识别一抗的HRP-缀合的二抗(Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TA，USA)在2.5％BSA(bioWORLD)中稀释至1：5000，并使其在室温下与硝酸纤维素膜反应2小时，并使用TBST洗涤3次，时间长达10分钟。使用ECL蛋白质印迹检测试剂(Amersham，Tokyo，Japan)检测蛋白质条带，使用G；BOX EF成像系统(Syngene，Cambridge，UK)鉴定蛋白质条带。结果如图4所示。
结果，如图2所示，证实了通过处理红豆乙醇提取物，L6肌肉细胞中mRNA转录增加了参与肌肉蛋白质合成的p-p70S6K和p-4EBP1的蛋白质表达水平。这意味着本发明的红豆乙醇提取物促进了肌肉细胞中的肌肉蛋白合成的相关因子的mRNA转译过程。
实验实施例3：评价红豆乙醇提取物的肌肉蛋白质降解的抑制
将浓度为2×105个细胞/mL的成肌细胞L6细胞(ATCC)与含有10％FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)接种于6孔板上并进行培养。当细胞密度达到约80-85％时，去除孔中的培养基，用含有2％HS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)代替培养基，以将L6细胞分化为肌管(myotube)。每2天用新鲜培养基更换一次，该分化总共进行6天。分化后，将上述实施例1-2中由100％乙醇制得的红豆乙醇提取物以20或40μg/mL的浓度溶解在含有50ng/mL TNF-α的DMEM培养基中，并处理至细胞上。6个小时后，使用TRIzol试剂(Takara，Osaka，Japan)分离总RNA。使用纳米滴剂(NanoDrop 1000；Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)对分离的总RNA进行定量；定量16μL RNA，将16μL RNA与逆转录酶预混物(ReverseTranscriptase Premix，ELPIS-Biotech)混合，并使用PCR机(Gene Amp PCR System 2700；Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)通过cDNA在42℃下合成55分钟，在70℃下合成15分钟。通过混合4μL的合成的cDNA和表1中列出的序列的正向引物和反向引物(Bioneer，Deajeon，Republic of Korea)和PCR预混物(ELPIS-Biotech)来制得PCR样品，然后对PCR进行30个重复的在95℃下进行30秒，60℃下进行1秒，在72℃下进行1分钟循环。
通过在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离扩增的cDNA，用G；BOX EF成像系统(Syngene)证实cDNA条带。结果如图3所示。
表1
在本发明的实施例中用于PCR的引物序列
结果，如图3所示，通过用红豆乙醇提取物处理，L6肌肉细胞中atrogin-1和MuRF-1mRNA的mRNA表达降低。这意味着本发明的红豆乙醇提取物在抑制肌肉细胞中的肌肉蛋白质降解方面具有优异的能力。
实验实施例4：评价红豆乙醇提取物在促进肌肉分化中的活性
将浓度为2×105个细胞/mL的成肌细胞L6细胞(ATCC)与含有10％FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)接种于6孔板上并进行培养。当细胞密度达到约80-85％时，去除孔中的培养基，然后将实施例1-2中由100％乙醇制得的红豆乙醇提取物以25,50或40μg/mL的浓度溶解在含有2％HS的DMEM(Hyclone)中，并用细胞进行处理以诱导分化成肌管。此时，用0.01％DMSO而非样品处理的组被用作对照组。上述步骤总共进行6天，每两天重复3次，然后使用TRIzol试剂(Takara)对所有的RNA进行分离。以与实验实施例3中相同的方法处理分离的RNA至cDNA合成和PCR，以证实MyoD和肌细胞生成素(myogenin)的mRNA转录水平。用于PCR的引物(Bioneer)的序列在下表2中示出。通过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳分离扩增的cDNA，用G；BOX EF成像系统(Syngene)证实cDNA条带。结果如图4所示。
表2
在本发明的实施例中用于PCR的引物序列
结果，如图4所示，通过用红豆乙醇提取物处理，L6肌肉细胞中MyoD和肌细胞生成素(myogenin)mRNA的mRNA表达增加。这意味着本发明的红豆乙醇提取物在促进肌肉细胞中的肌肉分化方面具有优异的能力。
实验实施例5：红豆热水提取物的肌肉生成活性
以与实验实施例1中相同的方式，通过处理实施例1-5中制得的40μg/mL红豆热水提取物来评价mTOR活性。结果如图5所示。
如图5所示，用红豆热水提取物处理后，L6肌肉细胞中mTOR的活性显著增加(**p<0.01)。这意味着本发明的红豆热水提取物在增加肌肉细胞中的肌肉生成方面具有优异的能力。
实验实施例6：红豆亚临界提取物的肌肉生成活性
以与实验实施例1中相同的方式，通过处理实施例1-7中制得的5μg/mL红豆亚临界提取物来评价mTOR活性。结果如图6所示。
如图6所示，用红豆亚临界提取物处理后，L6肌肉细胞中mTOR的活性显著增加(**p<0.01)。这意味着本发明的红豆亚临界提取物在增加肌肉细胞中的肌肉生成方面具有优异的能力。
实验实施例7：红豆蛋白和红豆肽的肌肉生成活性
以与实验实施例1中相同的方式，通过分别处理实施例2-1,2-4,2-5和2-6中制得的40μg/mL红豆蛋白和红豆肽来评价mTOR活性。结果如图7所示。
结果，如图7所示，用红豆蛋白和红豆肽处理后，L6肌肉细胞中mTOR的活性显著增加(**p<0.01)。这意味着本发明的红豆蛋白和红豆肽在增加肌肉细胞中的肌肉生成方面具有优异的能力。
实验实施例8：红豆肽的mRNA转录促进活性
以与实验实施例2中相同的方式，通过处理实施例2-5中制得的50或100μg/mL红豆肽来评估mTOR活性。结果如图8所示。
结果，如图8所示，证实了通过处理红豆肽，L6肌肉细胞中的mRNA转录增加了参与肌肉蛋白质合成的p-p70S6K和p-4EBP1的蛋白质表达。这意味着本发明的红豆肽促进肌肉细胞中肌肉蛋白质合成的mRNA转录。
实验实施例9：红豆肽的肌肉分化促进活性
以与实验实施例4中相同的方式进行实验。代替红豆乙醇提取物，将实施例2-5中制得的红豆肽以50或100μg/mL的浓度溶解，然后用细胞处理以诱导分化成肌管。此时，用0.01％DMSO而不是样品处理的组用作对照组。结果如图9所示。
结果，如图9所示，通过用红豆肽处理，L6肌肉细胞中MyoD和肌细胞生成素(myogenin)mRNA表达增加。这意味着本发明的红豆肽在促进肌肉细胞中肌肉分化方面具有优异的能力。
实验实施例10：黑豆乙醇提取物的肌肉生成活性
以与实验实施例1中相同的方式，通过处理实施例3-2中制得的40μg/mL黑豆乙醇提取物来评价mTOR活性。结果如图10所示。
如图10所示，用黑豆乙醇提取物处理后，L6肌肉细胞中mTOR的活性显著增加(**p<0.01)。这意味着本发明的黑豆乙醇提取物在增加肌肉细胞中的肌肉生成方面具有优异的能力。
实验实施例11：红豆乙醇提取物增强运动能力
为了评价红豆乙醇提取物的运动能力，通过荧光素酶测定法测定PGC-1α活性。将浓度为1.5μ105个细胞/孔的COS7猴肾细胞在24孔板中培养，并使用Lipofector(Aptabio，Yongin，Republic of Korea)将pGL3-PGC-1α-Luc质粒(Addgene，Cambridge，MA，USA)转化到细胞中。转染4小时后，使细胞稳定24小时。
然后，将由实施例1-2中的100％乙醇制得的红豆乙醇提取物以40μg/mL的浓度处理到细胞上24小时。最后24小时后，通过溶解在NP-40缓冲液(ELPIS-Biotech)中裂解细胞，测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。结果如图11所示。
结果，如图11所示，证实了通过红豆乙醇提取物，作为参与运动能力的主要因子的PGC-1α的活性显著增加(**p<0.01)。因此，证实红豆乙醇提取物促进运动能力。
实验实施例12：红豆乙醇提取物的线粒体生物合成促进活性
以与实验实施例4中相同的方式进行实验。将实施例1-2中的100％乙醇制得的红豆乙醇提取物以25,50或40μg/mL的浓度溶解，并处理至细胞上，以诱导肌管(myotube)分化。此时，用0.01％DMSO而不是样品处理的组用作对照组。而且，在PT-PCR中，使用以下具体的引物(Bioneer)进行PCR。结果如图12所示。
表3
在本发明的实施例中用于PCR的引物序列
结果，如图12所示，证实了通过用红豆乙醇提取物处理后，PGC-1α,ERRα,NRF-1andTfam的mRNA表达增加。这意味着本发明的红豆乙醇提取物在增加线粒体生物合成相关的基因的表达方面具有优异的能力，所述线粒体生物合成相关的基因的表达与运动能力密切相关。
实验实施例13：红豆蛋白和红豆肽增强运动能力
以与实验实施例11相同的方式，通过分别处理实施例2-1,2-4,2-5和2-6中制得的40μg/mL红豆蛋白和红豆肽来评价PGC-1α活性。结果如图13所示。
结果，如图13所示，证实了通过红豆蛋白和红豆肽，作为参与运动能力的主要因子的PGC-1α的活性显著增加(**p<0.01)。因此，证实红豆蛋白和红豆肽促进运动能力。
实验实施例14：红豆肽的线粒体生物合成促进活性
以与实验实施例4相同的方式，将实施例2-5中制得的红豆肽用50或100μg/mL处理以评价红豆肽的线粒体生物合成活性。结果如图14所示。
结果，如图14所示，证实了通过用红豆肽处理后，PGC-1α，ERRα，NRF-1和Tfam的mRNA表达增加。这意味着本发明的红豆肽在增加线粒体的生物合成相关的基因的表达方面具有优异的能力，所述线粒体的生物合成相关的基因的表达与运动能力密切相关。
实验实施例15：黑豆乙醇提取物提高运动能力
以与实验实施例11相同的方式，通过处理实施例3-2中制得的40μg/mL黑豆乙醇提取物来评价PGC-1α活性。结果如图15所示。
结果，如图15所示，证实了作为运动能力的主要因素的PGC-1α的活性通过黑豆乙醇提取物显著增加(**p<0.01)。因此，证实了黑豆乙醇提取物促进了运动能力。
实验例16：红豆肽的抗萎缩活性
16-1动物育种和诱导肌肉萎缩
购买7周龄雄性小鼠(C57BL/6N；Young Bio)进行实验。在Yonsei LaboratoryAnimal Reaserch Center(YLARC，Seoul，Republic of Korea)进行所有动物的育种，育种环境的温度保持在23±2℃，相对湿度在55±10％。在实验开始前，将总共20只小鼠随机分成几个组，每组5只小鼠，即分别为正常组、萎缩组、红豆300组和红豆600组。一周的适应后，通过腹腔注射325mg/kg三溴乙醇(tribromoethanol,Sigma-aldrich)诱导麻醉。麻醉后，使用皮肤缝合器(skin stapler)(Unidus,Chungcheongbuk-do,Republic of Korea)钉住萎缩组和红豆组中的小鼠的右后肢(hindlimb)腓肠肌(gastrocnemius muscle)和右足垫(right footpad)，损伤肌肉并防止右后肢移动，这种状态持续一周之久。一周后，固定在小鼠腓肠肌和足垫上的钉被移除，并且通过一周每天口服实施例1-2中由50％乙醇制备的浓度为300mg/kg或600mg/kg的红豆乙醇提取物来诱导复原。此时，正常组和萎缩组口服盐水而不是测试样品。
16-2肌肉力量测量
在口服给药期结束时，使用肌肉力量计(Chatillon force measurement system；Columbus Instrument，Columbus，OH，USA)测量小鼠的肌肉力量。用恒定力拉动小鼠的尾巴直到小鼠释放力量计的杆，对每只小鼠进行总共5次的连续测试。
结果，如图16所示，与正常组相比，萎缩组的肌肉力量显著降低(#p<0.05)，而用红豆乙醇提取物处理后肌肉力量显著增加(*p<0.05)。这意味着本发明的红豆乙醇提取物具有增加由于萎缩而降低的肌肉力量的优异效果。
16-3耐力测量
使用跑步机(LE8710MTS；anlab，Barcelona，Spain)评估实验动物的运动能力。一开始的速度为8m/min，接着速度每分钟增加1m/min。当小鼠到达冲击网格(shock grid)时，它被设定为向小鼠发射0.2mA的电力，并且当小鼠在接受电击10秒后停止奔跑时停止实验，然后测量时间和距离。
结果，如图17所示，与正常组相比，萎缩组的运动距离和运动时间显著减少(#p<0.05)，通过用红豆乙醇提取物处理，运动距离和运动时间显著增加(*p<0.05)。这意味着本发明的红豆乙醇提取物具有改善由于萎缩而降低的运动能力的优异效果。
16-4肌肉重量测量
在测量肌肉力量和运动能力后，通过腹腔注射325mg/kg三溴甲醇(Sigma-aldrich)麻醉实验动物并通过心脏血液采集将实验动物处死。确认心脏停止后，移除右后肢中未受损的胫骨前肌(tibialis anterior muscle)，然后测量重量。
结果，如图18所示，通过处理红豆乙醇提取物，与正常组相比，未受损的萎缩组的胫骨前肌的重量和运动时间显著减少(#p<0.05)，但体重显著增加(*p<0.05)。这意味着本发明的红豆乙醇提取物具有增加由于萎缩而减少的肌肉重量的优异效果。
在下文中，将描述用于改善肌肉功能或用于改善运动能力的食品或药品的制备实施例，所述药品和食品包含本发明所述的作为活性成分的红豆，但是本发明不限于此，而仅是具体描述而已。使用具有改善肌肉功能或增强运动能力的红豆乙醇提取物，按照以下组成成分和比例，根据常规方法制备制备实施例1和2的药物和食品组合物。
制备实施例：药物
制备实施例1-1粉末
将50mg实施例1至4的红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽与2g结晶纤维素混合后，按照常规粉末制备方法将该粉末填充在气密容器中以制备粉末。
制备实施例1-2片剂
将50mg实施例1至4的红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽与400mg结晶纤维素和5mg硬脂酸镁混合后，按照常规片剂制备方法片剂制备片剂。
制备实施例1-3胶囊剂
将30mg实施例1至4的红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽与100mg乳清蛋白，400mg结晶纤维素和6mg硬脂酸镁混合后，根据常规胶囊制备方法将胶囊剂填充到明胶胶囊中。
制备实施例2：食品
制备实施例2-1保健食品的制备
可以分别通过混合实施例1至4的1000mg红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽来制备本发明的保健食品组合物，可以混合70ug维生素A乙酸酯，1.0mg维生素E，0.13mg维生素B1，0.15mg维生素B2，0.5mg维生素B6，0.2ug维生素B12，10mg维生素C，10ug生物素，1.7mg烟酸酰胺，50ug叶酸，0.5mg泛酸钙，1.75mg硫酸亚铁，0.82mg氧化锌，25.3mg碳酸镁，15mg磷酸二氢钾，55mg磷酸氢钾，90mg柠檬酸钾，100mg碳酸钙，24.8mg氯化镁，但其混合比例可以任意改变。可以根据常规方法将上述组分混合以根据常规方法制备保健食品组合物的颗粒。
制备实施例2-2保健饮料的制备
分别将1000mg实施例1至4的红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽，1000mg柠檬酸，100g低聚糖，2g李子浓缩物，1g牛磺酸加入到纯净水中，根据常规的保健饮料制造方法，将上述组分以总共900mL混合，在85℃下搅拌和加热约1小时后，将所得溶液过滤，放入无菌2L容器中，密封灭菌，冷藏然后用于制备保健饮料组合物。
制备实施例2-3口香糖
将20wt％的胶基，76.9wt％的糖，1wt％的香料和2wt％的水分别与0.1wt％的实施例1至4中的红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽混合，以常规方式制备口香糖。
制备实施例2-4糖果
将60wt％的糖，39.8wt％的淀粉糖浆，0.1wt％的香料分别与0.1wt％的实施例1至4中的红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽混合，以常规方式制备糖果。
制备实施例2-5饼干
将25.59wt％的低筋面粉，22.22wt％的中筋面粉，4.80wt％的精制糖，0.73wt％的盐，0.78wt％的葡萄糖，11.78wt％的棕榈起酥油，1.54wt％的铵，0.17wt％的碳酸氢钠，0.16wt％的亚硫酸氢钠，1.45wt％的米粉，0.0001wt％的维生素B，0.04wt％的牛奶香料，20.6999wt％的水，1.16wt％的奶粉，0.29wt％的替代奶粉，0.03wt％的磷酸二氢钙，0.29wt％的喷雾盐和7.27wt％的喷雾奶分别和1.00wt％的实施例1至4的红豆提取物，红豆肽，黑豆提取物或黑豆肽混合，以常规方式制备饼干。
<110> 新树有限公司
<120> 一种包含小豆栽培种的用于改善肌肉功能或用于增强运动能力的的组合物
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Claims (28)

1.一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，通过用至少一种溶剂提取所述红豆来获得所述提取物，所述溶剂选自水、C1至C6有机溶剂、亚临界流体和超临界流体。
3.一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物，其特征在，所述药物组合物包含作为活性成分的红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述红豆衍生蛋白质通过包括以下步骤i)至v)的方法获得，且所述红豆衍生肽通过包括以下步骤i)至vii)的方法获得：
i)将干燥的红豆粉碎，然后用己烷作为溶剂进行萃取；
ii)除去步骤i)中获得的己烷提取物，并将水加入到残留物中，所述残留物的pH值为7.0-10.0；
iii)通过离心步骤ii)中留下的残留溶液获得上清液；
iv)将步骤iii)中获得的所述上清液的pH值保持在2.0至6.0；
v)离心步骤iv)中留下的所述上清液后，得到沉淀物，其为红豆衍生蛋白质；
vi)在步骤v)中获得的所述红豆衍生蛋白质中加入水解酶进行酶反应，然后过滤除去沉淀物；以及
vii)冻干在步骤vi)中除去沉淀物的滤液，以获得肽。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，步骤vi)中的所述水解酶为至少一种蛋白水解酶，所述至少一种蛋白水解酶选自碱性蛋白酶(Alcalase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)、复合蛋白酶(Protamex)和蛋白酶-NP(Protease-NP)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述红豆为红豆(V.angularis W.F.Wight)和/或黑豆(V.angularis var.angularis)。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述肌肉疾病是一种由肌肉功能减少、肌肉萎缩或肌肉退化引起的肌肉疾病。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述肌肉疾病选自张力缺乏(atony)、肌肉萎缩(muscular atrophy)、肌营养不良(muscular dystrophy)、肌肉退化、重症肌无力、恶病质(cachexia)和肌肉减少症(sarcopenia)。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述运动能力的改善包括预防和治疗至少一种选自退行性疾病、线粒体疾病、耐力功能障碍、敏捷性功能障碍、嗜睡、肌肉流失和抑郁症中的疾病。
10.一种用于改善肌肉功能或增强运动能力的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
11.根据权利要求10所述的食品组合物，其特征在于，通过用至少一种溶剂提取所述红豆来获得所述提取物，所述溶剂选自水、C1至C4有机溶剂、亚临界流体和超临界流体。
12.一种用于改善肌肉功能或增强运动能力的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物包含作为活性成分的红豆衍生蛋白质或红豆衍生肽。
13.根据权利要求12所述的食品组合物，其特征在于，所述红豆衍生蛋白质通过包括以下步骤i)至v)的方法获得，且所述红豆衍生肽通过包括以下步骤i)至vii)的方法获得：
i)将干燥的红豆粉碎，然后用己烷作为溶剂进行萃取；
ii)除去步骤i)中获得的己烷提取物，并将水加入到残留物中，所述残留物的pH值为7.0-10.0；
iii)通过离心步骤ii)中留下的残留溶液获得上清液；
iv)将步骤iii)中获得的所述上清液的pH值保持在2.0至6.0；
v)离心步骤iv)中留下的所述上清液后，得到沉淀物，其为红豆衍生蛋白质；
vi)在步骤v)中获得的所述红豆衍生蛋白质中加入水解酶进行酶反应，然后过滤除去沉淀物；以及
vii)冻干在步骤vi)中除去沉淀物的滤液，以获得肽。
14.根据权利要求13所述的食品组合物，其特征在于，步骤vi)中的所述水解酶为至少一种蛋白水解酶，所述至少一种蛋白水解酶选自碱性蛋白酶(Alcalase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)、复合蛋白酶(Protamex)和蛋白酶-NP(Protease-NP)。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的食品组合物，其特征在于，所述红豆为红豆(V.angularis W.F.Wight)和/或黑豆(V.angularis var.angularis)。
16.根据权利要求10至14中任一项所述的食品组合物，其特征在于，所述肌肉疾病是一种由肌肉功能减少、肌肉萎缩或肌肉退化引起的肌肉疾病。
17.根据权利要求16所述的食品组合物，其特征在于，所述肌肉疾病选自张力缺乏(atony)、肌肉萎缩(muscular atrophy)、肌营养不良(muscular dystrophy)、肌肉退化、重症肌无力、恶病质(cachexia)和肌肉减少症(sarcopenia)。
18.根据权利要求10至14中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述运动能力的改善包括预防至少一种选自退行性疾病、线粒体疾病、耐力功能障碍、敏捷性功能障碍、嗜睡、肌肉流失和抑郁症中的疾病。
19.一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物的应用，其特征在于，所述药物组合物包含作为活性成分的红豆(Vigna angularis)提取物。
20.一种用于治疗肌肉疾病或增强运动能力的药物组合物的应用，其特征在于，所述药物组合物包含作为活性成分的红豆蛋白质或红豆肽。
21.一种用于改善肌肉功能或增强运动能力的食品组合物的应用，其特征在于，所述食品组合物包含作为活性成分的红豆提取物。
22.一种用于改善肌肉功能或增强运动能力的食品组合物的应用，其特征在于，所述食品组合物包含作为活性成分的红豆蛋白质或红豆肽。
23.一种用于治疗肌肉疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的患者施用红豆(Vigna angularis)提取物。
24.一种用于治疗肌肉疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的患者施用红豆衍生蛋白质或红豆肽。
25.一种用于增强运动能力的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的患者施用红豆(Vigna angularis)提取物。
26.一种用于增强运动能力的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的患者施用红豆衍生蛋白质或红豆肽。
27.一种用于改善肌肉功能的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的患者施用红豆(Vigna angularis)提取物。
28.一种用于改善肌肉功能的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的患者施用红豆衍生蛋白质或红豆肽。
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