CN103239758A - 一种人工真皮支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人工真皮支架，包括深层和浅层两个层次的三维多孔结构，该人工真皮支架引入了加载有功能因子的缓释微球，包括加载抗生素的微球和加载皮肤生长因子的微球。所述人工真皮支架的三维多孔结构因深层和浅层孔隙率不同而形成梯度结构。该人工真皮支架的制备方法主要包括：制备加载有功能因子的缓释微球；制备两种浓度的胶原溶液作为基体溶液；将加载有功能因子的缓释微球混于相应的基体溶液，并成型包括深层和浅层两个层次的三维多孔结构，从而形成引入了加载有功能因子缓释微球的人工真皮支架。本发明的人工真皮支架具有抗菌活性和促进创面愈合的特性。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术和生物医学工程领域。更确切地说，本发明涉及一种人工真皮支架及其制备方法。
技术背景
皮肤作为人体器官，具有保持水分、透气和防止细菌侵袭等功能。当皮肤受到外伤、烧伤、炎症等损害，尤其是当大面积的皮肤受到严重损害时，伤口应该立即被保护起来。如果仅是皮肤的浅层或是小面积受损，新皮肤会自体得以再生。如果深层的大面积皮肤受到创伤，皮肤就不能实现自修复，通常须进行自体皮肤移植，如邮票植皮、网状植皮、嵌皮等方法。或者使用人工皮肤产品。现有技术的人工皮肤产品均存在皮肤诱导自体皮肤组织修复能力不足，而且存在创面修复过程中创面因为内源或外源性的感染的风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于：提供一种人工真皮支架及其制备方法，以克服现有技术用于皮肤损伤修复的人工真皮支架修复能力差的问题，避免内源或外源性感染的风险。
为解决上述技术问题，本发明的采取的技术方案是：提供一种人工真皮支架，包括深层和浅层两个层次的三维多孔结构，该人工真皮支架引入了加载有功能因子的缓释微球。
所述加载有功能因子的缓释微球包括加载抗生素的微球和/或加载皮肤生长因子的微球；所述人工真皮支架的三维多孔结构因深层和浅层孔隙率不同而形成梯度结构，所述浅层孔隙率低于深层孔隙率。
进一步地，在所述深层，加载抗生素的微球被加入；在所述浅层，加载皮肤生长因子的微球被加入，从而形成双因子缓释人工真皮支架。
进一步地，所述加载抗生素微球的基体原料选自聚乳酸，聚乙醇酸聚乳酸，聚乙醇酸中的一种或几种的组合；抗生素选自庆大霉素、万古霉素、青霉素中的一种或几种的组合；所述载皮肤生长因子的微球的基体原料选自聚乳酸，聚乙醇酸聚乳酸，聚乙醇酸中的一种或几种的组合；所述皮肤生长因子选自表皮生长因子或血管内皮细胞生长因子中的一种或两种；人工真皮支架三维多孔结构的制备原料为胶原、或胶原与壳聚糖、硫酸软骨素、丝素蛋白之一种或几种的复合而成的复合物。所述复合物中胶质量分数为50～98%。
所述深层的孔隙率为85～98%，孔径主要分布在100～300μm之间；浅层的孔隙率为75～95%，孔径主要分布在50～250μm之间。
本发明还提供人工真皮支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：制备加载有功能因子的缓释微球；
步骤2：制备一定浓度的胶原溶液作为基体溶液；
步骤3：将加载有功能因子的缓释微球混于相应的基体溶液，并成型包括深层和浅层两个层次的三维多孔结构，从而形成引入了加载有功能因子缓释微球的人工真皮支架。
所述步骤2是分别制备两种质量浓度的基体溶液。
所述步骤3中成型两个层次的三维多孔结构的工艺：是将所述一种浓度的胶原溶液或其中混有加载功能因子缓释微球，注入一定深度的模具中，淌平后静置一定时间形成第一层次；之后再将另一种浓度的胶原溶液或其中混有加载功能因子缓释微球，注入模具中所述第一层次之上，再淌平后静置一定时间形成第二层次；接着将模具置于一定温度下冷冻，然后冷冻干燥从而得到本发明的双层真皮支架。
进一步地，步骤1所述缓释微球包括加载抗生素的微球和/或加载皮肤因子的微球。
进一步地，步骤2中是分别制备总质量百分浓度为0.8~1%的胶原溶液和总质量百分浓度为0.4~0.8%的胶原溶液。
进一步地，步骤3中，是将制备得到的载抗生素的微球悬液混入质量百分浓度为0.4~0.8%的胶原溶液中形成第一混合溶液，以每5~35g第一混合溶液且其中含微球20~200mg的质量比例注入模具中，淌平后静置一定时间形成所述第一层次；将制备得到的载皮肤因子的微球悬液混入质量百分浓度为0.8~1%的胶原溶液中形成第二混合溶液，以每5~35g第二混合溶液且其中含微球5-100mg的质量比例注入已淌平的第一层次之上，再次淌平后静置一定时间形成所述的第二层次，经冷冻，然后冷冻干燥得到双因子缓释双层人工真皮支架；所述第一层次对应形成人工真皮支架的深层，第二层次对应形成浅层。
进一步地，所述步骤2中分别制备质量浓度为0.8~1%的胶原溶液和质量浓度为0.4~0.8%的胶原溶液，其工艺为：按0.1~2g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第一溶液，同时按丝素蛋白和/或硫酸软骨素和/或壳聚糖共0.1~2g溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第二溶液，将第一和第二溶液按一定比例混合，从而分别制备成质量百分浓度为0.8~1%的胶原溶液和质量百分浓度为0.4~0.8%的胶原溶液。
进一步地，所述步骤1制备加载有功能因子的缓释微球是指制备加载抗生素的微球和/或加载皮肤因子的微球，其工艺为：是将一定量的抗生素或皮肤因子的水溶液与PLA或者PLGA或者PGA的二氯甲烷DCM溶液混合，搅拌乳化制得内乳液后，同进将去离子水中加入聚山梨醇酯-80搅拌至分散均匀制得外水相，将内乳液加入外水相，搅拌乳化制得复乳液，进一步搅拌使DCM挥发，经洗涤分离得到加载抗生素的微球悬液或者加载皮肤因子的微球悬液。
本发明的有益效果：一方面，引入了制备两层孔隙率不同的支架，这样的梯度结构有利于引导皮肤组织的长入。另一方面，我们引入了加载功能因子的缓释微球，有效改善人工真皮支架促进创面修复、抗感染，或其它功能。
特别地在深层，加载抗生素的微球被加入，通过缓释抗生素以防止创面修复过程中，尤其是前期的感染，以实现抗生素的长效作用，用以克服感染。在浅层，加载皮肤生长因子的微球被加入，通过缓释皮肤生长因子以促进皮肤的修复，以促进创面愈合。这种人工真皮支架被称为双因子缓释人工真皮支架，具有抗菌活性和促进创面愈合的特性。整个真皮支架采用天然高分子制备成多孔支架结构。
本发明的制备方法，深层和浅层采用不同浓度逐层注模成型，形成梯度多孔支架，有利引导组织长入。且两层加载不同药物的微球，达到两层不同的功能。
特别地深层药物释放防止感染，浅层释放促进修复。
具体实施方式
本发明的人工真皮支架包括深层和浅层的两个层次的三维多孔结构，该两层孔隙率不同，浅层偏低，深层偏高，从而形成梯度结构。这样的梯度结构有利于引导皮肤组织的长入。在一具体实施方式中，深层的孔隙率为85～98%，孔径主要分布在100～300μm之间；浅层的孔隙率为75～95%，孔径主要分布在50～250μm之间。
进一步地，本发明的人工真皮支架引入了加载有功能因子的缓释微球，所述缓释微球包括但不限于加载抗生素的微球和/或加载皮肤生长因子的微球。最佳地，在深层，加载抗生素的微球被加入，通过缓释抗生素以防止创面修复过程中，尤其是前期的感染；在浅层，加载皮肤生长因子的微球被加入，通过缓释皮肤生长因子以促进皮肤的修复，从而形成本发明创造的双因子缓释人工真皮支架。
所述载抗生素微球的基体原料可选择聚乳酸PLA，乙醇酸-乳酸共聚物PLGA，聚乙醇酸PGA中的一种或几种的组合。抗生素可选择庆大霉素、万古霉素、青霉素等中的一种或几种的组合。也可根据具体需要来选择微球基体原料以及抗生素的种类。载抗生素微球的平均粒径为100nm～200μm。
所述载皮肤生长因子的微球的基体原料可选择聚乳酸PLA，乙醇酸-乳酸共聚物PLGA，聚乙醇酸PGA中的一种或几种的组合。所述皮肤生长因子可选择但不限于：表皮生长因子EGF或血管内皮细胞生长因子VEGF中的一种或两种。载皮肤生长因子微球的平均粒径为200nm～500μm。
本发明的人工真皮支架的两个层次的三维多孔结构的制备原料为胶原，或胶原与壳聚糖、硫酸软骨素、丝素蛋白之一种或几种的复合物。优选地，胶原在复合物中的质量分数为50～98%，其于成分为壳聚糖和/或硫酸软骨素和/或丝素蛋白。
本发明实施例所制备的人工真皮支架具有缓释抗生素和皮肤生长因子的特性，释放出的药物保持生物活性。一方面，引入了深层及浅层孔隙率不同的支架，这种梯度结构有利于引导皮肤组织的长入。另一方面，引入了缓释微球，在浅层，加载皮肤生长因子的微球被加入，通过缓释皮肤生长因子以促进皮肤的修复；在深层，加载抗生素的微球被加入，通过缓释抗生素以防止创面修复过程中尤其是前期的感染，且实现抗生素的长效作用，以克服感染。这种双因子缓释人工真皮支架，具有抗菌活性和促进创面愈合的特性，具有较好的诱导自体皮肤组织修复能力，可有效地在创面修复过程中防止创面因为内源或外源性的感染。整个真皮支架采用天然高分子制备成多孔支架结构。
可以理解，作为上述实施例的变换方式，所述双因子缓释微球（缓释抗生素和缓释皮肤生长因子）也可选择性地加载于浅层或深层二者之一，或者加载于同一层次。本发明的人工真皮支架制备方法主要包括的步骤如下文进行具体的描述。
步骤1：制备加载有功能因子的缓释微球，所述缓释微球可包括但不限于加载抗生素的微球和/或加载皮肤因子的微球。
其中，步骤1制备载抗生素的微球的工艺实例中，先取0.4mL的10~200mg/mL的抗生素如庆大霉素或万古霉素或青霉素等的超纯水溶液至4mL的PLA或者PLGA或者PGA浓度为20~200mg/mL的二氯甲烷DCM溶液，用内切式匀浆机以3000~5000rpm的转速乳化30~60秒，制得内乳液(即油包水乳液w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80（聚山梨酯-80），机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以3000~8000rpm的转速乳化30~90秒，制得复乳液(即水包油包水乳液w/o/w)；将该液中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜。离心后，水洗三次，得到加载抗生素的微球悬液。
步骤1制备载皮肤因子的微球的工艺实例中，先取0.2mL的0.01~100mg/mL的皮肤因子如表皮生长因子EGF或血管内皮细胞生长因子VEGF等的超纯水溶液至2mL的聚乳酸（PLA）或者乙醇酸-乳酸共聚物（PLGA）或者聚乙醇酸（PGA）浓度为20~200mg/mL的二氯甲烷（DCM）溶液，用内切式匀浆机以3000~5000rpm的转速乳化30~60秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80（吐温80），机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以3000~8000rpm的转速乳化30~90秒，制得复乳液(w/o/w); 将该液中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜。离心后，水洗三次，得到加载皮肤因子的微球悬液。
可以理解，可以根据现有技术的其它工艺来制备加载抗生素的微球和加载皮肤因子的微球。另外，根据具体的临床需要，也可以选择和制备加载其它功能因子的缓释微球。
步骤2：制备两种质量浓度的胶原溶液作为基体溶液，较佳地，分别制备总质量百分浓度为0.8~1%的胶原溶液和总质量百分浓度为0.4~0.8%的胶原溶液；更优选地，所述胶原溶液中复合有丝素蛋白和/或硫酸软骨素和/或壳聚糖。
其中，制备质量分数为0.8~1%的胶原与丝素蛋白和/或硫酸软骨素和/或壳聚糖复合的溶液的工艺为：按每0.1~2g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液配比比例配制第一溶液，同时按丝素蛋白和/或硫酸软骨素和/或壳聚糖总量为0.1~2g溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液的比例配制第二溶液，选取适宜配比将第一、二溶液混和配制成总的质量百分浓度为0.8~1%的复合胶原溶液。
制备质量分数为0.4~0.8%的胶原与丝素蛋白或硫酸软骨素或壳聚糖复合的溶液的工艺为：按每0.1~2 g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第一溶液，同时按丝素蛋白和/或硫酸软骨素和/或壳聚糖总质量0.1~2 g溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液的比例配制第二溶液，选取适宜配比将第一、二溶液混和制得总的质量百分浓度为0.4~0.8%的复合胶原溶液。
步骤3：将加载有功能因子的缓释微球混于相应的基体溶液，并成型包括深层和浅层两个层次的三维多孔结构，从而形成引入了加载有功能因子缓释微球的人工真皮支架。
所述成型两个层次的三维多孔结构的工艺，是将所述一种浓度的胶原溶液或其中混有加载功能因子缓释微球，注入一定深度的模具中，淌平后静置一定时间形成第一层次；之后再将另一种浓度的胶原溶液或其中混有加载功能因子缓释微球，注入模具中的所述第一层次之上，再淌平后静置一定时间形成第二层次；接着将模具置于-60~-80℃冷冻，然后冷冻干燥从而得到本发明的双层真皮支架。更优选地，将制备得到的载抗生素的微球悬液混入质量分数为0.4~0.8%的复合胶原溶液中形成第一混合溶液，以5~35g第一混合溶液且其中含微球20~200mg注入深度为5mm的正方体不锈钢模具中，淌平后静置1~10分钟形成第一层次；将制备得到的载皮肤因子的微球悬液混入质量分数为0.8~1%的复合胶原溶液中形成第二混合溶液，以5~35g该第二混合溶液且其中含微球5-100mg注入前述已淌平的第一层次上，再次淌平后静置1~10分钟形成第二层次，迅速置于-60~-80℃冷冻，然后冷冻干燥得到本发明双因子缓释双层人工真皮支架。其中第一层次对应形成人工真皮支架的深层，第二层次对应形成浅层。可以理解，模具的形状、尺寸、材质可根据不同需要进行灵活选择。
下面举例进一步阐明本发明双因子缓释人工真皮支架的制备方法。
实例 1
一种双因子缓释人工真皮支架的制备方法为：
首先，制备载抗生素的PLGA微球：取0.4mL的10mg/mL的庆大霉素的超纯水溶液至4mL的PLGA的DCM溶液，用内切式匀浆机以3000rpm的转速乳化30秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以3000rpm的转速乳化30秒，制得复乳液(w/o/w)；将该复乳液以中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜。离心后，水洗三次，得到加载抗生素的PLGA微球悬液；
同时，制备载皮肤因子的微球：取0.2mL的0.01mg/mL的表皮生长因子(EGF)的超纯水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用内切式匀浆机以5000rpm的转速乳化60秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以8000rpm的转速乳化90秒，制得复乳液(w/o/w)；将该复乳液以中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜；离心后，水洗三次，得到加载表皮生长因子的PLA微球悬液；
然后，制备复合人工真皮支架：将已制备的载庆大霉素的PLGA微球和载表皮生长因子的PLA微球复合进胶原与丝素蛋白的复合真皮支架，其具体实施的工艺步骤如下：
（1）制备质量分数为0.8%的胶原与丝素蛋白的胶原复合溶液：将0.1g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将1.513g丝素蛋白溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将两溶液混和均匀配制成总的质量浓度为0.8%的复合溶液；
（2）制备质量分数为0.4%的胶原与丝素蛋白的复合胶原溶液：将0.1g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将0.7032g丝素蛋白溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将两溶液混和均匀配制成总的质量浓度为0.4%的复合溶液；
（3）制备载微球的双层真皮支架，其具体包括的工艺步骤为：
a. 将制备得到的载抗生素的PLGA微球悬液混入质量浓度为0.8%的胶原与丝素蛋白的复合溶液中形成混合溶液，以5g该混合溶液其中含50mgPLGA微球注入深度为5mm的正方体不锈钢模具中，淌平后静置1分钟，形成第一层次；
b. 将制备得到的加载表皮生长因子的PLA微球悬液混入质量分数为0.4%的胶原与丝素蛋白的复合溶液中形成混合溶液，以该混合溶液15g其中含5mgPLGA微球注入a中已淌平的复合液之上，再次淌平后静置3分钟形成第二层次；迅速将模具置于-60~-80℃冷冻，然后冷冻干燥得到双层真皮支架，其中第一层次形成深层，第二层次形成浅层。
本例中制备的双因子人工真皮支架包括深层和浅层的两个层次的三维多孔结构，该两层孔隙率不同，浅层偏低，深层偏高，从而形成梯度结构。经实验检测可得，其中深层的孔隙率为85～98%，孔径主要分布在100～300μm之间，浅层的孔隙率为75～95%，孔径主要分布在50～250μm之间。
该双因子缓释人工真皮支架的深层引入加载抗生素的微球，通过缓释抗生素以防止创面修复过程中的感染；在浅层引入加载皮肤生长因子的微球，通过缓释皮肤生长因子以促进皮肤的修复。当该双层真皮支架用于Ⅲ度烧伤创面切痂后植皮时，可有效减少前期的感染，同时缩短创面修复的周期。
实例 2
一种双因子缓释人工真皮支架的制备方法为：
首先，制备载抗生素的PLGA微球：取0.4mL的200mg/mL的青霉素的超纯水溶液至4mL的PGA的DCM溶液，用内切式匀浆机以5000rpm的转速乳化60秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以8000rpm的转速乳化90秒，制得复乳液(w/o/w)；将该复乳液以中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜。离心后，水洗三次，得到加载青霉素的PGA微球悬液；
同时，制备载皮肤因子的微球：取0.2mL的100mg/mL的血管内皮(细胞)生长因子(VEGF)的超纯水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用内切式匀浆机以3000rpm的转速乳化30秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以8000rpm的转速乳化90秒，制得复乳液(w/o/w)；将该液中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜，离心后，水洗三次，得到加载血管内皮(细胞)生长因子的PLA微球悬液；
然后，制备复合人工真皮支架：将已制备的载抗生素的微球和载皮肤因子的微球复合进胶原与硫酸软骨素的复合真皮支架，其具体实施的工艺步骤如下：
（1）制备质量浓度为1%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液：将1.5g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将0.52g硫酸软骨素溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将这两溶液混和配制成总的质量浓度为1%的复合溶液；
（2）制备质量浓度为0.8%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液：将1.2g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将1.61g硫酸软骨素溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将这两溶液混和制得总的质量浓度为0.8%的复合溶液；
（3）制备载微球的双层真皮支架，其具体实施的工艺步骤如下：
a. 将制备得到的加载青霉素的PGA微球悬液混入质量浓度为0.8%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液中形成混合溶液，以20g该混合溶液其中含200mgPLGA微球注入深度为5mm的正方体不锈钢模具中，淌平后静置2分钟形成第一层；
b. 将制备得到的加载血管内皮(细胞)生长因子的PLA微球悬液混入质量浓度为1%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液中形成混合溶液，以20g该混合溶液其中含100mgPLGA微球注入a中已淌平的第一层之上，再次淌平后静置3分钟形成第二层；迅速置于-60~-80℃冷冻，然后冷冻干燥得到双层真皮支架，其中第一层次形成深层，第二层次形成浅层。
本例中制备的双因子人工真皮支架包括深层和浅层的两个层次的三维多孔结构，该两层孔隙率不同，浅层偏低，深层偏高，从而形成梯度结构。经实验检测可得，其中深层的孔隙率为85～98%，孔径主要分布在100～300μm之间，浅层的孔隙率为75～95%，孔径主要分布在50～250μm之间。
该双因子缓释人工真皮支架的深层引入加载抗生素的微球，通过缓释抗生素以防止创面修复过程中的感染；在浅层引入加载皮肤生长因子的微球，通过缓释皮肤生长因子以促进皮肤的修复。当该双层真皮支架用于Ⅲ度烧伤创面切痂后植皮时，可有效减少前期的感染，同时缩短创面修复的周期。
实例 3
一种双因子缓释人工真皮支架的制备方法为：
首先，制备载抗生素的PLGA微球：取0.4mL的50mg/mL的万古霉素的超纯水溶液至4mL的PGA的DCM溶液，用内切式匀浆机以4000rpm的转速乳化30秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以5000rpm的转速乳化60秒，制得复乳液(w/o/w); 将该复乳液以中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜，离心后，水洗三次，得到加载万古霉素的PGA微球悬液；
同时，制备载皮肤因子的微球：取0.2mL的100mg/mL的血管内皮(细胞)生长因子(VEGF)的超纯水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用内切式匀浆机以4000rpm的转速乳化50秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以5000rpm的转速乳化60秒，制得复乳液(w/o/w)；将该复乳液中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜，离心后，水洗三次，得到加载血管内皮(细胞)生长因子的PLA微球悬液；
然后，制备复合人工真皮支架：将已制备的载抗生素的微球和载皮肤因子的微球复合进胶原与硫酸软骨素的复合真皮支架，其具体的工艺步骤如下：
（1）制备质量浓度为0.9%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液：将1.5g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将0.32g硫酸软骨素溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将这两溶液混和配制成总的质量浓度为0.9%的复合溶液；
（2）制备质量浓度为0.7%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液：将1.2g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将0.21g硫酸软骨素溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将这两溶液混和制得总的质量浓度为0.7%的复合溶液；
（3）制备载微球的双层真皮支架，其具体的工艺步骤如下：
a. 将制备得到的加载万古霉素的PGA微球悬液混入质量浓度为0.8%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液中形成混合液，以15g该混合液其中含100mgPLGA微球注入深度为5mm的正方体不锈钢模具中，淌平后静置2分钟，形成第一层次；
b. 将制备得到的加载血管内皮(细胞)生长因子的PLA微球悬液混入质量浓度为1%的胶原与硫酸软骨素的复合溶液中形成混合液，以25g该混合液其中含50mgPLGA微球注入a中已淌平的复合溶液形成的第一层次之上，再次淌平后静置3分钟形成第二层次；迅速置于-60~-80℃冷冻，然后冷冻干燥得到双层真皮支架，其中第一层次形成深层，第二层次形成浅层。
本例中制备的双因子人工真皮支架包括深层和浅层的两个层次的三维多孔结构，该两层孔隙率不同，浅层偏低，深层偏高，从而形成梯度结构。经实验检测可得，其中深层的孔隙率为85～98%，孔径主要分布在100～300μm之间，浅层的孔隙率为75～95%，孔径主要分布在50～250μm之间。
该双因子缓释人工真皮支架的深层引入加载抗生素的微球，通过缓释抗生素以防止创面修复过程中的感染；在浅层引入加载皮肤生长因子的微球，通过缓释皮肤生长因子以促进皮肤的修复。当该双层真皮支架用于Ⅲ度烧伤创面切痂后植皮时，可有效减少前期的感染，同时缩短创面修复的周期。
实例 4
一种双因子缓释人工真皮支架的制备方法为：
首先，制备载抗生素的PLGA微球：取0.4mL的50mg/mL的万古霉素的超纯水溶液至4mL的PGA的DCM溶液，用内切式匀浆机以3000rpm的转速乳化20秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以5000rpm的转速乳化60秒，制得复乳液(w/o/w)；将该复乳液以中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜。离心后，水洗三次，得到加载万古霉素的PGA微球悬液；
同时，制备载皮肤因子的微球：取0.2mL的100mg/mL的血管内皮(细胞)生长因子(VEGF)的超纯水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用内切式匀浆机以3000rpm的转速乳化50秒，制得内乳液(w/o)；在30mL去离子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，机械搅拌至分散均匀，制得外水相；将内乳液加入外水相，用内切式匀浆机以5000rpm的转速乳化70秒，制得复乳液(w/o/w)；将该液中速搅拌3小时待DCM挥发，静置过夜，离心后，水洗三次，得到加载血管内皮(细胞)生长因子的PLA微球悬液；
然后，制备复合人工真皮支架：将已制备的载抗生素的微球和载皮肤因子的微球复合进胶原与硫酸软骨素的复合真皮支架，其具体的制备工艺步骤如下：
（1）制备质量浓度为0.9%的胶原与壳聚糖的复合溶液：将1.4g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将0.42g壳聚糖溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将这两溶液混和配制成总的质量浓度为0.9%的复合溶液；
（2）制备质量浓度为0.7%的胶原与壳聚糖的复合溶液：将1.3g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，同时将0.11g壳聚糖溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液，将这两溶液混和制得总的质量浓度为0.7%的复合溶液；
（3）制备载微球的双层真皮支架，其具体包括的制备工艺为：
a. 将制备得到的加载万古霉素的PGA微球悬液混入质量浓度为0.8%的胶原与壳聚糖的复合溶液中形成混合液，以15g该混合液其中含50mgPLGA微球注入深度为5mm的正方体不锈钢模具中，淌平后静置2分钟形成第一层次；
b. 将制备得到的加载血管内皮(细胞)生长因子的PLA微球悬液混入质量浓度为1%的胶原与壳聚糖的复合溶液中形成混合液，以25g该混合液其中含50mgPLGA微球注入a中已淌平的复合溶液形成的第一层次之上，再次淌平后静置3分钟形成第二层次；迅速置于-60~-80℃冷冻，然后冷冻干燥得到双层真皮支架，其中第一层次形成深层，第二层次形成浅层。
本例中制备的双因子人工真皮支架包括深层和浅层的两个层次的三维多孔结构，该两层孔隙率不同，浅层偏低，深层偏高，从而形成梯度结构。经实验检测可得，其中深层的孔隙率为85～98%，孔径主要分布在100～300μm之间，浅层的孔隙率为75～95%，孔径主要分布在50～250μm之间。
该双因子缓释人工真皮支架的深层引入加载抗生素的微球，通过缓释抗生素以防止创面修复过程中的感染；在浅层引入加载皮肤生长因子的微球，通过缓释皮肤生长因子以促进皮肤的修复。当该双层真皮支架用于Ⅲ度烧伤创面切痂后植皮时，可有效减少前期的感染，同时缩短创面修复的周期。
Claims (10)
1.一种人工真皮支架，包括深层和浅层两个层次的三维多孔结构，该人工真皮支架引入了加载有功能因子的缓释微球。
2.如权利要求1所述的人工真皮支架，其特征在于：所述加载有功能因子的缓释微球包括加载抗生素的微球和/或加载皮肤生长因子的微球；所述人工真皮支架的三维多孔结构因深层和浅层孔隙率不同而形成梯度结构，所述浅层孔隙率低于深层孔隙率。
3.如权利要求2所述的人工真皮支架，其特征在于：在所述深层，加载抗生素的微球被加入；在所述浅层，加载皮肤生长因子的微球被加入，从而形成双因子缓释人工真皮支架。
4.如权利要求2所述的人工真皮支架，其特征在于：所述加载抗生素微球的基体原料选自聚乳酸，乙醇酸-乳酸共聚物，聚乙醇酸中的一种或几种的组合；抗生素选自庆大霉素、万古霉素、青霉素中的一种或几种的组合；所述载皮肤生长因子的微球的基体原料选自聚乳酸，乙醇酸-乳酸共聚物，聚乙醇酸中的一种或几种的组合；所述皮肤生长因子选自表皮生长因子或血管内皮细胞生长因子中的一种或两种；人工真皮支架三维多孔结构的制备原料为胶原、或胶原与壳聚糖、硫酸软骨素、丝素蛋白之一种或几种的复合而成的复合物。
5.如权利要求4所述的人工真皮支架，其特征在于：所述复合物中胶原质量分数为50～98%。
6.如权利要求1所述的人工真皮支架，其特征在于：所述深层的孔隙率为85～98%，孔径主要分布在100～300μm之间；浅层的孔隙率为75～95%，孔径主要分布在50～250μm之间。
7.如权利要求1~6中任一项所述的人工真皮支架，其制备方法包括以下步骤：
步骤1：制备加载有功能因子的缓释微球；
步骤2：制备一定浓度的胶原溶液作为基体溶液；
步骤3：将加载有功能因子的缓释微球混于相应的基体溶液，并成型包括深层和浅层两个层次的三维多孔结构，从而形成引入了加载有功能因子缓释微球的人工真皮支架。
8.如权利要求7所述的人工真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤2是分别制备两种质量浓度的基体溶液；所述步骤3中成型两个层次的三维多孔结构的工艺：是将所述一种浓度的胶原溶液或其中混有加载功能因子缓释微球，注入一定深度的模具中，淌平后静置一定时间形成第一层次；之后再将另一种浓度的胶原溶液或其中混有加载功能因子缓释微球，注入模具中所述第一层次之上，再淌平后静置一定时间形成第二层次；接着将模具置于一定温度下冷冻，然后冷冻干燥从而得到本发明的双层真皮支架。
9.如权利要求8所述的人工真皮支架的制备方法，其特征在于：步骤1所述缓释微球包括加载抗生素的微球和/或加载皮肤因子的微球；步骤2中是分别制备总质量百分浓度为0.8~1%的胶原溶液和总质量百分浓度为0.4~0.8%的胶原溶液；步骤3中，是将制备得到的载抗生素的微球悬液混入质量百分浓度为0.4~0.8%的胶原溶液中形成第一混合溶液，以每5~35g第一混合溶液且其中含微球20~200mg的质量比例注入模具中，淌平后静置一定时间形成所述第一层次；将制备得到的载皮肤因子的微球悬液混入质量百分浓度为0.8~1%的胶原溶液中形成第二混合溶液，以每5~35g第二混合溶液且其中含微球5-100mg的质量比例注入已淌平的第一层次之上，再次淌平后静置一定时间形成所述的第二层次，经冷冻，然后冷冻干燥得到双因子缓释双层人工真皮支架；所述第一层次对应形成人工真皮支架的深层，第二层次对应形成浅层。
10.如权利要求7所述的人工真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤2中分别制备质量浓度为0.8~1%的胶原溶液和质量浓度为0.4~0.8%的胶原溶液，其工艺为：按0.1~2g胶原溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第一溶液，同时按丝素蛋白和/或硫酸软骨素和/或壳聚糖共0.1~2g溶解于100mL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第二溶液，将第一和第二溶液按一定比例混合，从而分别制备成质量百分浓度为0.8~1%的胶原溶液和质量百分浓度为0.4~0.8%的胶原溶液；所述步骤1制备加载有功能因子的缓释微球是指制备加载抗生素的微球和/或加载皮肤因子的微球，其工艺为：是将一定量的抗生素或皮肤因子的水溶液与PLA或者PLGA或者PGA的二氯甲烷DCM溶液混合，搅拌乳化制得内乳液后，同时将去离子水中加入聚山梨醇酯-80搅拌至分散均匀制得外水相，将内乳液加入外水相，搅拌乳化制得复乳液，进一步搅拌使DCM挥发，经洗涤分离得到加载抗生素的微球悬液或者加载皮肤因子的微球悬液。
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