KR102189616B1 - 운동 종말판 및 기타 특화 조직 구조의 형성을 위한 바이오스캐폴드 - Google Patents

운동 종말판 및 기타 특화 조직 구조의 형성을 위한 바이오스캐폴드 Download PDF

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존 비 스콧
벤자민 티 코노나
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Abstract

본원에서 제공되는 것은 조직 상의 기능성 클러스터, 예를 들면 골격근 세포 또는 조직상의 운동 종말판 (MEP) 또는 그의 구성요소의 형성을 촉진하는 데에 유용한 스캐폴드 및 방법은 물론, 그렇게 제조된 스캐폴드의 조직 손상 또는 결함을 복구하는 것을 위한 용도이다.

Description

운동 종말판 및 기타 특화 조직 구조의 형성을 위한 바이오스캐폴드{BIOSCAFFOLDS FOR FORMATION OF MOTOR ENDPLATES AND OTHER SPECIALIZED TISSUE STRUCTURES}
[관련 출원]
본 출원은 2011년 9월 30일자 U.S. 가출원 제61/541,652호의 우선권을 주장하는 바, 그 전체가 본원에 참조로써 개재된다.
[분야]
본 개시는 대상 작용제(agent)의 전달을 지지하는 데에 유용한 생체재료 구성체(construct)에 관한 것이다.
비제한적으로 수술, 염증, 외상성 손상 및 질환을 포함한 일련의 선천성 또는 후천성 이상으로 인한 근육 결손은 회복불가능한 근육 기능의 상실로 이어질 수 있다. 그와 같은 결함으로 고통받고 있는 사람들을 위하여, 현재 몇 가지 가용한 임상적 치료법들이 존재한다.
[선행기술문헌]
US2009/0035349A1
US2006/0045903A1
US2005/0095298A1
세포의 부착, 성장 및/또는 증식을 지지하며 자연 골격근의 일부 특징들을 가지고 있는 재료 (예컨대 중합체 또는 천연 스캐폴드(scaffold))를 사용하여 새로 골격근과 같은 근육 조직을 재생 또는 재-생성시키기 위한 세포-기반의 접근법들이 연구되어 왔다. 그러나, 특히 손상 또는 질환의 크기가 나머지 생육가능 조직의 재생 용량을 상당히 초과하는 경우 (예컨대 외상성 손상에 기인하는 대규모 근육 상실), 기능성인 근육 조직을 생성시키는 더 우수한 치료적 해결책이 요구되고 있다.
[발명의 개요]
본원에서 제공되는 것은 골격근 조직에서의 운동 종말판(motor endplate) (MEP) 또는 그의 구성요소와 같은 조직상 기능성 클러스터(cluster)의 형성을 촉진하는 데에 유용한 방법이다. 일부 실시양태에서, 근육 조직상에서의 아세틸콜린 수용체 클러스터의 촉진은 조직 조작된 구성체의 이식 전 및 후에 다핵 근관(myotube)의 포함, 성숙한 근육 마커 (예컨대 미오게닌(myogenin), MHC, 티틴(titin) 등)의 발현과 같은 근육 표현형을 촉진함으로써, 생체 내에서 신경재분포(re-innervation)가 이루어질 때 조직 조작 이식체가 계속 기능할 수 있으며, 바람직하게는 더욱 최적으로 기능할 수 있다.
역시 본원에서 제공되는 것은 거기에서 세포를 성장시키는 데에 유용한 스캐폴드이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 스캐폴드 내 또는 스캐폴드 상의 분리된 개별 위치에 1종 이상의 대상 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 스캐폴드 내에 또는 스캐폴드 상에 비드 (예컨대 마이크로비드 또는 나노비드)를 포함하며, 여기서 상기 비드는 대상 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상 작용제는 공유 결합을 통하여 비드 상에 도입된다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 골격근 세포 스캐폴드 또는 심근 세포 스캐폴드이다. 일부 실시양태에서, 대상 작용제는 아그린(agrin)이다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 피브린, 콜라겐, 아가로스, 셀룰로스, 알기네이트, 아가로스, 케라틴, 히드록시메틸 셀룰로스 또는 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트)를 포함한다.
역시 제공되는 것은 본원에서 기술되는 바와 같은 스캐폴드를 제공하는 것, 및 상기 스캐폴드 상에 세포 (예컨대 근육모세포 또는 위성 세포와 같은 근육 세포)를 접종하는 것을 포함하는 골격근 이식체(implant)의 제조 방법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 공여자 조직으로부터 근육 세포를 단리하는 것도 포함한다.
추가적으로 제공되는 것은 하기의 단계들 중 하나 이상을 포함하는, 스캐폴드 내에 또는 스캐폴드 상에 비드를 포함하는 스캐폴드의 제조 방법이다: 대상 작용제를 포함하는 비드를 포함하는 재료 (예컨대 히드로겔(hydrogel))를 제공하는 단계; 상기 재료를 주형(template) (예컨대 섬유 주형) 상에 적용하는 단계; 주형 주변의 재료를 중합시켜 중합된 재료를 형성시키는 단계; 및 이후 주형을 선택적으로 용해시켜 중합된 재료 내에 중공 공간 (예컨대 중공 튜브)를 생성시키는 단계.
역시 추가적으로 제공되는 것은 조직화된 골격근 조직을 생성시키기에 충분한 시간 동안 시험관 내에서 스캐폴드 상에 근육 세포를 주기적으로 연신 및 이완시키는 것을 포함하며; 또한 상기 스캐폴드 내 또는 스캐폴드 상의 분리된 개별 위치에는 아그린을 포함하고, 상기 아그린은 상기 분리된 개별 위치 중 1개 이상에 인접한 조직화된 골격근에서 응집된 아세틸콜린 수용체의 형성을 촉진하기에 효과적인 양으로 제공되는, 전구체 근육 세포 (예컨대 근육모세포 또는 위성 세포)로부터의 조직화된 골격근 조직의 배양 방법이다.
일부 실시양태에서, 분리된 개별 위치는 조직화된 골격근 조직에 형성된 근관에 대하여 1:10 내지 10:1 사이의 비, 또는 대략 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1의 비로 제공된다.
역시 제공되는 것은 상기 조직화된 골격근 조직을 생성시키기에 충분한 시간 동안 시험관 내에서 피브린 또는 피브리노겐 스캐폴드 상에 접종된 해당 근육 세포를 주기적으로 연신 및 이완시키는 것을 포함하며, 상기 스캐폴드는 제1 축을 따라 정렬된 다수의 채널을 포함하는, 전구체 근육 세포로부터의 조직화된 골격근 조직의 배양 방법이다.
추가적으로 제공되는 것은 본원에서 교시되는 바와 같은 방법에 의해 생성되는 다층 골격근 조직이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 연장된 다핵 근육 섬유를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 아세틸콜린 (ACh) 수용체를 포함하거나 발현한다. 일부 실시양태에서, 조직은 응집된 ACh 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 운동 종말판의 프레첼 형상 특징을 형성하는 응집된 ACh 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 상기 연장된 다핵 근육 섬유에 대하여 10:1 및 1:10, 또는 5:1 내지 1:5 사이, 또는 1:2 내지 2:1 사이의 비인 응집된 ACh 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 봉합가능하다.
역시 추가적으로 제공되는 것은 본원에서 기술되는 바와 같은 조작된 조직을 치료-효과적인 배열구조로 대상체에 이식하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체에서의 골격근 손상 또는 결함의 치료 방법이다.
역시 제공되는 것은 골격근 손상 또는 결함을 복구하는 데에 사용하기 위한, 본원에서 교시되는 바와 같은 조작된 조직이다.
본원에서 제공되는 것은 골격근 조직에서의 운동 종말판(motor endplate) (MEP) 또는 그의 구성요소와 같은 조직상 기능성 클러스터(cluster)의 형성을 촉진하는 데에 유용한 방법이다. 일부 실시양태에서, 근육 조직상에서의 아세틸콜린 수용체 클러스터의 촉진은 조직 조작된 구성체의 이식 전 및 후에 다핵 근관(myotube)의 포함, 성숙한 근육 마커 (예컨대 미오게닌(myogenin), MHC, 티틴(titin) 등)의 발현과 같은 근육 표현형을 촉진함으로써, 생체 내에서 신경재분포(re-innervation)가 이루어질 때 조직 조작 이식체가 계속 기능할 수 있으며, 바람직하게는 더욱 최적으로 기능할 수 있다.
도 1a-1b는 피브린 히드로겔 스캐폴드 형성의 개략적인 예를 제공하는 것으로써 (A), 세포가 접종되어 있거나, 및/또는 작용제 제시 (삼각형)를 통한 아세틸콜린 수용체 작용제 자극을 제공할 수 있는 폴리스티렌 비드를 함유하는 것 (B)일 수 있다.
도 2는 피브린 히드로겔 상에서 배양된 C2C12 세포에 대한 아그린-제시 비드의 효과를 기록한다. 아그린이 첨가되어 있지 않은 마이크로입자 비드 전달 비히클은 처리된 세포에서 반응을 산출하지 않는다 (A). 비드 표면에 아그린을 물리적으로 흡착시키는 것은 세포와 비드 전달 비히클 사이 접촉 영역에서의 1일 처리 후 막-결합 아세틸콜린 수용체에서 공간적으로 표적화된 클러스터화 반응의 유도를 가능케 한다 (B). 아그린-흡착된 비드는 3일 처리 후 클러스터화 반응을 생성시키는 데에 비효과적이지만 (데이터 미도시), EDAC/술포-NHS 공유 가교결합 화학을 사용하여 마이크로입자 표면에 아그린을 결합시키는 것은 처리 5일차 (C) 또는 그 이후에 클러스터화 거동의 유도를 가능케 한다. 점선은 초점 평면에서의 대략적인 세포-접종 영역을 나타내며, 화살표는 아세틸콜린 수용체 클러스터화의 중심을 나타낸다. 비드가 존재하는 경우, 모든 영역에서 클러스터화가 이루어짐으로써, 클러스터화 거동을 촉진함에 있어서의 아그린-제시 비드의 중요성을 표시해준다. 결과는 또한 비드 표면에의 아그린의 흡착은 단기 적용분야에 탁월한 반면, 아그린과 비드 사이의 공유 가교결합은 장기간의 세포 신호전달을 가능케 한다는 것을 시사한다.
도 3a-3b는 105 ㎛ 주형을 사용하여 신경 적용분야용으로 pMMA 주형 및 피브린으로부터 제작된 스캐폴드의 주사 전자 현미경 (SEM) 영상을 나타낸다.
도 4는 아그린-전달 마이크로입자를 사용한 5일 처리에 반응하여 근관-유사 세포 막에서 클러스터화되는 수용체를 나타낸다. 공초점 영상화는 평면외(out-of-plane) 신호를 제거함으로써 매우 얇은 조직 "슬라이스"의 영상을 산출한다. 3개 차원 모두의 구조에 걸친 신호의 전개를 나타내기 위하여, 연속 슬라이스가 사용될 수 있다. 마이크로입자 아래에서 시작하여 (A), 수직으로 진행하고 (B), 마이크로입자 수직 두께의 중심 부근에서 종료되는, (C) α-분가루스독소(alpha-bungarotoxin)를 사용한 형광 표지 현미경사진은 세포가 마이크로입자 접촉 영역에서 (염색되는) AChR 클러스터의 형성을 통하여 아그린 전달에 반응한다는 것을 보여준다. 점선 윤곽은 비드 표면에 공유 결합된 아그린을 포함하는 마이크로입자의 위치를 도시한다. 3개의 순차적인 하위-영상에 걸쳐 나타난 바와 같이, 클러스터화 거동은 접촉 영역에서의 비드 배향과 무관한데, 비드가 그것이 상부에, 측면에 또는 임의의 기울어진 각도로 접하여 있음을 동일하게 세포에 신호전달할 수 있음을 의미한다. 마찬가지로, 하나의 아그린-전달 입자가 다수의 인접 세포에 신호전달을 할 수 있는데, 하나의 세포에서의 반응의 산출이 그의 신호를 제공하는 아그린-커플링된 비드의 능력을 의미있게 고갈시키지는 않는다는 것을 나타낸다.
도 5는 패턴화된 피브린 스캐폴드의 근육모세포-유사 세포 접종의 효능을 도시한다. 스캐폴드는 희생용 pMMA 주형 주변에 트롬빈 및 칼슘 존재하에서의 피브리노겐의 중합을 통하여 제작하였다. 주형은 용해됨으로써, 거시적 피브린 생체재료 내의 중공 원통형 채널의 다공성 네트워크를 산출하였다. 스캐폴드의 상부에 (영상 좌측에서) 현탁액으로 첨가함으로써 C2C12 세포를 정적으로 접종하고, 성장 배지 중에서 1일 동안 배양한 후, 추가 10일 동안 근관-유사 표현형으로 분화시켰다. 시상 스캐폴드 단면의 저-배율 영상화는 DAPI 핵 염색에 의해 가시화하였을 때 세포가 성장 및 초기 분화 단계 동안의 이동에 의해 스캐폴드의 전체 두께에 (영상의 좌측에서 우측으로) 용이하게 집락화한다는 것을 보여준다. 스캐폴드 두께의 상부, 중간 및 저부 부근에서의 더 고-배율의 관찰은 근관-유사 세포가 스캐폴드 내에서 융합되어 아세틸콜린 수용체를 발현한다는 것을 드러낸다 (데이터 미도시).
본원에서 제공되는 것으로써 하기에서 추가 기술되는 것은 생체내 이식용으로 시험관 내에서 기능성 근육 조직을 생성시키는 데에 유용한 조성물 및 방법이다. 본원에서 인용되는 모든 특허 참고문헌의 개시내용은 그것이 본원에서 제시되는 개시내용과 부합하는 정도까지 의거 참조로써 개재된다.
본원에서 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 사용될 때, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 분명하게 다르게 표시되지 않는 한 복수의 형태 역시 포함하고자 하는 것이다. 또한, 화합물의 양, 투여량, 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 바와 같은 "약" 및 "대략"이라는 용어는 특정된 양의 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0.5 % 또는 심지어는 0.1 %의 변이를 포괄하여 의미하는 것이다. 또한, 본원에서 사용될 때, "및/또는" 또는 "/"는 관련하여 열거된 항목들 중 1종 이상의 임의의 모든 가능한 조합들은 물론, 선택사항 ("또는")으로 해석되는 경우에는 조합의 생략도 포괄하여 지칭한다.
"이식체"는 (예컨대 수의학 또는 의학적 (인간) 적용분야를 위하여) 대상체의 자연 조직(의 적어도 일부)를 복구, 증대 또는 대체하기 위하여 구성되는 생성물을 지칭한다. "이식가능한"이라는 용어는 장치가 환자 상에 또는 환자 내에 삽입, 매립, 이식 또는 다르게 만성적으로 부착되거나 위치될 수 있다는 것을 의미한다. 이식체는 세포가 상부에 접종되어 있거나 또는 그렇지 않거나, 및/또는 본원에서 기술되는 바와 같은 일부 실시양태에 따른 생체컨디셔닝(bioconditioning)에 적용되었거나 그렇지 않은 지지체를 포함한다.
"대상체"는 일반적으로 인간 대상체로써, "환자"를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있으며, 비제한적으로 백인, 아프리카계-미국인, 아프리카인, 아시아인, 히스패닉, 인디안 등을 포함하여, 임의의 인종 또는 민족인 대상체일 수 있다. 대상체는 태아, 신생아, 갓난아기, 유아, 어린이, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여, 임의 연령의 대상체일 수 있다.
대상체에는 또한 예를 들면 수의과 의학 및/또는 연구 또는 실험 목적의 동물 대상체, 특히 척추동물 대상체, 예를 들면 포유동물 대상체 예컨대 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 돼지, 설치류 (예컨대 래트 및 마우스), 토끼, 비-인간 영장류 등, 또는 어류 또는 조류 대상체가 포함될 수 있다.
"치료하다"는 대상체, 예를 들면 질환 (예컨대 근골격계 질환), 손상 또는 기타 장애 또는 결함을 앓고 있거나 그것이 발생할 위험성이 있는 환자에게 이익을 제공하는 임의 유형의 치료를 지칭한다. 치료하는 것에는 환자의 상태를 개선하거나 (예컨대 하나 이상의 증상의 경감), 질환의 발병 또는 진행을 지연하는 등의 목적으로 취하는 행동 및 삼가는 행동이 포함된다. 치료에는 현행 치료가 결함을 완전히 복구하지 못하는 사지 또는 안면의 대규모 근육 상실 또는 선천적 결함의 치료와 같은 골격근의 상실 또는 기능장애와 연관된 소정 질환 또는 손상의 치료가 포함된다. 다른 예에는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 소아마비-후 증후군, 근이영양증 등과 같은 질환 상태로 인한 골격근의 상실 또는 탈신경(denervation)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 치료하는 것에는 그를 필요로 하는 대상체에게 스캐폴드 (예컨대 근육 세포가 있거나 없는 비등방성 스캐폴드)를 이식하는 것에 의해 골격근 조직 (예를 들면 손상 또는 질환에 의해 해당 조직이 손상되거나 상실된 경우)을 재구성하는 것이 포함된다. 업계 숙련자라면 알고 있을 바와 같이, 스캐폴드는 예를 들면 손상 부위, 또는 그에 인접하여, 및/또는 대상체에게 이익을 제공할 수 있는 대상체의 또 다른 신체 부위에 이식될 수 있다.
본 발명을 수행하는 데에 사용되는 근육 세포는 업계에 알려져 있는 방법에 따라 단리될 수 있는데, 바람직하게는 비제한적으로 인간, 다른 영장류 예컨대 원숭이, 비비, 돼지, 양, 염소, 말, 개, 설치류 예컨대 마우스, 래트 등을 포함한 포유동물 근육 세포이다. 일반적으로, 그와 같은 세포는 골격근 세포이다. 조류, 어류, 파충류 및 양서류를 포함한 다른 종들의 골격근은 물론, 절지동물 및/또는 무척추동물 골격근 역시 그것을 원할 경우 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 세포, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 적절한 배양 조건 및 자극하에서 성숙한 다핵 근육 세포로 분화할 수 있는 세포이다. 근육 전구체 세포에 대해서는 알려져 있다. 예를 들면, U.S. 특허 제6,592,623호를 참조하라.
일부 실시양태에서는, 근육 조직으로부터 단리된 골격근 기원 세포가 사용된다. 일부 실시양태에서는, 줄기 세포가 사용되는데, 스캐폴드 상에의 접종 전 및/또는 후에 골격근 표현형으로 임의 분화될 수 있다. "골격근 세포"에는 근육모세포, 위성 세포 및 근관이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"근육모세포"는 서로 융합되어 근관을 발생시킬 수 있는 유형의 근육 전구 세포이다. 근육모세포는 위성 세포로부터 발생되는 것으로 생각되는데, 보통 척추동물 생물체에서의 그의 생명 주기 과정 동안 근섬유와 밀접하게 연관된다 (문헌 [Zammit et al., 2006; Journal of Histochemistry & Cytochemistry]). 근섬유가 손상되는 경우, 위성 세포가 활성화되어 근육모세포를 발생시키게 되는데, 그것은 추가적으로 분열되어 손상된 근육을 복구하거나 및/또는 새로운 섬유를 형성할 수 있다. 통상적으로, 근육 손상 후에는, 근섬유가 괴사성이 되어 대식세포에 의해 제거된다 (문헌 [Hurme et al. (1991) Healing of skeletal muscle injury: an ultrastructural and immunohistochemical study, Med. Sci Sports Exerc. 23, 801-810]). 이는 상기한 바와 같은 근육모세포의 증식 및 융합을 유도하여 다핵화 및 연장된 근관을 형성시키며, 그것은 자가-조립되어 더욱 조직화된 구조, 즉 근육 섬유를 형성한다 (문헌 [Campion (1984) The muscle satellite cell: a review, Int. Rev. Cytol. 87, 225-251]). 근육모세포는 표준 기술에 의해 적절한 공여자로부터 채취되어 단리될 수 있다.
"근관"은 보통 근육모세포의 융합에 의해 형성되는 연장된 다핵 세포이다. 근관은 통상적으로 말초에 위치된 핵 및 해당 세포질의 근피브릴(myofibril)을 가지는 (예컨대 포유동물에서 발견되는 바와 같음) 성숙한 근육 섬유로 발달될 수 있다.
본원에서 사용될 때의 "단리된"은 세포가 그의 자연 환경이 아닌 다른 조건에 위치된다는 것을 의미한다. 처음에 대상체, 예컨대 초대(primary) 체외이식편으로부터 단리될 때 조직 또는 세포는 "채취된다". 일 실시양태에서, 세포는 공여자 (예컨대 살아있거나 사체임)로부터 단리되거나, 또는 다른 세포 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일 실시양태에서, 세포는 근육으로부터 수득될 수 있다.
세포는 대상체와 관련하여 동계이거나(syngeneic) (즉 조직 이식 거부를 최소화하도록, 유전적으로 동일하거나 밀접하게 관련되어 있음), 동종이형이거나(allogeneic) (즉 동일 종의 유전적으로 동일하지 않은 구성원임) 또는 이계(xenogeneic) (즉 다른 종의 구성원임)일 수 있다. 동계인 세포에는 자가계열(autogeneic) 또는 자기유래(autologous) (즉 치료될 환자로부터 유래)인 것 및 동종계인(isogeneic) (즉 유전적으로 동일하나 다른 대상체, 예컨대 동일한 쌍둥이 유래) 것들이 포함된다. 세포는 예를 들면 공여자 (살아있거나 사체 중 어느 하나임)로부터 수득되거나, 또는 기존 세포 균주 또는 세포주로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 세포는 업계에 알려져 있는 표준 생검 기술을 사용하여 공여자 (예컨대 바이오스캐폴드 이식편의 잠재적 수용자)로부터 채취될 수 있다.
혈청 및 기타 미정 성분들을 포함하는 배지, 규정 배지, 또는 이들의 조합, 예컨대 RPMI, DMEM 등을 포함하는, 임의의 적합한 배양 배지를 본 발명에서 세포를 성장시키는 데에 사용될 수 있다.
"초대 배양"은 응집해제된 세포 또는 초대 체외이식편을 배양 용기에 접종한 후 확립되는 일차 배양이다. 본원에서 사용될 때의 "확장하는 것" 또는 "확장"은 생육가능 세포 수의 증가를 지칭한다. 확장은 예를 들면 세포들 중 적어도 일부가 분열되어 추가적인 세포를 생성시키는 1회 이상의 세포 주기를 통하여 세포를 "성장시키는 것"에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용될 때의 "성장시키는 것"에는 세포가 생육가능하게 유지되도록 하는 세포의 배양이 포함되는데, 세포의 확장 및/또는 분화는 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
"시험관 내에서 계대된" 또는 "계대된"은 보통 증식 속도에 따른 기계적 또는 효소적 응집해제, 재접종, 그리고 종종 2개 이상 자손 배양으로의 분열을 의미하는 이차 배양 용기로의 세포 배양의 전달 또는 하위배양을 지칭한다. 특정 유전형 또는 표현형에 대하여 군집이 선택되는 경우, 배양은 하위배양에 대한 "세포 균주"가 되는데, 다시 말하자면 배양은 균질하며, 바람직한 특징 (예컨대 소정의 단백질 또는 마커를 발현하는 능력)을 보유한다.
단백질 또는 기타 생물학적 마커를 "발현하다" 또는 그의 "발현"은 그것 또는 그의 전구체를 코딩하고 있는 유전자가 전사되고, 바람직하게는 번역된다는 것을 의미한다. 통상적으로, 본 발명에 있어서, 유전자 코딩 영역의 발현은 세포를 그 단백질 또는 기타 생물학적 마커에 대하여 "양성"이 되도록 하는 코딩된 폴리펩티드의 생성을 초래하게 된다. 업계에 알려져 있는 바와 같이, 소정 단백질 또는 기타 마커의 발현은 소정 표현형을 표시할 수 있다.
세포가 접종되어 성장함으로써 배양되는 조직을 생성시킬 수 있는 "스캐폴드"에는 어떠한 적합한 지지체도 포함된다. 예를 들면, U.S. 특허 제6,998,418호; 6,485,723호; 6,206,931호; 6,051,750호; 및 5,573,784호를 참조하라. 바람직하게는, 스캐폴드는 거기에서의 세포의 부착, 증식 및/또는 분화를 지지하도록 구성된다.
스캐폴드는 비제한적으로 합성 또는 천연 중합체, 기타 생체중합체, 및 이들의 조합을 포함한 어떠한 적합한 재료로도 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에는 콜라겐 지지체 또는 탈세포화(decellularized) 조직 지지체 (예를 들면 평활근 또는 골격근, 예컨대 탈세포화 포유동물 (예컨대 돼지) 방광 예컨대 방광 무세포 매트릭스 (BAM)로부터 수득됨)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에는 중합체 매트릭스 (예컨대 콜라겐, 히드로겔 등)가 포함된다. 일부 실시양태에서 스캐폴드에는 피브린 또는 피브리노겐이 포함된다.
스캐폴드는 모든 적합한 구성의 것일 수 있지만, 일부 실시양태에서는 일반적으로 시트와 같은 편평한 평면 부분을 포함하거나, 그것으로 구성되거나, 또는 본질적으로 그것으로 구성된다. 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 일반적으로 튜브형 구성을 포함하거나, 그것으로 구성되거나, 또는 본질적으로 그것으로 구성된다. 스캐폴드는 모든 적합한 두께의 것일 수 있지만, 일부 실시양태에서는 적어도 20, 30, 50 또는 100 ㎛의 두께, 600, 800 또는 1000 ㎛ 이하의 두께 등이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 0.5 mm 내지 20 mm, 또는 1 mm 내지 15 mm, 또는 3 mm 내지 10 mm 두께이다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 골격근 적용분야용으로 충분한 기계적 완전성을 가진다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 10 kPa 내지 1000 kPa, 또는 50 kPa 내지 500 kPa, 또는 100 kPa 내지 300 kPa의 인장 강도를 가진다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 적어도 10, 50, 100 또는 300 kPa의 인장 강도를 가진다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 10 kPa 내지 5000 kPa, 또는 100 kPa 내지 2500 kPa, 또는 500 kPa 내지 1000 kPa의 영 모듈러스(Young's modulus)를 가진다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 (예컨대 피브린 스캐폴드)는 100 kPa 내지 350 kPa의 영 모듈러스를 가진다. 본원에서 기술되는 기술에 의해 제작되는 스캐폴드의 영 모듈러스는 근육 세포 및 조직의 원래의 모듈러스를 모방하도록 설계될 수 있으며, 더 높고 더 낮은 모듈러스를 가지는 스캐폴드가 용이하게 제작되므로, 생리학적으로-적합한 기계적 특성을 가지거나 및/또는 다양한 시험관내 및 생체내 환경의 가혹성을 견딜 수 있는 재료의 사용을 가능케 한다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 원하는 골격근 조직을 생성시키기 위한 생물반응기에서의 기계적 자극 (예컨대 주기적 적재)을 견디기에 충분한 기계적 완전성을 가진다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 그 전체가 본원에 참조로써 개재되는 크리스트(Christ) 등의 2011년 8월 12일자 PCT 출원 제PCT/US2011/047600호에 적어도 5, 10, 15, 17 또는 20일 동안으로 기술되어 있는 세포 접종 및 바람직한 생물반응기 사전-컨디셔닝 프로토콜을 견딜 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 생물반응기 내에서 세포의 성장 및 성숙을 지지하도록 컨디셔닝된다. 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 바로 생체 내에 이식된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 스캐폴드는 대상 작용제의 국소화된 전달에 유용하다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 시험관 내 및/또는 이어지는 이식에서 세포의 기능적 형성을 촉진하거나 및/또는 표현형 특징을 유지하기 위하여 세포에 능동적으로 제공되는 성분을 포함할 수 있다.
예를 들면, 골격근 구성체 상에서의 운동 종말판 (MEP)의 형성을 촉진하며 골격근 세포의 표현형 특징들의 유지를 향상시킬 수 있는 작용제가 사용될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 골격근 구성체에서의 MEP 형성의 촉진이 조직 조작된 구성체의 이식 전 및/또는 후에 신경분포(innervated) 근육 표현형의 유지를 촉진하게 됨으로써, 원래의 조직에 의한 신경재분포가 발생할 때 조직-조작된 이식체가 그와 같은 기능성의 적어도 일부를 유지하게 되는 것으로 생각된다. 예를 들면, 이는 이식된 구성체에서 나타나는 기능성 근육 회복의 속도 및 크기를 증가시키게 될 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 회복 속도는 2, 3, 또는 4 내지 6, 8 또는 10주이다. 일부 실시양태에서, 회복의 크기는 원래 힘 발생량의 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 %이다. 일부 실시양태에서, 회복의 크기는 원래 힘 발생량의 30 내지 90 %, 또는 40 내지 80 %, 또는 50 내지 75 %이다.
골격근 구성체에서 MEP를 촉진하기 위한 아그린의 사용 이외에도, 비제한적으로 평활근 세포, 내피 세포, 신경 세포, 슈반 세포, 골 세포 등을 포함한 다른 세포 유형에서 원하는 표현형을 촉진하는 다른 작용제들이 사용될 수도 있다. 스캐폴드 (예컨대 근육 스캐폴드, 혈관 스캐폴드 등)에의 도입을 통하여 화학적 신호를 도입하는 것에 의해, 또는 작용제의 직접적인 제공 (예컨대 주사에 의함)에 의해, 재생 의학/조직 조작 적용분야를 위한 더 기능성인 표현형이 수득 또는 유지될 수 있다. 예를 들면, 혈관 세포 또는 조직의 혈관구조 형성을 촉진하기 위하여, VEGF와 같은 혈관형성 화합물이 스캐폴드에 접종되거나 스캐폴드에 의해 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드 상에의 또는 비드에의 도입에 의한 대상 작용제의 국소화된 전달을 제공한다. 본원에서 사용될 때의 "비드"는 통상적으로 마이크로 (10-6) 또는 나노 (10-9) 규모 (마이크로비드 또는 나노비드)인 임의의 기하학적 형상 (구체, 직사각형, 원추형 등)의 개별 입자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비드는 폴리스티렌 또는 다른 중합체 재료 예컨대 폴리(에틸렌), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 또는 폴리(락틱-co-글리콜산); 또는 금, 은, 산화 철 등과 같은 재료를 포함하거나 그것으로 제조된다. 상기 입자는 조작된 조직에서 대상 표현형을 촉진하는 데에 유용한 1종 이상의 대상 작용제 (예컨대 성장 인자 또는 발생 인자, 예컨대 아그린, 아세틸콜린 등)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 0.1 ㎛ 미만의 평균 직경을 가진다. 다른 실시양태에서, 비드는 1 mm를 초과하는 평균 직경을 가진다. 일부 실시양태에서, 비드는 0.1 ㎛ 내지 1 mm, 또는 1 ㎛ 내지 0.5 mm, 또는 10 ㎛ 내지 100 ㎛의 평균 직경을 가진다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 골격근 조직에의 아그린의 국소적 전달은 아세틸콜린 수용체 클러스터, 또는 운동 종말판 및/또는 신경근 이음부의 형성에 연관되어 있는 다른 구성요소의 형성을 촉진할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 작용제에는 헤파린-결합 성장-연관 분자 (HB-GAM), 무스카린, 아세틸콜린 수용체 항체, 카르바콜 및 니코틴이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 디스트로핀-연관 단백질 복합체를 안정화하는 비글리칸 또는 다른 작용제도 사용될 수 있다. 팔론(Fallon) 등의 U.S. 특허 출원 공개 제2011/0183910호를 참조하라.
대상 작용제를 비드에 커플링시키기 위한 어떠한 적합한 방법도 사용될 수 있다. 예를 들면, 작용제는 EDAC/NHS (카르복실-아민 커플링용) 또는 말레이미드 화학 (술피드릴 기에의 커플링용)을 포함한 다양한 화학을 통하여 비드에 흡착 또는 공유 결합될 수 있다. 비드는 조직 상에서의 별개 기능성 클러스터의 형성을 촉진하도록 스캐폴드 상에 또는 스캐폴드 내에 위치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 cm3 당 103, 104 또는 105개, 내지 cm3 당 108, 109, 1010 또는 2×1010개의 밀도로 스캐폴드 상에 또는 스캐폴드에 제공된다.
일부 실시양태에서는, 작용제를 포함하는 비드가 대상 부위에 직접 주사될 수 있다. 예를 들면, 생체 내에서 표현형을 유지하기 위하여, 아그린 (예컨대 히드로겔과 같은 담체 중에 제공됨)을 포함하는 비드가 탈신경 또는 근육 운동 상실 부위에 주사될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 세포 (예컨대 근육모세포, 근관 등) 및/또는 세포-이하 구성요소의 침윤을 지지하는 정렬되거나 실질적으로 정렬된 중공 도관 채널 (예컨대 지지체의 축을 따름) 또는 다른 다공성 구조를 포함한다. 이러한 스캐폴드는 바람직한 구조를 달성하기 위한 주형화 접근법(templating approach) 또는 기타 방법에 의해 제작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 3-차원 피브린 또는 피브리노겐 스캐폴드이다. 피브리노겐은 혈액 응고시 보통 이루어지는 바와 같이 트롬빈에 의해 피브린으로 전환될 수 있는 가용성 혈장 당단백질이다. 이러한 스캐폴드에는 내부 채널이 성형되도록 용해가능한 코어 주변에 스캐폴드를 형성시키는 것에 의해 제조되는 것들이 포함된다. 예를 들면, 폴리(메틸-메타크릴레이트) (pMMA) 비드 주변으로 피브린 또는 피브리노겐 스캐폴드가 형성된 후, 아세톤에 의해 비드가 용해됨으로써, 상호연결된 미세다공성 네트워크가 형성될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Linnes et al., Biomaterials 28 (2007) 5298-5306]을 참조하라. 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 중합체 막대 주변에 형성될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Flynn et al., Biomaterials (2003) 4265-4272]; [Stokols et al., Tissue Engineering 12(10) (2006) 2777-2787]을 참조하라.
일부 실시양태에서, 상기 채널은 중합체 (예컨대 100 kDa pMMA, 또는 폴리(테트라플루오로에틸렌)) 섬유가 피스톤 압출 시스템에서 압출되는 것을 사용한 피브리노겐-기재 다공성 스캐폴드 제조의 변형으로부터 형성될 수 있다. 섬유 직경은 압출 온도 및 수집 고데(godet)에서의 회수 속도에 따라 달라질 수 있다. 다음에, 섬유는 원하는 형상구조로 충진될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 섬유를 선택적으로 제거/용해하는 데에 적절한 용매가 사용될 수 있는 한, 어떠한 히드로겔 재료 및 섬유 조합도 사용될 수 있다. 희생용(sacrificial) 주형 섬유로 사용될 수 있는 다른 중합체 재료에는 폴리스티렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리(비닐 알콜), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤) 및 알기네이트가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 다른 히드로겔 재료에는 콜라겐, 아가로스, 셀룰로스 (및 이들의 변형), 알기네이트, 아가로스, 케라틴, 히드록시메틸 셀룰로스, 및 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서는, 주형 섬유의 선택적 (희생적) 제거를 촉진하기 위하여, 주형과 히드로겔 재료가 상이한 용해도를 가지는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 비드는 히드로겔 상에 포함된다.
일부 실시양태에 따른 지지체의 제작 과정 개략도를 도 1에 제시하였다. 먼저, 섬유 주형이 형성된다 (A). 섬유는 중합체 예컨대 pMMA일 수 있다. 상기 섬유는 상이한 과정에 의해 형성될 수 있으며, (예컨대 용융 압출에 의해) 원하는 직경으로 형성될 수 있다. 다음에, 히드로겔 재료 (예컨대 피브리노겐)가 (예컨대 원심분리, 또는 양압 또는 음압에 의해) 주형에 메워진다. 다음에, 히드로겔 재료가 중합될 수 있다 (예를 들면 트롬빈 및 칼슘에 의해 피브리노겐이 피브린으로 중합될 수 있음). 다음에, 용매에 의해 중합체 몰드(mold) 또는 주형이 선택적으로 용해됨으로써 (예를 들면 아세톤에 의해 pMMA가 용해될 수 있음), 예를 들면 정렬된 도관으로 기능할 수 있는 중공 튜브가 생성될 수 있다. 아그린 (삼각형)과 같은 작용제를 포함할 수 있는 국소-자극 비드 (원)가 구성체에 도입될 수 있다 (B). 그것은 메우기 과정에서 히드로겔에 포함될 수 있거나, 또는 지지체가 형성된 후 예컨대 흡착, 공유 가교결합 등을 통하여 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드의 중공 채널은 0.1, 1, 5, 또는 10 ㎛ 내지 1, 5 또는 10 밀리미터, 또는 100, 500, 1000 또는 5000 밀리미터의 직경 또는 평균 직경을 가진다. 원할 경우, 다른 형상구조가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 스캐폴드는 실질적으로 구형인 세공으로 제공될 수 있다. 예를 들면 라트너(Ratner) 등의 U.S. 특허 제7,972,628호를 참조하라.
일부 실시양태에서, 세포는 스캐폴드 상에 (예컨대 표면 상에) 또는 스캐폴드에 (예컨대 그 체적 내에) 접종된다. 세포 접종은 예를 들면 적절한 배양 배지 중 세포의 현탁액을 스캐폴드의 하나 이상의 면에 첨가하고, 그 후 중력 및/또는 자연 세포 운동성을 통하여 세포가 스캐폴드 상에 침강하거나 및/또는 거기에 침윤되는 것에 의해, 정적으로 수행될 수 있다. 세포 접종은 예를 들면 스캐폴드 몸체(bulk) 및/또는 그 다공성 구조 주변으로 또는 그것을 통한 세포 현탁액의 요동 또는 유동에 의해 스캐폴드로 세포를 안내하거나 밀고/당기는 작용을 할 수 있는 생물반응기를 사용하여, 동적으로 수행될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 비드 및/또는 세포를 포함하는 스캐폴드는 근관 및 성숙한 골격근 세포의 다른 마커를 형성시키기 위한 근육모세포의 성숙을 촉진하기 위한 생물반응기 사전-컨디셔닝에 적용된다. 예를 들면, 각각 그 전체가 본원에 참조로써 개재되는 유(Yoo) 등의 특허 출원 공개 제2006/0239981호; 및 크리스트 등의 2011년 8월 12일자 PCT 특허 출원 제PCT/US2011/047600호를 참조하라. 상기언급된 특허 출원들에 기술되어 있는 것들과 같은 어떠한 적합한 생물반응기 장치도 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 생물반응기 내에 정합하도록 구성되며 또한 세포 현탁액을 하나 이상의 스캐폴드 및/또는 세포가 접종된 스캐폴드의 상부 및/또는 내부로 한정하도록 설계되는 "몰드"가 제공된다. 상기 몰드는 경량의 재료 (예컨대 1-5 그램의 총 중량을 가짐)로 제조될 수 있는데, 스캐폴드 및/또는 세포가 접종된 스캐폴드 상에 위치될 때, 아래의 세포 구조를 상당히 손상시키지 않는 것이 바람직하다.
다중 세포 접종 프로토콜 (즉, 생물반응기 사전컨디셔닝에서의 추가적인 증가를 포함하는, 이와 같은 단 1회의 추가를 초과함) 역시 수행될 수 있다. 예를 들자면, 3 내지 4일 사이의 시간 동안 각 추가 세포 접종이 수행되는 경우, 일부 실시양태에 따른 세포 접종 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 또는 그 이상일 수 있다.
스캐폴드의 연신 길이는 고정 위치보다 길이가 적어도 5 % 더 큰 치수, 일부 실시양태에서는 바람직하게는 15 % 이하의 치수까지일 수 있으며, 이완은 고정 위치보다 길이가 크지 않은 치수까지 스캐폴드를 수축시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "고정 위치"는 연신과 이완 위치 사이의 중간일 수 있으며, 그와 같은 경우, 이완은 고정 위치보다 길이가 적어도 5 % 더 작은 치수까지 스캐폴드를 수축시키는 것을 포함할 수 있다.
연신 및 이완이 이루어지는 일차 시간 기간은 임의의 적합한 길이, 예를 들면 2 또는 3분 내지 10, 20 또는 30분의 기간 또는 그 이상일 수 있다. 주기적으로 연신 및 이완시키는 단계는 통상적으로 일차 시간 기간 동안 적어도 2 또는 3회 (예컨대 2, 3 또는 4회 내지 10 또는 20회) 수행된다.
스캐폴드가 고정 위치에서 유지되는 이차 시간 기간은 임의의 적합한 기간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이차 시간 기간은 일차 시간 기간에 비해 더 짧고, 1 또는 2분의 기간 내지 10 또는 20분의 기간일 수 있다. 다른 실시양태에서는, 이차 시간 기간이 일차 시간 기간에 비해 더 길고, 10 또는 20분의 기간 내지 40, 60 또는 90분의 기간 또는 그 이상일 수 있다. 일차 시간 기간이 연신과 이완 사이에 상대적으로 긴 간격을 포함하는 경우와 같은 일부 실시양태에서는, 이차 시간 기간에 대한 필요성이 모두 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 1 내지 3주의 시험관내 배양 동안 계속하여, 스캐폴드가 일차 "활성(active)" 시간 기간 동안 고정 치수에 비해 10 % 더 크고 더 작은 길이의 치수까지 분 당 3 주기의 속도로 총 5분 동안 주기적으로 연신 및 이완된 후, 25분의 "휴지(rest)" 이차 시간 기간이 이어진다. 일부 실시양태에서, 이와 같은 프로토콜은 구성체에서 다핵 세포 수의 증가, 더 두꺼운 근관 너비, 더 우수한 세포 정렬 등을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이와 같은 프로토콜은 구성체에서 (예컨대 10, 20, 50, 80 또는 100 %까지의) 다핵 세포 수의 증가, 더 두꺼운 근관 너비, 더 우수한 세포 정렬 등을 초래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 구성체 (스캐폴드 더하기 세포)는 하나 이상의 신경근 이음부 특징, 특히 시냅스-후 특징 예컨대 아세틸콜린 (ACh) 수용체의 발현을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 일부 실시양태에서는, 상기 ACh 수용체가 응집된다. 일부 실시양태에서, 응집된 ACh 수용체에는 생체내 신경분포 성숙 섬유에서의 운동 종말판의 특징적인 프레첼 형상을 가지거나 그와 유사한 것들이 포함될 수 있다.
자연 조직에서, 신경근 이음부 (NMJ) 또는 신경-근 시냅스는 각각 운동 뉴런 및 근육의 시냅스-전 및 -후 특화기구, 개재 시냅스 기저 라미나(intervening synaptic basal lamina), 및 특화 슈반 세포 캡을 포함한다 (문헌 [Salpeter, et al (1987) The Vertebrate Neuromuscular Junction. New York, Alan R. Liss.]). 시냅스전 기구는 통상적으로 시냅스 소포의 정돈된 배열로 표시되는데, 그의 하위세트가 활성 구역에서 혈장 막과 융합되어 유지되면서 근육 상의 아세틸콜린 수용체 (AChR)에 의해 인식되는 아세틸콜린을 방출함으로써, 궁극적으로 근육의 전기적 활성화 및 수축을 초래한다 (문헌 [Heuser, et al (1981) J. Cell Biol. 88: 564]). 이 구역으로부터 시냅스 간극(synaptic cleft)을 50 nm 바로 가로질러 이음부후 폴드(postjunctional fold)의 간극이 존재한다. 이 간극은 아세틸콜린 수용체 (AChR)로 가득 차 있는데, > 10,000 분자/㎛2의 밀도에 달할 수 있다 (문헌 [Huh et al. (2002) Mol. Neurobiol. 25: 79]). 국소화되어 엄격하게 조절되는 좁은 시냅스 간극으로의 아세틸콜린의 분비는 시냅스후 막에서의 높은 AChR 밀도와 연계되어 뉴런과 근육 사이의 빠르고 신뢰성 있는 시냅스 전달을 보장한다. 중증 근무력증에서 보이는 기능성 AChR 수의 감소와 같은 이러한 특화기구의 교란은 쇠약성이며 종종 치명적인 임상적 결과로 이어질 수 있다 (문헌 [Oosterhuis, et al (1992) Neurology & Neurosurgery 5: 638]).
일부 실시양태에서는, 대상 작용제를 포함하는 비드가 적정한 화학량론 또는 비드:세포 비 (즉 세포 당 비드의 수)가 달성되도록 스캐폴드 상에 제공된다. 일부 실시양태에서, 비드 대 세포의 비는 1:100 내지 100:1, 또는 1:50 내지 50:1, 또는 1:20 내지 20:1, 또는 1:15 내지 15:1, 1:10 내지 10:1, 또는 1:8 내지 8:1, 또는 1:5 내지 5:1, 또는 1:4 내지 4:1, 또는 1:3 내지 3:1, 또는 1:2 내지 2:1, 또는 대략 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 5:1, 4:1, 3:1, 또는 2:1이다.
골격근의 경우, 일부 실시양태에서는, 신경근 이음부 특징의 형성을 촉진하는 작용제, 예컨대 아그린을 세포 당 대략 1 지점의 신경분포 형성을 촉진하도록 대략 1:1, 1:2, 1:3, 3:1, 또는 2:1의 비드 대 세포 비로 포함하는 비드를 제공하는 것이 최적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 세포 (예컨대 생물반응기 컨디셔닝 후 형성된 융합 세포) 당 다수 지점의 신경분포 부위가 존재할 경우 일어날 수 있는 충돌 여기 파장을 감소시키는 데에 바람직할 수 있다. 원할 경우, 선택된 화학량론을 수득하기 위하여 스캐폴드상 또는 스캐폴드 내의 비드 밀도가 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, 근관은 약 300 내지 1500 ㎛의 길이 및 약 20 내지 30 ㎛의 직경을 가진다. 일부 실시양태에서, 이러한 크기는 원하는 화학량론을 수득하기 위하여 스캐폴드 내 또는 스캐폴드 상의 비드의 농도/분포를 계산하는 데에 사용될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이 생성되는 골격근 조직은 대상 화합물의 약학적 또는 독성학적 특성을 조사하기 위하여 (예를 들면 대상 화합물을 조직이 침지되어 있는 배양 배지에 첨가하고, 대조 조직과 비교하여 조직의 조직학적 또는 기계적 특성을 조사하는 것에 의함) 시험관 내에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 골격근 조직 구성체는 그것이 이식될 때 한쪽 단부에서 외과적으로 봉합되거나 다르게 결속되기에 충분한 구조적 완전성을 가지며 이후 수축시 장력을 발생시킬 수 있다는 점에서 "봉합가능"하다.
본원에서 기술되는 바와 같이 생성되는 골격근 조직 구성체는 환자, 예컨대 팔 또는 다리의 외상성 손상이 있는 환자에서 손상된 조직의 재구성에 사용될 수 있다. 그와 같은 조직은 지지체 상에서 형성되거나 (이식되기도 함), 또는 대상체에의 이식 전에 지지체로부터 제거될 수 있다. 상기 골격근 조직은 연조직을 "구축(build)"하기 위하여 (예컨대 절단된 사지와 인공 기구(prosthetic device) 사이의 경계에), 또는 손상된 근육 (예컨대 안면, 손, 발, 팔, 다리, 등 또는 몸통의 근육)을 (부분적으로 또는 전체적으로) 재구성하기 위하여 이식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자로의 이식 (예컨대 환자의 기존 근육과 결합됨), 및 예를 들면 손가락의 움직임에 연관되어 있는 골격근의 재구성에 충분한 조직량을 제공하기 위하여, 상기 골격근 조직은 적어도 1, 2 또는 3 세제곱 센티미터의 크기 또는 부피 (존재할 경우, 지지체의 부피는 계산하지 않음), 및/또는 1 cm 내지 50 cm의 길이를 가진다.
환자에의 동종이형 이식의 경우에는, 본원에서 기술되는 바와 같은 조직 구성체가 공지의 기술에 따라 적합화 또는 조직-유형화될 수 있거나, 및/또는 역시 공지 기술에 따라 조직 이식 거부를 극복하기 위하여 면역 억제제가 대상체에 투여될 수 있다.
하기의 비-제한적인 실시예에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
[실시예]
실시예 1 . 아세틸콜린 수용체의 발현. 생물반응기 사전컨디셔닝에 이어 조직 조작된 근육 복구 구성체 (TEMR) 형태구조의 특성화 동안, TEMR 구성체의 다핵 세포가 아세틸콜린 (ACh) 수용체를 발현하며, 드문 경우 이들 수용체의 응집을 나타낸다는 것이 발견되었다. 흥미롭게도, 일 구성체의 ACh 수용체 응집체는 성숙한 섬유의 운동 종말판의 특징적인 프레첼 형상을 나타내기 시작한다. 이러한 발견은 임상적으로 적절한 힘을 산출하는 성숙한 TEMR 구성체를 표시해주는데, 이식된 TEMR 구성체의 신경분포가 외상성으로 손상된 근육 조직의 기능적인 복구를 촉진하는 것으로 생각되며, 현재는 이러한 세포가 1) ACh 수용체를 발현하고, 2) 운동 종말판을 발생시키는 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있기 때문이다.
실시예 2 . 아그린-자극 아세틸콜린 수용체 클러스터화. 아그린에 의한 자극을 통한 아세틸콜린 수용체의 클러스터화를 달성하는 능력에 대한 개념-증명 연구를 위하여, C2C12 마우스 근육모세포 세포주를 사용하였다. 상기한 스캐폴드의 2-차원 버젼도 사용하여, 조직학적 평가를 가능케 하였다.
C2C12 세포를 2-차원 피브린 히드로겔 상에 4-10일 동안 접종하였다. 별도로, 아그린을 폴리스티렌 비드 표면 상에 코팅하거나, 또는 거기에 공유 고정하였다. C2C12 세포 배양 3-6일차에, 아그린-코팅된 비드를 24시간 이상 동안 세포 상에 위치시켰다. 다음에, 아세틸콜린 수용체 클러스터화의 마커인 알파-분가루스독소에 대하여 세포를 염색하였다.
피브린 히드로겔 상에서 배양된 C2C12 세포상 아그린-코팅 비드는 클러스터화 영역을 초래하였다 (도 2). 비드가 존재하는 경우, 모든 영역에서 클러스터화가 이루어짐으로써, 아그린-코팅된 비드가 클러스터화 거동을 촉진한다는 것을 표시해주었다. 비드 상에의 아그린의 물리적 흡착은 세포의 단기 신호전달 (예컨대 1 또는 2일)에 탁월한 반면, 공유 고정은 더 긴 시간 기간 (예컨대 5일 이상) 동안의 아그린 전달을 가능케 하는 것으로 나타났다. 더 고배율 영상은 아세틸콜린 수용체 클러스터화가 비드가 위치하는 곳에만 (미도시) 발생한다는 것을 확인해 주었다.
도 3a-3b는 105 ㎛ 주형을 사용하여 신경 적용분야용으로 pMMA 주형 및 피브린으로부터 제작된 스캐폴드의 주사 전자 현미경 (SEM) 영상을 나타낸다.
클러스터화 거동은 공초점 현미경법을 사용하여 세포와 아그린에 공유 결합된 비드 사이의 접촉 영역에서 확인되었다 (도 4). 또한, 수직 방향으로 신호를 분리하는 공초점 현미경법의 고유한 능력은 유도되는 클러스터화를 목적으로 하는 세포에 대한 비드 위치설정의 독립성은 물론, 다중 인접 세포를 알리는 아그린-전달 비드의 능력을 입증하였다.
실시예 3 . 스캐폴드에의 아그린-코팅 비드의 도입. 아그린-코팅된 비드를 2-D 히드로겔 및 상기한 3-D 스캐폴드 (폴리(테트라플루오로에틸렌) 튜브형 또는 직사각형 몰드를 사용하여 제작)에 도입하고, 형성된 3-D 스캐폴드 상에 근육모세포를 접종한 후, 실시예 2에서 상기한 것과 유사한 연구를 수행하여 3차원으로의 세포 접종의 효능은 물론, 비드가 스캐폴드 재료의 일부인 경우에 달성되는 아세틸콜린 수용체 클러스터화의 수준을 확인한다.
세포 현탁액의 정적 첨가 및 이후의 침윤에 의해 직사각형 3-D의 패턴화된 피브린 스캐폴드에 접종하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, C2C12 세포가 자연 세포 운동성을 통하여 다공성 구조의 전체 두께에 실질적으로 침윤함으로써, 피브린 생체재료 및 근육모세포-유사 세포 접종에 대한 희생 패턴화 과정 모두의 적합성을 입증하였다.
또한, 현미경법은 접종된 근관-유사 세포가 스캐폴드 내에 융합되며, 아세틸콜린 수용체를 발현한다는 것 (미도시)을 밝혔다.
전기는 본 발명의 예시로써, 그것을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 정의되는 바, 청구범위의 등가물들은 여기에 포함되어야 한다.
없음.

Claims (13)

  1. 시험관 내에서 스캐폴드 상에 근육 세포를 주기적으로 연신 및 이완시켜 조직화된 골격근 조직을 생성시키는 단계를 포함하며;
    상기 스캐폴드 내의 또는 상기 스캐폴드 상의 분리된 개별 위치에 아그린을 포함시키는 단계를 추가적으로 포함하고,
    상기 아그린은 상기 분리된 개별 위치 중 1개 이상에 인접한 조직화된 골격근에서 응집된 아세틸콜린 수용체의 형성을 촉진하기 위해 제공되는, 전구체 근육 세포로부터의 조직화된 골격근 조직의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아그린을 포함시키는 단계가 상기 스캐폴드 내에 또는 상기 스캐폴드 상에 상기 아그린을 포함하는 비드를 포함시키는 것에 의해 수행되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 비드가 마이크로비드인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 비드가 폴리스티렌, 폴리(에틸렌), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 또는 폴리(락틱-co-글리콜산)을 포함하는 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 비드가 금, 은, 또는 산화 철을 포함하는 방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 아그린이 공유 결합을 통하여 비드 상에 도입되는 방법.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 분리된 개별 위치가 상기 조직화된 골격근 조직에 형성된 근관에 대하여 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1의 분리된 개별 위치 수와 형성된 근관의 수의 비로 제공되는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드가 헤파린-결합 성장-연관 분자 (HB-GAM), 무스카린, 아세틸콜린 수용체 항체, 카르바콜 및 니코틴에서 선택되는 1종 이상의 작용제를 추가적으로 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드가 피브린, 콜라겐, 아가로스, 셀룰로스, 알기네이트, 아가로스, 케라틴, 히드록시메틸 셀룰로스 또는 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트)를 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 피브린을 포함하고,
    상기 스캐폴드는 제1 축을 따라 정렬된 다수의 채널을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구체 근육 세포가 근육모세포 또는 위성 세포인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 조직으로부터 전구체 근육 세포를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직이 봉합가능한 방법.
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