CN110218342A - 琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种琼脂糖‑明胶接枝物温敏水凝胶及其制备方法与应用。本发明利用可溶性N,N‑羰基二咪唑将降解琼脂糖的羟基活化,然后再与明胶上的氨基反应形成酰胺键,利用明胶在37℃下可溶的特性将未反应的明胶去除,利用明胶改善琼脂糖的生物活性和降解性能,同时采用琼脂糖赋予明胶体温(37℃)下成胶的特性,且降低了材料的免疫原性,得到的琼脂糖‑明胶接枝物温敏水凝胶可将细胞包埋并为细胞提供适合生长环境的三维水凝胶支架,同时也可作为控释系统将基因蛋白药物负载其中,用于组织修复或疾病诊疗。本发明的琼脂糖‑明胶接枝物温敏水凝胶制备方法简单,无需交联剂,制备得到的温敏水凝胶具有免疫原性低,易降解,生物活性好。
Description
技术领域
本发明涉及于医用技术领域,特别涉及一种琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
水凝胶操作方便,能为组织修复携带细胞、生长因子等功能组分。水凝胶具有以下优点:一、提供类似于软组织的高度水合环境,在植入后,其柔韧的特性可减少周围组织的摩擦或机械刺激;二、具有孔互连的半透膜,允许物质的运输,包括为负载的细胞提供营养物和运输代谢废物;三、可以保护包裹的细胞免受宿主免疫系统的免疫攻击;四、可以很容易地进行功能化或携带功能组分,以增强细胞-材料的相互作用,通过促进细胞活力或特异性地将细胞分化来加强细胞的治疗功效(Choe G,Park J,Park H,et al.HydrogelBiomaterials for Stem Cell Microencapsulation[J].Polymers,2018,10(9).)。
琼脂糖是由1,4-连接的3,6-脱水-1-半乳糖和1,3-连接的-D-半乳糖组成的衍生物。琼脂糖水凝胶是一种可逆的凝胶,可在冷却或加热时固化或液化,因此,不需要特殊的离子或添加剂来引起凝胶化。琼脂糖常用于生物医学研究,特别是在分子生物学中,因为它价格低廉且无免疫原性,具有优异的凝胶特性,在体外3D培养研究中,已经证明水凝胶具有维持细胞表型的作用。然而,纯琼脂糖凝胶的缺点是它们具有极低的细胞黏附能力和难降解的特点(Shin S,Ikram M,Subhan F,et al.Alginate/marine collagen/agarosecomposite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation[J].RSC Advances,2016,6(52):46952-46965.),因此,常使用具有生物活性或加快其降解的材料将其改性。
明胶是胶原蛋白不可逆水解得到的产物,具有良好的生物相容性,生物降解性等,目前在生物材料领域应用非常广泛。明胶在生理温度(37℃)下溶解为溶液,当温度降低(<29℃)时形成凝胶,因此,经常将明胶改性以确保其在体温下处于稳定的凝胶状态。使用化学交联剂如戊二醛对明胶进行交联,所得水凝胶虽然有很好的稳定性,但交联剂的毒性会对细胞或所负载的生物活性物质造成不利影响(王杨.明胶接枝改性及其复合水凝胶支架的研究[D].北京化工大学,2014)。目前也有一些产品使用明胶和一些具有成胶性能的材料共混,但不能克服明胶在37℃大量损失以及混合均匀度欠缺的问题。将明胶甲基丙烯酸酯(GelMA)水凝胶暴露于UV光使其链间形成共价交联来获得稳定的结构是最常用的方法。但也有研究称使用UV光固化交联负载细胞的水凝胶的关键问题是UV或UV诱导的自由基对细胞和DNA的损害(Mellati A,Fan C M,Tamayol A,et al.Microengineered 3D cell-ladenthermoresponsive hydrogels for mimicking cell morphology and orientation incartilage tissue engineering.[J].Biotechnology&Bioengineering,2017,114(1):217-231.)。使用物理交联法制备含明胶的水凝胶可以避免化学交联剂的使用,更加受到青睐。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶。
本发明的再一目的在于提供上述琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)将明胶加入二甲基亚砜(DMSO)中,加热条件下搅拌溶解,得到明胶溶液,冷却,备用;
(2)将琼脂糖加入二甲基亚砜中,加热条件下搅拌溶解,得到琼脂糖溶液,冷却,备用;
(3)将N,N羰基二咪唑(CDI)加入步骤(2)得到的琼脂糖溶液中,活化,得到活化琼脂糖溶液;
(4)将步骤(1)得到的明胶溶液与步骤(3)得到的活化琼脂糖溶液混合,搅拌反应,得到琼脂糖-明胶接枝物溶液;
(5)将步骤(4)得到的琼脂糖-明胶接枝物溶液透析,冻干,溶解,注入矿物油中制成胶珠,除去未反应的明胶,即得琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶。
步骤(1)中所述的明胶的分子量为10~100kDa;优选为50kDa。
步骤(1)中所述的加热的温度为50℃~70℃;优选为60℃。
步骤(1)中所述的明胶溶液的浓度为质量体积比2~8%;优选为质量体积比4%。
步骤(1)和(2)中所述的二甲基亚砜为除水的二甲基亚砜。
步骤(2)中所述的琼脂糖的分子量为10~100kDa;优选为50kDa。
步骤(2)中所述的加热的温度为70℃~90℃;优选为80℃。
步骤(2)中所述的琼脂糖溶液的浓度为质量体积比1~4%;优选为质量体积比2%。
步骤(3)中所述的N,N羰基二咪唑在琼脂糖溶液中的浓度为质量体积比0.5~5%;优选为质量体积比5%。
步骤(3)中所述的琼脂糖和N,N羰基二咪唑按质量比1:3~4:1配比计算;优选为按质量比1:2.5配比计算。
步骤(3)中所述的活化的温度为15~30℃;优选为25℃。
步骤(3)中所述的活化的时间为0.5~2h;优选为1h。
步骤(4)中所述的明胶溶液和活化琼脂糖溶液中,琼脂糖和明胶按质量比1:1~1:3配比计算;优选为按质量比1:2配比计算。
步骤(4)中所述的反应的温度为25~75℃;优选为55℃。
步骤(4)中所述的反应的时间为3~7h;优选为5h。
步骤(4)中所述的反应结束后采用去离子水终止反应。
步骤(1)、(2)和(4)中温度提高的方法均为使用油浴,反应体系中避免水的干扰。
步骤(5)中所述的透析是采用透析袋在双蒸水中透析2~5天,每天换水3次,以除去多余的小分子。
所述的透析袋为截留2~5kDa分子量的透析袋。
步骤(5)中所述的溶解的温度为80℃。
步骤(5)中所述的溶解是采用去离子水溶解,溶解后其中琼脂糖-明胶接枝物的浓度为质量体积比0.5~3%;优选为质量体积比2%。
步骤(5)中所述的胶珠的直径为0.5~4mm;优选为2~3mm。
步骤(5)中所述的除去未反应的明胶的方法是将胶珠放入去离子水中搅拌,37℃下搅拌2~5天,每天换水。
一种琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶,通过上述制备方法制备得到。
上述琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶在制备药物载体或组织工程支架中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.本发明利用可溶性N,N-羰基二咪唑将降解琼脂糖的羟基活化,然后再与明胶上的氨基反应形成酰胺键,利用明胶在37℃下可溶的特性将未反应的明胶去除。本发明利用明胶改善了琼脂糖的生物活性和降解性能,同时采用琼脂糖赋予明胶体温(37℃)下成胶的特性,且降低了材料的免疫原性。
2.本发明的琼脂糖-明胶接枝物水凝胶制备方法简单,无需交联剂,制备得到的温敏水凝胶具有免疫原性低,易降解,生物活性好。
3.本发明的琼脂糖-明胶接枝物水凝胶可将细胞包埋并为细胞提供适合生长环境的三维水凝胶支架,同时也可作为控释系统将基因蛋白药物负载其中,用于组织修复或疾病诊疗。
附图说明
图1是琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的合成路线图。
图2是琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的温敏特性示意图;其中,图A是40℃时琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的状态图;图B是37℃时琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的状态图。
图3是成纤维细胞L929加入琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶中3周时的染色图;其中,图A是对照组琼脂糖中培养的成纤维细胞L929染色图;图B、C和D分别是接枝率为12.7%、40.31%和86.32%的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶中培养的成纤维细胞L929染色图。
图4是琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶培养成纤维细胞L929后的细胞外基质沉积情况照片图;其中,图A是对照组琼脂糖培养后的细胞外基质沉积情况照片图;图B、C和D分别是接枝率为12.7%、40.31%、86.32%的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶培养后的细胞外基质沉积情况照片图。
图5是负载成纤维细胞L929的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶在体内5周时降解情况的H&E染色图;其中,图A是对照组琼脂糖的H&E染色图;图B、C和D分别是接枝率为12.7%、40.31%和86.32%的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的H&E染色图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施方式和实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。成纤维细胞L929购买自赛业生物科技有限公司。
实施例1
(1)制备明胶溶液:将1.2g分子量为60kDa的明胶加入30mL已除水的二甲基亚砜(DMSO)中,在60℃、油浴条件下搅拌溶解,得到明胶溶液,冷却,备用。
(2)制备琼脂糖溶液:将0.6g分子量为50kDa的琼脂糖加入30mL已除水的DMSO中,在80℃油浴条件下搅拌溶解,得到琼脂糖溶液,冷却,备用。
(3)琼脂糖活化:往步骤(2)的琼脂糖溶液中加入1.5g N,N羰基二咪唑(CDI),使CDI浓度为质量体积比5%,25℃活化1h,得到活化的琼脂糖溶液。
(4)琼脂糖接枝明胶:将步骤(1)的明胶溶液与步骤(3)活化的琼脂糖溶液混合,使之在55℃油浴条件下反应5h,加去离子水终止反应,得到琼脂糖-明胶接枝物溶液。
(5)琼脂糖-明胶接枝物的纯化和水凝胶的制备:将步骤(4)得到琼脂糖-明胶接枝物溶液放入透析袋(MW3000,MYM生物科技有限公司)透析3天,每天换水3次以去除多余的DMSO、咪唑等小分子,透析结束后冻干。将冻干后的产物在80℃使用去离子水溶解(浓度为质量体积比2%),注射入冷的矿物油,制成直径2~3mm的胶珠,将该胶珠放入干净的烧杯中,加去离子水,在37℃下搅拌3天,每天换水以去除未反应的明胶,冻干,即可得到琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶。
保持其他条件不变,上述步骤(3)中琼脂糖溶液中分别加入0.6g和0.15g CDI,使CDI的浓度为质量体积比2%和0.5%,得到的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶接枝率不同,如表1所示。
表1
表1的结果表明,同样的反应条件下,不同浓度的CDI制备得到的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶接枝率差异很大。
实施例2皮肤组织工程支架
(1)100℃下使用PBS(0.01M、pH7.4)溶解实施例1制备的3种接枝率分别为12.7%、40.31%和86.32%的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶,使其浓度均为质量体积比3%,灭菌后放入保温杯里保温。将生长状况良好的成纤维细胞L929消化后配制成细胞浓度为2.4×107个/mL的细胞悬液,取50μL细胞悬液放入8×8×2mm的硅胶模具中,将保温的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶溶液分别冷却到40℃并取100μL加入硅胶模具中,迅速搅拌,待其冷却成胶后取出,放入24孔板中,加入1mL DMEM完全培养基培养,同时设置成纤维细胞L929加入到分子量为50kDa的琼脂糖凝胶中的对照组。培养到21天时,琼脂糖-明胶物接枝温敏水凝胶内成纤维细胞L929明显成活率更高,接枝率为86.32%的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶内成纤维细胞L929成活率可达到93.22%(图3)。将水凝胶制成切片,用阿尔新蓝染色后可见大量细胞外基质沉积(图4),且接枝率越高细胞外基质沉积越明显。以上结果说明琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶显著提升了成纤维细胞的存活率和增殖效率。
(2)将步骤(1)中负载成纤维细胞L929的琼脂糖-明胶接枝物水凝胶植入大鼠皮下降解,以负载成纤维细胞L929的琼脂糖水凝胶作为对照组,5周后连同上皮一起取出,制成切片并使用H&E染色观察水凝胶的降解情况。发现水凝胶的降解效果随着接枝率的提高而加强,86.32%的琼脂糖-明胶水凝胶中长入了大量组织和血管(图5)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将明胶加入二甲基亚砜中,加热条件下搅拌溶解,得到明胶溶液,冷却,备用;
(2)将琼脂糖加入二甲基亚砜中,加热条件下搅拌溶解,得到琼脂糖溶液,冷却,备用;
(3)将N,N羰基二咪唑加入步骤(2)得到的琼脂糖溶液中,活化,得到活化琼脂糖溶液;
(4)将步骤(1)得到的明胶溶液与步骤(3)得到的活化琼脂糖溶液混合,搅拌反应,得到琼脂糖-明胶接枝物溶液;
(5)将步骤(4)得到的琼脂糖-明胶接枝物溶液透析,冻干,溶解,注入矿物油中制成胶珠,除去未反应的明胶,即得琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶。
2.根据权利要求1所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的明胶的分子量为10~100kDa;
步骤(2)中所述的琼脂糖的分子量为10~100kDa;
步骤(3)中所述的琼脂糖和N,N羰基二咪唑按质量比1:3~4:1配比计算;
步骤(4)中所述的明胶溶液和活化琼脂糖溶液中,琼脂糖和明胶按质量比1:1~1:3配比计算;
步骤(5)中所述的胶珠的直径为0.5~4mm。
3.根据权利要求2所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的明胶的分子量为50kDa;
步骤(2)中所述的琼脂糖的分子量为50kDa;
步骤(3)中所述的琼脂糖和N,N羰基二咪唑按质量比1:2.5配比计算;
步骤(4)中所述的明胶溶液和活化琼脂糖溶液中,琼脂糖和明胶按质量比1:2配比计算;
步骤(5)中所述的胶珠的直径为2~3mm。
4.根据权利要求1所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的明胶溶液的浓度为质量体积比2~8%;
步骤(2)中所述的琼脂糖溶液的浓度为质量体积比1~4%;
步骤(3)中所述的N,N羰基二咪唑在所述的琼脂糖溶液中的浓度为质量体积比0.5~5%;
步骤(5)中所述的溶解是采用去离子水溶解,溶解后其中琼脂糖-明胶接枝物的浓度为质量体积比0.5~3%。
5.根据权利要求4所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的明胶溶液的浓度为质量体积比4%;
步骤(2)中所述的琼脂糖溶液的浓度为质量体积比2%;
步骤(3)中所述的N,N羰基二咪唑在琼脂糖溶液中的浓度为质量体积比5%;
步骤(5)中所述的溶解是采用去离子水溶解,溶解后其中琼脂糖-明胶接枝物的浓度为质量体积比2%。
6.根据权利要求1所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的加热的温度为50℃~70℃;
步骤(2)中所述的加热的温度为70℃~90℃;
步骤(3)中所述的活化的温度为15~30℃;
步骤(3)中所述的活化的时间为0.5~2h;
步骤(4)中所述的反应的温度为25~75℃;
步骤(4)中所述的反应的时间为3~7h;
步骤(4)中所述的反应结束后采用去离子水终止反应;
步骤(5)中所述的溶解的温度为80℃;
步骤(5)中所述的透析是采用透析袋在双蒸水中透析2~5天,每天换水3次,以除去多余的小分子;
步骤(5)中所述的除去未反应的明胶的方法是将胶珠放入去离子水中搅拌,37℃下搅拌2~5天,每天换水。
7.根据权利要求6所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的加热的温度为60℃;
步骤(2)中所述的加热的温度为80℃;
步骤(3)中所述的活化的温度为25℃;
步骤(3)中所述的活化的时间为1h;
步骤(4)中所述的反应的温度为55℃;
步骤(4)中所述的反应的时间为5h;
所述的透析袋为截留2~5kDa分子量的透析袋。
8.根据权利要求1所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)和(2)中所述的二甲基亚砜为除水的二甲基亚砜;
步骤(1)、(2)和(4)中温度提高的方法均为使用油浴,反应体系中避免水的干扰。
9.一种琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶,其特征在于:通过权利要求1~8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶在制备药物载体或组织工程支架中的应用。
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