KR20120092494A - 분해 안정화된, 생체 적합성 콜라겐 매트릭스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분을 함유한다는 사실에 의해 구별되는 분해 안정화되고, 생체 적합성을 갖는 콜라겐 매트릭스에 관한 것이며, 또한 그와 같은 콜라겐 매트릭스의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 특히 에폭시 관능성 가교제에 의한 화학적 가교를 포함하며, 또한 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 화장품 또는 약학 제제로서의 용도에 관한 것이고, 특히 국부적 용도 및 상처 치료제로서, 임플란트로서, 인간 또는 동물의 지혈제로서, 생물공학, 기초 연구 및 조직 공학 분야에서의 세포군용 스캐폴드로서의 용도에 관한 것이다.

Description

분해 안정화된, 생체 적합성 콜라겐 매트릭스 {DEGRADATION-STABILISED, BIOCOMPATIBLE COLLAGEN MATRICES}

본 발명은 불용성 콜라겐 섬유들 외에 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분을 함유한다는 사실에 의해 특히 구별되는 분해 안정화된, 생체 적합성 콜라겐 매트릭스와, 특히 에폭시 관능성 가교제 의한 화학 가교를 포함하는, 그와 같은 콜라겐 매트릭스를 제조하는 방법, 화장품 또는 약제 및 상처 치료제와 임플란트 또는 인간 또는 동물 지혈제 및 생명 공학, 기초 연구 및 조직 공학 분야에서 세포군 (cell population)용 스캐폴드로서의 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 용도에 관한 것이다.

콜라겐 재료 분야에서, 기계적으로 안정하고, 신축성 있으며 생물학적 분해에 대해 적절한 안정성을 나타내는 재료와 스캐폴드의 제공은 중요한 역할을 갖는다. 그와 같은 제품에 대한 요구는 상처 치료와 지혈 분야에서 흡수성이 큰 재료의 분야 뿐 아니라, 특히 상처 치료 분야, 생물학적 임플란트 및 조직 공학 및 세포군의 스캐필드 분야에서 특히 중요성이 증가하고 있다. 화장품 분야에서, 특히 피부에 잘 받아들여지는 동시에 좋은 느낌과 외관을 갖는 재료가 또한 요구되고 있다. 더욱이 부가적으로 기계적 안정성을 갖는, 그와 같은 분해 안정화된 지지체 또는 기재를 통한 유효 성분의 제공은 화장품과 약학과 조직 공학 분야에서 모두 중요한 측면을 갖는다. 예를 들면 유효 성분과 조직 공학의 스캐폴드의 조합은 다수의 출판물에 반영된 전략이다. 흡수 또는 공유적으로 스캐폴드에 결합됨으로써 또는 디포 (depot)로부터 연속적으로 방출됨으로써 연장된 기간 동안 그들의 생물학적 활성을 발휘하는 유효 성분들은 종래 기술에 속한다. 해당 유효 성분 디포로부터의 연속적인 방출은, 특히 유효 성분이 짧은 생물학적 반감기를 갖는 경우에, 상처 치료에서 표적 개입 (targeted intervention)을 가능하게 한다. 예를 들면, 많은 중요한 현상들, 예컨대 세포 분화, 세포 증식 및 세포 집합 등은 유전자 발현을 통해 신호 단백질에 의해 영향을 받는다. 개별 세포들의 이용가능성과 분화, 재생 또는 대체, 세포 분할 및 세포 조절은 연구의 주된 과제이다 (Rui Miguel Paz, Dissertation RWTH Aachen 2004). 기능성을 향상시키기 위해 생물학적 활성 물질로 생체 재료를 구비하는 것은 순수한 패시브 임플란트 재료로부터 주위의 조직 또는 조직 유액과 의도적으로 상호작용하는 액티브 임플란트로의 발달을 보여준다. 생체 재료와 생물학적 활성 물질과의 조합은 의료 분야에서 널리 사용되며, 예를 들면 임플란트 관련 감염 예방에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. 예를 들면 상처 드레싱 분야에서, 더욱 중요한 역할은 개선된 상처 환경, 감염의 감소 및 유효 성분 부가에 의한 세포 성장 자극 뿐 아니라, 특히 매트릭스 재료의 강성과 같은 재료의 물리적 성질을 제어된 방식으로 조정함으로써 세포 분화 및 세포 발현 패턴에 의도적으로 영향을 미치는 것에 의해 이루어진다. 소위 특히 삼출, 즉 진물이 흐르는 상처에서 순수한 흡수 기능을 통한 순수한 물리적 수준에서, 그리고 활성 성분의 방출을 통한 약리학적 수준에서의 영향과 상호작용이 관련된 만성적 상처의 경우 상처 삼출액(wound exudate) 관리는 또한 최근 수년 간 더욱 중요해지고 있다.

생장 인자와 같은 단백질 유효 성분을 콜라겐 매트릭스에 로딩하는 것은 오랫동안 알려져 왔고, 예를 들면 WO 85/04413 또는 US 5219576 (EP 0428541 B1)에 기재되어 있다.

그러나 지지 재료의 높은 기계적 안정성을 만족시키는 제품을 얻기 위해서, 또한 예를 들면 상처 또는 생체 내 임플란트에서 바람직하지 않은 과도하게 급속한 생물학적 분해를 감소하기 위해서, 가교 방법, 특히 화학적 가교제와의 가교가 알려지고, 널리 사용되고 있다. 특히, 에폭시 관능성 가교제와 콜라겐의 화학적 가교를 수행하는 것도 알려져 있다.

이와 관련하여, 에폭시 가교제와의 가교가 고체이며, 건조하고, 일반적으로 동결 건조된 콜라겐 재료에 대해 행해지는 것이 주로 알려진 방법이다. 예를 들면 DE 69533285는 화학적으로 가교되거나 또는 부분적으로 가교될 수 있는 생체 고분자 섬유의 반월상 인공 기관 (meniscus prostheses)에 대해 기재하고 있으며, 가교는 이미 동결 건조된 콜라겐 섬유에서 일어난다.

WO 2003/053490 A1 (EP 1455855 A1)는 또한 화학적으로 가교될 수 있는 동결 건조 콜라겐을 제공한다. 동결 건조된 콜라겐-엘라스틴 재료의 화학적 가교 역시 여기서 기재되고 있으며, 화학적 가교제로서 글루타르알레히드가 사용되고 있으며, 에폭시드는 가교제로서 일반적으로만 언급되고 있다.

DE 102006006461 A1 및 DE 102004039537 A1은 피부 세포 (전체 피부 모델)로 파퓰레이트된 (populated) 콜라겐 매트릭스를 제공하며, 여기서 콜라겐 재료는 글루타르알데히드와 화학적으로 가교된다. 다수의 화학적 가교제가 일반적으로만 열거되고 있다. 여기서는 또한 이미 동결 건조된 재료의 가교만이 설명된다.

이들 과정에서의 화학적 가교는 고체 콜라겐 재료, 특히 시트 또는 층상 형태의 콜라겐 재료를 가교제 함유 용액에 침지하는 것으로써 통상 수행된다. 시트상 고체 콜라겐 재료 (층상)는 일반적으로 먼저 종래의 방법에 의해 콜라겐 재료를 건조 (예를 들면 동결 건조)하여 얻어지고, 그 후 가교제를 함유하는 용액에 침지하고, 추가의 건조 (예를 들면 동결 건조)를 거친다. 부가적 단계에서, 가교 반응이 일어난 후, 결합되지 않은 과잉의 가교제는 강한 헹굼에 의해 재료로부터 일반적으로 씻겨나가고, 이것은 가교된 재료의 생체 적합성 또는 가교제 잔유물에 의해 유발되는 독성을 감소시키기 위해 필요하다.

대응하는 과정은 특히 "콜라겐계 재료의 가교" (dissertation R. Zeeman, 1998)와, Zeeman 등에 의한 J Biomed Mater Res, 46, 424-433, 1999 와, J Biomed Mater Res, 47, 270-277, 1999 및 Biomaterials, 20, 921-931, 1999, 그리고 J Biomed Mater Res, 51, 541-548, 2000에 기재되어 있다. 그 과정에서, 예를 들면, 동결 건조로 얻어진 층상 더멀 시프 콜라겐 (dermal sheep collagen) (DSC 층)은 산 또는 알칼리 pH에서 1,4-부탄딘올 디글리시딜 에테르 (BDDGE)와 같은 에폭시 관능성 가교제 용액에 침지되고, 실온 (20 - 30℃)에서 수 일간 가교된다. 완전히 가교된 콜라겐 층은 그 다음 세척되고 다시 동결 건조되어 에폭시 가교 콜라겐 재료로 만들어진다. 이들 공보에서, 가교를 위해 사용된 pH값은 가교된 재료의 유연성과 탄력성에 중요한 영향을 미치고, pH < 6의 산성 pH (pH 4-6)에서 가교된 재료는 알칼리 pH 값에서 가교된 재료에 비해 더 높은 유연성과 탄력성을 갖는다.

EP 0898973 B1 은 또한 콜라겐의 화학적 가교 과정에 대해 설명하고 있다. 여기서는 화학적 가교를 위해 가능한 출발 물질로서 원칙적으로 콜라겐 서스펜션이 언급되고 있다. 그러나, 언급된 가교 과정은 실질적으로 적어도 두 개의 가교 단계로 이루어지고, 일반적으로 pH 4 - 9의 값에서 수행된다. BDDGE와 같은 에폭시드 가교제에 의해 가교가 수행되는 오직 하나의 구체적인 실시예는 상술한 바와 같이 시트 형태의 더멀 시프 콜라겐 (DSC)와 관련되고, BDDGE 함유 용액에 침지되고, 7일간의 반응 시간 후에 세척된 후 다시 동결 건조된다.

가교가, 고체를 침지하고, 콜라겐 재료를 건조 (동결 건조)하고 다시 건조함으로써 수행되는 그와 같은 과정의 문제점은, 한편으로 수 회의 건조 단계를 수행할 필요가 있지만, 이는 특히 공정 경제에 악영향을 미치며, 다른 한편으로 수 일이 걸리는 가교 시간의 관점에서 매우 비경제적이라는 것이다. 또한, 가교되고, 이미 동결 건조된 재료가 다시 동결 건조될 때, 재료에 바람직하지 않은 변화, 특히 층상 재료에 수축 형태의 변화가 관측될 수 있다는 점이 발견되었다. 부가적인 2차 건조 과정에 의해 불가피하게 유발되는 콜라겐 재료에 대한 증가된 열 스트레스로 인한 콜라겐 재료의 구조에 대한 악영향, 예를 들면 콜라겐 펩타이드 구조의 변성 또는 다른 구조적 변화가, 특히 콜라겐이 천연의, 생물학적 구조의 단백질로서 존재하는 경우에 예상된다.

반대로, 예를 들면 EP 0793511 A1로부터, 콜라겐과 엘라스틴의 폴리머 혼합물을 포함하는 복합 생체 폴리머 발포체의 제조 방법이 알려져 있으며, 여기서 가교제는 폴리머 서스펜션에 부가되고, 단일 건조 단계, 특히 동결 건조가 수행된다. 그러나 에폭시 관능성 가교제와 그와 같은 폴리머 혼합물의 가교는 개시되어 있지 않다.

EP 0680990 A1 는 또한 가교제를 폴리머 서스펜션에 부가하는 것과, 콜라겐과, 예를 들면 글리콜, 바람직하게는 이관능성으로 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)와 같은 특히 관능적으로 활성화된 합성 친수성 폴리머인 합성 친수성 폴리머와의 폴리머 혼합물을 가교반응시키는 것에 대해 개시하고 있다. 가교제로서는 많은 가능한 가교제 중에서 에폭시드만이 일반적으로 열거되고 있다.

US 4,883,864 는 화학적으로 개질된 (가교된) 콜라겐 조성물을 개시하고 있으며, 여기서 콜라겐은 펩신에 의해 용해된 다음, 가교제의 부가에 의해 가교된다. 에폭시드는 이 공보에서도 마찬가지로 가능한 가교제로서 일반적으로만 언급된다. 실시예 18은 상기 발명에 의한 콜라겐 재료가 동결 건조되고 외과 스폰지 재료로서 사용되는 것을 언급하고 있다. 불용성 천연 콜라겐 또는 특히 동결 건조 단계와 관련하여 에폭시드의 구체적 사용에 대해서는 여기서도 언급되고 있지 않다.

화학적으로 가교된 콜라겐 재료, 특히 산 불용성 천연 콜라겐은 이미 본 출원인의 예전 특허 출원인 DE 10350654 A1에 의해 알려져 있다. 이 출원에서, pH 2-4의 수용성 콜라겐 서스펜션이 바람직하게 사용된다. 또한 그와 같은 수용성 콜라겐 서스펜션에 가교제를 부가할 가능성과 이어서 동결 건조가 언급되고 있다. 특히 산 매체에서 반응하는 가교제가 사용될 때, 가교 처리는 동결 건조 이전에 수행될 수 있음이 또한 언급되고 있다. 다관능성 가교제의 다양한 그룹이 가능한 가교제로서 열거되고 있으며, 이 일반적 목록은 또한 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE)와 같은 디에폭시드를 포함한다. 그렇지만 탈수 열처리 (dehydrothermal) 가교가 바람직하게 수행된다. EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드)에 의해 가교되는 물질에 대해, 콜라겐 재료의 혈관 생성 특성 (angiogenetic properties)에서의 놀라운 향상이 또한 언급된다. 거기서 바람직한 것으로서 알려진 탈수 열처리 가교와 관련하여, 적어도 50 - 180℃의 동결 건조 온도가 언급되며, 80℃를 넘는 고온이 탈수 열처리 가교에 대해 바람직한 것으로서 언급된다. 특히 예를 들면 pH 값 < 4와 동결 건조 온도 범위의 명확한 선택과 조합된, 가교제로서 에폭시드의 명확한 선택은 거기서 명확하지 않다. 더욱이 이 문헌은 섬유 상의 천연 불용성 콜라겐의 콜라겐 서스펜션의 워크업과 제조에 대해 설명하고 있다. 그러나 거기에는 이 워크업의 맥락 내에서 콜라겐 재료에서 형성될 것으로 추정되는 방출 가능한 산 용해성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분의 존재에 대한 언급은 없다. 특히 일반적으로만 언급되는 화학적 가교와 관련하여, 그와 같은 가용성 구성 성분의 보존 필요성이나, 가능성에 대해서도 언급되어 있지 않다. 반대로, 이 문헌은 산 불용성 콜라겐 재료의 바람직한 용도에 대해 명확하게 언급하고 있으며 산 가용성 콜라겐은 바람직하지 않다고 명확하게 언급하고 있다. 예를 들면 단백질 생성성 (proteinogenic) 유효 성분(생장 인자 등)의 도입은 여기서 캡슐화 및 마이크로스피어의 도입에 의해 이루어진다.

종래 천연의 산 불용성 콜라겐은 산 용액에 불용성이며, 원심 분리에 의해 침전되고, 광현미경으로 볼 수 있는 섬유를 함유한 콜라겐 서스펜션의 일부를 지칭하며, 본 발명의 범위 내에서 천연 산 불용성 콜라겐은 특히 pH < 4의 산 용액에서 불용성이며, 16,000g의 원심 분리에 의해 침전될 수 있고, 광현미경 하에서 볼 수 있는 섬유 (섬유 두께 0.2 mm 이상)를 함유하는 순수한 콜라겐 서스펜션의 분획을 포함한다.

한편, 천연의 가용성, 또는 산 가용성 콜라겐은 예를 들면 SEC (크기 배제 크로마토그라피)와 같은 공지의 방법에 의한 분획에 의해 분자량이 > 250 kDa인 더 큰 분자량의 천연의 완전한 콜라겐 분자와, 분자량이 < 250 kDa인 작은 분자량의 콜라겐 펩타이드로 분리될 수 있다. 작은 분자량의 콜라겐 펩타이드는 따라서 완전한 콜라겐 분자로 할당될 수 없다.

원칙적으로, 낮은 분자량의 펩타이드 구성 성분 뿐 아니라, 가용성의 완전한 콜라겐 분자의 존재는 이후에 설명될 실시예에서와 같이 SDS-PAGE (소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)과 같은 공지의 방법에 의한 가용성 구성 성분의 분석에 의해 정량적으로 검출될 수 있다.

산 가용성 콜라겐 구성 성분과 콜라겐 펩타이드는 여러 가지 유리한 특성을 갖는다. 예를 들면, 그들은 막 형성성을 갖기 때문에 피부에 국부적으로 적용되거나 캐리어 물질로부터 방출될 때, 피부의 수분 보유 능력을 향상시킬 수 있고, 따라서 필름 형성을 통해 경표피 수분 손실을 감소시킨다. 더욱이 가용성 콜라겐 단편은 상처 치료와 세포군의 제어 가능성에서 긍정적인 특성을 가져오는 중요한 신호 메신저 및 매트릭스 구성 성분이며, 이는 소위 세포군의 발현 프로파일에 대해 조직 공학의 분야에서 특히 유리하고 바람직하다. 본 발명의 중요한 측면은 따라서, 동결 건조에서 다른 저분자량 펩타이드 구성 성분 뿐만 아니라 그와 같은 산 가용성 콜라겐 구성 성분과 펩타이드를 보존하는 것이고, 그에 의해 분해 안정화된 (화학적으로 가교된) 콜라겐 매트릭스가 사용될 때 매트릭스로부터 방출되고, 응용 면에서 유리한 작용을 달성할 수 있게 된다.

종래 기술에서 알려진 화학적으로 가교되고 그에 의해 분해 안정화된 콜라겐 재료는 예를 들면 스플릿-스킨 콜라겐 (split-skin collagen) 또는 상술한 더멀 시프 콜라겐 (DSC)의 경우 재료의 기본 물성과 수행되는 에폭시드 가교 과정 및 거기에 적용된 가교 조건 때문에 더 이상 산 가용성 콜라겐 부분, 단편 및 다른 펩타이드 구성 성분을 함유하지 않는다. 종래 기술에서 설명된 에폭시 가교 공정은 적어도 72시간에 걸친 긴 기간 동안 용매의 부피로서 많은 양의 현저하게 과도한 가교제를 사용하여 수행된다. 원 재료에 존재할 수 있는 가용성 부분들은 따라서 다량의 용매에 의해 유리되고 희석되어 세척된다. 높은 희석 효과의 결과, 가용성 펩타이드와 콜라겐 부분들은 매우 소량만이 재료에 존재한다. 아직 남아 있는 소량의 가용성 펩타이드 및 콜라겐 구성 성분들은 고농도의 가교제에 의해 긴 가교 시간 동안 콜라겐 섬유 (collagen strand)와 가교되고 따라서 가교 물질에 분리 불가능하게 결합된다. 상술한 공정은 필수 단계로서 부가적으로 가교 물질로부터 가교제를 세척하는 단계를 포함하기 때문에 비결합 가용성 콜라겐 부분 또는 가용성 콜라겐 단편 또는 저분자량 가용성 펩타이드 구성 성분들은 늦어도 세척 단계에서 가교 재료에서 씻겨 나간다. 따라서 종래 기술은 화학적 가교의 결과 높은 분해 안정성과 기계적 강도를 가질 뿐 아니라 동시에 높은 생체 적합성 (저독성)을 갖는 화학적으로 가교된 콜라겐 재료와 가교된 재료에서 방출가능한 산 가용성 콜라겐 부분, 단편 및/또는 다른 펩타이드 구성 성분을 제공하지 않는다.

그러므로 본 발명의 목적은 화장품 및 의학 용도에 적합한 높은 생물학적 분해 안정성 (가수분해 안정성)과 특히 함수 상태에서 높은 기계적 인열 강도 (습윤 인열 강도)를 갖는 동결 건조 콜라겐 매트릭스를 제공하는 것이다. 또한 콜라겐 매트릭스는 낮은 독성으로 특징 지워지는 높은 생체 적합성을 가지며, 사용 시 가교된 매트릭스로부터 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분의 방출을 허용한다. 또한, 가교된 콜라겐 매트릭스는 높은 액체 흡수 능력과 함수율을 갖고, 콜라겐 매트릭스는 감촉이 좋고 매력적인 시각 특성 (즉 높은 광학 밀도)를 가질 뿐 아니라 유연성과 탄력성이 높아서 특히 화장품 또는 약제, 특히 화장품용 드레싱 또는 마스크 및 치료제, 임플란트 또는 지혈제, 조직 공학에서 세포군/세포 배양용 스캐폴드로서 적합하다. 다른 측면에서, 콜라겐 매트릭스는 강성의 제어된 적용 결과로서 생물공학, 기초 연구 및 조직 공학 분야에서 의도적으로 영향을 미치게 되는 세포 분화 및 세포의 발현 패턴을 가능하게 한다. 세포의 발현 패턴의 영향에 대해 안정하고 최적화된 스캐폴드와 콜라겐 재료의 높은 생체 적합성은 예를 들면 임플란트로 사용될 때 및 조직 공학에서 세포 스캐폴드로서 사용될 때, 새로운 세포와 그들의 기능 향상에 필수 요건이다.

마지막으로 그러나 역시 중요한 것으로서, 본 발명에 의한 방법은 경제성의 관점에서 종래 기술에 비해 뛰어나다.

본 발명의 발명자들은 섬유 상이며 산 불용성 천연 콜라겐 외에 또한 상술한 바와 같이 정의된 천연 가용성 (산 가용성) 콜라겐 분획과 콜라겐 펩타이드 및/또는 구조형성제와 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분을 포함하는 콜라겐의 수용성 서스펜션에 pH < 4에서 에폭시 관능성 가교제를 부가하고, 100℃ 미만의 온도에서 동결 건조함으로써 그와 같은 특정한, 향상된 콜라겐 재료를 얻을 수 있음을 발견했다.특히, 놀랍게도 이 신규한 방법은 가교도에 대한 손실 없이 에폭시드 가교제의 함량을 종래 기술에서 알려진 가교제의 함량과 비교해서 극적으로 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 감소된 가교제 함량 뿐 아니라 pH < 4의 낮은 pH값은 특히 동결 건조 후의 잔여 에폭시드 활성의 관점에서 및 사용 시 방출될 수 있는 비가교된 가용성 콜라겐 및 펩타이드 구성 성분의 보존의 관점에서, 따라서 가교된 콜라겐 재료의 독성 및 생체 적합성의 관점에서 특히 바람직하다. 탈수 가열 가교에서 종래 적용되는 것보다 낮은 동결 건조 온도는 경제적 관점에서 유리할 뿐 아니라, 특히 온화한 공정과 온도 민감성 구성 성분 (즉, 불안정한 유효 성분)의 보호를 위해 필수적이다. 본 발명에 의한 방법의 또 다른 유리한 점은 콜라겐 서스펜션에 가교제를 부가하고 동결 건조 종료 전에 바람직하게는 24시간을 넘지 않는 콜라겐/가교제 혼합물의 짧은 유지 시간 (standing time)으로 가교된 목표물을 직접 제공하는 동결 건조를 수행함으로써 소위 원-포트 공정 (one-pot process)을 사용하는 것이다. 따라서 전체적으로 현저하게 경제적인 절차가 가능하다.

따라서, 특히 상기 목표들은 사용시 방출가능한 비가교된 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분을 함유하는, 기계적으로 안정하고 분해 안정화된, 생체 적합성 에폭시 가교된 콜라겐 매트릭스의 제조를 위한 공정에 의해 달성될 수 있으며, 상기 공정은 다음의 단계들을 포함한다:

a) 수용성 콜라겐 서스펜션을 제조하는 단계,

b) 단계 a)의 콜라겐 서스펜션의 pH값을 pH < 4로 조정하는 단계,

c) 구조 형성제, 유효 성분들 및/또는 보조 성분을 선택적으로 부가하는 단계,

d) 에폭시 관능성 가교제를 부가하는 단계, 단계 c)와 d)의 순서는 변경 가능,

e) 단계 d)에서 얻어질 수 있는 콜라겐 혼합물을 동결하는 단계,

f) 동결 건조 온도 < 100℃에서 단계 e)의 동결 혼합물을 동결 건조하는 단계,

g) 동결 건조 콜라겐 재료에 대한 수분 함량이 < 25wt% 되도록 동결 건조된 가교 콜라겐 재료를 선택적으로 조정하는 단계,

h) 선택적으로 단계 g)에서 얻어질 수 있는 재료를 원하는 형태로 변환, 살균 및 처리하는 단계.

본 발명은 또한 이 공정에 의해 얻어질 수 있는 사용시 방출가능한 비가교된 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분을 함유하는, 기계적으로 안정하고 분해 안정화된, 생체 적합성 가교 콜라겐 매트릭스를 제공한다.

가교 콜라겐 매트릭스를 제조하기 위해 본 발명에 의해 사용되는 콜라겐은 특히 소, 돼지, 말 또는 인간 유래이거나, 유전 공학에 의해 제조된 콜라겐이다. 특히 소에서 유래한 콜라겐이 바람직하다. 특히 바람직한 콜라겐의 제조는 출원인에 의한 DE 4048622 A1 및 DE 10350654 A1 에 설명된다. 거기에 설명된 콜라겐 스폰지의 제조를 위한 공정은:

- 콜라겐 원재료를 알칼리 처리하고,

- 얻어진 콜라겐 재료를 세척하고,

- 얻어진 콜라겐 재료를 산처리하고,

- 얻어진 콜라겐 재료를 세척하고, 및

- 얻어진 콜라겐 재료를 특히 콜로이드 밀을 사용하여 분쇄하는 것을 포함하며, 언급된 각 단계는 선택적으로 여러 번 반복될 수 있다.

그에 의해 소위 섬유소 (fibre) 및 원섬유 (fibril) 형태의 천연 산 불용성 콜라겐의 수용성 콜라겐 서스펜션이 얻어지며, 서스펜션은 부가적으로 측정가능한 양의 산 가용성 콜라겐과 산 가용성 펩타이드 구성 성분을 포함한다. 그와 같은 산 가용성 분획의 정량적 검출은 예를 들면 여기서 설명되는 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 수행될 수 있다. 이 콜라겐 서스펜션은 본 발명에 의한 공정에 의해 pH값을 pH < 4로 조정함으로써, 선택적으로 구조 형성제, 화장품 또는 약학적 유효 성분 및 보조 성분을 부가하고, 이어서 에폭시 관능성 가교제를 부가하고, < 100℃의 동결 건조 온도에서 동결 건조됨으로써 본 발명에 의한 제품을 제공한다.

이미 천연 가교된 콜라겐 섬유와 화학적으로 가교된 콜라겐 섬유 양쪽의 분해는 더 작은 상대 표면적 및 섬유 복합체에 포함된 개별 프로테인 사슬의 감소된 접근 가능성으로 인해 현저하게 천천히 발생한다.

본 발명에 의한 콜라겐 재료는 실질적으로 타입 Ⅰ, Ⅲ 및 Ⅴ이며, 주로 타입 Ⅰ이다. 본 발명에 의한 공정에서 사용되는 콜라겐 서스펜션은 예를 들면 DE 3203957 A1에서 알려진 공정에 의해 얻어질 수 있으며, 미리-분쇄되고, 균질화되며, 해섬된 (defibrated) 형태의 전처리되고 순수한 콜라겐을 함유하며, 본 발명에 의한 가교 콜라겐 매트릭스의 제조를 위한 출발 물질을 나타내는 수용성 분산액으로서 존재한다.

분산액의 건조 중량은 대략 1 - 4wt%, 바람직하게는 1.5 - 2.5wt%가 되어야 한다. 수용성 분산액의 pH값은 4 미만이어야 하며, 그렇지 않으면 pH값은 pH < 4로 조정되어야 한다. pH 값의 조정은 바람직하게는 묽은 염산으로 수행된다. 바람직하게는 수용성 콜라겐 서스펜션의 pH값은 pH 2.5-3.5, 더욱 바람직하게는 pH 2.7 - 3.3, 가장 특히 바람직하게는 pH 3으로 조정된다.

상술한 제조에 의해, 특히 분쇄 단계에 의해, 얻어진 콜라겐 서스펜션은 통상 섬유 상의 천연 산 불용성 콜라겐 외에도 또한 산 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분을 함유하며, 이들은 콜로이드 분쇄에 의해 방출되고 본 발명에 의하면 바람직하다. 그와 같은 산 가용성 구성 성분의 양은 공정에 의해 제어될 수 있으며, 바람직한 양으로 조정된다. 콜라겐 서스펜션 내에서 바람직한 산 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분의 양은, 콜라겐 서스펜션의 건조 무게에 대해 7wt%까지이며, 16,000g로 원심분리 후 동결 건조되어 얻어진 가용성 구성 성분의 중량으로 결정된다.

이하에서 설명되는 존재할 수 있는 구조 형성제 또는 선택적으로 화장품 또는 약학적 유효 성분 및 선택적으로 부가 성분을 본 발명에 의한 콜라겐 조성물에 부가하는 것은 이 시점에서 수용성 콜라겐 서스펜션에 부가함으로써 수행된다. 추가의 구조 형성제 또는 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 구성 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분 등의 군으로부터의 유효 성분의 부가에 의해, 콜라겐 서스펜션에서 상술한 가용성 콜라겐 및 펩타이드 구성 성분의 양은 자연적으로 증가될 수 있고, 특히 그에 의해 7wt% (건조 중량)를 넘는 현저히 다량의 함량을 성취할 수 있게 된다. 소량의 산 가용성 콜라겐 및 펩타이드를 그 자체로 함유하는 콜라겐 서스펜션이 사용될 경우, 그와 같은 구성 성분은 이 시점에서 원하는 양으로 서스펜션에 바람직하게 혼합될 수 있다.

그리고 나서 콜라겐 서스펜션에 에폭시 가교제의 부가가 행해진다. 그러나, 구조 형성제, 유효 성분 또는 존재할 수 있는 추가 성분의 부가 전에 에폭시 가교제를 혼합하는 것도 동등하게 가능하다. 이들 단계들은 따라서 연속 공정에서 변경가능하며, 원칙적으로 서로 교환가능하다.

에폭시 관능성 가교제는 폴리올 폴리글리시딜 에테르, 글리콜 디글리시딜 에테르, 글리세롤 디글리시딜 에테르, 글리세롤 트리글리시딜 에테르, 디글리세롤 테트라글리시딜 에테르, 에틸렌 글리콜 글리시딜 에테르, 부탄디올 디글리시딜 에테르와 같은 1-3의 중합도를 갖는 폴리올 폴리글리시딜 에테르 등의 폴리에폭시 화합물, 특히 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 디카르복실산 디글리시딜 에테르 등 뿐 아니라 디에폭시드를 포함하는 에폭시드 화합물 (에폭시드)의 군에서 선택된다. 에폭시 관능성 가교제는 특히 하기의 일반식에 의한 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 또는,

폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 프로필렌 글리콜의 폴리글리시딜 에테르 관능성 분자의 기로부터 선택될 수 있으며,

여기서 글리시딜 에테르 유도체는 하기의 일반식으로 표시된다.

여기서, x + z = 0 - 70 이고, y = 0 - 90이다.

디에폭시드기는 특히 하기의 일반식에 해당하는 기를 포함한다.

여기서, R은 가교 공정을 방해하지 않으며, 및/또는 수용액에서 가교 성분의 수용성을 감소시키지 않는 어떤 치환기로도 치환될 수 있으며, n=1-6이고 바람직하게는 n=1-4이다.

원칙적으로, 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 기본적 특성은 예를 들면 이관능성, 사슬 길이 등에 대해 적절한 가교제를 선택함으로써 제어될 수 있다.

수용성 에폭시드 가교제가 바람직하다; 에폭시드 가교제는 특히 바람직하게는 디에폭시드들의 기에서 선택되며, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE)가 가장 바람직하다. 적절한 조건 하에서 에폭시드 화합물은 아민과 카르복실기를 포함하는 다수의 관능기와 산 촉매 및 염기 촉매 반응을 모두 수행할 수 있다. 종래 기술 (예를 들면, Zeeman et al.)에서, 산 pH 범위 (pH 4-6)의 가교에 대해 일차적으로 카르복실기의 가교가 일어나는 반면, 알칼리 가교 (pH 9)에서는 아미드 기에서의 가교가 우선 일어나는 것으로 설명하고 있다.

가교제 및 가용성 프로테인 및 펩타이드 구성 성분, 유효 성분 및/또는 부가 성분의 군으로부터의 가능한 추가의 구성 성분의 결합을 위해, 콜라겐 서스펜션은 바람직하게는 실온 (23℃) 미만의 온도로 냉각된다. 특히, 혼합은 20℃ 미만의 온도, 바람직하게는 10℃ 미만의 온도, 특히 바람직하게는 5℃ 이하의 온도에서 일어나고, 콜라겐 서스펜션/혼합물의 온도는 연속 공정의 이 시점에서 혼합물의 동결 온도까지는 아직 내려가지 않는다.

이와 같이 상술한 선택적으로 추가의 구조 형성제, 유효 성분 및/또는 부가 성분 (콜라겐 혼합물) 뿐 아니라 가교제를 함유하고, pH값이 4 미만인 수용성 콜라겐 서스펜션이 얻어지고, 서스펜션은 바람직하게는 24시간 이내로 동결되어 수용성 콜라겐 혼합물의 대기 시간 (포트 시간)이 가능하면 24시간을 넘지 않게 한다.

이 대기 시간 (포트 시간) 동안의 수용성 콜라겐 혼합물의 바람직한 온도는 상기 정의된 혼합 작업의 감소된 온도에 대응하고, 따라서 콜라겐 혼합물은 어떤 대기 시간 동안에도 콜라겐 혼합물을 동결시키지 않고 20℃ 미만의 온도, 바람직하게는 10℃ 미만의 온도를 유지한다.

혼합 동안 및 동결 전 콜라겐 혼합물의 대기 시간의 감소는 본 발명에 의한 동결 건조된 콜라겐 매트릭스의 기계적 안정성 (습윤 인열 강도)에 대해 놀랍게도 유리한 작용을 갖는다. 예를 들면, 놀랍게도 기계적 습윤 인열 강도의 향상이 대기 시간 동안의 온도를 낮춤으로써 얻어질 수 있다는 것이 밝혀졌다.

바람직하게는, 이어지는 동결은 0.5 - 4시간, 더욱 바람직하게는 1 - 3시간 동안 -10 내지 -60℃에서 수행된다.

놀랍게도, 종래 기술에서 설명된 바와 같이 수 일 동안의 긴 대기 시간은 완전하고 만족스러운 가교의 달성에 완전히 필수적인 것은 명백하게 아니라는 것이 발견되었다. 이와 대조적으로, 놀랍게도 본 발명에 의한 공정에서 동결 건조에 앞선 보다 긴 대기 시간은 가교도에 악영향을 미치고, 따라서 인열 강도 (습윤 인열 강도) 및 분해율에 악영향을 미친다는 것이 발견되었다. 이와 관련하여, 본 발명에 의한 공정에서 수용성 콜라겐 혼합물을 제조 바로 직후에, 바람직하게는 24시간을 넘지 않는 기간 동안, 더욱 바람직하게는 18시간을 넘지 않는 기간 동안, 특히 바람직하게는 12시간 보다 짧은 기간 동안 동결하는 것이 유리하다는 것이 밝혀졌다. 짧은 대기 시간은 재료 특성에 대한 유리한 효과 외에도, 공정 경제의 이유에서도 바람직하다.

수용성 혼합물에서 펩타이드 분자와 가교제 분자 사이의 가교 반응은 수용성 서스펜션의 즉시 동결에 의해 억제되고, 이것은 이하에서 설명되는 바와 같이 처리 반응 매카니즘에 대한 이론에 의해 바람직한 것으로 추정되고 있다.

수용성 콜라겐 서스펜션에 대한 에폭시 관능성 가교제의 부가에서 경쟁 반응은 원칙적으로 한편에서는 에폭시드 가수 분해 (에폭시드

H₂O)와, 다른 한편의 에폭시드와 프로테인 간의 가교 반응 (에폭시드

프로테인) 사이에서 일어난다. 즉시 동결은 반응 구성 성분들을 고정시키고, 반응을 말 그대로 동결시킨다. 또한 그에 따라 물은 매우 순수한 형태로 동결되고, H₂O 결정 주변부에서 해리된 구성 성분 (에폭시드)가 이동되고, 에폭시드는 가교될 프로테인에 상대적으로 근접한 집중된 형태로 편재된다. 프로테인에 대한 에폭시드의 상대적인 근접성 및 증가된 농도로 인해, 콜라겐 섬유와의 바람직한 반응 역학이 얻어질 수 있고, 경쟁 반응은 "에폭시드

프로테인" 방향으로 이동한다. 또한 동결된 물 분자가 승화에 의해 즉시 기체 상태로 전환됨에 따라 거기서 일어나는 에너지 입력을 통해 동결 건조 과정이 시작됨으로써, 그에 의해 반응이 개시되는 에폭시드

프로테인 반응을 위한 활성 에너지도 또한 이용가능하게 된다는 점 역시 추정된다. 더욱이, 승화로 인해 물은 더 이상 액체 상의 중간 상태를 거치지 않기 때문에, 가수 분해 반응 (에폭시드

H₂O)이 부가적으로 억제된다.

따라서, 본 발명에 의하면 수용성 서스펜션에서 반응 시간을 가능한 한 짧게 유지하는 것과, 서스펜션을 가능한 한 빨리 동결 형태로 전환시키는 것이 특히 바람직하다.

상술한 설명에 근거해서, 특히 본 발명에 의한 공정에서 에폭시 가교제를 극도로 소량 사용하는 것도 가능하다. 본 발명에 의하면, 사용된 에폭시 농도는 최대 50wt%까지, 바람직하게는 20wt%, 더욱 바람직하게는 10wt%, 특히 바람직하게는 7wt%까지이며, 각각은 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대한 것이며, 또는 최대 1wt%까지, 바람직하게는 0.4wt%까지, 더욱 바람직하게는 0.2wt%까지, 특히 바람직하게는 0.14wt%까지이며, 각 경우는 수용성 콜라겐 서스펜션에 대한 것이다 (선택적으로 구조 형성제, 활성 성분과 보조 성분들을 포함할 수도 있다).

만족스러운 가교도를 달성하기 위해 (습윤 인열 강도/분해 속도/가수 분해 안정성), 가교제는 바람직하게는 적어도 0.5wt% , 더욱 바람직하게는 적어도 1wt%, 더더욱 바람직하게는 적어도 3wt% 사용되며, 각각의 경우는 수용성 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대한 것이다. 또는 적어도 0.01wt%, 바람직하게는 적어도 0.02wt%, 더욱 바람직하게는 적어도 0.06%wt%이며, 각각의 경우는 수용성 콜라겐 서스펜션에 대한 것이다 (선택적으로 구조 형성제, 유효 성분과 보조 성분들을 포함할 수도 있다). 적절한 가교제 농도의 선택은 바람직한 물질 특성 및 특별한 사용 분야에 대한 중요도에 달린 것이다.

대조적으로 종래 기술에서 사용되는 에폭시드 농도는 훨씬 더 높다. 그와 같은 낮은 에폭시드 농도의 사용은 특히 생체 적합성에 대해 바람직한 효과를 나타내며, 이는 최종 제품의 에폭시드 가교제의 잔여 활성 (그리고 따라서 낮은 독성)에 대응되며, 최종 제품의 사용 시에 부가적으로 방출된 산 가용성 콜라겐 및 펩타이드 구성 성분의 바람직한 보존을 허용한다.

관련된 독성 잠재성으로 인해, 잔여 에폭시드 활성은 가교 매트릭스의 생체 적합성의 척도를 나타낸다. 잔여 에폭시드 활성의 판단은 변형 NBP 분석 (니트로벤질-피리딘 분석)에 의해 수행될 수 있으며, 상기 NBP 분석은 Agarwal 등에 의한 "4-(p-니트로벤질피리딘)에 의한 에폭시드의 검출" (1979) (Bull. Environm. Contam. Toxicol. 23, p. 825-829)에 기초한 것이며, 변형은 여기서 상술한 바와 같이 Zocher 등 (2000)에 의해 "방선균의 에폭시드 가수 분해 효소 활성" (J. Biotechnol. Feb 17; 77(2-3), p. 287-292)에 따라 행해졌다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 낮은 잔여 에폭시 활성, 그에 의한 높은 생체 적합성은 또한 공정 상 바람직한 pH 4 미만의 낮은 pH값에서 기인할 수 있다. 그 이유는 최종 제품의 낮은 pH값은 남아 있는 잔여 에폭시드의 빠른 가수 분해에 영향을 미치고, 따라서 최종 제품에서의 그것의 분해도를 가속화하기 때문이다. 이 효과는 또한 이하에서 더 설명되는 바와 같이 가교 콜라겐 매트릭스 (최종 제품에서)의 수분 함량에 의해서도 상당히 영향을 받는다.

놀랍게도 본 발명에서 바람직한 낮은 에폭시드 농도는 인열 강도, 가수 분해 안정성 및 효소 분해 (즉, 콜라게나제 분해)에 대해서도 상당한 영향을 미친다는 것이 발견되었다. 여기서 최적의 결과는 상기에서 정의된 바람직한 범위에서 달성된다.

상술한 단계들에 의해 얻어질 수 있는 서스펜션은 바람직하게는 시트 형태로 동결되지만, 다른 가능한 기하학적, 천연 형태 또는 생리학적 형태로부터 적용되는 어떤 구성 또한 가능하다. 결과 시트의 두께는 0.5-5.0cm, 바람직하게는 1.0-3.0cm, 특히 바람직하게는 1.5-2.0cm이다,

특히 높은 흡수성 또는 수분 흡수 능력 및 가수 분해 속도의 이유로 본 발명에 의한 공정에 의해 얻어질 수 있는 콜라겐 매트릭스는 다공성 콜라겐 재료이다. 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 다공성 역시 조직 공학에서 세포군/세포 배양을 위한 스캐폴드로서의 적합성에 대한 중요한 특성을 나타낸다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 다공도는 실질적으로 두 개의 파라미터, 즉 재료 밀도와 얼음 결정 크기의 함수이다. 수용성 서스펜션에서 높은 고체 함량은 동결 건조된 최종 제품에서 재료 밀도를 증가시키고, 재수화제/고체 표면을 감소시킨다. 한편, 높은 동결 변화도 (freezing gradient)는 작은 얼음 결정을 가져오고, 이것은 재수화를 보조하는 넓은 내부 재료 표면을 초래한다. 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 구멍 크기는 따라서 동결 속도 제어에 의해 의도적으로 영향을 받을 수 있다. 또한 덜 바람직하기는 하지만 표면 활성제의 부가에 의해 구멍 크기에 영향을 미치는 것 역시 가능하다.

얻어진 시트는 선택적으로 -3 내지 -35℃에서 중간 보존될 수 있다. 바람직하게는 동결 시트는 적어도 24시간 동안 보존된다.

동결 및 선택적 중간 보존 후에, 시트는 동결 건조된다.

놀랍게도 기계적 인열 강도, 가수 분해 안정성, 낮은 잔여 에폭시 활성에 대응하는 생체 적합성과 최종 제품에서 방출될 수 있는 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분 및 방출가능한 구조 형성제 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분 등의 보존 및 재료의 유연성, 탄성 및 부드러움의 형태의 감촉 관련 측면에서, 바람직한 최적의 특성을 갖는 가교 콜라겐 매트릭스를 얻기 위해 본 발명에 의한 공정에서 동결 건조 온도는 100℃를 넘으면 안된다는 것이 밝혀졌다. 콜라겐 매트릭스의 탈수 가열 가교를 달성하기 위해서는 상대적으로 높은 동결 건조 온도인 50-180℃, 바람직하게는 80℃를 넘는 온도가 적용되는 것이 종래 기술로부터 알려졌다. 또한 가교도, 따라서 인열 강도는 동결 건조 온도에 따라 증가한다는 것 역시 알려져 있다. 특히 높은 가교도는 종래 기술에 의하면, 예를 들면 80 - 150℃ 또는 110 - 150℃ 의 동결 건조 온도에 의해 달성된다. 따라서 높은 동결 건조 온도는 또한 가교도에 대해 더 좋은 결과를 나을 것이고, 따라서 가교제의 사용과 관련하여 인열 강도에 대해서도 더 좋은 결과를 나을 것으로 예측될 것이다. 그렇지만, 이와는 반대로, 본 발명에 의한 에폭시드 가교 공정에서 높은 동결 건조 온도는 인열 강도 (습윤 인열 강도)에 대해 더 나쁜 결과를 초래한다는 것이 밝혀졌다. 특히, > 100℃에서의 탈수 가열 후 가교는 습윤 인열 강도에 대해 악영향을 미친다는 것 역시 밝혀졌다. 이 영향은 화학 가교 및 탈수 가열 가교의 부가적 영향을 기대한 당업자에게는 놀라운 것이다.

본 발명에 의한 100℃ 미만 온도의 동결 건조의 유리한 점은 승화 과정의 관련된 연장에 의해 결정된다. 비교적 낮은 동결 건조 온도로 인해, 재료의 완전한 건조를 위해 연장된 승화 과정이 필요하고, 그 결과 가교제와 프로테인 분자의 완전한 반응을 위해 연장된 기간이 이용가능하다. 따라서 가교 반응의 완료는 연장된 승화 과정 동안 가능하며, 이것은 더 높은 가교도를 가져온다. 반면, 높은 동결 건조 온도는 비균질적이고, 비균일하게 발생하는 촉진된 가교 반응을 초래하여 최종 제품이 낮은 인열 강도를 갖게 된다. 따라서 본 발명에 의한 공정은 100℃ 미만의 동결 건조 온도로 수행되고, 더욱 바람직한 동결 건조 온도는 85℃ 미만, 더욱 더 바람직한 온도는 80℃ 미만이다.

이미 위에서 언급한 바와 같이, 만족스러운 탈수 가열 가교를 달성하기 위해 유리한 동결 건조 온도인 100℃ 를 넘는 온도는 방출가능한 가용성 콜라겐 및 펩타이드 구성 성분 및/또는 구조형성제 또는 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 생성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분의 군으로부터의 유효 성분 보존의 관점에서는 불리하며, 그 이유는 이들 성분이 동시에 가교되고 따라서 재료에 분리가능하게 결합되기 때문이고, 다른 한편으로는 너무 높은 온도에서는 프로테인 형성성 구성 성분의 원하지 않는 - 적어도 부분적인 - 열 변성이 일어날 수 있기 때문이다.

종래 기술에서 설명된 가교 공정에 의하면, 20 - 30℃ 범위의 동결 건조 온도가 사용되고, 동결 건조 전에 44시간까지의 즉, 수일 간(7일간까지)의 상대적으로 긴 가교 시간이 필요하다. 한편, 본 발명에 의한 공정에서는, 동결 건조 전에 부가적인 가교 시간이 필요하지 않으며, 동결 건조 전 콜라겐 서스펜션의 대기 시간은 24시간을 넘지 않게 수행되고, 가교는 실질적으로 동결 건조 공정 중에 일어난다. 특히, ≥ 40℃의 동결 건조 온도, 바람직하게는 ≥ 50℃, 더욱 바람직하게는 ≥ 60℃의 온도가 최적 공정을 위해 유리하다. 본 발명에 의한 공정에서 가교 반응은 실질적으로 동결 건조 동안 일어나기 때문에 상술한 바와 같이 높은 가교 온도는 특히 짧은 동결 건조 시간을 가능하게 하고, 따라서 가교도 및 얻어진 재료의 안정성에 대한 악영향 없이 가교 시간을 특히 짧게 할 수 있다. 더욱이 시간 상의 이점은 가교 반응과 동결 건조가 단일 단계에서 수행되는 것으로부터도 얻어질 수 있다.

본 발명에 의한 공정에서, 얻어진 동결 건조 가교 콜라겐 재료의 수분 함량은 선택적으로 동결 건조 재료 (재수화)에 대해 최대 25wt%까지 조정된다. 더욱 바람직하게는 조정은 동결 건조 콜라겐 재료에 대해 20wt%까지, 더욱 바람직하게는 15wt%까지에 대해 행해진다. 바람직하게는 수분 함량의 재수화 또는 조정은 동결 건조 콜라겐 재료에 대해 적어도 3wt%, 더욱 바람직하게는 5wt%, 더더욱 바람직하게는 7wt%까지 수행된다. 특히, 동결 건조 콜라겐 재료에 대해 수분 함량이 3 - 25wt%, 더욱 바람직하게는 5 - 20wt%, 더더욱 바람직하게는 7 - 15wt%로 조정되는 것이 유리하다. 재수화 또는 수분 함량의 조정은 원칙적으로 실내 공기 조정 또는 수분 조정을 위한 공지의 방법에 의해 수행된다. 예를 들면 본 발명에 의한 동결 건조 콜라겐 재료는 적절하게 기후 제어된 실온 조건, 예를 들면 10 - 25℃, 상대 습도 40 - 95%, 더 바람직하게는 50 - 75%에서 적절한 시간 동안, 예를 들면 5 - 120시간, 더욱 바람직하게는 12-80시간 동안 보존됨으로써 조정 또는 조절된다. 원칙적으로 이 기술 분야에서 통상의 기술자는 바람직한 습도 조정에 대해 최선의 가능한 결과를 달성하기 위해 언급된 파라미터, 즉 온도, 습도 및 보존 시간을 적절히 조합할 수 있다.

놀랍게도 동결 건조된 콜라겐 재료의 그와 같은 수분 함량의 조절은 동결 건조 재료에서 에폭시드 가교제의 잔여 활성에 대해 유리하다는 것이 밝혀졌다. 특히, 여기서 정의된 결정 방법에 의해 잔여 에폭시 활성이 더 이상 검출되지 않는 수준까지의 감소가 재수화 조건 (수분 함량, 보존 시간)의 적절한 선택에 의해 현저하게 촉진됨을 볼 수 있었다. 특히, 재수화 파라미터의 선택에 의해 잔여 에폭시 활성의 고갈을 의도적으로 제어할 수 있고, 따라서 경제적으로 유리한 방식으로 공정에 영향을 줄 수 있다.

본 발명에 의해 만들어지는 에폭시 가교 동결 건조 콜라겐 매트릭스는 바람직하게는, 선택적으로 적절한 형태로 절단되고, 소독 및 처리될 수 있는, 다공성의 스폰지형 제품이다.

단계 d)에 따라 콜라겐 재료를 원하는 형태로 전환시키는 것은 절단에 의해 유리하게 수행된다. 원칙적으로, 종래의 공지의 공정을 사용하여 원하는 어떠한 기하학적 형태 또는 두께로도 절단될 수 있다.

본 발명의 의한 콜라겐 매트릭스의 소독은 특히 치료 목적으로 사용될 경우에 중요하며, 종래의 방법들이 여기에서도 참고로 인용된다. 감마/X선에 의한 소독이 바람직하다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스에 대한 처리는 선택적으로 인쇄, 엠보싱, 스탬핑, 천공 및/또는 라미네이션과 선택적인 레이저 각인과 포장을 포함한다.

본 발명에 의한 다공성 콜라겐 매트릭스는 바람직하게는 대략 0.1 - 30mm, 더욱 바람직하게는 0.5 - 20mm, 더욱더 바람직하게는 1 - 10mm의 두께 (가장 작은 종적 범위를 갖는 치수)를 갖는 층상 물질의 형태로 제공된다.

본 발명에 의한 가교 콜라겐 매트릭스는 콜라겐 외에, 선택적으로 적어도 하나의 구성 성분을 더 포함할 수 있으며, 상기 구성 성분은 구조형성제, 화장품 또는 약학적 유효 성분 및/또는 보조 성분의 군에서 선택된다.

구조형성제의 군에서 알긴산 염류, 엘라스틴, 히알루론산이 바람직하게 선택된다.

본 발명의 범위 내에서 화장품 유효 성분은 질병, 고통, 물리적 상처 또는 병리적 통증의 완화 또는 제거를 일차적으로 의도하지 않는다면, 특히 세척, 케어의 목적으로, 또는 외모 또는 체취에 영향을 주기 위해, 또는 체취를 부여하기 위해, 인간에게 외적으로 적용되도록 의도된 유효 성분들을 포함한다.

이 맥락에서, 본 발명에 의한 화장품용 재료는 예를 들면 입욕제, 피부 세정 및 크렌징제, 피부케어제, 특히 얼굴 피부 케어제, 눈화장품, 입술보호제, 손톱 보호제, 발 보호제, 머리카락 보호제, 특히 헤어 샴푸, 헤어 컨디셔너, 헤어 소프너 등, 차단제, 피부 태닝제 및 라이트닝제, 탈색소제, 데오도런트, 땀흘림 억제제, 제모제, 방충제 등 또는 그와 같은 제제의 조합이 바람직하다. 화장품용 드레싱 (cosmetic dressing) 또는 마스크로서의 사용이 특히 바람직하다.

화장품 활성, 선택적으로 또한 예를 들면 피부과학적, 치료적 활성을 갖는 화합물은 다음을 포함한다: 항여드름제, 살균제, 발한 억제제, 아스트린젠트, 데오도런트, 제모제, 피부용 컨디셔닝제, 피부평활제, 피롤리돈 카르복실산, 락트산 및 아미노산과 같은 다른 NMs(천연 보습 인자) 뿐 아니라 덱스판테놀 (판테놀, 판토테놀), 글리세롤 또는 요소 등의 피부 보습 증가제, 자외선 차단제, 각질 용해제, 자유라디칼용 라디칼 수용체, 항산화제, 항지루제, 항비듬제, 살균 유효 성분, 피부 노화의 징후 치료용 유효 성분 및/또는 피부 분화 및/또는 증식 및/또는 착색 조절제, 프로테아제 저해제, 예컨대 MMP (기질 단백질 분해효소) 저해제, AGE (최종 당 산화물) 물질 감소를 위한 당화 저해제, 비타민 C (아스코르브산) 및 그 유도체와 같은 비타민으로서, 예를 들면 아스코르빌 글루코시드와 같은 글루코시드, 나트륨 또는 마그네슘 아스코르빌 포스페이트 또는 아스코르빌 팔미테이트 및 스테아레이트, L-아스코르브산 포스페이트 에스테르와 같은 아스코르브산의 에스테르, L-아스코르브산 포스페이트 에스테르의 나트륨 및 칼륨염과 같은 알칼리 금속염; L-아스코르브산 포스페이트 에스테르의 마그네슘 및 칼슘염과 같은 알칼리 토금속염; L-아스코르브산 포스페이트 에스테르의 알루미늄염과 같은 삼가 금속염; L-아스코르브산 설페이트 에스테르의 나트륨 및 칼륨염과 같은 알칼리 금속염; L-아스코르브산 설페이트 에스테르의 마그네슘 및 칼슘염과 같은 알칼리 토금속염; L-아스코르브산 설페이트 에스테르의 알루미늄염과 같은 삼가 금속염; L-아스코르브산 에스테르의 나트륨 및 칼륨염과 같은 알칼리 금속염; L-아스코르브산 에스테르의 마그네슘 및 칼슘염과 같은 알칼리 토금속염; L-아스코르브산 에스테르의 알루미늄염과 같은 삼가 금속염;천연, 천연 동일성 및 인공 펩타이드로서, 예를 들면 뉴로펩타이드, 항균성 펩타이드 및 지방산과의 공유결합 또는 에스테르화에 의해 변형된, 그리고 변형되지 않은 매트리킨.

자극적인 부작용을 갖는 활성 성분으로는, 알파-히드록시산, β-히드록시산, 알파-케토산, β-케토산, 레티노이드 (레티놀, 레티날, 레티노산), 안스랄린 (디옥시안스라놀), 안스라노이드, 퍼옥사이드 (특히 벤조일 퍼옥사이드), 미녹시딜, 리튬염, 대상 길항물질, 비타민 D와 그 유도체; 카테콜, 플라보노이드, 세라마이드, 다가불포화 지방산, 필수지방산 (예를 들면, 감마-리놀레산), 리포솜 구조를 갖는 유효 성분, 캐리어 시스템, 엔자임, 코엔자임, 엔자임 저해제, 보습제, 피부진정제, 세정제 또는 거품 형성제 및 무기 또는 합성 매티파잉 필러 또는 파운데이션용 안료 또는 색소 또는 색소 입자와 같은 장식재, 메이크업 제제 및 눈, 입술, 얼굴 등의 꾸밈 및 색조 화장품용 다른 제제 및 연마제가 포함된다.

식물 유효 성분 추출물 또는 추출물 또는 그로부터 얻은 단일 물질이 더 언급된다. 식물 유효 성분 추출물은 일반적으로 고체 식물 추출물, 액체 식물 추출물, 친수성 식물 추출물, 친유성 식물 추출물, 단일 식물 성분; 플라보노이드 및 그 아글리카(aglyca)와 같은 그 혼합물: 루틴, 퀘세틴, 디오스민, 하이페로사이드, (네오)헤스페리딘, 헤스페리틴, 징코 비올로바 (예를 들면 징코 플라본 글리코시드), 산사나무 추출물 (예를 들면 올리고메릭 프로시아니딘), 메밀 (예를 들면 루틴), 회화나무 (예를 들면 루틴), 자작나무 잎(예를 들면 퀘세틴 글리코시드, 하이페로사이드 및 루틴), 딱총나무꽃 (예를 들면 루틴), 라임나무꽃 (예를 들면 궤세틴 및 파르네솔을 갖는 정유), 세인트 존스 워트 오일 또는 세인트 존스 워트 추출물, 달맞이꽃유(예를 들면 올리브 오일 추출물), 카렌듈라, 아니카 (예를 들면 정유에 의한 꽃 오일 추출물), 멜리사 (예를 들면 팔라본, 정유); 면역 자극제: 자주 천인국 (예를 들면 알콜성 추출물, 신선한 식물 쥬스, 압착 쥬스), 가시오갈피 나무; 알카로이드; 카페인, 테인, 홍차 또는 홍차 추출물, 테오브로민, 캡사이신, 아즈마린 (예를 들면 프라즈마린), 에버그린 (예를 들면 빈카마인); 추가적인 식물 약효 성분: 알로에, 마로니에 (예를 들면 에스신), 마늘 (예를 들면 마늘유), 파인애플 (예를 들면 브로멜린), 인삼 (예를 들면 진세노사이드), 밀크씨슬 열매 (예를 들면 표준화된 실리마린 추출물), 부처스 부름 뿌리 (예를 들면 루스코제닌), 쥐오줌풀 (예를 들면 발레포트리에이트, tct. 발레리아나에), 카바-카바 (예를 들면 카바락톤), 호프꽃 (예를 들면 호프 고미질(hop bitter substance)), 시계초 추출물, 엔지안 (예를 들면 에탄올 추출물), 안트라퀴논 함유 약물 추출물, 예를 들면 알로인 함유 알로에 베라 쥬스, 꽃가루 추출물, 조류 추출물, 감초 추출물, 야자나무 추출물, 갈피미아 (예를 들면 마더 팅처), 겨우살이 (예를 들면 수용성-에탄올 추출물), 피토스테롤(예를 들면 베타-시토스테롤), 멀레인꽃 (예를 들면 수용성 알콜 추출물), 드로세라 (예를 들면 리큐어 와인 추출물), 산자나무 열매 (예를 들면 거기서 얻어진 쥬스 또는 산자나무유), 머쉬맬로우 뿌리, 프림로즈 뿌리 추출물, 신선한 접시꽃 식물 추출물, 컴프리, 아이비, 쇠뜨기, 야로우, 창질경이 (예를 들면 압착 쥬스), 쐐기풀, 애기똥풀, 파슬리; 노롤라에나 로바타, 멕시칸 매리골드, 티오마 시엠, 여주 및 알로에 베라 추출물의 식물 추출물, 풍선덩굴 마더 팅처, 둘카마라 추출물과 탄닝제와 탄닌으로 이루어진 군에서 선택된다.

실질적으로 화장품에서 사용되는 위에서 설명된 유효 성분과 달리, 치료적 유효 성분 (의약)은 약사법의 의미 내에서 질병, 가벼운 질병, 물리적 상처 또는 병리학적 고통의 치유, 완화 또는 예방을 위해 의도된 것이다. 특히 상처 치료 및 치유 분야와 화상, 특히 화상용 응급처치 분야용으로서 외용 또는 트랜스더멀용으로 의도된 제제와 유효 성분이 특히 본 발명에 있어서 적합하다.

더멀 및 트랜스더멀용 유효 성분은 특히 피부 활성일 뿐 아니라 트랜스더멀 활성 성분이다. 그들은 예를 들면 화상 치료제, 피부병 치료제, 외용 진통제이며, 예를 들면 덱스트로프로폭시펜, 펜타조신, 페치딘, 부프레노르핀; 항류마티즘/소염제 (항염증제) (NSARs), 예를 들면 유향 또는 유향 추출물, 인도메타신, 디콜페낙, 나프록센, 케토프로펜, 이부프로펜, 플루비프로펜, 아세틸살리실산과 같은 살리실산 및 그 유도체, 옥시캄; 스테로이드 호르몬, 예들 들면 코르티코이드 및 글루코코르티코이드로서, 하이드로코르티손, 코르티솔, 코르티손 아세테이트, 클로프레드놀, 프레드니손, 프로드니솔론, 데플라자코트, 플루오코르토론, 트리암시놀론, 베타메타손, 베타메타손 발레레이트, 모멘타손 플로에이트, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 에티닐오에스트라디올, 메드로에르고타민, 디히드로에르고톡신; 벤즈부로마론, 알로푸리놀과 같은 항통풍제; 외용 피부제, 브롬페니라민, 바미핀과 같은 항히스타민제; 예를 들면 은 염화은, 질산은, 요오드화은 또는 종래 기술에서 알려진 상처 치료제를 함유하는 은과 같은 질산콜로이드성 은 및 은염과 같은 항박테리아제를 포함하는, 에리스로마이신, 클린다마이신, 테트라시클린과 같은 항생제, 항진균제, 펩타이드 의약, 항바이러스 유효 성분, 소염 유효 성분, 마취 유효 성분과 같은 항소양제 유효 성분으로서 예를 들면 항히스타민제, 벤조카인, 폴리도카놀 또는 코르티코이드 및 글루코코르티코이드; 항암제; 항기생충제 유효 성분; 외용 호르몬; 정맥 치료제; 타크로리무스, 피메크로리무스 등의 칼시뉴린 저해제와 같은 면역 억제제, 미네랄 성분 및 예를 들면 무기 또는 유기 셀레늄 화합물, 아연 및 아연 염 등 미량 원소와 모든 더멀 또는 트랜스더멀용을 포함한다. 설명에 의해 본 발명의 맥락 내에서 유효 성분을 화장품 유효 성분 또는 치료 유효 성분의 군으로 분류하는 것은 확정적인 분류를 나타내는 것이 아님이 주목되어야 한다.

특히, 여기서 분류는 해당 유효 성분이 화장품 유효 성분과 치료제 유효 성분으로 모두 사용될 가능성을 배제하는 것이 아니다.

더멀 및 트랜스 더멀용으로 바람직한 유효 성분은 신경피부염, 아토피 피부염, 건선, 주사코 등의 피부병 치료제, 소염제 유효 성분, 항소양제 유효 성분, 태닝제, 국부진통제 및 항바이러스 활성 성분을 함유하는 군에서 선택된다.

특히 바람직하게는, 예를 들면 요소, 아미노산 및 카르복실산, 피롤리돈카르복실산, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 락테이트 (락트산), 시트레이트, 염화물, 포스페이트 등과 요산 및 다른 유기산을 포함하는 피부의 천연 보습 인자 (NMF) 구성 성분 뿐 아니라 포스포리피드, 중성 지질 및 스핑고지질을 포함하는 피부형 지질군에서 선택된다..

특별한 선호는 상처 치료 분야에서 사용되는 유효 성분들, 특히 만성적 상처, 욕창, 종아리 궤양, 당뇨성 족부 신경병증 등의 치료용 유효 성분에 주어지며, 예를 들면 특히 은 질산염, 은 염화물, 은 요오드화물, 마이크로 크기의 은 입자 또는 종래 기술에서 알려진 은 함유 상처 치료 물질과 같은 은 함유 유효 성분 등의 진통제, 면역 억제제, 호르몬제, 마취 유효 성분, 항기생충제, 살균제 또는 항진균제, 항박테리아 유효 성분, 특히 예를 들면 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 셀레늄, 요오드 등의 전해질, 실리카, 미네랄 물질 및 미량 원소와 같은 상처 환경을 지지 및 조절하는 유효 성분, 예를 들면 콜라게나아제 또는 종래 기술에서 알려진 다른 적절한 단백질 가수 분해 효소 등의 상처 창상 절제를 위한 유효 성분, 상처 치유를 보조하는 유효 성분으로서, 예를 들면 생장 인자, 효소 저해제, 매트릭스 프로테인 또는 세포외 매트릭스 구성 성분 또는 가용성 (저분자량) 프로페인 및 펩타이드 구성 성분, 본 발명에 의해 사용된 콜라겐 서스펜션에 이미 함유된 I, III 및 V형 콜라겐 외의 콜라겐형이다.

상처 치료제 분야에서 특히 선호되는 유효 성분은 특히 은 질산염, 은 염화물, 마이크로 크기의 은 입자와 같은 은 함유 유효 성분, 타크로리무스, 피메크로리무스, 항히스타민제, 포리도카놀, 유향/유향 추출물, 캡사이신, 탄닌, 세이트 존스 워트 오일/세이트 존스 워트 추출물, 달맞이꽃 오일, 덱스판테놀과 무기 또는 유기 셀레늄 화합물, 아연 및 아연 염으로부터 선택된다.

더 바람직한 유효 성분은 프로테인 생성성 유효 성분의 군에서 선택되며, 바람직하게는 생장 인자, 프로테인 생성성 호르몬, 엔자임, 코엔자임, 글리코프로테인, 혈액 응고 인자, 재조합 기술에 의해 제조된 상술한 유효 성분의 다른 사이코카인 및 변종이다.

본 발명에 의해 사용될 수 있는 생장 인자는 VEGF (혈관 내피 생장 인자), bFGF (염기성 섬유모 세포 생장 인자), FGF-1 (산성 섬유모 세포 생장 인자), TGF-β, TGF-α(형질 전환 생장 인자 β 또는 α), EGF (내피 세포 생장 인자), HGF (간세포 생장 인자), TNF-α (종양 괴사 인자 α), IGF I and II (인슐린 유사 생장 인자/인슐린 결합 생장 인자 I 및 II), 헤파린 결합 생장 인자 I 및 II, PDGF (혈소판 유래 생장 인자), PD-ECGF (혈소판 유도 내피 생장 인자), BMP (뼈 형성 생장 인자), GHRP (성장 호르몬 방출 인자), 연골 유발 인자 A 및 B, 뼈 생장 인자, 인터류킨 8, 안지오포이에틴, 안지오제닌, 아프로티닌 및 vWF (본 빌레브란트 인자)로 이루어지는 군에서 선택된다.

유효 성분으로서 글리코프로테인은 예를 들면 면역 글로블린과 항체를 포함한다.

유효 성분으로서 다른 사이코카인은 예를 들면 인터류킨과 인터페론을 포함한다.

더욱 바람직한 유효 성분은 예를 들면 트롬빈, 피브리노겐 또는 콜레스테릴 설페이트 (예를 들면 소디움 콜레스테릴 설페이트)와 같은 혈액 응고 인자 등의 지혈 작용을 갖는 것이며, 또는 외인성 및/또는 내인성 응고 캐스캐이드 인자 및 물질에 대해 활성화 작용을 갖는 유효 성분으로서, 예를 들면 포스포리피드, 카올린, 아프로티닌, 인자 농축물, 조직 인자 또는 칼슘 이온이다.

항천식제와 같은 기관지 치료제, 진해제, 거담제 등과, 글리벤클라마이드와 같은 당뇨병 치료제, 호르몬, 덱사메타손과 같은 스테로이드 호르몬, 디지톡신과 같은 강심 글루코시드, 예를 들면 베타 차단제와 같은 심장 및 순환성 질병 치료제, 항부정맥제, 항고혈압제, 칼슘 안타고니스트 등과, 예를 들면 트리실릭 항우울제 (NSMRI), 세로토닌 재흡수 억제제 (SSRI), 노르아드레날린 재흡수 저해제 (NRI), 세로토닌-노르아드레날린 재흡수 저해제 (SNRI), 모노아미녹시다제 저해제 (MAO 저해제) 등의 항정신성약 및 항우울제, 신경 이완제, 진경제 또는 항간질제, 최면제, 진정제, 마취제, 위와 장 치료제, 지질 저하제, 항편두통제, 파라세타몰, 살리실산, 디클로페낙, 이부프로펜, 케토프로펜, 나프록센 등과 같은 진통제, 소염제, 혈관확장제, 이뇨제, 항통풍제, 세포증식억제제, 근이완제, 호르몬 패치 형태의 피임약, 예를 들면 니코틴 패치 형태의 항중독제, 식물 추출물, 예를 들면 베타-카로틴과 같은 프로비타민, 예들 들면 비타민 C,A,B,E 등과 같은 비타민 등의 추가의 유효 성분을 예를 들면 트랜스더멀 유효 성분 패치의 형태로 본 발명에 의한 조성물에서 트랜스더멀 투여에 의해 추가로 투여하는 것을 생각할 수 있다.

본 발명에 의하면 가장 특별하게 바람직하게 부가되는 추가의 구조형성제 또는 유효성분은 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분 또는 가용성 (저분자량) 프로테인 및 펩타이드 구성 성분의 군에서 선택되며, 바람직하게는 엘라스틴, 엘라스틴 가수분해물, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 피브로모듈린, 데코린, 비글리칸, 베르시칸, 퍼레칸, 고밀도 기저막 프로테오글리칸, 신데칸 및 세르글리신과 같은 글리코사미노글리칸, 피브린, 피브로넥틴, 파라밀론과 같은 글루칸 등에서 선택된다. 가장 바람직한 세포외 매트릭스 구성 성분과 구조형성제는 엘라스틴과 엘라스틴 가수분해물, 히알루론산 및 피브로넥틴 유형이다.

콜라겐 재료 자체는 또한 특히 지혈 작용 또는 상처 치유에서 긍정적인 보조 작용과 같은 어떤 치료 작용을 가질 수 있다. 그러나 그것은 본 발명의 의미 내에서 유효 성분은 아니다.

상술한 유효 성분은 그들 고유의 가교 콜라겐 매트릭스에 존재하거나, 복수의 유효 성분의 조합으로 존재하며, 동결 건조된 최종 제품에 대해 바람직하게는 40wt%까지의 양으로, 더 바람직하게는 60wt%까지의 양으로, 더욱 더 바람직하게는 80wt% 까지의 양으로 존재한다.

동결 건조 콜라겐 매트릭스에서, 구조형성제 또는 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분의 군으로부터의 유효 성분은 사용된 콜라겐 서스펜션의 작업으로부터의 산 가용성 콜라겐 또는 펩타이드 구성 성분과 함께, 동결 건조된 최종 제품의 건조 중량에 대해 총 10wt%의 양, 더욱 바람직하게는 20wt%까지의 양이 바람직하며, 이것은 여기서 정의된 결정 방법 (BGA)에 의해 측정된다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 선택적으로 적어도 하나의 부가 성분을 함유할 수 있다.

부가 성분은: 버퍼, 무기산 및 유기산 또는 염기와 같은 pH 조정제, 파라핀유 또는 바셀린유, 실리콘유와 같은 미네랄유와, 코코넛유, 스윗 아몬드유, 살구 유, 옥수수유, 호호바유, 올리브유, 아보카도유, 참기름, 야자유, 유칼립투스유, 로즈마리유, 라벤더유, 솔방울유, 타임유, 민트유, 카르다몸유, 오렌꽃유, 콩기름, 브랜유, 쌀기름, 평지유,, 캐스터유, 밀배아유 및 거기서 분리된 비타민 E, 달맞이꽃유와 같은 식물성 기름, 식물 레시틴 (예를 들면 콩 레시틴), 식물에서 분리된 스핑고리피드/세라마이드, 우지, 라놀린, 버터유와 같은 동물성 오일 또는 지방, 중성 오일, 스쿠알렌, 지방산 에스테르, 트리글리세리드와 같은 지방 알콜의 에스테르, 피부 온도에 해당하는 융점을 갖는 왁스 (밀랍, 카나우바 왁스 및 단델릴라 왁스와 같은 동물성 왁스, 마이크로 크리스탈린 왁스와 같은 광물성 왁스 및 폴리에틸렌 또는 실리콘 왁스와 같은 합성 왁스)와 예를 들면 화장품 및 향수 협회(워싱턴)에 의한 CTFA 페이퍼의 화장품 성분 핸드북, 제1판, 1998, 언급된 바와 같이 화장품 목적에 적합한 오일 (소위 화장용 오일)과, 상술한 세정 표면활성제에 부가하여 표면 활성제, 예를 들면 분산제, 습윤제, 유화제 등; 필러; 안정화제; 공용매; 약학적으로 및 화장품적으로 종래 사용되는 다른 색소와 안료로서, 특히 하이드로겔 조성물을 채색하는 데 우선적으로 사용되고, 신체 채색 용도가 아닌 것으로서 그와 같은 장식용 색소와 같은 안료와 색소는 유효 성분의 군으로서 열거됨; 보존제; 유연제; 윤활유 및 활택제 등을 포함한다.

본 발명에 의한 바람직한 보조 성분은 지방과 오일이다. 특히 상기 열거된 화장품용 오일, 특히 트리글리세리드, 특히 바람직하게는 카프릴산/카프론산 트리글리세리드, 스쿠알렌 또는 호호바유와 달맞이꽃유가 특히 바람직하다.

상기 언급된 보조 성분은 그들 자신의 가교된 콜라겐 매트릭스에 존재하거나 또는 복수의 가교 성분의 조합으로 존재하며, 동결 건조된 최종 제품에 대해 바람직하게는 80wt%까지의 양으로, 더욱 바람직하게는 60wt%까지의 양으로, 더욱 더 바람직하게는 40wt%까지의 양으로 존재한다.

일반적으로 본 발명의 맥락 내에서 상기 언급한 성분을 보조 성분의 카테코리로 분류하는 것은 이들 보조 성분이 또한 화장품 및/또는 치료 작용을 갖게 될 가능성을 배제하는 것은 아니며, 특히 바람직하게 사용되는 것으로 언급된 화장품 오일에 대해서는 그러하다.

본 발명에 의한 콜라겐 재료가 적어도 두 개의 언급된 군, 구조형성제, 유효 성분 및/또는 보조 성분으로부터의 부가 성분의 조합을 포함할 경우, 다공성 콜라겐 캐리어 매트릭스 전체에서 이들 부가 성분의 총량은 동결 건조된 콜라겐 재료에 대해 40wt%까지, 바람직하게는 60wt%까지, 더욱 바람직하게는 80wt%까지이다.

그와 같은 구조형성제, 유효 성분 및/또는 보조 성분의 양은 단독 또는 적어도 두 개의 언급된 군의 조합에서, 적어도 0.1wt%, 바람직하게는 1wt%이다.

이미 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 방법의 또 다른 유리한 점은 특별한 처리, 특히 방법에 의한 낮은 잔여 에폭시드 활성과 동결 건조 후 수분 함량을 조정함으로써 잔여 활성의 불활성화 가능성 때문에, 알려진 바와 같이 종래 기술의 공정 (예를 들면 Zeeman 그룹)에서의 에폭시드 가교제의 세정이 불필요하다. 이것은 동결 건조된 가교 물질에서 방출가능하게 사용된 콜라겐 서스펜션의 산 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분의 보존을 위해서 뿐 아니라, 여기에 정의된 바와 같이, 추가의 구조 형성제 또는 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분의 군으로부터의 유효 성분, 예를 들면 콜라겐 서스펜션에 부가적으로 부가되는 엘라스틴과 같은 성분에 대해서도 중요하다. 사용 시 그들의 긍정적인 작용을 발휘할 수 있는 그와 같은 구성 성분을 위해, 그들은 사용 시에 거의 캐리어 재료로서 작용하는 가교된 콜라겐 매트릭스로부터 방출되어야만 한다. 따라서 그와 같은 프로테인 형성성 유효 성분과 구성 성분들은 재료 중에서 대부분이 비가교상태로 남아 있어야 하며, 예를 들면 에폭시의 부가에 의해 콜라겐 재료 중에 가교되어 분리불가능하게 결합되어서는 안된다. 본 발명에 의한 방법에 의해, 본 발명에 의한 방법에서는 극단적으로 소량의 에폭시드 가교제가 존재하기 때문에 이들 가용성 매트릭스 프로테인 구성 성분을 비가교된 형태로 콜라겐 재료 중에 도입하는 것과, 그들 대부분이 비가교된 상태로 보존하는 것이 가능하게 되었다. 이 소량의 가교제의 결과로서, 가교 반응은 소량의 에폭시드 가교제와의 반응 상대로서 저분자량 프로테인 형성성 매트릭스 분자 대신에, 과량으로 존재하는 콜라겐 폴리펩티드 사이에서 일차적으로 일어난다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 사용 시에 방출될 수 있는 그와 같은 가용성의 비가교된 프로테인 형성성 구성 성분의 전체 양은 동결 건조된 콜라겐 재료의 건조 질량에 대해 적어도 0.1wt%, 바람직하게는 적어도 2wt%, 특히 바람직하게는 5wt%이다. 산 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분 및/또는 구조형성제 또는 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분의 군으로부터의 유효 성분을 포함하는 그와 같은 방출가능한 가용성 구성 성분의 양은 바람직하게는 최대 20wt%까지이다.

그와 같은 가용성의 방출가능한 콜라겐 및 펩타이드 구성 성분의 정량적 양은 예를 들면 BCA(Bicinchoninic acid) 분석에 의해 여기서 상술된 바와 같이 37℃에서 24시간 동안 0.9% NaCl로 추출 후 상청액에서 표준으로서 소혈청 알부민과의 비교에 의해 결정될 수 있다.

종래 기술에 의한 방법에서, 그와 같은 가용성 프로테인 형성성 구성 성분은 다량의 가교제로 인해 가교되며 따라서 캐리어 재료에 분리 불가능하게 결합된다. 어떤 비가교된 잔기도 잔여 에폭시 활성을 감소시키기 위해 잔여 에폭시 가교제의 필수적인 세정에 의해 부가적으로 이후의 공정에서 재료로부터 세정된다.

공정의 특히 바람직한 실시의 형태에서, 가교제의 부가 전에 합성 친수성 폴리머, 예를 들면 글리콜과 같은, 특히 이관능성으로 활성화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 특히 관능적으로 활성화된 합성 친수성 폴리머는 콜라겐 서스펜션에 부가되지 않는다. 따라서 본 발명에 의한 가교된 콜라겐 매트릭스의 특히 바람직한 실시의 형태는 콜라겐과 합성 폴리머의 컨쥬게이트를 포함하지 않는다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 동결 건조 에폭시 가교된 콜라겐 매트릭스는 적어도 수분 조정 단계 후에는 검출가능한 잔여 에폭시 활성을 나타내지 않는다.

또한, 본 발명에 의한 공정에 의해 얻어질 수 있는 콜라겐 재료는 생체 외 독성 시험을 위한 표준 절차 (XTT 시험)에서 어떤 독성도 나타내지 않았고, 이것은 그와 같은 가교 콜라겐 재료의 높은 생체 적합성의 또 다른 증거이다.

본 발명에 의한 동결 건조 에폭시 가교된 콜라겐 매트릭스는 또한 이미 정의되고, 설명된, 감소된 분해 속도 (감소된 콜라게나아제 분해/콜라게나아제 소화), 향상된 가수분해 안정성 및 향상된 습윤 인열 강도의 의미에서 향상된 기계적 안정성에 대응하는 향상된 분해 안정성에 의해 구별된다.

분해 속도 또는 분해율은 효소 분해, 특히 콜라게나제 소화에 대한 콜라겐 매트릭스의 안정성을 반영하기 때문에, 그것은 예를 들면 콜라게나제 소화 시험에 의해 결정될 수 있다. 이 시험에서, 효소 콜라게나제 (PBS (인산 완충 식염수) 버퍼에서 클로스트리듐 히스톨리티쿰 (타입 1)로부터의 콜라게나제)에 의한 콜라겐 섬유와 원섬유의 분해는 의도적으로 제어된 조건 하에서 행해졌고, 정의된 반응 시간 후에 분해 산물의 양이 분광 광도계로 UV/VIS 측정에 의해 결정되었고, 이는 다음의 실시예에서 상세하게 설명될 것이다.

본 발명에 의한 분해 안정화된 콜라겐 매트릭스는 비가교되거나 또는 탈수가열 가교 동결 건조된 콜라겐과 비교해서, 가용성 분해 산물의 양이 감소했다는 의미에서 분해율의 감소에 의해 구별되며, 이는 상술한 콜라게나제 소화에 의해 결정될 수 있다.

분해율은 한편으로는 사용된 가교제의 양에 의존하지만 한편으로는 부가된 가용성 프로테인 구성 성분 (매트릭스 프로테인 등)의 양에 의존한다. 사용된 공정 파라미터로 인해, 분해 특성은 바람직한 응용분야에 따라 제어될 수 있다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 바람직하게는 콜라게나제 첨가 후 6시간의 반응 시간에서 측정된 분해율이, 비가교 또는 탈수가열적으로만 가교된 동결 건조 콜라겐과 비교해서 (분해율 100%), 85%를 넘지 않고, 더 바람직하게는 70%를 넘지 않으며, 더욱 바람직하게는 50%를 넘지 않는다. 이것은 비가교 또는 탈수가열적으로만 가교된 동결 건조 콜라겐과 비교해서 적어도 15%, 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 50%의 분해 안정성에서의 향상을 의미한다.

콜라겐 매트릭스의 분해율을 결정하기 위한 다른 방법에 있어서, 콜라겐 매트릭스의 분해 속도는 클로스트리듐 히스토리쿰 (타입 I, 워딩톤 바이오케미칼)으로부터의 콜라게나제의 효소 분해 전과 후의 시료의 양에 의해 결정될 수 있다. 목적을 달성하기 위해, 콜라겐 매트릭스의 정의된 조각은 PBS 1 ml (pH 7.2)의 콜라게나제의 소정 단위를 함유하는 용액 내에 침지되고, 부드럽게 흔들면서 37℃에서 2시간 동안 배양된다. 분해는 0.2 ml의 0.25 M EDTA의 부가에 의해 중단되고, 얼음에 의한 냉각이 10분 간 수행된다. 그리고 시료는 5 ml의 PBS 버퍼 (pH 7.2)로 15분 동안 세 번 세정되고, 순수 5 ml 로 15분 간 세 번 세정되고, -80℃에서 밤새 동결된 다음 동결 건조된다. 동결 건조 후에 부분적으로 분해된 콜라겐 캐리어의 무게가 측정되고, 분해 속도가 다음과 같이 결정된다.

분해 속도 (%) =100 x (본래 무게 - 분해 후의 무게)/본래 무게

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 분해 속도가 60%를 넘지 않고, 바람직하게는 50%를 넘지 않고, 더욱 바람직하게는 40%를 넘지 않으며, 또한 분해 속도는 바람직하게는 적어도 약 2%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 4%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 8%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10%라는 점에서 구별된다.

가교도에 따라, 본 발명에 의한 가교 콜라겐 매트릭스는 더 많이 또는 덜 빠르게 재흡수되는 물질이다. 즉, 가교도가 낮은 재료는 예를 들면 피하 또는 근육 내 투여 후 조직에서 우세한 조건 하에서 효소적으로 분해된다. 상처와 접촉한 후, 재료는 따라서 그 위에 혹은 그 안에 남아 있을 수 있고 상처의 치료를 보조한다. 재료의 제거는 유리하게도 필요하지 않다. 그와 같은 사용은 특히 상처치료제로서 사용될 때 유리하다. 그와 같은 상처 치료제는 상처에 잔여될 것을 의도하기 때문에 그들은 또한 분해가능한 임플란트로 불리기도 한다.

증가된 기계적 안정성 (인열 강도)를 가질 뿐 아니라, 가교된 콜라겐 매트릭스는 생분해가능성 (예를 들면 효소 분해)에 대한 증가된 안정성을 갖고, 특히 조직 재구축이나 결손 충전용의 반영구적 임플란트로서 또는 세포군, 예를 들면 조직 공학 분야에서 스캐폴드로서 특히 적절하다.

콜라겐 매트릭스의 낮은 분해 속도, 따라서 높은 분해 안정성은 특히 화장품 드레싱, 세포군 스캐폴드로서의 용도 또는 예컨대 진공 보조 상처 치료 방법에서 상처 삼출물 흡수용 스폰지재로서의 용도로서 특히 유리하다.

한편, 그렇지만 상처 또는 생체 내에서 불완전하게 분해된 재료의 캡슐화를 초래하고 따라서 상처의 바람직하지 않은 경화를 초래하기 때문에 상처치료제로서의 용도 및 분해가능한 상처 치료 임플란트로서의 용도에 대해 매트릭스의 너무 낮은 분해 속도는 바람직하지 못하다. 그러므로, 본 발명에 있어서 분해속도/분해율을 원하는 용도에 따라 최적으로 조정하는 것이 특히 중요하다. 콜라겐 물질의 분해 특성은 상술한 바와 같이 얻어진 재료의 특성 및 가교 또는 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 제조 동안 거기에 적용된 건조 조건 모두에 의해 영향을 받는다. 본 발명에 의하면, 특히 유리한 분해 특성은 상술한 바와 같이 제조된 콜라겐 재료에 의해 얻어질 수 있으며, 특히 바람직한 응용 분야에 따라 이하에 설명되는 콜라겐 매트릭스에 대한 바람직한 제조 조건의 조합에 의해 얻어질 수 있다.

특히, 화장품용 드레싱용, 조직 공학에서의 세포군용 스캐폴드용, 진공 보조된 상처 치료 요법에서의 드레싱 재료용의 콜라겐 재료는 50%를 넘지 않는 낮은 분해율을 가지며, 이는 비가교된 또는 탈수가열적으로만 가교된 콜라겐과 비교해서 적어도 50%의 분해 안정성 향상에 해당한다. 한편, 심부 피부 결손 라이닝용 뿐 아니라, 상처치료제로서 또는 상처에 남아 있는 분해가능한 상처치료제 (분해 가능한 임플란트)로서, 또는 조직 재구축용 임플란트 용도의 콜라겐 재료는 85 - 70 %를 넘지 않는 낮은 분해율을 가지며, 이는 비가교된 또는 탈수가열적으로만 가교된 콜라겐과 비교해서 적어도 15 - 30%의 분해 안정성 향상에 해당한다.

본 발명의 범위 내에서, 가교 효과 또는 가교도는 한편으로는 가교에 의해 얻어질 수 있는 분해율의 감소 또는 콜라겐 매트릭스의 분해 안정성의 증가를 의미하며, 한편으로는 원칙적으로 종래의 결정 방법에 의해 결정되며, 특히 여기에 언급된 방법에 의해 결정되는 인열 강도 (습윤 인열 강도)의 증가에 의한 기계적 안정성의 향상과, 탄성율에 의해 정량적으로 측정되는 재료 강성율의 증가를 의미한다.

예를 들면 콜라게나제에 대한 콜라겐 구조의 내성은 예컨대 여기에 설명된 방법 (콜라게나제 소화)에 의해 결정될 수 있으며, 가교된 재료에 비해 비가교된 재료가 효소적으로 상당히 더 빨리 분해되는 것으로 측정되었다.

가수분해 안정성 역시 콜라겐 매트릭스의 가교의 척도이며, 예를 들면 소정 양의 콜라겐 매트릭스를 수용액에 위치시키고, 시간 경과에 대한 재료 특성의 변화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 비가교된 또는 탈수가열적으로 가교된 콜라겐 재료가 선택된 조건 (수용액에서 50℃) 하에서 18일 미만의 경과 후에 완전한 가수 분해 (매트릭스 구조의 구조적 분해)를 나타낸 반면, 같은 조건 하에서 본 발명에 의한 가교된 콜라겐 재료의 경우 매트릭스에 대한 어떤 구조적 변화도 관측되지 않았다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 습윤 인열 강도는 DIN EN ISO 3376에 의해 결정될 수 있고, 바람직하게는 50 cN/mm 보다 큰 층 두께이고, 더욱 바람직하게는 100 cN/mm 초과, 더욱 더 바람직하게는 300 cN/mm 초과이다.

그렇지만, 바람직하게는 습윤 인열 강도는 이하의 실시예에서 설명되는 바와 같이 내적 측정 방법 (UV8801)을 사용하여 결정된다. 이 내적 방법 (UV8801)에 의해 결정되는, 본 발명에 의한 가교된 콜라겐 매트릭스의 바람직한 습윤 인열 강도는 200 cN/mm 초과의 층 두께, 더욱 바람직하게는 400 cN/mm 초과, 더욱더 바람직하게는 500 cN/mm 초과이다.

본 발명에 의한 동결 건조된 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스는 또한 비가교된 콜라겐 매트릭스와 비교해서, 그리고 탈수가열 가교에 의해서만 또는 다른 공지의 화학적 가교제에 의해서만 가교된 콜라겐 매트릭스와 비교해서, 증가된 함습 또는 수화율 뿐 아니라 현저하게 향상된 흡수, 액체 흡수 및 저장 능력을 나타낸다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 액체 흡수 또는 저장 능력은 특히 흡수된 다량의 액체를 보존하고 유지하는 능력과 조합하여 다량의 액체를 흡수하는 능력을 의미한다. 본 발명에 의하면, 그 자신의 무게의 1 - 200배, 바람직하게는 10 - 100배의 양의 액체를 흡수 및 저장할 수 있는 가교된 콜라겐 매트릭스에 대해 선호가 주어진다.

재료에 의해 흡수될 수 있는 액체의 양은 팽윤의 질량 정도 (Q_m)로 표시되며,

여기서, Q_m 은 팽윤 전의 건조 재료의 질량 (m_{tr . Pr .})에 대한 팽윤 재료의 질량 (m_Gel)의 비율을 나타낸다.

팽윤의 질량도를 측정하기 위해, 동결 건조 재료는 따라서 칭량되고, 10 - 25℃ 온도에서 과량의 증류수를 함유하는 접시의 물 표면에 놓여서 10분간 팽윤하도록 한다. 과량의 물은 기계적 작용 없이 쏟아 버린다. 다시 팽윤된 조성물의 무게를 측정한 후, 팽윤 질량도는 상기 식에 따라 계산된다.

본 발명에 의한 동결 건조된 조성물은 바람직하게는 15 - 100의 팽윤 질량도를 갖는다. 또한 조성물의 무게에 의해 액체 유지 능력을 나타내는 것도 가능하다. 이를 위해, 상술한 시험 구성에서 계산된 팽윤 재료 시료의 무게의 증가는, 과량의 액체를 쏟아버린 다음, 액체의 부피로 환산되고 그것은 사용된 조성물 1g에 대한 증가된 무게와 액체의 흡수된 부피에 대응한다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 또한 비가교되거나 탈수가열적으로만 가교된 콜라겐 매트릭스와 비교해서 더 높은 광학 밀도에 의해 구별된다.

여기서의 광학 밀도는 정략적 단위 광학 밀도를 의미하며, 조사광에 대한 투과광 강도의 몫의 상용 로그로서 측정되며, 1m의 두께를 갖는 층상 콜라겐 매트릭스에 대해 Heiland SW 농도계 TD 03를 사용하여 계산된다. 본 발명의 콜라겐 매트릭스는 바람직하게는 mm 층 두께당 0.02 이상의 광학 밀도를 갖고, 더 바람직하게는 0.03 이상, 더욱더 바람직하게는 0.05 이상을 갖는다.

실질적으로 본 발명에 의한 공정에 의한 결과인 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 상술한 이점 외에도, 본 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 재료는 특히 비가교된 또는 탈수가열적으로만 가교된 콜라겐 재료에 비해, 또한 다른 공지의 화학 가교제에 의해 가교된 콜라겐 재료에 대해 다음의 이점을 갖는다.

- 더 좋은 느낌: 본 발명에 의한 재료는 동일한 층 두께에 대해 예를 들면 비가교/탈수 가열가교된 재료에 비해 더 벨벳같고, 부드러우며, 더욱 풍부하거나 볼륨이 큰 느낌을 갖는다. 이것은 특히 화장품 분야에서 유리하다.

- 더 높은 광학 밀도: 화장품 분야와 색체 인상에 의해 평가되는 실시의 형태에서 유리하다

- 더 높은 복원력: 가교된 재료는 기계적 작용에 대해서 예를 들면 비가교/탈수가열 가교된 재료만큼 쉽게 습윤 상태에서 붕괴되지 않고, 스폰지와 같이 더욱 쉽게 다시 원래의 부피를 취한다.

- 향상된 수분 흡수 능력

- 높은 탄성력과 유연성

- 제어가능한 세포군/세포 반응 (재료에 대한 세포의 응답)

제어가능한 세포군/세포 반응에 대하여, 본 발명에 의한 공정에 의해, 강성과 유연성, 효소 분해성 (분해율)에 대해 재료의 특성을 의도적으로 제어할 수 있는 가능성과 상기 제시된 바와 같이 방출가능한 가용성 콜라겐 및 펩타이드 구성 성분 또는 추가의 매트릭스 프로테인 및 가용성 펩타이드 구성 성분 등의 제공의 가능성이 발견되었다.

강성과 유연성의 제어에 대해, 세포군에 대해 적합한 매트릭스의 강성/유연성은 거기에 부착하는 세포의 특성에 상당한 영향을 갖는다는 것이 밝혀졌음이 주목된다. 세포 표현형의 발전 및 그 발현 패턴, 이동 및 증식 방식에 대한 세포 환경의 영향은 최근 수년 간 조직 공학 분야에서 기본 연구의 중심이 되고 있다. 그 조성물과는 별도로 세포외 매트릭스 (ECM)의 강성 (단단함 또는 강성)과 탄력성은 특별한 세포 환경의 주된 측면이다.

세포외 매트릭스의 강성은 세포 행동의 조절 신호이다. 예를 들면, 줄기 세포의 분화는 기질의 강성에 직접 의존하고; 마찬가지로 예를 들면 근섬유아세포의행동은 세포 환경의 특별한 강성에 기초한다. 세포는 그들을 둘러싼 ECM의 기계적 피드백에 직접 반응하다 (기계적-화학적 센싱).

세포를 둘러싼 재료의 강성과 그에 기초한 세포 응답 간의 관계를 연구하기 위해, 서로 다른 강성의 겔과 조성물의 사용이 종래 기술에 알려져 있다(Mih et al. in PLoS ONE 6 (5): e19929; 2011).

합성 기질의 예들은 다전해질 다층 (PEM) 뿐 아니라 다른 중합도를 갖는 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다; 예를 들면 콜라겐 겔과 같은 프로테인계 겔들도 마찬가지로 사용된다 (예를 들면, Yang et al. Biophysical Journal Vol. 97, 2051-2060; 2009.

가용성 콜라겐의 콜라겐 겔의 강성은 겔 형성 프로테인의 농도에 직접 의존하고, 예를 들면 글루타르알레하이드 또는 제니핀과 같은 가교제를 부가함으로써 더 변형될 수 있다.

문제의 재료의 탄성은 소위 탄성율 E 에 의해 정량화된다 (또한 영률). 이것은 다음과 같이 정의된다.

탄성율 (또한 물리학자 토마스 영의 영률)은 선형 탄성 거동과 선형 탄성 고체의 변형에 대한 응력과 변형 간의 관계를 나타내는 재료 공학의 물질 상수이다. 탄성율은 기호 E로 약칭된다.

탄성율 값은 변형에 대한 재료의 저항이 클수록 더 놓다. 높은 탄성율을 갖는 물질은 그러므로 단단하고, 낮은 탄성율을 갖는 물질은 유연하다.

건강한 조직 및 병들거나 손상된 조직의 ECM 강성은 넓은 분포를 가진다는 것이 알려져 있다.

예를 들면, 신경 조직 (뇌)의 강성은 E = 약 2.5 kPa이며, 근육 조직의 경우 E = 12 kPa, 뼈는 E = 18 GPa이다. 상처 치료에서 나타나는 육아 조직은 초기 강성이 0.1- 1 kPa이고, 7일 후에는 18 kPa로 설명된다 (Krishnan et al. in Cell Adhesion & Migration 2:2, 83-94; 2008).

생물 공학, 기초 연구와 조직 공학 분야에서 높은 생체 적합성과 대응하는 분해 안정성 뿐 아니라, 문제되는 조직에 특유한 강성을 갖고, 배양될 세포에 대해 최적 세포 환경을 제공할 수 있도록 의도적으로 조정될 수 있는 3D 배양용 스캐폴드의 제공이 흥미롭다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 본 발명에 의한 공정에 의해 조정가능한 0.01 내지 100 kPa범위의 강성을 갖으며, 바람직하게는 0.1 내지 60 kPa, 특히 바람직하게는 2 내지 40 kPa 범위이다.

콜라겐 매트릭스의 가교를 위한 본 공정에 의해, 최적 세포 내생 (군집), 세포 분화, 특히 직접 매트릭스와 접촉하는 세포의 소위 발현 프로파일의 요구에 대해 재료를 의도적으로 적응시키는 것이 가능하다. 발현 프로파일은 예를 들면 특별한 매트릭스 프로테인, 세포 골격 프로테인 (액틴), 사이토카인, 프로테아제 등의 발현을 나타낸다. 세포 분화 또는 군집된 매트릭스의 발현 프로파일의 그와 같은 제어는 특히 조직 공학 분야 및 바이오임플란트 분야뿐 아니라, 기초 연구, 진단 및 분석에서의 모델 시스템의 확립에서도 유용하다. 본 발명에 의한 가교된 콜라겐 매트릭스의 상술한 유리한 특성으로 인해, 그들은 화장품, 의료, 약학 또는 생명공학 용도에 특히 적합하다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 화장품제, 특히 화장품 드레싱 또는 마스크로서의 화장품 용도를 제공한다.

본 발명에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스의 화장품용 드레싱 또는 마스크로서의 용도는 특히 건조 상태에서 드레싱 또는 마스크를 처치될 신체 부위에 적용하고, 그것을 물 또는 하나 이상의 유효 성분 및/또는 선택적인 보조 성분의 수용액으로 수화하거나 또는 처치될 신체 부위에 적용하기 전에 콜라겐 매트릭스를 화장용 드레싱 또는 마스크의 형태로, 하나 이상의 유효 성분 및/또는 선택적으로 부가 성분의 수용액으로 흠뻑 젖게 함으로써 수행된다.

해당하는 건조 또는 사전 보습 도포는 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스를 상처 치료제로서 사용할 때 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스의 약제 (의료 장치도 포함), 특히 국부 또는 피부용 또는 사람이나 동물의 이식용으로서의 용도에 관한 것이다.

특별한 선호는 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 임플란트, 더멀 또는 트랜스더멀 피부 치료제 및/또는 지혈제 및 조직 공학 분야에서 세포 배양용 스캐폴드로서의 용도에 주어진다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스를 다음의 군에서 선택되는 적어도 하나의 적응증 또는 용도로서 사용하는 것에 관한 것이다: 급성 또는 만성 상처의 치료, 상처 치유의 향상, 조직 결손의 균등화, 부피 확보를 동반하는 심부 피부 결손 라이닝, 조직 재생 보조, 진피 재생, 화상 치료, 성형수술 용도, 흉터 절제 후의 용도, 자가조직 스플릿-피부 이식, 혈관 생성 보조, 더 나은 흉터 상태의 확보, 종아리 궤양, 욕창, 당뇨족과 같은 만성 상처의 치료, 상처 치유 징후의 치료, 심부 피부 결손을 갖는 질병의 치료, 턱 임플란트의 제조, 골 임플란트의 제조, 연골 임플란트의 제조, 조직 임플란트의 제조, 피부 임플란트의 제조, 의학적 드레싱의 제조, 트랜스더멀 드레싱의 제조, 상처 플라스터의 제조, 상처 붕대 재료의 제조, 상처 드레싱의 제조, 기초 연구, 진단 및 분산을 위한 조직 시스템의 체 외 재생산을 위한 모델 시스템 (예를 들면 피부 모델)의 제조와, 생물 공학에서, 세포 매트릭스 단위의 이식을 위한 세포 증식용 세포 배양 매트릭스의 제조.

더욱이, 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 원칙적으로 종래 기술에서 공지되고 예를 들면 US 2007/0027414에 설명된 진공 보조 상처 치료 요법에서 사용될 수 있다. 그들의 높은 유연성으로 인해 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 그와 같은 진공 치료에서 상처 기부에 성공적으로 도입될 수 있으며, 뛰어난 흡수 및 수화 특성으로 인해 과량의 상처 유액의 제거를 긍정적으로 보조한다. 삼출액의 이송은 기본적으로 높은 친수성과 팽윤성으로 인해 투과성의 다공질 콜라겐 매트릭스에 의해 달성된다. 또한 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 동결 건조 공정의 결과로서 높은 다공성을 갖고, 이것은 부가적으로 액체의 통과를 촉진시킨다. 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 특히 그 안에 함유된 방출가능한 가용성 콜라겐, 펩타이드 및 프로테인 구성 성분으로 인해 그 자체로 이미 상처 치유 과정에 긍정적인 영향을 미친다는 또 다른 유리한 점을 갖는다.

본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 특히 낮은 잔여 에폭시 활성과, 거기에 함유된 방출가능한 가용성 콜라겐, 펩타이드 및 프로테인 구성 성분에 대응하는 높은 생체 적합성으로 인해 상술한 용도에 특히 적합하다.

본 발명에 의한 가교 콜라겐 매트릭스의 상술한 바람직한 응용 분야에 있어서, 다층 마스크, 시트, 매트릭스, 드레싱, 패드, 층 또는 유사한 플랫 폼의 형태가 바람직하다. 그와 같은 다층 형태는 특히 외부 및 플랫 치료와, 피부의 더 넓은 영향 범위의 치료에 적합하다.

다른 가능한 실시의 형태에서, 그와 같은 다층 콜라겐 매트릭스는 또한 완전하게 또는 부분적으로 라미네이트화될 수 있으며, 즉 서로 결합된 다층의 형태로 존재한다 (샌드위치 층). 종래 기술에서 알려진 종래의 라미네이트 재료를 사용할 수 있으며, 예를 들면 예를 들면 레이온, 셀룰로오스, 폴리에틸렌 (PE) 또는 폴리우레탄 (PU) 또는 다른 합성 또는 반합성 폴리머/코폴리머와 같은 적절한 재료의 섬유, 부직포, 네트, 필름 또는 호일과 같은 형태가 사용될 수 있으며, 이들은 접착 결합, 열 라미네이션, 가교 등과 같은 종래의 방법에 의해 본 발명의 범위 내의 캐리어 재료에 단단하게 결합될 수 있다. 그와 같은 라미네이션은 특히 본 발명에 의한 층상 콜라겐 재료의 기계적 강도를 더욱 증가시키고, 사용 동안 특히 보습 상태에서의 취급성을 향상시키는데 적합하다. 바람직한 라미네이션은 자가부착층 또는 다층 플라스터재와의 라미네이션을 포함하며, 바람직하게는 자가부착 라미네이트 층이 모서리에서 콜라겐 재료 밖으로 전체적으로 또는 부분적으로 돌출되어 라미네이트된 콜라겐 재료가 종래의 플라스터 구성과 유사하게, 모서리의 자가 부착 라미네이션 돌출부분에 의해 치료될 피부 영역에 쉽게 고정될 수 있는 방식으로 다층 콜라겐 재료에 적용되는 것이 바람직하다. 그와 같은 자가 부착 라미네이트 콜라겐 재료의 경우, 특히 피부에 잘 받아들여지는 자가 부착 라미네이트 코팅으로서 자극과 알러지 유발 경향이 낮고, 이미 손상되거나 자극된 피부 영역에 대해 부착 층의 제거 시 부가적인 손상을 일으키지 않도록 쉽게 제거되는 것이 특히 선호된다. 바람직한 사용 분야에 따라 다르지만, 그와 같은 라미네이션은 사용 시 라미네이트된 콜라겐 재료의 수화를 허용하기 위해 차단성, 반차단성 또는 친수성 및 비차단성일 수 있으며, 친수성, 비차단성 또는 적어도 ( "그럼에도 불구하고 적어도"의 의미에서) 반차단성 라미네이션이 바람직하다. 더욱이, 그와 같은 자가 부착 라미네이션 코팅을 선택할 때, 재료가 습윤화될 때 부착층이 분리되지 않아서 부착 또는 고정 작용이 상실되지 않도록 부착층이 수용성이 아니라는 점이 확인되어야 한다.

따라서 본 발명은 또한 특히 부분적으로 또는 전체적으로 섬유, 부직포, 네트, 필름 또는 호일 또는 자가 부착층으로부터 선택되는 또 다른 층을 구비하는 층상 가교 콜라겐 재료를 포함하며, 상기 층은 가장자리에서 마감되거나 또는 모서리에서 전체적으로 또는 부분적으로 콜라겐 재료 밖으로 돌출되는 방식으로 층상 콜라겐 재료에 적용된다.

상술한 바와 같이 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스는 미리 흠뻑 적셔질 수 있으며, 즉 화장품용 또는 의료 용도로 사용되기 전에 완전히 재수화된다. 그와 같은 흠뻑 적심 또는 재수화는 바람직하게는 물과 선택적으로 순수 또는 소위 열수 (thermal water), 생리적 용액 및 적어도 하나의 유효 성분 및/또는 보조 성분을 함유하는 수용액을 포함하는 군에서 선택되는 수용액에서 수행되는 것이 바람직하다. 흠뻑 적심 (soaking) 또는 재수화에 사용되는 수용액은 또한 활성화 용액 (activator solution)으로 불리워진다.

그와 같은 활성화 용액은 예를 들면 용이하게 휘발되는 유효 성분 및/또는 보조 성분의 용액일 수 있으며, 이들은 예를 들면 동결 건조와 같은 제조 공정 때문에, 예를 들면 정유의 어떤 분획, 향수 등의 동결 건조 재료 안으로 도입되어서는 안 되거나 될 수 없다. 부가적인 수화 작용을 달성하는 유효 성분 및/또는 보조 성분이 존재할 수 있으며, 이들은 이들 수화 작용으로 인해 또는 습기를 흡수하는 경향으로 인해 본 발명에 의한 동결 건조된 콜라겐 매트릭스 안으로 도입될 수 없으며, 또는 소량만이 도입될 수 있다. 이는 동결 건조 콜라겐 재료 자체의 안정성 또는 존재하는 어떤 수분-불안정 유효 성분이 더 이상 유지될 수 없기 때문이다.

원칙적으로, 이전에 언급된 하나 이상의 유효 성분 및/또는 보조 성분이 활성화 용액 내에 존재할 수 있다. 특히 이전에 언급된 하나 이상의 바람직한 유효 성분 또는 보조 성분을 함유하는 유효 성분 용액은 특히 본 발명에 따라 바람직한 적응증에서의 치료적 용도에 적합하다.

특별히 바람직한 실시의 형태에서, 보존제 및/또는 폴리에테르, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 및 폴리글리콜 (PG)의 군으로부터의 보조 성분을 실질적으로 갖지 않는 수용성 활성화 용액이 사용된다.

본 발명의 다른 바람직한 실시의 형태에서, 본 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 재료는 관련된 공간 구성에서 활성화 용액에 존재한다 (조합 제제, 어플리케이션 키트, 세트, 부품 키트 (kit-of-parts) 등). 그와 같은 조합 제제 또는 부품 키트 구성은 바람직하게는 적어도 하나의 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스와 하나 이상의 유효 성분 및/또는 적어도 하나 이상의 보조 성분을 함유할 수 있는 적어도 하나의 수용액 (활성화 용액)을 포함하고, 그들은 바람직하게는 층상 드레싱, 패드 또는 마스크의 형태이다.

활성화 용액을 포함하는 본 발명에 의한 콜라겐 재료의 그와 같은 조합 제제 또는 부품 키트 조합의 구성은 부품 키트 구성으로부터 별도로 제거되고, 그것을 외부에서 사용 시 결합되는 두 개의 구성 성분을 구비할 수 있다. 그렇지만 구성 성분들은 예를 들면 거기에 구비된 챔버 내에서, 부품 키트 포장 그 자체 안에 결합되는 것도 가능하며, 재수화된 조성물은 거기로부터 직접 외부 또는 트랜스더멀 용도를 위해 제공될 수 있다. 이것은 바람직하게는 최종 사용자에 의해 직접 행해진다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다.

도 1: BCA법: 엘라스틴 가수분해물을 갖는 탈수 가열적으로만 가교된 콜라겐 매트릭스 ("비가교")와 비교하여 제조예 2에 의한 부가적 가용성 매트릭스 프로테인 (엘라스틴 가수분해물)을 갖는 에폭시 가교된 콜라겐에서 가용성 단백질 구성 성분의 결정 [%]
도 2a: 콜라겐 소화 시험: 엘라스틴 가수분해물을 갖는 탈수 가열적으로만 가교된 콜라겐 매트릭스 ("비가교")와 비교하여, 제조예 1a 및 2a의 본 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스의 6시간 이내의 분해율의 결정 [%]
도 2b: 콜라게나제 소화 시험: 콜라겐 소화 시험: 엘라스틴 가수분해물을 갖는 탈수 가열적으로만 가교된 콜라겐 매트릭스 ("비가교")와 비교하여, 제조예 1a 및 2a의 본 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스의 23시간 이내의 분해 부분의 절대량의 결정 (10mg으로 정규화된).
도 3: 가수분해 안정성: a) 트리글리세리드/중성 오일을 갖는 탈수 가열적으로 가교된 콜라겐 매트릭스 ("비가교") (동결 건조 온도 > 120℃); b)제조예 3의 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 (5% 에폭시드/DM; 트리글리세리드/중성 오일을 가짐: 동결 건조 온도 < 100℃); c)제조예 3에 의한 조성에 대응하는 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 (5% 에폭시드/DM; 트리글리세리드/중성 오일을 가짐; 동결 건조 온도 > 120℃).
도 4: 18일 후의 가수분해도 a) 탈수가열 가교된 콜라겐 매트릭스 b) 제조예 3의 발명에 의한 콜라겐 매트릭스와 비교해서.
도 5 : 습윤 인열 강도에 대한 동결 건조 온도의 영향 (내적 방법 UV8801)
도 6: 습윤 인열 강도에 대한 동결 건조 온도와 에폭시드 가교제 농도의 영향 (내적 방법 UV8801)
도 7: 습윤 인열 강도에 대한 대기 시간과 동결 전의 대기 시간 동안의 수용성 콜라겐 서스펜션/혼합물의 온도의 영향 (내적 방법 UV8801)
도 8: 잔여 에폭시드 활성 및 제조예 1의 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 잔여 에폭시드 활성의 감소에 대한 재수화의 영향
도 9: 강성/영률 E 측정을 위함 시험 구성

실시예

실시예 1

제조예 1a

에폭시드 가교에 의한 순수한 콜라겐 매트릭스 (5% 에폭시드 가교제 /건조 질량)

추가의 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분, 유효 성분 및.또는 부가 성분의 부가 없이 콜라겐 서스펜션의 건조 중량에 대해 5%의 에폭시드 가교제의 양을 사용한 본 발명에 의한 에폭시드 가교된 콜라겐 바이오매트릭스의 제조예

a) DE　4048622　A1 및 특히 DE　10350654　A1에 의한 방법으로 제조된 3000 g의 콜라겐 서스펜션 (건조 콜라겐 함량: 1.6%, 콜라겐 함량: 48 g)을 제공한다.

b) 콜라겐 서스펜션의 pH 값을 pH 3.3으로 조정한다.

c) 생략

d) 10℃ 미만의 온도에서, 2.4 g의 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE, Sigma-Aldrich)를 패들 교반기 (유로스타, IKA)로 600 rps로 교반하면서 5분 동안 콜라겐 서스펜션에 한방울씩 가한다. 얻어진 질량은 진공 믹서 (Smartmix, Amann/Girrbach)에서 약 750 g의 부분으로 가스제거된다.

e) 2시간 내로 가교제와 혼합하고, 가스제거된 서스펜션을 시트에 부은 다음 동결하고, 콜라겐 서스펜션은 동결될 때까지 18℃ 미만의 온도에서 유지된다.

f) 동결 질량은 24시간 동안 -20℃에서 보존되고, 동결 건조되고, 동결 건조 온도는 100℃ 미만으로 유지된다.

g) 동결 건조된 콜라겐 매트릭스는 수분 함량이 건조 콜라겐 매트릭스에 대해 25%까지 되도록 상대 습도 60-70%의 습도에서 24-48시간 동안 재수화된다.

h) 얻어진 콜라겐 매트릭스는 1-2mm의 층으로 나뉘어져 처리되고 선택적으로 감마 살균(20 kGy)된다.

제조예 1b

에폭시드 가교에 의한 순수한 콜라겐 매트릭스

(10% 에폭시 가교제 /건조 질량)

추가의 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분, 유효 성분 및/또는 부가 성분의 부가 없이 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대해 10%의 에폭시드 가교제의 양을 사용한 본 발명에 의한 에폭시드 가교된 콜라겐 바이오매트릭스의 제조예

제조는 제조예 1a와 비슷하게 수행되었으며, 단계 d)에서 4.8 g의 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE, Sigma-Aldrich)가 부가되고, 재수화가 96시간까지 수행되었다.

실시예 2:

제조예 2a

매트릭스 프로테인 (엘라스틴 가수분해물 )로부터의 부가적 가용성 프로테인 구성 성분을 갖는 에폭시드 가교 콜라겐 매트릭스

(5% 에폭시드 가교제 /건조 질량)

추가의 가용성 프로테인 또는 펩타이드/펩타이드 구성 성분 (매트릭스 프로테인: 엘라스틴)이 부가된, 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대해 5%의 에폭시드 가교제의 양을 사용한 본 발명에 의한 에폭시 가교된 콜라겐 바이오매트릭스의 제조예

a) DE　4048622　A1 및 특히 DE　10350654　A1에 의한 방법으로 제조된 3000 g의 콜라겐 서스펜션(건조 콜라겐 함량: 1.6%, 콜라겐 함량: 48 g)을 제공한다.

b) 콜라겐 서스펜션의 pH 값을 pH 3.3으로 조정한다.

c) 10℃ 미만의 온도에서, 2.4 g의 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE, Sigma-Aldrich)를 패들 교반기 (유로스타, IKA)로 550 rps로 교반하면서 5분 동안 콜라겐 서스펜션에 한 방울씩 가한다.

d) 30g의 엘라스틴 가수분해물 (엘라스틴 스페지알 B1N, GfN, Herstellung von Naturextrakten GmbH)을 동일한 조건 하에서 부가한다. 얻어진 질량 (수용성 콜라겐 혼합물)은 진공 믹서 (Smartmix, Amann/Girrbach)에서 약 750 g의 부분으로 2x 5분 동안 가스제거된다.

e) 2시간 내로 가교제와 엘라스틴 가수분해물과 혼합하고, 가스제거된 서스펜션을 시트에 부은 다음 동결하고, 콜라겐 서스펜션은 동결될 때까지 10℃ 미만의 온도에서 유지된다.

f) 동결 질량은 24시간 동안 -20℃에서 보존되고, 동결 건조되고, 동결 건조 온도는 100℃ 미만으로 유지된다.

g) 동결 건조된 콜라겐 매트릭스는 수분 함량이 건조 콜라겐 매트릭스에 대해 25%까지 되도록 상대 습도 60 - 70%의 습도에서 24-48시간 동안 재수화된다.

h) 얻어진 콜라겐 매트릭스는 1 - 2mm의 층으로 나뉘어져 처리되고 선택적으로 감마 살균(20 kGy)된다.

제조예 2b

매트릭스 프로테인 (엘라스틴 가수분해물 )의 군으로부터의 부가적 가용성 프로테인 구성 성분을 갖는 에폭시드 가교 콜라겐 매트릭스

(10% 에폭시드 가교제 /건조 질량)

추가의 가용성 프로테인 또는 펩타이드/펩타이드 구성 성분 (매트릭스 프로테인: 엘라스틴)이 부가된, 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대해 10%의 에폭시드 가교제의 양을 사용한 본 발명에 의한 에폭시 가교된 콜라겐 바이오매트릭스의 제조예

제조는 제조예 2a와 비슷하게 수행되었으며, 단계 c)에서 4.8 g의 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE, Sigma-Aldrich)가 부가되고, 재수화가 96시간까지 수행되었다.

실시예 3:

제조예 3

화장품용 지방 및 오일의 군으로부터의 부가 유효 성분/보조 성분을 갖는 에폭시드 가교 콜라겐 매트릭스 ( 트리글리세리드 /중성 오일)

(4.8% 에폭시드 가교제 /건조 질량)

지방 및 오일 (트리글리세리드/중성 오일)의 군으로부터의 추가의 유효 성분/보조 성분이 부가된, 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대해 4.8%의 에폭시드 가교제의 양을 사용한 본 발명에 의한 에폭시 가교된 콜라겐 바이오매트릭스의 제조예

a) DE　4048622　A1 및 특히 DE　10350654　A1에 의한 방법으로 제조된 3900 g의 콜라겐 서스펜션(건조 콜라겐 함량: 1.6%, 콜라겐 함량: 62.4 g)을 제공한다.

b) 콜라겐 서스펜션의 pH값을 pH 3.3으로 조정한다.

c) 10℃ 미만의 온도에서, 2.95 g의 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE, Sigma-Aldrich)를 패들 교반기 (유로스타, IKA)로 550 rps로 교반하면서 5분 동안 콜라겐 서스펜션에 한방울씩 가한다.

d) 3.8g의 중성 지방을 동일한 조건 하에서 부가한다. 얻어진 질량 (수용성 콜라겐 혼합물)은 진공 믹서 (Smartmix, Amann/Girrbach)에서 약 750 g의 부분으로 2x 5분 동안 가스제거된다.

e) 2시간 내로 가교제와 중성 지방을 혼합하고, 가스제거된 서스펜션을 시트에 부은 다음 동결하고, 콜라겐 서스펜션은 동결될 때까지 10℃ 미만의 온도에서 유지된다.

f) 동결 질량은 24시간 동안 -20℃에서 보존되고, 동결 건조되고, 동결 건조 온도는 100℃ 미만으로 유지된다.

g) 동결 건조된 콜라겐 매트릭스는 수분 함량이 건조 콜라겐 매트릭스에 대해 25%까지 되도록 상대 습도 60-70%의 습도에서 24-48시간 동안 재수화된다.

h) 얻어진 콜라겐 매트릭스는 1-2mm의 층으로 나뉘어져 처리되고 선택적으로 감마 살균(20 kGy)된다.

실시예 4:

SDS - PAGE 에 의한 가용성 프로테인의 정량적 결정

간단한 설명: SDS-PAGE

SDS = 소디움 도데실 설페이트, 세척제, 장쇄 지방산의 소디움 염

PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 아크릴아미드의 폴리머 겔에서의 전기 영동

전기 영동: 전압을 인가함으로써 캐리어 물질에서 하전된 입자의 분리에 의해 입자를 이동시킴

간단한 설명:이온성 세정제를 pH > 7 에서 부가함으로써, 하전되지 않은 단백질들이 하전된 입자로 전환되어 전기장을 형성하는 전압의 인가에 의해 그들의 크기와 형태에 의해 이동 거리를 두고 겔에서 분리된다. 낮은 질량의 프로테인은 높은 질량의 큰 프로테인보다 더 빨리 이동한다. 구형 프로테인은 길게 늘어진 실 형태의 프로테인보다 빨리 이동한다. 프로테인 그룹은 크기에 따라 분리되어 겔에서 좁은 띠 (밴드라고 불린다)를 형성함으로써 특정 염료에 의해 시각화될 수 있다. 프로테인 또는 프로테인 단편의 크기는 기준 물질과 비교되는 그들의 이동 거리에 근거해서 시각적으로 평가될 수 있다 (분자량 기준 = 프로테인의 알려진 크기).

적절한 시험 시스템은 종래 시판되는 시험 시스템이며, 예를 들면 Biorad의 기준시스템이다:

기준 XT 프리캐스트 겔 4-12% 아크릴아미드,

버퍼 시스템: Bis-Tris, 12+2 웰 콤, 웰 당 45㎕

겔 두께:1 mm,카탈로그 345-0123 Bio Rad

버퍼 B: 크라이테리언 XT Mes (버퍼, 20x) 컨트롤 210007145

샘플 버퍼: XT 샘플 버퍼 4x, 10 ml 컨트롤 310008088

종결된 프로테인 겔의 염색은 프로테인 민감성 염료인 쿠마씨 블루에 기반한 바로 사용할 수 있는 시약인 겔코드 블루 세이프 스테인 (GelCode Blue Safe Stain　(Thermo Scientific))에 의해 행해진다.

실시예 5:

BCA 방법에 의한 가용성 프로테인 구성 성분의 정량적 결정

BCA 시험에 의한 가용성 프로테인과 프로테인 구성 성분의 검출은 프로테인이 알칼리 수용액에서 Cu^{2 +} 이온과 착물을 형성한다는 사실에 근거한다 (뷰렛 반응) 이 착물의 Cu^{2 +} 이온은 Cu⁺ 이온으로 환원되어, BGA(bicinchinonic acid)와 보라색 착물을 형성한다. 이 채색 착물의 흡수는 562 nm에서 분광 분석에 의해 측정된다. 환원은 시스테인, 티로신, 트립토판 및 펩타이드 결합의 측쇄에 의해 수행되고, 색채 형성의 강도 (관련된 그룹의 산화환원 거동)는 온도에 의존하며, 따라서 시험의 민감도는 그의 변화에 의해 변형될 수 있다.

적절한 시험은 예를 들면 피어스 BCA 프로테인 어세이 키트 (Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific))와 같은 종래 시판되는 표준 시험 시스템이다.

결정은 표준 BSA(소 혈청 알부민)과의 비교로 행해진다.

착색 증진을 위한 반응 조건: 60℃, 1시간의 반응 시간

시험 결과:

도 1은 부가적인 가용성 매트릭스 프로테인 (엘라스틴 가수분해물)을 갖는 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스에서 가용성 프로테인 구성 성분의 퍼센트를 보여주며, 이것은 제조예 2a와 2b에 따라 제조된 조성물에 해당한다. 이 콜라겐 매트릭스는 5%와 10% 농도의 에폭시드로 가교되었으며, 각각의 경우는 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대한 것이고, 엘라스틴 가수분해물을 갖는 탈수 가열적으로만 가교된 콜라겐 매트릭스와 비교된다 (100%). (도면에서, "비가교된"은 탈수가열적으로 가교된 (즉, 화학적으로 가교되지 않은) 콜라겐 매트릭스를 나타낸다). 도면은 화학적 가교에도 불구하고 가용성 프로테인의 구성 성분의 높은 비율이 재료 안에 유지되는 것을 명확하게 보여준다. 측정은 또한 다음과 같은 중량의 가용성 프로테인 구성 성분을 나타내며, 각각의 경우는 시험된 재료에 대해 동결 건조된 최종 제품을 기준으로 한다:

엘라스틴에 의한 탈수가열적으로 가교된 콜라겐 매트릭스("비가교된"): >　15 wt%

5% 에폭시드에 의한 제조예 2a : > 10 wt%

10% 에폭시드에 의한 제조예 2b: > 4 wt%.

실시예 6:

분해율의 결정

콜라게나제 소화 시험

콜라겐 매트릭스의 효소적 안정성 (분해 안정성)의 확인이 효소 콜라게나제에 의한 콜라겐 섬유의 분해에 근거한 방법에 의해 수행되었다. 이 방법에서, 효소 콜라게나제 (PBS (인산-완충 식염수) 내의 클로스트리듐 히스토리티쿰으로부터의 콜라게나제 (타입 1))에 의한 콜라겐 섬유와 원섬유의 분해는 제어된 조건에 의해 의도적으로 영향을 받으며, 분해 산물의 양은 소정 반응 시간 후에 분광계에서 UV/VIS에 의해 결정된다.

사용된 화학물질:

- TRIS 버퍼 용액: TRIZMA 염기 (Fluka Art No. 93350 LOT 450756/1), CaCl₂*6H₂O (Riedel de Haen Art No. 12074 LOT 12610),

- HCl 25% (Merck Art No. 1.00316.1000 LOT Z730816335)

- EDTA 용액: 에틸렌디아민-테트라아세트산 디소디움 염 디하이드레이트 0.2 mol/l (Fluka Art No. 03679 LOT 1104109 10505293)

- 콜라게나제: Sigma C 688T LOT 122k8607, 700 U/mg

- 콜라겐 매트릭스: 예를 들면 제조예 1 내지 3에 의한 것.

시약의 제조:

TRIS 버퍼 용액 0.1 M/25mM CaCl₂:

1.21 g의 TRIZMA 염기를 80ml의 RO수에서 0.55 g의 CaCl₂*6H₂O와 함께 용해시키고, 약 1ml의 25% HCl을 사용하여 pH값을 7.4로 조정한다. 용액은 100 ml의 측정 플라스크로 옮겨져서 나머지 부분을 RO수로 채운다.

EDTA 용액 0.2 mol/l: 3.7224 g의 에틸렌디아민-테트라아세트산 디소듐 염 디하이드레이트를 50 ml의 RO수에 용해시킨다 (30분 간 자기 교반기 사용)

효소 용액:

5 mg의 효소를 1 ml의 TRIS 버퍼 용액에 용해시킨다. 개별 시험을 위해, 50 또는 100 U (전하 의존성 부피, 여기서 = 35 및 70㎕)의 부분 표본이 시험 시스템에 부가된다.

아세트산 0.95%:

0.95 ml의 빙초산에 RO수를 더하여 1000 ml를 채운다.

절차:

반경 10mm의 조각들(건조 중량 약 15 mg)을 2 mm 두께의 콜라겐 시트로 잘라 건조기에서 12시간 동안 건조했다. 시료는 2ml의 에펜도르프 용기 (Safe Lock Tubes 0030.120.094)로 칭량되고, 1.5　ml의 TRIS 버퍼 용액이 부가된다. 35 ㎕의 효소 용액이 부가되자마자, 시료는 Thermoblock (Stuart Scientific block heater) 내에서 37℃에서 뜨임처리된다 (tempered).

해당하는 소화 시간 (1.5시간, 3시간, 6시간 및 23시간 ) 후에 200 ㎕의 EDTA 용액을 에펜도르프 용기에 가하고, 18℃에서 30분간 최대 능력으로 원심분리시킨다. 0.95%의 빙초산 7.5ml로의 희석을 위해, 800㎕의 부분 표본이 10ml 표준 그라운드 시험관으로 옮겨지고, 스토퍼로 밀봉된 후 균질화 처리를 위해 부드럽게 좌우로 흔든다.

광도 측정:

측정은 234nm의 파장에서 UV/VIS 분광광도계로 행해졌다. 10 mm 석영 큐벳이 사용되었다. TRIS 버퍼 용액 800㎕와 함께 7.5ml의 아세트산이 블랭크값으로서 측정된다. 시료 측정 전에, 해당하는 효소 용액 (여기서: 에펜도르프 용기 내의 TRIS 버퍼 1.5ml에서의 효소 용액 35㎕)은 0의 값으로서 측정되어야 하며, 그 흡수는 다이어그램에서 0으로서 맞추어진다 (흡수는 약 0.0166)

절대값의 결정을 위해, 보정 용액이 또한 준비되고 상술한 절차에 의해 측정되었다.

보정 용액의 제조:

233㎕의 콜라게나제 용액 (600U에 해당)으로 8ml의 TRIS 버퍼에서 0.1006 g의 콜라겐이 37℃에서 하룻밤 사이에 완전히 분해되었다. 다음 날, 1333 ㎕의 EDTA 용액을 용액에 부가하고, 측정 플라스크에서 TRIS 버퍼로 10ml를 만들었다. 이 용액의 해당 부피는 하기의 표에 의하면 0.95% 아세트산으로 10ml로 희석되고 이 용액의 흡수는 234nm에서 측정되었다.

해당하는 보정 곡선은 다음의 1차 방정식;

A (234 nm) = 0.0011c-0.0407 (R²= 0.9983)이다.

시험 결과:

도 2a는 제조예 1a에 의한 부가 성분 없는 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스와, 제조예 2a에 의한 부가적인 가용성 매트릭스 프로테인 (엘라스틴 가수분해물)을 갖는 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스를, 엘라스틴 가수분해물을 갖는 탈수가열적으로만 가교된 콜라겐 매트릭스와 비교한 상대적인 분해율(%)를 나타낸다 (도면에서 "비가교된"은 탈수가열 가교된 (즉, 화학적으로 가교되지 않은) 콜라겐 매트릭스를 나타낸다).

도면은 본 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 물질의 분해 속도의 감소로 표현되는 분해에 있어서의 향상을 분명하게 나타낸다.

6시간 후에 완전히 분해된 매트릭스는 여기서 100%로 맞춰진다. 흡수값은 10mg의 매트릭스로 정규화되었다.

보정 곡선의 결정을 위해, 분해된 양의 절대값은 흡수값으로부터 계산될 수 있다:

도 2b는 23시간까지의 시간 동안 사용된 10mg의 매트릭스로 정규화된 분해된 매트릭스의 해당하는 절대 농도를 나타낸다.

도 2b는 또한 분해 백분율로서 23시간까지의 시간 동안의 분해의 전개를 보여준다. 본 발명에 의한 가교된 콜라겐 매트릭스는 따라서 23시간 동안의 콜라게나제 소화 후에도, 화학적으로 가교되지 않은 매트릭스에 비해 현저하게 뛰어난 분해 안정성을 나타낸다.

실시예 7:

가수 분해 안정성의 결정

콜라겐 매트릭스의 가수분해 안정성은 소정의 콜라겐 물질을 수용액에 위치시키고 50℃에서 저장하고, 시간 경과에 대한 물질 특성의 변화를 결정함으로써 연구되었다.

가수분해 안정성을 연구하기 위한 수용액의 예는 다음 조성을 갖는다:

제조:

1) 유리 비이커에서 자석 교반기를 사용하여 글리세롤, 펜탄디올 및 로콘살 MEP를 용해시킨다

2) 교반하면서 초순수 (SHC 101)로 최종 양의 약 98%를 만든다

3) NaCl을 더하고 자석 교반기를 사용하여 용해시킨다

4) 1% 시트르산 용액으로 pH를 5.0으로 조정한다

5) 초순수 (SHC 101)로 최종 양을 만든다.

6) pH값을 확인하고 필요한 경우 pH값을 다시 5.0으로 조정한다.

가수분해 안정성은 매트릭스의 수축으로 인한 표면적의 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다.

또한 가수분해 안정성은 다음과 같이 결정되는 질량의 감소에 의해서도 결정될 수 있다.

가수분해 안정성 (%) =M_tx x 100 / M_t0

여기서 M_tx = 건조된 비손상/화합 (cohesive) 매트릭스 재료의 질량이고, M_t0 = 시험 시작 전의 건조 매트릭스 재료의 질량이다.

시험 결과 :

가수분해 안정성은 표면적의 감소의 측정에 의해 상술한 조건 하에서 연구되었다.

a) 동결 건조 온도 >120℃ 에서 동결 건조된 트리글리세리드/중성 오일 함유 탈수 가열 가교된 콜라겐 매트릭스 ("비가교")

b) 제조예 3의 본 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 (트리글리세리드/중성 오일 함유)

c) 동결 건조 온도 >120℃ 에서 동결 건조된, 실시예 3에 의한 조성에 대응하는 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 (5% 에폭시드/DM).

도 3은 a)에 의한 탈수가열로만 가교된 ("비가교") 콜라겐 재료의 경우 선택된 시험 조건 하에서 5일 후에 완전한 가수 분해 (매트릭스 구조의 구조적 분해)를 나타내는 반면, b)에 의한 본 발명에 의한 에폭시 가교 콜라겐 물질의 경우 동일한 조건 하에서 18일 경과 후에도 매트릭스의 구조적 변화는 관측되지 않았음을 나타낸다. 동시에, c)에 의한 동결 건조 온도 > 100℃에서 건조된 에폭시 가교 콜라겐 물질은 b)에 의한 본 발명에 의한 물질과 비교해서 가수 분해의 시작 (표면적의 수축)을 나타낸다. 4주 후에, b)에 의한 본 발명에 의한 매트릭스 역시 가수 분해의 시작을 나타내며, 동시에 c)에 의한 더 높은 온도에서 건조된 재료는 현저하게 더 나쁜 가수 분해 안정성을 나타낸다. 따라서 이 결과는 동결 건조 온도 역시 가수 분해 안정성에 영향을 미친다는 사실을 반영한다. 따라서 >100℃ 의 동결 건조 온도에 노출된 매트릭스는 본 발명에 의해 제조된 재료 (< 100℃의 온도에서 동결 건조)에 비해 더 나쁜 가수 분해 안정성을 나타낸다.

실시예를 통해 도 4는 이미 설명한 시험 조건 하에서 18일 경과 후 b)에 의한 본 발명의 매트릭스와 비교해서 a)에 의한 탈수가열 가교된 매트릭스의 가수분해도를 타낸다.

실시예 8:

습윤 인열 강도의 결정

내적 방법 ( UV8801 )

다이 (내적 측정 방법 UV8801)에 의한 인열 강도의 결정 방법에서, 구형 헤드 (지름 25mm)를 갖는 금속 다이는 기계적 테스터 (Zwick material tester B Z 2.5 / TN 1S)의 도움으로 본 발명에 의한 콜라겐 매트릭스의 층상 형태 위에 압착되고, 다이가 남긴 경로와 힘이 측정된다.

결정을 위해 두께 1.5mm의 층상 콜라겐 매트릭스는 8 x 8 cm 크기로 절단되고, 장치의 표본 리시버 안으로 도입되고, 그 안에서 완전히 적셔진다. 그리고 측정이 시작되고, 구형 다이는 재료가 찢어질 때까지 시료를 누른다.

재료의 인열이 기록될 때의 힘이 전자 데이터 기록에 의해 기록되고, 계산되고, 표시된다.

시험 결과:

실시예에 의해, 도 5는 탈수가열 가교된 콜라겐 매트릭스 (가교되지 않고, 100℃에서 건조, "비가교"는 탈수가열 가교된 것을 나타낸다 (즉, 화학적으로 가교되지 않은))와 비교해서 제조예 1a에 의한 조성을 갖는 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스의 습윤 인열 강도 (내적 방법 UV8801에 의한)에서의 향상을 보여준다.

도 5는 또한 습윤 인열 강도에서 동결 건조 온도의 영향을 나타낸다. 도면에 의하면, ≥100℃의 동결 건조 온도에 노출된 매트릭스 또는 >100℃에서 후 건조된 매트릭스는 본 발명에 의해 제조된 재료보다 불량한 습윤 인열 강도를 나타낸다.

더욱이, 도 5는 또한 습윤 인열 강도에 대한 에폭시드 가교제 농도의 영향을 나타낸다. 에폭시드 농도가 >5%로 증가함에 따라 (수용성 콜라겐 서스펜션/혼합물 DM에서) 습윤 인열 강도는 감소함을 나타낸다. 최적의 습윤 인열 강도는 에폭시드 농도 5-10% (DM)의 주어진 공정 조건 하에서 얻어진다. 도면은 또한 기대한 바와 같이 탈수가열 가교된 콜라겐 재료의 습윤 인열 강도는 동결 건조 온도의 상승에 따라 증가함을 나타낸다.

도 7은 습윤 인열 강도에 대한 대기 시간과 동결 건조 전에 유지된 수용성 콜라겐 서스펜션/혼합물의 온도의 영향을 보여준다. 더 긴 대기 시간과 더 높은 온도는 모두 콜라겐 물질의 습윤 인열 강도에 악영향을 미친다는 것을 분명하게 알 수 있다.

모든 시험된 에폭시 가교 매트릭스 물질은 > 400 cN/mm 층두께의 습윤 인열 강도를 나타냈다.

탈수가열 가교된 물질은 <　200　cN/mm 층 두께의 습윤 인열 강도를 나타냈다.

실시예 9:

반응성 에폭시 화합물의 검출

잔여 에폭시 활성의 결정

( NBP 분석)

잔여 에폭시 활성은 변형된 NBP 분석 (니트로벤질-피리딘 분석)에 의해 결정될 수 있다. 이 방법은 Agarwal et al. (1979) Bull. Environm. Contam. Toxicol. 23, p. 825-829에 의한 "4-(p-니트로벤질-피리딘"에 의한 에폭시드의 검출"에 근거하며, Zocher et al. (2000) "방선균의 에폭시드 가수 분해 활성" J. Biotechnol. Feb 17; 77(2-3), p. 287-292에 따라 변형되었다.

1. 원리

시험 과정은 가용성, 에폭시드로 안정화된 바이오매트릭스의 경우 동결 건조된 최종 제품에서 반응성 에폭시 화합물의 정량적 결정을 위해 사용된다.

p-니트로벤질피리딘은 알킬화 화합물 (에폭시드 포함)과 반응하여 무색의 가용성이 적은 염을 만들고, 이것은 염기와의 반응으로 푸른색의 가용성이 적은 염료로 디프로토네이트된다. 색도는 570nm의 파장에서 분광기에 의해 검출될 수 있다.

2. 시약/화학제품

파라-니트로젠질피리딘 (NBP) (Merck, 합성용)

에틸렌 글리콜 (Fluka, purum)

아세톤 (Fluka, UV 분광용)

트리에틸아민 (Fluka, purum)

1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 또는 BDDG 또는 에폭시드 (Sigma Aldrich, purum)

RO수

그로부터 제조:

기질 용액: 50℃에서 5ml의 에틸렌 글리콜 및 1.25ml의 아세톤에 1g의 NBP를 용해 (10샘플에 대해 충분)

염기 용액 (base solution) : 50% 아세톤에서의 트리에틸아민 (v/v)

(10샘플에 대해 충분)

3. 장치

그라운드 유리, 그라운드 유리 스포터, 그라운드 유리 클램프를 갖는 시험관 또는 나사 마개를 구비한 50 ml 시험 플라스크

온장고와 히팅 블럭 (50℃)

안전 마개 또는 나사 마개를 구비한 2ml 반응 용기

200㎕ 용 및 1000㎕ 용 마이크로피펫 (Eppendorf), 그에 맞는 피펫 팁

UV 분광기 (570nm)

1.5ml 일회용 플라스틱 큐벳 (Plastikbrand, No. 7591 50)

4. 견본

시험될 콜라겐 재료를 견본으로서 자른다 (12 mm)

(3개를 한 세트로) 1-3 다이

비교 견본: 화학적 가교제 없는 동결 건조 바이오 매트릭스 (예를 들어 탈수가열 가교된 콜라겐 매트릭스)

5. 절차

기질 용액:

각각의 10개의 표본에 대해, 1 g의 NBP를 그라운드 유리를 구비한 시험관에 칭량하고, 5 ml의 에틸렌글리콜과 1.25 ml의 아세톤과 혼합한다. 더 많은 수의 표본에 대해서는 그에 따른 양을 배가시키고, 나사 마개 플라스크를 사용한다.

조심스럽게 용기를 막은 다음 (그라운드 유리 마개/그라운드 유리 클램프 또는 나사 마개), 기질 혼합물은 때때로 좌우로 흔들어주면서 고체가 완전히 용해될 때까지 (1/2 - 1 시간) 온장고에서 50℃로 가열된다. 기질 용액은 그 다음 실온에서 냉각된다. 염이 용해되어 남아 있다.

염기용액:

트리아세틸 아민 3 ml와 아세톤 3 ml를 유리 마개가 있는 시험관에 밀봉한 후 혼합한다.

보정 곡선을 위한 표준 표본의 제조:

사전 희석:

0.001g까지 정확한 1 g의 에폭시드를 파스퇴르 피펫 (유리)를 이용하여 100ml의 측정 플라스크로 바로 칭량하고, RO 수로 100ml를 채운 다음 잘 혼합한다 (1:100).

정확히 1000㎕의 사전 희석액을 1000㎕의 피펫으로 100ml 측정 플라스크로 옮긴 다음 100ml를 만들고 잘 혼합한다. 이것은 표준 측정값을 만들기 위한 (보정 곡선) 에폭시드 희석액이다 (1:10,000).

표준 측정값:비교 물질 (가교제 없는)의 12mm 조각의 동량을 2ml 반응용기에 가하고, 반응 용기를 라벨링한다. 200㎕ 피펫을 사용하여 부직포에 다른 부피의 RO수를 가하고 (부피에 대해서는 표 1의 A열 참조), 600㎕의 기질 용액을 부가한다.

표 1 - 표준 측정값

마지막으로 시험 표본이 종료된 바로 직후 반응 용기 내의 표준 계열에 에폭시드 희석액 1:10,000 (부피에 대해서는 표 1의 B열 참조)을 가한다. 다시 잠시 좌우로 흔든다.

시험 물질:

1-3 시험할 물질의 12 mm 조각들을 2ml 반응 용기 내에 0.1mg 까지 정확하게 칭량하고 3세트로 만든 다음 200㎕의 RO수로 충분히 적신다. 그리고 기질 용액 600㎕를 충분히 적셔진 조각들에 가한다.

처음에는 뿌옇던 서스펜션이 맑아질 때까지 반응 용기를 부드럽게 두드린다. 반응 용액이 맨 윗부분 아래에 있는 경우, 간단한 원심분리에 의해 액체를 바닥으로 되돌린다. 모든 표본을 50℃에서 1시간 동안 온장고 또는 히팅 블럭에서 배양하고, 조심스럽게 밀봉한다.

실온에서 냉각하고, 염기 용액 600㎕를 가한 다음 잠시 흔든다.

흡수의 측정은 10분 이내에 행해져야 한다.

1000㎕ 피펫을 사용하여 콜라겐 조각의 모든 상청액을 제거하고 1.5ml 플라스틱 큐벳으로 옮긴다.

염기 용액 부가 후 10분 이내의 570nm에서의 흡수의 측정

측정 프로그램: 방법들/농도/ENBP

보정점: 표준 측정값 50 (= 25 nmol 에폭시드)

평행선 및 블랭크: 빈 플라스틱 큐벳

6. 평가

반응 에폭시드의 양은 보정 곡선에 의해 결정된다(반응 농도/흡수). 측정 결과는 시험된 매트릭스 물질의 원래 칭량된 양과 관련되며, 다음과 같이 주어진다:

에폭시드 함량: ng/mg 콜라겐

시험 결과:

실시예에 의해, 도 8은 제조예 1a에 의한 매트릭스에 기반한 본 발명에 의해 제조된 콜라겐 물질의 잔여 에폭시드 활성과, 그것의 동결 건조 후 시간 경과에 따라 지수적 감소 (분해 곡선)를 나타낸다. 거기에서 시험된 매트릭스는 60℃를 넘지 않는 동결 건조 온도에서 건조되었다. 도면은 또한 특히 잔여 에폭시드 활성의 감소에서 재수화 조건의 영향을 나타낸다. 시험을 위해 콜라겐 물질은 동결 건조 직후 제어된 기후 조건 하에서 재수화되었다. 다음의 재수화 기간의 물질의 잔여 활성 감소가 비교되었다.

a) 24 시간,

b) 48 시간,

c) 72 시간 및

d) 96 시간

각각의 경우에 대해 결정은 재수화 완료 직후에 행해졌다. 시료 a)만이 첫번째 측정 수행 전에 통상의 주변 조건 하에서 24시간 동안 보존되었다. 따라서 표본 a) 및 b)에 대해 48시간 (2일) 후에, 표본 a), b) 및 c)에 대해 72시간 (3일) 후에, 표본 a), b), c) 및 d)에 대해 96시간 (4일) 후에, a) 내지 d)의 모든 표본에 대해 168시간 (7일) 및 336 시간 (14일 )후의 지시된 측정점을 얻었다.

재수화 기간이 증가함에 따라 잔여 에폭시드 활성은 현저하게 빨리 고갈될 수 있고 더 이상 검출되지 않는 수준까지 감소될 수 있음이 명확하다.

실시예 10:

체 외 세포 독성 시험

( XTT 시험)

제조예 3에 의한 에폭시 가교 콜라겐 물질에 대해서

1. 장비 및 방법

1.1 시험 물질:

제조예 3에 따른 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 물질

1.2. 추출물의 제조

시험 물질로부터 동일 크기 (9.6 cm²)의 조각이 3개의 다른 콜라겐 시트로 절단되었다. 잘린 조각들은 37±1.5℃에서 10% FCS (Gibco, Invitrogen, Ref. No. 10270-106), 1 mM 소디움 피루베이트, 4 mN L-글루타민 및 100㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 9.6ml의 세포 배양 배지 (RPMI 1640 medium) (완전 배지)에서 24시간 동안 진동 하에 추출되었다. 포지티브 및 네거티브 대조군이 같은 방식으로 추출되었다.

시험 물질은 표면적/부피비 3㎠/ml에서 ISO 10993-12 에 따라 추출되었다.

1.3. 대조군

네거티브 및 포시티브 대조군 추출물의 다량이 미리 제조되어 -20℃에서 보존되었다. 100% 추출물이 처리 직후에 해동되고 희석되었다. 네거티브 및 포지티브 대조군은 표면적/부피비 6㎠/ml에서 ISO 10993-12에 의한 완전 배지에서 추출되었다.

1.3.1 네거티브 대조군

RM-C (고밀도 폴리에틸렌)

제조자: 하타노 연구소, 하타노/일본

로트: C -042

1.3.2 포지티브 대조군

이름. 라텍스

공급자: VWR 인터내셔널 GmbH (64295 다름슈타트, 독일)

로트: 03200694110385

1.4 시험 시스템

1.4.1 세포주 L929 선택에 대한 기준

ATCC, CCL 1 NCTC 클론 929 세포주 (스트레인 L의 클론 마우스 연결 조직) 은 수년 간 체 외 실험에서 성공적으로 사용되어 왔다. 특히, 연구의 적절한 수행을 위해 필요한, 높은 증식율 (1992년 10월 22일에 측정된 배가 시간: 16시간)과 미처리 세포의 뛰어난 생존능력 (일반적으로 79% 이상)은 이 세포주의 선택에 유리한 측면이었다.

1.4.2 세포 배양

다량의 L929 세포주(LMP, 다름슈타트 공과대학, D-64287 다름슈타트에 의해 공급)는 실험에서 동일한 세포 배양 배치의 반복 사용을 허용한 할란 사이토테스트 세포 연구소 GmbH 세포은행에서 액화질소에 보존되었다. 그 결과, 세포의 재생가능한 특성으로 인해, 실험에서 일정한 파라미터의 유지가 확보되었다.

해동된 줄기세포 배양액은 플라스틱 바틀에서 37±1.5℃에서 배가되고, 배양은 완전 배지 6ml에서 2 x 10⁵ 세포/배양 바틀로 수행되었다. 세포는 일주일에 2번 하위배양되었다 (subcultivated). 세포배양액은 5.0±0.5%의 이산화탄소 분위기에서 37±1.5℃에서 배양되었다.

1.5 시험군

1.5.1 배지 대조군: 완전 배지

1.5.2. 네거티브 대조군: RM -C

24시간 동안 완전 배지로 추출되어 100% 추출

1.5.3. 포지티브 대조군: 라텍스

24시간 동안 완전 배지로 추출; 3% 추출, 10% 추출, 30% 추출, 70% 추출, 100% 추출

1.5.4. 시험 물질: 제조예 3에 의한 콜라겐 매트릭스

완전 배지로 24시간 동안 추출; 3% 추출, 10% 추출, 30% 추출, 100% 추출

1.6 시험 절차

1.6.1.세포 배양

50% 이상의 컨플루언트된 기하급수적으로 성장하는 줄기세포 배양액은 Ca-Mg 이 없는 염 용액으로 헹구어진 다음 37±1℃에서 5분 간 트립신 (Gibco BRL 트립신/EDTA 용액 10x Cat. No. 35400-019)으로 처리되었다. 그리고 효소 분해는 완전 배지의 부가에 의해 중단되고, 단일 세포 서스펜션이 준비되었다.

Ca-Mg이 없는 염 용액은 다음 조성을 갖는다 (리터 당):

NaCl 8000 mg

KCl 400 mg

글루코스 1000 mg

NaHCO₃ 350 mg

약 15,000개의 세포를 함유하는 0.1 ml의 배지가 96-웰 셀 배양 마이크로타이터 플레이트 (Greiner)의 개별 웰에 부가되었다. 배지는 완전배지였다.

플레이트는 세포 부착을 허용하기 위해 24시간 동안 배양되었다.

1.6.2 처리

그 다음으로 배지가 제거되고, 0.1 몰의 처리 배지가 세포에 부가되었으며, 처리 배지는 시험 물질 추출물과, 네거티브 및 포지티브 대조군 추출물 및 배지 대조군의 서로 다른 농도를 함유한다.

모든 배양은 5.0±0.5% CO₂ 분위기의 습한 대기에서 37±1.5℃에서 수행되었다.

1.6.3 XTT 라벨링 및 측정

24시간의 배양 시간 후, XTT 라벨링 혼합물 50㎕가 부가되었다. 혼합물은 XTT 라벨링 시약과 전자커플링 시약 (부피비 1:100)을 함유한다. 세포는 1시간 35분 동안 배양되고, 흡수를 측정하기 위한 (기준 파장 690nm) 450nm 필터를 구비한 마이크로플레이트 리더 ((Versamax^® Molecular Devices, D-85737 이스마닝)으로 이동시켰다.

1.7 데이터 기록

생성된 데이터는 기초 데이터로서 기록된다. 결과는 시험 물질, 네거티브 배지 및 대조군과 시험군을 포함하는 표의 형태로 제시된다.

1.8 결과의 평가

살아있는 세포 수의 감소는 시료에서 미토콘드리아 디하이드로게나제의 전체 활성의 감소를 초래한다. 이 감소는 흡수에 의해 측정되는, 형성된 오렌지색 포르마잔의 양과 직접 연관된다. 용량 의존성 세포독성 응답의 결과는 산술 평균 - 표준 편차로서 제시될 수 있다. 독성 물질의 농도를 계산하기 위해 배지 대조군 (XTT₅₀)에 대한 흡수의 50% 감소가 필요하며, 다음 식이 사용되었다:

a) Conc. >50= 최대. > 50% 배지 대조군 농도로 측정

b) Conc. <50= 최소. < 50% 배지 대조군 농도로 측정

c) %>50= a)에서의 상대 흡수 %

d) %<50= b)에서의 상대 흡수 %

XTT₅₀ 값이 더 작을 수록 시험 물질의 세포 독성 잠재성은 더 크다.

< 70% 및 ≥ 50% 의 배지 대조군에 대한 생존 가능성의 감소는 낮은 세포 독성을 의미한다. < 50% 배지 대조군에 대한 생존 가능성의 감소의 경우는, 잠재적 세포 독성이 존재한다.

2. 결과

2.1. 결과 표

완전 배지에서 24시간 추출 후의 결과

지시된 흡수는 반올림값을 나타낸다. 상대 흡수는 정확한 흡수값을 이용하여 계산되었다. 그늘진 (shaded) 시험군은 독성의 발생으로 인해 현미경 처리 직후 형태학적 변화를 나타내는 시험 물질 농도를 나타낸다.

* 7개의 웰의 평균 흡수 (절대값)

** 상대 흡수 [반올림 값]:

시험 물질의 XTT₅₀ 값은 세포의 생존 가능성이 관련된 방식으로 감소되지 않았기 때문에 계산될 수 없었다.

포지티브 대조군의 XTT₅₀ 값: 16.3% (v/v)

3. 토론

이 생체 외 연구는 마우스 세포주 L929를 사용하여 제조예 3에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 물질의 세포 독성 잠재성을 조사하기 위해 수행되었다.

동일한 시험편 (9.6 cm²) 이 세 개의 시험 물질로 절단되고, 절단 조각들은 상술한 바와 같이 추출되었다.

시험 추출물의 다음 농도가 연구되었다:

3%, 10%, 30% 및 100% (v/v)

다음 농도의 추출물 (포지티브 대조군)이 시험되었다:

3%, 10%, 30%, 70% 및 100 % (v/v)

배지 대조군 (완전 배지)와 네거티브 대조군 (추출된 네거티브 대조군 RM-C) 간에 어떤 관련성 있는 차이도 관측할 수 없었다.

포지티브 대조군 (라텍스)은 세포 생존 능력과 세포 증식에서 현저한 용량 의존성 감소를 나타냈다. 희석되지 않은 기준 표준 추출물 (100%)에 있어서, 약 1.81%의 각 웰에서 세포 생존 능력 및/또는 세포 증식의 감소가 발견되었다. 계산된 XTT₅₀ 값은 16.3% (v/v)였다.

배양 후의 세포 독성 효과는 제조예 3에 의한 콜라겐 물질의 어떤 시험 추출물에서도 관측될 수 없었다. 세포 생존 능력이 관련된 방식으로 감소되지 않았기 때문에 XTT₅₀ 값은 계산될 수 없었다.

4. 결과

요약하면, 상술한 실험 조건 하에서 이 시험의 맥락 내에서, 제조예 3에 의한 시험 물질 추출물은 가장 높은 시험 농도에서도 어떤 세포 독성 잠재성도 나타내지 않았다.

실시예 11:

제조예 2a 및 2b에 의한 에폭시 가교 콜라겐 물질의 강성/ 영률 E의 측정

(5% 및 10% 에폭시 가교제 /건조 질량)

( Stok et al .에 의한; J Biomed Mater Res ; 2009에 따름)

강성은 5 N 힘센서에 의해 재료 시험 기계 (Zwick/Roell 1456, Ulm)를 사용한 압축 시험에 의해 Stok et al. 2009 에 따라 측정되었다. 시험 다이를 위해 적절한 크기는 Spilker et al.; Journal of Biomechanical Engineering, series 114, H. 2, p. 191-201; 1992에 따라 계산되었고; 지름은 1.38mm였다. 표본은 마이크로 코디네이트 테이블 위의 홀더에 위치되었고 (도면 참조), PBS 층으로 덮였다. 플렉시글래스 커버가 시료가 위쪽으로 구부러지는 것을 방지한다.

다이는 표본을 단계적으로 표본 두께 5%, 15%, 25% 깊이로 이동시키고 시스템이 이완될 때까지 유지한다. 탄성율은 세 번의 인상 단계 (impression step)의 평형 상태의 마지막 10번의 값의 평균으로 결정된다:

탄성율 [kPa]은 변형율 (x)와 응력 (y)의 기울기이다.

변형율 = 투과 깊이[mm]/ 표본 두께[mm]

응력 = 힘[mN]/다이의 표면적 [㎟]

표본은 적어도 15분 간 PBS 에 침지되고, 홀더 안에 위치된 후, 그곳에서 이동하여 적어도 5분 간 PBS 층으로 덮인다. 시료의 표면은 0.1mN 저항이 검출된 센서의 위치로서 정의된다. E값의 결정은 세 번의 측정에 의해 행해진다 (n = 3).

시험 구성은 도 9의 예에 의해 도시된다.

결과:

제조예 2a (5% 에폭시드)에 의한 콜라겐 매트릭스는 9 kPa의 강성을 나타낸다.

제조예 2b (10% 에폭시드)에 의한 콜라겐 매트릭스는 22 kPa의 강성을 나타낸다.

가교되지 않은 콜라겐 매트릭스 (탈수가열 가교된)는 6 kPa의 강성만을 나타낸다.

실시예 12:

가교된 콜라겐 매트릭스의 용도

제조예 1 내지 3의 본 발명에 의한 물질은 특히 화장품제 및 약학 제제로서의 용도에 적합하다.

사용예 12a

화장품용 마스크로서의 용도

처리를 위해 제조예 1 내지 3의 본 발명에 의한 물질은 처치될 피부 영역의 원하는 모양과 크기로 잘리고, 또한,

a) 처치될 피부의 건조 상태에 위치되고, 물 또는 활성화 용액으로 적셔짐으로써 포화될 때까지 재수화되거나 또는,

b) 피부에 놓이기 전에 포화될 때까지 물 또는 활성화 용액으로 흠뻑 적셔지고 나서 재수화된 상태에서 처치될 피부 영역에 위치된다.

재수화된 콜라겐 드레싱은 약 20-30분 동안 처치될 피부 영역 위에 방치된다.

이 처치 동안 기존의 가려움 뿐 아니라 발적 (redness) 또는 자극이 현저히 감소했으며, 상쾌한 외관, 피부 탄력 증가 및 피부 보습력 향상이 나타났다.

사용예 12b

피하 임플란트로서의 용도

제조예 1 및 2의 본 발명에 의한 물질은 미용적 재건 수술 뿐 아니라 코성형 수술에서, 또한 필요하다면 종양 수술 또는 관련된 신체 부분과 별도로 외상 후에, 예를 들면 중앙 면부 영역에서 다양한 원인으로 발생하는 2차적 피부 볼륨 상실의 경우 예를 들면 볼륨 구축 재건을 목적으로 성형수술 또는 재건외과 수술 분야에서 피하 임플란트로서 사용될 수 있다.

이식 전에, 건조 상태에서 재료는 절단될 수 있고, 따라서 피부의 기부 영역에 적용될 수 있다.

매트릭스가 준비된 피부 포켓에 도입되기 전에, 다량의 멸균 생리 식염수 또는 링거액으로 반드시 재수화되어야 한다.

준비된 피하 피부 포켓으로의 매트릭스의 삽입은 멸균 생리 식염수 또는 링거액으로의 재수화가 완료된 직후 빠르게 행해진다. 상처 봉합은 수술 절차에 따라 적용되고, 처치 의사에 의해 결정된다.

매트릭스의 작용:

이식 시에, 매트릭스는 스캐폴드로서 작용하고, 재건 피부 조직에 관련된 세포가 내적 성장하도록 한다.

이동된 세포는 치유 과정 동안 자가조직 구조를 합성하고, 따라서 삽입된 임플란트 영역에서 원하는 볼륨의 증가를 제공한다.

조직 신생이 진행됨에 따라, 매트릭스의 구조는 완전히 재흡수되거나 리모델링될 수 있다.

천연의 구조적으로 손상되지 않은 콜라겐 템플레이트는 세포와 베슬 (vessel)의 내적 성장을 촉진하는데 매우 적절하고; 이것은 따라서 조직의 재생을 지지한다. 두 개의 다른 조직 층 간에 위치한 매트릭스의 용도는 고착 형성 및 2차적 수축에 대해 예방적으로 작용한다.

사용예 12c

진피 대체로서의 용도 (임플란트)

(급성 및 만성 상처)

제조예 1 및 2의 본 발명에 의한 물질은 화상 수술, 성형-재건 수술 및 이식을 필요로 하는 잘 치유되지 않은 상처 (예를 들면 만성적 상처)의 치료에서 심부 피부 결손 및 전층 부위 피부 결손의 경우, 자가조직 스플릿-피부 이식과 조합하여 진피 구축을 위해 사용될 수 있다.

적용:

대응하는 물질편을 포장에서 살균 제거하고 피부 결손에 맞게 대충 자른다. 건조 물질을 상처에 위치시키고, 먼저 복부직물 (stomach cloth)에 의해 상처 영역 안으로 누른다.

재료는 상처액으로 흠뻑 적셔지고, 공기 포켓을 형성할 염려 없이 상처 기부에 부착된다. 약 2mm의 좁은 겹치는 부분을 남기고 모서리를 자른다.

재료가 상처 영역에 적절하게 안착되면, 식염수를 흡입기로 조심스럽게 가하거나; 또는 식염수로 푹 젖은 복부 직물이 적용될 수 있고, 몇 분 후에 제거된다. 이 시간후, 재료는 완전히 재수화되고, 이전 위치에 따라 상처 기부에 정확하게 위치된다.

상처 영역 내로의 스플릿 스킨의 이식은 재료 바로 위에서 수행된다. 스플릿 스킨과 함께 재료의 부가적 확보는 스티칭 또는 스테이플에 의해 행해진다. 매트릭스가 이후 시간까지 스플릿 스핀 이식물을 덮지 못하면, 건조되지 않았는지 확인해야 하다. 생리 식염수로 적신 멸균, 비부착 거즈가 이 목적에 적합하다.

상처를 덮기 위해, 보습 상처 환경을 확보하기 위해 비차단성 실리콘 호일 또는 유효 성분이 없는 지방질 거즈의 수개의 층을 사용하는 것이 추천된다. 지금까지, 지방질 거즈의 5-6층과 거즈 붕대의 3-4층의 조합의 단단한 붕대의 사용이 실용상 유리하다는 것이 밝혀졌다. 붕대를 감는 방법은 스플릿 스킨, 매트릭스 및 상처 기부 사이에 우수한 접촉을 확보하고, 전단 응력을 흡수하도록 설계되어야 한다. 상처 치료용 진공 붕대의 사용은 각각의 특별한 경우마다 의사의 결정에 따라 달려 있다. 많은 경우, 이 붕대 기법의 사용에 의해 좋은 결과를 얻을 수 있었다.

처치의 목표는 복원된 피부의 질을 향상시키기 위한 피부 재생의 구축이다. 흉터는 감소되고 상처 수축은 예방된다.

사용예 12d

지혈제로서의 사용

(급성 및 수술 창상)

제조예 1 및 2의 본 발명에 의한 재료는 예를 들면 바람직하게는 내장 수술, 심혈관 수술, 신경외과 수술, 상악 수술 및 일반적인 구강 의학, ENT, 비뇨기 및 부인과의 경우 정맥 및 확산 출혈을 동반하는 수술의 경우 국부 처방용 지혈제로서 사용될 수 있다.

재료는 바람직하게는 건조 상태에서 면봉 소독된 상처 위에 놓이고 거기에서 약간 모델화된다. 그러나 사용 전에 수화될 수도 있다. 더 심한 출혈의 경우, 탐폰삽입법이 습포로 행해질 수 있다. 더 큰 상처 영역에 대해서는 몇 조각으로 제공되고, 작은 영역에 대해서는 재료를 가위로 적절하게 잘라서 사용할 수 있다.

작용 방식:

재료는 그 자신의 무게의 몇 배의 액체를 흡수한다. 더 큰 내부 표면에서 혈소판은 응집하고 혈액 응고 인자의 방출에 의해 국부적 지혈에 기여한다. 피브린은 상처 기부에 콜라겐 매트릭스 앵커를 형성하고 따라서 안정된 상처 봉합을 형성한다.

이 처치에 의해 신속한 지혈이 이루어질 수 있다.

사용예 12e

삼출 상처에 대한 더멀 / 트랜스더멀 상처 드레싱으로서의 용도

(만성적 상처)

제조예 1 및 2의 본 발명에 의한 재료는 국부적 상호 작용 상처 치료용 상처 드레싱으로서 사용될 수 있다. 최적의 작용을 위해 재료는 상처 기부 전체에 바로 적용되어야 한다. 삼출이 없거나 적은 상처에서는, 재료는 식염수 또는 링거액으로 재수화될 수 있다.

상처 드레싱은 습한 상처 치유 환경을 유지하기 위해 반드시 적절한 2차 붕대로 덮여야 한다. 첫번째 적용 후에, 상처는 삼출 정도에 따라 최대 72시간의 간격을 두고 다시 처치되어야 한다. 어떤 재흡수되지 않는 매트릭스도 상처에 남아있을 수 있다.

작용 방식:

재료는 자기 무게의 수 배의 액체를 흡수할 수 있고 따라서 상처액의 관리에 매우 적합하다. 상처 분비액의 흡수와 함께, 육아 조직의 형성이 보조되고 촉진된 결과로서 상처에서 배출된 괴사, 박테리아 및 피브린 커버링 역시 흡수될 수 있다. 이들 효과는 모두 상처 치유를 촉진시키는데 기여한다.

사용예 12f

진공 보조 상처 치료 요법에서의 용도

(만성적 상처)

사용을 위해 제조예 1 및 2의 본 발명에 의한 재료는 건조 상태에서 치료될 신체 부위에 적용되고, 필요한 경우 상처의 형태로 절단된다. 재료는 존재하는 상처 유액 또는 수용액 또는 생리식염수로 푹 적셔지거나 또는 재수화된다. 부가적으로 치료될 신체 부위에 적용하기 전에 본 발명에 의한 재료를 적시는 것도 가능하다.

상처는 종래의 진공 밀착 커버링 호일에 의해 에어타이트 방식으로 봉합되고, 상처액의 이송을 위해 상처액은 종래의 장치에 의해 종래의 진공 요법 과정에 의해 배수된다 (배수부).

이 처리에 의해 상처 표면적의 감소, 상처 가장자리의 수축, 육아 조직 형성의 강화 및 상처 치유의 촉진을 달성할 수 있다.

Claims (15)

1. 가교 콜라겐 매트릭스의 제조 방법으로서,
   a) 수용성 콜라겐 서스펜션을 제조,
   b) 단계 a)로부터의 콜라겐 서스펜션의 pH 값을 pH < 4로 조정,
   c) 선택적으로 추가의 구조 형성제, 유효 성분 및/또는 보조 성분을 부가,
   d) 에폭시 관능성 가교제의 부가, 단계 c)와 d)의 순서는 변경 가능,
   e) 단계 d)에서 얻어진 콜라겐 혼합물을 동결,
   f) 동결 건조 온도 < 100℃에서 단계 e)로부터의 동결 혼합물을 동결 건조,
   g) 최종 제품에 대한 25wt%까지의 수분 함량을 얻을 수 있도록 동결 건조 가교 콜라겐 재료를 선택적으로 조정,
   h) 단계 g)로부터 얻어진 재료의 원하는 형태로의 선택적 변환, 소독 및/또는 처리의 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 a)로부터의 콜라겐 서스펜션은 섬유소 및 원섬유 형태의 천연의 산 불가용성 콜라겐을 포함하는 것인 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 콜라겐 서스펜션은 산 가용성 콜라겐과 펩타이드 구성 성분을 포함하고, 및/또는 단계 c)에서 구조형성제, 또는 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분으로부터의 유효 성분이 부가되는 것인 제조 방법.
4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 에폭시 관능성 가교제는 특히 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDGE)와 같은 디에폭시드로부터 선택되는 것인 제조 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 에폭시 관능성 가교제는 단계 a)로부터의 콜라겐 서스펜션의 건조 질량에 대해 50wt%를 넘지 않는 양으로 부가되는 것인 제조 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 e)에 의한 동결은 단계 d)로부터의 콜라겐 혼합물 제조의 24시간 이내에 수행되는 것인 제조 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 얻어지는 가교 콜라겐 매트릭스.
8. 사용 시에 방출가능하며, BCA 방법에 의해 검출될 수 있고, 바람직하게는 BCA 방법에 의해 측정되는, 동결 건조 콜라겐 매트릭스에 대해 적어도 총량 0.1%의 가교되지 않은 산 가용성 콜라겐 및/또는 펩타이드 구성 성분 및/또는 구조 형성제 또는 매트릭스 프로테인, 세포외 매트릭스 구성 성분, 프로테인 형성성 유효 성분 및 가용성 프로테인 또는 펩타이드 구성 성분의 군으로부터의 유효 성분을 함유하는 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스.
9. 제7항 또는 제8항에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 얻어지는 콜라겐 매트릭스로서, DIN EN ISO 3376에 의해 측정되는 > 50　cN/mm 층 두께의 인열 강도 또는 UV8801 방법에 의해 측정되는 >　200 cN/mm 층두께의 인열 강도를 갖는 것인 콜라겐 매트릭스.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 얻어지는 콜라겐 매트릭스로서, 적어도 하나의 추가적인 구조 형성제, 적어도 하나의 화장품 유효 성분 또는 약학적 유효 성분 및/또는 적어도 하나의 보조 성분을 함유하는 것인 콜라겐 매트릭스.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 얻어지는 콜라겐 매트릭스로서, 전체적으로 또는 부분적으로 섬유, 부직포, 네트, 필름 또는 호일 또는 자가부착층으로부터 선택되는 추가의 층을 선택적으로 더 구비할 수 있는층상 드레싱, 시트, 패드 또는 마스크의 형태이며, 상기 추가의 층은, 가장자리에서 마감되거나 또는 전체적으로 또는 부분적으로 가장자리에서 콜라겐 재료 밖으로 돌출되는 방식으로 층상 콜라겐 재료에 적용되는 것인 콜라겐 매트릭스.
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 얻어지는 콜라겐 매트릭스로서, 피부 치료용, 피부병 치료용, 상처 치료용 또는 지혈용의 더멀 및 트랜스더멀 유효 성분의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효 성분을 함유하며, 특히 상기 유효 성분은 매트릭스 프로테인, 특히 엘라스틴 및/또는 생장 인자와 같은 가용성 펩타이드 구성 성분, 특히 은 함유 유효 성분으로서 특히 은 질산염과 같은 항박테리아성 상처치료제 및/또는 특히 트리글리세리드 또는 중성 오일과 같은 화장품 오일 및 지방의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 보조 성분을 함유하는 것인 콜라겐 매트릭스.
13. 제7항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법으로 얻어지는 콜라겐 매트릭스로서, 약학 제제로서의 용도, 특히 급성 및/또는 만성 상처치료용 제제로서의 용도, 임플란트로서, 더멀 또는 트랜스더멀 피부치료제로서, 지혈제 및/또는 진공 보조 상처 치료 요법에서의 용도인 것인 콜라겐 매트릭스.
14. 제7항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 의한 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법으로 얻어지는 콜라겐 매트릭스의 용도로서, 화장품 제제, 화장품용 드레싱 또는 마스크 또는 세포군용 스캐폴드로서의 용도.
15. 제7항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 적어도 하나의 동결 건조 에폭시 가교 콜라겐 매트릭스 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 얻어지는 콜라겐 매트릭스를 함유하는 조합 제제로서, 상기 제제는 하나 이상의 유효 성분 및/또는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분을 함유하는 적어도 하나의 수용액을, 세트로서의 공간 배열 (spatial arrangement) 또는 부분품 키트 제제와 관련하여 함유하는 것인 조합 제제.

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