KR102249419B1 - 복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 개선용 조성물 - Google Patents
복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 일실시예는 복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 개선 조성물을 제공한다. 본 발명의 일실시예에서 상기 복분자유는 압착 추출법 또는 초임계 추출법을 통해 착유될 수 있으며, 이렇게 수득한 복분자유를 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부장벽 기능과 밀접한 관련이 있는 치밀이음(tight junction) 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있다.
Description
본 발명은 피부장벽 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 복분자 씨로부터 수득한 복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
복분자(Bokbunja, Rubus coreanus)는 장미과의 낙엽 관목인 복분자딸기 혹은 그 열매를 일컫는다. 중국이 원산지로 알려져 있으며 우리나라에는 제주도 및 남부지역이 주요산지로 알려져 있다. 복분자는 초여름에 검붉은 열매를 수확하여 식용으로 활용하고 있으며 예로부터 한방에서는 강장제, 강정제 및 간을 보호하는 요약으로 귀한 약재로 알려져 왔으며, 신체 허약, 양위, 유정 및 유뇨 등에 실용되는 소재이다[Park, Y. S., Chang, H. G., J. Korean Soc. Agr. Chem. Biotechnol. 46: 367-375, 2003; Heo, J.,Dongyeubogam. Publications on oreiental medicine written]. 복분자에 함유된 성분 중, 줄기에는 epicatechin, catechine, procyanidin B-4가 있다고 알려져 있으며, 잎에는 kaempferol, quercetin, 쿼세틴 3-O-βellagic acid, 및 sanguin H-5 등이 존재한다. 또한 복분자 열매로부터는 퀘세틴 및 페놀 화합물이 존재한다. 또한 미성숙과에도 페놀 화합물로 gallotannin, 엘라기탄닌, gallic acid, 및 2,3-(S)-HHDP-D-글루코피라노사이드가 존재한다. 한편 복분자씨에서 추출한 성분이 공액리놀레산을 비롯한 오메가-3, 오메가-6, ellagitannins, 엘라그산, 팔미트산, 스테아르산 및 올레산 등의 활성 성분을 함유하고 있다는 것이 알려져 있다.
한편, 피부장벽 기능은 노화 및 외부 여러 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 이러한 피부장벽 손상은 결국 피부 수분량 감소와 주름 발생의 원인이 될 수 있다. 이러한 피부장벽과 직접적 관련이 있는 것이 바로 치밀이음(tight junction, TJ)이다. 치밀이음은 두 개 이상의 세포 간 부착을 연계하고, 세포외기질을 통해 물질수송을 조절하는 다중 단백질 복합체(multiprotein complexes)로 Occludin, Claudin 등이 알려져 있다. 치밀이음 관련 단백질들은 세포막 사이에 transmembrane domain을 가지고 있어 세포막 내에 강하게 박혀있으면서, Zona occludens-1(ZO-1), ZO-2, Cingulin 등과 actin cytoskeleton과 결합하고 다양한 신호 전달 단백질과의 상호작용 등을 하며, 이를 통해 세포 간의 부착(adhesion), 수분 및 이온 등의 물질 이동을 조절하는 물리적 장벽기능(barrier function)을 가진다. 이러한 피부세포의 장벽기능은 피부 표면의 약산성(pH 5.5) 유지와 각질층 내 항균 펩타이드 등에 직접 관여하며 바이러스나 박테리아와 같은 외부 침입을 막고 각질세포 분열과 분화를 조절하는 등 정상적 피부 보호 및 유지에 중요한 역할을 수행한다고 할 수 있다.
일반적으로 복분자 열매에서 추출된 성분들이 항암, 항우울제 치료에 사용되는 약학 조성물이 보고 되었거나 복분자씨에서 추출된 성분이 혈행개선이나 통풍치료에 효과가 있다는 선행문헌은 있었으나, 복분자씨에서 추출된 기름, 즉 복분자유가 피부장벽 기능을 개선하는데 효과가 있다고 시사하고 있지는 아니하다. 이에 본 발명자는 지속적인 연구를 통해 복분자유가 피부장벽 기능 개선에 효과를 가지고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 피부장벽 기능을 개선하기 위한 조성물을 제공하는 것이고, 구체적으로는 복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 강화용 조성물을 제공하는 것이며, 이러한 조성물은 피부장벽 기능을 개선하는 화장료 조성물, 건강기능 식품, 치밀이음 형성 촉진 조성물 및 피부보습제를 위한 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 실시예는 복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 조성물은 치밀이음(Tight junction) 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 치밀이음 단백질은 클라우딘-1(claudin-1), 클라우딘-4(claudin-4), 클라우딘-23(claudin-23) 및 오클루딘(occludin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 복분자유는,
복분자 열매로부터 복분자박을 수득하는 단계;
상기 수득된 복분자박을 열풍건조하여 진동 체로 필터링 후 원심분리기로 복분자씨를 분리하는 단계;
상기 분리된 복분자씨를 상온에서 자연건조시키는 단계;
상기 자연건조된 복분자씨를 착유하여 복분자유를 수득하는 단계; 및
상기 착유된 복분자유를 원심분리하여 여과하는 단계;
를 통해 추출될 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 열풍건조는 20 내지 35℃에서 50 내지 65시간동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 진동 체는 다수의 원형 기공을 가지며, 각 기공의 직경은 0.03 내지 0.5mm일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 복분자씨를 분리하는 단계에서 원심분리는 15 내지 25분동안 1000 내지 3500rpm으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 자연건조는 2 내지 3일동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 자연건조시키는 단계 이후에, 복분자씨를 로스팅하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 로스팅은 100 내지 180℃에서 1 내지 3분동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 착유는 압착 추출법 또는 초임계 추출법으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 압착 추출법은 추출압력 500 내지 700kg/cm2, 추출온도20 내지 40℃에서 10 내지 50분동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 초임계 추출법은 초임계 유체로서 액체 이산환탄소를 사용하고, 추출압력 180 내지 250 bar, 추출온도 20 내지 50℃ 상태에서 10 내지 100분동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 복분자유를 원심분리하는 것은 9000 내지 13000rpm에서 0.5 내지 2분동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 복분자유는 전체 조성물 100 중량부에서 0.1 내지 3 중량부일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 개선 조성물은 피부장벽 기능을 회복시킬 수 있고 피부 염증을 억제하는 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 히스타민(Histamine)을 HaCaT 세포에 넣어준 상태에서, 복분자유의 농도에 따른 처리시, 피부장벽 기능과 관련된 Claudin-1 및 Occludin의 mRNA발현량을 나타내는 그래프이다.
도2는 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 복분자유를 농도별로 처리했을 때의 세포독성실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도3은 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 히스타민 넣어준 후, 복분자유로 처리했을 때 Filaggrin, Keratin-1 및 Loricrin의 mRNA발현량을 나타내는 그래프이다.
도4는 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 히스타민 넣어준 후, 복분자유로 처리했을 때 Claudin-4, Claudin-23 및 Des-1의 mRNA발현량을 나타내는 그래프이다.
도5는 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 히스타민 넣어준 후, 복분자유로 처리했을 때 세포배양 시간에 따른 3D배양 결과값(mRNA발현량)을 나타내는 그래프이다.
도6은 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 복분자유의 세포독성에 대한 IC50결과값을 나타내는 그래프이다.
도7은 본 발명의 실시예에 따른 복분자유의 초임계 추출에 관한 공정도이다.
도2는 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 복분자유를 농도별로 처리했을 때의 세포독성실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도3은 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 히스타민 넣어준 후, 복분자유로 처리했을 때 Filaggrin, Keratin-1 및 Loricrin의 mRNA발현량을 나타내는 그래프이다.
도4는 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 히스타민 넣어준 후, 복분자유로 처리했을 때 Claudin-4, Claudin-23 및 Des-1의 mRNA발현량을 나타내는 그래프이다.
도5는 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 히스타민 넣어준 후, 복분자유로 처리했을 때 세포배양 시간에 따른 3D배양 결과값(mRNA발현량)을 나타내는 그래프이다.
도6은 인체 각질세포 Primary keratinocyte에 복분자유의 세포독성에 대한 IC50결과값을 나타내는 그래프이다.
도7은 본 발명의 실시예에 따른 복분자유의 초임계 추출에 관한 공정도이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일측면에 따르면, 피부장벽 기능 개선용 조성물은 복분자유를 유효성분으로 함유할 수 있다. 상기 피부장벽 기능은 치밀이음(Tight junction) 단백질과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다. 본 발명의 일실시예에 따르며, 상기 조성물은 치밀이음 단백질의 발현을 증가시킬 수 있으며, 구체적으로 상기 치밀이음 단백질은 클라우딘-1(claudin-1), 클라우딘-4(claudin-4), 클라우딘-23(claudin-23) 및 오클루딘(occludin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 클라우딘-1, 클라우딘-4 및 클라우딘-23은 클라우딘(claudin)단백질의 24가지 유형 중의 일부이다. 상기 클라우딘 단백질은 치밀이음(tight junction)단백질 중 가장 중요한 단백질 중 하나로서 많은 유기생물에서 발견되는 transmembrane 단백질이며, 상기 클라우딘-1의 경우, 다른 클라우딘 단백질 유형인 클라우딘-3 및 클라우딘-5과 상호작용을 할 수 있다. 상기 오클루딘은 상기 클라우딘 단백질과 마찬가지로 치밀이음 단백질 중 가장 중요한 단백질 중 하나로서, 치밀이음의 안정성(stability) 및 장벽기능을 유지시켜줄 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 상기 치밀이음 단백질이외에도 필라그린(filaggrin), 케라틴-1(keratin-1), Des-1 및 로리크린(loricrin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 필라그린(filaggrin)은 상피세포에 있는 케라틴(keratin) 섬유에 결합하는 필라멘트 관련 단백질로서, 상피 항상성을 유지할 수 있으며 피부장벽 기능을 유지시켜 줄 수 있다. 또한, 상기 필라그린은 피부의 생리학적 산성 pH를 유지시켜줄 있다.
상기 케라틴-1은 케라틴 종류 중 하나로서, 피부의 바깥층에 있는 케라티노사이트에서 생산되는 단백질이며, 다른 케라틴인 케라틴-9 또는 케라틴-10과 함께 케라틴 중간체 필라멘트(keratin intermediate filament)를 구성할 수 있다. 또한, 상기 케라틴-1은 피부 무결성(integrity)을 유지시켜줄 수 있다.
상기 Des-1은 근육 특이적 class3 중간섬유(intermediate filament)단백질을 의미하며, 근원섬유 및 세포막을 연결하는 세포질내 필라멘트 네트워크를 형성할 수 있으며 근육의 구조 및 기능에 필수적인 역할을 할 수 있다.
상기 로리크린은 각질화된 세포 외피를 구성하는 주요 단백질 중 하나로서, 상기 각질화된 세포 외피는 상피에서 발견된다. 그리고 상기 로리크린은 피부 각질층의 장벽 기능을 유지시켜 줄 수 있으며, 경구 점막하 섬유증 또는 백반증 검사의 초기단계 마커로서 역할을 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 복분자유는 복분자 열매로부터 복분자박을 수득하는 단계; 상기 수득된 복분자박을 열풍건조하여 진동 체로 필터링 후 원심분리기로 복분자씨를 분리하는 단계; 상기 분리된 복분자씨를 상온에서 자연건조시키는 단계; 상기 자연건조된 복분자씨를 착유하여 복분자유를 수득하는 단계; 및 상기 착유된 복분자유를 원심분리하여 여과하는 단계를 통해 추출될 수 있다.
상기 복분자박은 복분자의 주스 착즙 후 부산물로서, 본 발명의 일실시예에 따르면 복분자 열매를 그대로 이용해서 복분자유를 수득하는 것이 아니라 먼저 복분자 열매에서 복분자박을 수득한 후에 여기에 포함된 복분자씨를 이용할 수 있다.
상기 열풍건조는 열풍을 이용해서 건조하는 방식으로 물체에 뜨거운 열기를 통과시켜서 건조하는 방식을 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 열풍건조는 20 내지 35℃에서 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로는 20 내지 30℃, 20 내지 27℃, 또는 20 내지 25℃에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 22 내지 25℃에서 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 24℃에서 이루어질 수 있다. 또한 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 열풍건조는 50 내지 65시간동안 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로는 50 내지 60시간, 50 내지 58시간, 또는 50 내지 55시간동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 52시간동안 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 51시간동안 이루어질 수 있다.
상기 진동 체는 진동을 가함으로써 열풍건조된 복분자박을 걸러내는 체를 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 진동체는 다수의 원형 기공을 가지며, 각 기공의 직경은 0.03 내지 0.5mm일 수 있다. 상기 직경은 열풍건조된 복분자박 및 복분자씨의 크기를 고려한 것으로서, 보다 구체적으로 상기 직경은 0.03 내지 0.4mm, 0.03 내지 0.1mm, 또는 0.03 내지 0.3mm일 수 있다. 바람직하게 상기 직경은 0.05 내지 0.1mm일 수 있다. 가장 바람직하게는 0.07mm일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 복분자씨를 분리하는 단계에서 원심분리는 1000 내지 3500rpm으로 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로 상기 원심분리는 1500 내지 3500rpm 또는 1500 내지 3000 rpm에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 2000 내지 3000 rpm에서 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 2500rpm에서 이루어질 수 있다. 또한 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 복분자씨를 분리하는 단계에서 원심분리는 15 내지 25분동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 18 내지 21분동안 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 20분동안 이루어질 수 있다.
상기 자연건조는 인위적인 열이나 물리/화학적인 방법을 사용하지 않고 건조시키는 방법을 의미하는 것으로서, 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 자연건조는 2 내지 3일동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 3일동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 자연건조시키는 단계 이후에, 복분자씨를 로스팅하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 로스팅은 복분자씨에 열을 가해서 굽는 것을 의미하며, 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 로스팅은 100 내지 180℃에서 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 로스팅은 100 내지 170℃, 110 내지 170℃, 또는 120 내지 170℃에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 120 내지 160℃에서 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 150℃에서 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 로스팅은 1 내지 3분동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 2분동안 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 1분 30초동안 이루어질 수 있다.
상기 착유는 압착 추출법 또는 초임계 추출법으로 이루어질 수 있다. 상기 압착 추출법은 복분자씨에 압력을 가해서 복분자유를 추출하는 방법으로서, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 압착 추출법은 추출압력 500 내지 700kg/cm2에서 이루어질 수 있으며 바람직하게는 추출압력 550 내지 600 kg/cm2에서 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 570 kg/cm2에서 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면 상기 압착 추출법은 추출온도20 내지 40℃에서 이루어질 수 있으며 바람직하게는 25내지 40℃, 더욱 바람직하게는 25 내지 35℃에서 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 30℃에서 이루어질 수 있다.
상기 초임계 추출법은 액체나 기체와 다른 초임계 유체의 특성을 이용하여 추출하는 방법을 의미하는 것으로서, 낮은 온도에서 행해지므로 열에 불안정한 유지의 취급이나 추출에 용이하고, 무독한 추출용매를 사용해 잔류 없이 추출할 수 있고, 초임계유체의 용해력을 조절해 특정한 성분을 선택적으로 추출할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 초임계 유체는 이산화탄소일 수 있으며, 추출압력은 180 내지 250 bar일 수 있고, 보다 구체적으로 190 내지 250 bar, 200 내지 240 bar, 또는 210 내지 230 bar일 수 있다. 바람직하게는 220 bar일 수 있다.
그리고 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 초임계 추출법의 추출온도는 20 내지 50℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 30 내지 50℃일 수 있고 바람직하게는 30 내지 45℃일 수 있다. 가장 바람직하게는 40℃일 수 있다.
본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 상기 초임계 추출법의 추출시간은 10 내지 100분동안 이루어질 수 있고 바람직하게는 20 내지 60분일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30 내지 50분일 수 있다. 가장 바람직하게는 40분일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 복분자유를 원심분리하는 것은 9000 내지 13000rpm에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 10000 내지 13000rpm에서 이루어질 수 있고, 더욱 바람직하게는 10000 내지 12000rpm에서 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 11000rpm에서 이루어질 수 있다. 또한 본 발명의 다른 일실시예에 있어서, 상기 복분자유를 원심분리하는 것은 0.5 내지 2분동안 이루어질 수 있고, 바람직하게는 0.7 내지 1.5분동안 이루어질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.9 내지 1.2분동안 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 1분동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 복분자유는 전체 조성물 100 중량부에서 0.1 내지 3 중량부일 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.1 내지 2.5중량부, 0.3 내지 2중량부, 0.5 내지 1.5중량부 또는 0.7 내지 1.2중량부일 수 있다. 가장 바람직하게는 1.1중량부일 수 있다. 만약 상기 복분자유가 3 중량부를 초과하게 되면 세포에 독성을 가하게 되어 오히려 피부장벽 기능을 떨어뜨리고 0.1 중량부 미만이면 피부장벽 기능에 별다른 영향을 미치지 않는다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예1: 복분자유 제조(압착 추출법)
-20℃에서 냉동보관된 복분자 열매를 착즙하여 남은 부산물인 복분자박을 수득하였다. 이렇게 얻은 복분자 박을 24℃에서 52시간동안 열풍건조를 시킨 뒤에, 직경 0.07mm의 기공을 가진 진동 체에 걸러서 원심분리기에 넣고 20분동안 2500rpm으로 원심분리시켜서 복분자 씨를 분리해냈다. 이후 분리된 복분자 씨를 3일동안 자연건조를 시킨 뒤 약 140℃에서 2분동안 로스팅을 했다. 이렇게 로스팅된 복분자 씨를 30℃, 600kg/cm2으로 압착하여 복분자유를 추출해냈다. 이렇게 착유된 복분자유를 다시 11000rpm에서 1분동안 원심분리를 시켜서 여과시켰다.
실시예2: 복분자유 제조(초임계 추출법)
상기 실시예1과 복분자씨를 분리하여 자연건조시키는 과정까지는 동일했다. 자연건조된 복분자씨는 로스팅 단계를 거치는 경우와 로스팅 단계를 생략하는 단계 모두 가능했다. 로스팅 단계를 거치는 경우는 상기 실시예1과 동일한 조건으로 로스팅을 실시한 이후에 초임계 추출 과정을 수행했고, 로스팅 단계를 생략하는 경우 자연건조 이후 바로 초임계 추출 과정을 수행했다. 초임계 추출 과정은 도7의 공정을 따라 수행되었으며, 이를 요약하면 초임계 유체로서 이산화탄소가 사용되었다. 먼저 상기 자연건조된 복분자씨를 추출기에 넣은 뒤에 온도 40℃ 및 압력 220bar로 추출시간 40분으로 추출하였다. 그런 다음 복분자유가 포함된 이산화탄소 액체는 압력조절밸브로 20bar로 압력을 낮춰서 온도 -19℃의 2종류 phase의 이산화탄소로 되며 가열기로 가열시키면 증기로 날라가서 추출된 복분자유는 분리기에 남게 되었다. 이렇게 남은 복분자유를 회수했다. 이렇게 추출된 복분자유는 실시예1에서와 같이 원심분리를 통해 여과를 시켰다.
실시예3: RNA 추출 및 quantitative real-time PCR
전체 RNA가 트리졸(Trizol)로 분리되었고, 클로로포름 추출법 및 이소프로판올 침전법(isopropanol precipitation)으로 정제되었다. cDNA는 SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 정제된 RNA샘플 2 μg으로부터 합성되었다. 첫 단계로, 5 μM Oligo(dT)20 및 1mM 표시되지 않은(unlabled) deoxynucleotides (dNTPs) 혼합물이 2 μg의 전체 RNA에 첨가되었고, 65°C에서 5분동안 반응시켰다(annealing). 그리고 나서, 10 U Superscript II reverse transcriptase가 1X RT buffer, 20 mM KCl, 5 mM MgCl2, 및 2U RNaseOUTTMat존재하에, 50°C에서 50분동안 첨가되었다. 마지막으로, 반응혼합물은 85°C 에서 5분동안 종료되었다. 모든 cDNA 샘플은 -20°C에서 보관되었고, 실시간 PCR의 템플릿으로 사용하기 전에 DEPC와 1:50으로 희석시켰다.
StepOne Plus System (Applied Biosystems)의 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 프로토콜을 사용하는 실시간 PCR을 위해, 첫번째 DNA가닥이 목표 유전자 프라이머로 생성되었다. 데이터 분석은 2-ΔΔCt 방법으로 수행되었고 실험을 총 3번 반복되었다.
도 3 은 본 발명에 따른 복분자유로 인해 피부 장벽과 관련된 단백질인 Filaggrin, Keratin-1 및 Loricrin의 mRNA발현량 결과값을 나타낸 것이고, 도1 및 도4는 복분자유에 의한 피부 각질 형성세포의 치밀이음 관련 유전자인 Claudin mRNA 발현량을 측정한 결과이다. 도 1및 도 4를 참조하면, Claudin 1, Claudin 4, Claudin 23 및 Occludin은 히스타민으로 손상된 피부장벽 관련 단백질 발현량이 본 본 발명에 따른 복분자유 처리 이후 증가되는 것을 확인하였다. 이외에 도4에는 Des-1d의 mRNA발현량 결과값도 나타내었고 그 발현량도 상기 Claudin단백질들 처럼 본 발명에 따른 복분자유 처리이후 증가되는 것을 확인하였다. 참고로, DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 화장용 허가용 조성물 범위내 사용될 수 있는 소염제이다.
실시예4: 세포독성실험
세포 독성 측정을 위한 세포의 생존율 측정은 CCK-8 kit를 이용하였다. 배양된 세포에 실험하고자 하는 복분자 정유 시료를 각 농도별로 희석 시켜 24시간 동안 적용시켰다. 정유 시료를 적용 후, 각각의 well에 CCK-8 Kit (Dojindo Molecular Technology Inc., Tokyo, Japan)의 반응액을 supplement가 제외된 배지에 1/10로 희석하고, 이를 각 well당 100μl씩 처리하여 37℃ 배양기에 넣고 1시간 후에 ELISA microplate reader(SoftMax Pro5, Molecular Devices, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도2 및 도6에 나타내었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (14)
- 복분자유를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물로서,
상기 조성물은 치밀이음(Tight junction) 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하고,
상기 치밀이음 단백질은 클라우딘-1(claudin-1), 클라우딘-4(claudin-4), 클라우딘-23(claudin-23) 및 오클루딘(occludin)인 것을 특징으로 하며,
상기 조성물은 Des-1 또는 로리크린(loricrin)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 복분자유는,
복분자 열매로부터 복분자박을 수득하는 단계;
상기 수득된 복분자박을 열풍건조하여 진동 체로 필터링 후 원심분리기로 복분자씨를 분리하는 단계;
상기 분리된 복분자씨를 상온에서 자연건조시키는 단계;
상기 자연건조된 복분자씨를 착유하여 복분자유를 수득하는 단계; 및
상기 착유된 복분자유를 원심분리하여 여과하는 단계;
를 통해 추출되는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 열풍건조는 20 내지 35℃에서 50 내지 65시간동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 진동 체는 다수의 원형 기공을 가지며, 각 기공의 직경은 0.03 내지 0.5mm인 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 복분자씨를 분리하는 단계에서 원심분리는 15 내지 25분동안 1000 내지 3500rpm으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 자연건조는 2 내지 3일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 자연건조시키는 단계 이후에, 복분자씨를 로스팅하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하고,
상기 로스팅은 100 내지 180℃에서 1 내지 3분동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 착유는 압착 추출법 또는 초임계 추출법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 압착 추출법은 추출압력 500 내지 700kg/cm2, 추출온도20 내지 40℃에서 10 내지 50분동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 초임계 추출법은 초임계 유체로서 액체 이산환탄소를 사용하고, 추출압력 180 내지 250 bar, 추출온도 20 내지 50℃ 상태에서 10 내지 100분동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 복분자유를 원심분리하는 것은 9000 내지 13000rpm에서 0.5 내지 2분동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 복분자유는 전체 조성물 100 중량%에서 0.1 내지 3 중량%인 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 개선용 화장료 조성물.
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