TW201726153A - 用於預防藥物毒性引起腎病變之組合物、其製備方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種蟬花菌絲體組合物的製備方法，其包含齊備一蟬花菌種；將菌種接種於含有培養基的平板後，成長成菌絲；將菌絲切取下來後接種於培養液中培養獲得菌絲溶液；將菌絲溶液倒入具有發酵液的發酵槽中，培養獲得菌絲發酵培養液；菌絲發酵培養液分離菌絲體並冷凍乾燥後磨成粉狀，即為蟬花菌絲體組合物。另提供一種蟬花菌絲體組合物用於製備預防或治療腎病變的醫藥品的用途，其中醫藥品含有蟬花菌絲體組合物以及其藥學上可接受的載劑，可有效預防或治療腎病變。

Description

用於預防藥物毒性引起腎病變之組合物、其製備方法及其用途

本發明係涉及一種蟬花菌絲體組合物；另涉及一種蟬花菌絲體萃取物，特別是具有N⁶ -(2-羥乙基)腺苷[N⁶ -(2-hydroxyethyl)-adenosine，HEA]與腺苷-5'-單磷酸(adenosine-5'-monophosphate，5'-AMP)的萃取物。本發明另涉及一種製備方法，特別是指蟬花菌絲體組合物的製備方法。本發明另涉及一種製備方法，特別是指萃取蟬花菌絲體組合物的製備方法。本發明另涉及一種藉由前述蟬花菌絲體組合物用於預防腎病變的組合物及其應用。

蟬花，又名金蟬花蟲草，學名Cordyceps cicadae ，屬於真菌界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipataceae)、蟲草屬(Cordyceps )，為傳統常用之中草藥，以增強免疫力與改善腎功能，野生蟬花被發現分佈於大陸雲南、浙江、福建及四川省，為主要產區，此外，在日本、韓國、及台灣也都陸續被發現，在日本大部份都是在福島縣以南的低海拔山林內被發現；在韓國則曾經在濟州島發現過蟬花的蹤跡；在台灣蟬花子實體則在北部山區竹林中被發現過，在其他地區包括泰國、東南亞、北美及歐洲，都曾經發現過蟬花記錄。

每年四月到八月份，已感染蟲草菌的山蟬會由蟲頭部開始抽生子實體，大概在二十天左右子實體的部分會露出土面，一般都會長出1個至2個，長度在2.5公分至7公分。蟬花是中國已使用幾千年的處方草藥，有文獻指出蟬花(Cordyceps cicadae )成分中有類似冬蟲夏草的胺基酸、蟲草多醣、甘露醇等成分。

根據中國傳統醫學的記載蟬花(C. cicadae )一直被認為是類似冬蟲夏草的藥物，其中部分成分如胺基酸(amino acids)、多醣(polysaccharides)及甘露醇(mannitol)都類似於冬蟲夏草的成分，蟬花也被記載是最有價值的傳統中藥之一。在野生子實體被發現具有免疫調節之功能。至於應用液態發酵方式生產之蟬花，為菌絲體型態，與野生或人工培養之子實體，其型態明顯不同，已知液態培養之菌絲體粉末，於90天亞急毒性試驗中，於每天2000 mg/Kg BW劑量下，並未發現有任何之毒性，包括體重、器官重量、血液學、血清與尿液生化值，以及腎臟組織切片等。

鎂離子參與體內各種的生理反應，並在許多離子通道中的活性調節扮演重要的角色。人體血清中的鎂離子大約有80%是經過腎臟過濾和再吸收，腎絲球過濾鎂離子大約有20%是在近端腎小管被重吸收，而70%亨氏循環被吸收，剩下的10%則是在遠端腎小管中被吸收。之前研究顯示，位於細胞膜上一類重要的陽離子通道家族(melastatin-related transient receptor potential，TRPM)中，TRPM6蛋白與TRPM7蛋白對於鎂離子濃度之穩定，具有極重要之角色，當鎂離子濃度失去恆定後，腎臟細胞受損，其中之TRPM6蛋白與TRPM7蛋白的表現會有明顯的下降趨勢，因此可以透過免疫組織染色切片的方式，來觀察TRPM6蛋白與TRPM7蛋白的表現，作為判斷是否腎臟組織受到傷害。

葡萄糖調節蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)，也被稱為免疫球蛋白結合蛋白(binding protein，Bip)或熱休克蛋白A5(heat shock proteins A5，HSPA5)屬於HSP70家族中的成員之一，具有調節鈣離子功能，是內質網中重要的調節器之一，有助於鈣離子在內質網中的平衡。在內質網平衡的情況下，GRP78蛋白會與三種蛋白分別為活化轉錄因子6 (activating transcription factor 6，ATF6)、蛋白激酶類內質網激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)與LRE1(laminarinase resistance 1)結合且不具任何活性；當內質網受損時便會誘發原本結合在ATF6、PERK、IRE1上的GRP78蛋白脫離，並與未摺疊的蛋白結合。此時細胞就會啟動適應性的反應，來紓解細胞內過多的錯誤摺疊蛋白，當內質網中堆積過多錯誤摺疊蛋白，就會使得內質網產生內質網氧化壓力(endoplasmic reticulum stress，ER stress)。在這個情況下GRP78蛋白就會從未摺疊蛋白傳導器(unfolded protein response sensors，UPR sensors)上被釋放出來，進而使得該途徑被啟動活化。有文獻證實環孢靈(cyclosporine A，CsA)會導致細胞的壞死及腎小管的空泡化，最主要之因素是因為內質網壓力的產生，使得葡萄糖調控GRP78蛋白被大量表現，因而啟動下游訊號途徑，最後就會使得細胞被誘導走向凋亡的途徑。

有鑑於蟬花菌絲體的成份與功效目前尚無被廣泛地研究與應用，且內質網壓力所造成的腎病變尚無有效預防或治療的方式，因此現有技術實有待改善的必要。

為了克服現有技術之缺點，本發明的目的在於提供一種蟬花菌絲體組合物，該蟬花菌絲體組合物並能有效用於預防腎病變。

為達到上述之發明目的，本發明提供一種蟬花(Cordyceps cicadae )菌絲體組合物的製備方法，其包含：齊備一蟬花(Cordyceps cicadae)菌種，其係取自臺灣食品工業發展研究所編號BCRC MU30106；將菌種接種於含有培養基的平板後，成長成菌絲；將菌絲切取下來後接種於培養液中，以轉速100 G至500 G培養1天至5天獲得菌絲溶液；將菌絲溶液倒入具有發酵液的發酵槽中，調整酸鹼值至4.5至5.5後繼續培養3天至5天，獲得菌絲發酵培養液；以及菌絲發酵培養液離心取出菌絲體，並將菌絲體冷凍乾燥後磨成粉狀，即為蟬花菌絲體組合物。

較佳的，所述之菌絲溶液倒入具有發酵液的發酵槽中的步驟中，調整酸鹼值至5後繼續培養4天，獲得菌絲發酵培養液。

更佳的，所述之發酵液包含蔗糖、黃豆粉、酵母萃取物或其組合。

較佳的，所述之菌絲切取下來後接種於培養液中，以轉速100 G培養3天獲得菌絲溶液。

本發明另提供一種蟬花菌絲體萃取物的製備方法，其包含：齊備一如前述之蟬花菌絲體組合物的製備方法所製得蟬花菌絲體組合物；以及將蟬花菌絲體組合物溶於甲醇後，以超音波震盪進行萃取，得到蟬花菌絲體萃取物。

較佳的，所述之甲醇係為20%至100%甲醇。

更佳的，所述之甲醇係為60%甲醇。

較佳的，所述之溶於甲醇的蟬花菌絲體以超音波震盪進行萃取的步驟中後，歷經濃縮至乾燥，再以甲醇回溶，並經過過濾後得到蟬花菌絲體萃取物。

本發明另提供一種蟬花菌絲體萃取物，其係由前述之蟬花菌絲體萃取物的製備方法所製得。

較佳的，所述之蟬花菌絲體萃取物包含鳥嘌呤(guanine)、腺甘酸(adenosine)、鳥苷-5’-單磷酸(guansine-5'-monophosphate，GMP)、N⁶ -(2-羥乙基)腺苷[N⁶ -(2-hydroxyethyl)-adenosine，HEA]、以及腺苷-5’-單磷酸(adenosine-5'-monophosphate，5’-AMP)。

本發明另提供一種蟬花菌絲體萃取物，其係包含鳥嘌呤、腺甘酸、鳥苷-5’-單磷酸、N⁶ -(2-羥乙基)腺苷以及腺苷-5’-單磷酸。

本發明另提供一種如前述之蟬花菌絲體組合物用於製備預防或治療腎病變的醫藥品的用途，其中醫藥品含有有效劑量之蟬花菌絲體組合物以及其藥學上可接受的載劑。

本發明所述之「腎病變(nephropathy)」，是指腎臟的疾病或是功能損傷，可能是腎臟組織細胞內的內質網壓力的產生，而導致可能有尿素氮(urea nitrogen)廓清率下降、肌肝酸(creatinine)廓清率下降、腎小管裂解及腎絲球萎縮等情形。

較佳的，所述之醫藥品含有蟬花菌絲體組合物之有效劑量係介於每日每公斤350毫克(mg/kg/day)至4000 mg/kg/day。

更佳的，所述之醫藥品含有蟬花菌絲體組合物之有效劑量係介於每日每公斤389 mg/kg/day至3890 mg/kg/day。

本發明所述之「有效劑量」係指在劑量上及對於所需要之時間而言對預防或治療腎病變有效之量；藥物劑量换算根據Reagan-Shaw et al. (The FASEB Journal 22: 659-661, 2007)提出的論述，成年人有效劑量(mg/kg)=動物劑量 (mg/kg) × 大鼠Km 值 /成年人Km 值 (大鼠Km 值為6、成年人Km 值為37) ，因此大鼠每次使用的環孢靈劑量(10 mg/kg)换算至成年人(體重60公斤)的劑量為97.3毫克/次；大鼠每次使用的蟬花菌絲體劑量40 mg/kg，换算至60公斤成年人的劑量為每次389.2毫克；蟬花菌絲體劑量400 mg/kg，换算至60公斤成年人的劑量為每次3.89克。

本發明所述之「醫藥學上可接受之載劑」包含，但不限於溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

本發明所述之「醫藥品」可以多種形式存在，該等形式包含，但不限於液體、半固體及固體藥劑形式，諸如溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(slurry)、脂質體、栓劑以及其他類似或適用本發明之劑型。

較佳的，所述之醫藥品係經腸道的或非經腸道的劑型。

更佳的，所述之該經腸道的劑型係口服劑型，其口服劑型係溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。

本發明另提供一種如前述之蟬花菌絲體組合物用於製備預防或治療藥物毒性造成的腎病變的醫藥品的用途，其中醫藥品含有有效劑量之蟬花菌絲體組合物以及其藥學上可接受的載劑。

本發明所述之「藥物毒性」，是指可能由於免抑制劑例如環孢靈等藥物造成腎病變的情形。

本發明的優點在於本發明之蟬花菌絲體組合物，藉由本發明之蟬花菌絲體組合物的製備方法，其製備過程簡易；且由本發明得知蟬花菌絲體萃取物具有鳥嘌呤、腺甘酸、鳥苷-5’-單磷酸、N⁶ -(2-羥乙基)腺苷以及腺苷-5’-單磷酸。本發明之蟬花菌絲體組合物可有效預防或治療腎病變。

以下配合圖式及本發明之較佳實施例，進一步闡述本發明為達成目的所採取的技術手段。

製備例1 蟬花菌絲體組合物之製備

本發明所使用之蟬花菌絲體組合物，係以液態發酵方式製備，其菌種經食品工業發展研究鑑定為Isaria cicadae (有性世代為Cordyceps cicadae )之菌種，編號BCRC MU30106。首先將菌種以每毫升10⁵ 顆(cell/mL)的菌量接種於平板上，平板培養基為馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基(potato dextrose agar)於25ºC培養4天後長成菌絲，再將生長於平板培養基上的菌絲與培養基塊體一起切取下來並接種於含有1公升的培養液三角燒瓶中，其中培養液含有2.5% (w/v)的蔗糖、1.2% (w/v)的黃豆粉(soybean powder)與0.8% (w/v)的酵母菌萃取物(yeast extract)。每個燒瓶含有大小約25平方公釐(mm² )的菌絲體塊，以震盪培養箱以轉速為100 G於25ºC培養三天獲得菌絲溶液；將1公升的菌絲溶液倒入含有300公升的培養液於發酵槽中(含7500克蔗糖、3600克黃豆粉及2400克酵母萃取物為碳氮源)，調整酸鹼值至5.0後，通入空氣繼續培養4天獲得菌絲發酵培養液。所得菌絲發酵培養液以離心機轉速為2.4 G分離菌絲體與懸浮液，取菌絲體進行冷凍乾燥，乾燥之結塊磨粉後，即得蟬花菌絲體組合物。

製備例2 蟬花菌絲體萃取物的製備

取製備例1並精秤1克蟬花菌絲體組合物，利用不同濃度(0%、20%、40%、60%、80%與100%)的甲醇20 mL，於室溫下超音波震盪萃取重覆三次後，分別合併相同濃度之甲醇萃取液並減壓濃縮至乾燥，以5 mL 100%甲醇回溶，經過0.25微米(mm)過濾後得到蟬花菌絲體萃取物。

以下各組實驗數據以平均值與標準偏差(mean±SEM)表示。統計分析以單因子變異數分析(one-way analysis of variance，ANOVA)分析，並以鄧肯氏多變域測驗(Duncan’ s multiple range test)進行顯著差異性分析，以p ＜ 0.05 為顯著性差異。

實施例1 蟬花菌絲體成分分析含量

參考美國公認分析化學會(association of official analytical. chemists USA，AOAC，1995)標準測定方式，取製備例1中100克蟬花菌絲體粉末，分別測定水分含量、灰份、粗纖維、粗脂肪、總碳水化合物及粗蛋白。結果顯示，水份含量6.92%、灰份含量4.61%、粗脂肪含量7.81%、粗蛋白含量27.19%以及碳水化合物53.48%。

實施例2 蟬花菌絲體萃取物中核苷類之化合物成分

取製備例2的蟬花菌絲體萃取物，利用高效液相層析串聯質譜儀(mass spectrometry，MS)分析蟬花菌絲體萃取物中的核苷類化合物。分析方法：分離管柱：Eclipse Plus C18 (2.1´100毫米(mm)；1.8 mm particle size, Agilent)；保護管柱：Sceurity Guard C18 (ODS) (4 mm x 3.0 mm ID, Phenomenex Inc., Torrance, CA, U.S.A.)；管柱烘箱溫度：35°C；移動相：溶劑A (含有0.1%甲酸的水)；溶劑B [含有5毫莫耳濃度(mM)甲酸銨的甲醇]；流速：每分鐘0.3毫升(mL/min)；以下表1所述的時間、溶劑A與溶劑B為進行移動相之條件。檢測波長：210奈米(nm)至400 nm；質譜儀分析：電噴灑離子化法(electrospray ionization，ESI)，配合多重反應監控(multi reaction monitoring，MRM)方式測定。 表1、不同時間點溶劑A與溶劑B的比例

請參閱圖1及圖2所示，經過LC-ESI(+)-MS/MS-MRM與HPLC分析，共鑑定出五種化合物，其中以60%甲醇之萃取物圖2中編號3的HEA佔有相當高之比例(24.3%)，其次為編號5的5'-AMP，為首次被報導於蟬花菌絲體萃取物中存在之含量。請參閱圖3及圖4所示，並進一步將HEA以矽膠管柱層析純化；分離出單一物質後(如圖3所示)，並分析出分子量為180.1的HEA(如圖4所示)。

實施例3 大鼠腎功能生化與蛋白質分析

取製備例1 蟬花菌絲體組合物作為實驗。八週齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，共分成六組(一)控制組(control)；(二)環孢靈(CsA；10 mg/kg)組；(三)低劑量蟬花菌絲體(LCC；40 mg/kg)組；(四)高劑量蟬花菌絲體(HCC；400 mg/kg)；(五)低劑量蟬花菌絲體+環孢靈(LCC+CsA)；(六)高劑量蟬花菌絲體+環孢靈(HCC+CsA)組，每組六隻大鼠。以上各組皆以管灌餵的方式給予動物，每組給予飲水及飼料自由攝食飲用。在實驗期間控制組給予兩次生理食鹽水(當作其他五組的安慰劑)，CsA組除了給予環孢靈外再給予一次1 mL生理食鹽水(當作CsA組的安慰劑)，蟬花組除了給予蟬花菌絲體外再給予一次生理食鹽水(當作CsA的安慰劑)，每天一次共管餵7天。其中第(五)組及第(六)組每日先施予蟬花菌絲體，隔六個小時後再施予環孢靈。動物房的溫度設定在全天候22ºC至25ºC，光暗週期各為12個小時，實驗為期八天。在犧牲前24小時將老鼠放入代謝籠內收集24小時的尿液，收集完後利用二氧化碳將老鼠迷暈，以肝門靜脈採取老鼠的血液及採取腎臟，統一採取右邊的腎臟組織縱切1/2後以生理食鹽水潤濕，將組織放入福馬林中固定，左邊的腎臟組織分裝於1.5 mL微量離心管中放置於-80ºC冰箱備用，血液透過離心機離心轉速為500 G、4°C、15分鐘收集血清，將血清分裝於1.5 mL微量離心管中放置於-80ºC冰箱中備用。

(1) 血清及尿液腎功能生化值分析

血液及尿液生化值之分析是透過全自動生化分析儀(Hitachi-7180)進行分析。收集的血清及尿液檢測的項目包括尿素氮、肌肝酸、鈣離子、鎂離子、鈉離子、鉀離子，透過血液及尿液生化值來判定大鼠體內離子的表現及腎臟的功能的影響。請參閱圖5所示，利用尿素氮廓清率公式{urea nitrogen renal clearance = [U_BUN × V(mL)] / [S_BUN × T(min)]}計算，從圖5可得知經過環孢靈誘導腎損傷後，尿素氮的廓清率顯著下降，在CsA組及LCC+CsA、HCC+CsA組別相互比較下，在給予低劑量蟬花菌絲體的組別中尿素氮的廓清率有顯著上升，表示給予蟬花菌絲體具有保護腎臟之功效。

依肌酐酸廓清率(creatinine clearance rate，CCR)公式，肌酐廓清率公式(mL/min)=(尿液中肌酸酐×體積)/(血清中肌酸酐×時間)，以24小時之尿量、尿中肌肝酸含量及血清肌肝酸濃度計算腎臟每分鐘的過濾量(mL/min)，以此方法評估腎臟功能。當腎臟功能受到損傷後，肌酐酸的廓清率會隨著腎臟損傷功能而衰退。請參閱圖5所示，經過環孢靈誘導損傷的組別中，相較於CsA組別，在LCC+CsA的組別中肌酐酸的廓清率具統計學上顯著上升，HCC+CsA組別中肌酐酸的廓清率有上升的趨勢。

(2) 大鼠腎臟組織切片染色

利用切片機將包埋於石蠟中的組織切成薄片，將切好的組織薄片至於水浴槽中，再利用載玻片將組織蠟片撈起風乾(組織蠟片要平貼於載玻片上)，將組織切片60ºC烘箱中10分鐘進行脫臘，以二甲苯浸潤玻片兩次，每次4分鐘，在進行水合作用(依序為100%、95%、80%、70%、50%、35%乙醇)各一分鐘，沖洗蒸餾水3分鐘，以1%蘇木精(hematoxylin)染劑，染色15分鐘接著沖洗蒸餾水30秒Scott溶液5分鐘，再沖洗蒸餾水30秒，接著進行脫水作用(依序為35%、50%、70%乙醇)每次步驟沖洗15秒後再浸泡0.5%伊紅(eosin配置於70%乙醇)染劑，染色3分鐘至5分鐘，進行第二次脫水(依序為80%、90%、95%、99.5%乙醇)每個步驟15秒，最後利用二甲苯(100% xylene)浸潤兩次，每次3分鐘。封片使用溶脂性封片膠，乾燥後於顯微鏡下觀察。

請參閱圖6所示，腎臟組織透過HE染色(hematoxylin-eosin staining)，觀察大鼠腎臟組織在給予管灌餵蟬花菌絲體及環孢靈後腎臟組織的型態表現，可以知在控制組、LCC組、HCC組中的組織型態差異並不大，在CsA組別中可以知腎小管會有顯著裂解及腎絲球萎縮的情形，而在LCC+CsA組或HCC+CsA組中可以知，組織中的腎小管裂解及腎絲球萎縮的現象有獲得顯著的改善。

(3) 大鼠腎臟切片免疫組織化學染色

利用切片機將包埋於石蠟中的組織切成薄片，將切好的組織薄片至於水浴槽中，再利用載玻片將組織蠟片撈起風乾(組織蠟片要平貼於載玻片上)，將組織切片60°C烘箱中10分鐘進行脫臘，將脫完臘的切片浸泡在二甲苯中5分鐘(重複三次)，將切片依序取出浸泡於100%酒精中5分鐘(重覆兩次)，將切片取出浸泡於95%酒精中3分鐘一次，取出將切片浸泡於75%精中浸泡3分鐘一次，將取出切片浸泡於50%酒精中3分鐘一次，取出切片利用磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗5分鐘三次。石蠟包埋的組織切片用二甲苯脫去石蠟和復水之後，加入0.01 M的檸檬酸鈉溶液以4°C的PBS在冰桶上清洗3分鐘一次。將石蠟切片經過脫蠟覆水及細胞打洞之後加入3%過氧化氫(H₂ O₂ )溶於甲醇反應二10分鐘，利用清洗5分鐘(重覆三次)以PBS微波爐加熱至沸騰30分鐘；將切片置放於逆滲透(reverse osmosis，RO)水清洗3分鐘(重覆三次)後以過氧化物(peroxidase)填補(blocking)10分鐘，再用PBS清洗5分鐘(重覆三次)，放入一抗在4ºC冰箱隔夜反應。將切片於一抗隔夜反應之後，以PBS清洗5分鐘(重覆三次)加入二抗室溫下反應30分鐘，再以PBS清洗5分鐘(重覆三次)之後以二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)與成色劑反應10分鐘，置入蘇木精染色約十五秒之後將切片進行封片。

請參閱圖7A、圖7B、圖8A與圖8B所示，經環孢靈誘導損傷七天後，由免疫組織染色切片可見環孢靈的確造成大鼠的腎臟組織產生變化，使得鎂離子通道TRPM6與TRPM7的蛋白表現下降；而預先給予蟬花菌絲體，可見在腎臟組織鎂離子通道TRPM6與TRPM7的蛋白質表現與控制組無顯著差異，因此腎臟組織鎂離子通道TRPM6與TRPM7的蛋白質明顯受到保護。

(4) 大鼠腎臟組織偵測環孢靈所誘導葡萄糖調節蛋白(glucose-regulated protein 78，GRP 78)的蛋白質表現

蛋白質濃度的測定根據Bradford (1976)的方法加以修改，分別取0微升(μL)、10 μL、20 μL、40 μL、80 μL、100 μL胎牛血清蛋白(1 mg/mL，bovine serum albumin，BSA)到微量離心管，加入不同量的二次水，再加入200 μL染劑(BIO-RAD^TM protein-assay dye)均勻混合總體積為1 mL；以純水當做空白組，再加入待測蛋白透過分光光度計測波長595 nm的吸光值，再經由BSA標準曲線去求的未知樣品蛋白質濃度，即可求出未知樣品的蛋白質濃度。蛋白質電泳的方法是依據Laemli等人所提出來的方法，將蛋白質以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)透過分子量大小的分離後，膠體分為上膠與下膠兩個部分。將配好的下膠經由製膠玻璃邊緣注入，注入上膠後立即加入乙醇進行壓膠，以確保下膠的平整，待下膠凝固後就可將乙醇移除；利用二次水進行沖洗，沖洗過後即可配製上膠膠體，將配好的上膠膠體注入製膠玻璃內隨即插入齒梳，待上膠凝固後就可將齒梳移除。將蛋白質樣品與5倍的樣品緩衝液(5X sample buffer)以4：1的比例均勻混合、99°C加熱5分鐘，冷卻後將樣品注入樣膠體槽內，並於第一個樣品槽內注入2 μL蛋白質標準液(pre-stain protein marker)，以電壓100 V電泳100分鐘後即可關閉電源。將膠體以以下順序置放：濾紙、膠體、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜、濾紙，浸濕後利用半乾式轉漬的方式透過10V電壓50分鐘進行轉漬，將膠體上的蛋白質轉漬到PVDF膜上，在轉漬前要將汽泡趕出，避免影響轉漬過後的結果。以5%脫脂奶粉配制於TBS-T(每公升含有2.42克Tris-base、8克NaCl、0.1% Tween-20)內，填補2小時以阻斷非特異性結構，將阻斷完非特異性結構的PVDF膜加入初級抗體4ºC歷經隔夜，隔日在利用TBS-T清洗PVDF膜四次每次10分鐘，將清洗完的PVDF膜加入二級抗體，於室溫下填補一個小時，在利用TBS-T清洗PVDF膜四次每次10分鐘，將清洗完的PVDF膜加入冷光呈色劑(enhanced chemiluminescence，ECL)反應一分鐘(避光)，在透過化學冷光拍攝系統進行拍照。

請參閱圖9A及圖9B所示，從左至右分別為控制組、CsA組、LCC組、LCC+CsA組，利用管灌餵的方式給予大鼠七天，大鼠犧牲後獲得的腎臟組織利用超音波破碎儀將組織破碎，獲得的蛋白質經過定量、並透過蛋白質電泳分析組織中GRP78蛋白質的表現情形。結果在給予環孢靈過後的組別中GRP78蛋白質的訊號表現有顯著增加的趨勢，表示環孢靈的確使得GRP78蛋白質訊號被活化表現，而給予蟬花菌絲體進行保護，GRP78的蛋白質訊號表現有顯著減少的現象(P＜0.05)。

實施例4 環孢素與HEA對於腎臟細胞HK-2生長之影響

利用人類腎近曲小管細胞(human kidney proximal tubular cells，HK-2)培養於杜氏改良伊格爾培養基混合F-12培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium nutrient mixture F-12，DMEM/F-12)的培養液中內含10% FBS及青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin，PS)。細胞置於含有5%二氧化碳及飽和濕度之37°C恆溫培養箱中培養，並在細胞數目到達飽和前進行繼代培養。

請參閱圖10所示，HK-2細胞在環孢靈劑量10 μM濃度反應24小時至72小時，可以觀察到細胞的存活率皆在60%以上，而在環孢靈20 μM濃度反應24小時至72小時，可以觀察到細胞存活率在50%以下。因此以環孢靈10 μM 的濃度進行後續細胞相關實驗。請參閱圖11所示，在HEA不同濃度中細胞生長的情形，HEA加入細胞中反應之濃度為0.1 μM至90 μM，反應時間24小時，從實驗結果可見施予0.1 μM至45 μM的HEA，細胞存活率可達90%以上，其中0.1 μM至0.9 μM濃度顯示未具任何毒性，因此後續細胞保護試驗中，即以此濃度進行。

請參閱圖12所示，在HEA加入細胞中反應之濃度為0.1 μM至0.9 μM、反應時間4小時後加入環孢靈10 μM反應24小時，從實驗結果可見在相當低濃度下(0.1 μM至0.9 μM)的HEA，具有預防環孢靈傷害增生的現象，其中又以0.9 μM的HEA較具顯著性。

根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。

圖1為本發明之蟬花菌絲體萃取物以LC-ESI(+)-MS/MS-MRM分析之總離子層析圖；counts為計數量。 圖2為本發明之蟬花菌絲體萃取物以高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)偵測UC 260 nm分析之高效液相層析圖；編號1為鳥嘌呤；編號2為腺甘酸；編號3為HEA；編號4為鳥苷-5’-單磷酸；編號5為腺苷-5’-單磷酸；cps (count per second，每秒計數量)。 圖3為本發明之蟬花菌絲體萃取物之HEA高效液相層析圖。 圖4為本發明之蟬花菌絲體萃取物之HEA總離子層析圖。 圖5為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之尿素氮與肌酸酐廓清率之柱狀圖；CsA為環孢靈、LCC為低劑量蟬花菌絲體組合物、HCC為高劑量蟬花菌絲體組合物；不同小寫英文字母之間具有顯著差異(p ＜0.05)。 圖6為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之腎臟組織蘇木紫-伊紅染色切片圖(hematoxylin-eosin staining，HE staining)(放大倍率為400倍)；箭頭表示腎小管裂解及腎絲球萎縮現象。 圖7A為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之TRPM6蛋白質的免疫組織化學染色圖；箭頭表示TRPM6蛋白。 圖7B為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之TRPM6蛋白質免疫組織化學染色的量化圖；各組得出的百分比數值以該組總蛋白質為基準。 圖8A為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之TRPM7蛋白質的免疫組織化學染色圖；箭頭表示TRPM7蛋白。 圖8B為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之TRPM7蛋白質免疫組織化學染色的量化柱狀圖；各組得出的百分比數值以該組總蛋白質為基準。 圖9A為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之GRP78蛋白質經蛋白質電泳後以西方墨點法偵測蛋白質表現量；上方為GRP78蛋白質表現量，下方為β-ACTIN (β-肌動蛋白)蛋白質表現量。 圖9B為本發明之不同組別給予環孢靈及/或不同劑量之蟬花菌絲體組合物於大鼠之GRP78蛋白質相較於β-ACTIN蛋白質後的柱狀圖；不同小寫英文字母之間具有顯著差異(p ＜0.05)。 圖10為本發明之單獨施予不同濃度之環孢靈(CsA)對於腎臟細胞HK-2分別於24小時、48小時、72小時之存活影響的柱狀圖；各組比例係相對於控制組；不同小寫英文字母之間具有顯著差異(p ＜0.05)。 圖11為本發明之單獨施予不同濃度HEA對於腎臟細胞HK-2的存活影響的柱狀圖；各組比例係相對於控制組；不同小寫英文字母之間具有顯著差異(p ＜0.05)。 圖12為本發明之預先施予不同濃度HEA後再施予CsA對於腎臟細胞HK-2的存活影響的柱狀圖；各組比例係相對於控制組；不同小寫英文字母之間具有顯著差異(p ＜0.05)。

Claims (10)

1. 一種蟬花(Cordyceps cicadae )菌絲體組合物的製備方法，其包含： 齊備一蟬花菌種，其係取自臺灣食品工業發展研究所編號BCRC MU30106； 將菌種接種於含有培養基的平板後，成長成菌絲； 將菌絲切取下來後接種於培養液中，以轉速100 G至500 G培養1天至5天獲得菌絲溶液； 將菌絲溶液倒入具有發酵液的發酵槽中，調整酸鹼值至4.5至5.5後繼續培養3天至5天，獲得菌絲發酵培養液；以及 菌絲發酵培養液離心取出菌絲體，並將菌絲體冷凍乾燥後磨成粉狀，即為蟬花菌絲體組合物。
2. 如請求項1所述之蟬花菌絲體組合物的製備方法，其中菌絲溶液倒入具有發酵液的發酵槽中的步驟中，調整酸鹼值至5後繼續培養4天，獲得菌絲發酵培養液。
3. 如請求項2所述之蟬花菌絲體組合物的製備方法，其中發酵液包含蔗糖、黃豆粉、酵母萃取物或其組合。
4. 一種蟬花菌絲體萃取物的製備方法，其包含： 齊備一如請求項1至3中任一項所述之蟬花菌絲體組合物的製備方法所製得蟬花菌絲體組合物；以及 將蟬花菌絲體組合物溶於甲醇後，以超音波震盪進行萃取，得到蟬花菌絲體萃取物。
5. 如請求項4所述之蟬花菌絲體萃取物的製備方法，其中該甲醇係為20%至100%甲醇。
6. 如請求項4或5所述之蟬花菌絲體萃取物的製備方法，其中溶於甲醇的蟬花菌絲體以超音波震盪進行萃取的步驟後，歷經濃縮至乾燥，再以甲醇回溶，並經過過濾後得到蟬花菌絲體萃取物。
7. 一種蟬花菌絲體萃取物，其係由如請求項4至6中任一項所述之製備方法所製得。
8. 如請求項7所述之蟬花菌絲體萃取物，其包含鳥嘌呤(guanine)、腺甘酸(adenosine)、鳥苷-5’-單磷酸(guansine-5'-monophosphate，GMP)、N⁶ -(2-羥乙基)腺苷[N⁶ -(2-hydroxyethyl)-adenosine，HEA]以及腺苷-5’-單磷酸(adenosine-5'-monophosphate，5’-AMP)。
9. 一種如請求項1至3中任一項所述之蟬花菌絲體組合物用於製備預防或治療腎病變的醫藥品的用途，其中醫藥品含有有效劑量之蟬花菌絲體組合物以及其藥學上可接受的載劑。
10. 如請求項9所述之蟬花菌絲體組合物用於製備預防或治療腎病變的醫藥品的用途，其中該醫藥品含有蟬花菌絲體組合物之有效劑量係介於每日每公斤350毫克(mg/kg/day)至4000 mg/kg/day。