CN117143796B - 一种提取植物组织线粒体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提取植物组织线粒体的方法，包括步骤1：取植物材料进行预处理，而后进行液氮研磨，并加入预冷的研磨介质匀浆；步骤2：对匀浆进行抽滤2‑3次、离心、去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2‑3次后将其转移至提取缓冲液中，制成悬液；步骤3：向所述悬液中加入提取溶剂均匀混合，而后在搅拌条件下水浴加热，45min后取出冷却至室温，离心得到上清液；及，步骤4：将上清液冷却降温至4～5℃，而后离心取得沉淀，即得到线粒体，本发明的方法提取过程简单高效，对于设备条件要求低，从而有效的降低了提取成本，同时提取的线粒体完整度好，活性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种提取植物组织线粒体的方法。
背景技术
线粒体是一种双膜结合的细胞器，存在于大多数真核细胞中，是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化，分别对应有氧呼吸的第二、三阶段。细胞质基质中完成的糖酵解和在线粒体基质中完成的三羧酸循环在会产还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(reduced flavin adenosine dinucleotide，FADH2)等高能分子，而氧化磷酸化这一步骤的作用则是利用这些物质还原氧气释放能量合成ATP。
目前，线粒体越来越多被作为研究植物的品种资源、细胞质雄性不育、植物抗胁迫及细胞凋亡的重要细胞器，提取有活性的线粒体是线粒体研究的基础。由于线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如植物种子或根系中，大量制备线粒体就是从这些组织细胞中提取。但是，现有的线粒体提取多采用试剂盒提取法、密度梯度离心法和差速离心法，其对于仪器设备要求高，成本高，且提取的效率低、活率不高。
因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的提取植物组织线粒体的方法。
为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
一种提取植物组织线粒体的方法，包括如下步骤：
步骤1：取植物材料进行预处理，而后进行液氮研磨，并加入预冷的研磨介质匀浆；
步骤2：对匀浆进行抽滤2-3次、离心、去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2-3次后将其转移至提取缓冲液中，制成悬液；
步骤3：向所述悬液中加入提取溶剂均匀混合，而后在搅拌条件下水浴加热，45min后取出冷却至室温，离心得到上清液；
及，步骤4：将上清液冷却降温至4～5℃，而后离心取得沉淀，即得到线粒体。
优选的，所述步骤1中，植物材料为植物茎叶、根系、种子中的一种。
优选的，所述步骤1中，对植物材料进行预处理包括对植物材料进行清洗、消毒及粉碎。
优选的，所述步骤1中，所述研磨介质为pH为7.5的磷酸钾缓冲液，其中含有0.3M蔗糖、1％(W/V)BSA、1％(W/V)PVP-40，2.0mM EGTA，1.0Mm AOS，20mM半胱氨酸。
优选的，所述步骤2中，离心条件为：4000-4500g，10-15min。
优选的，所述步骤2中，洗涤介质由0.3M蔗糖，1％(W/V)BSA，20mM TES-Na组成，pH为7.5。
优选的，所述步骤2中，提取缓冲液由0.4～0.6mol/L蔗糖、0.9～
1.1mmol/L MgCl2、0.9～1.1mmol/L EGTA、4.5～5.5g/L PVP、0.9～1.1g/L cys、1.3～1.5mL/L巯基乙醇、0.9～1.1g/L BSA和48～52mmol/L Tris～HCl组成，pH为7.4～7.8。
优选的，所述步骤3中，提取溶剂由0.5～1.0mol/L氯化胆碱和1.5～2.5mol/L N-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖组成。
优选的，所述步骤3中，离心速率为5000～7000g，离心时间为30～35min。
优选的，所述步骤4中，离心速率为10000～11000g，离心时间为50～60min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用的提取方法，相对于传统的提取方法来说，提取过程简单高效，对于设备条件要求低，从而有效的降低了提取成本，同时提取的线粒体完整度好，活性高。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
本发明提供了一种提取植物组织线粒体的方法，包括如下步骤：
步骤1：取植物材料进行预处理，而后进行液氮研磨，并加入预冷的研磨介质匀浆；该步骤中，植物材料可以选自植物茎叶、根系、种子等等，研磨温度为4℃；研磨介质为pH为7.5的磷酸钾缓冲液，其中含有0.3M蔗糖、1％(W/V)BSA、1％(W/V)PVP-40，2.0mM EGTA，1.0Mm AOS，20mM半胱氨酸。
步骤2：对匀浆进行抽滤2-3次、离心、去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2-3次后将其转移至提取缓冲液中，制成悬液；该步骤中，离心速率为4000-4500g，离心时间为10-15min；洗涤介质由0.3M蔗糖，1％(W/V)BSA，20mM TES-Na组成，pH为7.5；提取缓冲液由0.4～0.6mol/L蔗糖、0.9～1.1mmol/L MgCl2、0.9～1.1mmol/L EGTA、4.5～5.5g/LPVP、0.9～1.1g/L cys、1.3～1.5mL/L巯基乙醇、0.9～1.1g/L BSA和48～
52mmol/L Tris～HCl组成，pH为7.4～7.8。
步骤3：向所述悬液中加入提取溶剂均匀混合，而后在搅拌条件下水浴加热，45min后取出冷却至室温，离心得到上清液；该步骤中，提取溶剂由0.5～1.0mol/L氯化胆碱和1.5～2.5mol/L N-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖组成；水浴加热温度为60～70℃；离心速率为5000～7000g，离心时间为30～35min。
及，步骤4：将上清液冷却降温至4～5℃，而后离心取得沉淀，即得到线粒体；该步骤中，离心速率为10000～11000g，离心时间为50～60min。
实施例1
一种提取植物组织线粒体的方法，包括如下步骤：
步骤1：取豌豆根部，对其进行其冲洗、消毒、粉碎；而后将其放入4℃的研钵中，加入液氮及研磨介质进行研磨得到匀浆；其中研磨介质为pH为7.5的磷酸钾缓冲液，其中含有0.3M蔗糖、1％(W/V)BSA、1％(W/V)PVP-40，2.0mM EGTA，1.0Mm AOS，20mM半胱氨酸。
步骤2：对所述匀浆进行抽滤2-3次，而后在4000-4500g的条件下离心10-15min，去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2-3次后将其转移至提取缓冲液中，制成悬液；其中洗涤介质由0.3M蔗糖，1％(W/V)BSA，20mM TES-Na组成，pH为7.5；提取缓冲液由0.5mol/L蔗糖、1.0mmol/L MgCl2、1.1mmol/L EGTA、5.0g/L PVP、1.0g/L cys、1.4mL/L巯基乙醇、0.9g/L BSA和50mmol/L Tris～HCl组成，pH为7.4～7.8。
步骤3：向所述悬液中加入由0.5mol/L氯化胆碱和1.5mol/L N-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖组成的提取溶剂均匀混合，而后在搅拌、60～70℃条件下水浴加热，45min后取出冷却至室温，在5000～7000g的条件下离心30～35min得到上清液。
步骤4：将上清液冷却降温至4～5℃，而后在10000～11000g的条件下离心50～60min取得沉淀，即得到线粒体。
实施例2
一种提取植物组织线粒体的方法，包括如下步骤：
步骤1：取豌豆根部，对其进行其冲洗、消毒、粉碎；而后将其放入4℃的研钵中，加入液氮及研磨介质进行研磨得到匀浆；其中研磨介质为pH为7.5的磷酸钾缓冲液，其中含有0.3M蔗糖、1％(W/V)BSA、1％(W/V)PVP-40，2.0mM EGTA，1.0Mm AOS，20mM半胱氨酸。
步骤2：对所述匀浆进行抽滤2-3次，而后在4000-4500g的条件下离心10-15min，去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2-3次后将其转移至提取缓冲液中，制成悬液；其中洗涤介质由0.3M蔗糖，1％(W/V)BSA，20mM TES-Na组成，pH为7.5；提取缓冲液由0.5mol/L蔗糖、1.0mmol/L MgCl2、1.1mmol/L EGTA、5.0g/L PVP、1.0g/L cys、1.4mL/L巯基乙醇、0.9g/L BSA和50mmol/L Tris～HCl组成，pH为7.4～7.8。
步骤3：向所述悬液中加入由0.5mol/L氯化胆碱和2.0mol/L N-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖组成的提取溶剂均匀混合，而后在搅拌、60～70℃条件下水浴加热，45min后取出冷却至室温，在5000～7000g的条件下离心30～35min得到上清液。
步骤4：将上清液冷却降温至4～5℃，而后在10000～11000g的条件下离心50～60min取得沉淀，即得到线粒体。
实施例3
一种提取植物组织线粒体的方法，包括如下步骤：
步骤1：取豌豆根部，对其进行其冲洗、消毒、粉碎；而后将其放入4℃的研钵中，加入液氮及研磨介质进行研磨得到匀浆；其中研磨介质为pH为7.5的磷酸钾缓冲液，其中含有0.3M蔗糖、1％(W/V)BSA、1％(W/V)PVP-40，2.0mM EGTA，1.0Mm AOS，20mM半胱氨酸。
步骤2：对所述匀浆进行抽滤2-3次，而后在4000-4500g的条件下离心10-15min，去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2-3次后将其转移至提取缓冲液中，制成悬液；其中洗涤介质由0.3M蔗糖，1％(W/V)BSA，20mM TES-Na组成，pH为7.5；提取缓冲液由0.5mol/L蔗糖、1.0mmol/L MgCl2、1.1mmol/L EGTA、5.0g/L PVP、1.0g/L cys、1.4mL/L巯基乙醇、0.9g/L BSA和50mmol/L Tris～HCl组成，pH为7.4～7.8。
步骤3：向所述悬液中加入由1.0mol/L氯化胆碱和2.5mol/L N-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖组成的提取溶剂均匀混合，而后在搅拌、60～70℃条件下水浴加热，45min后取出冷却至室温，在5000～7000g的条件下离心30～35min得到上清液。
步骤4：将上清液冷却降温至4～5℃，而后在10000～11000g的条件下离心50～60min取得沉淀，即得到线粒体。
对比例
一种提取植物组织线粒体的方法，包括如下步骤：
步骤1：取豌豆根部，对其进行其冲洗、消毒、粉碎；而后将其放入4℃的研钵中，加入液氮及研磨介质进行研磨得到匀浆；其中研磨介质为pH为7.5的磷酸钾缓冲液，其中含有0.3M蔗糖、1％(W/V)BSA、1％(W/V)PVP-40，2.0mM EGTA，1.0Mm AOS，20mM半胱氨酸。
步骤2：对所述匀浆进行抽滤2-3次，而后在4000-4500g的条件下离心10-15min，去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2-3次后将其转移至提取缓冲液中，制成粗制线粒体悬液；其中洗涤介质由0.3M蔗糖，1％(W/V)BSA，20mM TES-Na组成，pH为7.5；提取缓冲液由0.5mol/L蔗糖、1.0mmol/L MgCl2、1.1mmol/L EGTA、5.0g/L PVP、1.0g/L cys、1.4mL/L巯基乙醇、0.9g/L BSA和50mmol/L Tris～HCl组成，pH为7.4～7.8。
步骤3：将粗制线粒体悬浮液铺在不连续Percoll梯度上，密度梯度为：18％(W/V)Percoll溶液和50％(W/V)Percoll溶液的体积比为1:1,40000g离心1h；所述percoll溶液的密度为在洗涤介质中的密度；
步骤4：收集18％和50％界面间的线粒体，用上述洗涤介质洗涤3次，18000g离心15min,去除上清液，得到线粒体沉淀，置于-70℃冰箱中保存即可。
对实施例1-3及对比例提取的线粒体外膜完整度及细胞色素C氧化酶活性进行测定。
1、线粒体外膜完整度测定
检测方法为：由于Triton X-100能够破碎完整的线粒体，通过测定0.01％Triton加入前后琥珀酸：细胞色素氧化还原酶活性之比来确定线粒体的完整性，所有的操作步骤均在0-4℃下进行，检测结果如表1所示。
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例 | |
| 线粒体外膜完整性(％) | 96 | 98 | 95 | 91 |
2、细胞色素C氧化酶活性测定
在5只比色杯中分别加入0.1mL 0.01M的磷酸盐缓冲液，0.07mL 1％的亚铁细胞色素C(将细胞色素C溶解于0.01M pH7.0磷酸钾缓冲液中)和0.83mL蒸馏水。其中一只加入0.01mol 0.1M亚铁氰化钾作为对照，另外4只分别加入10微升不同组别线粒体制剂。在550nm处，使用Shimadzuuv-120-02型分光光度计测量吸光值，每过△t＝15s间隔读数以起始时吸光值作为A0,以15s以后读数作为A1。从ln(A1-A1+△)对t作图所得直线的斜率即可求的k实验结果如表2所示，本实验以一级反应速率常数k作为数据对比的最终根据，按照公式计算出的第一反应速率k值如表中所展示，因此反应速率常数A越大的组别，在线粒体提取实验中相对效果越好。
表2线粒体细胞色素C氧化酶活性测定结果
| 对照组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例 | |
| K值 | 17.18 | 40.26 | 45.32 | 41.59 | 23.15 |
由上述表1和表2的结果可知，采用本发明的方法提取的线粒体相对于传统的提取方法提取的线粒体完整度好，活性高。
所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
Claims (9)
1.一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：取植物材料进行预处理，而后进行液氮研磨，并加入预冷的研磨介质匀浆；
步骤2：对匀浆进行抽滤2-3次、离心、去除上清液，并使用洗涤介质对沉淀进行清洗，2-3次后将其转移至提取缓冲液中，制成悬液；
步骤3：向所述悬液中加入提取溶剂均匀混合，而后在搅拌条件下水浴加热，45min后取出冷却至室温，离心得到上清液；提取溶剂由0.5~1.0mol/L氯化胆碱和1.5~2.5mol/L N-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖组成；
及，步骤4：将上清液冷却降温至4~5℃，而后离心取得沉淀，即得到线粒体。
2.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤1中，植物材料为植物茎叶、根系、种子中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤1中，对植物材料进行预处理包括对植物材料进行清洗、消毒及粉碎。
4.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤1中，所述研磨介质为pH为7.5的磷酸钾缓冲液，其中含有0.3 M蔗糖、1 %（W／V）BSA、1 %（W／V）PVP-40，2.0 mM EGTA，1.0 mM AOS，20 mM 半胱氨酸。
5.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤2中，离心条件为：4000-4500g，10-15min。
6.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤2中，洗涤介质由0.3 M 蔗糖，1 %（W／V） BSA ，20 mM TES-Na组成，pH 为7.5。
7.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤2中，提取缓冲液由0.4～0.6 mol/L蔗糖、0.9～1.1 mmol/L MgCl2、0.9～1.1 mmol/L EGTA、4.5～5.5 g/L PVP、0.9～1.1 g/L cys、1.3～1.5 mL/L巯基乙醇、0.9～1.1 g/L BSA和48～52mmol/L Tris~HCl组成，pH 为7.4～7.8。
8.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤3中，离心速率为5000~7000g，离心时间为30~35min。
9.根据权利要求1所述的一种提取植物组织线粒体的方法，其特征在于：所述步骤4中，离心速率为10000~11000g，离心时间为50~60min。
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