JP4422573B2 - 霍山デンドロビーコーリイス抽出物及びその調製方法 - Google Patents
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て、腎臓糸球体基膜(glomerular basement membrane)の糖化ではない(23)。Poduslo等の人達も1994年に、糖化した蛋白質はその疎通血脳バリア(blood brain barrier)の能力を増加すると指摘した。
上記アイディアによればその中のアルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによれば、該抽出物は生物体中の高度糖化終産物(advanced glycation end product;AGE)含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該心血管病は動脈硬化、血管損傷及び中風からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該神経変性は網膜神経細胞変性、RPE細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質変性及び脳部錐状神経変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該腎臓病は腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該眼疾は葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎及びブルチ氏膜変性からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該膵臓病は糖尿病及びその併発症からなる群より選ばれたものであり、ただし、これら群組に限定されない。
上記アイディアによれば、該水溶性有機溶剤は含炭素数が1〜8に介するアルコール類、アルキル類又はエステル類の中の一つである。
上記アイディアによれば、該アルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによれば該蘭科植物はジイナスデンドロビウムに属する。
上記アイディアによれば、該第1のアルコール類はメタノール又はエタノールである。
上記アイディアによれば、該第2のアルコール類は含炭素数1〜8のアルコール類である。
上記アイディアによれば、該第2のアルコール類はブタノール又はn−ブタノールである。
上記アイディアによれば、該アルキル類抽出物はn−ヘキサン抽出物である。
上記アイディアによれば、該エステル類はエチルアセテートである
上記アイディアによれば、該第2の溶出剤は体積比が1:1のメタノールと水との混合物により組成される。
上記アイディアによれば、該DCMPbL6,7D2は、さらに、メタノール/水/酢酸を体積比30:65:1にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第3の溶出物DCMPbL6,7D2H2を生ずる。
上記アイディアによれば、該DCMPbL6,7D3は更に一個のメタノール/水/酢酸を体積比40:60:1にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第4の溶出物DCMPbL6,7D3H3を生ずる。
上記アイディアによれば該DCMPbL6,7D4はさらに一個のメタノール/水/酢酸を体積比45:55:1にて組成した混合物で色層分析を行うことにより第5の溶出物DCMPbL6,7D4H3を生ずる。
上記アイディアによれば、該抽出物は生物体中の高度糖化終産物(advanced glycation end product;AGE)含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、RPE細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性、腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病及びその併発症及び敗血性ショックからなる群より選ばれた病気である。
上記アイディアによれば、該組成物は網膜黒色素上皮細胞(retinal pigment epithelium cell;RPE)を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は生物体中の高度糖化終産物(advanced glycation end product;AGE)含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、RPE細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜病変、糖尿病とその併発症及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
上記アイディアによれば、該化合物は網膜黒色素上皮細胞(retinal pigment epithelium cell;RPE)を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該化合物は生物体中の高度糖化終産物(advanced glycation end product;AGE)含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、RPE細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病及びその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
上記アイディアによれば、該組成物は網膜黒色素上皮細胞(retinal pigment epithelium cell;RPE)を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成物は生物体中の高度糖化終産物(advanced glycation end product;AGE)含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、RPE細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病とその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
上記アイディアによれば、該組成分は網膜黒色素上皮細胞(retinal pigment epithelium cell;RPE)を促進する作用を有する。
上記アイディアによれば、該組成分は生物体中の高度糖化終産物(advanced glycation end product;AGE)含有量を減少する作用を有する。
上記アイディアによれば、該生理受容性を有するキャリヤは薬理活性を有するキャリヤである。
上記アイディアによれば、該病気は動脈硬化、血管損傷、中風、網膜神経細胞変性、RPE細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、粘質細胞変性、網膜神経膠質細胞変性、脳部錐状神経変性、腎臓糸球体変性及び腎臓糸球体基膜変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、老年性黄斑変性、フォトリセプタ退化、網膜発炎、ブルチ氏膜変性、糖尿病とその併発症、及び敗血性ショックからなる群より選ばれたものである。
屠牛場から牛眼を取得し、ヨード酒で外表を消毒してから再度燐酸緩衝液(PBS)で二回洗滌し、解剖して水晶体、ガラス体、網膜等を除去した後、0.1%EDTAで40分間処理し、さらに5%トリプシンで15分間処理して円形鉗子で軽く圧し、吸管で軽吸数回後単一のRPE細胞を得た。溶液を吸出して10%の胎牛血清(fetal calf serum;FCS)の培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium;DMEM)中に置き、37℃において5%CO2 飽和湿度の培養箱中で培養する。5〜6日毎に新培養液を取替え、いっぱいに生長したら0.05%トリプシン及び0.02%のエチレンジアミンテトラ酢酸で継続処理する。本実験は主として第5代、第6代で生物活性のテストを進行する。
屠牛場から新鮮な牛眼を取得し、氷上で30分間照光した後先ずヨードで外表を消毒し次にハンク氏バッファで二回洗滌した。次に解剖して水晶体、ガラス体を除去し、網膜を小砕片に鋏み切って20%のシュクロースを含有した20mM Tris−HCl溶液中に置き、4℃の氷箱で3時間撹拌して、それぞれNo.300,220,110,74,53,10メッシュの濾過膜で濾過する。濾液中の細胞数を計算し、管毎に1×108 ROS細胞を分装し−20℃の氷箱に置いて保存させる。
ROS解凍後除去した上澄液を取出し、700ml(含10%シュクロース)の硼酸塩緩衝液(pH8.0)を添加して混和した後、再度ROSの1/1000重量の蛍光物質fluorescein isothiocyanate(FITC)粉末を添加して、4℃の温度において1.5時間回転した。含20%シュクロースの20mMトリス−アセテート(pH7.2)を利用してROSと混和してないFITCを洗滌して除去し、10000rpmで10分間遠心し、数回重複して再度シュクロースのDMEM中に溶解した。
RPE細胞を5×104 cells/mlに調製して200mlを96ウエルプレート中に吸取らせ、いっぱいに生長した後新培養液を取替え、さらに不同濃度のテスト用薬物20mlを各ウエルに添加すると共に胎牛血清の含量を2%〜5%間に置かさせ、48時間培養した後、50mlの2×107 FITC−ROS/mlを各ウエル中に添加して4時間培養した。
100ml細胞培養上澄液に50mlの2,3−ジアミノナフタリン(DAN)を添加して室温中で十分間作用した後、25mlの2.8NのNaOHを添加して反応を中止させ、さらに細胞蛍光測定機(Cyto-Fluorometer2300(基態360±40nm、激態400±40nm)で測定した。得られた値は既知濃度、亜硝酸ナトリウム(NaNO2 )により作り出された標準曲線からニトリックオキサイド濃度を換算して算出したものである。
網膜色素上皮細胞を100mm培養盤(1×106 cells in DMEM+10%FCS)で培養し、いっぱいに生長した後新培養液(含2.5%FCSのDMEM)に取替え、霍山デンドロビーコーリイス化学溶媒分層法の区分物を0.1μg/ml添加し、48時間培養した。先ず培養液を除去し、凍り付いたPBS緩衝液で二回洗滌した後、1ml/105 −106 cellsのRNA zol TMB添加し5分間静置した。次にこそぎ杓で細胞を組織培養盤の上から下へ刮ぎ、1.5mlの遠心管内に移して1/10倍の体積量のクロロフォルムを添加した。そして快速に揺動混和して均一にした後、氷の上に5分間静置して4℃の温度下で12000rpmの高速度遠心を15分間行った。しかる後注意深く上層の透明水層を吸取り、他の1.5mlの遠心管内に移して等体積のイソプロパノールを添加して均一に混和し、再度氷上で5分間静置した。そして、4℃の温度で12000rpmの高速度で10分間遠心し上澄液を除去し、70%のエタノールで沈澱部分を洗浄した。さらには4℃の温度及び7500rpmを通して8分間遠心を行い、エタノールを除去乾燥した。しかる後、含0.1%ジエチルピロカーボネート,DEPC)の既に4回処理した水を溶解し、その一部を取りOD260で定量すると共に、OD260/OD280で純度を判定した。剰余の部分は70%のエタノールで保存し、−20℃の温度下に置いた。
それぞれ加薬組と対照組とのRPE細胞より抽出された全RNA5mgを取り、2.5mgのOligo dTを添加して、70℃の温度10分間後室温で10分間置いた。そしてさらに10mM試薬(dNTP)2ml・rRNasin 1ml、Avian Myeloblastosis virus;AMV、reverse transcriptase 1ml(10unit)、及びその緩衝液を添加して反応体積を20mlにした。しかる後42℃の温度にて50分間反応し、さらに90℃の温度にて5分間加熱した後、氷上に10分間置いた。最後、rRNAaseH 1ml添加して37℃の温度で30分間反応した。逆転写反応のcDNA及び不同倍数希釈したcDNAを取り、2mM dNTP 5ml添加し及び各管に検出したい因子(primer):β−actin及び各種標的のジーン(gene)のsense及びantisense Primer 0.1mg/ml各1ml、ポリマレース(polymerase)1ml(2単位)及びその緩衝液を添加した。作用体積は20mlで、条件は変性処理(denaturing)が94℃、1.5分間で行われ、アニーリングが57℃、1.5分間で行われ、延長(extension)は72℃、2分間、DNA thermal cycler(Perkin-Elmer-Cetus)でPCR反応を行う。β−actin反応は25サイクル、HGF反応は35個サイクルである。
Sense,21mer:5’-GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA-3’
Antisense,21mer:5’-CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA-3’
2.VEGF primer:
Sense,24mer:5’-AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT-3’
3.bFGF primer:
Sense,19mer:5’-CCA AGC GGC TGT ACT CCA A-3’
4.TGF−β primer:
Sense,24mer:5’-CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG-3’
Antisense,24mer:5’-ACG ATC ATG CAC AAC TGC TCC-3’
(a)牛糖化アルブミンの作製
一倍のPBSでアルブミン(フラクションV)を1mMに希釈し、0.22μmの無菌濾過膜で濾過した後、0.22μm無菌濾過膜で濾過した250mMグルコースを37℃培養箱中に置いて糖化作用を進行した。3週後反応液を透析して余ったグルコースを除去した後、ConA-Sepharoseゲルで純化を行い、透析後冷凍して乾燥保存した。
一倍のPBS(pH7.4)でアルブミン(フラクションV)を100mg/ml(1.51mM)に希釈し、0.22μmの無菌濾過膜で濾過した後、等体積の一倍のPBS(pH7.4)を0.22μm無菌濾過膜で濾過した後の1.8g/ml(1M)のD−グルコースをガラス管内に溶解させ、37℃培養箱に置いて黒やみの中で糖化反応を行い、60日後反応液を透析袋中に置いて余計なグルコースを除去する。しかる後、再度0.22μm無菌濾過膜で濾過して、蛋白質濃度を測定後分装し、冷凍乾燥後−20℃の温度に保存して使用に供する。
アルブミン100mg、FITC 1.8mgを取り、15ml 0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(Sodium carbonate buffer,pH9.5)に溶解して、25℃の温度において光を避けながら5時間撹拌した。そしてHW−55F(1.6×100cm)分子ふるい柱で分離を進行し、全プロセス的に光を避けながら、5%(v/v)のn−ブタノール溶出緩衝液とし、自然流速で分離を行う。分離したサンプルを三回水で透析を行い、蛋白質定量後無菌濾過し、冷凍乾燥で分装して蛍光を測定すると共に蛍光の当量比を計算量定した。
事前に滅菌清潔したガラス片を24槽培養盤(24 well culture plate)中に置き、300μl 0.5%ゲルで30分間塗布し、更に培養液で塗布したゲルを洗い流した。RPE細胞は毎槽5×104 個細胞(5×104 cell/well)の細胞数目で10%FCS/DMEMを用いてガラス片を被せてある24 well plate中に培養した。各盤内には0.7mlの培養液があり、48時間後に細胞がいっぱいに生長した後培養液を吸取り除去し、0.5ml培養液で三回洗い、30〜300μg/ml不同濃度のFITC−BSA DMEMを培養液0.5ml中に加えた。PBSでこの細胞を四回洗滌し、まだ呑食されていないか又は結合した蛍光を洗い除去する。ガラス片を取出して含1%FQEBのPBSで湿潤し、封片後すぐ蛍光顕微鏡で観察した。
1)霍山デンドロビーコーリイスの抽出物の調製
粉砕機で2kgのデンドロビーコーリイスを粉砕した後メタノール又はエタノールを添加して全夜浸潤した後フィルタネットで残渣を除去すると共に、吸気濾過方式で濾過した後減圧濃縮を行い、繰り返し三回浸潤した。メタノール又はエタノールが完全に吸気乾燥された後、デンドロビーコーリイスがアルコール類から抽出して得たことから、アルコール類粗抽出物をDeCaMと名付けた。
400mlの水で三回溶出した後等量のn−ヘキサンで3回分層し、DCMPhと名付けた。水層はエチル−アセテートで4回分層してEtOAc層を得、DCMPeと名付けた。水層はさらにn−ブタノールで3回分層し、n−ブタノール層及び水層を得、それぞれDCMPb及びDCMPwと名付けた。
次の分離方法で霍山デンドロビーコーリイス活性成分を分離した。先ずメタノールで霍山デンドロビーコーリイス1.9kgをメタノールで三回約16リットル抽出した。減圧濃縮後乾燥してDCMと称するサンプルを得た。先ずエチル−アセテート(EtOAc)で2リットル溶解した後、再度等体積の水で分配抽出を行い、そして水層は再度等体積のエチル−アセテートで2回抽出し、エチル−アセテート(EtOAc)層と第2の水層を得た。このEtOAc抽出層を混和収集した後、減圧濃縮乾燥し、再度ヘキサン4リットル及びメタノール2リットルで3回分配抽出して2層を得、減圧濃縮後ヘキサン層(DCMPe/hと名付ける)及びメタノール層(DCMPe/m)サンプルを得た。第2の水層を2リットルに調整し、さらにブタノール2リットルで分配抽出し、減圧濃縮後ブタノール層(DCMPbと名付ける)及び第3の水層(DCMPw)サンプルを得た。PCMPbサンプルはLH20膠で分子管柱色層分析(2.5×107 cm、移動層はメタノール:水=50:50)を行い、活性な篩分を行った後得られた8個クロマトグラフィーピークの中の第6のクロマトグラフィーピークと第7のクロマトグラフィーピークの抽出物を収集してPCMPbL6,7サンプルと名付けた。次に、再度Diaion SP−20 SSで吸着管柱色層分析(1×30cm)を行い、イソプロパノール:水=20:80(体積比)の溶出液で第2のクロマトグラフィーピークを溶出し、DCMPbL6,7D2と名付けた。そしてイソプロパノール:水=30:70(体積比)の溶出液で第3のクロマトグラフィーピークの溶出をDCMPbL6,7D3と名付けた。またイソプロパノール:水=40:60(体積比)の溶出液で第4のクロマトグラフィーピークの溶出をDCMPbL6,7D4と名付けた。
図2は霍山デンドロビーコーリイス抽出物のRPE細胞呑食作用に対する影響の柱形図である。この図2に示すように、不同濃度の霍山デンドロビーコーリイスのメタノール抽出物(0.1,1,10,100μg/ml)のRPE細胞に対する呑食作用はいずれも顕著の促進効果を有する。そして濃度が10%のFCSも顕著にRPE細胞の呑食作用を促進することができる。これらに関連する操作のフローチャートを以下に示す。
図25は霍山デンドロビーコーリイス抽出物がRPE細胞対ニトリックオキサイド生成作用に対する影響柱形図である。この図25から分るように、不同の霍山デンドロビーコーリイス抽出物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)がRPE細胞対ニトリックオキサイド生成作用に対する影響は同一ではない。その中符号「#」及び「*」はそれぞれ得られた結果と2%FCSでRPE細胞を処理して得られたニトリックオキサイド生成作用の促進効果とを比較した時に得られた差異度が顕著水準0.05と0.01に達したことを表わしている。この図25に示すように、濃度が100、1000μg/mlの霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物DCM、濃度が10、100、1000μg/mlの霍山デンドロビーコーリイスエチルアセテート抽出物DCMPe、濃度が10又は1000μg/mlの霍山デンドロビーコーリイスn−ブタノール抽出物PCMPb、及び濃度が100、1000μg/mlの霍山デンドロビーコーリイスn−ヘキサン抽出物DCMPhはいずれも顕著にRPE細胞がニトリックオキサイド生成作用に対する影響を促進する。関連する操作プログラムは以下に示される。先ず104 個RPE細胞を96槽培養盤(96well culture plate)中に置き、10%FCSを含んだDMEMで48時間培養した。次に2%FCSを含んだDMEMを培養液とした。しかる後、それぞれ不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)を添加し、48時間経過後、各槽内にそれぞれ濃度が2×107 FITC−ROS細胞/mlの溶液50μlを添加した。4時間後PBSで余計なFITC−ROS細胞を洗い流し、最後多重量定冷光検出系統(1420 Multilabel counter (PE) measure system)で蛍光強度のテストを行った。ここで不同濃度の霍山デンドロビーコーリイス抽出物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)がRPE細胞のニトリックオキサイド生成作用に対して顕著な促進作用を有していることにより、霍山デンドロビーコーリイス抽出物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)を含み且つ生理活性を有する如何なる組成は、その他生理受容性のキャリヤを有する可能性があるだろうが、該組成はいずれも霍山デンドロビーコーリイス抽出物(DCM、DCMPh、DCMPe、DCMPb)を含んでいるのでRPE細胞のニトリックオキサイド生成作用に対して促進作用を有する。その中、該キャリヤは該抽出物又は該抽出物の同分異物を携帯して移動できる如何なる物質である。例えば、膠錠(内部には該抽出物又は該抽出物の同分異物が装入されている)であってもよい。
図26(A)−(B)は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物でRPE細胞を処理して得られたβ−actin(A)及び(B)を表現する電気泳動図である。その中、これら生長因子の表現はRT−PCRの方法により呈現される。図26から分るように、霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物は明らかに、RPE細胞の肝機能因子β−actin及びHGF表現に対する作用を促進する。その関連する操作プログラムを簡単に説明すると、先ず2%FCS及び1000μg/mlを含んだ霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物のDMEMにおいて24時間培養後電気泳動を行った。その中、1μg全RNAにより発生されたcDNAをβ−actin(A)の型板(template)(1X)とし、0.5μg全RNAにより発生されたcDNA量をHGF(B)の型板とした(1X)。第1のレイン(lane)はX174/Hae IIIを標記(marker)として得た結果である。第2のレインは1倍型板の電気泳動結果である。第3のレインは型板を両倍に希釈して得られた電気泳動結果である。第4のレインは型板を4倍希釈した後得られた電気泳動結果である。第5のレインは型板を8倍希釈した後に得られた電気泳動結果である。第6のレインは型板を16倍に希釈した後に得られた電気泳動結果である。
図28(A)ないし図29(B)は霍山デンドロビーコーリイス抽出物DeCaMがRPE細胞に対して、正常状況下でβ−actin、bFGF、VEGF及びTGF−βジーン表現に対する作用を示し、その中β−actinのmRNA表現を対照組とする。図28(A)ないし図29(B)の結果から分るように、正常のRPE細胞の場合、そのbFGF、mRNAの表現量は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物に4倍抑制されている。そしてVFGF、mRNAの表現量は2倍に抑制されている。TGF−β mRNAの表現量になると特殊的な変化がない。この関連な操作プログラムを次に簡単に説明すると、先ずRPE細胞を2%FCS及び1000μg/mlを含んだ霍山デンドロビーコーリイス抽出物DeCaMのDMEM中に移入して培養した。48時間経過後RNAを抽出し、RT−PCR方法により分析を進行し、その中の1μg全RNAにより発生したcDNA量を型板(template)(1X)とした。第1のレイン(lane)はψX174を標記として得た結果であり、第2のレインは100bpはしご状物(ladder)を標記として得た結果であり、第3のレインは1倍型板の電気泳動結果であり、第4のレインは型板を2倍希釈して得た電気泳動結果であり、第5のレインは型板を4倍希釈して得た電気泳動結果であり、第6のレインは型板を8倍希釈して得た電気泳動結果であり、第7のレインは型板を16倍希釈して得た電気泳動結果であり、第8のレインは型板を32倍希釈した後に得た電気泳動結果である。
0.1g/mlボビン漿液アルブミン(bovine serum albmin;BSA)のフラクションV及び180mg/mlグルコースを含有したPBSを配置し、口径が0.22μmの無菌濾膜で濾過して、それぞれ5ml取り15mlテストパイプ中に加えた(反応濃度は760mM BSA及び0.5Mグルコース)。また他にグルコースを含まない対照組をも作製し、密封後暗黒37℃培養箱中に置いた。2、4、8、12、16週放置後取出した。4℃において100倍体積の脱イオン(de-ionized)水で4回透析し、完全にグルコースを除去して無菌濾過で冷凍乾燥した後、定量に秤量して回溶分装後再度冷凍乾燥し、−20℃の温度に置いて保存した。
関連な操作フローチャートを次に説明する。
96槽の培養盤(96well culture plate)中に1×106 個RPE細胞を移し、10%FCSを含んだDMEMを培養液として、37℃の温度において、大気中5%CO2 を含む条件下で48時間培養した。合せて5組の実験処理で各組2盤処理し、36、48時間実験処理後0.01%EDTA処理で細胞をDMEM中に打落し置き、細胞数を計算した。5組の処理条件はそれぞれ次の表に表される。
図32は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物及び肝生長因子HGFがRPE細胞に対する蛋白質水解活性影響の電気泳動図である。この図32では水解活性は各処理組の間において差異が大きくないが、10μg/ml DCM及び50ng/ml HGFでRPE細胞を処理して得られた水解作用と、処理を受けなかった制御組とを比較したところ、RPE細胞の水解作用がいくらか増加していることがはっきり見えた。次に関連な操作ステップを説明する。106 個RPE細胞を直径10cmの培養皿中に移入し、先ず10%を含んだFCSのDMEM中でRPE細胞を48時間培養した後、さらに2%を含んだFCS及び不同濃度の霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物又はHGF[(a)100μg/ml、(b)10μg/ml DCM、(c)1μg/ml DCM、(d)50ng/ml HGF及び(e)制御組のDMEM]で48時間培養した。しかる後、細胞の蛋白質(cellular extracts)を抽出して細分せずに、先ず蛋白質を定量して再びAGE−BSAと共同反応したところ、反応濃度は細胞抽出物(抽出された蛋白質)及びAGE−BSAがいずれも500mg/mlであり、つまり酵素(細胞抽出物)と反応基質(AGE−BSA)比は1:1で、82時間培養した。その中、第1のレインはψX174を標記として得られた結果であり、第2のレインは細胞抽出物より得られた結果であり、第3ないし第8のレインは0〜82時間の電気泳動結果であり、第9ないし第10のレインは電気泳動を行って得られた結果である。
図34は霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物が糖尿病を有するラット体内のAGE含量に対する影響柱形図である。図34に示すように、霍山デンドロビーコーリイス抽出物DCMで糖尿病を有するラットを処理した後、該ラット体内のAGE含量は明らかに降下し、つまり、この動物試験により霍山デンドロビーコーリイスメタノール抽出物は確実にAGE含量を減少する効果を有する。その関連する操作プログラムを説明すると、先ず6週大きさのC57BL/6Jラットを取り、pH4.5、濃度が0.15Mのレモン酸緩衝液(citric acid buffer)によりSTZを毎日1kg体重毎に50mgの剤量でラット体内に注入し、連続5日注射した。このように12〜14日注射した後眼窩採血で測定したところ、血糖濃度が250mg/dlよりも大きくなってから始めて需要に達した。この需要に符合するラットを4組に分け、それぞれ体重の差異に応じて不同剤量を含んだデンドロビーコーリイスメタノール抽出物の飼料(0mg/kg/day、1g/kg/day、200mg/kg/day及び40mg/kg/day)で飼い、毎週一回採血して観察し、もし血糖が下がれば再度200mg/kg/dayの剤量でSTZを注射してラットを高血糖の環境中にさせ、約4〜8週後、眼窩血を取り血糖及びAGB ABを測定した。また眼晴、肝、腎を取り、石ろう包埋切片にして先ずHe stainで病理変化を観察した。実験中においては体重、飲水、飼料の消耗量を記録した。同時にラットの外観、皮毛の変化、四足及び尾血液循環状況に注意し写真を取って記録した。その符号「*」で該制御組と比較して得た差異が顕著水準0.05に達していることを表わし、「**」で差異度が顕著水準0.01に達していることを表わす。
Claims (3)
- 霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法であって、
(a)メタノールまたはエタノールで霍山デンドロビーコーリイス植物を抽出して第1のアルコール類抽出物を生ずるステップと、
(b)先ずエチル−アセテートで、次いで水で前記第1のアルコール類抽出物を抽出して第1の水層抽出物を生ずるステップと、
(c)エチル−アセテートで前記第1の水層抽出物を抽出してエステル抽出物及び第2の水層抽出物を生ずるステップと、
(d)ブタノールまたはn−ブタノールで前記第2の水層抽出物を抽出して第2のアルコール類抽出物及び第3の水層抽出物を生ずるステップと、
(e)色層分析法で前記第2のアルコール類抽出物を色層分析して(chromatographing)第1の溶出物を得るステップと、
(f)イソプロパノールと水で組成した混合物である第1の溶出剤で前記第1の溶出物を溶出して第2の溶出物を得るステップと、
(g)メタノール/水/酢酸で組成した混合物で前記第2の溶出物へ色層分析を行う(chromatograph)ことにより第3の溶出物を生じるステップと
を備えてなる、霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法。 - 前記霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法において、前記第1の溶出物がDCMPbL6,7と名付けられた、請求項1に記載の植物抽出物の調製方法。
- 前記霍山デンドロビーコーリイス植物抽出物の調製方法において、
ステップ(e)は第2の溶出剤により実施され、
前記第2の溶出剤は体積比が1:1のメタノールと水との混合物により組成され、
前記第1の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比20:80で組成した混合物であり、且つ該第2の溶出物はDCMPbL6,7D2と名付けられ、
前記DCMPbL6,7D2は更に、メタノール/水/酢酸を体積比30:65:1にて組成した混合物で色層分析を行う(chromatograph)ことにより前記第3の溶出物DCMPbL6,7D2H2を生じ、
前記第1の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比30:70にて組成した混合物であり、そして前記第2の溶出物はDCMPbL6,7D3と名付けられ、
前記DCMPbL6,7D3は更に一個のメタノール/水/酢酸を体積比40:60:1にて組成した混合物で色層分析を行うことにより前記第3の溶出物DCMPbL6,7D3H3を生じ、
前記第1の溶出剤はイソプロパノールと水とを体積比40:60にて組成した混合物であり、そして該第2の溶出物の名称はDCMPbL6,7D4と名付けられ、及び
前記DCMPbL6,7D4はさらに一個のメタノール/水/酢酸を体積比45:55:1にて組成した混合物で色層分析を行うことにより前記第3の溶出物DCMPbL6,7D4H3を生ずる、
請求項2に記載の植物抽出物の調製方法。
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