CN114958719A - 一种从组织中快速提取高浓度线粒体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，是以匀浆缓冲液对离体动物组织或细胞进行匀浆获取匀浆液，在匀浆液中加入枯草杆菌蛋白酶A，0～4℃孵育8～10min后进行首次离心，收集上清液得到粗提线粒体液，将粗提线粒体液以40µm细胞过滤器过滤，滤液中加入BSA溶液，再次以40µm细胞过滤器过滤，收集滤液，以10µm细胞过滤器过滤滤液，再次离心，弃上清，收集沉淀得到分离出的线粒体。本发明提取方法仅需要通过3次细胞过滤器过滤，依靠自身重力完成线粒体的过滤纯化，规避了离心法对线粒体自身的损伤，在低耗时，低损伤的同时，具有较高的线粒体提取率和纯度，可以达到(1×107～1×109)个线粒体/100mg组织。

Description

一种从组织中快速提取高浓度线粒体的方法
技术领域
本发明属于线粒体提取技术领域，涉及一种从组织中提取线粒体的方法，特别是涉及一种能够快速提取高浓度线粒体的分离方法。
背景技术
作为真核细胞中的能量合成工厂，线粒体不仅负责细胞内的能量代谢过程，同时还作为细胞信号转导的中间枢纽，参与调控细胞凋亡、坏死、自噬、铁死亡等过程。此外，线粒体是细胞内物质代谢的主要场所，与三羧酸循环、氧化磷酸化、钙稳态、血红素合成及部分心磷脂、泛醌的生物合成等多种物质代谢过程密切相关。
最近的研究证据表明，线粒体功能障碍参与了肿瘤、心肌缺血再灌注损伤、神经退行性病变等多个系统疾病的发生发展过程。目前，临床上暂缺乏精准稳定的有效干预手段用于缓解和治疗系统疾病中的线粒体功能障碍。
近年来，通过大量研究发现，在心脏、肝脏、肺脏、肾脏及大脑等高耗能低储能器官组织疾病中，由自体组织分离提纯的活性线粒体移植治疗(简称自体线粒体移植)为疾病的预后提供了可观的获益。
矛盾的是，根据相关文献[1]报道，分离提纯出的活性线粒体所需的体外保存条件较为苛刻，在冰上60min后的活性即可降至正常状态的10～15%，且线粒体内外膜结构稳定性也会时间依赖性下降。在线粒体移植的相关临床研究中，对线粒体的浓度与活性均要求较高，这就严重限制了线粒体移植的临床应用。
目前最常用的线粒体提取分离方式大多为蔗糖密度梯度离心法或组织线粒体分离提取试剂盒法等，但这些方式均只适用于实验室条件下的线粒体提取，时间长，效率低，无法保证分离抽提出的线粒体具有较好的活性、纯度和膜结构稳定性，难以实现向临床的转化。
其中，蔗糖密度梯度离心法需要反复地进行沉淀重悬与超速离心，总体耗时长，约90～120min。蔗糖密度梯度离心法不仅费时费力，而且线粒体蛋白纯度、细胞色素C及ATP水平还均弱于试剂盒法[2]。组织线粒体分离提取试剂盒法虽然耗时短，约45～65min，但是不同品牌的试剂盒提取的线粒体纯度与效率不一，实验结果稳定性较差，而且没有过滤步骤，细胞碎片较多，受胞质蛋白β-actin污染较多[2]。同时，无论是采用蔗糖密度梯度离心法还是组织线粒体分离提取试剂盒法，其最终步骤的离心加速度均≥11000g，离心时间均≥10min，且均无过滤器进行过滤处理。
有文献指出[3]，高转速离心(12000g)不利于维持线粒体结构和功能的完整性。因此，现有技术无法保证最终抽提出的线粒体活性和浓度能够满足后续进行大动物实验和临床试验中自体线粒体移植的最佳需求，这些都极大地限制了自体线粒体移植的临床应用。
综上所述，目前亟待一种能够从自体组织中提取分离高浓度、高纯度、高活性的高质量线粒体的技术方法，以满足未来进行自体线粒体移植的临床治疗需求。
[1] Yamada Y, Ito M, Arai M, Hibino M, Tsujioka T, Harashima H:Challenges in Promoting Mitochondrial Transplantation Therapy. Int J Mol Sci2020, 21(17).。
[2] 吴媛, 董凌月, 安威, 安云庆: 几种不同提取线粒体的方法对线粒体含量及活性的影响. 首都医科大学学报 2010(2): 4.。
[3] 何玛莉, 李心雨, 于睿, 皮佳仪, 孙雅涵, 徐森, 韩学超, 田炜, 徐菁蔓:离心速率对大鼠心肌细胞线粒体提取质量的影响. 河北联合大学学报（医学版） 2019,021(002): 85-90.。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从组织中快速提取高浓度线粒体的方法。
本发明所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法具体包括以下步骤：
a)、以匀浆缓冲液对离体动物组织或细胞进行匀浆，获取匀浆液；
b)、在匀浆液中加入枯草杆菌蛋白酶A，0～4℃孵育8～10min后，首次离心，收集上清液得到粗提线粒体液；
c)、将粗提线粒体液以40µm细胞过滤器过滤，滤液中加入BSA溶液，再次以40µm细胞过滤器过滤，收集滤液；
d)、以10µm细胞过滤器过滤滤液，再次离心，弃上清，收集沉淀得到分离出的线粒体。
进一步地，本发明提取方法中，所述用于匀浆的离体动物组织或细胞是以PBS溶液清洗后的组织或细胞。
更进一步地，所述匀浆缓冲液的用量优选是离体动物组织或细胞质量的15～20倍。
进一步地，本发明提取方法中，是按照每1g离体动物组织或细胞使用2～4mg枯草杆菌蛋白酶A的用量，将枯草杆菌蛋白酶A加入匀浆液中。
具体地，是将孵育后的匀浆液在4℃下，以900g的离心力进行首次离心以获得粗提线粒体液。
更具体地，所述首次离心的时间优选为2～3min。
进一步地，本发明提取方法中，所述使用细胞过滤器进行的过滤均是在0～4℃条件下进行的，且所使用的40µm和10µm孔径的细胞过滤器在过滤前均需要用匀浆缓冲液进行预润湿处理。
更进一步地，使用细胞过滤器进行过滤时，应将被过滤介质匀速缓慢地加入细胞过滤器的滤网中，在重力的作用下完成过滤。
优选地，使用40µm孔径细胞过滤器完成单次过滤的速度应不快于100µl/s，10µm孔径细胞过滤器完成单次过滤的速度应不快于50µl/s，以减少细胞过滤器的孔剪切力对线粒体结构的破坏。
进一步地，需要将粗提线粒体液过滤后的滤液加入BSA溶液进行稀释后，再次进行过滤。BSA溶液的加入量为10～15mg/g离体动物组织或细胞。
进一步地，本发明是将最终过滤出的滤液在4℃下，以9000g的离心力进行再次离心，以获得纯化后的白色线粒体沉淀。
更进一步地，优选的再次离心的时间为8～10min。
更进一步地，本发明的提取方法还包括将得到的线粒体沉淀用呼吸缓冲液以重悬浓度为3×107～3×109个/ml重悬后，置于0～4℃下暂存。
其中，本发明提取方法中使用的匀浆缓冲液和呼吸缓冲液都是细胞提取过程中使用的常规试剂，各种文献中报道的匀浆缓冲液和呼吸缓冲液均可以使用，本发明对其没有特殊限定。
与现有技术通过高速离心提纯线粒体不同的是，在再次离心之前，本发明只是使用了不同孔径的细胞过滤器对粗提线粒体进行分步骤的过滤，以实现线粒体的纯化。
本发明的提取方法仅需要通过3次细胞过滤器过滤，熟练操作后整个过滤过程只需要3～5min，依靠自身重力完成线粒体的过滤纯化，规避了离心法对线粒体自身的损伤，具有操作简便，低耗时，低损伤同时兼顾高纯度、高提取率等优点。
本发明的提取方法中共进行了两次离心，首次离心4℃、900g、2～3min，其离心目的与其他方法近似，均为匀浆后将粗提线粒体液与未彻底消化的大块组织分离开，故离心转速和离心时间均较小；再次离心4℃、9000g、8～10min，相比于现有技术中最终离心步骤所需的离心转速及离心时间均有所缩减。
这得益于本发明此前已经使用细胞过滤器将大部分其余细胞器及细胞碎片去除，故所需的离心转速及离心时间能够显著低于现有技术（现有技术的最终离心步骤的目的在于将线粒体同其他细胞器、细胞碎片及细胞液分离开，因此对所需的离心转速及离心时间要求较高，而本发明的目的只是为了将胞质液中的非线粒体成分与线粒体分离）。
本发明提供了一种从离体组织/细胞中快速提取纯化线粒体的方法，整个提取过程耗时短，仅需25～30min，而且本发明提取方法同时还具有较高的线粒体提取率，提取率可以达到(1×107～1×109)个线粒体/100mg组织。
本发明方法提取的线粒体还具有高纯度的特点，非线粒体细胞器及细胞碎片少，杂蛋白含量低，线粒体结构功能完整，为后续线粒体能量代谢研究、线粒体移植治疗提供了技术上的支持。
附图说明
图1是实施例1提取线粒体的透射电镜图。
图2是实施例1～3提取线粒体的ATP浓度。
图3是实施例1～3胞质及线粒体蛋白免疫印迹图。
图4是实施例1提取线粒体的荧光染色示踪图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例和对比例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例和对比例中使用的各种材料或试剂，如无特殊说明，并没有来源上的特殊限制，均可以通过商业途径获取得到，或者可以按照本领域熟知的常规方法进行制备。
以下实施例中所使用匀浆缓冲液的组成为：300mmol/L蔗糖溶液，10mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸，氢氧化钾调节pH=7.2，使用ddH2O配制，4℃保存。
呼吸缓冲液的组成为：70mmol/L蔗糖溶液，220mmol/L甘露醇溶液，10mmol/L磷酸二氢钾，5mmol/L氯化镁，2mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.5mmol/L 乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸，使用ddH2O配制，4℃保存。
实施例1。
取0.3g成年C57小鼠的股四头肌组织，置于1×PBS溶液中清洗后取出。
将清洗后的股四头肌组织置于50ml灭菌离心管中，加入5ml匀浆缓冲液，以2000rpm匀浆60s，获得匀浆液。
向匀浆液中加入300µl浓度0.4%的枯草杆菌蛋白酶A，置于冰上，0～4℃孵育10min。
将孵育后的匀浆液在4℃下以离心力900g离心2min，提取保留上清液，得到约3ml粗提线粒体液。
使用匀浆缓冲液分别对40µm和10µm的细胞过滤器进行预润湿处理。
将40µm细胞过滤器安装在50ml离心管上，置于冰上，对上述得到的粗提线粒体液进行第1次过滤，控制过滤速度不快于100µl/s，约需30s完成对3ml粗提线粒体液的过滤。
往滤液中加入300µl浓度2%的BSA溶液，轻柔摇匀，再使用40µm细胞过滤器进行第2次过滤，过滤速度同第1次过滤。
使用10µm细胞过滤器对上述第2次过滤所得滤液再进行第3次过滤，控制过滤速度不快于50µl/s，约3ml滤液的过滤时间约需1min。
将第3次过滤所得滤液于4℃下以离心力9000g离心8min，弃去上清，以1ml呼吸缓冲液重悬沉淀，置于冰上暂存。
图1是上述提取得到的线粒体的透射电镜图。视野中以提取纯化的线粒体为主，可见少量细胞碎片，未见其余混杂细胞器。放大局部可见线粒体双层膜结构完整，线粒体嵴清晰，表明所提取的线粒体纯度高，线粒体结构完整。
实施例2。
取0.3g成年C57小鼠的心肌组织，置于1×PBS溶液中清洗后取出。
将清洗后的心肌组织置于50ml灭菌离心管中，加入5ml匀浆缓冲液，以2000rpm匀浆60s，获得匀浆液。
向匀浆液中加入250µl浓度0.4%的枯草杆菌蛋白酶A，置于冰上孵育10min。
将孵育后的匀浆液在4℃下以离心力900g离心2min，提取保留上清液，得到粗提线粒体液约3ml。
使用匀浆缓冲液分别对40µm和10µm的细胞过滤器进行预润湿处理。
将40µm细胞过滤器安装在50ml离心管上，置于冰上，对上述得到的粗提线粒体液进行第1次过滤，过滤持续时间约30s。
往滤液中加入250µl浓度2%的BSA溶液，轻柔摇匀，再使用40µm细胞过滤器进行第2次过滤，过滤持续时间约30s。
使用10µm细胞过滤器对上述第2次过滤所得滤液再进行第3次过滤，过滤持续时间约1min。
将第3次过滤所得滤液于4℃下以离心力9000g离心8min，弃去上清，以1ml呼吸缓冲液重悬沉淀，置于冰上，0～4℃下暂存。
实施例3。
取0.3g成年C57小鼠的肝脏组织，置于1×PBS溶液中清洗后取出。
将清洗后的肝脏组织置于50ml灭菌离心管中，加入5ml匀浆缓冲液，以2000rpm匀浆60s，获得匀浆液。
向匀浆液中加入300µl浓度0.4%的枯草杆菌蛋白酶A，置于冰上孵育10min。
将孵育后的匀浆液在4℃下以离心力900g离心2min，提取保留上清液，得到粗提线粒体液约3ml。
使用匀浆缓冲液分别对40µm和10µm的细胞过滤器进行预润湿处理。
将40µm细胞过滤器安装在50ml离心管上，置于冰上，对上述得到的粗提线粒体液进行第1次过滤，过滤持续时间约30s。
往滤液中加入250µl浓度2%的BSA溶液，轻柔摇匀，再使用40µm细胞过滤器进行第2次过滤，过滤持续时间约30s。
使用10µm细胞过滤器对上述第2次过滤所得滤液再进行第3次过滤，过滤持续时间约1min。
将第3次过滤所得滤液于4℃下以离心力9000g离心8min，弃去上清，以1ml呼吸缓冲液重悬沉淀，置于冰上暂存。
实施例4。
针对实施例1～3分别使用小鼠股四头肌、心肌及肝脏作为组织来源提取的线粒体样本，使用增强型ATP检测试剂盒(Beyotime，货号S0027)检测其ATP含量。
检测结果显示，各线粒体样本的ATP浓度如图2所示。
由此可以看出，采用本发明方法从不同组织中提取线粒体，均能检测到较高浓度的ATP含量。与相关文献报道的采用线粒体分离提取试剂盒或蔗糖密度梯度离心法从骨骼肌、心肌及肝脏等同质量组织中提取的线粒体ATP浓度比较，本发明提取方法的线粒体ATP浓度明显高于其他两种方法，表明本发明方法所提取的线粒体活性良好。
其中，采用线粒体分离提取试剂盒或蔗糖密度梯度离心法从同质量组织中提取线粒体的ATP浓度参见文献[2]以及文献[4]～[6]。
[4] Anker, S. D.; Giacca, M.; Sinagra, G.; Barazzoni, R., PreservedSkeletal Muscle Mitochondrial Function, Redox State, Inflammation and Mass inObese Mice with Chronic Heart Failure. Nutrients 2020, 12(11).。
[5] Gortan Cappellari, G.; Zanetti, M.; Semolic, A.; Vinci, P.;Ruozi, G.; Falcione, A.; Filigheddu, N.; Guarnieri, G.; Graziani, A.; Giacca,M.; Barazzoni, R., Unacylated Ghrelin Reduces Skeletal Muscle Reactive OxygenSpecies Generation and Inflammation and Prevents High-Fat Diet-InducedHyperglycemia and Whole-Body Insulin Resistance in Rodents. Diabetes 2016, 65(4), 874-86.。
[6] Sun, X.; Gao, R.; Li, W.; Zhao, Y.; Yang, H.; Chen, H.; Jiang,H.; Dong, Z.; Hu, J.; Liu, J.; Zou, Y.; Sun, A.; Ge, J., Alda-1 treatmentpromotes the therapeutic effect of mitochondrial transplantation formyocardial ischemia-reperfusion injury.Bioact Mater 2021, 6(7), 2058-2069.。
实施例5。
针对实施例1～3分别使用小鼠股四头肌、心肌及肝脏作为组织来源提取的线粒体样本，分别以免疫印迹法检测小鼠股四头肌、心肌及肝脏的胞质蛋白和线粒体蛋白中的胞质内参β-actin和线粒体标记蛋白CoxⅣ。
除不在滤液中加入BSA溶液外，其余均按照实施例1～3的方法对小鼠不同组织进行提取。取最后离心后的上清作为小鼠股四头肌、心肌及肝脏的胞质液，各取200µl；分别将沉淀以1ml呼吸缓冲液重悬后，各取200µl作为小鼠股四头肌、心肌及肝脏线粒体。
在各胞质液中分别加入1×RIPA+蛋白酶抑制剂溶液100µl，混匀，0～4℃下静置10min，充分裂解胞质液中的蛋白质。各线粒体重悬液中加入线粒体裂解液100µl，混匀后在0～4℃下静置10min。以预冷的4℃高速离心机12000rpm离心10min，弃去上清，收集沉淀，分别得到胞质蛋白和线粒体蛋白。
使用BCA法对蛋白质浓度进行测定并调整上样量，进一步采用Western蛋白免疫印迹法检测胞质内参β-actin和线粒体标记蛋白CoxⅣ，结果如图3所示。
从图3中可以看出，在三个不同来源的小鼠组织样本中，本发明方法提取的线粒体提取液中均含有线粒体特异性标记蛋白CoxⅣ(17KD处可见目的蛋白条带)，证明在提取液中含有一定浓度的线粒体；而在上清(胞质蛋白)中，则几乎无CoxⅣ条带，证明本发明方法的提取效率较高，能将组织中的线粒体较完全地提取分离出来。
相反的，在各组织来源的上清(胞质蛋白)中可以看到胞质蛋白β-actin，而在线粒体提取液中则无此蛋白条带，也证明了本发明方法提取的线粒体纯度较高，受其他胞质蛋白的污染小。
应用例。
分别对原位及本发明方法提取的体外线粒体进行定位，荧光显微镜下进行检测。
体外培养H9C2心肌细胞，分为两组：对照组(ctrl)和外源性线粒体处理组(Mito)。
1）利用MitoTracker Red荧光标记各组心肌细胞的原位线粒体。在每孔细胞中加入浓度为200nM的MitoTracker Red溶液，避光并放入细胞培养箱中，于37℃孵育15min，取出培养板，弃去培养基，用PBS缓冲液充分洗涤3遍，再加入新的完全培养基。
2）取10µl实施例1提取重悬的线粒体溶液，以PBS稀释10倍，加入浓度200nM的MitoTracker Green，置于冰上15min，进行体外线粒体荧光标记后，以900g离心4min，弃上清，用PBS洗涤2遍，最后用100µl呼吸缓冲液重悬。
将2）荧光标记的线粒体溶液以1∶100的比例加入到上述1）的H9C2心肌细胞Mito组中，同时在ctrl组加入同体积的PBS，37℃共培养3h。
图4给出了线粒体的荧光染色示踪图。图中，ctrl为对照组，Mito表示外源性线粒体处理组。Hoechst为细胞核染色，Merge为合成图。
可以看出，相比于ctrl，Mito在外源性地加入本发明方法提取的线粒体并与心肌细胞共培育3h后，在细胞内可见绿色荧光，证明本发明提取的线粒体不仅具有生物活性，还可以进入到细胞内。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，包括：
a)、以匀浆缓冲液对离体动物组织或细胞进行匀浆，获取匀浆液；
b)、在匀浆液中加入枯草杆菌蛋白酶A，0～4℃孵育8～10min后，首次离心，收集上清液得到粗提线粒体液；
c)、将粗提线粒体液以40µm细胞过滤器过滤，滤液中加入BSA溶液，再次以40µm细胞过滤器过滤，收集滤液；
d)、以10µm细胞过滤器过滤滤液，再次离心，弃上清，收集沉淀得到分离出的线粒体。
2.根据权利要求1所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是所述匀浆缓冲液的用量是离体动物组织或细胞质量的15～20倍。
3.根据权利要求1所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是按照每1g离体动物组织或细胞使用2～4mg枯草杆菌蛋白酶A的用量，将枯草杆菌蛋白酶A加入匀浆液中。
4.根据权利要求1所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是将孵育后的匀浆液在4℃下，以900g的离心力进行首次离心以获得粗提线粒体液。
5.根据权利要求4所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是所述首次离心时间为2～3min。
6.根据权利要求1所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是使用细胞过滤器进行的过滤均在0～4℃条件下进行，使用的40µm和10µm细胞过滤器在过滤前用匀浆缓冲液进行预润湿处理。
7.根据权利要求1所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是40µm细胞过滤器完成单次过滤的速度不快于100µl/s，10µm细胞过滤器完成单次过滤的速度不快于50µl/s。
8.根据权利要求1所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是滤液中BSA溶液的加入量为10～15mg/g离体动物组织或细胞。
9.根据权利要求1所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是所述再次离心在4℃下，以9000g的离心力进行。
10.根据权利要求9所述的从组织中快速提取高浓度线粒体的方法，其特征是所述再次离心时间为8～10min。
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