CN110791475A - 骨骼肌组织线粒体的提取方法 - Google Patents

骨骼肌组织线粒体的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨骼肌组织线粒体的提取方法，包括以下步骤：步骤一：取肌肉组织，切成肉糜；步骤二：将肉糜与裂解液混合并匀浆，得匀浆液；步骤三：离心得第一上清液，将第一上清液过滤，得第一滤液，将第一滤液离心，得第二上清液，将第二上清液离心得第一沉淀；步骤四：向步骤三制得的第一沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀，离心得第三上清液，再将第三上清液离心得第二沉淀，即得骨骼肌组织线粒体。同时，通过改进裂解液、洗涤缓冲液和保存缓冲液配方，改进匀浆器结构，获得提取率、纯度均较高的骨骼肌线粒体，解决了骨骼肌组织线粒体提取存在的提取率低、杂蛋白含量高，提取效果差的问题。

Description

骨骼肌组织线粒体的提取方法
技术领域
本发明涉及一种线粒体的提取方法。更具体地说，本发明涉及一种骨骼肌组织线粒体的提取方法，属于线粒体提取技术领域。
背景技术
肌肉组织中线粒体是生物体产生能量的“工厂”，对生物体机能有重要影响，是食品、生物、医药等领域研究的热点，越来越多的学者致力于线粒体结构、功能和线粒体蛋白特性的研究，因此肌肉组织线粒体的提取方法快速、高效，所提取的线粒体足量、纯度高至关重要。
根据肌肉结构和功能不同，可分为骨骼肌、心肌、平滑肌，其中心肌和肝脏组织作为动物组织线粒体提取的原料应用较多，其细胞易破碎，提取方法比较成熟，相比之下，骨骼肌细胞韧性较高，不易破碎，造成提取率低、杂蛋白含量高，提取效果差，亟待研发新的适用于骨骼肌组织的线粒体提取方法，提升骨骼肌组织线粒体的提取率，为开展骨骼肌线粒体结构、功能和线粒体蛋白特性分析与研究提供技术支撑。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明的一个目的是提供一种骨骼肌组织线粒体的提取方法，提高骨骼肌线粒体的提取率，为开展骨骼肌线粒体结构、功能和线粒体蛋白特性分析与研究提供技术支撑。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种骨骼肌组织线粒体的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：取肌肉组织，切成肉糜；
步骤二：将肉糜与裂解液混合并匀浆，得匀浆液；其中，肉糜与裂解液的质量体积比为1.5～2g:5ml；
步骤三：将匀浆液置于温度为2～4℃、离心力为1300～1500g条件下离心5～8min，得第一上清液，将第一上清液过滤，得第一滤液，将第一滤液置于温度为2～4℃、离心力为1300～1500g条件下离心5～8min，得第二上清液，将第二上清液置于温度为2～4℃、离心力为15000～16000g条件下离心15～20min，得第一沉淀；
步骤四：向步骤三制得的第一沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀，置于温度为2～4℃、离心力为1300～1500g条件下离心5～8min，得第三上清液，再将第三上清液置于温度为2～4℃、离心力为15000～16000g条件下离心15～20min，得第二沉淀；其中，洗涤缓冲液与第一沉淀的体积质量比为0.1ml/100μg。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤一中肌肉组织为骨骼肌。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤一中骨骼肌在离体12h内降至0～4℃。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤一中骨骼肌为温度为0～4℃、离体24h内的样本。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤一中切成的肉糜小于2mm3。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤三中将第一上清液过滤时，纱布的层数不小于8。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤二中裂解液配方为：150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，225mmol/L甘露醇，75mmol/L蔗糖，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.5％脱氧胆酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，1mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1片/50ml蛋白酶抑制剂。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤四中洗涤缓冲液配方为：0.25mol/L蔗糖，pH为7.4的0.003mol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸-三羟甲基氨基甲烷，pH为7.4的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤五中保存缓冲液配方为：质量分数为20％的二甲基亚砜，150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，质量分数为20％的甘露醇，质量分数为20％的蔗糖。
优选的是，所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，步骤二中的匀浆器进行改进：匀浆杵1的研磨部位和匀浆器主体2内壁形状均为倒三角形或均为半圆形结构，所述匀浆杵的研磨部位和所述匀浆器主体内壁相配合，匀浆器主体内壁和匀浆杵研磨部位外表面均为磨砂材料。
本发明至少包括以下有益效果：
1)本发明提供了一种骨骼肌组织线粒体的提取方法，能够有效获得一定量的骨骼肌线粒体，提高骨骼肌组织线粒体的提取率；
2)采用本方法提取的骨骼肌组织线粒体，杂蛋白含量低，所得的骨骼肌线粒体纯度提高，为开展骨骼肌线粒体结构、功能和线粒体蛋白特性分析与研究提供技术支撑。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实施例一、二、三骨骼肌线粒体蛋白免疫印迹图；
图2为对比例一、二、三、四骨骼肌线粒体蛋白免疫印迹图；
图3为对比例五骨骼肌线粒体蛋白免疫印迹图；
图4为实施例一、二、三改进后的匀浆器结构透视图。
具体实施方式
下面通过实施例和图1～4对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例一>
步骤一：取肌肉组织，切成肉糜；
步骤二：将肉糜与裂解液混合并匀浆，得匀浆液；其中，肉糜与裂解液的质量体积比为1.5g:5ml；
步骤三：将匀浆液置于温度为2℃、离心力为1300g条件下离心5min，得第一上清液，将第一上清液过滤，得第一滤液，将第一滤液置于温度为2℃、离心力为1300g条件下离心5min，得第二上清液，将第二上清液置于温度为2℃、离心力为15000g条件下离心15min，得第一沉淀；
步骤四：向步骤三制得的第一沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀，置于温度为2℃、离心力为1300g条件下离心5min，得第三上清液，再将第三上清液置于温度为2℃、离心力为15000g条件下离心15min，得第二沉淀；其中，洗涤缓冲液与第一沉淀的体积质量比为0.1ml/100μg。
其中，步骤一中肌肉组织为骨骼肌；骨骼肌在离体12h内降至0℃；提取所用骨骼肌为温度为0℃、离体24h内的样本；骨骼肌切成的肉糜1mm3。
步骤三中将第一上清液过滤时，纱布的层数为8。
步骤二中裂解液配方为：150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，225mmol/L甘露醇，75mmol/L蔗糖，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.5％脱氧胆酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，1mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1片/50ml蛋白酶抑制剂。
步骤四中洗涤缓冲液配方为：0.25mol/L蔗糖，pH为7.4的0.003mol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸-三羟甲基氨基甲烷，pH为7.4的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。
步骤五中保存缓冲液配方为：质量分数为20％的二甲基亚砜，150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，质量分数为20％的甘露醇，质量分数为20％的蔗糖。
步骤二中的匀浆器进行改进：匀浆杵2的研磨部位和匀浆器主体1内壁形状均为倒三角形或均为半圆形结构，所述匀浆杵2的研磨部位和所述匀浆器主体1内壁相配合，匀浆器主体1内壁和匀浆杵2研磨部位外表面均为磨砂材料。
<实施例二>
步骤一：取肌肉组织，切成肉糜；
步骤二：将肉糜与裂解液混合并匀浆，得匀浆液；其中，肉糜与裂解液的质量体积比为1.8g:5ml；
步骤三：将匀浆液置于温度为3℃、离心力为1400g条件下离心7min，得第一上清液，将第一上清液过滤，得第一滤液，将第一滤液置于温度为3℃、离心力为1400g条件下离心7min，得第二上清液，将第二上清液置于温度为3℃、离心力为15500g条件下离心18min，得第一沉淀；
步骤四：向步骤三制得的第一沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀，置于温度为3℃、离心力为1400g条件下离心7min，得第三上清液，再将第三上清液置于温度为3℃、离心力为15500g条件下离心18min，得第二沉淀；其中，洗涤缓冲液与第一沉淀的体积质量比为0.1ml/100μg。
其中，步骤一中肌肉组织为骨骼肌；骨骼肌在离体8h内降至2℃；提取所用骨骼肌为温度为2℃、离体12h内的样本；骨骼肌切成的肉糜1.5mm3。
步骤三中将第一上清液过滤时，纱布的层数为9。
步骤二中裂解液配方为：150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，225mmol/L甘露醇，75mmol/L蔗糖，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.5％脱氧胆酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，1mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1片/50ml蛋白酶抑制剂。
步骤四中洗涤缓冲液配方为：0.25mol/L蔗糖，pH为7.4的0.003mol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸-三羟甲基氨基甲烷，pH为7.4的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。
步骤五中保存缓冲液配方为：质量分数为20％的二甲基亚砜，150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，质量分数为20％的甘露醇，质量分数为20％的蔗糖。
步骤二中的匀浆器进行改进：匀浆杵2的研磨部位和匀浆器主体1内壁形状均为倒三角形或均为半圆形结构，所述匀浆杵2的研磨部位和所述匀浆器主体1内壁相配合，匀浆器主体1内壁和匀浆杵2研磨部位外表面均为磨砂材料。
<实施例三>
步骤一：取肌肉组织，切成肉糜；
步骤二：将肉糜与裂解液混合并匀浆，得匀浆液；其中，肉糜与裂解液的质量体积比为2g:5ml；
步骤三：将匀浆液置于温度为4℃、离心力为1500g条件下离心8min，得第一上清液，将第一上清液过滤，得第一滤液，将第一滤液置于温度为4℃、离心力为1500g条件下离心8min，得第二上清液，将第二上清液置于温度为4℃、离心力为16000g条件下离心20min，得第一沉淀；
步骤四：向步骤三制得的第一沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀，置于温度为4℃、离心力为1500g条件下离心8min，得第三上清液，再将第三上清液置于温度为4℃、离心力为16000g条件下离心20min，得第二沉淀；其中，洗涤缓冲液与第一沉淀的体积质量比为0.1ml/100μg。
其中，步骤一中肌肉组织为骨骼肌；骨骼肌在离体5h内降至4℃；提取所用骨骼肌为温度为4℃、离体8h内的样本；骨骼肌切成的肉糜2mm3。
步骤三中将第一上清液过滤时，纱布的层数为10。
步骤二中裂解液配方为：150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，225mmol/L甘露醇，75mmol/L蔗糖，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.5％脱氧胆酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，1mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1片/50ml蛋白酶抑制剂。
步骤四中洗涤缓冲液配方为：0.25mol/L蔗糖，pH为7.4的0.003mol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸-三羟甲基氨基甲烷，pH为7.4的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。
步骤五中保存缓冲液配方为：质量分数为20％的二甲基亚砜，150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，质量分数为20％的甘露醇，质量分数为20％的蔗糖。
步骤二中的匀浆器进行改进：匀浆杵2的研磨部位和匀浆器主体1内壁形状均为倒三角形或均为半圆形结构，所述匀浆杵2的研磨部位和所述匀浆器主体1内壁相配合，匀浆器主体1内壁和匀浆杵2研磨部位外表面均为磨砂材料。
<对比例一>
骨骼肌组织线粒体提取方法同实施例一，其中，步骤二中裂解液配方为：150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，1片/50ml蛋白酶抑制剂。
<对比例二>
骨骼肌组织线粒体提取方法同实施例一，其中，步骤四中洗涤缓冲液配方为：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸。
<对比例三>
骨骼肌组织线粒体提取方法同实施例一，其中，步骤二中的匀浆器为普通圆柱形玻璃匀浆器。
<对比例四>
骨骼肌组织线粒体提取方法同实施例一，其中，步骤五中保存缓冲液配方为：150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
<对比例五>
骨骼肌组织线粒体提取方法同实施例一，其中，步骤三中将第一上清液过滤时，纱布的层数为7。
提取线粒体主要是用于线粒体结构和功能的分析和研究，所提取线粒体的纯度和质量直接决定后续分析和研究的准确性，是线粒体提取效果的重要评价参数。采用免疫印迹方法，使用线粒体特异蛋白抗体，能够反映线粒体的提取效果。
由图1可见，实施例一、二、三所提取的骨骼肌线粒体特异蛋白的免疫印迹条带清晰，且杂蛋白条带很少，免疫印迹图上几乎看不到，表明所述的骨骼肌线粒体提取方法能够提取到一定量的骨骼肌线粒体且所提取的骨骼肌线粒体纯度很高，能够满足后续研究的要求。
由图2可见，对比例一、二、三、四所提取的骨骼肌线粒体特异蛋白的免疫印迹图中没有显示出目标蛋白的富集，同时杂蛋白条带较多，表明所述的骨骼肌线粒体提取方法无法有效提取到骨骼肌线粒体且提取物中杂蛋白较多，对后续分析和研究将会有很大干扰，不能满足骨骼肌线粒体提取的需要。
与细胞、心肌等其他类型组织相比，骨骼肌组织中脂肪含量相对较高，而脂肪影响线粒体的提取率，因此，骨骼肌组织线粒体提取过程中，除去脂肪对保证线粒体提取效率十分重要。由图3可见，与实施例一、二、三相比，对比例五减少步骤三中第一上清液过滤时纱布的层数，所提取的骨骼肌线粒体特异蛋白的免疫印迹图中有杂蛋白条带出现，表明脂肪过滤不充分会影响骨骼肌线粒体的提取纯度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取肌肉组织，切成肉糜；
步骤二：将肉糜与裂解液混合并匀浆，得匀浆液；其中，肉糜与裂解液的质量体积比为1.5～2g:5ml；
步骤三：将匀浆液置于温度为2～4℃、离心力为1300～1500g条件下离心5～8min，得第一上清液，将第一上清液过滤，得第一滤液，将第一滤液置于温度为2～4℃、离心力为1300～1500g条件下离心5～8min，得第二上清液，将第二上清液置于温度为2～4℃、离心力为15000～16000g条件下离心15～20min，得第一沉淀；
步骤四：向步骤三制得的第一沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀，置于温度为2～4℃、离心力为1300～1500g条件下离心5～8min，得第三上清液，再将第三上清液置于温度为2～4℃、离心力为15000～16000g条件下离心15～20min，得第二沉淀，即得骨骼肌组织线粒体，其中，洗涤缓冲液与第一沉淀的体积质量比为0.1ml/100μg。
2.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤一中肌肉组织为骨骼肌。
3.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤一中骨骼肌在离体12h内降至0～4℃。
4.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤一中骨骼肌为温度为0～4℃、离体24h内的样本。
5.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤一中切成的肉糜小于2mm3。
6.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤三中将第一上清液过滤时，纱布的层数不小于8。
7.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤二中裂解液配方为：150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，225mmol/L甘露醇，75mmol/L蔗糖，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.5％脱氧胆酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，1mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1片/50ml蛋白酶抑制剂。
8.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤四中洗涤缓冲液配方为：0.25mol/L蔗糖，pH为7.4的0.003mol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸-三羟甲基氨基甲烷，pH为7.4的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。
9.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤五中保存缓冲液配方为：质量分数为20％的二甲基亚砜，150mmol/L氯化钠，pH为7.4的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，质量分数为20％的甘露醇，质量分数为20％的蔗糖。
10.如权利要求1所述的骨骼肌组织线粒体的提取方法，其特征在于，步骤二中的匀浆器进行改进：匀浆杵的研磨部位和匀浆器主体内壁形状均为倒三角形或均为半圆形结构，所述匀浆杵的研磨部位和所述匀浆器主体内壁相配合，匀浆器主体内壁和匀浆杵研磨部位外表面均为磨砂材料。
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