JP2024508742A - 二本鎖miRNAを有効成分として含む毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用組成物 - Google Patents
二本鎖miRNAを有効成分として含む毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024508742A JP2024508742A JP2023549095A JP2023549095A JP2024508742A JP 2024508742 A JP2024508742 A JP 2024508742A JP 2023549095 A JP2023549095 A JP 2023549095A JP 2023549095 A JP2023549095 A JP 2023549095A JP 2024508742 A JP2024508742 A JP 2024508742A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hair
- mir
- improving
- graying
- preventing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003752 improving hair Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 title claims abstract description 64
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 title claims abstract description 61
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title abstract description 141
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title abstract description 138
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims abstract description 103
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 108091026478 miR-3199-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 108091088478 miR-3199-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 108091050034 miR-3139 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108091075059 miR-3189 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 108091043178 miR-8485 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 124
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 43
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 38
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 22
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 22
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 17
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 10
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 claims description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 8
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims description 6
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QYIXCDOBOSTCEI-QCYZZNICSA-N (5alpha)-cholestan-3beta-ol Chemical compound C([C@@H]1CC2)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]2(C)CC1 QYIXCDOBOSTCEI-QCYZZNICSA-N 0.000 claims description 4
- YEYCQJVCAMFWCO-UHFFFAOYSA-N 3beta-cholesteryl formate Natural products C1C=C2CC(OC=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 YEYCQJVCAMFWCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 claims description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- YEYCQJVCAMFWCO-PXBBAZSNSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] formate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 YEYCQJVCAMFWCO-PXBBAZSNSA-N 0.000 claims description 4
- QYIXCDOBOSTCEI-UHFFFAOYSA-N alpha-cholestanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 QYIXCDOBOSTCEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052925 anhydrite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N glyceric acid Chemical compound OCC(O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 4
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 4
- YGPZWPHDULZYFR-DPAQBDIFSA-N (3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](N)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 YGPZWPHDULZYFR-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 claims description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 239000000118 hair dye Substances 0.000 claims description 3
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 claims description 3
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 claims description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 2
- 239000003051 hair bleaching agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000008266 hair spray Substances 0.000 claims description 2
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 claims description 2
- 235000011929 mousse Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 claims description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 claims description 2
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims 1
- 239000003676 hair preparation Substances 0.000 claims 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 149
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Natural products O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 16
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 abstract description 6
- 210000004918 root sheath Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003658 preventing hair loss Effects 0.000 abstract 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 64
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 49
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 42
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 42
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 42
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 37
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 31
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 29
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 28
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 28
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 description 26
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 26
- 108010050345 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Proteins 0.000 description 25
- 102000013760 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Human genes 0.000 description 24
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 description 21
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108010051081 dopachrome isomerase Proteins 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 16
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 15
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 15
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 14
- 108010014402 tyrosinase-related protein-1 Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 9
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 9
- 108091042305 miR-7978 stem-loop Proteins 0.000 description 9
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 108091089979 miR-4644 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 108091056748 miR-6074 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 7
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 7
- 108091043220 miR-3132 stem-loop Proteins 0.000 description 7
- 108091030513 miR-933 stem-loop Proteins 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 7
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100022289 60S ribosomal protein L13a Human genes 0.000 description 6
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 6
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 6
- 101000681240 Homo sapiens 60S ribosomal protein L13a Proteins 0.000 description 6
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 4
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 3
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N Minoxidil Chemical compound NC1=[N+]([O-])C(N)=CC(N2CCCCC2)=N1 ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRZOAKDECILMJB-UHFFFAOYSA-N N#CCCNP(=O)=O Chemical compound N#CCCNP(=O)=O FRZOAKDECILMJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238633 Odonata Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 206010068168 androgenetic alopecia Diseases 0.000 description 2
- 201000002996 androgenic alopecia Diseases 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000686 essence Substances 0.000 description 2
- DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N finasteride Chemical compound N([C@@H]1CC2)C(=O)C=C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)[C@@]2(C)CC1 DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N 0.000 description 2
- 229960004039 finasteride Drugs 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008717 functional decline Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229960003632 minoxidil Drugs 0.000 description 2
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000011781 Karyopherins Human genes 0.000 description 1
- 108010062228 Karyopherins Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 231100000480 WST assay Toxicity 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000013685 acquired idiopathic sideroblastic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000010864 dual luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 230000031774 hair cycle Effects 0.000 description 1
- 210000000642 hair follicle dermal papilla cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003694 hair properties Effects 0.000 description 1
- 210000004919 hair shaft Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 208000000069 hyperpigmentation Diseases 0.000 description 1
- 230000003810 hyperpigmentation Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002780 melanosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 101150087532 mitF gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005582 sexual transmission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000003797 telogen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 229940043263 traditional drug Drugs 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
- A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q5/00—Preparations for care of the hair
- A61Q5/10—Preparations for permanently dyeing the hair
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Birds (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本発明は、二本鎖miRNAを有効成分として含む毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用組成物に関し、より詳細には、二本鎖miRNAであるmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、これを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、または前記構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用の薬学的または化粧料組成物に関する。本発明による組成物は、メラニン形成細胞を活性化し、メラニンの生成を促進することにより、毛髪の灰白色化を予防し、その進行速度を遅くすることができ、すでに灰白色化が進行した毛髪を灰白色化前の毛髪状態に改善することができる。また、メラニン生成細胞の活性とともに、毛包に存在する毛乳頭細胞及び角質形成細胞の増殖促進、毛髪の外毛根鞘の発達及び毛髪の成長を誘導して発毛促進及び/または脱毛の予防効果を発揮することができる。
Description
本発明は、二本鎖miRNAを有効成分として含む毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用組成物に関し、より詳細には、二本鎖miRNAであるmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、これを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、または前記構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用の薬学的または化粧料組成物に関する。
人間の毛髪の灰白色化(Hair greying)は、生理的老化の一現象で、毛包(hair follicle)のメラニン形成細胞(melanocyte)または幹細胞(melanocyte stem cell)の機能低下及び枯渇によるメラニン色素(melanin pigment)の減少によって引き起こされることとして知られている。メラニン色素は、毛髪の色を決定する重要な因子であり、メラニン細胞内に存在するメラノソーム(melanosome)からメラニンが合成されて分泌され、近接した角質形成細胞(keratinocyte)、繊維芽細胞(fibroblast)などに伝達された後、毛髪の成長と共に移動して毛髪の色を維持することになる。現在、毛髪の灰白色化の解決策としては、単純な染色施術が使用されているが、染色は一時的な方法で白髪の成長によって再染色が必須であり、染毛剤の染料に含まれる成分には頭皮や毛包に刺激を与えたり、アレルギーや皮膚炎を引き起こすなど様々な副作用が存在する。現在、メラニン色素の生成調節に関連した研究は、遺伝的要因、老化、ホルモン、成長因子、紫外線など様々な要因によって発生する皮膚のメラニン過剰誘発による色素沈着などの症状を抑制し、皮膚美白効果を示す物質開発及び作用機序の解明に限られている。逆に、毛髪の灰白色化またはメラニン合成低下を克服するためのメラニン生成促進に関連する作用機序及び物質開発に関する研究はほとんど進んでいない。また、メラニン生成(melanogenesis)は、様々な信号(SCF-KIT-RAS-ERK信号経路、MC1R-cAMP-PKA信号経路、Wnt-β-catenin信号経路)の相互作用によって調節されるが、このような複雑な作用機序のため、毛髪の灰白色化を防止または改善するための作用機序の解明及び新規物質の開発が容易ではないのが実情である。
最近、中年男性で主に発症し、男性の遺伝的疾患とされていた男性型脱毛症(androgenetic alopecia、AGA)は、深刻な環境汚染、ストレス、食生活の変化、人口の急激な高齢化により、若い男性だけでなく、女性にも普遍的に発生しており、脱毛に対する関心が高まり、脱毛市場が急速に成長している。遺伝的要因、男性ホルモン、老化、血液循環障害など様々な要因によって脱毛が誘発されることが知られており、男性ホルモン(androgen)であるジヒドロテストステロン(DHT)の生成を抑制するフィナステリド(finasteride)と血管拡張及び血液循環を改善するミノキシジル(minoxidil)だけが現在許可された治療薬である。しかし、これらの薬物は投与用法及び用量によって一時的で限られた効能を持ち、様々な副作用を伴うため、副作用なしで毛髪成長促進のための毛包細胞の活性化及び細胞増殖を誘導する新しい概念の物質開発が求められている。
毛髪の成長サイクル(hair cycle)は3段階で構成され、毛髪が最も活発に成長する成長期(anagen)、成長が止まって毛髪の退化が始まる退化期(categen)、そして毛包の活動性が停止した状態である休止期(telogen)に分類され、脱毛とは成長サイクルによって成長を止めた毛髪が自然に抜けることを指し、様々な要因が作用することで脱毛を引き起こすことが知られている。脱毛症状緩和のための薬物開発が長い間行われてきたが、経口用脱毛治療剤であるフィナステリドと塗布型脱毛治療剤であるミノキシジル以外にはないのが現状だ。しかし、男性ホルモン生成抑制メカニズムを通じて脱毛症状の緩和を誘導するため、効能の限界及び副作用が伴っている。したがって、副作用なしに効能を示す新しいメカニズムと戦略を持つ物質の開発が必要である。毛包細胞(hair follicle cell)の活性化及び増殖を促進して休止期の毛髪を成長期に素早く転換を誘導することは、脱毛治療剤開発の重要な戦略の一つである。したがって、毛髪成長促進のための毛包細胞の活性化及び細胞増殖を誘導する新しい概念の物質開発が求められている。
遺伝子の発現を抑制する技術は、疾患治療のための治療薬開発及び標的検証において重要なツールであり、既存の伝統的な薬物治療方法の限界点を克服するために様々な方面で開発が進められているが、その一つが干渉RNA(RNA interference、以下RNAiと表記)の利用である(Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A., Nat Rev Drug Discov 6, 556-68. 2007.)。RNAiは、遺伝子発現を抑制するために使用される方法で、簡単かつ少ない費用で遺伝子抑制効果が顕著に見られるため、その技術の応用分野が多様化している。siRNAは、16から27のヌクレオチドで構成された単鎖RNAで、細胞内でリスク(RNA Induced Silencing Complex、RISC)と呼ばれるリボ核酸タンパク質結合体(ribonucleoprotein)の構成成分として活動する。RISCは、RNA酵素はさみとして機能し、メッセンジャーRNA(messenger RNA、以下mRNAと表記)を切断してmRNAからタンパク質が生成されるのを阻害する。RISCに含まれるsiRNAは、siRNA配列と相補的な配列を持つmRNAと結合して二本鎖RNAを形成し、RISCは、RNA酵素はさみとして作用して目標となるmRNAを切断し、mRNAがこれ以上タンパク質を繰り返し生成する鋳型(template)としての機能を遂行できないようにする。
このようにRNAiベースの治療剤は、タンパク質生成段階以前のmRNAを遮断するという点、そしてRNAと細胞内在的なRISCシステムを活用するという点において、前記単分子物質の治療剤より進歩した技術として評価されるが、siRNAベースの技術でも解決できない副作用があり、これは非標的効果(off-target effect)と呼ばれる現象である。前記のようにsiRNA配列と相補的に結合するmRNAを分解するが、siRNA配列全体と相補的ではなく、一部分だけ相補的なmRNAとも結合して分解を誘発し、これを標的でないmRNAの分解を誘発するため、非標的効果と呼ばれる。
前記のRNAiベースの治療剤の技術的難点を克服するために、マイクロRNA(microRNA、以下miRNAと表記)を治療剤として使用しようとする研究が活発に行われている(Agostini, M. & Knight, R.A., Oncotarget 5, 872-81, 2014; Dangwal, S. &Thum, T., Annu Rev PharmacolToxicol 54, 185-203, 2014.)。miRNAは、16から27のヌクレオチドで構成されたRNAで、タンパク質に翻訳されるメッセンジャーRNAに対してタンパク質非生成RNA(protein non-coding RNA)に分類される(Carthew, R.W. &Sontheimer, E.J.、Cell 136, 642-55, 2009; MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561, 2010; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009)。miRNAは、高等動植物細胞の遺伝体に記録されており、細胞の生成、成長、分化、死滅を含む細胞の代謝及び機能を調節するのに核心的な役割を果たすことが知られている。現在までに人間の遺伝体では2000種余りのmiRNAが知られており、このうちかなりの数のmiRNAの機能はまだ知られていない。
miRNAは、遺伝体からPol IIと呼ばれるRNAポリメラーゼ(polymerase)によってRNAに転写されるが、初期長さは特定できないほど多様である(Carthew, R.W. &Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; Brodersen, P. &Voinnet, O., Nat Rev Mol Cell Biol 10, 141-148, 2009.)。これは、miRNAが遺伝体に含まれる位置の多様性に起因するもので、mRNAのタンパク質生成非関与部分であるイントロン(intron)に位置し、mRNAの生成と同時に転写される場合及び遺伝体上において遺伝子間の空白空間(inter-genic region)に位置して独自に転写される場合など、様々な方法で生成されるからである(Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68, 2009.)。このように初期に生成されたmiRNAの母体を一次miR(primary microRNA)というが、一次miRNAは、核内のドロシャ(Drosha)と呼ばれるRNA切断酵素(RNase)などによって前駆体miRNA(precursor miRNA、以下pre-miRと表記)に編集される(Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009.)。Pre-miRは、RNAヘアピン構造(RNA hair-pin structure)を形成し、およそ70-80個のヌクレオチドで構成される。細胞核内部のPre-miRは、エクスポーチンタンパク質などによって核から細胞質に移動され、細胞質内でダイサー(Dicer)と呼ばれる別のRNA切断酵素によって二次加工され、16-27個のヌクレオチドで構成される二本鎖の成熟miRNA(mature microRNA、以下、他の修飾語なしでmiRと記述する場合は、成熟miRを意味する)を生成する。二本鎖miRのうち一本鎖のRNAが選択的に選定され、前記リボ核酸タンパク質結合体であるRISCと結合して活性を持つようになり、miRの配列を利用して標的mRNAと結合する。
一般的に、mRNAはタンパク質生成関与の有無を基準に大きく3つの部分に分けることができ、タンパク質翻訳情報を含むコーディング部分(coding region)とコーディング部分のそれぞれ5'と3'部分としてタンパク質翻訳情報を持たない5'-UTR(Un-Translated Region)と3'-UTRに分けることができる。mRNAとの相補的配列を利用して、目標mRNAの分解を引き起こすsiRNAはmRNAの5'-、3'-UTRおよびコーディング部分に関係なく作用するのに対し、miRは主に3'-UTRと結合をする(Carthew, R.W. &Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009.)。mRNAとの結合位置の違いに加えて、siRNAと他のmiRNAの独特な特徴として、siRNAはsiRNA全体の配列と相補的な配列を含むmRNAと主に結合するのに対し、miRNAはmiRNAの5'末端から2-8ヌクレオチド位置に位置する、限られたサイズの種子部分(seed region)配列が主に目標mRNA認識に使用される点が異なり、したがって、全体のmiRNAの配列が目標遺伝子と完全な相補的な配列を持たず、一定部分非相補的な配列が含まれてもmiRNA活性に影響を与えない(Bartel, D.P.、Cell 136, 215-33, 2009.)。種子部分の配列サイズが6-8ヌクレオチドであるため、これと相補的な配列を3' UTRに持つmRNAの種類は多様であり、このような理由から、1種のmiRNAで複数の種のmRNAを同時に制御することができる。このようなmiRNAの性質は、miRNAが細胞の分裂、成長、分化、死滅に至る多くの部分の細胞生理学的側面の制御に関与する効率的な調節因子(regulator)としての機能を持つ。また、調節因子としてのmiRNAの機能は、様々な疾患に効果的に適用できることが利点として作用するが、siRNAの場合、単一遺伝子の発現の抑制を目指すのに対し、miRNAは様々なシグナル伝達経路に関与する遺伝子多数の発現を同時に阻害することができるからである。多数のmRNAが3' UTRに1種以上のmiRNAが結合する可能性のある部分を含んでおり、あるバイオインフォマティクス的な計算によると、全体のmRNAの約30%がmiRNAによってタンパク質生成が調節されていることが知られている。
miRNAまたはsiRNAの優れた効果および多様な使用範囲にもかかわらず、miRNA/siRNAが治療薬として開発されるためには、体内でのmiRNA/siRNAの安定性(stability)の改善と細胞送達効率の改善を通じてmiRNA/siRNAがターゲット細胞に効果的に送達されなければならない(FY Xie., Drug Discov. Today.2006 Jan; 11(1-2):67-73)。体内安定性の向上及びmiRNA/siRNAの非特異的な自然免疫反応(innate immune stimulation)の問題を解決するために、miRNA/siRNAの一部のヌクレオチドまたは骨格(backbone)に対して核酸分解酵素抵抗性を持つように変形(modification)したり、ウイルス性ベクター(viral vector)、リポソームまたはナノ粒子(nanoparticle)などの伝達体を利用するなど、これに対する研究が活発に試みられている。アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス性ベクターを利用した伝達システムは、形質導入効率(transfection efficacy)は高いが、免疫原性(immunogenicity)や発がん性(oncogenicity)が高い。一方、ナノ粒子(nanoparticle)を含む非ウイルス性(non-viral)伝達システムは、ウイルス性伝達システムに比べ細胞伝達効率は低いが、生体内(in vivo)での安定性(stability)が高く、ターゲット特異的に伝達が可能で、内包されているRNAiオリゴヌクレオチドを細胞または組織に吸収(uptake)及び内在化(internalization)し、細胞毒性及び自然免疫誘発がほとんどないという利点があり、現在はウイルス性伝達システムに比べ有力な伝達方法として評価されている(Akhtar S, J Clin Invest.2007 December 3; 117(12):3623-3632)。
非ウイルス性伝達システムの中でナノキャリア(nanocarrier)を利用する方法は、リポソーム、陽イオン性高分子複合体などの様々な高分子を使用してナノ粒子を形成し、miRNA/siRNAをこれらのナノ粒子、すなわちナノキャリア(nanocarrier)に担持して細胞に伝達する方法である。ナノキャリアを利用する方法のうち、主に活用される方法は、高分子ナノ粒子(polymeric nanoparticle)、高分子ミセル(polymer micelle)、リポフレックス(lipoplex)などがあるが、このうちリポフレックスを利用した方法は、陽イオン性脂質で構成され、細胞のエンドソーム(endosome)の陰イオン性脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発し、細胞内に伝達する役割を果たす。また、miRNA/siRNAセンス(sense; パッセンジャー(passenger))鎖の末端部位に化学物質などを連結して増強された薬物動態学(pharmacokinetics)的特徴を持たせることで、生体内(in vivo)で高い効率を誘導できることが知られている(J Soutschek, Nature 11; 432(7014):173-8, 2004)。この時、miRNA/siRNAセンスまたはアンチセンス(antisense; ガイド(guide))鎖の末端に結合された化学物質の性質によってmiRNA/siRNAの安定性が変わる。
例えば、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)など高分子化合物が接合された形のsiRNAは、陽イオン性物質が存在する条件下でmiRNA/siRNAの陰イオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することにより、改善されたmiRNA/siRNAの安定性を持つ伝達体になる(SH Kim, J Control Release 129(2):107-16, 2008)。特に、高分子複合体で構成されたミセル(micelle)は、薬物送達担体として使われる他のシステムである、微小球体(microsphere)またはナノ粒子などに比べてそのサイズが極めて小さく、分布が非常に一定であり、自発的に形成される構造であるため、製剤の品質管理及び再現性の確保が容易であるという利点がある。miRNA/siRNAの細胞内伝達効率を向上させるために、miRNA/siRNAに生体適合性高分子である親水性物質(例えば、ポリエチレングリコールを単純共有結合またはリンカー媒介(linker-mediated)共有結合で接合させたmiRNA/siRNA接合体を通じて安定性の確保及び効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された(韓国登録特許第883471号)。
しかし、miRNA/siRNAの化学的修飾およびポリエチレングリコールを結合させること(PEGylation)だけでは、生体内での安定性が低く、標的臓器への送達が円滑に行われないという欠点がある。このような欠点を解決するために、二本鎖オリゴヌクレオチド、特にmiRNA/siRNAなどの二本鎖オリゴRNAに親水性及び疎水性物質が結合された二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が開発されたが、前記構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってSAMiRNATM(self-assembled micelle inhibitory RNA)と名付けられた自己組立ナノ粒子を形成することになるが(大韓民国登録特許第1224828号)、SAMiRNATM技術は、従来の伝達技術に比べて非常にサイズが小さく、かつ均一(homogenous)なナノ粒子を得ることができるという利点がある。
SAMiRNATM技術の具体的な例として、親水性物質としてPEGまたはHEG(Hexaethylenglycol)が使用されるが、PEGは合成ポリマー(synthetic polymer)で医薬品、特にタンパク質の水溶性(solubility)増加及び薬物動態学の調節のためによく使用される。PEGは多分散系(polydisperse)物質で、一バッチ(batch)のポリマーは異なる個数のモノマー(monomer)の総和で構成され、分子量がガウス曲線の形を示し、多分散指数(polydisperse value、Mw/Mn)で物質の均質性の程度を表現する。つまり、PEGが低い分子量(3~5kDa)である場合、約1.01の多分散指数を示し、高い分子量(20 kDa)である場合、約1.2という高い多分散指数を示し、高い分子量であるほど物質の同質性が比較的低いという特徴を示す。したがって、PEGを医薬品に結合させた場合、接合体にPEGの多分散的な特徴が反映されて単一物質の検証が容易ではないという欠点があり、PEGの合成及び精製過程の改善を通じて低い多分散指数を持つ物質を生産する傾向にあるが、特に分子量が小さい物質にPEGを結合させた場合、結合が容易に行われたか確認が容易でない不便な点があるなど、物質の多分散性特徴による問題点が存在する(Francesco M. VDRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458)。これに伴い、最近では既存の自己組立てナノ粒子であるSAMiRNATM技術の改良された形で、SAMiRNATMを構成する二本鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質を一定の分子量を有する均一な1~15個のモノマーと必要に応じてリンカー(linker)を含む基本単位をブロック(block)化し、これを必要に応じて適切な数を使用することで、従来のSAMiRNATMに比べてより小さなサイズを持ち、また、多分散性が飛躍的に改善された新しい形の伝達体技術が開発された。
そこで、本発明者らは、毛髪の灰白色化を改善させることができるmiRNAを発見しようと努力した結果、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485がそれぞれメラニン形成細胞を活性化し、メラニンの生成を促進して毛髪の灰白色化を改善できることを確認した。また、メラニン細胞の活性化に加え、毛包に存在する毛乳頭細胞(hair follicle dermal papilla cell)、角質形成細胞(keratinocyte)等の増殖促進を確認し、毛包の外毛根鞘(outer root sheath、ORS)及び毛髪長さの増加を確認することで本発明を完成した。
Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A., Nat Rev Drug Discov 6, 556-68. 2007
Agostini, M. & Knight, R.A., Oncotarget 5, 872-81, 2014
Dangwal, S. &Thum, T., Annu Rev PharmacolToxicol 54, 185-203, 2014
Carthew, R.W. &Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009
MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561, 2010
Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009
Carthew, R.W. &Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009
Brodersen, P. &Voinnet, O., Nat Rev Mol Cell Biol 10, 141-148, 2009
Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68, 2009
Akhtar S, J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12):3623-3632, 2007
SH Kim, J Control Release 129(2):107-16, 2008
本発明は、毛髪毛包のメラニン生成細胞の活性化及びメラニン生成促進を通じて毛髪の灰白色化を改善し、毛包細胞の増殖促進を誘導して脱毛を予防または改善し、発毛を促進することができる新規な組成物を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の薬学的組成物を提供する。
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善が必要な対象物に
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の化粧料組成物を提供する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の化粧料組成物を提供する。
本発明は、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善が必要な対象物に
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を投与する工程を含む、毛髪の白化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善方法を提供する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を投与する工程を含む、毛髪の白化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善方法を提供する。
本発明は、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善のための
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
本発明は、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善のための医薬品または化粧料の製造のための
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
図1は、SAMiRNATMに搭載されたヒトmiRNA 1728種を利用して、ヒト皮膚がん細胞株(M21)でメラニン生成量測定による1次スクリーニングを行った結果を示す。
図2は、スクリーニングを通じて選別されたメラニン生成量が高い18種について、2種類のヒト皮膚がん細胞株(M21、SK-MEL28)で2次スクリーニングした結果を示す。
図3は、1、2次スクリーニングを通じてメラニン生成量が最も高い9種のmiRNAに対して、ヒト皮膚がん細胞株(SK-MEL-28)でメラニン生成量及び色変化効能に対する再現性を評価した結果である。
図4は、SK-MEL-28細胞株でメラニン生成量が最も高い9種のmiR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-933の作用機序を分析するために、メラニン生成シグナル伝達の変化をRT-qPCR反応を通じて分析した結果である。
図5は、human epidermal melanocytes細胞株から選別された9種のmiR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-933のメラニン生成シグナル伝達の変化をRT-qPCR反応を通じて分析した結果である。
図6は、SK-MEL-28細胞株から選別された9種のmiR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-933の作用機序分析のために、メラニン生成シグナル伝達の変化をウエスタンブロット分析法で確認した結果である。
図7は、最終選別された4種のmiR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-8485について、人間の白髪で外毛根鞘(ORS)及び毛包細胞増殖促進を観察した結果である。
図8は、最終選別された4種のmiR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-8485について、人間の白髪で効能(色変化)を観察した結果である。
図9aは、SK-MEL-28細胞株におけるSAMiRNA-miR-3199処理による細胞色変化及びメラニン生成量分析結果を示す。
図9bは、SK-MEL-28細胞株でSAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成シグナル伝達の変化をRT-qPCRにより確認した結果である。
図9cは、SK-MEL-28細胞株でSAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成シグナル伝達の変化をimmunoblot分析法で確認した結果である。
図9dは、SK-MEL-28細胞株でSAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成シグナル伝達の変化をimmunocytochemistry分析法を通じて効能を確認した結果である。
図10aは、miR-3199のターゲット遺伝子としてGSK3βを選別した結果を示す。
図10bは、SK-MEL-28細胞株でSAMiRNA-miR-3199処理によってGSK3β阻害能をRT-qPCR分析法で確認した結果である。
図10cは、SK-MEL-28細胞株でSAMiRNA-miR-3199処理によってGSK3β阻害能をimmunoblot分析法で確認した結果である。
図10dは、SK-MEL-28細胞株でSAMiRNA-miR-3199処理によってGSK3β阻害能をimmunocytochemistry分析法で確認した結果である。
図10eは、miR-3199がGSK3β mRNA 3' UTRに直接結合して作用することをluciferase reporter assay分析法を通じて確認した結果である。
図11aは、human epidermal melanocytesにおけるSAMiRNA-miR-3199処理による細胞色変化及びメラニン生成量の分析結果を示す。
図11bは、human epidermal melanocytesにおけるSAMiRNA-miR-3199処理によってメラニン生成シグナル伝達の変化をRT-qPCR分析法により確認した結果である。
図11cは、human epidermal melanocytesにおけるSAMiRNA-miR-3199処理によってメラニン生成のシグナル伝達変化をimmunoblot分析法で確認した結果である。
図12aは、ヒト毛乳頭細胞、角質形成細胞、ヒトメラニン細胞でSAMiRNA-miR-3199の細胞毒性及び自然免疫毒性を評価した結果である。
図12bは、炎症性サイトカインの増加有無の確認を通じてSAMiRNA-miR-3199の細胞毒性及び自然免疫毒性を評価した結果である。
他に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
本発明では、毛髪の灰白色化及び脱毛を予防、防止または改善しようとする需要により、ヒトmiRNA 1728種に対するスクリーニングライブラリーを合成し(表2)、これをヒト皮膚がん細胞株であるM21、SK-MEL-28細胞に処理し、メラニン生成量測定及び細胞色の変化を総合的に分析することにより、効果の良いmiRNAであるmiR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-8485など4種を発見した。また、前記miRNAがメラニン細胞活性及びメラニン生成促進、毛髪の灰白色化を改善できることを確認し、メラニン生成促進の作用機序を解明し、細胞毒性及び自然免疫毒性評価を通じて副作用なしに毛髪のメラニン生成を促進できることを確認した。加えて、メラニン生成細胞活性と共に毛包に存在する毛乳頭細胞及び角質形成細胞などの細胞増殖が促進され、外毛根鞘の発達及び毛髪の長さが増加することを確認した。
したがって、本発明は、一観点から
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の薬学的組成物に関する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の薬学的組成物に関する。
本発明は別の観点から、
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物に関する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物に関する。
本発明において、前記組成物は、メラニン形成細胞活性及び毛包細胞増殖により、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛が予防または改善されることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、前記miR-3139は、配列番号9で示される塩基配列及び配列番号10で示される塩基配列を含むことを特徴とし、好ましくは、配列番号9で示される塩基配列及び配列番号10で示される塩基配列で構成されるDNA/DNA、RNA/RNA、またはDNA/RNAハイブリッドである。
miR-3139
5'- CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU -3' (配列番号9)
5'- UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU -3' (配列番号10)
miR-3139
5'- CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU -3' (配列番号9)
5'- UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU -3' (配列番号10)
本発明において、前記miR-3189は、配列番号5で示される塩基配列及び配列番号6で示される塩基配列を含むことを特徴とし、好ましくは、配列番号5で示される塩基配列と配列番号6で示される塩基配列で構成されるDNA/DNA、RNA/RNA、またはDNA/RNAハイブリッドである。
miR-3189
5'- UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA -3' (配列番号5)
5'- CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG -3' (配列番号6)
miR-3189
5'- UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA -3' (配列番号5)
5'- CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG -3' (配列番号6)
本発明において、前記miR-3199は、配列番号15で示される塩基配列及び配列番号16で示される塩基配列を含むことを特徴とし、好ましくは、配列番号15で示される塩基配列及び配列番号16で示される塩基配列で構成されるDNA/DNA、RNA/RNA、またはDNA/RNAハイブリッドである。
miR-3199
5'- CUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUU -3' (配列番号15)
5'- AGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUU -3' (配列番号16)
miR-3199
5'- CUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUU -3' (配列番号15)
5'- AGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUU -3' (配列番号16)
本発明において、前記miR-8485は、配列番号1で示される塩基配列及び配列番号2で示される塩基配列を含むことを特徴とし、好ましくは、配列番号1で示される塩基配列と配列番号2で示される塩基配列で構成されるDNA/DNA、RNA/RNA、またはDNA/RNAハイブリッドである。
miR-8485
5'- ACGUGUGUGUGUGUGUGUGUU -3' (配列番号1)
5'- CACACACACACACACACGUAU -3' (配列番号2)
miR-8485
5'- ACGUGUGUGUGUGUGUGUGUU -3' (配列番号1)
5'- CACACACACACACACACGUAU -3' (配列番号2)
本発明のmiR-3189、miR-3199、miR-8485は、microphthalmia-associated transcription factor(MITF)、tyrosinase(TYR)、tyrosinase-related protein 1(TYRP1)、tyrosinase-related protein 2(TYRP2)の発現を増加させ、miR-3139は、TYR、TYRP2の発現を増加させることを確認した。
本発明のmiRNAが増加させる遺伝子は、以下のような機能をすることが知られている。
MITFは、転写因子としてメラニン色素合成に直接関与する酵素であるTYR、TYRP1およびTYRP2遺伝子の発現を調節し、メラニン細胞の発達および分化のための重要な転写因子として知られている(D'Mello, S. A., Finlay, G. J., Baguley, B. C. & Askarian-Amiri, M. E. Signaling Pathways in Melanogenesis.Int J Mol Sci. 17 (2016); Kawakami A, Fisher DE. The master role of microphthalmia-associated transcription factor in melanocyte and melanoma biology. Lab Investig. (2017))。
TYR、TYRP1、TYRP2は、主にチロシンをメラニン色素に変換するのに関与し、特にTYRとTYRP2は、メラニンの量と質に影響を与える重要な酵素として知られている(NIU, C., AISA, H.A..、2017: Upregulation of melanogenesis and tyrosinase activity: potential agents for vitiligo. Molecules 22, E1303. (2017); D'Mello, S. A., Finlay, G. J., Baguley, B. C. & Askarian-Amiri, M. E. Signaling Pathways in Melanogenesis.Int J Mol Sci. 17 (2016))。
前記の背景技術で記述したように、miRNA活性配列の2番目の塩基から8-9番目の塩基まで該当する種子配列(seed region)が活性の主要な要因であるが、二本鎖オリゴヌクレオチドを製造する際、これを含む長い二本鎖オリゴヌクレオチドを製造して使用することもできる。
また、前記miRNAは、二本鎖であってよく、他の態様として単一分子ポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはmiRNAであってもよいが、これに限定されない。
一方、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485は、それを構成するセンス鎖またはこれに相補的なアンチセンス鎖において、一つ以上の塩基が置換、欠失、または挿入された配列を含むことができる。
本発明による二本鎖オリゴヌクレオチドは、一本または両鎖の3'末端に一つまたはそれ以上の非結合された(unpaired)ヌクレオチドを含む構造であるオーバーハング(overhang)を含むことができる。また、前記センス鎖またはアンチセンス鎖は、好ましくは19ないし31個のヌクレオチドで構成されることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、前記RNAまたはDNAオリゴヌクレオチドに親水性物質および疎水性物質が結合されたオリゴ接合体の場合、RNAまたはDNAオリゴヌクレオチドの両末端に親水性物質および疎水性物質が接合された形態の接合体を通じて、オリゴヌクレオチドを生体内で効率的に送達することができるだけでなく、安定性が向上することができる。
また、疎水性物質の疎水性相互作用により自己組織化ナノ粒子を形成することになるが、このようなナノ粒子は、体内への伝達効率及び体内での安定性が極めて優れているだけでなく、構造の改善により粒子サイズが非常に均一であり、QC(Quality control)が容易であるため、薬物としての製造工程が簡単であるという利点がある。
一態様として、前記親水性物質は、(P)n、(Pm-J)nまたは(J-Pm)nで示され、Pは親水性物質モノマー、nは1ないし200、mは1ないし15、Jはm個の親水性物質モノマー間またはm個の親水性物質モノマーとオリゴヌクレオチドを互いに連結するリンカーである。
本発明において、前記親水性物質は、分子量が200ないし10,000であることを特徴とする。
本発明において、前記親水性物質は、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成される群から選択されるいずれか1つであることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、前記リンカ(J)は、PO3
-、SO3及びCO2で構成される群から選択されることを特徴とする。
本発明において、前記疎水性物質の分子量は、250ないし1,000であることを特徴とし、前記疎水性物質は、ステロイド(steroid)誘導体、グリセライド(glyceride)誘導体、グリセロールエーテル(glycerol ether)、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol)、C12ないしC50の不飽和または飽和炭化水素(hydrocarbon)、ジアシルホスファチジルコリン(diacylphosphatidylcholine)、脂肪酸(fatty acid)、リン脂質(phospholipid)及びリポポリアミン(lipopolyamine)で構成される群から選択されることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、前記ステロイド(steroid)誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレスタニルアミンで構成される群から選択されることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、前記グリセリド誘導体は、モノ-、ジ-およびトリ-グリセリドから選択されることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、前記XおよびYで示される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とし、前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とし、前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライト結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とするが、これらに限定されない。
前記親水性物質がAである場合、本発明による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(1')の構造を有することができる。
前記構造式(1')において、A、B、X及びYは、前記構造式(1)の定義と同じであり、SはmiRNAのセンス鎖、ASはmiRNAのアンチセンス鎖を意味する。
一態様として、本発明によるmiRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(2)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体である。
A-X-5' R 3' Y-B 構造式 (2)
前記構造式(2)において、A、B、X、YおよびRは、構造式1での定義と同じである。
A-X-5' R 3' Y-B 構造式 (2)
前記構造式(2)において、A、B、X、YおよびRは、構造式1での定義と同じである。
一態様として、前記親水性物質は、分子量が200ないし10,000の陽イオン性または非イオン性高分子物質であってよく、好ましくは1,000ないし2,000の非イオン性高分子物質であってよい。前記親水性物質の場合、非イオン性親水性高分子化合物として、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成される群から選択されるいずれか1つであることを特徴とするが、これに限定されない。
別の態様として、前記親水性物質が(Pm-J)nまたは(J-Pm)nである場合、本発明による二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(3)または構造式(4)の構造を有する。
(Pm-J)n-X-R-Y-B 構造式 (3)
(J-Pm)n-X-R-Y-B 構造式 (4)
前記構造式(3)及び構造式(4)において、Pは親水性物質モノマー、nは1ないし200、mは1ないし15、Jはm個の親水性物質モノマー間またはm個の親水性物質モノマーとオリゴヌクレオチドを互いに連結するリンカーであり、XとYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合、Rは本発明の特異的なmiRNAsである。より好ましくは、本発明によるmiRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(3')の構造を有する。
前記構造式(3')において、P、B、J、m、n、X及びYは前記構造式(3)の定義と同じであり、SはmiRNAのセンス鎖、ASはmiRNAのアンチセンス鎖を意味する。
(Pm-J)n-X-R-Y-B 構造式 (3)
(J-Pm)n-X-R-Y-B 構造式 (4)
前記構造式(3)及び構造式(4)において、Pは親水性物質モノマー、nは1ないし200、mは1ないし15、Jはm個の親水性物質モノマー間またはm個の親水性物質モノマーとオリゴヌクレオチドを互いに連結するリンカーであり、XとYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合、Rは本発明の特異的なmiRNAsである。より好ましくは、本発明によるmiRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(3')の構造を有する。
より好ましくは、本発明によるmiRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(4')の構造を有する。
前記構造式(4')において、P、B、J、m、n、X及びYは前記構造式(4)の定義と同じであり、SはmiRNAのセンス鎖、ASはmiRNAのアンチセンス鎖を意味する。
前記構造式(3)及び構造式(4)における親水性物質モノマー(P)は、非イオン性親水性高分子のモノマーのうち、本発明の目的に合致するものであればいずれでも制限なく使用することができ、好ましくは表1に記載された化合物(1)ないし化合物(3)から選択されたモノマー、より好ましくは化合物(1)のモノマーを使用することができ、化合物(1)におけるGは、好ましくはCH2、O、S及びNHから選択することができる。
特に、親水性物質モノマーの中でも化合物(1)で示されるモノマーには、様々な官能基を導入することができ、生体内の親和性が良く、免疫反応を少なく誘導するなどの生体適合性(bio-compatibility)が優れているだけでなく、構造式(3)及び構造式(4)による構造体内に含まれるオリゴヌクレオチドの生体内安定性を増加させ、送達効率を増加させることができるという利点があり、本発明による構造体の製造に非常に適している。
構造式(3)及び構造式(4)における親水性物質は、総分子量が1,000ないし2,000の範囲内であることが好ましい。したがって、例えば、化合物(1)によるヘキサエチレングリコール、すなわち、構造式(3)及び構造式(4)におけるGがOであり、mが6である物質が使用される場合、ヘキサエチレングリコールスペーサー(spacer)の分子量が344であるため、繰り返し回数(n)は3ないし5であることが好ましい。本発明は、必要に応じて前記構造式(3)及び構造式(4)で(Pm-J)または(J-Pm)で表される親水性グループの繰り返し単位、すなわち親水性物質ブロックがnで表される適切な数で使用できることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質モノマーであるPとリンカーであるJは、独立して各親水性物質ブロック間で同一である場合もあれば、異なる場合もある。すなわち、親水性物質ブロックが3つ使用される場合(n=3)、1つ目のブロックには化合物(1)による親水性物質モノマーが、2つ目のブロックには化合物(2)による親水性物質モノマーが、3つ目のブロックには化合物(3)による親水性物質モノマーが使用されるなど、全ての親水性物質ブロックごとに異なる親水性物質モノマーが使用されることもあり、全ての親水性物質ブロックに化合物(1)ないし化合物(3)による親水性物質モノマーから選択されるいずれか1つの親水性物質モノマーが同じように使用されることもある。同様に、親水性物質モノマーの結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロックごとに全て同じリンカーが使用されることも、各親水性物質ブロックごとに異なるリンカーが使用されることもある。また、親水性物質モノマーの数であるmも、各親水性物質ブロック間で同一である場合もあれば、異なる場合もある。すなわち、1つ目の親水性物質ブロックでは親水性物質モノマーが3つ連結(m=3)され、2つ目の親水性物質ブロックでは親水性物質モノマーが5つ(m=5)、3つ目の親水性物質ブロックでは親水性物質モノマーが4つ連結(m=4)されるなど、異なる数の親水性物質モノマーが使用されることもあり、すべての親水性物質ブロックで同じ数の親水性物質モノマーが使用されることもある。
本発明において、前記リンカー(J)は、PO3
-、SO3及びCO2で構成される群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。使用される親水性物質のモノマーなどによって、本発明の目的に合致する限り、いかなるリンカーも使用可能であることは、当業者にとって自明である。
前記親水性物質モノマーの全部または一部は、必要に応じて、ターゲット特異的リガンドなど他の物質との結合のために必要な官能基を持つように変更されてもよい。
場合によっては、前記遺伝子に特異的なmiRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体のアンチセンス鎖の5´末端にリン酸基(phosphate group)が1つないし3つ結合することがある。
例えば、miRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(3'')または構造式(4'')の構造を有する。
前記疎水性物質(B)は、疎水性相互作用を通じて構造式(1)によるオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割を果たす。
前記疎水性物質は、分子量が250ないし1,000であることが好ましく、ステロイド(steroid)誘導体、グリセライド(glyceride)誘導体、グリセロールエーテル(glycerol ether)、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol)、C12ないしC50の不飽和または飽和炭化水素(hydrocarbon)、ジアシルホスファチジルコリン(diacylphosphatidylcholine)、脂肪酸(fatty acid)、リン脂質(phospholipid)、リポポリアミン(lipopolyamine)などが使用できるが、これに限定されない。本発明の目的に合致するものであれば、いかなる疎水性物質も使用可能であることは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明である。
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレステロール、コレスタノール、コリン酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレステリルアミンで構成される群から選択することができ、前記グリセリド誘導体は、モノ-、ジ-及びトリ-グリセリドなどから選択することができ、この時、グリセリドの脂肪酸は、C12ないしC50の不飽和または飽和脂肪酸が好ましい。
特に、前記疎水性物質の中でも、飽和または不飽和炭化水素やコレステロールが、本発明によるオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができるという利点を有するという点で好ましい。
前記疎水性物質は、親水性物質の反対側の末端(distal end)に結合し、miRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖のどの位置に結合してもよい。
本発明において、親水性物質、親水性物質ブロックまたは疎水性物質とオリゴヌクレオチドは、単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合(XまたはY)によって結合される。前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のいずれであってもよい。この時、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸化結合があり、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライト結合、生分解性結合または酵素分解性結合などがあるが、これらに限定されない。
本発明で提供するメラニン細胞活性及びメラニン生成促進による毛髪の灰白色化改善用、脱毛の予防または改善用、毛包細胞増殖促進用及び/または発毛促進用組成物の有効成分として使用可能なmiRNA配列は、ヒト遺伝子由来の配列であるが、miRNAの由来遺伝子をヒト遺伝子に限定せず、他の動物由来の遺伝子から得られたmiRNA配列も使用することができる。
前記miRNAは、miRNAの生物学的等価効能を発生させる様々なmiRNA誘導体(miRNA mimic)の形で使用することができ、同じ種子部分を含むmiRNA配列を含む変形されたmiRNAを使用することができる。この時、前記のmiRNAセンス及びアンチセンス配列の長さを減らすことができ、長さが15個のヌクレオチドで構成された短い誘導体の使用も可能である。
前記miRNAに対するmiRNA誘導体としては、RNAのリン酸骨格構造(phosphate backbone structure)を硫黄などの他の元素で置換した形態であるホスホロチオエート(phosphorothiolate)構造を部分的に含むことができ、RNAの代わりにDNA、PNA(peptide nucleic acids)およびLNA(locked nucleic acid)分子で全体または部分的に置換した形で使用可能であり、また、RNA糖の2'水酸化基を様々な機能性構造で置換した形で使用可能であり、これはメチル化、メトキシ化、フッ素化などを含むが、これらの変形に限定されない。
前記miRNAは、成熟miRNAとそこから誘導された前記miRNA誘導体の二本鎖RNAに限定されるものではなく、miRNA前駆体の形で使用することができ、miRNA前駆体もまた、前記記載のRNAリン酸骨格構造、RNA核酸のDNA、PNAおよびLNAなどへの部分または全体置換、RNA糖分子の2'水酸化基の変形が可能である。
前記miRNAは、miRNA前駆体または一次miRNA(pre-miRNA)の形で使用可能であり、これを化学的な方法で合成したり、またはプラスミド(plasmid)の形で細胞に伝達して発現することが可能である。
本発明において、miRNAを培養皿で培養した細胞に伝達する方法は、陽イオン性脂質との混合物を使用する方法、電気的な刺激で伝達する方法及びウイルスを利用する方法などを使用することができるが、当業界でmiRNAを伝達することが知られている様々な方法を当業者が容易に適用して使用することができ、前記の方法に限定されない。
本発明は、別の観点から、前記miR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485のmiRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体およびナノ粒子に関する。
先に説明したように、前記miRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、疎水性及び親水性物質の両方を含んでいる両親媒性であり、親水性部分は体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用を通じて親和性を持っているため外側に向かうようになり、疎水性物質はそれらの間の疎水性相互作用(hydrophobic interaction)を通じて内側に向かうようになり、熱力学的に安定したナノ粒子を形成する。つまり、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置し、前記miRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチドの外側方向に親水性物質が位置し、前記miRNA配列を保護する形のナノ粒子を形成する。
本発明によるナノ粒子は、同じ配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド構造体のみで形成することもあるし、異なる配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド構造体で構成することもあることを特徴とし、異なるメラニン生成促進及び毛包細胞増殖促進遺伝子ターゲットmiRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が本発明によるナノ粒子に含まれることもある。例えば、前記ナノ粒子は、miR-3139を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体とmiR-8485を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が混合されてナノ粒子を構成することがある。
また、前記miRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体以外の他のメラニン細胞活性を通じたメラニン生成促進及び毛包細胞増殖促進miRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、またはこれを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体が本発明による組成物にさらに含まれることがある。
本発明では、前記miRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体(SAMiRNATM)及びナノ粒子のメラニン細胞活性及びメラニン生成促進効果とこれによる灰白色化改善効果が確認された。また、メラニン生成細胞の活性と共に毛包に存在する毛乳頭細胞及び角質形成細胞の増殖促進効果が確認された。
したがって、本発明は、前記組成物を薬学的用途及び化粧料として活用することができるが、前記薬学的組成物は、軟膏、ペースト、ゲル、ゼリー、セラム(serum)、エアゾールスプレー、非エアゾールスプレー、フォーム、クリーム、ローション、溶液または懸濁液の剤形の中から選択される剤形に使用されることを特徴とするが、これに限定されない。
前記組成物を化粧料として使用する場合、これに限定されないが、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャークリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアゾール、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘアソープ、ヘアクレンジングフォーム、ヘアオイル、ヘアドライヤー、毛髪保存処理剤、毛髪染色剤、毛髪用ウェーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアジェル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング剤、ヘアラッカー、ヘアモイスチャライザー、ヘアムースまたはヘアスプレーの剤形の中から選択される剤形に使用されることを特徴とする。
本発明の組成物には、前記の有効成分に加えて、さらに薬剤学的に許容可能な担体を1種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能でなければならず、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分の中の一つまたは二つ以上の成分を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形として製剤化することができる。特に、凍結乾燥(lyophilized)された形態の剤形に製剤化して提供することが望ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明が属する技術分野で通常知られている方法が使用することができ、凍結乾燥のための安定化剤が追加されることもある。さらに、当分野の適切な方法またはレミントンの薬学科学(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)に開示されている方法を利用して、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
本発明の組成物に含まれる有効成分などの含有量及び投与方法は、通常の個人のメラニン細胞数及び機能低下の程度、灰白色化の症状と部位の重症度に基づいて、当技術分野の通常の専門家が決定することができる。また、酸剤、錠剤、注射剤、軟膏剤、機能性化粧品などの様々な形態で製剤化することができ、単位-投与量または多-投与量容器、例えば密封されたアンプルおよびボトルなどで提供することもできる。
本発明による前記miRNAを含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、これを含む組成物またはナノ粒子を機能性化粧品または皮膚外用剤の製造に利用する場合、機能性化粧品または皮膚外用剤の剤形は、クリーム、ローション、ゲル、水溶性リキッドおよびエッセンスで構成される群から選択されることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明は、別の観点から、毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善が必要な対象物に
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を投与する段階を含む毛髪の白化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善方法を提供する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を投与する段階を含む毛髪の白化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善方法を提供する。
本発明は、別の観点から、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善のための
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
本発明は、別の観点から、毛髪の灰白色化改善、発毛促進、および/または脱毛の予防または改善のための医薬品または化粧料の製造のための(i)miR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体:
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体:
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純な共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供する。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、あくまでも本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業者にとって自明であろう。
実施例1:メラニン生成促進miRNA選別のためのスクリーニング
1-1:メラニン生成促進ヒトmiRNA候補群
miRNAデータベースであるmiRBase(www.mirbase.org)が提供する21バージョンのヒトmiRNA配列として、ステムループ構造(stem-loop structure)基準で1728種のmiRNAを二本鎖オリゴヌクレオチド構造体(SAMiRNATM)に搭載された形で合成した(表2)。合成されたすべてのmiRNA鎖は、MALDI-TOF方式の質量分析機を使用して意図した配列の合成有無を判別及び確認した。ヒト皮膚がん細胞株を対象に1728種のmiRNAを利用して、メラニン生成量が最も高いmiRNAを発見するためのスクリーニングを行った。本発明で実験したヒト1728種のmiRNAセンス鎖の配列はmiRbase(http://www.mirbase.org)に公知されており、種子配列(seed region)が一方の鎖にのみある場合、二重鎖の形で細胞に伝達するために相補的な配列を合成した。
1-1:メラニン生成促進ヒトmiRNA候補群
miRNAデータベースであるmiRBase(www.mirbase.org)が提供する21バージョンのヒトmiRNA配列として、ステムループ構造(stem-loop structure)基準で1728種のmiRNAを二本鎖オリゴヌクレオチド構造体(SAMiRNATM)に搭載された形で合成した(表2)。合成されたすべてのmiRNA鎖は、MALDI-TOF方式の質量分析機を使用して意図した配列の合成有無を判別及び確認した。ヒト皮膚がん細胞株を対象に1728種のmiRNAを利用して、メラニン生成量が最も高いmiRNAを発見するためのスクリーニングを行った。本発明で実験したヒト1728種のmiRNAセンス鎖の配列はmiRbase(http://www.mirbase.org)に公知されており、種子配列(seed region)が一方の鎖にのみある場合、二重鎖の形で細胞に伝達するために相補的な配列を合成した。
例えば、miR-3139のmiRNAは以下のように製造した。
配列番号9:5'- CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU -3'
配列番号10:5'- UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU -3'
配列番号9:5'- CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU -3'
配列番号10:5'- UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU -3'
また、種子配列が両鎖にある場合、各鎖をセンスおよびアンチセンス鎖として合成した。例えば、miR-3189のmiRNAは以下のように製造した。
配列番号5:5'- UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA -3' (sense)
配列番号6:5'- CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG -3' (antisense)
配列番号5:5'- UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA -3' (sense)
配列番号6:5'- CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG -3' (antisense)
1-2:細胞培養及びmiRNAのトランスフェクション(Transfection)
メラニン生成を効果的に増加させるmiRNAを発見するために、ヒト由来皮膚がん細胞株であるhuman melanoma M21(Korean cell line bank、KR)を利用した。M21細胞株は、10% Fetal Bovine Serum(FBS、Hyclone、US)及び1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むDMEM培地(Hyclone、US)を用いて37℃/5% CO2条件で培養した。M21細胞を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellの条件で分注し、翌日Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen、US)を用いて製造業者のプロトコルに従ってmiRNAを40nMでトランスフェクションした。
メラニン生成を効果的に増加させるmiRNAを発見するために、ヒト由来皮膚がん細胞株であるhuman melanoma M21(Korean cell line bank、KR)を利用した。M21細胞株は、10% Fetal Bovine Serum(FBS、Hyclone、US)及び1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むDMEM培地(Hyclone、US)を用いて37℃/5% CO2条件で培養した。M21細胞を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellの条件で分注し、翌日Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen、US)を用いて製造業者のプロトコルに従ってmiRNAを40nMでトランスフェクションした。
1-3:メラニン生成量測定による1728種のmiRNA1次スクリーニング及び再現評価
実施例1-2の方法でM21細胞に1728種のmiRNAを3回繰り返してトランスフェクションを行った。72時間培養後、全ての細胞を集め、メラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応後、波長405mm下で吸光度を測定して色変化及びメラニン生成量を比較した。72時間培養後、すべての細胞を集め、メラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。再現評価のために上位9種のmiRNAを対象にM21細胞株に実施例1-2の方法で処理した。72時間培養後、すべての細胞を集め、メラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
実施例1-2の方法でM21細胞に1728種のmiRNAを3回繰り返してトランスフェクションを行った。72時間培養後、全ての細胞を集め、メラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応後、波長405mm下で吸光度を測定して色変化及びメラニン生成量を比較した。72時間培養後、すべての細胞を集め、メラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。再現評価のために上位9種のmiRNAを対象にM21細胞株に実施例1-2の方法で処理した。72時間培養後、すべての細胞を集め、メラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
その結果、合計1728種を処理したM21細胞株でメラニン生成量が13.0μg/ml以上(陰性対照群に比べて1.88倍以上)、陽性対照群であるIBMX(Sigma、US)/CuSO4(Sigma、US)処理群と類似のメラニン生成量を示す9種のmiRNAを選別した(図1)。再現評価のための繰り返し実験でも、選別された上位9種のmiRNAにより、M21細胞株で陰性対照群に比べて高い色変化及びメラニン生成が確認された(図2、表3)。
実施例2:選別された9種のmiRNAの再現評価及びメラニン生成メカニズム分析を通じた最終配列のスクリーニング
2-1:細胞培養とmiRNAのトランスフェクション(Transfection)
メラニン生成上位9種の再現評価のために、ヒト由来皮膚がん細胞株であるSK-MEL-28(Korean cell line bank、KR)を利用した。SK-MEL-28細胞株は、10% FBS(Hyclone、US)と1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むMEM培地(Hyclone、US)を用いて37℃/5% CO2条件で培養した。SK-MEL-28細胞を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellの条件で分注し、翌日Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen、US)を用いて製造業者のプロトコルに従ってmiRNAを40nMでトランスフェクションした。
2-1:細胞培養とmiRNAのトランスフェクション(Transfection)
メラニン生成上位9種の再現評価のために、ヒト由来皮膚がん細胞株であるSK-MEL-28(Korean cell line bank、KR)を利用した。SK-MEL-28細胞株は、10% FBS(Hyclone、US)と1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むMEM培地(Hyclone、US)を用いて37℃/5% CO2条件で培養した。SK-MEL-28細胞を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellの条件で分注し、翌日Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen、US)を用いて製造業者のプロトコルに従ってmiRNAを40nMでトランスフェクションした。
2-2:メラニン生成量分析を通じた上位9種のmiRNAの再現評価
選別された上位9種のmiRNAの再現評価のために、SK-MEL-28細胞を対象に色変化及びメラニン生成量を測定した。実施例2-1の方法でSK-MEL-28細胞にmiR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-933をそれぞれ3回繰り返してトランスフェクションを行った。72時間培養後、すべての細胞を集めて色変化を観察し、メラニン生成量測定のためにメラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応させた後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
選別された上位9種のmiRNAの再現評価のために、SK-MEL-28細胞を対象に色変化及びメラニン生成量を測定した。実施例2-1の方法でSK-MEL-28細胞にmiR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-933をそれぞれ3回繰り返してトランスフェクションを行った。72時間培養後、すべての細胞を集めて色変化を観察し、メラニン生成量測定のためにメラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応させた後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
その結果、miR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-933を処理した群で、陰性対照群に比べて顕著な色変化およびメラニン生成増加が観察された。陽性対照群であるメラニン誘導物質と比較すると、著しく優れた色変化及びメラニン生成量の増加が確認された(図3)。
2-3:SK-MEL-28細胞におけるメラニン生成促進作用機序解析のためのRT-qPCR分析
選別された上位9種のmiRNAのメラニン生成促進作用機序を分析するために、メラニン生成過程の重要な因子であるMITF、TYR、TYRP1、TYRP2などの遺伝子分析のためにRT-qPCR分析を行った。SK-MEL-28細胞株を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例2-1の方法でSK-MEL-28細胞にmiR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-933をそれぞれ3回繰り返してトランスフェクションを行った。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群対比実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。各遺伝子に対するプライマー配列は以下の通りである(表4)。
選別された上位9種のmiRNAのメラニン生成促進作用機序を分析するために、メラニン生成過程の重要な因子であるMITF、TYR、TYRP1、TYRP2などの遺伝子分析のためにRT-qPCR分析を行った。SK-MEL-28細胞株を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例2-1の方法でSK-MEL-28細胞にmiR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-933をそれぞれ3回繰り返してトランスフェクションを行った。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群対比実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。各遺伝子に対するプライマー配列は以下の通りである(表4)。
その結果、メラニン小体でメラニン合成に直接関与する酵素であるTYR、TYRP1およびTYRP2の遺伝子発現が9種のmiRNAによって増加することを確認した(図4)。転写因子であるMITFの場合、弱く増加するか、変化が観察されないことを確認し、これはMITFの調節が遺伝子発現だけでなく、タンパク質の安定性及び活性化(activity)によって調節される機序が存在するためであると解釈される。
2-4:ヒトメラニン形成細胞におけるメラニン生成促進作用機序解析のためのRT-qPCR分析
人間の正常皮膚組織から得たメラニン形成細胞(Human Epidermal Melanocytes)を用いて9種のmiRNAによるMITF、TYR、TYRP1、TYRP2の遺伝子発現を分析した。Human Epidermal Melanocytes(Invitrogen、US)細胞を12 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、human melanocyte growth supplement-2(Gibco、US)を含むmammalian cell culture/primary cell culture(Gibco、US)に37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、miR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-933の9種をそれぞれ5μM濃度で処理した。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。
人間の正常皮膚組織から得たメラニン形成細胞(Human Epidermal Melanocytes)を用いて9種のmiRNAによるMITF、TYR、TYRP1、TYRP2の遺伝子発現を分析した。Human Epidermal Melanocytes(Invitrogen、US)細胞を12 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、human melanocyte growth supplement-2(Gibco、US)を含むmammalian cell culture/primary cell culture(Gibco、US)に37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、miR-8485、miR-7978、miR-6074、miR-3132、miR-4644、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-933の9種をそれぞれ5μM濃度で処理した。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。
その結果、ヒト正常メラニン形成細胞では、黒色腫細胞であるM21の結果とは異なり、miR-8485、miR-7978、miR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-933によってMITFの遺伝子発現が陰性対照群に比べて約1.2~1.7倍増加することを確認した。また、TYRの場合、9種のmiRNAによって約1.2~3.1倍増加することを確認した。TYRP1およびTYRP2の場合、9種のmiRNA配列別に発現様式の違いが観察されたが、miR-8485、miR-7978、miR-3189、miR-3199、miR-933の場合、TYRP1およびTYRP2がすべて増加する傾向を示し、miR-6074、miR-3139、miR-4644の場合、TYRP2だけが増加することを確認した(図5)。
2-5:メラニン生成促進作用機序解析のためのウエスタンブロット分析
メラニン生成過程で重要な因子であるMITF及びTYRタンパク質の発現分析のためにウエスタンブロット分析を行った。SK-MEL-28細胞株を6 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例2-1の方法でSK-MEL-28細胞にmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485をそれぞれトランスフェクションした。96時間培養後、ウエスタンブロットプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはMITF(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
メラニン生成過程で重要な因子であるMITF及びTYRタンパク質の発現分析のためにウエスタンブロット分析を行った。SK-MEL-28細胞株を6 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例2-1の方法でSK-MEL-28細胞にmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485をそれぞれトランスフェクションした。96時間培養後、ウエスタンブロットプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはMITF(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
その結果、前記のRT-qPCR結果と同様に9種のmiRNAによってMITF及びTYRタンパク質が増加することを確認した(図6)。選別された上位9種のmiRNA処理による細胞色変化、メラニン合成量、メラニン生成過程の主要遺伝子及びタンパク質発現結果を総合して、最もメラニン合成量が高く、MITF、TYR、TYRP1/2の遺伝子及びタンパク質発現が明らかなmiR-3139、miR-3189、miR-3199、miR-8485の4種を最終的に選別した(表5)。
実施例3:最終選別された4種のmiRNAのヒトの毛髪に対する効能評価
最終的に選別された4種のmiRNAを利用して、人間の白髪を対象に効能評価を行った。毛髪は、実験当日、白髪の一番先端部分を抜いて採取し、毛根から1~2cm程度切った後、24 well plate(Falcon、US)に10% FBS(Hyclone、US)と1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むDMEM/F12培地(Gibco、US)200μLで培養を開始した。2日間隔で約35日間、4種のmiRNAを5μM濃度で処理しながら、白髪の毛根細胞の増殖、毛髪の色変化及び性状を観察した。
最終的に選別された4種のmiRNAを利用して、人間の白髪を対象に効能評価を行った。毛髪は、実験当日、白髪の一番先端部分を抜いて採取し、毛根から1~2cm程度切った後、24 well plate(Falcon、US)に10% FBS(Hyclone、US)と1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むDMEM/F12培地(Gibco、US)200μLで培養を開始した。2日間隔で約35日間、4種のmiRNAを5μM濃度で処理しながら、白髪の毛根細胞の増殖、毛髪の色変化及び性状を観察した。
その結果、陰性対照群では処理期間中に大きな変化はなかったが、miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485で処理した群では、時間の経過とともにHair follicleの外毛根鞘部位が広がり、毛包細胞および角質形成細胞の増殖(proliferation)または移動(migration)の増加が観察され、hair follicleの長さの増加も観察された(図7)。また、毛幹(hair shaft)を含め全体的に灰白色化が改善されることを確認した(図8)。
実施例4:SK-MEL-28細胞におけるSAMiRNA-miR-3199のメラニン生成促進効能評価
4-1:細胞培養及びSAMiRNA-miR-3199の処理(treatment)
SAMiRNA-miR-3199のメラニン生成促進効能評価のために、ヒト由来皮膚がん細胞株であるSK-MEL-28(Korean cell line bank、KR)を利用した。SK-MEL-28細胞株は、10% FBS(Hyclone、US)と1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むMEM培地(Hyclone、US)を用いて37℃/5% CO2条件で培養した。SK-MEL-28細胞を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellの条件で分注し、翌日5μM濃度で処理した。
4-1:細胞培養及びSAMiRNA-miR-3199の処理(treatment)
SAMiRNA-miR-3199のメラニン生成促進効能評価のために、ヒト由来皮膚がん細胞株であるSK-MEL-28(Korean cell line bank、KR)を利用した。SK-MEL-28細胞株は、10% FBS(Hyclone、US)と1% Penicillin-Streptomycin(Hyclone、US)を含むMEM培地(Hyclone、US)を用いて37℃/5% CO2条件で培養した。SK-MEL-28細胞を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellの条件で分注し、翌日5μM濃度で処理した。
4-2:SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成量分析
実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞にSAMiRNA-miR-3199を処理した。72時間培養後、すべての細胞を集めて色変化を観察し、メラニン生成量測定のためにメラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応させた後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞にSAMiRNA-miR-3199を処理した。72時間培養後、すべての細胞を集めて色変化を観察し、メラニン生成量測定のためにメラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応させた後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
その結果、SAMiRNA-miR-3199を処理した場合、陰性対照群に比べて顕著な色変化及びメラニン量の増加が観察された(図9a)。
4-3:SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成関連遺伝子の発現解析
SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成関連遺伝子MITF、TYR、TYRP1、TYRP2の遺伝子分析のためにRT-qPCR分析を行った。実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群と比較した実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。
SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成関連遺伝子MITF、TYR、TYRP1、TYRP2の遺伝子分析のためにRT-qPCR分析を行った。実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群と比較した実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。
その結果、SAMiRNA-miR-3199処理によってメラニン合成の核心転写因子であるMITFが有意に増加し、メラニン合成の核心酵素であるTYR、TYRP1およびTYRP2の遺伝子発現が大きく増加することを確認した(図9b)。
4-4:SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成関連タンパク質発現量分析
メラニン生成過程の核心因子であるMITF及びTYRタンパク質発現分析のためにimmunoblotを実施した。SK-MEL-28細胞株を6 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、SK-MEL-28細胞株に5μM SAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、immunoblotプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはMITF(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、α-Tubulin(Cell Signaling Technology、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
メラニン生成過程の核心因子であるMITF及びTYRタンパク質発現分析のためにimmunoblotを実施した。SK-MEL-28細胞株を6 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、SK-MEL-28細胞株に5μM SAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、immunoblotプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはMITF(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、α-Tubulin(Cell Signaling Technology、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
その結果、RT-qPCRによる遺伝子発現分析結果と同様に、SAMiRNA-miR-3199処理によってMITF及びTYRタンパク質が大きく増加することを確認した(図9c)。
4-5:SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成関連タンパク質の細胞内発現解析
メラニン生成の核心因子であるMITF及びTYRタンパク質の細胞内発現パターン分析のためにimmunocytochemistry分析を行った。細胞分注前に12 well plate(Falcon、US)にcover glassを入れ、Poly-L-lysineを利用して1時間コーティングした後、SK-MEL-28細胞株を2×104cells/wellで分注し、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、細胞透過のために0.1%のTriton-X100溶液に10分間反応させた後、1% BSAを含む溶液に1時間ブロックし、一次抗体にはMITF(abcam、UK)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。染色された細胞の蛍光分析のためにスピニングディスクコンフォーカル(Dragonfly high-speed confocal image platform、Andor)を用いて画像を分析した。
メラニン生成の核心因子であるMITF及びTYRタンパク質の細胞内発現パターン分析のためにimmunocytochemistry分析を行った。細胞分注前に12 well plate(Falcon、US)にcover glassを入れ、Poly-L-lysineを利用して1時間コーティングした後、SK-MEL-28細胞株を2×104cells/wellで分注し、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、細胞透過のために0.1%のTriton-X100溶液に10分間反応させた後、1% BSAを含む溶液に1時間ブロックし、一次抗体にはMITF(abcam、UK)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。染色された細胞の蛍光分析のためにスピニングディスクコンフォーカル(Dragonfly high-speed confocal image platform、Andor)を用いて画像を分析した。
その結果、SAMiRNA-miR-3199処理によって転写因子であるMITFの場合、核での発現が大きく増加し、メラニン合成酵素であるTYRの場合、メラニン小体がある細胞質での発現が大きく増加することを確認した(図9d)。
実施例5:SAMiRNA-miR-3199のターゲット遺伝子分析及びメカニズム分析
5-1:miR-3199ターゲット遺伝子解析
miRNAターゲット遺伝子予測プログラム(TargetScan、http://www/targetscan.org/)を利用して、miR-3199の種子配列と結合が可能な予測された多くの遺伝子の中から、メラニン生成機序の主要なシグナル伝達系核心調節因子であるGSK3β遺伝子を選別した。GSK3βの3'UTRの4153-4159にmiR-3199の結合が予測された(図10a)。
5-1:miR-3199ターゲット遺伝子解析
miRNAターゲット遺伝子予測プログラム(TargetScan、http://www/targetscan.org/)を利用して、miR-3199の種子配列と結合が可能な予測された多くの遺伝子の中から、メラニン生成機序の主要なシグナル伝達系核心調節因子であるGSK3β遺伝子を選別した。GSK3βの3'UTRの4153-4159にmiR-3199の結合が予測された(図10a)。
5-2:SAMiRNA-miR-3199のターゲット遺伝子GSK3β mRNA阻害能分析
SAMiRNA-miR-3199のターゲット遺伝子GSK3β mRNA阻害能分析のためにRT-qPCR分析を行った。SK-MEL-28細胞株を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。24時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従ってGSK3β(Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群対比実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。GSK3βに対するプライマー配列は以下の通りである(表6)。
SAMiRNA-miR-3199のターゲット遺伝子GSK3β mRNA阻害能分析のためにRT-qPCR分析を行った。SK-MEL-28細胞株を12 well plate(Falcon、US)に4×104cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。24時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従ってGSK3β(Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群対比実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。GSK3βに対するプライマー配列は以下の通りである(表6)。
その結果、SAMiRNA-miR-3199処理により、ターゲット遺伝子であるGSK3βが有意に減少することを確認した(図10b)。
5-3:SAMiRNA-miR-3199処理によるGSK3βタンパク質発現量分析
SAMiRNA-miR-3199のGSK3βタンパク質阻害能分析のためにimmunoblotを行った。SK-MEL-28細胞株を6 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、immunoblotプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはGSK3β(Cell Signaling Technology Inc.、US)、β-catenin(Becton, Dickinson and Company Inc、US)、α-Tubulin(Cell Signaling Technology、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
SAMiRNA-miR-3199のGSK3βタンパク質阻害能分析のためにimmunoblotを行った。SK-MEL-28細胞株を6 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、immunoblotプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはGSK3β(Cell Signaling Technology Inc.、US)、β-catenin(Becton, Dickinson and Company Inc、US)、α-Tubulin(Cell Signaling Technology、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
その結果、RT-qPCRによるGSK3β遺伝子発現分析結果と同様に、SAMiRNA-miR-3199処理によってGSK3βタンパク質が減少することを確認した。GSK3βは、β-cateninをリン酸化してタンパク質分解(degradation)を促進してタンパク質安定性を低下させ、GSK3βの発現が阻害されるとβ-cateninタンパク質安定性が増加し、タンパク質が増加する。したがって、SAMiRNA-miR-3199処理によってβ-cateninタンパク質が増加することを確認した(図10c)。
5-4:SAMiRNA-miR-3199処理による細胞内GSK3βタンパク質の発現パターン分析
SAMiRNA-miR-3199処理による細胞内GSK3βタンパク質発現パターン分析のためにimmunocytochemistryを行った。細胞分注前に12 well plate(Falcon、US)に cover glassを入れ、Poly-L-lysineを利用して1時間コーティングした後、SK-MEL-28細胞株を2×104cells/wellで分注して37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。48時間培養後、細胞透過のために0.1%のTriton-X100溶液に10分間反応させた後、1% BSAを含む溶液に1時間ブロックし、一次抗体にはGSK3β(Cell Signaling Technology Inc.、US)、β-catenin(Becton, Dickinson and Company Inc、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。染色された細胞の蛍光分析のためにスピニングディスクコンフォーカル(Dragonfly high-speed confocal image platform、Andor)を用いて分析した。
SAMiRNA-miR-3199処理による細胞内GSK3βタンパク質発現パターン分析のためにimmunocytochemistryを行った。細胞分注前に12 well plate(Falcon、US)に cover glassを入れ、Poly-L-lysineを利用して1時間コーティングした後、SK-MEL-28細胞株を2×104cells/wellで分注して37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、実施例4-1の方法でSK-MEL-28細胞株にSAMiRNA-miR-3199を処理した。48時間培養後、細胞透過のために0.1%のTriton-X100溶液に10分間反応させた後、1% BSAを含む溶液に1時間ブロックし、一次抗体にはGSK3β(Cell Signaling Technology Inc.、US)、β-catenin(Becton, Dickinson and Company Inc、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)とHRP-linked-anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。染色された細胞の蛍光分析のためにスピニングディスクコンフォーカル(Dragonfly high-speed confocal image platform、Andor)を用いて分析した。
その結果、SAMiRNA-miR-3199処理により、ターゲット遺伝子であるGSK3βの発現が減少することを確認し、β-cateninタンパク質が核と細胞質で大きく増加することを確認した(図10d)。
5-5:SAMiRNA-miR-3199のGSK3β mRNAの3'UTRへの直接結合有無の分析
miR-3199がGSK3β mRNAの3'UTRへの直接結合有無を分析するためにluciferase reporter assayを行った。SK-MEL-28細胞株を12 well plate(Falcon、US)に3×104cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、SK-MEL-28細胞株にGSK3β結合部位が正常なGSK3β-wild type(WT)またはGSK3β結合部位を変異させた(結合できない形)GSK3β-mutant(MT)が挿入されたベクターをLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen、US)を用いてトランスフェクションさせた。同時に5μMのSAMiRNA-miR-3199をそれぞれ処理した。96時間培養後、luciferase activity測定のためにDual-Luciferase(登録商標) Reporter Assay System(PromegaTM Corporation、US)を使用して製造業者のプロトコルに従って実験を行い、分析した。
miR-3199がGSK3β mRNAの3'UTRへの直接結合有無を分析するためにluciferase reporter assayを行った。SK-MEL-28細胞株を12 well plate(Falcon、US)に3×104cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、SK-MEL-28細胞株にGSK3β結合部位が正常なGSK3β-wild type(WT)またはGSK3β結合部位を変異させた(結合できない形)GSK3β-mutant(MT)が挿入されたベクターをLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen、US)を用いてトランスフェクションさせた。同時に5μMのSAMiRNA-miR-3199をそれぞれ処理した。96時間培養後、luciferase activity測定のためにDual-Luciferase(登録商標) Reporter Assay System(PromegaTM Corporation、US)を使用して製造業者のプロトコルに従って実験を行い、分析した。
その結果、正常結合部位を持つGSK3β-WTが発現している細胞にSAMiRNA-miR-3199処理した場合、luciferase activityが有意に減少し、変異結合部位を持つGSK3β-MTが発現している細胞ではSAMiRNA-miR-3199処理によるluciferase activityの変化がないことを確認した(図10e)。これにより、miR-3199がGSK3β mRNAの3' UTR(4153-4159)に直接結合してGSK3βを阻害することを確認した。
実施例6:ヒトメラニン細胞におけるSAMiRNA-miR-3199のメラニン生成促進効能評価
6-1:細胞培養及びSAMiRNA-miR-3199の処理(treatment)
SAMiRNA-miR-3199のメラニン生成促進効能評価のために、人間の正常皮膚組織から得たHuman Epidermal Melanocytes(HEMs、Invitrogen、US)を利用した。HEMsは、melanocyte growth supplement-2(Gibco、US)を含むmammalian cell culture/primary cell culture medium(Gibco、US)に37℃/5% CO2条件で培養した。HEMsを12 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellの条件で分注し、翌日SAMiRNA-miR-3199を5μM濃度で処理した。
6-1:細胞培養及びSAMiRNA-miR-3199の処理(treatment)
SAMiRNA-miR-3199のメラニン生成促進効能評価のために、人間の正常皮膚組織から得たHuman Epidermal Melanocytes(HEMs、Invitrogen、US)を利用した。HEMsは、melanocyte growth supplement-2(Gibco、US)を含むmammalian cell culture/primary cell culture medium(Gibco、US)に37℃/5% CO2条件で培養した。HEMsを12 well plate(Falcon、US)に1×105cells/wellの条件で分注し、翌日SAMiRNA-miR-3199を5μM濃度で処理した。
6-2:SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成量分析
SAMiRNA-miR-3199の効能評価のためにHEMsを対象に色変化及びメラニン生成量を測定した。実施例6-1の方法でHEMsにSAMiRNA-miR-3199を5μM濃度で処理した。72時間培養後、すべての細胞を集めて色変化を観察し、メラニン生成量測定のためにメラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応させた後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
SAMiRNA-miR-3199の効能評価のためにHEMsを対象に色変化及びメラニン生成量を測定した。実施例6-1の方法でHEMsにSAMiRNA-miR-3199を5μM濃度で処理した。72時間培養後、すべての細胞を集めて色変化を観察し、メラニン生成量測定のためにメラニン抽出プロトコルに従って1M NaOH(Bioneer、KR)に37℃で2時間反応させた後、波長405mm下で吸光度を測定してメラニン生成量を分析した。
その結果、SAMiRNA-miR-3199を処理した場合、陰性対照群に比べて顕著な色変化及びメラニン量の増加が観察された(図11a)。
6-3:SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成関連遺伝子発現解析
SAMiRNA-miR-3199処理後、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2、GSK3βなどの遺伝子分析のためにRT-qPCR分析を行った。実施例6-1の方法でHEMsにSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群に比べて実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。
SAMiRNA-miR-3199処理後、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2、GSK3βなどの遺伝子分析のためにRT-qPCR分析を行った。実施例6-1の方法でHEMsにSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を用いて細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って前記遺伝子(Human qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。qPCR array後に導出される二つの遺伝子のCt値を2(- Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8]を通じて相対定量分析で対照群に比べて実験群の各遺伝子mRNAの相対的な量(fold change)を計算した。
その結果、SAMiRNA-miR-3199処理によってMITF、TYR、TYRP1、TYRP2の遺伝子発現が大きく増加することを確認した(図11b)。また、miR-3199のターゲット遺伝子であるGSK3βが有意に減少することを確認した(図11b)。
6-4:SAMiRNA-miR-3199処理によるメラニン生成コアタンパク質の発現量分析
SAMiRNA-miR-3199処理によるMITF及びTYRタンパク質発現変化の分析のためにimmunoblotを行った。HEMsを6 well plate(Falcon、US)に2×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。実施例6-1の方法でHEMsにSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、immunoblotプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはMITF(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、α-Tubulin(Cell Signaling Technology、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
SAMiRNA-miR-3199処理によるMITF及びTYRタンパク質発現変化の分析のためにimmunoblotを行った。HEMsを6 well plate(Falcon、US)に2×105cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。実施例6-1の方法でHEMsにSAMiRNA-miR-3199を処理した。96時間培養後、immunoblotプロトコルに従って分析を行った。一次抗体にはMITF(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、Tyrosinase(Santa Cruz Biotechnology Inc.、US)、α-Tubulin(Cell Signaling Technology、US)を使用し、二次抗体にはHRP-linked-anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology、US)を使用した。
その結果、RT-qPCRによる遺伝子発現分析結果と同様に、SAMiRNA-miR-3199処理によってMITF及びTYRタンパク質が増加することを確認した(図11c)。
実施例7:SAMiRNA-miR-3199の細胞毒性及び自然免疫毒性評価
7-1:SAMiRNA-miR-3199の細胞毒性評価
SAMiRNA-miR-3199の細胞毒性評価のために、ヒト毛乳頭細胞であるHuman follicle dermal papilla cell(HFDPC, Promocell、DE)、角質形成細胞であるHaCaT(ATCC、US)、ヒトメラニン細胞(Human Epidermal Melanocytes、Invitrogen、US)を利用した。96 well plate(Falcon、US)にHFDPC 3×103cells/well、HaCaT 4×103cells/well、HEMs 5×103cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、各細胞にSAMiRNA-miR-3199を濃度別(0、1、5、10、20μM)に処理した。72時間培養後、細胞毒性測定のためにWST assay kit(DOGEN、KR)を使用して製造業者のプロトコルに従って実験を行い、分析した。
7-1:SAMiRNA-miR-3199の細胞毒性評価
SAMiRNA-miR-3199の細胞毒性評価のために、ヒト毛乳頭細胞であるHuman follicle dermal papilla cell(HFDPC, Promocell、DE)、角質形成細胞であるHaCaT(ATCC、US)、ヒトメラニン細胞(Human Epidermal Melanocytes、Invitrogen、US)を利用した。96 well plate(Falcon、US)にHFDPC 3×103cells/well、HaCaT 4×103cells/well、HEMs 5×103cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、各細胞にSAMiRNA-miR-3199を濃度別(0、1、5、10、20μM)に処理した。72時間培養後、細胞毒性測定のためにWST assay kit(DOGEN、KR)を使用して製造業者のプロトコルに従って実験を行い、分析した。
その結果、すべての細胞株で高濃度であるSAMiRNA-miR-3199 20μM濃度でも細胞毒性が観察されなかった(図12a)。
7-2:SAMiRNA-miR-3199の自然免疫毒性評価
SAMiRNA-miR-3199の自然免疫毒性評価のために、ヒト末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)(Cellular Technology Limited、US)を利用した。12 well plate(Falcon、US)に5×105 cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、SAMiRNA-miR-3199を濃度別(0、5、10、20μM)に処理した。6時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を利用して細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って炎症性サイトカイン遺伝子(Human Immune qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。各遺伝子に対するプライマー配列は以下の通りである(表7)。
SAMiRNA-miR-3199の自然免疫毒性評価のために、ヒト末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)(Cellular Technology Limited、US)を利用した。12 well plate(Falcon、US)に5×105 cells/wellで分注した後、37℃/5% CO2条件で培養した。翌日、SAMiRNA-miR-3199を濃度別(0、5、10、20μM)に処理した。6時間培養後、Universal RNA extraction kit(Bioneer、KR)を利用して細胞溶解物から総RNAを抽出し、このRNAを鋳型としてAccuPower GreenStarTM RT-qPCR Master Mix(Bioneer、KR)を用いて製造業者のプロトコルに従って炎症性サイトカイン遺伝子(Human Immune qPCR panel kit、Bioneer、KR)及びRPL13A(Human reference qPCR primer set、Bioneer、KR)のmRNA発現レベルをqRT-PCRで分析した。各遺伝子に対するプライマー配列は以下の通りである(表7)。
その結果、高濃度であるSAMiRNA-miR-3199 20μM濃度でも炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6、IL-12β、TNF-α、INF-γなど)の増加が観察されず、自然免疫毒性は現れないことが確認された(図12b)。
実施例8:二本鎖オリゴヌクレオチド構造体(SAMiRNA)
本発明で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(5)のような構造を有する。
C -S-S-C186- 5' S 3' -ポリエチレングリコール2000 構造式 (5)
3' AS 5' -PO4
前記構造式(5)において、SはmiRNAのセンス鎖、ASはmiRNAのアンチセンス鎖、PO4はリン酸基、ポリエチレングリコールは親水性物質モノマーでポリエチレングリコール2000(polyethylene glycol 2000)がリンカーであるリン酸基(PO3 -)を介して結合され、C24は疎水性物質でジスルフィド結合が含まれており、5'及び3'は二本鎖オリゴRNAの末端方向を意味する。
本発明で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式(5)のような構造を有する。
C -S-S-C186- 5' S 3' -ポリエチレングリコール2000 構造式 (5)
3' AS 5' -PO4
前記構造式(5)において、SはmiRNAのセンス鎖、ASはmiRNAのアンチセンス鎖、PO4はリン酸基、ポリエチレングリコールは親水性物質モノマーでポリエチレングリコール2000(polyethylene glycol 2000)がリンカーであるリン酸基(PO3 -)を介して結合され、C24は疎水性物質でジスルフィド結合が含まれており、5'及び3'は二本鎖オリゴRNAの末端方向を意味する。
前記構造式(5)のmiRNAのセンス鎖は、DMT-ポリエチレングリコール2000-CPGを支持体とし、βシアノエチルホスホアミドを利用してRNA骨格構造を形成するホスホジエステル結合を連結する方法により、3'末端部位にポリエチレングリコールが結合したセンス鎖を含むオリゴRNA親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれている疎水性C24を5'末端に結合して所望のRNA高分子構造体のセンス鎖を製造した。センス鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、βシアノエチルホスホアミドを利用してRNA骨格構造を構成するホスホジエステル結合を繋いでいく方法を使用してセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した後、5'末端にリン酸基が結合したアンチセンス鎖を製造した。
本発明による組成物は、メラニン形成細胞を活性化させ、メラニンの生成を促進して毛髪の灰白色化を予防し、その進行速度を遅くすることができ、すでに灰白色化が進行した毛髪を灰白色化前の毛髪状態に改善することができ、従来の毛髪の灰白色化を隠すために繰り返し使用していた単純な染色剤とは差別化された副作用がなく、薬学的用途及び化粧料や染毛用組成物として有用に活用することができる。また、メラニン生成細胞の活性と共に毛包に存在する毛乳頭細胞及び角質形成細胞の増殖を促進し、副作用なしに脱毛症の緩和及び発毛促進を誘導することができる薬学的用途及び化粧料組成物として有用に活用することができる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明したが、当業者にとって、これらの具体的な技術は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されるものではないことは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
Claims (35)
- (i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199、またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の薬学的組成物。 - 前記miR-3139は、配列番号9で示される塩基配列及び配列番号10で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記miR-3189は、配列番号5で示される塩基配列及び配列番号6で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記miR-3199は、配列番号15で示される塩基配列及び配列番号16で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記miR-8485は、配列番号1で示される塩基配列及び配列番号2で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記親水性物質は、(P)n、(Pm-J)nまたは(J-Pm)nで表示され、Pは親水性物質モノマー(monomer)、nは1ないし200、mは1ないし15、Jはm個の親水性物質モノマー間またはm個の親水性物質モノマーとオリゴヌクレオチドを相互に連結するリンカーであることを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記親水性物質は、分子量が200ないし10,000であることを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記親水性物質は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成される群から選ばれるいずれか1つであることを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記リンカー(J)は、PO3 -、SO3及びCO2で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記疎水性物質の分子量は、250ないし1,000であることを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記疎水性物質は、ステロイド(steroid)誘導体、グリセライド(glyceride)誘導体、グリセロールエーテル(glycerol ether)、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol)、C12ないしC50の不飽和または飽和炭化水素(hydrocarbon)、ジアシルホスファチジルコリン(diacylphosphatidylcholine)、脂肪酸(fatty acid)、リン脂質(phospholipid)及びリポポリアミン(lipopolyamine)で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用の薬学的組成物。
- 前記ステロイド(steroid)誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレステリルアミンで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項12記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記グリセリド誘導体は、モノ-、ジ-およびトリ-グリセリドから選択されることを特徴とする、請求項12に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記X及びYで示される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする、請求項1に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする、請求項15に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- 前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライト結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする、請求項15に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用薬学的組成物。
- (i)miR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485、
(ii)下記構造式(1)の構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、
A-X-R-Y-B 構造式 (1)
前記構造式(1)において、Aは親水性物質、Bは疎水性物質、XおよびYはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーを介した共有結合を意味し、RはmiR-3139、miR-3189、miR-3199またはmiR-8485を意味する。または
(iii)前記二本鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含む、毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。 - 前記miR-3139は、配列番号9で示される塩基配列及び配列番号10で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記miR-3189は、配列番号5で示される塩基配列及び配列番号6で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記miR-3199は、配列番号15で示される塩基配列及び配列番号16で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記miR-8485は、配列番号1で示される塩基配列及び配列番号2で示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記親水性物質は、(P)n、(Pm-J)nまたは(J-Pm)nで表示され、Pは親水性物質モノマー(monomer)、nは1ないし200、mは1ないし15、Jはm個の親水性物質モノマー間またはm個の親水性物質モノマーとオリゴヌクレオチドを相互に連結するリンカーであることを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記親水性物質は、分子量が200ないし10,000であることを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記親水性物質は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成される群から選択されるいずれか1つであることを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記リンカー(J)が、PO3 -、SO3及びCO2で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項23に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記疎水性物質の分子量は、250ないし1,000であることを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記疎水性物質は、ステロイド(steroid)誘導体、グリセライド(glyceride)誘導体、グリセロールエーテル(glycerol ether)、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol)、C12ないしC50の不飽和または飽和炭化水素(hydrocarbon)、ジアシルホスファチジルコリン(diacylphosphatidylcholine)、脂肪酸(fatty acid)、リン脂質(phospholipid)及びリポポリアミン(lipopolyamine)で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項28に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記ステロイド(steroid)誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コリン酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレステリルアミンで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項29に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記グリセリド誘導体は、モノ-、ジ-およびトリ-グリセリドから選択されることを特徴とする、請求項29に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記X及びYで示される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする、請求項32に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進および/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライト結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする、請求項32に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
- 前記化粧料組成物は、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャークリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアゾール、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘア石鹸、ヘアクレンジングフォーム、ヘアオイル、ヘアドライヤー、毛髪保存処理剤、毛髪染色剤、毛髪用ウェーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアジェル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング剤、ヘアラッカー、ヘアモイスチャライザー、ヘアムース及びヘアスプレーで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項18に記載の毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用化粧料組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2021-0025554 | 2021-02-25 | ||
KR20210025554 | 2021-02-25 | ||
PCT/KR2022/002765 WO2022182188A1 (ko) | 2021-02-25 | 2022-02-25 | 이중가닥 mirna를 유효성분으로 포함하는 모발의 회백색화 개선, 발모 촉진 및/또는 탈모의 예방 또는 개선용 조성물 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024508742A true JP2024508742A (ja) | 2024-02-28 |
Family
ID=83049563
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023549095A Pending JP2024508742A (ja) | 2021-02-25 | 2022-02-25 | 二本鎖miRNAを有効成分として含む毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用組成物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4299078A1 (ja) |
JP (1) | JP2024508742A (ja) |
KR (1) | KR20220121743A (ja) |
CN (1) | CN116847888A (ja) |
AU (1) | AU2022226837A1 (ja) |
CA (1) | CA3206861A1 (ja) |
WO (1) | WO2022182188A1 (ja) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009504179A (ja) | 2005-08-17 | 2009-02-05 | バイオニア コーポレイション | siRNAの細胞内伝達のためのsiRNAと親水性高分子との間の接合体、及びその製造方法 |
KR101224828B1 (ko) | 2009-05-14 | 2013-01-22 | (주)바이오니아 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
WO2015002511A1 (ko) | 2013-07-05 | 2015-01-08 | (주)바이오니아 | 개선된 고효율 나노입자형 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 그의 제조방법 |
WO2016014478A1 (en) * | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | USE OF AN miRNA TO REDUCE PROLIFERATION OF A CANCER CELL |
CA2977624C (en) * | 2015-02-25 | 2021-11-30 | Bioneer Corporation | Pharmaceutical composition for treating cancer comprising microrna as active ingredient |
KR102189987B1 (ko) * | 2017-11-27 | 2020-12-11 | (주)프로스테믹스 | miRNA를 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 |
-
2022
- 2022-02-25 AU AU2022226837A patent/AU2022226837A1/en active Pending
- 2022-02-25 CA CA3206861A patent/CA3206861A1/en active Pending
- 2022-02-25 JP JP2023549095A patent/JP2024508742A/ja active Pending
- 2022-02-25 KR KR1020220025070A patent/KR20220121743A/ko unknown
- 2022-02-25 CN CN202280014067.3A patent/CN116847888A/zh active Pending
- 2022-02-25 EP EP22760104.4A patent/EP4299078A1/en active Pending
- 2022-02-25 WO PCT/KR2022/002765 patent/WO2022182188A1/ko active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3206861A1 (en) | 2022-09-01 |
AU2022226837A1 (en) | 2023-07-20 |
WO2022182188A1 (ko) | 2022-09-01 |
KR20220121743A (ko) | 2022-09-01 |
EP4299078A1 (en) | 2024-01-03 |
CN116847888A (zh) | 2023-10-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK2853597T3 (en) | RNA INTERFERENCE-INducing NUCLEIC ACID MOLECULES WITH CELL PENETENING EQUIPMENT AND USE THEREOF | |
US10512600B2 (en) | RNA complexes that inhibit melanin production | |
EP2796150B1 (en) | Novel oligonucleotide conjugates and use thereof | |
KR101752812B1 (ko) | 고효율 나노입자형 이중나선 올리고 rna 구조체 및 그의 제조방법 | |
CN106177990B (zh) | 一种新的前体miRNA及其在肿瘤治疗中的应用 | |
US9303261B2 (en) | Composition for controlling chromogenesis including microRNA | |
JP7356505B2 (ja) | Dkk1遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物 | |
CN114404608B (zh) | 一种嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸及其用途 | |
JP2023113845A (ja) | アンドロゲン受容体特異的配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド構造体、及びこれを含む脱毛予防及び発毛用組成物 | |
JP2014504501A (ja) | Hif1αの発現を阻害するsiRNAおよびこれを含む抗癌組成物 | |
JP2024508742A (ja) | 二本鎖miRNAを有効成分として含む毛髪の灰白色化改善、発毛促進及び/または脱毛の予防または改善用組成物 | |
RU2778086C1 (ru) | Двуцепочечные олигонуклеотидные конструкции, содержащие специфичную для андрогеновых рецепторов последовательность, и содержащие их композиции для предотвращения выпадения волос и усиления роста волос | |
KR101841713B1 (ko) | Tslp 발현을 억제하는 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 미용 또는 약제학적 조성물 | |
US20150329857A1 (en) | Rna interference to activate stem cells | |
KR20160016475A (ko) | Tslp 발현을 억제하는 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 미용 또는 약제학적 조성물 | |
RU2810514C1 (ru) | Композиция для предупреждения или лечения заболевания, связанного с ожирением, содержащая амфирегулин-специфическую двухцепочечную олигонуклеотидную структуру | |
JP2023526277A (ja) | 核酸リガンドコンジュゲートおよび細胞への送達のためのその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230815 |