WO2011094965A1

WO2011094965A1 - 一种制备组织工程角膜的方法

Info

Publication number: WO2011094965A1
Application number: PCT/CN2010/071124
Authority: WO
Inventors: 王爱军
Original assignee: 陕西瑞盛生物科技有限公司
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2011-08-11
Also published as: CN101757690A; CN101757690B

Description

一种制备组织工程角膜的方法技术领域

本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程角膜的制备方法。

背景技术

眼球的解剖特点决定了眼球位置暴露、组织结构脆弱，很小的外力或异物均可造成严重的损害，此外，一些角膜疾病包括感染性角膜病、角膜变性、营养不良和免疫性角膜病等，均可导致角膜损伤。而一旦损伤，将严重影响视觉、或导致失明。角膜病损是仅次于白内障的第二大致盲性眼病，并以每年 150万〜 200万病例的速度递增。而角膜移植术是治疗角膜病损最有效的手段，传统角膜移植的供体主要来自尸体和捐献。目前，我国约有 400万角膜盲患者，许多是可以通过角膜移植治疗复明，但由于供体的角膜来源非常有限，限制了角膜修复手术的开展。组织工程技术的兴起为各种可导致失明的角膜疾病治疗带来了希望。组织工程角膜是应用细胞生物学和组织工程学原理构建种子细胞与生物材料的复合体，移植后具有改善病损角膜组织形态、结构和功能的作用。但其中起关键作用的种子细胞的来源问题目前尚未解决，而获取自体角膜细胞将不可避免地破坏健康眼，寻找其他来源的种子细胞就成为解决问题的关键。

研究表明，成体干细胞存在于许多成体组织器官中，具有多向分化及横向分化的能力，对组织的修复和内环境的稳定具有重要作用。羊膜位于胚胎胎膜的最内层，由单层的上皮细胞、及其下面的基底膜和含有基质细胞的海绵层组成，其中包含大量的干细胞。从胚胎发育的角度看，羊膜细胞来源于不同胚层: 人羊膜上皮细胞（ hAECs)来源于受精后第八天的胚胎外胚层，人羊膜基质细胞 (hAMCs)来源于原条的胚外中胚层。研究证明，来源于羊膜组织的细胞表达干细胞标志物，包括 Oct24、 GATA22, GATA24、 Pax26、 TRA21260, SSEA23、 SSEA24、 STAT23、 Rex2、神经细胞粘附分子、巢蛋白、骨形态蛋白 2/4、肝细胞核因子 24α、波形蛋白、 CK218、 Sox22、归巢细胞粘附分子 21、 Brachyury和 Notch21等，并能够分化成为多种成熟细胞，如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞和血管内皮细胞。而且羊膜干细胞具有非常强的扩增能力，体外培养 21d后传至第 3代的 hAMCs数量扩增约 300 倍。 hAMCs中 Oct24 转录产物表达水平高于骨髓基质细胞，其编码蛋白 Oct24 是维持干细胞更新能力和胚胎干细胞未分化状态的调节蛋白。这些研究提示，人羊膜组织含有的细胞有望成为再生医学领域的可靠细胞来源。

目前的组织工程角膜主要采用去除细胞成分的羊膜作为载体，在其表面接种角膜缘干细胞来构建，其缺点主要是角膜缘干细胞来源受限，去除细胞成分的羊膜不能发挥其中羊膜干细胞的作用；同时羊膜结构非常薄，没有强度，不能修复角膜缺损，使其临床应用效果不佳。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种制备组织工程角膜的方法，所采用的种子细胞具有来源广泛，增殖、分化能力强的优点；所制备的角膜无明显免疫排斥反应，又具有天然角膜的结构和成分，能促进羊膜细胞的生长、增殖和分化，可用于修复角膜缺损，加速角膜透明。

本发明组织工程角膜的制备方法，其特征在于：是采用羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞作为种子细胞，经体外扩增培养后将其种植在脱细胞天然角膜基质的两面，再经体外诱导培养形成组织工程角膜；所述的羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞来自人羊膜，经分离、扩增和体外诱导分化，使羊膜上皮细胞转化为角膜上皮细胞，羊膜基质细胞转化为角膜基质细胞；所述的脱细胞天然角膜基质来自动物角膜，经削切、脱细胞、脱水处理后所形成的板层角膜支架；所述的体外诱导培养是采用诱导培养液诱导羊膜细胞分化培养的过程。

本发明所制备的组织工程角膜采用人羊膜细胞为种子细胞，具有来源广泛、增殖和分化能力强的优点；作为支架的脱细胞异种角膜基质去除抗原成分后，显著降低了免疫排斥反应，又具有天然角膜的结构和成分，能促进羊膜干细胞的生长、增殖和分化，用于充填角膜缺损，能够迅速与机体整合实现透明；最终所形成的组织工程角膜能够修复角膜缺损。

本发明组织工程角膜的制备方法，具体步骤包括：

步骤一、制备角膜支架：取动物角膜剥离去掉角膜周围组织，磷酸盐缓冲液（PBS溶液）清洗后置于 -80°C中冷冻至少 30分钟，于室温下解冻，如此反复冻融 2〜5次，使细胞完全破裂崩解；在 4°C纯水中浸泡至溶胀后削切至所需厚度；再将其置于蛋白酶溶液中消化，用纯水漂洗干净；将其置入 0.1〜1M的 NaOH溶液中浸泡 8分钟以上，以达到溶解细胞、灭活病毒的目的，用 PBS溶液漂洗至 pH中性；再将其置入含有 DNA酶和 -半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡 25分钟以上，去除残留的 DNA和 -半乳糖基抗原成分，降低免疫原性，用 PBS溶液漂洗；为使种植细胞更容易贴附，经脱水干燥后再使用含牛血清、或胶原蛋白、或多聚赖氨酸、或精氨酸 -甘氨酸-天冬氨酸 (RGD多肽)的任一种溶液浸泡 20分钟以上，再经脱水干燥后消毒，得到角膜支架；

步骤二、羊膜细胞的培养：取新鲜人羊膜，分离培养羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞，其分离和培养方法采用已有技术完成（人羊膜上皮细胞原代培养及肝细胞特异性蛋白的表达，上海交通大学学报 (医学版)， 2009 (03 )： 303〜304)_; 步骤三、配制诱导培养液，其组成是在商用 EpiLife培养液中添加有，碱性成纤维细胞生长因子 2〜20ng/ml、表皮细胞生长因子 2〜20 ng/m 转化生长因子 -1 2〜30ng/ml、胰岛素 2〜40ng/ml、氢化可的松 50〜400 ng/ml、腺嘌呤 20〜4(^g/ml、转铁蛋白 l〜l(^g/ml、前列腺素 -E2 0.5〜8ng/ml、胰岛素样生长因子 -1 2〜10 ng/ml;

步骤四、制备组织工程角膜：在 4°C条件下，按质量比将胶原 7〜10份：透明质酸 2〜3份：硫酸软骨素 0.5〜1份混合，用 0.1〜0.5M的醋酸溶液将其配制成浓度为 2〜10mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射后，按其体积加入 10% 的胎牛血清，再加入终浓度为 10mg/ml的 DMEM培养基，调 pH至 7.2〜7.4，制成凝胶溶液；再将所制备角膜支架的基质面（角膜的削切面）浸透凝胶溶液，置于 37°C环境下预固化；将体外培养的羊膜基质细胞混合于凝胶溶液中，按 10⁵〜10⁶个 /cm²的细胞密度滴加到预固化的角膜支架上，静置固化后翻转角膜支架，将体外培养的羊膜上皮细胞按 10⁴〜10⁵个 /cm²的细胞密度滴加到角膜支架另一面，静置 2〜3小时后，置于培养器皿内的培养支架上，采用诱导培养液连续培养 6〜10天，培养期间每天换液，组织工程角膜培养完成；上述的培养条件均为 37°C、 5%C0₂环境。

本发明所制备的组织工程角膜，采用脱细胞天然角膜为支架，利用人羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞作为种子细胞，既克服了异种角膜基质免疫排斥大的难题，又保留了其天然角膜的结构（能够恢复角膜的透明度）和主要成分（包括能促进角膜细胞生长、增殖和分化的生长因子)；采用这种较为理想的支架，复合具有多向分化能力的羊膜细胞，在体外进行诱导、培养，得到与天然角膜相似的含有活细胞的组织工程角膜，其免疫原性极低。与现有技术产品相比，本发明的制备方法具有成本低、操作简便、来源广泛和易于贮存的优点；所制备的组织工程角膜具有一定的弹性和韧性，形状大小和厚度易于改变；具有与正常角膜相似的生理特性，避免了非角膜材料植入后的并发症，植入体内可逐渐被受体细胞所改建，最终完全透明，可用于修复各种原因导致的角膜损伤。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。

步骤一、制备角膜支架：获取猪角膜组织，剥离去掉角膜周围组织， PBS 溶液清洗后置于 -80°C中冷冻 1小时，取出后在室温下解冻，如此反复冻融 3次，使细胞完全破裂崩解；在 4°C纯水中浸泡 1天，使其溶胀后削切 1/2厚度；再将其置于 0.2 % (w/v)蛋白酶溶液中消化 2小时，纯水漂洗 3〜5次；将其置入 0.5M 的 NaOH溶液中浸泡 2分钟，以达到溶解细胞、灭活病毒的目的，用 PBS溶液漂洗至 plH生；置入含有 40U/ml DNA酶和 30U/ml -半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡 3分钟，去除残留的 DNA和 -半乳糖基抗原成分，降低免疫原性，用 PBS 溶液漂洗；经脱水干燥后使用 10%(v/v)的多聚赖氨酸溶液浸泡 30分钟，再经脱水干燥后采用 ^6QCo辐射消毒，得到角膜支架；

步骤二、羊膜细胞的培养：可采用已有技术实现，也可按以下方案实现；无菌条件下，将获取的人羊膜用 Dhank's液冲洗清除残留血迹，剪成碎片，用含 0.02%EDTA 的 0.05%胰蛋白酶溶液消化 5分钟，收集上清液离心，将获取的细胞以 1.25x l0⁵/mL 的密度接种于培养板，此为羊膜上皮细胞；另将剩余的组织碎片，加入含有 0.075 mg/mL DNaseI的 0.75 mg/mL 的胶原酶溶液，于 37°C、 200 r/min旋转消化至组织完全消化，用 300 目钢网过滤，收集细胞滤液，在 1500 r/min离心 lOmin; 将沉淀细胞重悬于 LG-DMEM 培养基（内含 10% FBS, 2 mmol/L L-谷氨酰胺， 1 必需氨基酸（GIBCO) , 5^mol/L 2 -巯基乙醇， 1 mmol/L丙酮酸钠， 100 U/mL青霉素和 100 mg/mL链霉素）中，以 1·25χ 10⁵个 /mL 的细胞密度接种于培养板，此为羊膜基质细胞；将所获取的羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞分别置于 3t 、 5%C0₂、饱和湿度的条件下培养，每 3天更换培养基；当细胞汇合度达 8^ 90%后，用 0.25%的胰蛋白酶溶液消化、传代。步骤三、诱导培养液的配制：在商用 EpiLife培养液（美国 invitrigen公司生产）中添加碱性成纤维细胞生长因子 2ng/ml、表皮细胞生长因子 4ng/ml、转化生长因子 -1 10ng/ml、胰岛素 15 ng/ml、氢化可的松 200 ng/ml、腺嘌呤 25 g/ml、转铁蛋白 lO g/ml、前列腺素 -E2 4ng/ml、胰岛素样生长因子 -1 2.5ng/ml_;

步骤四、制备组织工程角膜：先在 4°C条件下，按质量比将胶原 8份、透明质酸 2份、硫酸软骨素 1份混合，用 0.2M 的醋酸溶液将其配制成浓度为 4mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射后，按其体积加入 10% 的胎牛血清，再加入 DMEM培养基使其终浓度达到 10mg/ml，调 pH至 7.2，制成凝胶溶液；再将制备的角膜支架的基质面（角膜的削切面）浸透凝胶溶液，于 37°C环境下预固化；将体外培养的羊膜基质细胞混合于凝胶溶液中，再按 3χ10⁵个 /cm²的细胞密度滴加到预固化后的角膜支架上，于 5 %C0₂环境中 37°C条件下固化；固化后翻转角膜支架，将体外培养的羊膜上皮细胞按 10⁵个 /cm²的密度滴加到角膜支架的另一面，静置 2小时后，置入培养器皿内的培养支架上，采用诱导培养液连续培养 8天，培养期间每天换液，组织工程角膜培养完成；上述的培养条件均为 37°C、 5 %C0₂环境。

将所制备的组织工程角膜用于人体移植手术，其方法和术后护理与常规板层角膜的移植手术相同；结果显示，术后 3个月，大体观察角膜清晰度良好，组织学结构基本恢复正常，其角膜上皮和基质层的组织学结构与正常角膜基本一致。

Claims

权利要求书

1、一种制备组织工程角膜的方法，包括有羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞的获得，其特征在于：是采用羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞作为种子细胞，经体外扩增培养后将其种植在脱细胞天然角膜基质的两面，再经体外诱导培养形成组织工程角膜；所述的羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞来自人羊膜，经分离、扩增和体外诱导分化，使羊膜上皮细胞转化为角膜上皮细胞，羊膜基质细胞转化为角膜基质细胞；所述的脱细胞天然角膜基质来自动物角膜，经削切、脱细胞、脱水处理后所形成的板层角膜支架；所述的体外诱导培养是采用诱导培养液诱导羊膜细胞分化培养的过程。

2、根据权利要求 1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：步骤一、制备角膜支架：取动物角膜剥离去掉角膜周围组织， PBS溶液清洗后置于 -80°C中冷冻至少 30分钟，于室温下解冻，如此反复冻融 2〜5次；再于 4°C纯水中浸泡至溶胀后削切至所需厚度；将其置于蛋白酶溶液中消化，用纯水漂洗干净；再置入 0.1〜1M的 NaOH溶液中浸泡 8分钟以上，用 PBS溶液漂洗至 pH中性；将其置入含有 DNA酶和 -半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡 25分钟以上，用 PBS溶液漂洗；经脱水干燥后，使用含牛血清、或胶原蛋白、或多聚赖氨酸、或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的任一种溶液浸泡 20分钟以上，再经脱水干燥后消毒，得到角膜支架；

步骤二、羊膜细胞的培养：取新鲜人羊膜，分离培养获得羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞；

步骤三、配制诱导培养液：其组成是在商用 EpiLife培养液中添加有，碱性成纤维细胞生长因子 2〜20 ng/ml、表皮细胞生长因子 2〜20 ng/ml、转化生长因子 -1 2〜30 ng/ml、胰岛素 2〜40 ng/ml、氢化可的松 50〜400 ng/ml、腺嘌呤 2 4(^g/ml、转铁蛋白 l〜l(^g/ml、前列腺素 -E2 0.5〜8ng/ml、胰岛素样生长因子 -1 2〜10 ng/ml;

步骤四、制备组织工程角膜：在 4°C条件下，按质量比将胶原 7〜10份：透明质酸 2〜3份：硫酸软骨素 0.5〜1份混合，用 0.1〜0.5M的醋酸溶液将其配制成浓度为 2〜10mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射后，按其体积加入 10% 的胎牛血清，再加入终浓度为 10mg/ml的 DMEM培养基，调 pH至 7.2〜7.4，制成凝胶溶液；再将所制备角膜支架的基质面浸透凝胶溶液，置于 37°C环境下预固化；将体外培养的羊膜基质细胞混合于凝胶溶液中，按 10⁵〜10⁶个 /cm² 的细胞密度滴加到预固化的角膜支架上，静置固化后翻转角膜支架，将体外培养的羊膜上皮细胞按 10⁴〜10⁵个 /cm²的细胞密度滴加到角膜支架另一面，静置 2〜 3小时后，置于培养器皿内的培养支架上，采用诱导培养液连续培养 6〜10天，培养期间每天换液，组织工程角膜培养完成。