CN104862282A - 一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，以解决角膜上皮替代物稀缺的问题。本发明采用一种转录因子基因--paired box 6基因，将其转染进入大鼠脂肪间充质干细胞，诱导细胞转分化为角膜上皮样细胞，方法清晰、简便，鉴定结果证实可靠；用本发明方法获得的角膜上皮样细胞，能够用于修复角膜上皮的损伤，并形成完整的复层角膜上皮（鉴定试验已经证实），作为一种干细胞治疗药物，具有潜在的临床应用前景；此角膜上皮样细胞，用于构建组织工程角膜上皮，具有较大的市场应用前景。

Description

一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法

技术领域

 本发明涉及一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法。

背景技术

国家统计局第二次全国残疾人调查显示，中国因角膜病致盲患者约有400万人，并以每年约10％的比例增加。受限于角膜供体的紧缺，大量角膜盲患者得不到及时的治疗。研制组织工程角膜是科研人员及企业的迫切责任和任务，无论是社会效益还是经济效益都是巨大的，甚至不可估量。

组织工程角膜上皮来源的问题，是构建组织工程角膜的关键技术难点之一。建立一种安全高效的角膜上皮样细胞制造方法，将为组织工程角膜的研制与生产提供坚实基础。

使用脂肪间充质干细胞作为组织工程角膜上皮的种子细胞，具有较好的临床应用优势。脂肪间充质干细胞的安全性逐渐得到认可，它具备易于取材和培养的优势，具有多向分化潜能，更易形成商品化的临床产品。

本项目诱导间充质干细胞分化为上皮细胞，这种间质-上皮转变，使细胞趋向于成熟分化，更加稳定，提高了应用安全性，临床应用前景较佳。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，用于构建角膜上皮。

本发明通过下述技术方案实现：

一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，是将一种转录因子基因--paired box 6（Pax6）基因，通过脂质体介导，转染导入到大鼠脂肪间充质干细胞，此基因在细胞内表达，诱导细胞转分化，经过31天左右的时间，形成角膜上皮样细胞。期间，通过G418筛选的方法，挑选Pax6阳性表达的细胞，去除Pax6没有成功转染导入的细胞。

进一步地，具体包括以下步骤：

（1）采用载体PCDNA3.1(+)，构建paired box 6质粒，其中，paired box 6基因的ORF序列为：

ATGCAGAACAGTCACAGCGGAGTGAATCAGCTTGGTGGTGTCTTTGTCAACGGGCGGCCACTGCCGGACTCCACCCGGCAGAAGATCGTAGAGCTAGCTCACAGCGGGGCCCGGCCGTGCGACATTTCCCGAATTCTGCAGACCCATGCAGATGCAAAAGTCCAGGTGCTGGACAATGAAAACGTATCCAACGGTTGTGTGAGTAAAATTCTGGGCAGGTATTACGAGACTGGCTCCATCAGACCCAGGGCAATCGGAGGGAGTAAGCCAAGAGTGGCGACTCCAGAAGTTGTAAGCAAAATAGCCCAGTATAAACGGGAGTGCCCTTCCATCTTTGCTTGGGAAATCCGAGACAGATTATTATCCGAGGGGGTCTGTACCAACGATAACATACCCAGTGTGTCATCAATAAACAGAGTTCTTCGCAACCTGGCTAGCGAAAAGCAACAGATGGGCGCAGACGGCATGTATGATAAACTAAGGATGTTGAACGGGCAGACCGGAAGCTGGGGCACACGCCCTGGTTGGTATCCCGGGACTTCAGTACCAGGGCAACCCACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGAAGGAGGGGGAGAGAACACCAACTCCATCAGTTCTAACGGAGAAGACTCGGATGAAGCTCAGATGCGACTTCAGCTGAAGCGGAAGCTGCAAAGAAATAGAACATCTTTTACCCAAGAGCAGATTGAGGCTCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGGACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGGGAAAGACTAGCAGCCAAAATAGATCTACCTGAAGCAAGAATACAGGTATGGTTTTCTAATCGAAGGGCCAAATGGAGAAGAGAAGAGAAACTGAGGAACCAGAGAAGACAGGCCAGCAACACTCCTAGTCACATTCCTATCAGCAGCAGCTTCAGTACCAGTGTCTACCAGCCAATCCCACAGCCCACCACACCTGTCTCCTCCTTCACATCAGGTTCCATGTTGGGCCGAACAGACACCGCCCTCACCAACACGTACAGTGCTTTGCCACCCATGCCCAGCTTCACCATGGCAAACAACCTGCCTATGCAACCCCCAGTCCCCAGTCAGACCTCCTCATACTCGTGCATGCTGCCCACCAGCCCGTCAGTGAATGGGCGGAGTTATGATACCTACACCCCTCCGCACATGCAAACACACATGAACAGTCAGCCCATGGGCACCTCGGGGACCACTTCAACAGGACTCATTTCACCTGGAGTGTCAGTTCCCGTCCAAGTTCCCGGGAGTGAACCTGACATGTCTCAGTACTGGCCTCGATTACAGTAG。

另外，此构建的paired box 6质粒，还具有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签和G418（Geneticin，遗传霉素）抗性，以利于质粒转染后阳性细胞的辨识和筛选。

（2）将大鼠脂肪间充质干细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为0.8×10⁵个，向孔内加入含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基，并将培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中进行培养；

（3）接种24h后，采用阳离子脂质体介导质粒DNA转染，并使其形成含有上述质粒的混合液，并将其加入到上述培养板的培养孔中，每孔加入的DNA为0.5μg；混合液加入4～6h后，更换培养基（采用含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基），继续培养；

（4）48h后，将上述培养基换成含有600μg/ml G418的培养基，每3天（d）更换一次培养基，10d后将存活的阳性细胞克隆在培养板盖上进行标记，刮除其他细胞，将培养基中的G418浓度降为300μg/ml，继续培养20d，挑选阳性克隆并采用有限稀释法筛选，筛选出的细胞，即为角膜上皮样细胞。

另外，本发明对细胞进行了鉴定（判断筛选得到的细胞是否为角膜上皮样细胞）。

鉴定依据：细胞形态依据:角膜上皮细胞呈铺路石状，而脂肪间充质干细胞为梭状；特征蛋白分子依据（最关键依据）:角膜上皮细胞的特征蛋白分子是细胞角蛋白3（cytokeratin 3，CK3）、细胞角蛋白12（cytokeratin 12，CK12）；另外，E-Cadherin蛋白作为上皮细胞的标志，可以作为角膜上皮细胞特征的辅助依据；细胞移植依据:角膜上皮细胞在角膜表面能够形成角膜上皮。

鉴定方法：细胞形态在倒置显微镜下观察和拍摄；分子鉴定主要通过Western blot法与细胞免疫荧光染色法，其中CK3+12的多克隆抗体采用北京博奥森生物技术有限公司（目录号：bs 2369R），E-Cadherin单克隆抗体购自abcam公司（目录号：ab76055)；细胞移植鉴定主要观察细胞移植于兔眼后形成角膜上皮的能力。

鉴定结果：

①Pax6蛋白在细胞的表达情况：Western blot法检测显示：携带EGFP的Pax6蛋白在实验组呈阳性表达。对照组细胞为大鼠脂肪间充质干细胞，实验组细胞为大鼠脂肪间充质干细胞经过Pax6转染并筛选后所得的细胞。见图1。

②细胞形态观察显示，经过Pax6质粒转染并G418筛选，原先为梭状的大鼠脂肪间充质干细胞（对照组），形态上转变成如铺路石样的细胞（实验组）。见图2。

③Western blot法检测显示，CK3、CK12蛋白分子在实验组细胞呈阳性表达，而在作为对照的大鼠脂肪间充质干细胞为阴性。见图3。

④细胞免疫荧光检测显示：实验组细胞CK3-12抗体染色为阳性，E-Cadherin抗体染色为阳性，而对照组均为阴性。见图4。

⑤细胞移植实验显示，实验组细胞移植于兔眼后能够形成复层角膜上皮。图5：a移植前刮除兔眼角膜上皮层，切除角膜缘组织； b细胞移植5天后大体观察；c倒置荧光显微镜下观察具有EGFP标记的角膜上皮样细胞；d角膜HE染色，可见复层角膜上皮形成。

值得说明的是Pax6质粒是将Pax6基因插入载体PCDNA3.1(+)（由发明人委托广州复能基因有限公司制作并测序鉴定，产品货号为CCS- Mm04345-PCDNA3.1（+））。该质粒还具有EGFP标签和G418抗性，以利于细胞筛选。上述Pax6基因，选用美国国家生物技术信息中心参考序列号（NCBI Reference Sequence）为NM_013627.5的基因序列。

本发明具有以下优点及有益效果：

优点：①本发明采用一种转录因子基因--paired box 6基因，构建质粒，采用脂质体介导转染，经过G418筛选，诱导细胞转分化为角膜上皮样细胞，方法清晰、简便，鉴定结果证实可靠；②本发明选用脂肪间充质干细胞，具有取材方便，安全性好的有点。

有益效果：①用本发明方法获得的角膜上皮样细胞，能够用于修复角膜上皮的损伤，并形成完整的复层角膜上皮（鉴定试验已经证实），作为一种干细胞治疗药物，具有潜在的临床应用前景；②用本发明方法获得的角膜上皮样细胞，用于构建组织工程角膜上皮，具有较大的市场应用前景。

附图说明

图1为Pax6蛋白在细胞的表达情况（Western blot法检测）。

图2为细胞形态特征图片（倒置荧光显微镜下观察）。

图3为角膜上皮特征蛋白（CK3，CK12）表达情况（Western blot法检测）。

图4为角膜上皮特征蛋白（CK3，CK12）表达情况（细胞免疫荧光检测）。

图5为角膜上皮样细胞兔眼移植实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。

实施例

1、SD大鼠脂肪间充质干细胞的分离与培养：

（1）SD大鼠脂肪间充质干细胞的分离：

手术器械及手术单清洗后121℃灭菌40min并置于烘箱内60℃烘干水蒸气，移动紫外灯照射实验动物手术台30min，脱臼处死SD大鼠，并置于配制好的75%酒精中浸泡15min。从细胞培养间超净工作台处用无菌的50ml离心管取配制好且经高压灭菌后的无菌PBS 40ml，将提前准备好的无菌手术单铺在实验动物手术台及SD大鼠腹股沟周围，用50ml针头固定SD大鼠，用提前准备好的无菌的刀片轻轻划开SD大鼠腹股沟，用无菌钳子分开扩大手术区域，用无菌镊子取SD大鼠腹股沟皮下脂肪，连同微小血管旁的脂肪组织，将取下来的脂肪组织用无菌的PBS充分洗3遍，将洗好的脂肪组织置于玻璃培养皿中，加入少许PBS，用无菌的显微眼科手术器械分离剔除非脂肪组织并剪碎脂肪组织至2mm左右，吸干PBS等液体成分，加入2倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃下200r/min震荡消化1h，1h后，向培养皿内添等体积的含10%FBS的低糖DMEM并混匀，然后将培养皿内的全部液体及固体成分移至离心管，1000r/min，离心10min，用吸管吸掉液体表面上层的脂肪油滴及部分其余组织，倒掉上清液，用PBS重悬离心管底部沉淀，1000r/min，重复离心10min，倒掉上清液，用10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬离心管底部沉淀，接种于25cm² 细胞培养瓶中，置于37℃5%CO2培养箱中培养，5d后半量换液。

（2）细胞传代及冻存和复苏：

①SD大鼠脂肪间充质干细胞的培养：细胞分离后培养10d，倒置显微镜下观察大量SD大鼠脂肪间充质干细胞沿着细小絮状组织边缘伸出并贴壁生长，呈细长梭形，并呈漩涡状排列。用含10%FBS的低糖DMEM给细胞换培养液，平均每3d给细胞换培养液一回，具体时间根据观察细胞培养液颜色的变化而定。

②SD大鼠脂肪间充质干细胞的传代：待细胞生长融合至90%左右，弃去培养基，用无菌PBS轻轻润洗一次，然后加入配制好的胰酶1ml，37℃消化，直至细胞开始皱缩脱落，加1ml含10%FBS的低糖DMEM混匀，小心摇动培养瓶确保贴壁细胞几乎全部脱落时，将其移至离心管，1000r/min，离心5min，弃掉上清液，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬细胞，按1:3接种传代。

③SD大鼠脂肪间充质干细胞的冻存：将消化得到的细胞，用1ml含50%低糖DMEM40%胎牛血清10%DMSO的细胞冻存液重悬细胞，用移液枪移至高压灭菌并烘干的冻存管内，管口拧紧并缠上封口胶，贴上标签，置于4℃冰箱30min，然后移至-20℃冰箱1h，再-80℃冰箱过夜，第二天将其放至液氮罐保存。

④SD大鼠脂肪间充质干细胞的复苏：从液氮罐内取出冻存的细胞，立即置于37℃的水浴锅内轻轻摇动，待其完全融化，移至离心管，1000r/min，离心5min，弃掉上清液，用含10%胎牛血清的低糖DMEM轻轻吹打混匀离心管底部沉淀，然后用移液枪将其移至细胞培养瓶中，并将其置于适宜的细胞培养箱中，次日，显微镜下观察，细胞大量贴壁，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基给细胞全量换液，以后每3d换一次液，待细胞生长融合至90%左右，给细胞传代，然后备用。

2、SD大鼠脂肪间充质干细胞的鉴定（流式鉴定：CD90、CD105、CD34、CD45）：

（1）流式检测前1d，细胞铺板。

（2）流式检测当天，将培养板内的培养基全部洗掉。

（3）向培养板孔内加入无菌的生理盐水，小心摇动培养板。重复两次。

（4）向孔内加入0.25%的胰酶，置于37℃的培养箱中消化。

（5）用含10%的低糖DMEM终止消化，然后1000r/min，离心10min。

（6）加入PBS，重悬细胞，，然后1000r/min，离心10min。重复2次。

（7）按照大约1x106cells/ml的细胞浓度，用PBS重悬细胞，然后向每管细胞中加入50ml的HAB，充分混匀，室温下放置1min，然后将链接有荧光素的CD90、CD105、CD34、CD45抗体分别向对应加入，室温下避光放置50min，然后吸出，用PBS洗2次，然后加入缓冲液重悬，上机检测。

3、Pax6质粒转化、扩增、提取与转染：

该Pax6质粒是将paired box 6基因插入载体PCDNA3.1(+)中，同时插入EGFP等序列而得。

（1）Pax6质粒转化：将配制好的灭菌后的固体LB培养基冷至25℃左右时加入Amp，浓度为0.6g/ml，然后将其倒在培养平板内，冷却凝固备用。从-80℃冰箱中取出200ulE.coli DH5a大肠杆菌感受态细胞悬液，置于室温下待其融化，融化后立即置于碎冰上。加入3ul稀释配好的Pax6质粒，并轻微摇动混匀，碎冰上放置30mim后。置于42℃水浴锅中90s后，迅速将其置于碎冰上3min。向管中加入1ml配制好的不含氨苄抗生素的无菌LB，吹打混合均匀后置于摇床上，设置温度为37℃转速为150r/min，时间为60min。6000r/min、离心3min，弃去700ul，轻轻重悬混匀。取20ul涂于含有氨苄抗生素的筛选平板上，正面向上放置30min，30min后倒置培养皿，并放入温度设置为37℃细菌培养箱中18h。18h后，将其拿到4℃冰箱备用。

（2）Pax6质粒扩增：从固体LB培养基中挑选大而圆且透亮并独立的菌落，备用。将挑选好的菌落用10μl枪尖轻轻挑取少量，然后将枪尖打入含有0.6g/ml Amp的液态LB培养基中，随后置于37℃培养箱中以220r/min摇动12h，以让大肠杆菌繁殖。

（3）Pax6质粒提取：取培养好的大肠杆菌液5ml，4000 x g，离心5min，然后弃掉上清并吸干液体。加入250ul 的SolutionⅠ/RNAase A，充分重悬离心后得到的沉淀，并涡旋5s。加入250ul的SolutionⅡ，轻轻的上下颠倒EP管，使其反应3min，直至观察到浑浊的液体变清亮。加入350ul的SolutionⅢ，立即轻轻的上下颠倒EP管，以充分的混合，可观察到有大量白色絮状物形成。13000 x g，离心10min。轻轻的吸出上清液，加入经过除尘的小柱子，静放10min，以保证液体与柱子的充分结合，然后10000 x g，离心1min。弃去离心出来的液体，重复使用集液管，向柱子内加入500ul的Buffer HB，6000r/min，离心1min。弃去离心出来的液体，重复使用集液管，向柱子内加入700ul的提前用乙醇稀释过的DNA Wash Bufer，6000r/min，离心1min。接着再弃去离心出来的液体，重复使用集液管，向柱子内加入700ul的提前用乙醇稀释过的DNA Wash Bufer，6000r/min，离心1min。然后13000 x g，离心空柱子2min，以充分去掉酒精成分。弃掉集液管，将柱子放入无菌的EP管，向柱子内加入50ul的双蒸水，放置10min，以保证双蒸水与柱子的充分结合，然后13000 x g，离心2min。测定所提取得到的质粒浓度，并做好标记，放入-20℃冰箱保存备用。

（4）质粒转染：我们采用脂质体转染的方法，将Pax6质粒转染第4代SD大鼠脂肪间充质干细胞，同时将不做质粒转染S第4代SD大鼠脂肪间充质干细胞作为对照实验以观察实验结果。具体的实验步骤如下：A、转染前一天，用0.25%的胰酶消化培养好的SD大鼠脂肪间充质干细胞，并计数，按照0.8x105   cells/well的密度接种于24孔板中，向孔内加入含10%胎牛血清不含抗生素生物低糖DMEM培养基培养SD大鼠脂肪间充质干细胞，以至24h后，所接种细胞生长融合至75%左右。B、24h后，对于24孔板中所接种的细胞，分别设置为实验组和对照组，实验组以Pax6质粒转染SD大鼠脂肪间充质干细胞，对照组直接采用SD大鼠脂肪间充质干细胞，每组实验设置三个重复孔，对于实验组的24孔板的每孔细胞分别按照以下步骤进行转染：①向1号无菌的EP管中加入0.5ug的质粒DNA，再加入25ul的Opti-MEM培养基，轻轻混匀置于20℃的水浴锅中5min。②向2号无菌的EP管中加入2ul的lipofectamine 2000，再加入25ul的Opti-MEM，轻轻混匀置于20℃的水浴锅中5min。③将1号与2号EP管中的液体混合，轻轻混匀置于20℃的水浴锅中20min。④再向EP管中加入100ul的Opti-MEM，轻轻混匀后，将每个细胞孔中的培养液体洗掉并用PBS洗2遍，然后分别换成该混合液，轻轻摇动培养板，以混匀，置于37℃、5%的CO2的细胞培养箱中培养5h左右。⑤4h后，显微镜下看细胞存活状况，当出现细胞大量死亡时（5h后），应立即将孔内的液体换成含有10%FBS的低糖DMEM，继续置于细胞培养箱中。⑥24h后，开始于荧光显微镜下动态查看细胞被激发出绿光以检测转染结果，直至培养96h后，可以看到大量细胞能被激发出绿光，该细胞即为角膜上皮样细胞。

4、G418抗性筛选：

（1）细胞对G418不同浓度的敏感性试验：

不同细胞对G418的抗性强度不一样，在做转染后G418筛选前，需要进行SD大鼠的脂肪间充质干细胞对G418抗性强度的试验，具体实验步骤如下：A、细胞铺板，SD大鼠脂肪间充质干细胞经胰酶消化后进行细胞计数，然后以0.5×10⁵cells/well的密度接种于24孔板中，细胞培养箱中培养细胞24h后，细胞生长融合至30%左右。B、24h后，将培养板孔中的培养液换成含有不同浓度的G418培养液，其浓度分别为0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、80ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml。之后每2天给细胞换液，继续培养查看，直至培养14d之后，出现细胞完全死亡的最小G418浓度为后续进行G418筛选实验的最佳实验使用浓度。

（2）细胞筛选：DNA转染48小时后，细胞汇合度在40%～50%左右，将上述培养基换成含有600ug/ml G418的培养基，每3d更换一次培养基，10d后细胞大量死亡，将存活的阳性细胞克隆在培养板盖上进行标记，刮除其他细胞，将培养基中的G418浓度降为300ug/ml，继续培养20d，挑选阳性克隆并采用有限稀释法筛选，筛选出的细胞克隆，进行常规传代培养，同时进行细胞鉴定。

5、细胞蛋白表达的检测：

本实施例采用蛋白印迹法进行相应的检测。

（1）蛋白样品处理：A、收集细胞：胰酶消化细胞，1000r/min，离心5min；PBS重悬细胞，1000r/min，离心5min，重复一次。B、每25cm２培养瓶的细胞加入100ul RIPA，冰盒中重悬细胞并吹打混匀。冰浴30min每10min颠倒混匀一次。期间，用超声波细胞粉碎机每次5s，间隔5min。C、裂解液于预冷的离心机中，13,000 rmp/min，离心15分钟。D、轻轻吸走上清液至新的离心管中，注意不能吸到絮状沉淀物质。其中取2ul进行蛋白质定量。剩余蛋白进行下一步操作。E、每80ul蛋白液加入20ul 上样缓冲液（5X） 混匀后沸水浴10min，瞬时离心几秒钟，然后-80℃保存。

（2）蛋白质定量：根据BCA法进行蛋白质定量，具体实验步骤如下：A、配置BCA工作液：①96孔板每孔配置200μl该溶液。②按照试剂B与试剂A比例为1:50的比例充分混匀。B显色反应：①配制梯度稀释为20、10、5、4、3、2、1、0.5和0 μg / ml的BSA标准品。②分别吸取2 μl标准品到96孔板的对应孔中。并加入18 μl NaCl。③分别吸取2 μl样品（未变性）至微孔板对应孔中，再向其中吸18 μl NaCl。空白对照加20ul NaCl 溶液。④每孔加入200 μl已经 配制好的工作液，震板30s以充分混匀。⑤盖好微孔板，37℃温育30min。⑥冷却至室温。⑦观察550 nm附近的每孔吸收值。⑧每个标准孔与待测样品孔的吸收值各自减去空白孔平均光吸收值。⑨用经过校正了的BSA标准蛋白550 nm测量值对其浓度（μg/ml）作标准曲线。然后以标准曲线并结合所得的吸光度来计算待测样品浓度。

（3）PAGE胶配制：①将凝胶玻璃板清洗干净，用双蒸水浸泡后，置于烘箱内烤干或于通风处吹干，加胶条组装玻璃板，切记注意胶条在两板之间要积紧，以防漏胶，组装好凝胶装置，注意检测是否会漏胶。 ②配制分离胶，分别选合适的移液枪按照分离胶配方加试剂于干净的小烧杯中。操作过程中应特别注意：a、30%丙烯酰胺溶液有神经毒性，操作时需戴好手套；b、10%过硫酸氨和TEMED应在其他溶液加完后再加，且加后需轻轻摇晃烧杯，直至灌胶结束，以免灌胶前胶已凝固；c、每加完一种溶液，重新换一个枪头。分离胶液配制完成后，用1ml的移液枪将此溶液小心低速移至架好板内到大约6cm的高度。向每板垂直缓慢加入双蒸水以压平分离胶液面，通风处放置1小时左右至聚合彻底。 ③聚合完全后倾斜倒去双蒸水，用滤纸吸干预留部分双蒸水，并注意观察分离胶平面是否平整。 ④按照浓缩胶的配制方法配制浓缩胶。用移液枪将配好的浓缩胶液加入板中至顶端，小心均衡的插入梳子，室温下浓缩聚合1小时左右。

（4）电泳：①去掉胶条，转换玻璃板方向，放入电泳槽。加入电泳缓冲液至两侧都浸入到电泳缓冲液中。小心拔去梳子，避免将梳齿一并拔掉；观察梳齿，若梳齿歪斜，应用细针调整；并用移液枪适当冲一下加样孔，且上样前应将胶板下的气泡赶走。②将所有已经通过煮沸变性的蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加蛋白上样缓冲液后直接上样，样品两侧的泳道用等体积的1×上样缓冲液，Marker也用1×上样缓冲液调整至与样品等体积，并记录加样顺序。剩余溶液（溶于1×上样缓冲液）-80℃储存，-80℃可以储存一个月。③设定初始电压为60V，接通电源开始跑胶，待所有样品移到浓缩胶下端形成一条线时，重设电压为100V，在溴酚蓝泳动至距胶下缘1cm左右时，断开电源，电泳结束，大约2h左右。

（5）转膜：①电泳结束后，将胶版从电泳槽中取出，从胶版左右两边的凹槽处慢慢将胶版撬开（动作应轻柔以免将凝胶损坏），依照Marker的指示，保留目的蛋白所在的凝胶区域，将其余区域切掉。②按照目的凝胶的大小，剪下适宜大小的PVDF膜，并在右上角剪去一角作为标记。且应注意在裁剪过程中手不能直接触碰到PVDF膜，以免污染上杂蛋白。然后将PVDF膜放入99.5%的甲醇溶液中浸泡1min以激发膜的正电位，再将PVDF膜转移到转膜缓冲液中。注意操作过程中戴手套。③在转膜缓冲液中将泡沫紧贴转移夹黑色面（负极），然后依次放置适宜大小的滤纸、带有目的蛋白的凝胶、与凝胶相应大小的转印膜、适宜大小的滤纸及泡沫、转移夹白色面（正极）的顺序组装好转移夹层，注意转印膜和凝胶之间不能留有气泡，如有气泡，用干净镊子将其驱赶完全。④接通电源，开始转膜：将黑色电极引线接通转移装置的负极孔，红色阳极引线接通正极孔；按照红色接红色，黑色接黑色以连接电源输出端。⑤转膜装置周围放置冰块，保证转膜过程中转膜装置始终处于低温状态，以获得相对恒定的高电压。打开电源，设定电压为100V或电流为350mA时间为2小时（参考建议：10KD-30KD蛋白100V 1-2小时，30KD-60KD蛋白 100V 2-3小时）。⑥转膜完成后，从槽中取出转移夹。⑦用镊子小心逐层打开转移叠层。⑧用TBS漂洗PVDF膜，转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染液染色4h，清水漂洗后观察以判断转膜情况，如可染出的蛋白质条带较明显，则转膜不完全，如不能染出蛋白质条带说明转膜完全。

（6）封闭及杂交：①封闭：用TBS漂洗过的PVDF膜，将其蛋白面向上浸没于5%的脱脂奶粉中置于水平钟罢式摇床上缓慢摇荡2小时。②结合一抗：按照抗体使用说明书，并结合实际实验中的问题，确定最佳抗体稀释比例。用TBS稀释配制一抗，其中CK3-12的稀释比例为1:100，E-cadherin的稀释比例为1:100，beta-actin的稀释比例为1:1000，Pax6的稀释比例为1:500。使用塑料封口机制作薄膜口袋，其大小比PVDF膜稍大。选择与PVDF膜相应的一抗，向制作好的薄膜口袋内加入TBS稀释过的抗体2ml(所需体积：1平方厘米加1ml一抗)并封口，然后置于4℃冰箱内过夜。③洗膜：一抗孵育结束后，取出PVDF膜置于TBST液中，在水平钟罢式摇床上快速震荡漂洗5次，每次10min。④结合二抗：根据不同的一抗来源选择其相适宜的二抗类型，其中与E-cadherin一抗对应的二抗为羊抗鼠，与CK3-12、beta-actin、Pax6一抗对应的二抗为羊抗兔，，且根据鉴定方法选择HRP标记的抗体，按照二抗说明书，用TBS按适宜稀释比例稀释二抗。重新制作薄膜口袋，比PVDF膜稍大，向制作好的薄膜口袋内加入2ml的用TBS稀释过的而抗并封口（所需体积：1平方厘米加1ml二抗），然后将其置于水平钟罢式摇床上，室温轻摇二小时。⑤洗膜：二抗孵育结束后，取出PVDF膜置于TBST液中，在水平钟罢式摇床上快速震荡漂洗5次，每次10min。

（7）显色并曝光：使用HRP-ECL发光法显影：将A液和B液按比例混匀。膜用UP水轻轻漂洗几下，于凝胶成像仪采集图像信息。注意蛋白面向上加入发光液。然后曝光显影，注意保存图片。

 6、细胞免疫荧光染色法

（1）细胞铺板：实验前1d，进行细胞铺板，按照0.6x10⁵cells/well的密度将细胞接种于24孔板内，以确保24h后细胞生长融合至50%左右。

（2）孵育一抗

①细胞铺板后24h左右，将长好细胞的培养板取出，向孔内加入PBS，左右轻轻晃动培养板，润洗，然后吸掉。重复3次，每次5min。

②向孔内加入配制好的4%多聚甲醛，15min后全部吸掉。

③向孔内加入PBS，左右轻轻晃动培养板，润洗，然后吸掉。重复3次，每次5min。

④向孔内0.1%的Trition-100，室温放置20min，以穿透细胞，然后吸掉。

⑤向孔内加入PBS，左右轻轻晃动培养板，润洗，然后吸掉。重复3次，每次5min。

⑥用吸水纸洗掉PBS，注意尽可能吸干净，然后向孔内滴加2滴正常的山羊血清，室温放置30min，以封闭，按照抗体使用说明书并结合实际实验中的各种问题，用PBD稀释配制抗体，其中CK3-12的稀释比例为1:500，E-Cadherin的稀释比例为1:200。

⑦封闭30min后，用吸水纸洗掉封闭液，注意尽可能的吸干净，然后直接向孔中加入足量的稀释配制好的一抗，并设置对照组，对照组向孔中加入等量的PBS。

⑧放置于湿盒中，4℃，过夜。

（3）孵育二抗

①从4℃冰箱中取出湿盒，置于室温下少许，然后洗出孔内的液体，向孔内加入PBS，左右轻轻晃动培养板，润洗，然后吸掉。重复5次，每次5min。用PBS配制荧光二抗，其稀释比例为1:200。

②用吸水纸洗干PBS，向孔内滴加足量的配制好的荧光二抗，放入湿盒，避光，37℃，孵育1h，然后洗掉。

③向孔内加入PBS，左右轻轻晃动培养板，润洗，然后吸掉。重复5次，每次5min。

④向孔内滴加DAPI，避光放置5min，然后吸掉。

⑤向孔内加入PBS，左右轻轻晃动培养板，润洗，然后吸掉。重复5次，每次5min。

⑥在暗室内，将细胞置于倒置荧光显微镜下观察，并采集图像。

本发明将Pax6基因导入到大鼠脂肪间充质干细胞，能够形成角膜上皮样细胞，通过试验鉴定、测试从而确定了本发明的可信性，以及可靠性，临床应用前景较佳。

按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  刘漪沦

 

<120>  一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法

 

<130> 

 

<160> 

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1311

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  paired box 6基因的ORF序列

 

<400>  1

atgcagaaca gtcacagcgg agtgaatcag cttggtggtg tctttgtcaa cgggcggcca      60

ctgccggact ccacccggca gaagatcgta gagctagctc acagcggggc ccggccgtgc     120

gacatttccc gaattctgca gacccatgca gatgcaaaag tccaggtgct ggacaatgaa     180

aacgtatcca acggttgtgt gagtaaaatt ctgggcaggt attacgagac tggctccatc     240

agacccaggg caatcggagg gagtaagcca agagtggcga ctccagaagt tgtaagcaaa     300

atagcccagt ataaacggga gtgcccttcc atctttgctt gggaaatccg agacagatta     360

ttatccgagg gggtctgtac caacgataac atacccagtg tgtcatcaat aaacagagtt     420

cttcgcaacc tggctagcga aaagcaacag atgggcgcag acggcatgta tgataaacta     480

aggatgttga acgggcagac cggaagctgg ggcacacgcc ctggttggta tcccgggact     540

tcagtaccag ggcaacccac gcaagatggc tgccagcaac aggaaggagg gggagagaac     600

accaactcca tcagttctaa cggagaagac tcggatgaag ctcagatgcg acttcagctg     660

aagcggaagc tgcaaagaaa tagaacatct tttacccaag agcagattga ggctctggag     720

aaagagtttg agaggaccca ttatccagat gtgtttgccc gggaaagact agcagccaaa     780

atagatctac ctgaagcaag aatacaggta tggttttcta atcgaagggc caaatggaga     840

agagaagaga aactgaggaa ccagagaaga caggccagca acactcctag tcacattcct     900

atcagcagca gcttcagtac cagtgtctac cagccaatcc cacagcccac cacacctgtc     960

tcctccttca catcaggttc catgttgggc cgaacagaca ccgccctcac caacacgtac    1020

agtgctttgc cacccatgcc cagcttcacc atggcaaaca acctgcctat gcaaccccca    1080

gtccccagtc agacctcctc atactcgtgc atgctgccca ccagcccgtc agtgaatggg    1140

cggagttatg atacctacac ccctccgcac atgcaaacac acatgaacag tcagcccatg    1200

ggcacctcgg ggaccacttc aacaggactc atttcacctg gagtgtcagt tcccgtccaa    1260

gttcccggga gtgaacctga catgtctcag tactggcctc gattacagta g             1311

 

Claims (2)

1.一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，其特征在于，将一种转录因子基因--paired box 6（Pax6）基因，导入到大鼠脂肪间充质干细胞，诱导细胞发生转分化，形成角膜上皮样细胞。

2. 根据权利要求1所述的一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）采用载体PCDNA3.1(+)，构建paired box 6质粒，其中，paired box 6基因的ORF序列为：

ATGCAGAACAGTCACAGCGGAGTGAATCAGCTTGGTGGTGTCTTTGTCAACGGGCGGCCACTGCCGGACTCCACCCGGCAGAAGATCGTAGAGCTAGCTCACAGCGGGGCCCGGCCGTGCGACATTTCCCGAATTCTGCAGACCCATGCAGATGCAAAAGTCCAGGTGCTGGACAATGAAAACGTATCCAACGGTTGTGTGAGTAAAATTCTGGGCAGGTATTACGAGACTGGCTCCATCAGACCCAGGGCAATCGGAGGGAGTAAGCCAAGAGTGGCGACTCCAGAAGTTGTAAGCAAAATAGCCCAGTATAAACGGGAGTGCCCTTCCATCTTTGCTTGGGAAATCCGAGACAGATTATTATCCGAGGGGGTCTGTACCAACGATAACATACCCAGTGTGTCATCAATAAACAGAGTTCTTCGCAACCTGGCTAGCGAAAAGCAACAGATGGGCGCAGACGGCATGTATGATAAACTAAGGATGTTGAACGGGCAGACCGGAAGCTGGGGCACACGCCCTGGTTGGTATCCCGGGACTTCAGTACCAGGGCAACCCACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGAAGGAGGGGGAGAGAACACCAACTCCATCAGTTCTAACGGAGAAGACTCGGATGAAGCTCAGATGCGACTTCAGCTGAAGCGGAAGCTGCAAAGAAATAGAACATCTTTTACCCAAGAGCAGATTGAGGCTCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGGACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGGGAAAGACTAGCAGCCAAAATAGATCTACCTGAAGCAAGAATACAGGTATGGTTTTCTAATCGAAGGGCCAAATGGAGAAGAGAAGAGAAACTGAGGAACCAGAGAAGACAGGCCAGCAACACTCCTAGTCACATTCCTATCAGCAGCAGCTTCAGTACCAGTGTCTACCAGCCAATCCCACAGCCCACCACACCTGTCTCCTCCTTCACATCAGGTTCCATGTTGGGCCGAACAGACACCGCCCTCACCAACACGTACAGTGCTTTGCCACCCATGCCCAGCTTCACCATGGCAAACAACCTGCCTATGCAACCCCCAGTCCCCAGTCAGACCTCCTCATACTCGTGCATGCTGCCCACCAGCCCGTCAGTGAATGGGCGGAGTTATGATACCTACACCCCTCCGCACATGCAAACACACATGAACAGTCAGCCCATGGGCACCTCGGGGACCACTTCAACAGGACTCATTTCACCTGGAGTGTCAGTTCCCGTCCAAGTTCCCGGGAGTGAACCTGACATGTCTCAGTACTGGCCTCGATTACAGTAG；

另外，此构建的paired box 6质粒，还具有增强型绿色荧光蛋白标签和G418抗性，以利于质粒转染后阳性细胞的辨识和筛选；

（2）将大鼠脂肪间充质干细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为0.8×10⁵个，向孔内加入含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基，并将培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中进行培养；

（3）目的基因导入细胞的方法：接种24h后，采用阳离子脂质体介导质粒DNA转染，使其形成含有上述质粒的混合液，并将其加入到上述培养板的培养孔中，每孔加入的DNA为0.5μg；混合液加入4～6h后，更换成含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基，继续培养；

（4）48h后，将上述培养基换成含有600μg/ml G418的培养基，每3d更换一次培养基，10d后将存活的阳性细胞克隆在培养板盖上进行标记，刮除其他细胞，将培养基中的G418浓度降为300μg/ml，继续培养20d，挑选阳性克隆并采用有限稀释法筛选，筛选出的细胞，即为角膜上皮样细胞。