JP4422573B2 - 霍山デンドロビーコーリイス抽出物及びその調製方法 - Google Patents
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本発明は網膜黒色素上皮（retinal pigment epithelium；ＲＰＥ）調製制御する細胞作用を有する抽出物及びその製造プロセスに関し、特に、霍山デンドロビーコーリイス抽出物及びその製造プロセスに関する。
目前民間で最も高貴な眼科用中国薬草はデンドロビーコーリイス（Dendrobii Caulis）であり、このデンドロビーコーリイスは蘭利植物に属し、その薬用部位は茎である。甘味な味わいがあるとともにやや塩辛くできている。ある一部の中国薬物写本にはデンドロビューム種類が例えばだ液分泌障害、胃病、及び眼科障害の病気の治療に効果あることが開示されている。我々の前の研究調査の経験によればデンドロビーコーリイスは最も薬効のあるものである。
ＲＰＥ細胞は網膜の最外層に位置し、ブルチ氏膜（Bruch’s membrance）とフォトリセプタとの間に配列して一個の単層細胞(1) を形成している。ＲＰＥ細胞の頂端の長軟毛状突起（villous processes）はフォトリセプタの外段と互いに接触し、その底端には多くのブルチ氏膜を透過して脈絡膜と緊密に連接したベイサル インホルディングがある。これは効果的に脈絡膜及び網膜神経層の有毒物質及び代謝物を清除又は輸送するので、ＲＰＥ細胞も非常に重要な網膜血管バリア（blood-retinal barrier）を構成する。
他にＲＰＥも光線を吸収する機能を有する外に、呑噬桿状細胞及び錐状細胞が光線の刺激を受けて脱落した外節（rod outer segments；ＲＯＳ）、呑噬体（phagosome）の分解、細胞外基質（extracellular matrix）とメラニンとの合成、フォトリセプタの外段の再生時に必要な物質の提供、ビタミンＡの貯存と運送、ロードプシンの合成、網膜の接着力…等の作用と関連する。統計によれば、ラットの一個ＲＰＥ細胞は一日に２５，０００個の桿状細胞及び錐状細胞が光線の刺激を受けて脱落した外節を清除しなければならない。これはこのように頻繁な呑噬機能の重要性を物語るものである(2) 。ＲＰＥ細胞の正常な呑食作用は網膜中のフォトリセプタの健康の維持に対して頗る大きな関連性を有するので、一旦呑食機能が低下すると、フォトリセプタの退化（degeneration）を来す(3) 。それはＲＰＥ細胞は年齢の増加に従って死亡又は他所に遊離するので、たとえ老化したＲＰＥ細胞がなお呑噬能力を有するとしても、その消化吸収（digestion）の能力はもう明らかに低下している(4) 。１９９５年Panda-Jonas等の人達は既に人のフォトリセプタは年毎に０．２−０．４％損失すると共に、桿状細胞の損失は錐状細胞損失よりも多いと指摘している(5) 。これは老年人の視力減退及び病気の発生を来すので、ＲＰＥ細胞機能の維持は視覚系統に対してすこぶる重要である。
また、ニトリックオキサイド（ＮＯ）は性質が不安定で半衰期が僅数秒しかない小分子ガス(6) であるが、多種の生理機能を有している。このニトリックオキサイド（ＮＯ）は電気中性であるので自由に細胞膜を透過して進出することが出来る(7) 。他方、ニトリックオキサイドはアンペアドエレクトロンを有しているので、フリーラジカルに類似して高度の反応力を有し、一旦形成すると迅速に細胞膜を通過して作用を生ずる(8) 。免疫系統においては、ニトリックオキサイドは細胞毒性を防禦及び制御する役目を果す。そして血管系統においては、ニトリックオキサイドはいわゆる内皮細胞弛緩因子（ＥＤＲＦ）であり、中枢神経系統において神経伝導物質（Neurotransmitter）(7) として作用する。
ニトリックオキサイドはニトリックオキサイドシンターゼ（nitric oxide synthase；ＮＯＳ）において、Ｌ−アルギニンをＬ−シトルリンに転変する過程中で釈放されるが、目前に至るまで、詳細なるニトリックオキサイド合成機制はまだ完全に明白に知られていない。ニトリックオキサイドシンターゼには３種の異構体（isoforms）があり、その中neuronal ＮＯＳ及びendothelial ＮＯＳは基本型でありｃＮＯＳと略称する。その活性としてカルシウムイオンＣａ++及びカルモジュリン（calmodulin）の調節を受けて発生するニトリックオキサイドはｎＭ（１０-9Ｍ）グレードに属する。第３種はimmunologic ＮＯＳであって可誘導型（inducible form）に属しｉＮＯＳと略称する。しかしながらその活性はＣａ++及びカルモジュリンの調節を受けず、発生したニトリックオキサイドはｍＭ（１０-6Ｍ）グレードに属する。その中、ｃＮＯＳ及びｉＮＯＳのジーンは不同染色体上に位置する（人類ならば、endothelial on chromosome７，Neuronal on chromosome１２，ｉＮＯＳ on chromosome１７）(8,9)。
現在既に網膜中の網膜神経細胞（retinal neuron）、ＲＰＥ細胞、無軸突細胞及び神経節細胞（amacrine and ganglion cells）、粘質細胞（Muller cells）等、いずれもニトリックオキサイドシンターゼ（ＮＯＳ）の存在があることを発見した。かつ現在に至るまで、既にニトリックオキサイドが生理及び病理状態においていずれも重要な役割を演ずると共に目の機能関係と密接であることが裏付けられた(10)。１９９４年、Kurenny等の人達はニトリックオキサイドはフォトリセプタ上のvoltage-gated ion channelの機能を有していることを指摘した。したがって、ニトリックオキサイドは光線情報の伝送と関連する可能性があることが推測された(11)。１９９３年、Deussen等の人達は基礎環境（basal condition）又は局所貧血（ischemia）下においてニトリックオキサイドは網膜血流量の制御能力を有することを発見した(12)。Tilton等の人達もニトリックオキサイドは糖尿病により引起された網膜内血管の受けた損失の程度を調節するのが可能であることを指摘した(13)。そして１９９４年、Goureau等の人達は網膜神経膠質細胞（retinal glial cells）及び網膜色素上皮細胞がＬＰＳ，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−αの刺激を受けるとニトリックオキサイドシンサターゼの表現を促進し、ひいてはニトリックオキサイドを大量生産すると指摘している。これから分るように、ニトリックオキサイドは網膜が発炎又は感染を受けた場合は、防禦、保護の役目を果すことができる(14)。しかしながら、目前に至るまで、ｃＮＯＳの視覚リセプタにおける位置及び特性はまだいささか明白でない所があり、ある文献では視覚リセプタ本体にはｃＮＯＳ活性があると指摘しているが、他の文献では視覚リセプタ外段にこそｃＮＯＳ活性があり、ニトリックオキサイドを生ずることにより光線の伝導、神経突触の信号伝送、生理状態下又は欠血状態下における網膜の血流量等を調節することが出来る(10)。ｉＮＯＳの活性も網膜のある細胞中に表現されており、例えばＲＰＥ細胞及び粘質細胞等では、文献に培養牛の網膜色素上皮細胞において、もしＩＦＮ−γ，ＬＰＳ，ＴＮＦ−αの刺激後約１２ｈｒ経過すれば大量なニトリックオキサイドを生ずると共に、少くとも９６ｈｒ持続すると指摘している(15)。細胞激素（cytokines）のＲＰＥ細胞のｉＮＯＳ活性上における影響はすこぶる複雑であり、例えばbovine ＲＰＥにあっては、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αの刺激が需要であり、この刺激があってから大量のニトリックオキサイドを生ずることが出来る。そしてｂＦＧＦはＮＯＳを抑制する作用を有し、ＴＧＦ−βはいくらかの促進作用を有している(18)。また人類ＲＰＥ細胞にあっては、必ずInterleukin−１βの刺激があってから始めて大量のＮＯを生ずることができ、ＬＰＳは影響がなく、ＴＧＦ−βは明らかにニトリックオキサイドを生ずることを抑制することができる。
細菌の感染を受けた場合、ｉＮＯＳの表現はその釈放されたニトリックオキサイドが侵入した微生物を殺菌することで有利であるが、その反面、ある状況下ではニトリックオキサイドを余り多量に生ずると却って自体免疫病（autoimmune disease）又は敗血性ショックを招いてしまう。１９９４年、Tilton等の人達はニトリックオキサイドが眼底の発炎反応と関係があることを説明するための第１の証拠を提出したが、本出願人はｉＮＯＳ inhibitorが内毒素（endotoxin）により引起された葡萄膜炎を阻断できることを発見した(18)。Goureau等の人達はＩＦＮ−γ及びＬＰＳで処理して大量のニトリックオキサイドを発生させるが、この作用はａＦＧＦ，ｂＦＧＦに抑制されると指摘し、かつ、ｉＮＯＳにおける表現であってｉＮＯＳ ｍＲＮＡの安定性を抑制するのでないと指摘したので、本出願人はＦＧＦは内毒素又は細胞激素（cytokines）により引起された傷害を免れるように保護できるものであると推測した(19)。他に１９９４年、Becguet等の人達の研究において、牛のＲＰＥ細胞を培養した時ＳＩＮ−１（ＮＯの供給者とする）を添加又は細胞激素を利用し細胞を刺激して大量なニトリックオキサイドを発生させると、ＲＰＥ細胞の呑食活性が抑制され、このような作用はニトリックオキサイドスカンベンジャ（例えばhemoglobulin）又はＬ−アルギニン類似物により回復され、かつ、ｃＧＭＰと関連しないと指摘した。これから分るように、ｉＮＯＳは網膜においても免疫調節の役目を果している。
よく見られる網膜変性は糖尿病により引起された網膜血管新生（proliferative diabetic retinopathy）、増殖性網膜変性（proliferative vitreoretinopathy）及び老年性黄斑部変性（Aged-macular degeneration）等があり(20)、そして網膜変性はあらゆる眼科病気において最も治療しにくいものである。高血糖（hyperglycemia）が糖化作用（glycation）の発生を加速して高度糖化最終生成物（advanced glycation end products；ＡＧＥｓ）を生ずることは、ずっと糖尿病後期に引起された各種の血管、神経併発症と密接に関連していると認定されている(21-25)。ＡＧＥは還元糖（reducing sugar）のアルデヒド基又はケトン基と蛋白質のプライマリーアミノ酸とが、非酵素の作用を経由して不安定なシッフ塩基（schiff base）を生じ、更にアマドリ転位（Amadori rearrangement）によりアマドリ生成物を生じるように形成されている(26)。既知の非酵素作用は非可逆反応であって大抵半衰期の長い蛋白質上に発生しているので(27)、ＡＧＥの形成により蛋白質架橋（cross-linking）を来たした後、蛋白質を蛋白酵素（protease）に対して抗性を発生させるので、ＡＧＥの累積は老化の標記である(28,29)。年齢の増加に従って脳部の錐状神経・ブルチ氏膜（Bruch’s membrane）、コラーゲン中のＡＧＥの含有量も上昇する。非酵素糖化作用の速率は初級反応を呈し、反応速率は還元糖及び蛋白質の濃度により決定される。糖尿病患者の血糖濃度は一般健康人に比べて高いので、もっと糖化作用の発生を加速する。糖尿病が動脈粥状硬化を加速し、腎臓を損傷し(25)、血管を傷み、神経が変質(26)し、網膜変性及び糖尿病患者健康者よりも中風にかかり易いのは(30)いずれもＡＧＥと直接的に関連する(26,28,29)。糖尿病が赤血球の集合を来すのは、主としてアルブミンが糖化された後第３の構造改変を来すことにより抗集合（anti-aggregation）の機能が喪失することにある(22)。なお研究によれば、糖尿病が腎臓糸球体疎通性の改変を誘発するのはアルブミンが糖化したからであっ
て、腎臓糸球体基膜（glomerular basement membrane）の糖化ではない(23)。Poduslo等の人達も１９９４年に、糖化した蛋白質はその疎通血脳バリア（blood brain barrier）の能力を増加すると指摘した。
て、腎臓糸球体基膜（glomerular basement membrane）の糖化ではない(23)。Poduslo等の人達も１９９４年に、糖化した蛋白質はその疎通血脳バリア（blood brain barrier）の能力を増加すると指摘した。
ＡＧＥで細胞表面上のいくらかのリセプタ、蛋白質と結合できるものとして、目前既にスカベンジャリセプタ第１型及び第２型、ＡＧＥのリセプタ（ＲＡＧＥ，the receptor for ＡＧＥ），ＯＳＴ−４８（ＡＧＥ−Ｒ１），８０Ｋ−Ｈ phosphoprotein（ＡＧＥ−Ｒ２）及びgalectin−３（ＡＧＥ−Ｒ３）が知られている(32)。また、モノサイト、マクロ食細胞、内皮細胞、神経膠細胞…等にはいずれもＡＧＥリセプタが発見されている。そして細胞がＡＧＥに活性化されると、常に細胞外基質蛋白質（extracellular matrix protein）、血管付着分（Vascular adhesion molecules）、及び生長因子（growth factor）表現量を増加させ、不同の細胞種類及び情報伝達に従って、走化性（chemotaxis）、血管新生（angiogenesis）、酸化圧力、細胞増性、細胞プログラム死亡（programmed cell death）を伴う(34)。既に、人類脳部の各種細胞表現が不同一の高度糖化終産物リセプタはＡＧＥを清除することが出来るが、この能力が喪失すると、細胞外ＡＧＥの累積を来し、中枢神経系統の発炎反応を誘発することが知られている。ＡＧＥはＲＰＥ細胞の網膜血管内皮細胞生長因子（retinal vascular endothelial growth factor）(21)、及びＰＤＧＦ−β（３４）の表現量を増加させることができる。このＡＧＥは老化過程において重要な役割を演ずるので、われわれは糖化アルブミンで一個の病理モデルとして新しい研究と探索が行えることを希望している。
ＨＧＦ／ＳＦ（Hepatocyte growth factor）は肝臓でもっとも重要な生長因子であり、６０ＫＤａの重連鎖（α chain）及び３０ＫＤａの軽連鎖（β chain）をジスルフィド結合で連接することにより構成されている。体内で合成したばかりのＨＧＦ／ＳＦはprepro ＨＧＦ／ＳＦであって、酵素を介して改修した後異双形式（heterodimeric form）に形成してから始めて生物活性を有する。ＨＧＦは多機能の生長因子であり、組織修理及び器官再生において重要な役割を演ずる。ＨＧＦは体内における分布が十分に広く、その中肝臓の産量が最大であり、次に、膵臓、胸線、血液、小腸、胎盤…等に見られる(35)。１９９６年、眼の組織、例えば涙液、涙線、及び角膜中にＨＧＦ／ＳＦ又はＨＧＦ／ＳＦリセプタの存在が発見され、これによりＨＧＦ／ＳＦには眼内に調節制御の役を演ずる特徴があることが認められた(36)。１９９８年Ｈｅ等の人達は更に網膜色素上皮細胞には同時にＨＧＦ及びＨＧＦリセプタ（ｃ−Ｍｅｔ）を有しているばかりでなく、ｃ−Ｍｅｔのチロシン加燐酸化反応もずっと持続して表現しているので、ＨＧＦの網膜色素上皮細胞に対して言えば、一個自体作用（self-stimulation function）の生長因子であり、かつ、網膜発育(37)、傷口治癒及び網膜血管新生と関連する(38)。上記の内容から分るように、ＲＰＥの促進又は抑制を問わず、細胞活性の影響因子はいずれも目前すぐ了解及び突破しなければならない分野である。
要するに、ＲＰＥ細胞は網膜発育及びその関連する調節制御上非常に重要な役割を演じているので、間接的にＲＰＥ細胞と関連する機制を把握制御するために如何にＲＰＥ細胞の活性を調節制御するかは既に今日の関連研究の重要課題となっている。
したがって、本出願人は上記先行技術の欠点に鑑み、鋭意試験と研究とを重ねた結果、ついに本発明の「霍山デンドロビー抽出物及びその調製方法」を案出した。
本発明の目的は、水溶性有機溶剤又は該水溶性有機溶剤と水との混合物によりデンドロビーコーリイス植物を抽出した、生理活性を有する霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物を提供することにある。
上記アイディアによれば、該水溶性有機溶剤は含炭素数が１〜８に介するアルコール類、アルキル類又はエステル類である。
上記アイディアによればその中のアルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによればその中のアルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによれば、該抽出物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該抽出物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該抽出物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
また、本発明も生理活性を有する組成物を提供したがこの組成物は生理受容性を有するキャリヤ（physilogically acceptable carrier）及び前記いずれかの項に記載された抽出物又は該抽出物の同分異物（isomer）を含んでいる。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は心血管病に対して薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該心血管病は動脈硬化、血管損傷及び中風からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該心血管病は動脈硬化、血管損傷及び中風からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は神経変性に対して薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該神経変性は網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質変性及び脳部錐状神経変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該神経変性は網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質変性及び脳部錐状神経変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は腎臓病に対して薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該腎臓病は腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該腎臓病は腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、生理活性を有する組成物は眼疾に対して薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該眼疾は葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎及びブルチ氏膜変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該眼疾は葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎及びブルチ氏膜変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は膵臓病に対して薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該膵臓病は糖尿病及びその併発症からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該膵臓病は糖尿病及びその併発症からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は自体免疫病（autoimmune disease）又は敗血性ショックに対して薬理活性を有する組成物である。
本発明はまた水、水溶性有機溶剤、又は水と該水溶性有機溶剤の混合物により植物を抽出するステップを備えた霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の方法を提供した。
上記アイディアによれば、該水溶性有機溶剤は含炭素数が１〜８に介するアルコール類、アルキル類又はエステル類の中の一つである。
上記アイディアによれば、該アルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによれば、該水溶性有機溶剤は含炭素数が１〜８に介するアルコール類、アルキル類又はエステル類の中の一つである。
上記アイディアによれば、該アルコール類はメタノール又はエタノールである。
本発明にはまた植物抽出物を調製する方法が提供され、（ａ）第１のアルコール類で該植物を抽出して第１のアルコール類抽出物を生ずるステップと、（ｂ）水とアルキル類で同時に該第１のアルコール類抽出物を抽出して第１の水層抽出物及びアルキル類抽出物を生ずるステップと、（ｃ）エステル類で該水層を抽出してエステル抽出物及び第２の水層抽出物を生ずるステップと、（ｄ）第２のアルコール類で該第２の水層抽出物を抽出して第２のアルコール類抽出物及び第３の水層抽出物を生ずるステップと、を備えてなる。
上記アイディアによれば、該植物は蘭科植物である。
上記アイディアによれば該蘭科植物はジイナスデンドロビウムに属する。
上記アイディアによれば該蘭科植物はジイナスデンドロビウムに属する。
上記アイディアによればステップ（ａ）はさらにａ１）該植物の乾物質を提供するステップと、ａ２）粉砕機で乾物質を磨潰すステップと、ａ３）該第１のアルコール類で磨潰された該物質を抽出して第１のアルコール類抽出物を得るステップとを備えてなる。
上記アイディアによれば、該第１のアルコール類の含炭素数は１〜８である。
上記アイディアによれば、該第１のアルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによれば、該第２のアルコール類は含炭素数１〜８のアルコール類である。
上記アイディアによれば、該第２のアルコール類はブタノール又はｎ−ブタノールである。
上記アイディアによれば、該第１のアルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによれば、該第２のアルコール類は含炭素数１〜８のアルコール類である。
上記アイディアによれば、該第２のアルコール類はブタノール又はｎ−ブタノールである。
上記アイディアによれば、ステップ（ｂ）はさらにｂ１）減圧、濃縮、吸気等で第１のアルコール類抽出物を乾燥するステップを備えている。
上記アイディアによれば、該アルキル類抽出物はｎ−ヘキサン抽出物である。
上記アイディアによれば、該アルキル類抽出物はｎ−ヘキサン抽出物である。
上記アイディアによれば、上記ステップ（ｃ）は更にｃ１）該エステル類抽出物を乾燥するステップと、ｃ２）ヘキサンとメタノールで乾燥した後の該エステル類抽出物を抽出してヘキサン抽出物とエタノール抽出物を生ずるステップとを備えてなる。
上記アイディアによれば、該ヘキサン抽出物は減圧、濃縮、吸気等のステップを介して乾燥される。
上記アイディアによれば、該エステル類はエチルアセテートである
上記アイディアによれば、該エステル類はエチルアセテートである
上記アイディアによれば、該方法は更に（ｅ）色層分析法で該第２のアルコール類抽出物を色層分析して名称をＤＣＭＰｂＬ６，７と名付けた第１の溶出物を得るステップと、（ｆ）第１の溶出剤で該ＤＣＭＰｂＬ６，７を溶出して第２の溶出物を得るステップとを備えてなる。
上記アイディアによれば、該ステップ（ｅ）は第２の溶出剤により実施される。
上記アイディアによれば、該第２の溶出剤は体積比が１：１のメタノールと水との混合物により組成される。
上記アイディアによれば、該第２の溶出剤は体積比が１：１のメタノールと水との混合物により組成される。
上記アイディアによれば、該第１の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比２０：８０で組成した混合物であり、該第２の溶出物はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２と名付けられる。
上記アイディアによれば、該ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２は、さらに、メタノール／水／酢酸を体積比３０：６５：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第３の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２を生ずる。
上記アイディアによれば、該ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２は、さらに、メタノール／水／酢酸を体積比３０：６５：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第３の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２を生ずる。
上記アイディアによれば、該第１の溶出物はイソプロパノールと水とを体積比３０：７０にて組成した混合物であり、そして該第２の溶出物の名称はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３と名付けられる。
上記アイディアによれば、該ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３は更に一個のメタノール／水／酢酸を体積比４０：６０：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第４の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３を生ずる。
上記アイディアによれば、該ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３は更に一個のメタノール／水／酢酸を体積比４０：６０：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第４の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３を生ずる。
上記アイディアによれば、該第１の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比４０：６０にて組成した混合物であり、そして該第２の溶出物の名称はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４と名付けられる。
上記アイディアによれば該ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４はさらに一個のメタノール／水／酢酸を体積比４５：５５：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第５の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３を生ずる。
上記アイディアによれば該ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４はさらに一個のメタノール／水／酢酸を体積比４５：５５：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第５の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３を生ずる。
さらには、本発明も前記方法により生じた各抽出物であるいずれかの他種のデンドロビーコーリイス植物抽出物を提供する。
上記アイディアによれば、該植物抽出物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該抽出物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該抽出物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
また、本発明も生理活性を有する組成物を提供した。この組成物は生理受容性を有するキャリヤ及び前記植物抽出物又は該抽出物の同分異物（isomer）を備えている。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該組成物は下記の心血管病、神経病、腎臓病、肝臓病、眼疾及び自体免疫病等の病気からなる群より選ばれたいずれかの、薬理反応を有する医薬組成物である。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性、腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病及びその併発症及び敗血性ショックからなる群より選ばれた病気である。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性、腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病及びその併発症及び敗血性ショックからなる群より選ばれた病気である。
本発明は他に別種の組成物である、前記得られた該第２の溶出物を提供した。
上記アイディアによれば、該組成物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
また、本発明も生理活性を有する組成物を提供した。この組成物は生理受容性を有するキャリヤ及び前記の組成物又は該組成物の同分異物（isomer）である。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該組成物は下記病患組からなる群より選ばれたいずれかの病気の薬理反応を有する医薬組成物であり、この病患群組は心血管病、神経病、腎臓病、肝臓病、眼疾及び自体免疫病を含んでいる。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜病変、糖尿病とその併発症及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜病変、糖尿病とその併発症及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
本発明も前記得られた該第３の溶出物である化合物を提供した。
上記アイディアによれば、該化合物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該化合物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該化合物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該化合物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
また、本発明も別の生理活性を有する組成物を提供したがこの組成物は生理受容性を有するキャリヤ及び前記いずれかの項に記載された化合物又は該化合物の同分異物（isomer）を含む。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該組成物は下記病患組からなる群より選ばれたいずれかの病気の薬理反応を有する医薬組成物であり、この病患群組は心血管病、神経病、腎臓病、肝臓病、眼疾及び自体免疫病を含んでいる。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病及びその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病及びその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
本発明はまた前記得られた該第４の溶出物である組成分を提供した。
上記アイディアによれば、該組成物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
また本発明も他種の生活活性を有する組成物を提供したがこの組成物は生理受容性を有するキャリヤ及び前記組成分又は該組成分の同分異物（isomer）を含んでいる。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該組成物は下記病患組からなる群より選ばれたいずれかの病気の薬理反応を有する医薬組成物であり、この病患群組は心血管病、神経病、腎臓病、肝臓病、眼疾及び自体免疫病を含んでいる。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病とその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病とその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
さらに、本発明はまた前記得られた該第５の溶出物である組成分を提供した。
上記アイディアによれば、該組成分は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成分は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成分は網膜黒色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell；ＲＰＥ）を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成分は生物体中の高度糖化終産物（advanced glycation end product；ＡＧＥ）含有量を減少する作用を有する。
また本発明も他種の生理活性を有する組成物を提供したが、この組成物は生理受容性を有するキャリヤ及び前記組成分又は該組成分の同分異物（isomer）を含んでいる。
上記アイディアによれば、該生理活性を有する組成物は薬理活性を有する組成物である。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該組成物は下記病患組からなる群より選ばれたいずれかの病気の薬理反応を有する医薬組成物であり、この病患群組は心血管病、神経病、腎臓病、肝臓病、眼疾及び自体免疫病を含んでいる。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病とその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病とその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
本発明の霍山デンドロビーコーリイス抽出物及びその製造プロセスは以下の実施例の説明により十分に了解が得られると共に、本技芸に熟知せる当業者によりこれに基づいて実施され得る。しかしながら、本発明の実施の形態は下記の実施例に限定されない。
（１）網膜色素上皮細胞の培養
屠牛場から牛眼を取得し、ヨード酒で外表を消毒してから再度燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で二回洗滌し、解剖して水晶体、ガラス体、網膜等を除去した後、０．１％ＥＤＴＡで４０分間処理し、さらに５％トリプシンで１５分間処理して円形鉗子で軽く圧し、吸管で軽吸数回後単一のＲＰＥ細胞を得た。溶液を吸出して１０％の胎牛血清（fetal calf serum；ＦＣＳ）の培養液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；ＤＭＥＭ）中に置き、３７℃において５％ＣＯ2 飽和湿度の培養箱中で培養する。５〜６日毎に新培養液を取替え、いっぱいに生長したら０．０５％トリプシン及び０．０２％のエチレンジアミンテトラ酢酸で継続処理する。本実験は主として第５代、第６代で生物活性のテストを進行する。
屠牛場から牛眼を取得し、ヨード酒で外表を消毒してから再度燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で二回洗滌し、解剖して水晶体、ガラス体、網膜等を除去した後、０．１％ＥＤＴＡで４０分間処理し、さらに５％トリプシンで１５分間処理して円形鉗子で軽く圧し、吸管で軽吸数回後単一のＲＰＥ細胞を得た。溶液を吸出して１０％の胎牛血清（fetal calf serum；ＦＣＳ）の培養液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；ＤＭＥＭ）中に置き、３７℃において５％ＣＯ2 飽和湿度の培養箱中で培養する。５〜６日毎に新培養液を取替え、いっぱいに生長したら０．０５％トリプシン及び０．０２％のエチレンジアミンテトラ酢酸で継続処理する。本実験は主として第５代、第６代で生物活性のテストを進行する。
（２）ＲＯＳの調製
屠牛場から新鮮な牛眼を取得し、氷上で３０分間照光した後先ずヨードで外表を消毒し次にハンク氏バッファで二回洗滌した。次に解剖して水晶体、ガラス体を除去し、網膜を小砕片に鋏み切って２０％のシュクロースを含有した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中に置き、４℃の氷箱で３時間撹拌して、それぞれＮｏ．３００，２２０，１１０，７４，５３，１０メッシュの濾過膜で濾過する。濾液中の細胞数を計算し、管毎に１×１０8 ＲＯＳ細胞を分装し−２０℃の氷箱に置いて保存させる。
屠牛場から新鮮な牛眼を取得し、氷上で３０分間照光した後先ずヨードで外表を消毒し次にハンク氏バッファで二回洗滌した。次に解剖して水晶体、ガラス体を除去し、網膜を小砕片に鋏み切って２０％のシュクロースを含有した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中に置き、４℃の氷箱で３時間撹拌して、それぞれＮｏ．３００，２２０，１１０，７４，５３，１０メッシュの濾過膜で濾過する。濾液中の細胞数を計算し、管毎に１×１０8 ＲＯＳ細胞を分装し−２０℃の氷箱に置いて保存させる。
（３）ＦＩＴＣ−ＲＯＳの調製
ＲＯＳ解凍後除去した上澄液を取出し、７００ｍｌ（含１０％シュクロース）の硼酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して混和した後、再度ＲＯＳの１／１０００重量の蛍光物質fluorescein isothiocyanate（ＦＩＴＣ）粉末を添加して、４℃の温度において１．５時間回転した。含２０％シュクロースの２０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ７．２）を利用してＲＯＳと混和してないＦＩＴＣを洗滌して除去し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、数回重複して再度シュクロースのＤＭＥＭ中に溶解した。
ＲＯＳ解凍後除去した上澄液を取出し、７００ｍｌ（含１０％シュクロース）の硼酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して混和した後、再度ＲＯＳの１／１０００重量の蛍光物質fluorescein isothiocyanate（ＦＩＴＣ）粉末を添加して、４℃の温度において１．５時間回転した。含２０％シュクロースの２０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ７．２）を利用してＲＯＳと混和してないＦＩＴＣを洗滌して除去し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、数回重複して再度シュクロースのＤＭＥＭ中に溶解した。
（４）網膜色素上皮細胞呑食機能の測定
ＲＰＥ細胞を５×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製して２００ｍｌを９６ウエルプレート中に吸取らせ、いっぱいに生長した後新培養液を取替え、さらに不同濃度のテスト用薬物２０ｍｌを各ウエルに添加すると共に胎牛血清の含量を２％〜５％間に置かさせ、４８時間培養した後、５０ｍｌの２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ／ｍｌを各ウエル中に添加して４時間培養した。
ＲＰＥ細胞を５×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製して２００ｍｌを９６ウエルプレート中に吸取らせ、いっぱいに生長した後新培養液を取替え、さらに不同濃度のテスト用薬物２０ｍｌを各ウエルに添加すると共に胎牛血清の含量を２％〜５％間に置かさせ、４８時間培養した後、５０ｍｌの２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ／ｍｌを各ウエル中に添加して４時間培養した。
しかる後、上澄液を清除すると共に２．５％シュクロース／ＰＢＳで数回洗滌し、最後に１００μｌ ＰＢＳを添加して、細胞蛍光測定機Cyto-Fluorometer（Ex filter：４８５／２０ｎｍ，Em filter ５３０／２５ｎｍ）を利用して、ＲＰＥ表面に粘着されかつ呑食されたＦＩＴＣ−ＲＯＳ量を測定した。各ウエルに５ｍｌのFluro Quenchを添加し、培養箱中で１時間反応後その蛍光読値を測定し呑食されたＦＩＴＣ−ＲＯＳ量とした。
（５）網膜色素上皮細胞ニトリックオキサイド生成の測定（ＤＡＮ assay）(39)
１００ｍｌ細胞培養上澄液に５０ｍｌの２，３−ジアミノナフタリン（ＤＡＮ）を添加して室温中で十分間作用した後、２５ｍｌの２．８ＮのＮａＯＨを添加して反応を中止させ、さらに細胞蛍光測定機（Cyto-Fluorometer２３００（基態３６０±４０ｎｍ、激態４００±４０ｎｍ）で測定した。得られた値は既知濃度、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2 ）により作り出された標準曲線からニトリックオキサイド濃度を換算して算出したものである。
１００ｍｌ細胞培養上澄液に５０ｍｌの２，３−ジアミノナフタリン（ＤＡＮ）を添加して室温中で十分間作用した後、２５ｍｌの２．８ＮのＮａＯＨを添加して反応を中止させ、さらに細胞蛍光測定機（Cyto-Fluorometer２３００（基態３６０±４０ｎｍ、激態４００±４０ｎｍ）で測定した。得られた値は既知濃度、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2 ）により作り出された標準曲線からニトリックオキサイド濃度を換算して算出したものである。
（６）網膜色素上皮細胞リボヌクレイン酸（ＲＮＡ）の調製
網膜色素上皮細胞を１００ｍｍ培養盤（１×１０6 cells in ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養し、いっぱいに生長した後新培養液（含２．５％ＦＣＳのＤＭＥＭ）に取替え、霍山デンドロビーコーリイス化学溶媒分層法の区分物を０．１μｇ／ｍｌ添加し、４８時間培養した。先ず培養液を除去し、凍り付いたＰＢＳ緩衝液で二回洗滌した後、１ｍｌ／１０5 −１０6 cellsのＲＮＡ zol ＴＭＢ添加し５分間静置した。次にこそぎ杓で細胞を組織培養盤の上から下へ刮ぎ、１．５ｍｌの遠心管内に移して１／１０倍の体積量のクロロフォルムを添加した。そして快速に揺動混和して均一にした後、氷の上に５分間静置して４℃の温度下で１２０００ｒｐｍの高速度遠心を１５分間行った。しかる後注意深く上層の透明水層を吸取り、他の１．５ｍｌの遠心管内に移して等体積のイソプロパノールを添加して均一に混和し、再度氷上で５分間静置した。そして、４℃の温度で１２０００ｒｐｍの高速度で１０分間遠心し上澄液を除去し、７０％のエタノールで沈澱部分を洗浄した。さらには４℃の温度及び７５００ｒｐｍを通して８分間遠心を行い、エタノールを除去乾燥した。しかる後、含０．１％ジエチルピロカーボネート，ＤＥＰＣ）の既に４回処理した水を溶解し、その一部を取りＯＤ２６０で定量すると共に、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０で純度を判定した。剰余の部分は７０％のエタノールで保存し、−２０℃の温度下に置いた。
網膜色素上皮細胞を１００ｍｍ培養盤（１×１０6 cells in ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養し、いっぱいに生長した後新培養液（含２．５％ＦＣＳのＤＭＥＭ）に取替え、霍山デンドロビーコーリイス化学溶媒分層法の区分物を０．１μｇ／ｍｌ添加し、４８時間培養した。先ず培養液を除去し、凍り付いたＰＢＳ緩衝液で二回洗滌した後、１ｍｌ／１０5 −１０6 cellsのＲＮＡ zol ＴＭＢ添加し５分間静置した。次にこそぎ杓で細胞を組織培養盤の上から下へ刮ぎ、１．５ｍｌの遠心管内に移して１／１０倍の体積量のクロロフォルムを添加した。そして快速に揺動混和して均一にした後、氷の上に５分間静置して４℃の温度下で１２０００ｒｐｍの高速度遠心を１５分間行った。しかる後注意深く上層の透明水層を吸取り、他の１．５ｍｌの遠心管内に移して等体積のイソプロパノールを添加して均一に混和し、再度氷上で５分間静置した。そして、４℃の温度で１２０００ｒｐｍの高速度で１０分間遠心し上澄液を除去し、７０％のエタノールで沈澱部分を洗浄した。さらには４℃の温度及び７５００ｒｐｍを通して８分間遠心を行い、エタノールを除去乾燥した。しかる後、含０．１％ジエチルピロカーボネート，ＤＥＰＣ）の既に４回処理した水を溶解し、その一部を取りＯＤ２６０で定量すると共に、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０で純度を判定した。剰余の部分は７０％のエタノールで保存し、−２０℃の温度下に置いた。
（７）ＲＰＥ細胞の生長因子の逆転写及び多連鎖重合反応（Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction；ＲＴ−ＰＣＲ）
それぞれ加薬組と対照組とのＲＰＥ細胞より抽出された全ＲＮＡ５ｍｇを取り、２．５ｍｇのOligo dＴを添加して、７０℃の温度１０分間後室温で１０分間置いた。そしてさらに１０ｍＭ試薬（ｄＮＴＰ）２ｍｌ・ｒＲＮａｓｉｎ １ｍｌ、Avian Myeloblastosis virus；ＡＭＶ、reverse transcriptase １ｍｌ（１０ｕｎｉｔ）、及びその緩衝液を添加して反応体積を２０ｍｌにした。しかる後４２℃の温度にて５０分間反応し、さらに９０℃の温度にて５分間加熱した後、氷上に１０分間置いた。最後、ｒＲＮＡａｓｅＨ １ｍｌ添加して３７℃の温度で３０分間反応した。逆転写反応のｃＤＮＡ及び不同倍数希釈したｃＤＮＡを取り、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ｍｌ添加し及び各管に検出したい因子（primer）：β−actin及び各種標的のジーン（gene）のsense及びantisense Primer ０．１ｍｇ／ｍｌ各１ｍｌ、ポリマレース（polymerase）１ｍｌ（２単位）及びその緩衝液を添加した。作用体積は２０ｍｌで、条件は変性処理（denaturing）が９４℃、１．５分間で行われ、アニーリングが５７℃、１．５分間で行われ、延長（extension）は７２℃、２分間、ＤＮＡ thermal cycler（Perkin-Elmer-Cetus）でＰＣＲ反応を行う。β−actin反応は２５サイクル、ＨＧＦ反応は３５個サイクルである。
それぞれ加薬組と対照組とのＲＰＥ細胞より抽出された全ＲＮＡ５ｍｇを取り、２．５ｍｇのOligo dＴを添加して、７０℃の温度１０分間後室温で１０分間置いた。そしてさらに１０ｍＭ試薬（ｄＮＴＰ）２ｍｌ・ｒＲＮａｓｉｎ １ｍｌ、Avian Myeloblastosis virus；ＡＭＶ、reverse transcriptase １ｍｌ（１０ｕｎｉｔ）、及びその緩衝液を添加して反応体積を２０ｍｌにした。しかる後４２℃の温度にて５０分間反応し、さらに９０℃の温度にて５分間加熱した後、氷上に１０分間置いた。最後、ｒＲＮＡａｓｅＨ １ｍｌ添加して３７℃の温度で３０分間反応した。逆転写反応のｃＤＮＡ及び不同倍数希釈したｃＤＮＡを取り、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ｍｌ添加し及び各管に検出したい因子（primer）：β−actin及び各種標的のジーン（gene）のsense及びantisense Primer ０．１ｍｇ／ｍｌ各１ｍｌ、ポリマレース（polymerase）１ｍｌ（２単位）及びその緩衝液を添加した。作用体積は２０ｍｌで、条件は変性処理（denaturing）が９４℃、１．５分間で行われ、アニーリングが５７℃、１．５分間で行われ、延長（extension）は７２℃、２分間、ＤＮＡ thermal cycler（Perkin-Elmer-Cetus）でＰＣＲ反応を行う。β−actin反応は２５サイクル、ＨＧＦ反応は３５個サイクルである。
１．ＨＧＦはGibco（Gaithersburg，ＭＤ，ＵＳＡ）から手引きしたものである。
Sense，21mer：5’-GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA-3’
Antisense，21mer：5’-CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA-3’
２．ＶＥＧＦ primer：
Sense，24mer：5’-AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT-3’
３．ｂＦＧＦ primer：
Sense，19mer：5’-CCA AGC GGC TGT ACT CCA A-3’
４．ＴＧＦ−β primer：
Sense，24mer：5’-CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG-3’
Antisense，24mer：5’-ACG ATC ATG CAC AAC TGC TCC-3’
Sense，21mer：5’-GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA-3’
Antisense，21mer：5’-CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA-3’
２．ＶＥＧＦ primer：
Sense，24mer：5’-AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT-3’
３．ｂＦＧＦ primer：
Sense，19mer：5’-CCA AGC GGC TGT ACT CCA A-3’
４．ＴＧＦ−β primer：
Sense，24mer：5’-CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG-3’
Antisense，24mer：5’-ACG ATC ATG CAC AAC TGC TCC-3’
（８）糖化アルブミン（glycated albumin）の調製
（ａ）牛糖化アルブミンの作製
一倍のＰＢＳでアルブミン（フラクションＶ）を１ｍＭに希釈し、０．２２μｍの無菌濾過膜で濾過した後、０．２２μｍ無菌濾過膜で濾過した２５０ｍＭグルコースを３７℃培養箱中に置いて糖化作用を進行した。３週後反応液を透析して余ったグルコースを除去した後、ConA-Sepharoseゲルで純化を行い、透析後冷凍して乾燥保存した。
（ａ）牛糖化アルブミンの作製
一倍のＰＢＳでアルブミン（フラクションＶ）を１ｍＭに希釈し、０．２２μｍの無菌濾過膜で濾過した後、０．２２μｍ無菌濾過膜で濾過した２５０ｍＭグルコースを３７℃培養箱中に置いて糖化作用を進行した。３週後反応液を透析して余ったグルコースを除去した後、ConA-Sepharoseゲルで純化を行い、透析後冷凍して乾燥保存した。
（ｂ）ラット糖化アルブミンの作製
一倍のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でアルブミン（フラクションＶ）を１００ｍｇ／ｍｌ（１．５１ｍＭ）に希釈し、０．２２μｍの無菌濾過膜で濾過した後、等体積の一倍のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を０．２２μｍ無菌濾過膜で濾過した後の１．８ｇ／ｍｌ（１Ｍ）のＤ−グルコースをガラス管内に溶解させ、３７℃培養箱に置いて黒やみの中で糖化反応を行い、６０日後反応液を透析袋中に置いて余計なグルコースを除去する。しかる後、再度０．２２μｍ無菌濾過膜で濾過して、蛋白質濃度を測定後分装し、冷凍乾燥後−２０℃の温度に保存して使用に供する。
一倍のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でアルブミン（フラクションＶ）を１００ｍｇ／ｍｌ（１．５１ｍＭ）に希釈し、０．２２μｍの無菌濾過膜で濾過した後、等体積の一倍のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を０．２２μｍ無菌濾過膜で濾過した後の１．８ｇ／ｍｌ（１Ｍ）のＤ−グルコースをガラス管内に溶解させ、３７℃培養箱に置いて黒やみの中で糖化反応を行い、６０日後反応液を透析袋中に置いて余計なグルコースを除去する。しかる後、再度０．２２μｍ無菌濾過膜で濾過して、蛋白質濃度を測定後分装し、冷凍乾燥後−２０℃の温度に保存して使用に供する。
（９）ＦＩＴＣテストによるＡＧＥ−ＢＳＡ（４０）の量定
アルブミン１００ｍｇ、ＦＩＴＣ １．８ｍｇを取り、１５ｍｌ ０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（Sodium carbonate buffer，ｐＨ９．５）に溶解して、２５℃の温度において光を避けながら５時間撹拌した。そしてＨＷ−５５Ｆ（１．６×１００ｃｍ）分子ふるい柱で分離を進行し、全プロセス的に光を避けながら、５％（ｖ／ｖ）のｎ−ブタノール溶出緩衝液とし、自然流速で分離を行う。分離したサンプルを三回水で透析を行い、蛋白質定量後無菌濾過し、冷凍乾燥で分装して蛍光を測定すると共に蛍光の当量比を計算量定した。
アルブミン１００ｍｇ、ＦＩＴＣ １．８ｍｇを取り、１５ｍｌ ０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（Sodium carbonate buffer，ｐＨ９．５）に溶解して、２５℃の温度において光を避けながら５時間撹拌した。そしてＨＷ−５５Ｆ（１．６×１００ｃｍ）分子ふるい柱で分離を進行し、全プロセス的に光を避けながら、５％（ｖ／ｖ）のｎ−ブタノール溶出緩衝液とし、自然流速で分離を行う。分離したサンプルを三回水で透析を行い、蛋白質定量後無菌濾過し、冷凍乾燥で分装して蛍光を測定すると共に蛍光の当量比を計算量定した。
（１０）ＲＰＥ細胞減成ＦＩＴＣ−labeled ＡＧＥ−ＢＳＡの観察
事前に滅菌清潔したガラス片を２４槽培養盤（２４ well culture plate）中に置き、３００μｌ ０．５％ゲルで３０分間塗布し、更に培養液で塗布したゲルを洗い流した。ＲＰＥ細胞は毎槽５×１０4 個細胞（５×１０4 cell／well）の細胞数目で１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭを用いてガラス片を被せてある２４ well plate中に培養した。各盤内には０．７ｍｌの培養液があり、４８時間後に細胞がいっぱいに生長した後培養液を吸取り除去し、０．５ｍｌ培養液で三回洗い、３０〜３００μｇ／ｍｌ不同濃度のＦＩＴＣ−ＢＳＡ ＤＭＥＭを培養液０．５ｍｌ中に加えた。ＰＢＳでこの細胞を四回洗滌し、まだ呑食されていないか又は結合した蛍光を洗い除去する。ガラス片を取出して含１％ＦＱＥＢのＰＢＳで湿潤し、封片後すぐ蛍光顕微鏡で観察した。
事前に滅菌清潔したガラス片を２４槽培養盤（２４ well culture plate）中に置き、３００μｌ ０．５％ゲルで３０分間塗布し、更に培養液で塗布したゲルを洗い流した。ＲＰＥ細胞は毎槽５×１０4 個細胞（５×１０4 cell／well）の細胞数目で１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭを用いてガラス片を被せてある２４ well plate中に培養した。各盤内には０．７ｍｌの培養液があり、４８時間後に細胞がいっぱいに生長した後培養液を吸取り除去し、０．５ｍｌ培養液で三回洗い、３０〜３００μｇ／ｍｌ不同濃度のＦＩＴＣ−ＢＳＡ ＤＭＥＭを培養液０．５ｍｌ中に加えた。ＰＢＳでこの細胞を四回洗滌し、まだ呑食されていないか又は結合した蛍光を洗い除去する。ガラス片を取出して含１％ＦＱＥＢのＰＢＳで湿潤し、封片後すぐ蛍光顕微鏡で観察した。
（１１）霍山デンドロビーコーリイスの抽出物及び純化活性成分の分離
１）霍山デンドロビーコーリイスの抽出物の調製
粉砕機で２ｋｇのデンドロビーコーリイスを粉砕した後メタノール又はエタノールを添加して全夜浸潤した後フィルタネットで残渣を除去すると共に、吸気濾過方式で濾過した後減圧濃縮を行い、繰り返し三回浸潤した。メタノール又はエタノールが完全に吸気乾燥された後、デンドロビーコーリイスがアルコール類から抽出して得たことから、アルコール類粗抽出物をＤｅＣａＭと名付けた。
１）霍山デンドロビーコーリイスの抽出物の調製
粉砕機で２ｋｇのデンドロビーコーリイスを粉砕した後メタノール又はエタノールを添加して全夜浸潤した後フィルタネットで残渣を除去すると共に、吸気濾過方式で濾過した後減圧濃縮を行い、繰り返し三回浸潤した。メタノール又はエタノールが完全に吸気乾燥された後、デンドロビーコーリイスがアルコール類から抽出して得たことから、アルコール類粗抽出物をＤｅＣａＭと名付けた。
２）霍山デンドロビーコーリイス化学溶分層抽出物の調製
４００ｍｌの水で三回溶出した後等量のｎ−ヘキサンで３回分層し、ＤＣＭＰｈと名付けた。水層はエチル−アセテートで４回分層してＥｔＯＡｃ層を得、ＤＣＭＰｅと名付けた。水層はさらにｎ−ブタノールで３回分層し、ｎ−ブタノール層及び水層を得、それぞれＤＣＭＰｂ及びＤＣＭＰｗと名付けた。
４００ｍｌの水で三回溶出した後等量のｎ−ヘキサンで３回分層し、ＤＣＭＰｈと名付けた。水層はエチル−アセテートで４回分層してＥｔＯＡｃ層を得、ＤＣＭＰｅと名付けた。水層はさらにｎ−ブタノールで３回分層し、ｎ−ブタノール層及び水層を得、それぞれＤＣＭＰｂ及びＤＣＭＰｗと名付けた。
３）霍山デンドロビーコーリイス純化成分の抽出及び分離
次の分離方法で霍山デンドロビーコーリイス活性成分を分離した。先ずメタノールで霍山デンドロビーコーリイス１．９ｋｇをメタノールで三回約１６リットル抽出した。減圧濃縮後乾燥してＤＣＭと称するサンプルを得た。先ずエチル−アセテート（ＥｔＯＡｃ）で２リットル溶解した後、再度等体積の水で分配抽出を行い、そして水層は再度等体積のエチル−アセテートで２回抽出し、エチル−アセテート（ＥｔＯＡｃ）層と第２の水層を得た。このＥｔＯＡｃ抽出層を混和収集した後、減圧濃縮乾燥し、再度ヘキサン４リットル及びメタノール２リットルで３回分配抽出して２層を得、減圧濃縮後ヘキサン層（ＤＣＭＰｅ／ｈと名付ける）及びメタノール層（ＤＣＭＰｅ／ｍ）サンプルを得た。第２の水層を２リットルに調整し、さらにブタノール２リットルで分配抽出し、減圧濃縮後ブタノール層（ＤＣＭＰｂと名付ける）及び第３の水層（ＤＣＭＰｗ）サンプルを得た。ＰＣＭＰｂサンプルはＬＨ２０膠で分子管柱色層分析（２．５×１０7 ｃｍ、移動層はメタノール：水＝５０：５０）を行い、活性な篩分を行った後得られた８個クロマトグラフィーピークの中の第６のクロマトグラフィーピークと第７のクロマトグラフィーピークの抽出物を収集してＰＣＭＰｂＬ６，７サンプルと名付けた。次に、再度Ｄｉａｉｏｎ ＳＰ−２０ ＳＳで吸着管柱色層分析（１×３０ｃｍ）を行い、イソプロパノール：水＝２０：８０（体積比）の溶出液で第２のクロマトグラフィーピークを溶出し、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２と名付けた。そしてイソプロパノール：水＝３０：７０（体積比）の溶出液で第３のクロマトグラフィーピークの溶出をＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３と名付けた。またイソプロパノール：水＝４０：６０（体積比）の溶出液で第４のクロマトグラフィーピークの溶出をＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４と名付けた。
次の分離方法で霍山デンドロビーコーリイス活性成分を分離した。先ずメタノールで霍山デンドロビーコーリイス１．９ｋｇをメタノールで三回約１６リットル抽出した。減圧濃縮後乾燥してＤＣＭと称するサンプルを得た。先ずエチル−アセテート（ＥｔＯＡｃ）で２リットル溶解した後、再度等体積の水で分配抽出を行い、そして水層は再度等体積のエチル−アセテートで２回抽出し、エチル−アセテート（ＥｔＯＡｃ）層と第２の水層を得た。このＥｔＯＡｃ抽出層を混和収集した後、減圧濃縮乾燥し、再度ヘキサン４リットル及びメタノール２リットルで３回分配抽出して２層を得、減圧濃縮後ヘキサン層（ＤＣＭＰｅ／ｈと名付ける）及びメタノール層（ＤＣＭＰｅ／ｍ）サンプルを得た。第２の水層を２リットルに調整し、さらにブタノール２リットルで分配抽出し、減圧濃縮後ブタノール層（ＤＣＭＰｂと名付ける）及び第３の水層（ＤＣＭＰｗ）サンプルを得た。ＰＣＭＰｂサンプルはＬＨ２０膠で分子管柱色層分析（２．５×１０7 ｃｍ、移動層はメタノール：水＝５０：５０）を行い、活性な篩分を行った後得られた８個クロマトグラフィーピークの中の第６のクロマトグラフィーピークと第７のクロマトグラフィーピークの抽出物を収集してＰＣＭＰｂＬ６，７サンプルと名付けた。次に、再度Ｄｉａｉｏｎ ＳＰ−２０ ＳＳで吸着管柱色層分析（１×３０ｃｍ）を行い、イソプロパノール：水＝２０：８０（体積比）の溶出液で第２のクロマトグラフィーピークを溶出し、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２と名付けた。そしてイソプロパノール：水＝３０：７０（体積比）の溶出液で第３のクロマトグラフィーピークの溶出をＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３と名付けた。またイソプロパノール：水＝４０：６０（体積比）の溶出液で第４のクロマトグラフィーピークの溶出をＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４と名付けた。
その中、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２は再度ＨＰＬＣ逆相Ｃ１８管柱を通して溶出液がメタノール：水：酢酸＝３５：６５：１（体積比）の時に溶出し、その中の第２のクロマトグラフィーピークを収集してＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２と名付けた。
ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３はさらにＨＰＬＣ逆相Ｃ１８管柱を通して溶出液がメタノール：水：酢酸＝４０：６０：１（体積比）の時に溶出し、その中の第３のクロマトグラフィーピークを収集してＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３と名付けた。そしてＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４はＨＰＬＣ逆相Ｃ１８管柱を通して溶出液がメタノール：水：酢酸＝４５：５５：１（体積比）時に溶出を行い、その中の第３のクロマトグラフィーピークを収集してＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３と名付けた。その分離のフローチャートは図１に示す如きである。
（１２）霍山デンドロビーコーリイスアルコール抽出物のＲＰＥ呑食作用に対する影響
図２は霍山デンドロビーコーリイス抽出物のＲＰＥ細胞呑食作用に対する影響の柱形図である。この図２に示すように、不同濃度の霍山デンドロビーコーリイスのメタノール抽出物（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌ）のＲＰＥ細胞に対する呑食作用はいずれも顕著の促進効果を有する。そして濃度が１０％のＦＣＳも顕著にＲＰＥ細胞の呑食作用を促進することができる。これらに関連する操作のフローチャートを以下に示す。
図２は霍山デンドロビーコーリイス抽出物のＲＰＥ細胞呑食作用に対する影響の柱形図である。この図２に示すように、不同濃度の霍山デンドロビーコーリイスのメタノール抽出物（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌ）のＲＰＥ細胞に対する呑食作用はいずれも顕著の促進効果を有する。そして濃度が１０％のＦＣＳも顕著にＲＰＥ細胞の呑食作用を促進することができる。これらに関連する操作のフローチャートを以下に示す。
１０4 個ＲＰＥ細胞を９６槽培養盤（９６well culture plate）中に置き、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで４８時間培養した。次に２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを培養液として、それぞれ不同濃度の霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物を添加した。４８時間後、各槽内に濃度が２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞／ｍｌである溶液５０μｌを添加した。４時間経過後、ＰＢＳで余計なＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞を洗い去り、最後に多重量定冷光検出系統（１４２０ Multilabel counter (PE) measure system）で蛍光強度のテストを進行した。その中、２％ＦＣＳ処理ＲＰＥ細胞を利用して得られた呑食作用促進効果を基礎とし、符号「＃」は該基礎と比較して得られた差異度が顕著水準０．０５に達していることを表わし、符号「＊」は差異度が顕著水準０．０１に達していることを表わす。上記の内容から分るように、霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物を有する組成物、組成分又はその他生理活性を有する組成は、たとえ、その他に生理受容性を有するキャリヤがあっても、該組成は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物を含んでいることにより、ＲＰＥ細胞の呑食作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質である。例えば膠錠であってもよい（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物を装入している）。
図３は霍山デンドロビーコーリイス抽出物がＲＰＥ細胞呑食作用に対する影響の柱形図である。この図３に示すように、不同霍山デンドロビーコーリイス抽出物（１．１０μｇ／ｍｌのＤＣＭＰｅ／ｈ及び１．１０μｇ／ｍｌのＤＣＭＰｅ／ｍ及び０．１，１，１０μｇ／ｍｌのＤＣＭＰｂ）がＲＰＥ細胞に対する呑食作用はいずれも顕著な促進効果を有する。関連の操作フローチャートを以下に説明する。先ず１０4 個ＲＰＥ細胞を９６槽培養盤（９６well culture plate）中に置き、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭで４８時間培養した。次に２％ＦＣＳのＤＭＥＭを培養液とした。しかる後、それぞれ不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物を添加し、４８時間経過後、各槽内にそれぞれ濃度が２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞／ｍｌの溶液５０μｌを添加した。４時間後、ＰＢＳで余計なＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞を洗い流し最後多重量定冷光検出系統（１４２０ Multilabel counter (PE) measure system）で蛍光強度のテストを行った。その中、２％ＦＣＳでＲＰＥ細胞を処理して得られた呑食作用促進効果を基礎とし、符号「＃」は該基礎と比較して得られた差異度が０．０５に達していることを表わし、符号「＊」は差異度が顕著水準０．０１に達していることを表わす。上記の内容から分るように、霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭＰｅ／ｈ，ＤＣＭＰｅ／ｍ，ＤＣＭＰｂ）を有する組成物、組成分又はその他生理活性を有する組成はたとえ、その他に生理受容性を有するキャリヤがあっても、該組成は霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭＰｅ／ｈ，ＤＣＭＰｅ／ｍ，ＤＣＭＰｂ）を含んでいることにより、ＲＰＥ細胞の呑食作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質である。例えば膠錠であってもよい（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物を装入している）。
上記の純化後の霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２・ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３・ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３も顕著にＲＰＥ細胞の呑食作用を促進することが出来る。ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２を例に取れば、不同濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌ）がＲＰＥ細胞の呑食作用に対する作用はいずれも顕著な促進作用を有しており、図４に関連結果が示されている。その操作プログラムは、先ず１０4 個ＲＰＥ細胞を９６槽培養基盤（９６well culture plate）中に置き、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭで４８時間培養した。次に２％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培養液としてそれぞれ不同濃度のデンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２）添加して４８時間後、各槽内に濃度が２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞／ｍｌの溶液５０μｌを添加した。４時間経過後、ＰＢＳで余計なＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞を洗い流し、最後に多重量定冷光検出系統（１４２０ Multilabel counter (PE) measure system）で蛍光強度のテストを行った。その中、２％ＦＣＳ処理ＲＰＥ細胞を利用して得られた呑食作用促進効果を基礎とし、符号「＃」は該基礎と比較して得られた差異度が０．０５に達していることを表わし、符号「＊」は差異度が顕著水準０．０１に達していることを表わす。その中、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２の化学構造は今日に至ってもまだ確定できないが、その存在は既に確実に図５ないし図１０に示された結果（６００−ＭＨｚのＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹスペクトル図表及びＵＶスペクトラム）より証明されている。その中、図５ないし図１０はジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide-ｄ６，ＤＭＳＯ−ｄ６）を溶剤として６００−ＭＨｚ又は５００−ＭＨｚで霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２に対して分析を行って得られたＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ（５００−ＭＨｚ）スペクトル図表であり、そして図１１は霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２のＵＶスペクトログラムである。要するに、霍山デンドロビーコーリイス組成物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２を有することにより生理活性を有する如何なる組成は、他の生理受容性を有するキャリヤを含むだろうが、該組成はいずれも霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２を含むのでＲＰＥ細胞の呑食作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる、如何なる物質である。例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
また霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３にあっては、不同濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３（０．１，１μｇ／ｍｌ）はＲＰＥ細胞の呑食作用に対していずれも顕著の促進作用を有する。図１２にその関連結果を示している。この関連操作プログラムを簡単に説明すると、先ず１０4 個ＲＰＥ細胞を９６槽培養液盤（９６well culture plate）中に置き入れ、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭで４８時間培養した。次に２％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培養液としてそれぞれ不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３を添加して４８時間経過後、各槽内にそれぞれ濃度が２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞／ｍｌの溶液５０μｌを添加した。４時間経過後、ＰＢＳで余計なＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞を洗い流し、最後に多重量定冷光検出技術系統（１４２０ Multilabel counter (PE) measure system）で蛍光強度のテストを行った。その中、２％ＦＣＳ処理ＲＰＥ細胞を利用して得られた呑食作用促進効果を基礎とし、符号「＃」は該基礎と比較して得られた差異度が０．０５に達していることを表わし、符号「＊」は差異度が顕著水準０．０１に達していることを表わす。その中、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３の化学構造は今日に至ってまだ確定できないが、その存在は既に確実に図１３ないし図１７に示された結果より証明されている。それはジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide-ｄ６，ＤＭ−ｄ６）を溶剤として５００−ＭＨｚで霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３に対して分析を行って得たＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＮＭＢＣ、ＣＯＳＹスペクトル図表である。要するにこれはＤＣＭＰｂＬ６，７ＤＨ３がＲＰＥ細胞の呑食作用に対して顕著な促進作用を有しているので、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３を有し且つ生理活性を有する如何なる組成は他の生理受容性のキャリヤを有する可能性があっても、該組成はいずれも霍山デンドロビーコーリイスの抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３を包含することにより、ＲＰＥ細胞の呑食作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質である、例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
また他に、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３にあっては、不同濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）がＲＰＥ細胞に対する呑食作用はいずれも顕著な促進作用を有する。関連の結果は図１８を参照しながら関連のフローチャートを以下に説明する。先ず１０4 個ＲＰＥ細胞を９６槽培養盤（９６well culture plate）中に置き、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭで４８時間培養した。次に２％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培養液とした。しかる後、それぞれ不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３を添加し、４８時間経過後、各槽内にそれぞれ濃度が２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞／ｍｌの溶液５０μｌを添加した。４時間後、ＰＢＳで余計なＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞を洗い流し、最後多重量定冷光検出系統（１４２０ Multilabel counter (PE) measure system）で蛍光強度のテストを行った。その中、２％ＦＣＳでＲＰＥ細胞を処理して得られた呑食作用促進効果を基礎とし、符号「＃」は該基礎と比較して得られた差異度が０．０５に達していることを表わし、符号「＊」は差異度が顕著水準０．０１に達していることを表わす。その中、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３の化学構造は今日に至ってもまだ確定できないが、その存在は、確実に図１９乃至図２４に示された結果により証明されている。その中ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide-d6，ＤＭＳＯ−d6）を溶剤として５００−ＭＨｚで霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３に対して分析を行い、ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＢＭＣ・ＣＯＳＹスペクトル図表が得られた。要するにＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３はＲＰＥ細胞に対する呑食作用に顕著作用を有しているので霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３を有しかつ生理活性を有する如何なる組成は他の生理受容性を有するキャリヤを含むだろうが、該組成はいずれも霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３を含むことによりＲＰＥ細胞の呑食作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる物質である。例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
（１３）霍山デンドロビーコーリイス抽出物がＲＰＥ細胞対ニトリックオキサイド生成作用に対する影響
図２５は霍山デンドロビーコーリイス抽出物がＲＰＥ細胞対ニトリックオキサイド生成作用に対する影響柱形図である。この図２５から分るように、不同の霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）がＲＰＥ細胞対ニトリックオキサイド生成作用に対する影響は同一ではない。その中符号「＃」及び「＊」はそれぞれ得られた結果と２％ＦＣＳでＲＰＥ細胞を処理して得られたニトリックオキサイド生成作用の促進効果とを比較した時に得られた差異度が顕著水準０．０５と０．０１に達したことを表わしている。この図２５に示すように、濃度が１００、１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物ＤＣＭ、濃度が１０、１００、１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスエチルアセテート抽出物ＤＣＭＰｅ、濃度が１０又は１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスｎ−ブタノール抽出物ＰＣＭＰｂ、及び濃度が１００、１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスｎ−ヘキサン抽出物ＤＣＭＰｈはいずれも顕著にＲＰＥ細胞がニトリックオキサイド生成作用に対する影響を促進する。関連する操作プログラムは以下に示される。先ず１０4 個ＲＰＥ細胞を９６槽培養盤（９６well culture plate）中に置き、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭで４８時間培養した。次に２％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培養液とした。しかる後、それぞれ不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を添加し、４８時間経過後、各槽内にそれぞれ濃度が２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞／ｍｌの溶液５０μｌを添加した。４時間後ＰＢＳで余計なＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞を洗い流し、最後多重量定冷光検出系統（１４２０ Multilabel counter (PE) measure system）で蛍光強度のテストを行った。ここで不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）がＲＰＥ細胞のニトリックオキサイド生成作用に対して顕著な促進作用を有していることにより、霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を含み且つ生理活性を有する如何なる組成は、その他生理受容性のキャリヤを有する可能性があるだろうが、該組成はいずれも霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を含んでいるのでＲＰＥ細胞のニトリックオキサイド生成作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質である。例えば、膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
図２５は霍山デンドロビーコーリイス抽出物がＲＰＥ細胞対ニトリックオキサイド生成作用に対する影響柱形図である。この図２５から分るように、不同の霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）がＲＰＥ細胞対ニトリックオキサイド生成作用に対する影響は同一ではない。その中符号「＃」及び「＊」はそれぞれ得られた結果と２％ＦＣＳでＲＰＥ細胞を処理して得られたニトリックオキサイド生成作用の促進効果とを比較した時に得られた差異度が顕著水準０．０５と０．０１に達したことを表わしている。この図２５に示すように、濃度が１００、１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物ＤＣＭ、濃度が１０、１００、１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスエチルアセテート抽出物ＤＣＭＰｅ、濃度が１０又は１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスｎ−ブタノール抽出物ＰＣＭＰｂ、及び濃度が１００、１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイスｎ−ヘキサン抽出物ＤＣＭＰｈはいずれも顕著にＲＰＥ細胞がニトリックオキサイド生成作用に対する影響を促進する。関連する操作プログラムは以下に示される。先ず１０4 個ＲＰＥ細胞を９６槽培養盤（９６well culture plate）中に置き、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭで４８時間培養した。次に２％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培養液とした。しかる後、それぞれ不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を添加し、４８時間経過後、各槽内にそれぞれ濃度が２×１０7 ＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞／ｍｌの溶液５０μｌを添加した。４時間後ＰＢＳで余計なＦＩＴＣ−ＲＯＳ細胞を洗い流し、最後多重量定冷光検出系統（１４２０ Multilabel counter (PE) measure system）で蛍光強度のテストを行った。ここで不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）がＲＰＥ細胞のニトリックオキサイド生成作用に対して顕著な促進作用を有していることにより、霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を含み且つ生理活性を有する如何なる組成は、その他生理受容性のキャリヤを有する可能性があるだろうが、該組成はいずれも霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を含んでいるのでＲＰＥ細胞のニトリックオキサイド生成作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質である。例えば、膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
（１４）霍山デンドロビーコーリイス抽出物がＲＰＥ細胞の肝生長因子β−actinとＨＧＦ表現に対する促進作用
図２６（Ａ）−（Ｂ）は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物でＲＰＥ細胞を処理して得られたβ−actin（Ａ）及び（Ｂ）を表現する電気泳動図である。その中、これら生長因子の表現はＲＴ−ＰＣＲの方法により呈現される。図２６から分るように、霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物は明らかに、ＲＰＥ細胞の肝機能因子β−actin及びＨＧＦ表現に対する作用を促進する。その関連する操作プログラムを簡単に説明すると、先ず２％ＦＣＳ及び１０００μｇ／ｍｌを含んだ霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物のＤＭＥＭにおいて２４時間培養後電気泳動を行った。その中、１μｇ全ＲＮＡにより発生されたｃＤＮＡをβ−actin（Ａ）の型板（template）（1X）とし、０．５μｇ全ＲＮＡにより発生されたｃＤＮＡ量をＨＧＦ（Ｂ）の型板とした（1X）。第１のレイン（lane）はＸ１７４／Hae IIIを標記（marker）として得た結果である。第２のレインは１倍型板の電気泳動結果である。第３のレインは型板を両倍に希釈して得られた電気泳動結果である。第４のレインは型板を４倍希釈した後得られた電気泳動結果である。第５のレインは型板を８倍希釈した後に得られた電気泳動結果である。第６のレインは型板を１６倍に希釈した後に得られた電気泳動結果である。
図２６（Ａ）−（Ｂ）は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物でＲＰＥ細胞を処理して得られたβ−actin（Ａ）及び（Ｂ）を表現する電気泳動図である。その中、これら生長因子の表現はＲＴ−ＰＣＲの方法により呈現される。図２６から分るように、霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物は明らかに、ＲＰＥ細胞の肝機能因子β−actin及びＨＧＦ表現に対する作用を促進する。その関連する操作プログラムを簡単に説明すると、先ず２％ＦＣＳ及び１０００μｇ／ｍｌを含んだ霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物のＤＭＥＭにおいて２４時間培養後電気泳動を行った。その中、１μｇ全ＲＮＡにより発生されたｃＤＮＡをβ−actin（Ａ）の型板（template）（1X）とし、０．５μｇ全ＲＮＡにより発生されたｃＤＮＡ量をＨＧＦ（Ｂ）の型板とした（1X）。第１のレイン（lane）はＸ１７４／Hae IIIを標記（marker）として得た結果である。第２のレインは１倍型板の電気泳動結果である。第３のレインは型板を両倍に希釈して得られた電気泳動結果である。第４のレインは型板を４倍希釈した後得られた電気泳動結果である。第５のレインは型板を８倍希釈した後に得られた電気泳動結果である。第６のレインは型板を１６倍に希釈した後に得られた電気泳動結果である。
次に図２７は不同霍山デンドロビーコーリイス抽出物がＲＰＥ細胞のＨＧＦに対するｍＲＮＡ表現の電気泳動図である。この図２７から分るように、霍山デンドロビーコーリイスｎ−ヘキサン抽出物ＤＣＭＰｈは明らかにＲＰＥ細胞が肝機能因子β−actin及びＨＧＦ表現に対して促進する作用を有している。その関連な操作プログラムを簡単に説明すると、先ずＲＰＥ細胞を２％ＦＣＳと０．１μｇ／ｍｌとを含んだ不同霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ｎ−ヘキサン抽出物ＤＣＭＰｈ、エチルアセテート抽出物ＤＣＭＰｅ及びｎ−ブタノール抽出物ＤＣＭＰｂ）のＤＭＥＭ中に移入した。４８時間経過後電気泳動を行い、その中、１μｇ全ＲＮＡにより発生されたｃＤＮＡ量を型板とした（1X）。第１のレイン（lane）はＸ１７４／Hae IIIを標記（marker）として得られた結果である。第２レインはＨＧＦ制御組の電気泳動結果である。第３のレインはβ−actin制御組の電気泳動結果である。第４のレインは霍山デンドロビーコーリイスｎ−ヘキサン抽出物ＤＣＭＰｈでＲＰＥ細胞を処理して得られたＨＧＦ表現の電気泳動結果である。第５のレインは霍山デンドロビーコーリイスｎ−ヘキサン抽出物ＤＣＭＰｈでＲＰＥ細胞を処理して得られたβ−actin表現の電気泳動結果で、第６のレインは霍山デンドロビーコーリイスエチルアセテート抽出物ＤＣＭＰｅでＲＰＥ細胞を処理して得られたＨＧＦ表現の電気泳動結果である。第７のレインは霍山デンドロビーコーリイスエチルアセテート抽出物ＤＣＭＰｅでＲＰＥ細胞を処理して得られたβ−actin表現の電気泳動結果である。第８のレインは霍山デンドロビーコーリイスｎ−ブタノール抽出物ＤＣＭＰｂでＲＰＥ細胞を処理して得られたＨＧＦ表現の電気泳動結果である。第９のレインは霍山デンドロビーコーリイスｎ−ブタノール抽出物ＤＣＭＰｂでＲＰＥ細胞を処理して得られたβ−actin表現の電気泳動結果である。
また、不同濃度のデンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）はＲＰＥ細胞の肝生長因子β−actin及びＨＧＦの表現に対して顕著な促進作用を有していることにより、霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を有し且つ生理活性を有する如何なる組成は、その他に生理受容性を有するキャリヤを有する可能性があるけれども、該組成はいずれも霍山デンドロビーコーリイス抽出物（ＤＣＭ、ＤＣＭＰｈ、ＤＣＭＰｅ、ＤＣＭＰｂ）を含んでいるのでＲＰＥ細胞の肝生長因子β−actin及びＨＧＦの表現に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質である。例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
（１５）霍山デンドロビーコーリイスのＲＰＥ細胞に対して、正常及び酸素欠乏の状況下でｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βジーン表現に対する抑制作用
図２８（Ａ）ないし図２９（Ｂ）は霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭがＲＰＥ細胞に対して、正常状況下でβ−actin、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βジーン表現に対する作用を示し、その中β−actinのｍＲＮＡ表現を対照組とする。図２８（Ａ）ないし図２９（Ｂ）の結果から分るように、正常のＲＰＥ細胞の場合、そのｂＦＧＦ、ｍＲＮＡの表現量は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物に４倍抑制されている。そしてＶＦＧＦ、ｍＲＮＡの表現量は２倍に抑制されている。ＴＧＦ−β ｍＲＮＡの表現量になると特殊的な変化がない。この関連な操作プログラムを次に簡単に説明すると、先ずＲＰＥ細胞を２％ＦＣＳ及び１０００μｇ／ｍｌを含んだ霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭのＤＭＥＭ中に移入して培養した。４８時間経過後ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ方法により分析を進行し、その中の１μｇ全ＲＮＡにより発生したｃＤＮＡ量を型板（template）（1X）とした。第１のレイン（lane）はψＸ１７４を標記として得た結果であり、第２のレインは１００ｂｐはしご状物（ladder）を標記として得た結果であり、第３のレインは１倍型板の電気泳動結果であり、第４のレインは型板を２倍希釈して得た電気泳動結果であり、第５のレインは型板を４倍希釈して得た電気泳動結果であり、第６のレインは型板を８倍希釈して得た電気泳動結果であり、第７のレインは型板を１６倍希釈して得た電気泳動結果であり、第８のレインは型板を３２倍希釈した後に得た電気泳動結果である。
図２８（Ａ）ないし図２９（Ｂ）は霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭがＲＰＥ細胞に対して、正常状況下でβ−actin、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βジーン表現に対する作用を示し、その中β−actinのｍＲＮＡ表現を対照組とする。図２８（Ａ）ないし図２９（Ｂ）の結果から分るように、正常のＲＰＥ細胞の場合、そのｂＦＧＦ、ｍＲＮＡの表現量は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物に４倍抑制されている。そしてＶＦＧＦ、ｍＲＮＡの表現量は２倍に抑制されている。ＴＧＦ−β ｍＲＮＡの表現量になると特殊的な変化がない。この関連な操作プログラムを次に簡単に説明すると、先ずＲＰＥ細胞を２％ＦＣＳ及び１０００μｇ／ｍｌを含んだ霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭのＤＭＥＭ中に移入して培養した。４８時間経過後ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ方法により分析を進行し、その中の１μｇ全ＲＮＡにより発生したｃＤＮＡ量を型板（template）（1X）とした。第１のレイン（lane）はψＸ１７４を標記として得た結果であり、第２のレインは１００ｂｐはしご状物（ladder）を標記として得た結果であり、第３のレインは１倍型板の電気泳動結果であり、第４のレインは型板を２倍希釈して得た電気泳動結果であり、第５のレインは型板を４倍希釈して得た電気泳動結果であり、第６のレインは型板を８倍希釈して得た電気泳動結果であり、第７のレインは型板を１６倍希釈して得た電気泳動結果であり、第８のレインは型板を３２倍希釈した後に得た電気泳動結果である。
ここで、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭは正常状況下ではＲＰＥ細胞のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦに対して顕著な抑制作用を有していることにより、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭを有し且つ生理活性を有する如何なる組成は、他に生理受容性を有するキャリヤを有する可能性があっても、該組成がいずれも霍山デンドロビーコーリイス粗抽出物ＤｅＣａＭを含んでいるのでＲＰＥ細胞のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦの表現に対して抑制作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質であり、例えば、膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
図３０（Ａ）ないし図３１（Ｂ）はデンドロビーコーリイス粗抽出物ＤｅＣａＭをＲＰＥ細胞に対して、酸素欠乏状況（hypoxia）下でβ−actin、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βジーン表現に対する作用であり、その中β−actinのｍＲＮＡ表現を対照組とする。図３０（Ａ）ないし図３１（Ｂ）の結果から分るように、酸素欠乏ＲＰＥ細胞の場合、そのｂＦＧＦ ｍＲＮＡの表現量は霍山デンドロビーコーリイス粗抽出物に２倍抑制されており、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの表現量は２倍抑制されており、ＴＧＦ−β ｍＲＮＡの表現量は４倍に抑制されている。その関連な操作プログラムを次に示すと、先ずＲＰＥ細胞を２％のＦＣＳ及び１０００μｇ／ｍｌの霍山デンドロビーコーリイス粗抽出物ＤｅＣａＭを含んだＤＭＥＭ中に移入し４８時間培養後ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ方法により分析を行い、その中の１μｇ全ＲＮＡにより発生したｃＤＮＡ量を型板（template）（1X）とした。第１のレイン（lane）はψＸ１７４を標記として得た結果であり、第２のレインは１００ｂｐはしご状物（ladder）を標記として得た結果であり、第３のレインは１倍型板の電気泳動結果であり、第４のレインは型板を２倍希釈した後得られた電気泳動結果であり、第５のレインは型板を４倍希釈した後得た電気泳動結果であり、第６のレインは型板を８倍希釈した後に得た電気泳動結果であり、第７のレインは型板を１６倍希釈して得た電気泳動結果であり、第８のレインは型板を３２倍希釈した後に得た電気泳動結果である。
ここで、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭは酸素欠乏状況下でＲＰＥ細胞のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βの表現に対して顕著な抑制作用を有していることにより、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤｅＣａＭを有し且つ生理活性を有する如何なる組成は、他に生理受容性を有するキャリヤを有する可能性があっても、該組成がいずれも霍山デンドロビーコーリイス粗抽出物ＤｅＣａＭを含んでいるので、ＲＰＥ細胞のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βの表現に対して抑制作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質であり、例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。以上の内容から分るように霍山デンドロビーコーリイス抽出物は選択的に眼疾中において重要な役割を演ずるジーン、例えばｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β等ｍＲＮＡの表現を調節することができる。
（１６）テストパイプ内糖化アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ）の作製
０．１ｇ／ｍｌボビン漿液アルブミン（bovine serum albmin；ＢＳＡ）のフラクションＶ及び１８０ｍｇ／ｍｌグルコースを含有したＰＢＳを配置し、口径が０．２２μｍの無菌濾膜で濾過して、それぞれ５ｍｌ取り１５ｍｌテストパイプ中に加えた（反応濃度は７６０ｍＭ ＢＳＡ及び０．５Ｍグルコース）。また他にグルコースを含まない対照組をも作製し、密封後暗黒３７℃培養箱中に置いた。２、４、８、１２、１６週放置後取出した。４℃において１００倍体積の脱イオン（de-ionized）水で４回透析し、完全にグルコースを除去して無菌濾過で冷凍乾燥した後、定量に秤量して回溶分装後再度冷凍乾燥し、−２０℃の温度に置いて保存した。
０．１ｇ／ｍｌボビン漿液アルブミン（bovine serum albmin；ＢＳＡ）のフラクションＶ及び１８０ｍｇ／ｍｌグルコースを含有したＰＢＳを配置し、口径が０．２２μｍの無菌濾膜で濾過して、それぞれ５ｍｌ取り１５ｍｌテストパイプ中に加えた（反応濃度は７６０ｍＭ ＢＳＡ及び０．５Ｍグルコース）。また他にグルコースを含まない対照組をも作製し、密封後暗黒３７℃培養箱中に置いた。２、４、８、１２、１６週放置後取出した。４℃において１００倍体積の脱イオン（de-ionized）水で４回透析し、完全にグルコースを除去して無菌濾過で冷凍乾燥した後、定量に秤量して回溶分装後再度冷凍乾燥し、−２０℃の温度に置いて保存した。
（１７）霍山デンドロビーコーリイス抽出物とＨＧＦとがＲＰＥ細胞に対してＡＧＥ−ＢＳＡ能力を減成する影響
関連な操作フローチャートを次に説明する。
９６槽の培養盤（９６well culture plate）中に１×１０6 個ＲＰＥ細胞を移し、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培養液として、３７℃の温度において、大気中５％ＣＯ2 を含む条件下で４８時間培養した。合せて５組の実験処理で各組２盤処理し、３６、４８時間実験処理後０．０１％ＥＤＴＡ処理で細胞をＤＭＥＭ中に打落し置き、細胞数を計算した。５組の処理条件はそれぞれ次の表に表される。
関連な操作フローチャートを次に説明する。
９６槽の培養盤（９６well culture plate）中に１×１０6 個ＲＰＥ細胞を移し、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培養液として、３７℃の温度において、大気中５％ＣＯ2 を含む条件下で４８時間培養した。合せて５組の実験処理で各組２盤処理し、３６、４８時間実験処理後０．０１％ＥＤＴＡ処理で細胞をＤＭＥＭ中に打落し置き、細胞数を計算した。５組の処理条件はそれぞれ次の表に表される。
溶液は１２００ｒｐｍ遠心５分間後、細胞を再度１０ｍｌ ＤＭＥＭ中に２回懸け、再度０．７ｍｌ均質緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液［５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５、１ｍＭ dithiothreitol（ＤＴＴ）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、３ｍＭ窒化ナトリウムＮａＮ3 ］で離心し、０．１％を含んだTritonＸ−１００で懸濁した後超音波振動器で４回、毎回１５秒で徹底的に細胞を打破した。それから１３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、再び１５秒×４回で超音波振動を行い、１１０００ｒｐｍで１５分間遠心上澄液を収集した。無菌濾過して蛋白質濃度を計算しＡＧＥ及びＡＧＥ−ＢＳＡ減成の形式及び程度を電気泳動観察を行った。
（１８）霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物及び肝生長因子ＨＧＦがＲＰＥ細胞の蛋白質水解活性に対する影響
図３２は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物及び肝生長因子ＨＧＦがＲＰＥ細胞に対する蛋白質水解活性影響の電気泳動図である。この図３２では水解活性は各処理組の間において差異が大きくないが、１０μｇ／ｍｌ ＤＣＭ及び５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦでＲＰＥ細胞を処理して得られた水解作用と、処理を受けなかった制御組とを比較したところ、ＲＰＥ細胞の水解作用がいくらか増加していることがはっきり見えた。次に関連な操作ステップを説明する。１０6 個ＲＰＥ細胞を直径１０ｃｍの培養皿中に移入し、先ず１０％を含んだＦＣＳのＤＭＥＭ中でＲＰＥ細胞を４８時間培養した後、さらに２％を含んだＦＣＳ及び不同濃度の霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物又はＨＧＦ［（ａ）１００μｇ／ｍｌ、（ｂ）１０μｇ／ｍｌ ＤＣＭ、（ｃ）１μｇ／ｍｌ ＤＣＭ、（ｄ）５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ及び（ｅ）制御組のＤＭＥＭ］で４８時間培養した。しかる後、細胞の蛋白質（cellular extracts）を抽出して細分せずに、先ず蛋白質を定量して再びＡＧＥ−ＢＳＡと共同反応したところ、反応濃度は細胞抽出物（抽出された蛋白質）及びＡＧＥ−ＢＳＡがいずれも５００ｍｇ／ｍｌであり、つまり酵素（細胞抽出物）と反応基質（ＡＧＥ−ＢＳＡ）比は１：１で、８２時間培養した。その中、第１のレインはψＸ１７４を標記として得られた結果であり、第２のレインは細胞抽出物より得られた結果であり、第３ないし第８のレインは０〜８２時間の電気泳動結果であり、第９ないし第１０のレインは電気泳動を行って得られた結果である。
図３２は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物及び肝生長因子ＨＧＦがＲＰＥ細胞に対する蛋白質水解活性影響の電気泳動図である。この図３２では水解活性は各処理組の間において差異が大きくないが、１０μｇ／ｍｌ ＤＣＭ及び５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦでＲＰＥ細胞を処理して得られた水解作用と、処理を受けなかった制御組とを比較したところ、ＲＰＥ細胞の水解作用がいくらか増加していることがはっきり見えた。次に関連な操作ステップを説明する。１０6 個ＲＰＥ細胞を直径１０ｃｍの培養皿中に移入し、先ず１０％を含んだＦＣＳのＤＭＥＭ中でＲＰＥ細胞を４８時間培養した後、さらに２％を含んだＦＣＳ及び不同濃度の霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物又はＨＧＦ［（ａ）１００μｇ／ｍｌ、（ｂ）１０μｇ／ｍｌ ＤＣＭ、（ｃ）１μｇ／ｍｌ ＤＣＭ、（ｄ）５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ及び（ｅ）制御組のＤＭＥＭ］で４８時間培養した。しかる後、細胞の蛋白質（cellular extracts）を抽出して細分せずに、先ず蛋白質を定量して再びＡＧＥ−ＢＳＡと共同反応したところ、反応濃度は細胞抽出物（抽出された蛋白質）及びＡＧＥ−ＢＳＡがいずれも５００ｍｇ／ｍｌであり、つまり酵素（細胞抽出物）と反応基質（ＡＧＥ−ＢＳＡ）比は１：１で、８２時間培養した。その中、第１のレインはψＸ１７４を標記として得られた結果であり、第２のレインは細胞抽出物より得られた結果であり、第３ないし第８のレインは０〜８２時間の電気泳動結果であり、第９ないし第１０のレインは電気泳動を行って得られた結果である。
また図３３は図に基づいて描かれた、霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物及び肝生長因子がＲＰＥ細胞に対する蛋白質水解活性影響の折線図である。図３３に示すように水解作用の速率は１２から４８時間の作用時間中速度が比較的はやく、そして４８と８２時間との間に培養した減成形式は不同処理間において僅に些細な差異を見た。そして４８時間培養した時、１０ｍｇ／ｍｌ ＤＣＭがＲＰＥ細胞水解活性に対する影響が最も強く、そして１００μｇ／ｍｌ ＤＣＭ及び５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦの効果はその次につぐ。
このように、霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物及び肝生長因子がＲＰＥ細胞の蛋白質水解活性に対して促進作用を有していることから、霍山デンドロビーコーリイス抽出物又はＨＧＦを有し且つ生理活性を有する組成は、他に生理受容性を有したキャリヤを有する可能性があっても、該組成が霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭ又はＨＧＦを含んでいるので、ＲＰＥ細胞の蛋白質水解活性に対して促進作用を有する。その中該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯できる如何なる物質である。例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
（１９）低剤量のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で自体免疫糖尿病併発症を誘導建立する動物モデル
図３４は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物が糖尿病を有するラット体内のＡＧＥ含量に対する影響柱形図である。図３４に示すように、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭで糖尿病を有するラットを処理した後、該ラット体内のＡＧＥ含量は明らかに降下し、つまり、この動物試験により霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物は確実にＡＧＥ含量を減少する効果を有する。その関連する操作プログラムを説明すると、先ず６週大きさのＣ５７ＢＬ／６Ｊラットを取り、ｐＨ４．５、濃度が０．１５Ｍのレモン酸緩衝液（citric acid buffer）によりＳＴＺを毎日１ｋｇ体重毎に５０ｍｇの剤量でラット体内に注入し、連続５日注射した。このように１２〜１４日注射した後眼窩採血で測定したところ、血糖濃度が２５０ｍｇ／ｄｌよりも大きくなってから始めて需要に達した。この需要に符合するラットを４組に分け、それぞれ体重の差異に応じて不同剤量を含んだデンドロビーコーリイスメタノール抽出物の飼料（０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１ｇ／ｋｇ／ｄａｙ、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ及び４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で飼い、毎週一回採血して観察し、もし血糖が下がれば再度２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの剤量でＳＴＺを注射してラットを高血糖の環境中にさせ、約４〜８週後、眼窩血を取り血糖及びＡＧＢ ＡＢを測定した。また眼晴、肝、腎を取り、石ろう包埋切片にして先ずHe stainで病理変化を観察した。実験中においては体重、飲水、飼料の消耗量を記録した。同時にラットの外観、皮毛の変化、四足及び尾血液循環状況に注意し写真を取って記録した。その符号「＊」で該制御組と比較して得た差異が顕著水準０．０５に達していることを表わし、「＊＊」で差異度が顕著水準０．０１に達していることを表わす。
図３４は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物が糖尿病を有するラット体内のＡＧＥ含量に対する影響柱形図である。図３４に示すように、霍山デンドロビーコーリイス抽出物ＤＣＭで糖尿病を有するラットを処理した後、該ラット体内のＡＧＥ含量は明らかに降下し、つまり、この動物試験により霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物は確実にＡＧＥ含量を減少する効果を有する。その関連する操作プログラムを説明すると、先ず６週大きさのＣ５７ＢＬ／６Ｊラットを取り、ｐＨ４．５、濃度が０．１５Ｍのレモン酸緩衝液（citric acid buffer）によりＳＴＺを毎日１ｋｇ体重毎に５０ｍｇの剤量でラット体内に注入し、連続５日注射した。このように１２〜１４日注射した後眼窩採血で測定したところ、血糖濃度が２５０ｍｇ／ｄｌよりも大きくなってから始めて需要に達した。この需要に符合するラットを４組に分け、それぞれ体重の差異に応じて不同剤量を含んだデンドロビーコーリイスメタノール抽出物の飼料（０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１ｇ／ｋｇ／ｄａｙ、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ及び４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で飼い、毎週一回採血して観察し、もし血糖が下がれば再度２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの剤量でＳＴＺを注射してラットを高血糖の環境中にさせ、約４〜８週後、眼窩血を取り血糖及びＡＧＢ ＡＢを測定した。また眼晴、肝、腎を取り、石ろう包埋切片にして先ずHe stainで病理変化を観察した。実験中においては体重、飲水、飼料の消耗量を記録した。同時にラットの外観、皮毛の変化、四足及び尾血液循環状況に注意し写真を取って記録した。その符号「＊」で該制御組と比較して得た差異が顕著水準０．０５に達していることを表わし、「＊＊」で差異度が顕著水準０．０１に達していることを表わす。
また霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物は確実にＡＧＥ量を効果を有していることから、霍山デンドロビーコーリイスメタノールＤＣＭを有し且つ生理活性を有しているいかなる組成は、他に生理受容性を有するキャリヤを有する可能性であっても、該組成がいずれも霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物ＤＣＭを含んでいるので、体内のＡＧＥ含量を降下することに効果を有する。その中該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質であり、例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている）であってもよい。
以上の内容から分るように、本出願人は鋭意試験と研究とを重ねた結果、ついに霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物は確実に網膜黒色素上皮（retinal pigment epithelieum；ＲＰＥ）細胞の作用を調節制御できると共に、間接的にその関連機制を影響する。本発明により提出された霍山デンドロビーコーリイス抽出物はＲＰＥ細胞の呑食作用、ニトリックオキサイド生成作用、肝生長因子表現等作用に対して促進効果を有する外に、体内のＡＧＥ含量をも減少できる。また他に、正常又は酸素欠乏を問わず、霍山デンドロビーコーリイス抽出物はＲＰＥ細胞内の血管内皮生長因子（vascular endothelial growth factor；ＶＥＧＦ）、生長因子を変換（transforming growth factor-beta；ＴＧＦ−β）、及び繊維母細胞生長素（basic fibroblast growth factor；ｂＦＧＦ）のジーン表現に対していずれも顕著な抑制作用を有する。したがって、霍山デンドロビーコーリイス抽出物を含む如何なる組成物、例えば霍山デンドロビーコーリイス抽出物及びその生理受容性キャリヤの生理活性を有する組成物はいずれも本発明により提出された各霍山デンドロビーコーリイス抽出物を有しているので上記の効果を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質であり、例えば膠錠（内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が盛られている）であってもよい。
また網膜黒色素上皮細胞、体内のニトリックオキサイド生成作用、肝生長因子、体内のＡＧＥ含量、ＲＰＥ細胞内の血管内皮生長因子（ＶＥＧＥ）と繊維母細胞生長素（ｂＦＧＦ）の作用及び変換生長因子（ＴＧＦ−β）のジーン表現は心血管病、神経病、腎臓病、肝臓病、眼疾及び自体免疫等病気と関係する（本出願の先行技術内容を参照されたし）。
そして本発明の霍山デンドロビーコーリイス抽出物はまた網膜黒色素上皮細胞量、ニトリックオキサイド生成作用、肝生長因子作用、体内ＡＧＥ量、ＲＰＥ細胞内の血管内皮生産因子（ＶＥＧＦ）と繊維母細胞生長素（ｂＦＧＦ）の作用及び変換生長因子（ＴＧＦ−β）のジーン表現と関連するので、本発明の霍山デンドロビーコーリイス抽出物も、動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、ＲＰＥ細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性と腎糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病及びその併発症、及び敗血性ショック等の病気に対して影響を有する。また、本発明の実際応用範囲も非常に広く、網膜上皮細胞と体内ＡＧＥ含量の作用に限定されない。そして本発明は関連抽出物応用の最初の例であるので、本発明が顕著な新規性及び進歩性を有していることは言うまでもない。
上記の実施の形態は本発明をより具体的に説明するためにあげたもので、当然本発明はこれら実施の形態に限定されず、添付のクレームの範囲を逸脱しない限り、当業者による単純な設計変更、附加、修飾、置換はいずれも本発明の技術的範囲に属する。
Claims (3)
- 霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法であって、
（ａ）メタノールまたはエタノールで霍山デンドロビーコーリイス植物を抽出して第１のアルコール類抽出物を生ずるステップと、
（ｂ）先ずエチル−アセテートで、次いで水で前記第１のアルコール類抽出物を抽出して第１の水層抽出物を生ずるステップと、
（ｃ）エチル−アセテートで前記第１の水層抽出物を抽出してエステル抽出物及び第２の水層抽出物を生ずるステップと、
（ｄ）ブタノールまたはｎ−ブタノールで前記第２の水層抽出物を抽出して第２のアルコール類抽出物及び第３の水層抽出物を生ずるステップと、
（ｅ）色層分析法で前記第２のアルコール類抽出物を色層分析して（chromatographing）第１の溶出物を得るステップと、
（ｆ）イソプロパノールと水で組成した混合物である第１の溶出剤で前記第１の溶出物を溶出して第２の溶出物を得るステップと、
（ｇ）メタノール／水／酢酸で組成した混合物で前記第２の溶出物へ色層分析を行う（chromatograph）ことにより第３の溶出物を生じるステップと
を備えてなる、霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法。 - 前記霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法において、前記第１の溶出物がＤＣＭＰｂＬ６，７と名付けられた、請求項１に記載の植物抽出物の調製方法。
- 前記霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法において、
ステップ（ｅ）は第２の溶出剤により実施され、
前記第２の溶出剤は体積比が１：１のメタノールと水との混合物により組成され、
前記第１の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比２０：８０で組成した混合物であり、且つ該第２の溶出物はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２と名付けられ、
前記ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２は更に、メタノール／水／酢酸を体積比３０：６５：１にて組成した混合物で色層分析を行う（chromatograph）ことにより前記第３の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２を生じ、
前記第１の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比３０：７０にて組成した混合物であり、そして前記第２の溶出物はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３と名付けられ、
前記ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３は更に一個のメタノール／水／酢酸を体積比４０：６０：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより前記第３の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３Ｈ３を生じ、
前記第１の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比４０：６０にて組成した混合物であり、そして該第２の溶出物の名称はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４と名付けられ、及び
前記ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４はさらに一個のメタノール／水／酢酸を体積比４５：５５：１にて組成した混合物で色層分析を行うことにより前記第３の溶出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４Ｈ３を生ずる、
請求項２に記載の植物抽出物の調製方法。
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