CN111808793A - 一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术与生物医疗领域,具体涉及一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法。该方法步骤如下:取动物组织或细胞,加入线粒体和胞浆蛋白制备试剂,匀浆,得匀浆液;将所述匀浆液离心,弃沉淀,保留上清液;将所述上清液离心,保留沉淀,得到粗提线粒体,将粗提线粒体用IB溶液重悬,记作A溶液;将冰浴15%Percoll溶液与A溶液按照1:1的体积比混合后,离心,弃上清液,保留沉淀;将沉淀加入到IB溶液中,离心,弃上清,保留沉淀,清洗沉淀,去除Percoll溶液后得到纯化的线粒体;该方法所获得的线粒体比市售商品化试剂盒所提取的线粒体的纯度更高、活性更高,可用于科学实验研究。

Description

一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术与生物医疗领域,具体涉及一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法。
背景技术
线粒体是真核生物细胞内重要的细胞器,是细胞能量代谢和氧代谢的场所,参与氧化磷酸化,三羧酸循环,储存钙离子等,在细胞的生存和死亡过程中发挥关键作用。线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。在细胞受到损伤后,线粒体的结构及功能改变如膜电位、呼吸链、蛋白定位、细胞色素C、氧自由基等的异常,可直接或间接引起细胞坏死或凋亡,最终引起各种疾病的发生。目前已发现线粒体基因、结构和功能异常与衰老、肿瘤、心血管病、糖尿病及神经退行性疾病等100多种疾病相关。线粒体功能研究已成为细胞生物学领域重要研究热点之一。
线粒体功能的研究需要纯化的,高活性的线粒体。目前科学研究中用到的线粒体分离方法主要为蔗糖密度梯度离心法或商品化的线粒体分离试剂盒,前者需要超高速离心机,一般实验室不具备,并且步骤繁琐用时较长,得到的线粒体活性较差,后者虽然大大缩减了提取时间但所提线粒体纯度较低,常含有其他细胞成份,如糖原、细胞碎片等。常常导致实验失败或结果不稳定、重复性差。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明旨在提供一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法。
本发明的技术方案如下:
一种新型高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法,具体步骤如下:
S1,取动物组织或细胞,加入线粒体和胞浆蛋白制备试剂,匀浆,得匀浆液;
S2,将所述匀浆液离心,参数设置为4℃,1000g,5min,保留上清液;将所述上清液离心,参数设置为4℃,10000g,8min,保留沉淀,得到粗提线粒体,将粗提线粒体用IB溶液重悬,记作A溶液;
S3,将冰浴15%Percoll溶液与A溶液按照1:1的体积比混合后,离心,弃上清液,保留沉淀;
S4,将S3的沉淀加入到IB溶液中,离心,弃上清,保留沉淀,清洗沉淀,去除15%Percoll溶液后得到纯化的线粒体;
其中,所述IB溶液由D-甘露醇、D-蔗糖、浓度为0.5M的HEPES-KOH和浓度为0.5M的MEGTA-KOH溶于水制得,每1000ml的IB溶液中溶解40-41gD-甘露醇,23-24g D-蔗糖,5mlHEPES-KOH,2ml MEGTA-KOH,KOH调pH=7.4;
所述EGTA-KOH由EGTA溶于水制得,每100ml中溶解19-20g EGTA,KOH调pH=7.4;
所述HEPES-KOH由HEPES溶于水制得,每500ml中溶解59-60g HEPES,KOH调pH=7.4;
所述15%Percoll溶液由浓度为0.25M的L-蔗糖以及IB溶液、Percoll按照10:75:15的体积比混合后制得。
进一步的,S1中,线粒体和胞浆蛋白制备试剂的体积为1ml,对应的动物组织质量为0.1g,动物细胞为500-550万个。
更进一步的,S3中,离心参数设置为4℃,21000g,8min。
更进一步的,S4中,离心参数设置为4℃,15000g,5min。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明技术能很好的保持线粒体活性,线粒体得率稳定、结构完整。
2、本发明的一种新型高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法,操作简便易行,全程约30分钟,不需超高速离心,具有很强的可操作性和实用性,所获得线粒体的纯度和活性都显著优于市面常见的线粒体提取试剂盒。
附图说明
图1为不同方法提取小鼠肝脏组织线粒体电镜检测线粒体纯度比较,图A为实施例1方法提取,图B为Solarbio-SM0020提取试剂盒提取,图C为Solarbio-BC3270提取试剂盒提取,图D为APPLYGEN-C1260提取试剂盒,图中所示为线粒体以及肝糖原、胞膜杂质成分。
图2为HepG2细胞内线粒体与实施例3方法提取该细胞线粒体的形态比较。A为肝细胞系HepG2细胞的线粒体(线粒体为GFP+,表现为绿色)、B为实施例3所述方法提取的HepG2细胞系的线粒体(线粒体为GFP+,表现为绿色)。
图3为免疫印迹法检测不同方法提取线粒体蛋白中胞浆蛋白actin,内质网特异性标记蛋白PDI(可以间接反应胞浆蛋白)以及线粒体特异性标记蛋白CoxⅣ。
图4为不同方法提取小鼠肝脏组织线粒体活性检测。A图为酶标仪检测不同方法提取的线粒体JC-1染色中红色荧光与绿色荧光的比值,B-E为线粒体复合物1-4的活性检测。
图5为不同方法提取小鼠肝脏组织线粒体得率检测。A为BCA定量法标准曲线,B为每克小鼠肝脏湿重所提取出的蛋白浓度,C为每克小鼠肝脏湿重所提取出的线粒体双链DNA浓度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明,但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明,下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例中所用试剂均可商品化购买之后配置。
线粒体和胞浆蛋白制备试剂:线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒C1260。
IB溶液:将40.08g(220mM)D-甘露醇和23.96g(70mM)D-蔗糖融入900ml蒸馏水中,依次加入5ml浓度为0.5M的HEPES-KOH和2ml浓度为0.5M的EGTA-KOH,4℃中用KOH调pH=7.4,用蒸馏水补足体积1L,过滤,保留滤液,4℃保存。
0.5M EGTA-KOH:将19.02g EGTA(Cat.No.E8050)粉末溶于80ml蒸馏水中,用KOH调pH=7.4,用水补足至100ml,室温保存。
0.5M HEPES-KOH:将59.575g HEPES(Sigma,H4034)溶于400ml蒸馏水中,用KOH调pH=7.4,用水补足至500ml,室温保存。
15%Percoll溶液:10%0.25M L-蔗糖,75%IB溶液,15%Percoll(GEHealthcare,17-00891-02),现用现配,过滤,保留滤液,4℃备用。
0.25M L-蔗糖:将0.855g L-蔗糖融入10ml蒸馏水中,过滤,保留滤液,4℃保存。
实施例1
小鼠肝脏的线粒体提取与纯化方法,具体步骤如下:
S1,取新鲜小鼠肝脏,加入线粒体和胞浆蛋白制备试剂,用间隙严紧的冰浴玻璃匀浆器研磨30次,制备组织匀浆液;所述动物组织或动物细胞质量:线粒体/胞浆分离溶液体积等于0.1g:1ml;
S2,将所述匀浆液移至2ml Eppenduf tube管,于4℃1000g离心5min,弃沉淀,保留上清液;
S3,将上清液移至另一2ml Eppenduf tube管,4℃10000g离心8min,保留沉淀,即为粗提线粒体,用500uL IB溶液将沉淀重悬,记作A溶液,备用;
S4,取500uL冰浴15%Percoll溶液于一1.5mL EP管中,将所述A溶液缓缓加到15%Percoll溶液之上,4℃21000g离心8min,弃上清,保留沉淀;
S5,向S4的沉淀中加入800ul IB溶液,4℃15000g离心5min,弃上清,保留沉淀,即为纯化线粒体。
实施例2
原代骨髓巨噬细胞的线粒体提取与纯化方法
S1,取原代骨髓巨噬细胞约500万个,加入1ml线粒体和胞浆蛋白制备试剂,用1ml注射器反复吹吸30次,制备细胞匀浆;
S2,将所述匀浆液移至2ml Eppenduf tube管,于4℃1000g离心5min,弃沉淀,保留上清液;
S3,将上清液移至另一2ml Eppenduf tube管,4℃10000g离心8min,保留沉淀,即为粗提线粒体,用500uL IB溶液将沉淀重悬,记作A溶液,备用;
S4,取500uL冰浴15%Percoll溶液于一1.5mL EP管中,将所述A溶液缓缓加到15%Percoll溶液之上,4℃21000g离心8min,弃上清,保留沉淀;
S5,向S4的沉淀中加入800ul IB溶液,4℃15000g离心5min,弃上清,保留沉淀,即为纯化线粒体。
实施例3
HepG2细胞的线粒体提取与纯化方法
S1,取HepG2细胞约500万个,加入1ml线粒体和胞浆蛋白制备试剂,用1ml注射器反复吹吸30次,制备细胞匀浆;
S2,将所述匀浆液移至2ml Eppenduf tube管,于4℃1000g离心5min,弃沉淀,保留上清液;
S3,将上清液移至另一2ml Eppenduf tube管,4℃10000g离心8min,保留沉淀,即为粗提线粒体,用500uL IB溶液将沉淀重悬,记作A溶液,备用;
S4,取500uL冰浴15%Percoll溶液于一1.5mLEP管中,将所述A溶液缓缓加到15%Percoll溶液之上,4℃21000g离心8min,弃上清,保留沉淀;
S5,向S4的沉淀中加入800ul IB溶液,4℃15000g离心5min,弃上清,保留沉淀,即为纯化线粒体。
将上述实施例获得的线粒体与常用的三种不同线粒体分离试剂盒(Solarbio-SM0020、Solarbio-BC3270和APPLYGEN-C1260)提取的线粒体进行线粒体得率、活性及纯度的比较。通过BCA蛋白定量及线粒体DNA定量测定线粒体得率,酶标仪检测线粒体复合体1-4来对比线粒体活性,利用电镜及Western blot的方法检测线粒体纯度。
结果如图1-3所示,结果显示本发明技术提取的线粒体在DNA得率与商品化试剂盒提取所得线粒体没有显著性差异的情况下,活性要优于商品化试剂盒,提取纯度大大提高,表明本技术发明能快速获得高活性、高纯度的线粒体。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法,其特征在于,具体步骤如下:
S1,取动物组织或细胞,加入线粒体和胞浆蛋白制备试剂,匀浆,得匀浆液;
S2,将所述匀浆液离心,参数设置为4℃,1000g,5min,保留上清液;将所述上清液离心,参数设置为4℃,10000g,8min,保留沉淀,得到粗提线粒体,将粗提线粒体用IB溶液重悬,记作A溶液;
S3,将冰浴15%Percoll溶液与A溶液按照1:1的体积比混合后,离心,弃上清液,保留沉淀;
S4,将S3的沉淀加入到IB溶液中,离心,弃上清,保留沉淀,清洗沉淀,去除15%Percoll溶液后得到纯化的线粒体;
其中,所述IB溶液由D-甘露醇、D-蔗糖、浓度为0.5M的HEPES-KOH和浓度为0.5M的MEGTA-KOH溶于水制得,每1000ml的IB溶液中溶解40-41gD-甘露醇,23-24g D-蔗糖,5mlHEPES-KOH,2ml MEGTA-KOH,KOH调pH=7.4;
所述EGTA-KOH由EGTA溶于水制得,每100ml中溶解19-20g EGTA,KOH调pH=7.4;
所述HEPES-KOH由HEPES溶于水制得,每500ml中溶解59-60g HEPES,KOH调pH=7.4;
所述15%Percoll溶液由浓度为0.25M的L-蔗糖以及IB溶液、Percoll按照10:75:15的体积比混合后制得。
2.根据权利要求1所述的一种新型高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法,其特征在于,S1中,线粒体和胞浆蛋白制备试剂的体积为1ml,对应的动物组织质量为0.1g,动物细胞为500-550万个。
3.根据权利要求2所述的一种新型高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法,其特征在于,S3中,离心参数设置为4℃,21000g,8min。
4.根据权利要求3所述的一种新型高活性、高纯度线粒体提取与纯化方法,其特征在于,S4中,离心参数设置为4℃,15000g,5min。
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