KR102082196B1 - 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 파래 추출물을 섭취한 경우, 근조직의 생성이 촉진되는 효과가 나타난다.

Description

파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 조성물{A Composition Comprising Extract of Enteromorpha for promoting muscle tissue production}

본 발명은 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

현재 대한민국은 급격한 속도로 고령화 시대로 전환되어지고 있으며, 2017년 65세 이상 인구는 707만명으로 전체 인구의 13.8%를 차지하는 것으로 나타났다. 최근 연구결과를 살펴보았을 때 연령이 증가함에 따라 근육이 감소하는 근감소증이 나타나는 경향이 증가한다는 사실이 보고되고 있으며, 이러한 근육량의 감소 및 근력 약화는 체력 약화와 활동성의 저하로 이어지고, 최종적으로 독립된 생활이 어렵게 만드며, 부가적으로는 신체장애를 야기한다. 또한 근감소는 당뇨, 비만, 고혈압의 성인병과 퇴행성 질환으로 이어질 수 있기 때문에 근감소는 노령화 시대의 잠재적 위험 요인으로 인식되고 있다.

한편, 파래는 해조류 중 녹조류 일종으로 향기가 많고 맛이 독특하여 한국과 일본 등지에서 즐겨 먹는 해조류의 한 종류로서 칼륨, 미네랄 성분이 풍부한 것으로 알려져 있으며, 파래에서 추출된 다당류에는 혈중 지질 감소, 항박테리아, 항염증 그리고 항암활성이 있는 것으로 보고되고 있다(Wang et al). 이와 관련 파래 성분을 분리 및 정제하여 그 약리작용 및 작용기전을 밝혀내는 연구도 다양하게 진행 중이다.

이에 본 발명의 목적은 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자는 파래 추출물이 근조직의 생성을 촉진 할 수 있다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 과제 해결 수단은 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 조성물이다.

본 발명의 파래 추출물은 근조직의 생성을 촉진하는 효과를 가지는 바, 근조직 생성 촉진용 조성물로 사용되기에 적합하다.

도 1은 본 발명의 파래 추출물을 제조하기 위한 추출 과정을 간략화한 도이다.
도 2는 본 발명의 파래 추출물과 비교예로 사용된 파래 증류수 추출물의 세포 활성 측정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 파래 추출물을 처리한 경우 나타나는 IGF-1 신호경로 활성화의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 파래 추출물을 처리한 경우 나타나는 MEK 신호경로 활성화의 측정 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 파래 추출물은 1) 파래를 증류수로 추출하는 것;

2) 상기 추출물을 원심분리하여 상층액을 분리하는 것;

3) 상기 상층액에 2 내지 4배 부피의 에탄올을 가하고 당을 가라앉히는 것; 및

4) 가라앉힌 당을 여과하여 제거한 후 여과액을 감압 농축하는 것을 포함하는 방법으로 수득된다.

상기 1) 단계에서의 파래는 파래 분말인 것이 바람직하다.

상기 1) 단계에서의 증류수는 파래 분말 중량의 20 내지 30배 사용하는 것이 바람직하다. 이보다 적게 사용할 경우, 유효 성분이 제대로 추출되지 않을 수 있으며, 이보다 많게 사용할 경우 전체 추출 과정에 사용되는 비용이 상승하는 문제점이 있다.

상기 3) 단계에서의 에탄올은 상층액 부피의 2 내지 4배 사용하는 것이 바람직하다. 이보다 적게 사용할 경우, 유효 성분이 제대로 추출되지 않을 수 있으며, 이보다 많게 사용할 경우 전체 추출 과정에 사용되는 비용이 상승하는 문제점이 있다.

본 발명의 상기 추출 방법은 5) 얻어진 추출물을 증류수에 녹이고 암모늄 설페이트를 첨가하여 침전물을 수득하는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 암모늄 설페이트는 파래 추출물을 침전시키기 위한 목적으로 상용되며, 암모늄 설페이트 이외에 아세톤이 사용 가능하다.

본 발명의 파래 추출물은 근조직 생성 촉진 효과를 나타내어 근조직 생성 촉진용 조성물로 사용되기에 적합하다.

본 발명의 근조직 생성 촉진용 조성물은 파래 추출물 이외에 근조직 생성 촉진 효과를 갖는 다른 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 근조직 생성 촉진용 조성물은 일반적으로 약물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있고, 사용될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에이스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐리롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다.

상기 근조직 생성 촉진용 조성물을 제제화하는 경우 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 웨텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 근조직 생성 촉진용 조성물은 근조직 손상 치료에 사용되는 종래의 다른 약물과 병용하여 사용할 수 있다. 종래의 다른 약물과 병용하는 경우, 순차적으로 혹은 동시에 투여될 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 근조직 생성 촉진용 조성물은 본 발명의 목적에 부합하는 범위 내에서 어떠한 일반적인 경로를 통해서도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

실시예

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

파래 분말의 제조

부산 근해에서 채취한 파래를 깨끗한 물에 3 내지 4회 수세하여 염분 및 불순물을 제거하고, 수세, 정선 및 탈수의 과정을 거쳐 동결 건조기로 건조한 후 식품 분쇄기로 분말화하여 파래 분말을 제조하였다.

본 발명의 파래 추출물 제조

3구 플라스크에 5L의 증류수와 파래 분말 200g을 침지시키고 상온에서 4시간 동안 교반하여 추출하였다. 그 후 원심분리(3,000rpm, 4℃, 30분)하여 상층액을 분리하였으며, 상층액의 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 저온에서 24시간 동안 반응시켜 당을 가라앉혔다. 그 후 감압 여과하여 당을 제거한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 원심분리 후 얻어진 잔사를 같은 방법으로 한 번 더 추출하고, 농축시켰다. 농축물을 증류수에 녹이고 암모늄 설페이트를 첨가하여 포화시키는 방법으로 24시간동안 단백질을 침전시켰다. 원심분리(3,000rpm, 4℃, 20분)하여 침전된 단백질만 분리하고, 침전된 단백질 액체에 남아있는 암모늄 설페이트를 제거하기 위하여 투석막을 이용하여 48시간동안 증류수 내에서 교반하였다. 이후 최종적으로 얻은 파래 추출물을 동결 건조하여 분말화 하였다. 도 1은 본 발명에 따른 파래 추출물의 제조 과정을 간략화한 공정도이다.

비교예

파래 증류수 추출물의 제조

본 발명의 파래 추출물과의 세포활성 비교를 위하여 추출 용매로서 증류수만을 사용하여 파래 추출물을 제조하였다. 먼저 3구 플라스크에 5L의 증류수와 파래 분말 200g을 침지시키고 상온에서 4시간 동안 교반하여 추출하였다. 그 후 원심분리(3,000rpm, 4℃, 30분)하여 상층액을 분리하였으며, 얻어진 상층액을 동결 건조하여 분말화 한 후 실험에 사용하였다.

실험예 1. 본 발명의 파래 추출물의 세포 활성 평가

본 발명에 따른 파래 추출물의 근조직 생성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 근아세포(myoblast, skeletal muscle, L6 cell)를 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 분양받아 배양하였다. 실험을 위해 세포는 1X10⁶ cells/well의 수준으로 하여 96 well 플레이트에 배양하였으며, 배지는 10% FBS를 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 플레이트 표면적 60%정도 배양되면, 실시예에서 제조한 파래 추출물이 함유된 serum free DMEM과 파래 증류수 추출물이 함유된 serum free DMEM으로 교체하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 세포활성을 측정하기 위하여 배지를 제거하고 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxiphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS, promega, USA) 용액을 첨가하여 30분간 반응한 뒤 490nm에서 ELISA plate reader 기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 근조직 생성 촉진 정도는 파래 추출물을 처리하지 않은 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하여 백분율로 계산하여 표기하였다. 세포활성을 측정한 결과를 도 2로 나타내었으며, 본 발명의 파래 추출물의 경우 세포의 활성을 촉진시키는 결과가 확인되었으나, 증류수만을 이용하여 추출한 파래 증류수 추출물의 경우 세포의 활성에 영향을 주지 않는 다는 점을 확인하였다.

세포생존율(Cell viability, %) = (추출물 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)X100

실험예 2. 웨스턴 블롯팅을 통한 본 발명 파래 추출물의 근조직 생성 촉진 효능 분석

본 발명의 파래 추출물의 근조직 생성 촉진 효능을 확인하고자 세포성장 촉진인자인 Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)과 그 하위 신호전달에 대한 확인 실험을 진행하였다. Ø100 플래이트에 배양된 근아세포를 RIPA 라이시스 완충액(2μg/ml 펩스타틴, 2g/ml Na₃VO₄, 2μg/ml NaF, 1μg/ml 아프로티닌, 5μg/ml 류펩틴, 10μg/ml 페닐메틸설포닐플루오라이드)속에서 균질화하고 원심분리(12,000rpm, 4℃, 20분)하여 상층액을 회수하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트로 측정하였고, 단백질 양을 50μg/레인으로 동일하게 취하여 5X 시료 완충액과 섞어 수조에서 끓이고 7.5%, 10% 및 12.5% SDS-PAGE 겔에 웨스턴 블롯하였다. 표준 분자량은 이중 색상 마커(dual color marker)를 사용하였고, PVDF 멤브레인(Millipore, USA)으로 전달하였다. 멤브레인은 1% 소혈청알부민(BSA)/TBS-T로 블락(Block)하였고, 1차 항체에서 2시간 동안 상온 반응시키고, TBS-T로 15분간 2회 세척한 후 2차 항체를 1:10,000-5,000 비율로 희석하여 1시간 반응시켰다. 반응시킨 멤브레인을 TBS-T로 15분간 2회 세척한 후, uper Signal West Pico Luminol/Enhancer solution 와 Super Signal West Pico Stable Peroxide solution (Rockford IL, USA)을 사용하여 형광 젤 이미지 분석장치 (Azure biosystems)로 현상한 후 스캔하여 나온 밴드로 단백질 발현 수준을 확인하였다.

본 실험예에서는 IGF-1 경로의 IGF-1R의 인산화와 하위 신호경로 단백질의 발현량을 확인하였으며, 이를 도 3 및 4로 나타내었다. 도 3에서 확인한 바와 같이, 대조군에 비해 파래 추출물 처리군(EL-GP)에서의 IGF-1R 단백질의 인산화가 증가한 것으로 나타났으며 관련된 단백질인 shc, PY99의 발현량이 증가한 것으로 확인되었다. 이는 세포의 대사, 성장 및 분화에 본 발명의 파래 추출물이 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 도 4에서 확인한 바와 같이, IGF로 유도되어져 세포의 증식을 촉진하는 Ras/Raf 단백질의 발현과 MEK, ERK 단백질의 인산화 역시 대조군에 비해 본 발명의 파래 추출물 처리군이 증가하는 것으로 나타났다. 이로부터 본 발명의 파래 추출물이 근조직의 생성 촉진에 관여하는 것으로 판단된다.

Claims (5)

1. 파래 추출물을 포함하는 근감소 또는 근조직 손상 치료용 약학 조성물로서,
   상기 파래 추출물은 1) 파래를 증류수로 추출하는 단계;
   2) 상기 추출물을 원심분리하여 상층액을 분리하는 단계;
   3) 상기 상층액에 2 내지 4배 부피의 에탄올을 가하고 당을 가라앉히는 단계; 및
   4) 가라앉힌 당을 여과하여 제거한 후 여과액을 감압 농축하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것인, 파래 추출물을 포함하는 근감소 또는 근조직 손상 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출 방법은 5) 얻어진 추출물을 증류수에 녹이고 암모늄 설페이트 또는 아세톤을 첨가하여 침전물을 수득하는 것을 더 포함하는 것인 근감소 또는 근조직 손상 치료용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 1) 단계에서의 파래는 파래 분말인 근감소 또는 근조직 손상 치료용 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 3) 단계에서는 에탄올을 상층액의 3배 부피로 사용하는 것인 근감소 또는 근조직 손상 치료용 약학 조성물.
5. 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 배지 조성물로서,
   상기 파래 추출물은 1) 파래를 증류수로 추출하는 단계;
   2) 상기 추출물을 원심분리하여 상층액을 분리하는 단계;
   3) 상기 상층액에 2 내지 4배 부피의 에탄올을 가하고 당을 가라앉히는 단계; 및
   4) 가라앉힌 당을 여과하여 제거한 후 여과액을 감압 농축하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것인, 파래 추출물을 포함하는 근조직 생성 촉진용 배지 조성물.

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