BR112016000160B1 - estrutura de oligonucleotídeo tipo nanopartícula melhorada tendo alta eficiência e método para a preparação da mesma - Google Patents

Abstract

ESTRUTURA DE OLIGONUCLEOTÍDEO TIPO NANOPARTÍCULA MELHORADA TENDOALTA EFICIÊNCIA E MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DA MESMARefere-se a presente invenção a uma estrutura de oligonucleotídeo em que um composto polímero é ligado a um oligonucleotídeo via ligação covalente para melhorar a estabilidade in vivo do oligonucleotídeo e eficiência de liberação celular do oligonucleotídeo; e a um método para preparar a mesma. A estrutura de oligonucleotídeo é melhorada em material homogêneo, assim, solucionando o problema na verificação do material devido às características de polidispersão que ocorrem quando um material hidrofílico ligado ao oligonucleotídeo é um polímero sintético; a estrutura de oligonucleotídeo é fácil de sintetizar em comparação com o processo existente; e o tamanho da estrutura de oligo RNA fita dupla pode ser precisamente ajustada através do controle do número de repetição de um bloco de material hidrofílico, e a função de regulação da expressão de gene do oligonucleotídeo não se deteriora através da síntese da estrutura de oligonucleotídeo otimizada, e o oligonucleotídeo pode ser liberado nas células mesmo em dosagem de concentração relativamente baixa.

Description

Campo de Aplicação

[001] A presente invenção refere-se à uma estrutura de oligonucleotídeo tendo alta eficiência que é efetivamente útil para tratar câncer, doença infecciosa, etc.

[002] A estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a presente invenção tem uma estrutura em que um material hidrofílico e um material hidrofóbico são conjugados a ambas as extremidades do oligonucleotídeo usando uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante de modo que o oligonucleotídeo incluído na estrutura de oligonucleotídeo é efetivamente liberada nas células, em que a estrutura pode ser convertida em uma forma de nanopartícula por interações hidrofóbicas da estrutura de oligonucleotídeos em uma solução aquosa.

[003] Além disso, a presente invenção refere-se à uma composição farmacêutica incluindo a estrutura de oligonucleotídeo, um método para preparar a estrutura de oligonucleotídeo, e uma tecnologia para liberação de oligonucleotídeo usando a estrutura de oligonucleotídeo.

Estado da Técnica

[004] Vári os tipos de agentes terapêuticos baseados em oligonucleotídeos como um oligonucleotídeo antissenso (ASO), interferência de RNA (doravante referido como RNAi), microRNA (miRNA) etc., foram ativamente desenvolvidos até o momento.

[005] O ASO tem uma função de controlar a transferência de informação de um gene em uma proteína pela troca de um metabolismo intermediário do mRNA através de RNA de fita simples ou fita de DNA, que deve alcançar o controle de expressão desejado da proteína alvo pela seleção de sequências de base que são suficientemente complementares e hibridizadas especificamente. O ASO é uma sequência especificamente ligada a um gene alvo, que não tem um efeito na expressão de outros genes diferentes do gene alvo. Portanto, a tecnologia do ASO é uma ferramenta que é útil para a análise de funções in vivo da proteína específica e tem uma possibilidade de ser utilizado como uma terapia de gene com respeito às doenças específicas (FASEBJ.9,1288-1296,1995).

[006] miRNA (microRNA) é um RNA pequeno de um grupo grande que é naturalmente produzido em um sujeito, e pelo menos algum deles controla a expressão do gene alvo. O miRNA é formado de aproximadamente 70 nucleotídeos de transcriptomas precursoras em gancho de fita simples por um dicer ribonuclease (Ambros et al. 2003. Current Biology 13(10):807-818), em que o dicer corta o precursor para formar de miRNAs de fita dupla de 21-23 nucleotídeos. Em muitos casos, o miRNA é transcrito de algumas sequências de DNA cujas funções não foram descobertas ainda. O miRNA não é traduzido em proteína, mas ao invés, os miRNAs são combinados com os mRNAs específicos que bloqueiam a tradução. Isto é apesar de que os miRNAs formam incorretamente pares de bases com alvos dos mesmos para inibir a tradução.

[007] Uma vez que o papel do RNAi foi descoberto, foi descobertofunciona sequencialmente para o mRNA em vários tipos de células de mamíferos (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med, 2005, 83: 764-773). Quando uma cadeia longa de fita dupla de RNA é liberada para uma célula, a fita dupla de RNA liberada é convertida em um RNA de interferência pequeno (daqui em diante referido como 'siRNA') que é processado para 21 a 23 pares de base (bp) por uma endonuclease chamada Dicer. siRNA tem uma cadeia curta de fita dupla de RNA tendo 19 a 27 bases e é acoplado a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), pelo qual uma fita guia (antissenso) reconhece e decompõe o mRNA alvo para a sequência especificamente inibir a expressão do gene alvo (Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).

[008] Em particular, a cadeia longa do RNA de fita dupla liberada a partir do lado de fora tem um problema de causar excessivamente uma reação imune não específica da sequência através da expressão de interferon em uma célula mamária; entretanto, foi descoberto que o problema pode ser superado por um siRNA de fita curta (Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001. 411, 494-498).

[009] Entretanto, o siRNA também tem uma possibilidade de estímulo de resposta imune inata gerada através dos sensores presentes nas células, e por conseguinte, de modo a superar a possibilidade, a estrutura específica do siRNA é mudada ou substituintes 2-metoxi ou substituintes 2-flúor foram desenvolvidos.

[010] Um siRNA sintetizado quimicamente tem uma fita dupla de cerca de 19 a 27 pares de bases (bps) e tem uma estrutura pendente de 2-nt(nucleotídeo) na extremidade 3’, e de modo que o siRNA de fita dupla expresse uma atividade, é sabido que o siRNA de fita dupla tem uma estrutura que consiste em um grupo 3’- hidroxil (OH) e grupo 5’-fosfato (PO4) (Effect of asymmetric terminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection. Nucleic Acids Res 1 October 2008:5812-5821). É conhecido que um siRNA sintetizado e comercializado tem uma estrutura em que grupos hidroxil estão presentes em ambas as extremidades, e quando o siRNA sintetizado é liberado para uma célula, a extremidade 5’ do siRNA é fosforilada por uma quinase de fosforilação para expressar funções do siRNA (siRNA function in RNAi: A chemical modification analysis. RNA 2003. 9: 1034-1048).

[011] Bertrand et al., descobriram que como comparado a um oligonucleotídeo antissenso (ASO) no mesmo gene alvo, siRNA tem um efeito de inibir significativamente a expressão do mRNA in vitro e in vivo, e o efeito correspondente é mantido por um longo tempo (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296: 1000-1004).

[012] Além disso, uma vez que o siRNA é complementarmente ligado a um mRNA alvo para a sequência especificamente regular a expressão do gene alvo, um mecanismo do siRNA tem uma vantagem que, um alvo para ser capaz de ser aplicado, pode ser notavelmente aumentado como comparado com o produto médico baseado em anticorpo existente ou pequena droga molecular. (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).

[013] Mesmo se um agente terapêutico baseado em oligonucleotídeo (siRNA, etc.) tem um excelente efeito e uma faixa de uso variável, de modo a desenvolver o siRNA como um agente terapêutico, o siRNA é requerido por ser eficazmente liberado para a célula alvo pela melhora da estabilidade do siRNA e uma eficiência de liberação à célula do siRNA (Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).

[014] Em particular, uma vez que oligonucleotídeos tais como siRNA, etc., não são passados através de uma bicamada fosfolipídica hidrofóbica de uma célula devido às cargas negativas da mesma, é difícil de ser liberada em uma célula através de difusão simples.

[015] De modo a aumentar a eficiência da liberação dos oligonucleotídeos in vivo ou in vitro, vários tipos de materiais de liberação de célula foram desenvolvidos. Lipossomas, surfactantes catiônicos, etc., são geralmente e amplamente utilizados. Ainda, métodos de uso de carreadores tais como a fusão de um gene em lipossomas, um método de uso de lipídeo catiônico ou um polímero catiônico, etc., um método de mudança da estrutura química, isto é, mudar uma estrutura básica combinada do oligonucleotídeo para metilfosfonato, ácido nucleico peptídico (PNA), etc., e um método de uso de um conjugado são conhecidos (Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today. 2008 Oct; 13(19-20):842-855; Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2008 Jul;36(12):4158-71).

[016] Dentre eles, um método de uso de um nanocarreador, isto é, um método de uso de vários polímeros tais como lipossomas, compósito de polímero catiônico, etc., deve capturar oligonucleotídeos em um nanocarreador pela formação de nanopartículas para liberar os oligonucleotídeos capturados para as células. Dentre os métodos de uso de nanocarreadores, um método de uso de nanopartícula polimérica, micela de polímero, lipoplex ou similares, é principalmente utilizado, em que o lipoplex consiste em lipídeo catiônico para interagir com o lipídeo aniônico do endossoma de uma célula, assim induzindo um efeito de desestabilização do endossoma para liberar o siRNA dentro de uma célula (Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Oct 15; 93(21):11493-8).

[017] Em particular, é conhecido que quando o oligonucleotídeo é siRNA, materiais químicos, etc., são conectados nas porções extremidades de uma fita passageira de siRNA (senso) para fornecer características farmacocinéticas aumentadas, de modo que alta eficiência pode ser induzida in vivo (Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004 Nov 11; 432(7014):173-8). Aqui, a estabilidade do siRNA pode variar dependendo das propriedades dos materiais químicos ligados às extremidades da fita do siRNA senso (passageiro) ou antissenso (guia). Por exemplo, um siRNA ao qual um composto polímero tal como polietileno glicol (PEG) é conjugado, interage com um grupo fosfato aniônico do siRNA na presença de materiais catiônicos para formar um complexo, assim sendo um carreador tendo uma estabilidade de siRNA melhorada (Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer. J Control Release. 2008 Jul 14; 129(2):107-16). Em particular, micelas que consistem em complexos de polímero têm um tamanho extremamente pequeno, distribuição significativamente uniforme e são formadas espontaneamente, assim sendo fácil para controlar a qualidade da formulação e garantir a reprodutibilidade, como comparado a outros sistemas utilizados como um veículo de liberação de droga, tais como microesferas, manopartículas, etc.

[018] Ainda, de modo a melhorar uma eficiência de liberação intracelular de siRNA, a tecnologia de uso de um siRNA conjugado em que o material hidrofílico que é um polímero biocompatível (por exemplo, polietileno glicol (PEG)) é conjugado ao siRNA por uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por um ligante, para assim assegurar a estabilidade do siRNA e tem permeabilidade de membrana celular eficaz foi desenvolvida (veja a Publicação de Patente Coreana No. 883471). Entretanto, a modificação química do siRNA e a conjugação com o polietileno glicol (PEG) (Pequilação) ainda tem desvantagens que a estabilidade em um corpo vivo é baixa e a liberação em um tecido alvo não é fácil.

[019] O documento de patente CA2859127 intitulado NOVEL OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES AND USE THEREOF (equivalente ao pedido nacional BR112014014730) refere-se ao provimento de estruturas de RNA de fita dupla em que um composto polímero covalentemente ligado a um oligo RNA de dupla hélice para tratamento de doenças, particularmente câncer, melhorando a liberação do oligo RNA dupla hélice; um ligante específico ao alvo e respectivo método; técnica de liberação de oligo RNA dupla hélice em modo específico ao alvo. Também revela nanopartícula composta de estruturas de oligo RNA ligadas ao ligante dupla hélice efetivamente liberando o oligo RNA dupla hélice a um alvo provendo a atividade do oligo RNA dupla hélice mesmo quando o oligo RNA dupla hélice é administrado em baixa concentrações. Ainda, previne a liberação não específica do oligo RNA dupla hélice em outros órgãos e células. Além disso, refere-se à um conjugado híbrido, que compreende materiais hidrofílico e hidrofóbicos ligados covalentemente às extremidades de um oligonucleotídeo antissenso (ASO), melhorando a estabilidade in vivo do ASO, bem como a um método para preparar conjugado híbrido e nanopartícula composta pelos conjugados.

[020] A publicação internacional WO2009045457 intitulada TRIPARTITE RNAi CONSTRUCTS, revela composições e métodos para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula. O processo compreende a introdução de RNAi tripartido de cadeia dupla nas células e reduz a expressão do RNA mensageiro correspondente nas células. As construções, que podem ser empacotadas ou entregues como construções de RNAi sequestradas, diferem do siRNA canônico, pois compreendem uma estrutura tripartida que segue a fórmula geral de ter (1) um núcleo de RNAi (nativo ou abreviado), (2) uma ou mais porções terminais ligadas ao núcleo de RNAi e opcionalmente (3) um ligante entre o núcleo de RNAi e a porção terminal. Uma vez embalados em veículos de seqüestro, as construções são ativadas para a regulação de genes pela aplicação de certas formas de energia.

[021] O artigo Poly(L-histidine)-PEG block copolymer micelles and pH-induced destabilization (LEE, E. S. et al. JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, (20030731), vol. 90, no. 3), descreve a preparação e utilização de copolímeros de dibloco poli (L-histidina) -pol (etileno glicol) (poliHis-b-PEG) para a construção de micelas poliméricas que respondem a alterações locais de pH no corpo. PolyHis foi sintetizado por polimerização de abertura de anel de N-carboxianidreto de L- histidina, cujo grupo imidazole amina foi protegido pelo grupo dinitrofenil. O polímero resultante (M (n): 5.000 g / mole) foi acoplado a poli (etileno glicol) (M (n): 2.000 g / mole) pormeio de uma ligação amida usando a reação mediada por diciclo- hexil carbodiimida e N-hidroxissuccinimida. O copolímero em bloco em dimetilsulfóxido formou micelas poliméricas em diafiltração contra um tampão de borato em pH 8. A dispersão dinâmica da luz e a microscopia de força atômica mostraram que as micelas eram esféricas, diâmetro aproximadamente 114 nm, com distribuição unimodal. A concentração crítica de micelas (CMC) em pH 8,0 foi de 2,3 mg/l. O CMC aumentou acentuadamente ao diminuir o pH do meio de diafiltração abaixo de 7,2. As micelas preparadas a pH 8,0 foram gradualmente desestabilizadas abaixo de pH 7,4, como evidenciado por um ligeiro aumento na transmitância da luz, uma alteração na distribuição do tamanho e uma diminuição na intensidade da fluorescência do pireno. Concluiu-se que a ionização do bloco polyHis que forma o núcleo da micela determinou a CMC e a estabilidade dependentes do pH. Após uma otimização adicional da sensibilidade ao pH, espera-se que as micelas sensíveis ao pH tenham aplicação no tratamento de tumores sólidos, explorando o fato de que a maioria dos tumores sólidos tem um pH extracelular ácido.

[022] O artigo Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer (Cho K1, Wang X, Nie S, Chen ZG, Shin DM. Clinical Cancer Research 2008 Mar 1;14(5):1310-1316), é um apanhado do progresso nas nanoterapêuticas do câncer, que estão sendo implementadas para resolver várias limitações dos sistemas convencionais de administração de medicamentos, como biodistribuição e direcionamento inespecíficos, falta de solubilidade em água, baixa biodisponibilidade oral e baixos índices terapêuticos. Para melhorar a biodistribuição de medicamentos contra o câncer, as nanopartículas foram projetadas para características ideais de tamanho e superfície, aumentando o tempo de circulação na corrente sanguínea. Eles também são capazes de transportar seus medicamentos ativos carregados para as células cancerígenas, usando seletivamente a fisiopatologia exclusiva dos tumores, como seu efeito de permeabilidade e retenção aprimorado e o microambiente do tumor. Além deste mecanismo de direcionamento passivo, estratégias de direcionamento ativo usando ligantes ou anticorpos direcionados contra alvos tumorais selecionados amplificam a especificidade dessas nanopartículas terapêuticas. A resistência aos medicamentos, outro obstáculo que impede a eficácia de agentes quimioterapêuticos convencionais e com alvo molecular, também pode ser superada, ou pelo menos reduzida, usando nanopartículas. As nanopartículas têm a capacidade de se acumular nas células sem serem reconhecidas pela glicoproteína- P, um dos principais mediadores da resistência a múltiplas drogas, resultando no aumento da concentração intracelular de drogas. Nanopartículas multifuncionais e multiplex estão agora sendo investigadas ativamente e estão no horizonte como a próxima geração de nanopartículas, facilitando o tratamento de câncer personalizado e sob medida.

[023] De modo a resolver as desvantagens da téc9]nica atual, uma estrutura compreendendo um RNA oligo de fita dupla (‘estrutura RNA oligo de fita dupla’) em que um material hidrofílico e um material hidrofóbico são ligados a oligonucleotídeos, em particular, RNA oligo de fita dupla tal como siRNA, foi desenvolvido, em que a estrutura RNA oligo de fita dupla forma uma nanopartícula automontada chamada RNA inibitório de micela automontada (SAMiRNA™) por uma interação hidrofóbica de um material hidrofóbico (veja a Publicação de Patente Coreana No. 1224828), a tecnologia SAMiRNA™ tem uma vantagem em que nanopartículas homogêneas tendo um tamanho significativamente pequeno são capazes de serem obtidas como comparado às tecnologias de liberação existentes.

[024] Como um exemplo específico da tecnologia SAMiRNA™, PEG (polietileno glicol) é utilizado como um material hidrofílico, em que PEG é o polímero sintético, que é utilizado para aumentar a solubilidade de agentes farmacêuticos, particularmente, proteína, e para controlar a farmacocinética. PEG é um material polidisperso como todos os polímeros sintéticos, um polímero em um lote consiste na soma de números diferentes de monômeros, um peso molecular é mostrado na curva de Gauss, e um índice de polidispersividade (Mw/Mn) expressa o grau de homogeneidade de um material. Isto é, quando o PEG tem um baixo peso molecular (3 a 5 kDa), o índice polidisperso é cerca de 1,01, e quando PEG tem um alto peso molecular (20 kDa), o índice polidisperso é cerca de 1,2 que é alto, de modo que conforme o peso molecular é maior, a homogeneidade do material é relativamente baixa (F. M. Veronese. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials (2001) 22:405-417).

[025] Assim, quando o PEG é ligado aos agentes farmacêuticos, a característica de polidispersividade do PEG é refletida no conjugado, de modo que é difícil verificar um material único. Recentemente, de modo a superar o problema, a produção de materiais tendo um índice de polidispersividade baixo pela sintetização de PEG e melhorando processos de purificação é uma tendência em crescimento, mas ainda há problemas devido à característica de polidispersividade do material, particularmente, quando PEG é ligado a um material tendo um pequeno peso molecular, há dificuldade em confirmar se a ligação é ou não realizada facilmente, etc. (Francesco M. Veronese and Gianfranco Pasut. PEGylation, successful approach to drug delivery. DRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458).

[026] Ainda, o tamanho das nanopartículas significativamente afeta a eficiência de liberação dentro da célula alvo, quando o tamanho das nanopartículas é 50 nm ou menor, as nanopartículas são rapidamente removidas do corpo através de excreção, e quando o tamanho das nanopartículas é 100 nm ou maior, as nanopartículas não são uniformemente liberadas no tecido, e o efeito é reduzido. Portanto, é requerido formar nanopartículas cada uma tendo um tamanho predeterminado (Wim H De Jong and Paul JA Borm. Int J Nanomedicine. 2008 June; 3(2): 133-149.).

[027] Portanto, o mercado requer um novo conceito de técnica de liberação de oligonucleotídeo para resolver a característica de polidispersividade de materiais hidrofílicos tais como PEG, etc., deles mesmos, mantendo um excelente efeito do SAMiRNATM de acordo com a técnica a que estão relacionados.

Descrição Geral da Invenção

[028] Um objetivo da presente invenção é fornecer um novo conceito de nanopartículas tendo um tamanho pequeno e polidispersividade melhorada e uma estrutura de oligonucleotídeo formando as nanopartículas.

[029] Ainda, outro objetivo da presente invenção é fornecer um método de preparo da estrutura de oligonucleotídeo e nanopartículas formadas da estrutura de oligonucleotídeo, uma composição farmacêutica incluindo a estrutura de oligonucleotídeo e uma tecnologia para controlar a expressão de gene utilizando a mesma.

[030] Os presentes inventores descobriram que em uma tecnologia de SAMiRNA™ que são as nanopartículas automontadas existentes, quando o material hidrofílico da estrutura de oligonucleotídeo configurando SAMiRNA™ é bloqueado como uma unidade de base incluindo monômeros uniformes (o número de monômeros é m) tendo um peso molecular predeterminado e um ligante como necessário, o número apropriado de materiais hidrofílicos bloqueados é utilizado como necessário, as nanopartículas formadas pela estrutura de oligonucleotídeos tem um tamanho significativamente pequeno e polidispersividade notavelmente melhorada como comparado ao SAMiRNA™ existente, e completa a presente invenção.

Breve Descrição das Figuras

[031] A FIG. 1 é um diagrama esquemático de uma nanopartícula formada de estruturas de olinucleotídeo para os quais materiais hidrofílicos, cada um tendo o mesmo peso molecular, são ligados de acordo com a presente invenção.

[032] A FIG. 2 mostra toda a rota sintética do 3,4,6-triacetil- 1-hexa(etileno glicol)-N-acetil-galactosamina-CPG (Vidro de Poro Controlado).

[033] A FIG. 3 mostra toda a rota sintética do 2,3,4,6- tetraacetil-1-hexa(etileno glicol)-manose-CPG (Vidro de Pro Controlado).

[034] A FIG. 4 mostra toda a rota sintética do 2,3,4,6- tetraacetil-1-hexa(etileno glicol)-glicose-CPG (Vidro de Poro Controlado).

[035] A FIG. 5 mostra os resultados da análise NMR do 1,3,4,6- tetraacetil-N-acetil galactosamina (Composto 1 da FIG 2).1H NMR (300 MHz, DMSO-d6); 7,91~7,6 (d, 1H), 5,66~5,61 (d, 1H), 5,28~5,25 (d, 1H), 5,10~5,03 (d, 1H), 4,25~4,19 (t, 1H),4,15~3,94 (m, 3H), 2,12~2,10 (s, 3H), 2,04~2,02 (s, 3H),2,00~1,98 (s, 3H), 1,91~1,89 (s, 3H), 1,78~1,76 (s, 3H)

[036] A FIG. 6 mostra os resultados da análise NMR do 3,4,6- triacetil-1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina(Composto 2 da FIG 2).1H NMR (300 MHz, CDCl3); 6,66~6,61 (d, 1H), 5,33~5,29 (d, 1H),5,02~4,96 (d, 1H), 4,80~4,75 (d, 1H), 4,25~4,07 (m, 2H),3,93~3,79 (m, 2H), 3,73~3,54 (m, 24H), 2,16~2,14 (s, 3H),2,05~2,03 (s, 3H), 1,99~1,97 (s, 6H)

[037] A FIG. 7 mostra os resultados da análise NMR do 3,4,6- triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N'-1',2'-propanodiol]-N-acetil-galactosamina 3,4,6-triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N'- 1',2'-propanodiol]-N-acetil-galactosamina (Composto 3 da FIG 2).1H NMR (300 MHz, CDCl3); 1H NMR (300MHz, CDCl3) ; 6,83~6,78 (d, 1H), 6,10~6,08 (s, 1H), 5,33~5,29 (d, 1H), 5,00~4,94 (d, 1H),4,82~4,77 (d, 1H), 4,22~4,08 (m, 4H), 3,94~3,85 (m, 2H),3,83~3,74 (m, 1H), 3,66~3,52 (m, 24H), 3,40~3,24 (m, 2H),2,18~2,16 (s, 6H), 2,05~2,03 (s, 3H), 2,00~1,98 (s, 3H)

[038] A FIG. 8 mostra os resultados da análise NMR do 3,4,6- triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N'-1'-metoxi (dimetoxitritil)-2'-propanol]-N-acetil galactosamina (Composto 4 da FIG 2).1H NMR (300MHz, DMSO-d6) ; 7,80~7,75 (d, 1H), 7,40~7,20 (m, 9H),7,00~6,98 (s, 1H), 6,90~6,85 (d, 4H), 5,22~5,20 (s, 1H),5,00~4,87 (m, 2H), 4,58~4,55 (d, 1H), 4,04~4,02 (s, 4H),3,94~3,82 (m, 1H), 3,74~3,72 (s, 6H), 3,51~3,49 (s, 24H),3,18~3,12 (m, 1H), 2,94~2,85 (m, 2H), 2,11~2,09 (s, 3H),2,00~1,98 (s, 3H), 1,90~1,88 (s, 3H), 1,78~1,76 (s, 3H)

[039] A FIG. 9 mostra os resultados da análise NMR do 3,4,6-triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N'-1'-metoxi (dimetoxitritil)- 2'-propoxi (ácido succínico)]-N-acetil galactosamina (Composto 5 da FIG 2).1H NMR (300MHz, CDCl3) ; 7,43~,38 (d, 2H), 7,31~7,19 (m, 7H),6, 84~6, 79 (d, 4H), 6,75~6,67 (t, 1H), 5, 52~4, 89 (m, 1H),5, 32~5, 30 (s, 1H), 5,21~5,19 (s, 1H), 5, 01~4, 95 (d, 1H),4, 81~4, 76 (d, 1H), 4,30~4,08 (m, 3H), 3, 93~3, 86 (m, 2H),3, 79~3, 77 (s, 6H), 3,66~3,52 (m, 24H), 3, 36~3, 32 (m, 1H),3, 21~3, 17 (d, 2H), 2,75~2,56 (m, 4H), 2, 18~2, 16 (s, 3H),2,04~2,01 (m, 6H), 1,98~1,96 (s, 3H)

[040] A FIG. 10 mostra uma estrutura de uma estrutura de oligonucleotídeo à qual um ligante está ligado, e como um exemplo da mesma, mono-NAG-(Hexa etileno glicol)n-Oligo-Lipídeo e uma estrutura de lipídeo introduzida em seu interior.(A) Uma estrutura da estrutura oligonucleotídeo à qual o ligante está ligado.(B) Uma estrutura do mono-NAG-(Hexa etileno glicol)n-Oligo- Lipídeo.

[041] A FIG. 11 mostra os resultados de uma espectroscopia de massa (MALDI-TOF MS) do mono-NAG-(HexaetilenoGlicol)1-Oligo- Lipídeo. Um peso molecular do (mono-NAG-(Hexaetileno Glicol)1- Oligo-Lipídeo (MW 7807,4)).

[042] A FIG. 12 mostra os resultados da espectroscopia de massa (MALDI-TOF MS) do mono-NAG-(HexaetilenoGlicol)2-Oligo-Lipídeo. Um peso molecular do (mono-NAG-(Hexaetileno Glicol)2-Oligo- Lipídeo (MW 8152,7)).

[043] A FIG. 13 mostra os resultados de uma espectroscopia de massa (MALDI-TOF MS) do mono-NAG-(HexaetilenoGlicol)3-Oligo- Lipídeos. Um peso molecular do (mono-NAG-(Hexaetileno Glicol)3- Oligo-Lipídeo (MW 8498,0)).

[044] A FIG. 14 mostra os resultados de uma espectroscopia de massa (MALDI-TOF MS) do mono-NAG-(HexaetilenoGlicol)4-Oligo- Lipídeo. Um peso molecular do (mono-NAG-(Hexaetileno Glicol)4- Oligo-Lipídeo (MW 8843,3)).

[045] A FIG. 15 é um gráfico obtido pela medição da concentração de micela crítica de nanopartículas (SAMiRNA) de estruturas de RNA oligo de fita dupla às quais materiais hidrofílicos, cada um tendo o mesmo peso molecular, estão ligados de acordo com a presente invenção.

[046] A FIG. 16 é um gráfico obtido pela medição do tamanho e índice de polidispersividade das nanopartículas (SAMiRNA) das estruturas de RNA oligo de fita dupla às quais materiais hidrofílicos, cada um tendo o mesmo peso molecular, estão ligados de acordo com a presente invenção.(n significa o número de repetição do monômero do material hidrofílico, e as nanopartículas da estrutura de RNA oligo de fita dupla formada da estrutura correspondente).

[047] A FIG. 17 mostra o grau de inibição das expressões do gene alvo em linhagens de células tratadas com as nanopartículas (SAMiRNA) das estruturas de RNA oligo de fita dupla às quais materiais hidrofílicos, cada um tendo o mesmo peso molecular, estão ligados de acordo com a presente invenção.(n significa o número de repetição do monômero do material hidrofílico, e as nanopartículas da estrutura RNA oligo de fita dupla formada da estrutura correspondente).

Melhor Modo de Realizar a Invenção

[048] O oligonucleotídeo da presente invenção é um material que consiste em um DNA (desoxiribonucleotídeo) ou RNA (ribonucleotídeo), e significa um oligonucleotídeo antissenso formado em uma fita simples ou uma fita dupla de ligações complementares, RNA de interferência pequeno (siRNA), RNA em gancho pequeno (shRNA), microRNA (miRNA), inibidor de miRNA, aptâmero, etc., mas a presente invenção não está limitada a estes.

[049] Em particular, quando o oligonucleotídeo na presente invenção é o oligonucleotídeo de fita dupla, a fita antissenso é a fita que está complementarmente ligada ao mRNA alvo no complexo de silenciamento induzido de RNA (RISC) para decompor o mRNA alvo, assim tendo atividade de RNAi, e a fita senso significa uma fita tendo uma sequência complementarmente à fita antissenso. “Complementarmente” ou “ligando complementarmente” na presente invenção significa que duas sequências estão ligadas uma à outra para formar uma estrutura de fita dupla, em que o ligante não é necessariamente uma ligação de combinação perfeita, e pode também incluir um desemparelhamento no caso em que algumas sequências são diferentes.

[050] Ainda, um miRNA imitado na presente invenção é um RNA de fita dupla tendo a mesma sequência e estrutura como o miRNA presente na natureza, que significa o miRNA em uma forma sintetizada quimicamente. Um inibidor de miRNA significa um oligonucleotídeo de fita dupla sintetizado quimicamente que é complementarmente ligado ao miRNA presente na natureza para inibir a ação do miRNA correspondente.

[051] Em uma modalidade exemplar, a presente invenção fornece uma nova forma de estrutura de oligonucleotídeo tendo uma estrutura representada pela seguinte Fórmula Estrutural (1) ou Fórmula Estrutural (2).

Fórmula Estrutural (1) Fórmula Estrutural (2)

[052] Nas Fórmulas Estruturais (1) e (2), A é um monômero do material hidrofílico, B é um material hidrofílico, J é um ligante em que monômeros de materiais hidrofílicos (a soma é m) estão conectados um ao outro ou um ligante em que os monômeros de materiais hidrofílicos (a soma é m) estão conectados a oligonucleotídeos, X e Y são cada um independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante, R é um oligonucleotídeo de fita simples ou fita dupla, m é um integrante de 1 a 15 e n é um integrante de 1 a 10,

[053] Q é (Li-Zj) ou P-J1-J2,

[054] L é um ligante especificamente ligado a um receptor que promove a internalização da célula alvo através de endocitose mediada por receptor (RME), e Z é um ligante que medeia uma ligação covalente simples ou uma ligação entre o monômero do material hidrofílico em um bloco de material hidrofílico e o ligante,

[055] i representa um integrante de 0 a 5, preferencialmente, um integrante de 0 a 3, e j significa 0 ou 1, na condição de que quando i é 0, j é necessariamente 0,

[056] P significa um grupo amina ou um grupo polihistidina, e

[057] J1 e J2 são ligantes independentes que mediam uma ligação covalente simples, ou uma ligação entre o grupo amina e o grupo polihistidina com o material hidrofílico.

[058] O “bloco de material hidrofílico” na presente invenção significa uma unidade repetida representada por (Am-J) ou (J-Am) nas Fórmulas Estruturais (1) e (2).

[059] Nas Fórmulas Estruturais (1) e (2), o monômero do material hidrofílico A é utilizável sem limitação contanto que atenda os objetos da presente invenção dentre os monômeros do polímero hidrofílico não iônico. O monômero do material hidrofílico A é preferencialmente um monômero selecionado dos seguintes compostos (1) a (3) mostrados na Tabela 1, mais preferencialmente, um monômero do composto (1), e G no composto (1) pode ser preferencialmente selecionado de CH2, O, S e NH.

[060] Em particular, dentre os materiais de monômeros hidrofílicos, o monômero do Composto (1) pode ter vários grupos funcionais introduzidos em seu interior e boa afinidade in vivo, e induz uma pequena resposta imune, assim tendo excelente biocompatibilidade e, ainda, pode aumentar a estabilidade in vivo do oligonucleotídeo incluído nas estruturas de acordo com as Fórmulas Estruturais (1) e (2), e pode aumentar a eficiência de liberação, que é significativamente adequado para produzir a estrutura de acordo com a presente invenção.

[061] [Tabel a 1] Estrutura do monômero do material hidrofílico preferido na presente invenção

[062] O material hidrofílico nas Fórmulas Estruturais (1) e (2) preferencialmente tem um peso molecular total de 1.000 a 2.000. Portanto, por exemplo, quando hexaetileno glicol representado pelo Composto (1), isto é, um material em que G é O e m é 6, é utilizado nas Fórmulas Estruturais (1) e (2), um peso molecular de espaçador hexaetileno glicol é 344, de modo que o número de repetição (n) é preferido por ser 3 a 5.

[063] Em particular, na presente invenção, a unidade repetida do grupo hidrofílico representado por (Am-J) ou (J-Am) nas Fórmulas Estruturais (1) e (2), isto é, bloco de material hidrofílico, é capaz de ser utilizada em um número apropriado representado por n como necessário. A, o monômero do material hidrofílico, e J, o ligante, incluídos em cada bloco de material hidrofílico, podem ser independentemente os mesmos um como cada outro ou serem diferentes um do outro em cada bloco de material hidrofílico. Isto é, quando 3 blocos de material hidrofílico são utilizados (n = 3), o monômero do material hidrofílico do composto (1) é utilizado no primeiro bloco, o monômero do material hidrofílico do composto (2) é utilizado no segundo bloco, o monômero do material hidrofílico do composto (3) é utilizado no terceiro bloco, etc. Isto é, diferentes monômeros de materiais hidrofílicos para todos os blocos de materiais hidrofílicos podem ser utilizados, e qualquer monômero do material hidrofílico selecionado dos monômeros dos materiais hidrofílicos dos compostos (1) a (3) podem ser igualmente utilizados em todos os blocos de materiais hidrofílicos. Similarmente, os ligantes que mediam a ligação do monômero do material hidrofílico podem também serem os mesmos como os outros ou diferentes uns dos outros para todos os blocos de material hidrofílico. Ainda, m que é o número de monômeros de materiais hidrofílicos pode ser o mesmo como o outro ou diferente um do outro dentre todos os blocos de materiais hidrofílicos. Isto é, 3 monômeros de materiais hidrofílicos (m=3) estão conectados em um primeiro bloco de material hidrofílico, 5 monômeros de materiais hidrofílicos (m=5) estão conectado no segundo bloco de material hidrofílico, 4 monômeros de materiais hidrofílicos (m=4) estão conectados em um terceiro bloco de material hidrofílico, etc. Isto é, os monômeros de materiais hidrofílicos cada um tendo diferentes números ou cada um tendo o mesmo número, podem ser utilizados em todos os blocos de materiais hidrofílicos.

[064] Ainda, na presente invenção, o ligante (J) é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em PO3, SO3 e CO2, mas a presente invenção não é limitada a isto. É óbvio para uma pessoa com conhecimento na técnica que qualquer ligante pode ser utilizado dependendo do monômero do material hidrofílico utilizado, etc., contanto que atenda os objetivos da presente invenção.

[065] Alguns ou todos os monômeros de materiais hidrofílicos podem ser modificados para terem grupos funcionais requeridos para ligação com outros materiais tais como um ligante específico alvo, etc., como necessário.

[066] O bloco de material hidrofílico pode ser ligado em qualquer posição da extremidade 3’ ou extremidade 5’ do oligo de fita única, e pode ser ligado a qualquer posição da extremidade 3’ ou extremidade 5’ da fita senso ou a fita antissenso do oligo de fita dupla.

[067] Os materiais hidrofílicos B nas Fórmulas Estruturais (1) e (2) formam as nanopartículas formadas das estruturas do oligonucleotídeo das Fórmulas Estruturais (1) e (2) através de uma interação hidrofóbica. O material hidrofóbico preferencialmente tem um peso molecular de 250 a 1.000, e pode incluir um derivado de esteroide, um derivado de glicerídeo, éter glicerol, polipropileno glicol, hidrocarboneto C12 a C50 insaturado ou saturado, diacilfosfatidilcolina, ácido graxo, fosfolipídeo, lipopoliamina, etc., mas a presente invenção não é limitada a isto. É óbvio para uma pessoa com conhecimento na técnica que qualquer material hidrofóbico pode ser utilizado contanto que atenda aos objetivos da presente invenção.

[068] O derivado de esteroide pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em colesterol, colestanol, ácido cólico, formato de colesteril, formato de colestanil e colestanil amina, e o derivado de glicerídeo pode ser selecionado a partir de mono-, di- e tri-glicerídeo, etc., em que o ácido graxo do glicerídeo é preferido por ser ácido graxo C12 a C50 insaturado ou saturado.

[069] Em particular, dentre os materiais hidrofóbicos, hidrocarboneto saturado ou insaturado ou colesterol é preferido uma vez que seja facilmente capaz de ser ligado em uma etapa sintética da estrutura de oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção, e hidrocarboneto C24, particularmente, tetracosano incluindo uma ligação dissulfídica é a mais preferida.

[070] O material hidrofóbico é ligado à extremidade oposta (extremidade distal) do oligonucleotídeo ligado ao bloco de material hidrofílico, e pode ser ligado a qualquer posição da fita senso ou fita antissenso do oligo de fita dupla.

[071] O oligonucleotídeo (R) na presente invenção pode incluir um siRNA ou shRNA de fita dupla ou fita simples, mimético de microRNA antissenso, inibidor de microRNA, oligonucleotídeos antissenso (ASO), etc., sem limitação, e em particular, o siRNA de fita dupla é mais preferido.

[072] Quando oligonucleotídeos de fita dupla tais como siRNA de fita dupla, miRNA, etc., são utilizados, a fita senso e/ou fita antissenso do oligonucleotídeo de fita dupla consiste em 15 a 40, preferencialmente 19 a 31 nucleotídeos, e em particular, é preferido ligar-se a pelo menos um grupo fosfato, preferencialmente um a três grupos fosfato na extremidade 5’ da fita antissenso.

[073] Ainda, o oligonucleotídeo tem várias modificações para fornecer resistência da nuclease e diminuição de estímulo imune não específico de modo a melhorar a estabilidade in vivo, em que a modificação pode ser uma ou mais combinações selecionadas da modificação em que o grupo -OH no carbono 2’ em uma estrutura de açúcar em um ou mais nucleotídeos é substituído com -CH3 (metil), - OCH3(metoxi), -NH2, -F(flúor), -O-2-metoxietil, -O-propil, -O-2- metiltioetil, -O-3-aminopropil, -O-3-dimetilaminopropil, -O-N- metilacetamida ou -O-dimetilamidooxietil; modificação em que oxigênio em uma estrutura de açúcar em nucleotídeos é substituído com enxofre; e modificação para fosforotioato ou boranofosfofato, ligações de metil fosfonato de ligações de nucleotídeos, ou pode ser uma modificação de ácido nucleico de peptídeo (PNA), modificação de ácido nucleico bloqueado (LNA), ou modificação de ácido nucleico não bloqueado (UNA) (Crooke et al., Ann. Rev. Med. Vol.55: pp61-65 2004, US 5.660.985, US5.958.691, US 6.531.584, US 5.808.023, US 6.326.358, US 6.175.001 Braasch D. A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. et al., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. et al., Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003,Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 17 5761-5773, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 5 1823-1832).

[074] Enquanto isso, o tecido do tumor é rígido por ter limitação de difusão como comparado ao tecido normal, em que esta limitação de difusão afeta o movimento dos resíduos, tais como nutrientes, oxigênio e dióxido de carbono requerido para o crescimento do tumor, de modo que a limitação de difusão é superada formando os vasos sanguíneos em torno do tumor através de angiogênese. Os vasos de sangue no tecido do tumor formados pela angiogênese têm uma estrutura de vaso sanguíneo defeituoso e com vazamento, com um espaço de 100 nm a 2 um, dependendo dos tipos de tumores. Portanto, as nanopartículas passam facilmente através do endotélio capilar do tecido de câncer tendo uma estrutura de vaso sanguíneo defeituoso e com vazamento como comparado a capilares organizados do tecido normal, de modo que é fácil acessar o interstício do tumor no processo de circulação de sangue. Em adição, vasos linfáticos (drenagem linfática) não estão presentes no tecido do tumor, de modo que drogas são acumuladas, o que refere-se a um aumento no efeito de permeação e retenção (EPR). Este fenômeno em que as nanopartículas são liberadas especificamente ao tecido de tumor por este efeito, refere-se como direcionamento passivo (direcionamento passivo) (Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol.Oncol. 2008 Jan-Feb; 26(1):57-64).

[075] Um direcionamento ativo representa um caso em que uma fração de direcionamento é ligada à nanopartícula, e foi reportado que o direcionamento ativo promove um acúmulo preferencial das nanopartículas dentro do tecido alvo ou melhora a internalização em que as nanopartículas são liberadas dentro da célula alvo (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10):552-8. Epub 2008 Aug 21). O direcionamento ativo utiliza materiais (fração de direcionamento) tendo a capacidade de serem capazes de estarem ligados aos carboidratos, receptores, antígenos que são específicos para superfície de célula alvo ou super-expressos (Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-1917).

[076] Portanto, quando uma fração de direcionamento é fornecida na estrutura do oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção e a nanopartícula formada do mesmo, a liberação para a célula alvo é promovida eficazmente para alcançar a liberação para a célula alvo mesmo em uma concentração de dosagem relativamente baixa, assim mostrando uma função de alto controle para a expressão do gene alvo, e assim prevenindo a liberação não específica do oligonucleotídeo a outros órgãos e células.

[077] Por conseguinte, a presente invenção fornece estruturas representas pelas Fórmulas Estruturais (3) e (4) em que Q é (Li- Zj) nas estruturas de acordo com as Fórmulas Estruturais (1) e (2), e em que o ligante (L), particularmente, o ligante (L) especificamente ligado ao receptor que promove a internalização da célula alvo através de endocitose mediada por receptor (RME), é adicionalmente incluído.(Li-Zj)-(Am-J)n-X-R-Y-B Fórmula Estrutural (3)(Li-Zj)-(J-Am)n-X-R-Y-B Fórmula Estrutural (4)

[078] O ligante nas Fórmulas Estruturais (3) e (4) pode ser preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo específico de receptor alvo ou aptâmero, peptídeo tendo propriedades de RME para promover a internalização da célula de um modo específico de célula alvo; ou folato (geralmente, folato e ácido fólico são interseccionalmente utilizados, e o folato na presente invenção significa folato em um estado natural ou em um estado ativado em um corpo humano), produtos químicos tais como açúcar, carboidrato, etc., incluindo hexoaminas tais como N-acetil galactosamina (NAG), etc., glicose, manose, mas a presente invenção não está limitada a isto.

[079] Em particular, quando o ligante da presente invenção é açúcar tal como N-acetil Galactosamina (NAG), manose, glicose, etc., o ligante correspondente pode não apenas complementar e fortalecer a hidrofilicidade que pode ser diminuída dependendo do número repetido do monômero do bloco de material hidrofílico, mas também fornece um efeito de direcionamento das nanopartículas formadas das estruturas de acordo com as Fórmulas Estruturais (3) e (4) da presente invenção, de modo que as nanopartículas podem ser facilmente formadas.

[080] O ligante pode ser diretamente conectado ao monômero do material hidrofílico no bloco de material hidrofílico por uma ligação covalente, ou pode ser ligado ao monômero do material hidrofílico no bloco de material hidrofílico por um ligante (Z) mediando a ligação do ligante. É óbvio para uma pessoa com conhecimento na técnica que quando o ligante está ligado covalentemente ao monômero do material hidrofílico no bloco de material hidrofílico pelo ligante (Z), qualquer ligante pode ser utilizado contanto que atenda os objetivos da presente invenção. Em particular, o ligante preferencialmente tem uma estrutura selecionada dos Compostos (4) a (7) mostrados na Tabela 2 abaixo.

[081] Tabel a 2. Estrutura do ligante preferido na presente invenção

[082] No Composto (4), T é um composto em que qualquer compostoselecionado dos compostos (1) a (3) é repetido 1 a 15 vezes, e em particular, é preferido repetir o composto representado pela Fórmula Estrutural (1) 1 a 15 vezes. No Composto (4), T estáligado ao ligante, e a extremidade distal do monômero de material hidrofílico no bloco de material hidrofílico ou o ligante.

[083] Ainda, nos Compostos (5) a (7), o lado esquerdo do grupo funcional é ligado ao ligante, e o lado direito é ligado ao monômero do material hidrofílico no bloco de material hidrofílico, e n no Composto (5) é 0 ou 1. Pelo menos um grupo funcional que é capaz de ser ligado ao ligante está incluído nos Compostos (5) a (7), de modo que pelo menos um ligante ligando pode melhorar mais a eficiência da liberação da estrutura de RNA oligo de fita dupla de acordo com a presente invenção ao tecido alvo.

[084] Nas Fórmulas Estruturais (3) e (4), quando ambos de i e j são 0, é fornecida uma estrutura de olinucleotídeo à qual o ligante não está ligado, e quando i é 1 e j é 0, é fornecida uma forma em que o ligante está diretamente ligado ao monômero do material hidrofílico no bloco de material hidrofílico, e quando i é um integrante de 1 ou mais, e j é 1, é fornecida uma forma mediada por ligante em que o ligante é ligado ao monômero do material hidrofílico no bloco de material hidrofílico.

[085] Em adição, a presente invenção fornece estruturas em que o grupo amina ou grupo polihistidina estão adicionalmente introduzidos na extremidade do material hidrofílico das estruturas representadas pelas Fórmulas Estruturais 1 e 2, particularmente, a porção de extremidade distal da extremidade ligada ao siRNA, isto é, estruturas representadas pelas Fórmulas Estruturais 5 e 6 em que Q é P-J1-J2 na Fórmulas Estruturais (1) e (2).P-J1-J2-(Am-J)n-X-R-Y-B Fórmula Estrutural (5)P-J1-J2-(J-Am)n-X-R-Y-B Fórmula Estrutural (6)

[086] Nas Fórmulas Estruturais (5) e (6), J1 e J2 são ligantes e são cada um independentemente uma ligação covalente simples ou são preferencialmente selecionados a partir do grupo que consiste em C2-12 alquil, alquenil, alquinil, PO3-, SO3 e CO2, mas a presente invenção não é limitada a isto. É óbvio para uma pessoa com conhecimento na técnica que qualquer ligante é utilizável como J1 e J2 contanto que atenda os objetivos da presente invenção dependendo do material hidrofílico utilizado.

[087] Preferencialmente, quando o grupo amina é introduzido, na Fórmula Estrutural (5), J2 é preferencialmente PO3-, e J1 é preferencialmente C6 alquil, e na Fórmula Estrutural (6), J2 é preferencialmente uma ligação covalente simples, e J1 é preferencialmente C6 alquil, mas a presente invenção não está limitada a isto.

[088] Em adição, quando o grupo polihistidina é introduzido, na Fórmula Estrutural (5), J2 é preferencialmente PO3-, e J1 é preferencialmente o Composto (8), e na Fórmula Estrutural (6), J2 é preferencialmente uma ligação covalente simples, e J1 é preferencialmente o Composto (8), mas a presente invenção não está limitada a isto.

[089] Composto (8)

[090] O grupo amina nas Fórmulas Estruturais (5) e (6) pode ser grupos amina primários ou terciários, e o grupo amina primário é particularmente preferido. O grupo amina pode estar presente como um sal de amina. Por exemplo, o sal do grupo amina primário pode estar presente na forma de NH3+. Ainda, o grupo polihistidina nas Fórmulas Estruturais (5) e (6) preferencialmente inclui 3 a 10 histidinas, mais preferencialmente, 5 a 8 histidinas, e mais preferencialmente, 6 histidinas. Em adição à histidina, pelo menos uma cisteína pode ser incluída adicionalmente.

[091] O grupo amina ou grupo polihistidina é introduzido para realizar facilmente a introdução intercelular e escapar do endossomo da estrutura de RNA do oligonucleotídeo, e uma possibilidade de introduzir o grupo amina e utilizando o grupo polihistidina para realizar facilmente a introdução intercelular e escapar do endossomo dos carreadores tais como Ponto Quântico, Dendrímero, lipossoma, etc., e o efeito dos mesmos já foi reportado.

[092] Especificamente, é conhecido que o grupo amina primário expresso na extremidade ou fora do carreador é protonado em pH in vivo para formar um conjugado com um gene carregado negativamente por uma interação eletrostática, e escapar do endossomo é facilmente realizado devido à aminas terciárias internas tendo um efeito tampão em um pH baixo do endossomo após ser introduzido nas células, assim sendo capaz de proteger o carreador da decomposição do lisossoma (Gene Delivery and Expression Inhibition Using Polymer-Based Hybrid Material. Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No.3, pp254-259).

[093] É conhecido que a histidina que é um dos aminoácidos não essenciais, tem um anel imidazol (pKa3 6,04) em um resíduo (-R) para aumentar a capacidade do tampão (capacidade de tamponamento) no endossoma e lisossoma, de modo que a expressão de histidina pode ser utilizada para aumentar a eficiência de escapar do endossomo em carreadores de gene não virais incluindo lipossoma (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262- 270).

[094] Nas Fórmulas Estruturais (1) a (6) na presente invenção, o bloco de material hidrofílico ou material hidrofílico está ligado a um oligonucleotídeo pela ligação covalente simples ou ligação covalente mediada por ligante (X ou Y). O ligante mediando a ligação covalente está ligado covalentemente ao bloco de material hidrofílico ou o material hidrofílico representado por (Am-J)n ou (J-Am)n nas Fórmulas Estruturais (1) e (2) e na extremidade do oligonucleotídeo, e não é particularmente limitado contanto que a ligação que é possível ser decomposta em um ambiente específico seja fornecida como necessário. Portanto, qualquer composto para a ligação para ativar o oligonucleotídeo e/ou o material hidrofílico (ou material hidrofóbico) na preparação da estrutura do oligonucleotídeo pode ser utilizado como o ligante. A ligação covalente pode ser qualquer uma de uma ligação não degradável ou uma ligação degradável. Aqui, exemplos de ligação não degradável podem incluir uma ligação amida ou uma ligação de fosforilação, e exemplos da ligação degradável podem incluir uma ligação dissulfídica, uma ligação degradável ao ácido, uma ligação éster, uma ligação anidrido, uma ligação biodegradável ou uma ligação degradável enzimaticamente e similares, mas a presente invenção não está necessariamente limitada a isto.

[095] Na Fórmulas Estruturais (1) a (6) da presente invenção, quando o oligonucleotídeo de fita dupla, particularmente, o RNA oligo de fita dupla é utilizado, as ligações do RNA oligo de fita dupla e o bloco de material hidrofílico podem ser várias como mostrados nas Fórmulas Estruturais 7 a 18 da Tabela 3 abaixo.

[096] Tabela 3. Tipos de ligações entre RNA oligo de fita dupla e material hidrofóbico e hidrofílico preferidos na presente invenção.

[097] Na Tabela 3, S significa uma fita senso de um RNA oligo de fita dupla, AS significa uma fita antissenso do RNA oligo de fita dupla e pAS significa uma fita antissenso à qual um grupo fosfato está ligado. O restante A, B, X, Y, L, Z, n e m são os mesmos como sendo definidos nas Fórmulas Estruturais (1) e (2).

[098] Em particular, a estrutura do oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção representada pela Fórmula Estrutural (4) preferencialmente tem uma estrutura representada pela Fórmula Estrutural (19) abaixo:

[099] Na Fórmula Estrutural (19), A é um monômero de material hidrofílico, B é um material hidrofílico, L é um ligante especificamente ligado ao receptor que promove a internalização da célula alvo através de endocitose mediada por receptor (RME), Z é um ligante que medeia a ligação entre o monômero do material hidrofílico e o ligante, R é um oligonucleotídeo de fita dupla ou fita simples, m é um integrante de 1 a 15, n é um integrante de 1 a 10 e A, B, L, R, etc., são os mesmos como sendo definidos na Fórmula Estrutural (4) da presente especificação.

[0100] Em particular, A é qualquer material selecionado dos Compostos (1) a (3) mostrados na Tabela 1, e Z é preferencialmente um Composto (4).

[0101] Em outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece um suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20) abaixo:

[0102] Na Fórmula Estrutural (20), L é o mesmo como sendo definido nas Fórmulas Estruturais (3) e (4), e T é o mesmo como sendo definido no Composto (4). Ainda, um de C e D é um suporte sólido, o outro é dimetoxitritil, E e F são independentemente cada um integrante de 1 a 10, e i representa 0 ou 1.

[0103] Em ainda outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece um método para preparar estruturas de oligonucleotídeo representadas pelas Fórmulas Estruturais (1) a (4) através do uso de um suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20).

[0104] O método é para preparar estruturas de oligonucleotídeo representadas pelas Fórmulas Estruturais (1) a (4) através do uso do suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20) da presente invenção, e quando o oligonucleotídeo é uma fita simples, o método inclui:

[0105] (1) ligar covalentemente um bloco de material hidrofílico ao suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20) n- vezes repetidamente;

[0106] (2) sinteti zar um oligonucleotídeo de fita simples baseado no suporte sólido ao qual o bloco de material hidrofílico está ligado;

[0107] (3) ligar covalentemente um material hidrofóbico à extremidade 5’ do oligonucleotídeo ao qual o bloco de material hidrofílico está ligado; e

[0108] (4) separar a estrutura de oligonucleotídeo do suporte sólido.

[0109] Na presente invenção, o suporte sólido inclui vidro de poro controlado (CPG), poliestireno, sílica gel, papel de celulose, etc., mas a presente invenção não está limitada a isto. Quando o suporte sólido é CPG, um diâmetro é preferencialmente 40 a 180 μm, e preferencialmente tem um tamanho de poro de 500 a 3000Â .

[0110] Ainda, quando o oligonucleotídeo da estrutura do oligonucleotídeo da presente invenção é um RNA de fita dupla, o oligonucleotídeo de fita dupla preferencialmente consiste em 19 a 31 nucleotídeos. O oligonucleotídeo utilizável na presente invenção pode ser qualquer oligonucleotídeo de fita dupla com respeito a qualquer gene que é utilizado para terapia de gene ou pesquisa de gene, ou que tem uma possibilidade de ser utilizado para terapia de gene ou pesquisa de gene.

[0111] A presente invenção fornece estruturas de oligonucleotídeo de fita dupla (RNA) representadas pelas Fórmulas Estruturais (7) a (10) e (13) a (16) mostradas na Tabela 3, e um método para preparar as mesmas. Especificamente, o método para preparar as estruturas de oligonucleotídeo representadas pelas Fórmulas Estruturais (7) a (10) e (13) a (16) através do uso do suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20) da presente invenção, e quando o oligonucleotídeo é uma fita dupla, o método inclui:

[0112] (1) ligar covalentemente um bloco de material hidrofílico ao suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20) n- vezes repetidamente;

[0113] (2) sinteti zar um RNA de fita simples baseado em um suporte sólido ao qual o bloco de material hidrofílico está ligado;

[0114] (3) ligar covalentemente um material hidrofóbico à extremidade 5’ do RNA ao qual o bloco de material hidrofílico está ligado;

[0115] (4) separar a estrutura RNA-polímero e um RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta a partir do suporte sólido; e

[0116] (5) formar o oligonucleotídeo de fita dupla através doanelamento da estrutura RNA-polímero e do RNA de fita simplestendo uma sequência complementar a esta.

[0117] Mais preferencialmente, o método inclui:

[0118] (1) ligar o bloco de material hidrofílico no suportesólido representa pela Fórmula Estrutural (20);

[0119] (2) repeti r a Etapa (1) n-1 vezes;

[0120] (3) sinteti zar um RNA de fita simples baseado no suporte sólido ao qual o bloco de material hidrofílico está ligado;

[0121] (4) ligar um material hidrofóbico à extremidade 5’ do RNA de fita simples;

[0122] (5) quando a sintetização está completa, separar e purificar a estrutura RNA-polímero e um RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta a partir do suporte sólido; e

[0123] (6) preparar a estrutura de RNA oligo de fita dupla pelo anelamento da estrutura RNA-polímero e o RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta.

[0124] Após a Etapa (5) acima, quando o preparo está completo, se sim ou não a estrutura RNA-polímero desejada e RNA de fita dupla estão preparadas, pode ser confirmado pela purificação do reagente utilizando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e medindo um peso molecular das mesmas utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. No método de preparo, a sintetização do RNA de fita simples tendo uma sequência complementar à sequência do RNA de fita simples sintetizado na Etapa (3), pode ser realizada antes da Etapa (1) ou pode ser realizada durante qualquer etapa das Etapas (1) a (5).

[0125] Ainda, quando um grupo fosfato está ligado à extremidade 5’ da fita antissenso como mostrado na Fórmula Estrutural (8) ou (14), o grupo fosfato pode ser ligado à extremidade 5’ da fita antissenso antes ou após a Etapa (6) do método de preparo.

[0126] Ainda, a presente invenção fornece estruturas de RNA oligo de fita dupla às quais o ligante está ligado representado pelas Fórmulas Estruturais (9), (10), (15) e (16), e um método para preparar o mesmo. Especificamente, o método para preparar as estruturas de RNA oligo de fita dupla utilizando o suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20) inclui:

[0127] (1) ligar covalentemente um bloco de material hidrofílico no suporte sólido representado pela Fórmula Estrutural (20) n- vezes repetidamente;

[0128] (2) sinteti zar um RNA de fita simples baseado no suporte sólido ao qual o bloco de material hidrofílico está ligado, sintetizado pela Etapa (1);

[0129] (3) ligar covalentemente um material hidrofóbico à extremidade 5’ do material obtido pela Etapa (2);

[0130] (4) quando a sintetização está completa, separar e purificar a estrutura RNA-polímero de fita simples à qual o ligante está ligado e o RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta do suporte sólido (CPG); e

[0131] (5) fo rmar a estrutura RNA oligo de fita dupla pelo anelamento da estrutura RNA-polímero à qual o ligante está ligado e o RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta.

[0132] Após a Etapa (5) acima, quando a preparação está completa, se sim ou não a estrutura RNA-polímero desejada à qual o ligante está ligado e o RNA de fita simples estão preparadas, pode ser confirmado pela purificação do reagente utilizando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e medindo o peso molecular dos mesmos utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. No método de preparação, a sintetização do RNA de fita simples tendo uma sequência complementar à sequência do RNA de fita simples sintetizado na Etapa (2), pode ser realizada antes da Etapa (1) ou pode ser realizada durante qualquer etapa das Etapas (1) a (4).

[0133] Ainda, quando um grupo fosfato está ligado à extremidade 5’ da fita antissenso como mostrado na Fórmula Estrutural (10) ou (16), o grupo fosfato pode estar ligado à extremidade 5’ da fita antissenso antes ou após a Etapa (6) do método de preparação.

[0134] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para preparar um material representado pela Fórmula Estrutural (21) e estruturas de oligonucleotídeo representadas pelas Fórmulas Estruturais (1) a (4) utilizando o material. A Fórmula Estrutural (21) é diferente da Fórmula Estrutural (20)apenas em vista dos substituintes C e D:

[0135] No material representado pela Fórmula Estrutural (21), um de C e D é dimetoxitritil, e o outro é cianoetilfósforo amidita.

[0136] O método é para preparar as estruturas de oligonucleotídeo representadas pelas Fórmulas Estruturais (1) a (4) pelo uso do material representado pela Fórmula Estrutural (21) da presente invenção, e quando o oligonucleotídeo é uma fita dupla, o método inclui:

[0137] (1) sintetizar um oligonucleotídeo de fita simples utilizando um suporte sólido ao qual um grupo funcional está ligado, preferencialmente, CPG;

[0138] (2) ligar covalentemente um monômero de material hidrofílico baseado no suporte sólido ao qual o oligonucleotídeo está ligado n-vezes repetidamente;

[0139] (3) ligar covalentemente um material representado pela Fórmula Estrutural (21) à extremidade 5’ do oligonucleotídeo ao qual o material hidrofílico está ligado;

[0140] (4) separar a estrutura de polímero de oligonucleotídeo do suporte sólido; e

[0141] (5) ligar covalentemente um material hidrofóbico através do grupo funcional ligado à extremidade 3’ da estrutura de oligonucleotídeo obtida na Etapa (4).

[0142] Ainda, o método é para preparar as estruturas de oligonucleotídeo representadas pelas Fórmulas Estruturais (1) a (4) pelo uso do material representado pela Fórmula Estrutural (21) da presente invenção, e quando o oligonucleotídeo é uma fita dupla, o método inclui:

[0143] (1) sinteti zar um oligonucleotídeo de fita simples utilizando um suporte sólido ao qual um grupo funcional está ligado, preferencialmente, CPG;

[0144] (2) ligar covalentemente um monômero de material hidrofílico baseado no suporte sólido ao qual o oligonucleotídeo está ligado n-vezes repetidamente;

[0145] (3) ligar covalentemente um material representado pela Fórmula Estrutural (21) à extremidade 5’ do oligonucleotídeo ao qual o material hidrofílico está ligado;

[0146] (4) separar a estrutura RNA-polímero e o RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta do suporte sólido;

[0147] (5) ligar covalentemente um material hidrofóbico através de grupo funcional ligado à extremidade 3’ da estrutura de oligonucleotídeo obtida da Etapa (4); e

[0148] (6) fo rmar a estrutura oligonucleotídeo de fita dupla pelo anelamento da estrutura RNA-polímero e o RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta.

[0149] Ainda, quando um grupo fosfato está ligado à extremidade 5’ da fita antissenso, o grupo fosfato pode ser ligado à extremidade 5’ da fita antissenso antes ou após a Etapa (6) do método de preparação.

[0150] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece nanopartículas formadas das estruturas de oligonucleotídeo representadas por qualquer uma das Fórmulas Estruturais (1) a (6). O oligonucleotídeo é anfipático contendo ambos os materiais hidrofóbicos e materiais hidrofílicos, em que a porção hidrofílica consiste em n blocos de materiais hidrofílicos e tem afinidade através de uma interação tal como ligação de hidrogênio, etc., com moléculas de água presentes no corpo para serem direcionadas para fora, e os materiais hidrofóbicos são direcionados para dentro por uma interação hidrofóbica entre os mesmos, assim formando uma nanopartícula estável termodinamicamente (SAMiRNA). Isto é, os materiais hidrofóbicos são posicionados no centro da nanopartícula e os blocos de material hidrofílico são posicionados em uma direção para fora do oligonucleotídeo, assim formando nanopartículas que protegem o RNA oligo de fita dupla (veja FIG. 1). As nanopartículas como formadas acima podem melhorar a liberação intracelular do oligonucleotídeo e melhorar a eficiência para controlar a expressão de gene do oligonucleotídeo, que são possíveis de serem utilizadas no tratamento de doenças.

[0151] Ainda, uma vez que o monômero do material hidrofílico no bloco de material hidrofílico e o número de monômeros do mesmo podem ser facilmente controlados, e o número de blocos dematerial hidrofílico para serem utilizados podem também serfacilmente controlados, as porções de material hidrofílico queconsistem em n blocos de material hidrofílico em todas asestruturas de oligonucleotídeo são as mesmas uma como a outra,de modo que a estrutura de oligonucleotídeo tendo a porção dematerial hidrofílico tem vantagens em que é fácil realizaranálise do material, e como comparado à estrutura deoligonucleotídeo sintetizada pelo uso do material hidrofílico através de processo de purificação adicional assim como para ter o mesmo peso molecular, um processo de síntese é simples, e o custo pode ser reduzido.

[0152] Em adição, uma vez que o tamanho das nanopartículas formadas da estrutura do oligonucleotídeo pode ser regulado pelo controle do número de repetição dos blocos de material hidrofílico e monômeros de material hidrofílico, as nanopartículas formadas baseado no oligonucleotídeo podem ter capacidade de liberação de célula reprodutível significativa.

[0153] Ainda, o oligonucleotídeo ao qual o ligante está ligado, em que o ligante é particularmente açúcares tais como N-acetil Galactosamina (NAG), manose, glicose, etc., e a estrutura do oligonucleotídeo é representada pela Fórmula Estrutural (1) ou (2), pode simultaneamente complementar e fortalecer a hidrofilicidade que é diminuída quando o número de repetição dos blocos de material hidrofílico é diminuído, assim estabilizando a formação das nanopartículas. As nanopartículas às quais o ligante está ligado como formado acima, podem melhorar a liberação intracelular do oligonucleotídeo e melhorar a eficiência do oligonucleotídeo, que é possível ser utilizado para tratamento de doenças. Sínteses mais específicas da estrutura e características, eficiência de liberação intracelular e efeitos das nanopartículas formadas das estruturas de oligonucleotídeo serão descritos pelos seguintes Exemplos em maiores detalhes.

[0154] Ainda, a presente invenção fornece um método de tratamento utilizando as estruturas de oligonucleotídeo ou as nanopartículas formadas baseadas nas estruturas de oligonucleotídeo. Especificamente, o método de tratamento inclui nanopartículas formadas de estruturas de oligonucleotídeos e administrar as nanopartículas no corpo de um animal.

[0155] Ainda, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade farmaceuticamente eficaz das nanopartículas formadas das estruturas de oligonucleotídeo.

[0156] A composição da presente invenção pode ser preparada por incluir adicionalmente pelo menos um tipo de carreador aceitável farmaceuticamente para administração em adição aos componentes eficazes descritos acima para administração. O carreador farmaceuticamente aceitável é requerido para ser compatível com os componentes eficazes da presente invenção. Um componente selecionado de solução salina, água esterilizada, solução de Ringer, solução salina tamponada, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos podem ser utilizados. Em adição, outros aditivos convencionais tais como antioxidante, tampão, fungistat, etc., podem ser adicionados à mesma como necessário. Em adição, a composição pode ser preparada como uma formulação para injeção, tal como uma solução aquosa, suspensão, emulsão, etc., por adicionalmente adicionar diluente, dispersante, surfactante, ligante e lubrificante à mesma. Em adição, métodos apropriados na técnica ou um método divulgado em Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA, podem ser preferencialmente utilizados para a formulação, dependendo de cada doença ou componente.

[0157] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser determinada baseado nos sintomas do paciente geral e gravidade da doença por especialistas na técnica. Em adição, a composição pode ser formulada em vários tipos tais como pó, comprimido, injeção, pomada, xarope e similares, e pode ser fornecida com uma dose única ou um recipiente de doses múltiplas, por exemplo, uma ampola selada, frasco e similares.

[0158] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada oralmente ou parenteralmente. Exemplos de uma rota de administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem incluir oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intradural, intracardíaca, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intestinal, sublingual ou administração tópica, mas a presente invenção não está limitada a isto.

[0159] Para a administração clínica como descrito acima, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada como uma formulação apropriada por tecnologia conhecida. A quantidade de administração da composição da presente invenção pode ter várias faixas dependendo do peso, idade, gênero, condição de saúde, dieta, tempo de administração, método, taxa de excreção, a gravidade da doença e similares, de um paciente, e pode ser facilmente determinada por um especialista geral na técnica.

[0160] A presente invenção fornece um método de regulação da expressão de gene in vivo ou in vitro, utilizando a estrutura de oligonucleotídeo. Em adição, a presente invenção fornece um método de regular a expressão de gene in vivo ou in vitro, utilizando a nanopartícula contendo a estrutura de oligonucleotídeo.Exemplos

[0161] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos seguintes Exemplos. Estes exemplos são apenas para exemplificar a presente invenção, e será óbvio para aqueles com conhecimento na técnica que o escopo da presente invenção não é entendido para ser limitado a estes exemplos.

[0162] Exemplo 1. Preparação do CPG (3’ N-acetil galactosamina) (vidro de poro controlado)

[0163] De modo a preparar uma estrutura RNA oligo de fita dupla à qual um ligante está ligado, CPG N-acetil galactosamina que é um material ligante e é ligável à estrutura RNA oligo de fita dupla, foi preparado.

[0164] Exempl o 1-1. Preparação do reagente de 1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG (vidro de poro controlado)

[0165] De modo a ligar o N-acetil galactosamina (NAG) à estrutura RNA oligo de fita dupla, 1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG (vidro de poro controlado) foi preparado como mostrado na FIG. 2.

[0166] Exemplo 1-1-1. Preparação do 1,3,4,6-tetraacetil-NAG (Composto 1 da FIG. 2)

[0167] Os materiais iniciais, cloridrato de galactosamina (Sigma Aldrich, USA) (10 g, 46,37 mmol), acetonitrila (150 ml) e trietilamina (556,48 ml) foram misturados uns com os outros e refluxados por 1 hora. A mistura foi lentamente resfriada para temperatura ambiente, resfriada para 0D utilizando água com gelo, e anidrido acético (43,83 ml, 463,70mmol) foi adicionado gota a gota. Após a adição estar completa, a água com gelo foi removida, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 24 horas. Após a reação estar completa, solução aquosa de bicarbonato de sódio saturada foi lentamente adicionada até que o pH seja neutro. Após o pH estar neutro, a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas para obter um sólido, o sólido obtido foi filtrado, e o filtrado foi sequencialmente lavado com etil acetato, água destilada e etil acetato. O sólido foi seco à vácuo para obter 1,3,4,6-tetraacetil-NAG (9,792 g, 56 %) (veja FIG. 2).

[0168] Exempl o 1-1-2.Preparação do 3,4,6-triacetil-1-hexa(etilenoglicol)-N-acetil galactosamina (Composto 2 da FIG. 2)

[0169] 1,3,4,6 -tetraacetil-N-acetil-galactosamina (6,77 g, 18,04 mmol) obtido do Exemplo 1-1-1, cloreto de ferro (III) (3,80 g, 23,45 mmol) e cloreto de metileno (200 ml) foram misturados uns com os outros e agitados em temperatura ambiente. Após agitar por 10 minutos, hexa(etileno glicol) (5,90 ml, 4,82 mmol) foi adicionado a isto e refluxado por 2 horas. Após a reação estar completa, a mistura foi filtrada através de celite, e o filtrado foi lavado com cloreto de metileno. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e etil acetato e água destilada foram adicionados para extrair uma camada aquosa. A camada aquosa obtida foi extraída com cloreto de metileno, e a camada orgânica foi coletada e seca sob sulfato de magnésio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e seco à vácuo para obter 3,4,6-triacetil-1-hexa (etileno glicol)-N-acetil- galactosamina (2,24 g, 74,9%) (veja FIG. 3).

[0170] Exempl o 1-1-3. Preparação do 3,4,6-triacetil-1- [hexa(etileno glicol)-N’-1’,2’-propanodiol]-N-acetil galactosamina (Composto 3 da FIG. 2).

[0171] 3,4,6 -triacetil-1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina (13,66g, 22,33mmol) obtido pelo Exemplo 1-1-2 foi adicionado em acetonitrila (220ml) e agitado. NN’-disuccinimidil carbonato (9,15g, 35,73mmol) e trietilamina (9,90ml, 71,46mmol) foram adicionados a isto e agitados por 24 horas. 3-amino-1,2- propanodiol (3,26g, 35,73mmol) foi diluído com N,N’-dimetil formamida (60ml), trietilamina (4,95ml, 35,73mmol) foi adicionada a isto, e a mistura foi adicionada à uma solução de reação e agitada por 24 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e seca à vácuo. A mistura foi separada por uma coluna, e a solução obtida foi concentrada sob pressão reduzida. A mistura obtida foi seca à vácuo para obter 3,4,6-triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N'-1',2'-propanodiol]-N-acetil galactosamina (9,23g, 56,7%) (veja FIG. 4).

[0172] Exempl o 1-1-4. Preparação do 3,4,6-triacetil-1- [hexa(etileno glicol)-N’-1’-metoxi(dimetoxitritil)-2’-propanol]- N-acetil galactosamina (Composto 4 da FIG. 2).

[0173] 3,4,6 -triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N’-1’,2’- propanodiol]-N-acetil galactosamina (9,23g (12,67mmol, 1eq)) obtida pelo Exemplo 1-1-3 foi adicionada ao cloreto de metileno (120ml) e agitada. Trietilamina (5,27ml (38,00mmol, 3eq)) foi adicionada a isto. Cloreto de DMT (4,72g, 13,93mmol) diluído em cloreto de metileno (20 ml) foi adicionado e a mistura agitada por 24 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, extraída com etil acetato, seca sobre sulfato de magnésio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. A mistura foi separada por uma coluna, e a solução obtida foi concentrada sob pressão reduzida. A mistura obtida foi seca à vácuo para obter 3,4,6-triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N'-1'- metoxi-dimetoxitritil-2'-propanol]-N-acetil-galactosamina desejada (7,77g, 59,5%).

[0174] Exempl o 1-1-5. Preparação do 3,4,6-triacetil-1- [hexa(etileno glicol)-N’-1’-metoxi(dimetoxitritil)-2’-propoxi (ácido succínico)]-N-acetil galactosamina (Composto 5 da FIG. 2).

[0175] 3,4,6 -triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N’-1’- metoxi(dimetoxitritil)-2’-propanol]-N-acetil galactosamina(7,72g, 7,487mmol) obtida pelo Exemplo 1-1-4 foi adicionada em piridina (70ml) e agitada. Anidrido acético (3,75g, 37,486mmol) e DMAP (0,46g, 3,745mmol) foram adicionados a isto, e a mistura foi agitada a 60 a 70°C por 24 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e seca à vácuo. A mistura foi extraída com etil acetato. A mistura foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O filtrado foi separado por coluna e a solução obtida foi concentrada sob pressão reduzida. A mistura obtida foi seca à vácuo para obter 3,4,6-triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N'- 1'-metoxi (dimetoxitritil)-2'-propoxi (ácido succínico)]-N- acetil-galactosamina desejado (7,61g, 89,9%).

[0176] Exemplo 1-1-6. Preparação do composto CPG antes de tamparo 3,4,6-triacetil-1-hexa (etileno glicol)-N-acetilgalactosamina-CPG (Composto 6 da FIG. 2)

[0177] 3,4,6 -triacetil-1-[hexa(etileno glicol)-N’-1'-metoxi (dimetoxitritil)-2'-propoxi (ácido succínico)]-N-acetil- galactosamina (0,34 g, 0,30 mmol) obtido pelo Exemplo 1-1-5 foi adicionado a um vidro de poro controlado com alquilamina de cadeia longa (LCAA-CPG) (1000Â) (5g), bis-2—oxo-3—cloreto fosfórico oxazolidinil (0,2g, 0,45 mmol), 1-hidroxibenzotriazo (0,06 g, 0,45 mmol) e cloreto de metileno (50ml). Trietil amina (0,03ml, 2,25mmol) foi adicionada a isto. A mistura foi reagida por 24 horas. A mistura foi filtrada e lavada com metanol. A mistura foi seca para obter um composto CPG desejado (4,91g) antes de tampar o 3,4,6-triacetil-1-hexa (etileno glicol)-N- acetil galactosamina-CPG.

[0178] Exempl o 1-1-7. Preparação do 3,4,6-triacetil-1- hexa(etileno glicol)-N-acetil-galactosamina-CPG (Vidro de Poro Controlado) (Composto 7 da FIG. 2).

[0179] O composto CPG (4,86g) antes de tampar o 3,4,6-triacetil- 1-hexa (etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG obtido pelo Exemplo 1-1-6, foi adicionado em piridina (30ml), anidrido acético (6,02ml, 63,70mmol) e 1-metlimidazol (5,08ml, 63,70mmol) e reagido por 24 horas. A mistura foi filtrada e lavada com metanol. O filtrado foi seco à vácuo para obter um composto desejado, 3,4,6-triacetil-1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG (Vidro de Poro Controlado) (2,8g).

[0180] Exemplo 2. Preparação da Estrutura de RNA Oligo de Fita Dupla

[0181] Daqui em diante, de modo a inibir a Survivina, um RNA oligo de fita dupla para Survivina foi utilizado. A Survivina, que é uma proteína comumente expressa na maioria dos tumores neoplásicos ou em linhagens de células transformadas testadas até o momento, é esperada como um importante alvo no tratamento de câncer (Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7): 553-62).

[0182] O RNA oligo de fita dupla para Survivina da presente invenção consiste em uma fita senso da SEQ ID NO: 1 e uma fita antissenso tendo uma sequência complementar a esta, e um RNA oligo de fita dupla utilizado como um grupo controle consiste em uma fita senso da SEQ ID NO: 2 e uma fita antissenso tendo uma sequência complementar a esta. Sequências de base do RNA oligo de fita dupla utilizadas nos presentes Exemplos são como segue:(SEQ ID NO: 1) 5’-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3'(SEQ ID NO: 2) 5’-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3'

[0183] No RNA oligo de fita dupla, a fita simples do RNA oligo de fita dupla foi sintetizada por um método de uso de β- cianoetilfosforamidita para conectar uma ligação fosfodiéster formando uma estrutura de esqueleto de RNA (Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: use of beta-cyanoethyl-N,N- dialkylamino-/N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11): 4539-57).

[0184] Uma sequência desejada de fita simples de RNA pode ser obtida iniciando o processo de síntese no suporte sólido (CPG) contendo nucleosídeo ligado a esta e repetindo ciclos incluindo desbloqueio, acoplamento, tampamento e oxidação. O sintetizador de RNA 384 (BIONEER, Korea) foi utilizado para uma série dos processos de síntese correspondentes do RNA oligo de fita dupla.

[0185] De modo a analisar as propriedades físicas da nanopartícula formada da estrutura de RNA oligo de fita dupla de acordo com o número de repetição do monômero do material hidrofílico formando a estrutura do RNA oligo de fita dupla, as estruturas de RNA oligo de fita dupla tendo as seguintes estruturas foram preparadas.

[0186] As estruturas RNA oligo de fita dupla às quais o ligante preparado na presente invenção foi ligado, tinham as estruturas mostradas na Tabela 4 abaixo, respectivamente.

[0187] Tabel a 4. Detalhes da estrutura à qual o ligante preparado na presente invenção foi ligado

[0188] Na Tabela 4, S é uma fita senso do RNA oligo de fita dupla; AS é uma fita antissenso do RNA oligo de fita dupla; PO4 é um grupo fosfato; NAG é um ligante, N-acetil galactosamina; PEG é um material hidrofílico polidisperso, isto é, polietileno glicol; hexametileno glicol-PO3- é um monômero de material hidrofílico em que hexaetileno glicol está ligado através de um grupo fosfato (PO3-); o subscrito é o número de repetição (n) do monômero do material hidrofílico; C24 é um material hidrofóbico, e tetradocosano incluindo uma ligação dissulfídica; e 5’ e 3’ significam derivados da extremidade de RNA oligo de fita dupla.

[0189] A fit a antissenso da estrutura RNA oligo de fita dupla tem a mesma estrutura. A fita antissenso da estrutura RNA oligo de fita dupla foi preparada pelo método descrito acima em que uma ligação fosfodiéster formando uma estrutura de esqueleto de RNA é ligada utilizando β-cianoetilfosforamidita. Então, de modo a ligar um grupo fosfato à extremidade 5’, o reagente de fosforilação química (CPR) que é [3-(4,4' dimetoxitritiloxi)- 2,2-dicarboxietil]propil-(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil) fosforamidita foi utilizado para preparar uma fita antissenso do S-SAMiRNALP-PO4 à qual um grupo fosfato está ligado na extremidade 5’. De outro modo, a fita antissenso à qual o grupo fosfato está ligado foi preparada recuperando a fita simples de RNA do CPG e tratando com uma quinase de fosforilação para ligar o grupo fosfato à extremidade 5’.

[0190] No caso da fita senso da estrutura RNA oligo de fita dupla SAMiRNA, a fita senso do SAMiRNA em que NAG-PEG está ligado à extremidade 3’ e tetradocosano (C24) está ligado à extremidade 5’ foi preparada ligando o material hidrofílico, isto é, polietileno glicol fosforamidato (PEG-fosforamidita, em que PEG tem um peso molecular (Mn) de 2000) através da reação acima utilizando 3,4,6-triacetil-1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG preparado pelo Exemplo 1, como um suporte, sintetizando RNA e ligando tetradocosano (C24) incluindo uma ligação dissulfídica na extremidade 5’.

[0191] No caso da fita senso da estrutura RNA oligo de fita dupla monoSAMiRNA (n=1), a fita senso do monoSAMiRNA (n=1) em que NAG- hexaetileno glicol está ligado à extremidade 3’ e tetradocosano está ligado à extremidade 5’ foi preparada pela sintetização do RNA através da reação acima utilizando 3,4,6-triacetil-1- hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG preparado no Exemplo 1, como um suporte, e adicionalmente ligando o material hidrofóbico, isto é, tetradocosano (C24) incluindo uma ligação dissulfídica à extremidade 5’.

[0192] No caso da fita senso da estrutura de RNA oligo de fita dupla monoSAMiRNA (n=2), a fita senso do monoSAMiRNA (n=2) em que NAG-hexaetileno glicol-(-PO4- hexaetileno glicol)1 está ligado à extremidade 3’ e tetradocosano está ligado à extremidade 5’ foi preparada pela ligação do monômero de material hidrofílico, isto é, demetoxitritil hexaetileno glicol fosforamidato, através da reação acima utilizando 3,4,6- triacetil-1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG preparado no Exemplo 1, como um suporte, sintetizando RNA, e adicionalmente ligando o material hidrofóbico, isto é, tetradocosano (C24) incluindo uma ligação dissulfídica à extremidade 5’.

[0193] No caso da fita senso da estrutura de RNA oligo de fita dupla monoSAMiRNA (n=3), a fita senso do monoSAMiRNA (n=3) em que NAG-hexaetileno glicol-(-PO4- hexaetileno glicol)2 está ligado à extremidade 3’ e tetradocosano está ligado à extremidade 5’ foi preparada ligando continuamente o monômero do material hidrofílico, isto é, dois demetoxitritil hexaetileno glicol fosforamidatos, através da reação acima utilizando 3,4,6- triacetil-1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG preparado no Exemplo 1, como um suporte, sintetizando RNA, e adicionalmente ligando o material hidrofóbico, isto é, tetradocosano (C24) incluindo uma ligação dissulfídica à extremidade 5’.

[0194] No caso da fita senso da estrutura de RNA oligo de fita dupla monoSAMiRNA (n=4), a fita senso do monoSAMiRNA (n=4) em que NAG-hexaetileno glicol-(-PO3- hexaetileno glicol)3 está ligado à extremidade 3’ e tetradocosano está ligado à extremidade 5’ foi preparado ligando continuamente o monômero do material hidrofílico, isto é, três demetoxitritil hexaetileno glicol fosforamidatos, através da reação acima utilizando 3,4,6- triacetil-1-hexa(etileno glicol)-N-acetil galactosamina-CPG preparado no Exemplo 1, como um suporte, sintetizando RNA, e adicionalmente ligando o material hidrofóbico, isto é, tetradocosano (C24) incluindo uma ligação dissulfídica à extremidade 5’.

[0195] Quando a síntese foi completa, a fita simples de RNA e estrutura RNA-polímero, sintetizadas tratando amônia 28 %(v/v) em banho de água a 60°C, foram separadas do CPG e as frações de proteção foram removidas dele por uma reação de desproteção, respectivamente. A fita simples de RNA e a estrutura RNA- polímero da qual a fração de proteção foi removida, foram tratadas com N-metilpirolidona, trietilamina e trietilaminatrihudrofluoreto em uma proporção de volume de 10:3:4 em um forno a 70°C, para remover 2' TBDMS(tert- butildimetilsilil). A fita simples de RNA, a estrutura RNA- polímero, e a estrutura RNA-polímero à qual o ligante está ligado, foram separadas dos reagentes por HPLC, e os pesos moleculares das mesmas foram medidos por espectroscopia de massa MALDI-TOF (SHIMADZU, Japão) para confirmar se sim ou não a sequência de base e a estrutura RNA-polímero correspondem àquelas a serem sintetizadas (FIGS. 11 a 14). Então, de modo a preparar cada estrutura RNA oligo de fita dupla, a fita senso e a fita antissenso em uma quantidade equivalente foram misturas uma à outra e colocadas em tampão de anelamento 1X (HEPES 30 mM, acetato de potássio 100 mM, acetato de magnésio 2 mM (pH 7,0 a 7,5), seguido pela reação em um banho de água em temperatura constante a 90°C por 3 minutos, e então reagidas a 37°C, assim preparando SAMiRNA, monoSAMiRNA (n=1), monoSAMiRNA (n=2), monoSAMiRNA (n=3) e monoSAMiRNA (n=4) desejados, respectivamente. Foi confirmado por eletroforese que as estruturas RNA oligo de fita dupla foram aneladas.

[0196] Exempl o 3. Análise das propriedades físicas das nanopartículas que consistem em monoSAMiRNA

[0197] Uma nanopartícula, isto é, micela, é formada por uma interação hidrofóbica entre os materiais hidrofóbicos ligados à extremidade do RNA oligo de fita dupla monoSAMiRNA preparado no Exemplo 2 (veja FIG. 1).

[0198] A formação da nanopartícula (SAMiRNA) que consiste do monoSAMiRNA correspondente foi confirmada pela análise do tamanho da nanopartícula e valor de concentração de micela crítico (CMC) de acordo com o número de repetição dos monômeros de material hidrofílico do monoSAMiRNA e Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM).

[0199] Exemplo 3-1. Medição da concentração de micela crítica (CMC) da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA

[0200] Um material anfifílico contendo ambos os grupos hidrofóbicos e grupos hidrofílicos em uma única molécula pode ser um surfactante, em que quando o surfactante está dissolvido em uma solução aquosa, os grupos hidrofóbicos do mesmo se movem em direção à porção central para prevenir que os grupos hidrofóbicos entrem em contato com água e os grupos hidrofílicos do mesmo se movem na direção exterior para formar uma micela. Aqui, uma concentração em que a micela é inicialmente formada é referida como uma concentração de micela crítica (CMC). Um método de medir a CMC utilizando pigmento fluorescente é baseado na propriedade do pigmento fluorescente em que o declive da curva do gráfico da intensidade de fluorescência é rapidamente mudado antes/após a micela estar formada. De modo a medir a CMC da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA, 0,04 mM DPH (1,6- Difenil-1,3,5-hexatrieno, SIGMA, USA) foi preparado como o pigmento fluorescente. 1 nmolM de monoSAMiRNA(n=1) foi diluído de uma concentração de 0, 0977 ^/m£ para o máximo de 50 ^/m£ com DPBS para cada etapa para preparar as amostras de monoSAMiRNA(n=1) tendo o volume total de 180 ^. 20 ^ de 0,04 mM DPH e metanol, que é um solvente de DPH, para um grupo controle foram adicionados às amostras preparadas, respectivamente, e misturadas bem, e tratadas com dispersor ultrassônico (Wiseclean: DAIHAN, Korea) de modo que o tamanho da nanopartícula é homogeneizado (700 W; amplitude: 20 %). As amostras homogeneizadas foram reagidas em temperatura ambiente sem luz por cerca de 24 horas, e os valores de fluorescência (excitação: 355 nm, emissão: 428 nm, leitura de topo) foram medidos. De modo a confirmar os valores de fluorescência relativos dentre os valores de fluorescência medidos, o valor de fluorescência da amostra contendo DPH - o valor de fluorescência da amostra contendo apenas o metanol (eixo Y) na mesma concentração foi medido e mostrado como um gráfico com respeito ao valor log da concentração tratada de monoSAMiRNA (n=1) (eixo X). MonoSAMiRNA (n=2) e monoSAMiRNA (n=3) foram medidos pelo mesmo método como descrito acima.

[0201] O valor de fluorescência medido para cada concentração foi rapidamente aumentado enquanto movendo de uma seção de baixa concentração para uma seção de alta concentração, em que a concentração no ponto de aumento rápido é a concentração CMC. Portanto, quando desenhando as linhas de tendência pela divisão da seção de baixa concentração em que a quantidade de fluorescência não é aumentada e a seção de alta concentração em que a quantidade de fluorescência é aumentada em várias seções, um valor X em uma interseção das duas linhas de tendência é a concentração CMC. Foi observado que a CMC medida da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=1) foi 0,83 μg/m^, que foi relativamente alta, e a CMC medida da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=2) foi 0,33 μg/m^, que foi significativamente baixa. Foi observado que a CMC medida da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=3) foi 0,58 μg/m^, e a CMC medida da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=4) foi 0,44^g/rn^ (FIG. 15). Por conseguinte, foi confirmado que a micela pode ser bem formada pela nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA mesmo em uma concentração significativamente baixa.

[0202] Exemplo 3-2. Preparação das nanopartículas que consistemem monoSAMiRNA

[0203] De modo a preparar nanopartículas homogeneizadas, o monoSAMiRNA (n=1) foi dissolvido em 1,5ml DPBS (Solução Salina Tamponada de Fosfato do Dulbecco) em uma concentração de 50 ^/^, e a mistura obtida foi seca por congelamento sob condição de -75°C e 5mTorr por 48 horas. MonoSAMiRNA(n=2), monoSAMiRNA(n=3) e monoSAMiRNA(n=4) foram medidos pelo mesmo método como descrito acima.

[0204] Exempl o 3-3. Medição do tamanho e índice de polidispersividade (PDI) da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA

[0205] Um tamanho de nanopartícula foi medido por medição de potencial zeta. Especificamente, um tamanho de nanopartícula homogeneizado produzido pelo Exemplo 3-2 foi medido por medição do potencial zeta (Nano-ZS, MALVERN, England), sob condições em que um índice de refração do material foi 1,459, um índice de absorção foi 0,001, uma temperatura de um solvente: DPBS foi 25°C e a viscosidade correspondente e índice de refração foram 1,0200 e 1,335, respectivamente. Uma vez que a medição foi conduzida por uma medição de tamanho incluindo 15 vezes repetidas e então repetida seis vezes. MonoSAMiRNA (n=1), monoSAMiRNA (n=2), monoSAMiRNA (n=3) e monoSAMiRNA (n=4) foram medidos pelo mesmo método como descrito acima.

[0206] Foi confirmado que um tamanho da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=1) foi 111 nm e o PDI da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=1) foi 0,19. Foi confirmado que um tamanho da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=2) foi cerca de 86 nm e o PDI da mesma foi 0,25, um tamanho da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=3) foi cerca de 80 nm e o PDI da mesma foi 0,30, e um tamanho da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA (n=4) foi cerca de 83 nm e o PDI da mesma foi 0,26 (FIG. 16). Conforme o valor PDI diminui, as partículas correspondentes se tornam distribuídas uniformemente e, portanto, pode ser apreciado que a nanopartícula da presente invenção tem um tamanho uniforme significativo.

[0207] Exemplo 3-4. Observação da nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA por TEM

[0208] A nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA foi observada por TEM de modo a confirmar a forma da mesma. Especificamente, o S-SAMiRNA foi dissolvido em DPBS de modo a ter a concentração final de 100 μg/^ e tratado por dispersor ultrassônico (Wiseclean: DAIHAN, Korea) de modo que o tamanho da nanopartícula seja homogeneizado (700 W; amplitude: 20 %). A nanopartícula que consiste em S-SAMiRNA foi observada com um material tendo uma alta densidade de elétron através de um método de coloração negativa. Foi confirmado que a nanopartícula observada por TEM tinha um tamanho similar ao da nanopartícula medida no Exemplo 3-2.

[0209] Exemplo 4. Inibição da expressão do gene alvo em linhagem de célula tumoral utilizando nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA

[0210] O aspecto de expressão do gene survivina da linhagem de célula tumoral transfectada foi observado utilizando a nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA preparada no Exemplo 3-2.

[0211] Exemplo 4-1. Cultura da linhagem de célula tumoral

[0212] Células de câncer cervical humano (HeLa) adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) foram cultivadas em um meio de cultura EMEM (meio essencial mínimo da Eagle formulado pela ATCC, EUA) contendo 10% (v/v) de soro bovino fetal, 100 unidades/^ de penicilina e 100μg/m^ de estreptomicina, sob a condição de 37°C e 5 %(v/v) de CO2.

[0213] Exemplo 4-2. Transformação da linhagem de célula tumoral utilizando a nanopartícula que consiste em monoSAMiRNA

[0214] 1 x 105 de linhagem de célula de fibroblasto cultivada no Exemplo 4-1 foi cultivada no meio EMEM por 18 horas em uma placa de 12 poços sob condição de 37°C e 5 %(v/v) de CO2, e o meio foi removido, e a mesma quantidade do meio Opti-MEM (GIBCO, USA) para cada poço foi dispensada. 100^ do meio Opti-MEM e SAMiRNA e monoSAMiRNA produzidos no Exemplo 3-2 foram adicionados ao DPBS em uma concentração de 50 ^/^, e a mistura obtida foi seca por congelamento sob condição de -75°C e 5mTorr por 48 horas pelo mesmo método como Exemplo 3-1 para produzir as nanopartículas homogeneizadas. Então, cada poço da linhagem de célula tumoral transfecção em uma concentração de 200 nM, e cultivado sob condição de 37°C e 5 %(v/v) de CO2 para o total de 48 horas.

[0215] Exempl o 4-3. Análise quantitativa relativa do mRNA do gene

Survivina

[0216] cDNA foi sintetizado extraindo o RNA total da linhagem de célula transfectada no Exemplo 4-2 acima, e uma quantidade de expressão de mRNA Survivina foi quantificada relativamente por PCR de tempo real de acordo com um método divulgado na Publicação Aberta de Patente Coreana No. 10-2009-0042297 (veja FIG. 17). Sur584 significa SAMiRNA tendo uma sequência de RNA oligo de fita dupla (SEQ ID NO: 1) específica para o gene alvo Survivina para cada estrutura de SAMiRNA, e CONT significa SAMiRNA incluindo uma sequência de grupo controle (SEQ ID NO: 2) que não afeta a expressão do gene alvo. Um grau de inibição de expressão do mRNA do gene alvo foi calculado com a quantidade de expressão do gene alvo de uma amostra tratada com Sur584 com respeito à quantidade de expressão do gene alvo de uma amostra tratada com CONT através de uma quantificação comparativa. Todos os monoSAMiRNAs (n=1 a 4) incluindo RNA oligo de fita dupla específico de Survivina tiveram um efeito de inibição da expressão do gene alvo, e foi observado que a partir do monoSAMiRNA (n=2) em que os blocos de material hidrofílico são dois ou mais, o alto efeito de inibição da expressão do gene alvo (cerca de 75% ou mais de inibição de expressão) foi mantido.

[0217] Exemplo 5. Preparação da estrutura oligo de fita dupla em que o grupo amina e/ou grupo histidina é introduzido no material hidrofílico

[0218] Exempl o 5.1. Preparação do SAMiRNA incluindo etileno glicol como monômero de material hidrofílico

[0219] Em um caso da estrutura oligo de fita dupla incluindo etileno glicol, particularmente, hexametileno glicol como um monômero de material hidrofílico, e C24 tetradocosano como um material hidrofóbico na presente invenção, a estrutura oligo de fita dupla pode ser representada pela Fórmula Estrutural (22) abaixo:

[0220] Na Fórmula Estrutural (22), C24 é tetradocosano que é um material hidrofóbico, e n é uma unidade repetida de hexa etileno glicol e é o mesmo como sendo definido na Fórmula Estrutural (1) ou (2).

[0221] No presente Exemplo, uma estrutura RNA oligo de fita dupla ([hexa etileno glicol]4-SAMiRNA) representada pela Fórmula Estrutural (23) abaixo, em que n é 4, foi preparada:

[0222] A Fórmula Estrutural (23) é especificamente representadapela Fórmula Estrutural (24) abaixo:

[0223] Nas Fórmulas Estruturais (23) e (24), S é uma fita senso do siRNA; AS é uma fita antissenso do siRNA; hexa etileno glicol é um material hidrofílico; C24 é um material hidrofóbico e tetradocosano incluindo uma ligação dissulfídica; e 5' e 3’ significam diretividades da extremidade do RNA oligo de fita dupla.

[0224] A fita senso do siRNA das Fórmulas Estruturais (23) e (24) foi produzida sintetizando n hexa etileno glicóis tendo uma forma de β-cianoetil fosforamidita, baseado em 3’ Uni-CPG produzido no Exemplo 1 da Publicação Aberta de Patente Coreana No. 10-2012-0119212, como um suporte, e sintetizando uma fita senso de uma estrutura de material hidrfílico-RNA oligo à qual hexa etileno glicol está ligado na extremidade 3’ pelo método descrito acima em que uma ligação fosfodiéster formando uma estrutura de esqueleto de RNA está ligada utilizando RNA β- cianoetil fosforamidita, e ligando tetradocosano incluindo uma ligação dissulfídica à extremidade 5', assim produzindo a fita senso da estrutura RNA-polímero desejada. Para uma fita antissenso em que o anelamento é realizado com a fita senso, a fita antissenso tendo uma sequência complementar à fita senso foi produzida pela reação descrita acima.

[0225] Quando a síntese foi completa, a fita simples de RNA e a estrutura RNA-polímero sintetizada pelo tratamento de amônia 28%(v/v) em banho de água a 60°C foram separadas do CPG e a frações de proteção foram removidas desta por uma reação de desproteção, respectivamente. A fita simples de RNA e cada estrutura RNA-polímero das quais a fração de proteção foram removidas, foram tratadas com N-metil pirrolidona, trietilamina e trietilaminatrihidrofluoreto em uma proporção de volume de 10:3:4, em um forno a 70°C, para remover 2' TBDMS (tert- butildimetilsilil).

[0226] O RNA do produto de reação foi separado e purificado por HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japão) equipado com coluna Daisogel C18 (Daiso, Japão), e foi confirmado se sim ou não o RNA purificado atende a sequência de base alvo por espectrômetro de massa MALDI-TOF (Shimadzu, Japão). Então, de modo a preparar cada estrutura RNA oligo de fita dupla, a fita senso e a fita antissenso em uma quantidade equivalente foram misturadas uma à outra e colocadas em um tampão de anelamento 1X (30 mM HEPES, 100 mM acetato de potássio, 2 mM acetato de magnésio (pH 7,0 a 7,5)), seguido pela reação em um banho de água em temperatura constante a 90°C por 3 minutos, e reagido novamente a 37°C, assim preparando cada estrutura RNA oligo de fita dupla incluindo siRNA tendo uma sequência Survivina como a fita senso. Foi confirmado por eletroforese que a estrutura RNA oligo de fita dupla foi anelada.

[0227] Exemplo 5.2. Preparação do SAMiRNA incluindo etileno glicol em que o grupo amina é introduzido, como monômero de material hidrofílico

[0228] Uma estrutura RNA oligo de fita dupla representada pela Fórmula Estrutural (25) abaixo em que um grupo amina é introduzido no material hidrofílico, foi preparada.

[0229] A Fórmula Estrutural (25) é especificamente representadapela Fórmula Estrutural (26) abaixo:

[0230] Nas Fórmulas Estruturais (25) e (26), S é uma fita senso do siRNA; AS é uma fita antissenso do siRNA; hexa etileno glicol é um material hidrofílico; C6 é um ligante com 6 carbonos conectando [Etileno Glicol]4 e Amina, C24 é um material hidrofóbico e tetradocosano incluindo uma ligação dissulfídica; e 5' e 3’ significam diretividades da extremidade do RNA oligo de fita dupla.

[0231] Ainda, o bloco de material hidrofílico está conectado a um grupo fosfato na extremidade 3’ da fita senso siRNA.

[0232] A fita senso do siRNA das Fórmulas Estruturais (25) e (26) foi produzida sintetizando 4 hexa etileno glicóis tendo uma forma de β-cianoetil fosforamidita, baseado no CPG incluindo derivado de 3’ Succinimida, como um suporte, e sintetizando uma fita senso de uma estrutura de material hidrofílico-RNA oligo à qual hexa etileno glicol está ligado à extremidade 3’ pelo método descrito acima em que uma ligação fosfodiéster formando uma estrutura de esqueleto de RNA é ligada utilizando RNA β- cianoetil fosforamidita, e ligando tetradocosano incluindo uma ligação dissulfídica à extremidade 5', assim produzindo a fita senso da estrutura RNA-polímero desejada. Para uma fita antissenso em que o anelamento é realizado com a fita senso, a fita antissenso tendo uma sequência complementar à fita senso foi produzida pela reação descrita acima.

[0233] Quando a síntese foi completa, a fita simples de RNA e estrutura RNA-polímero sintetizada pelo tratamento de amônia 28% (v/v) em banho de água a 60°C, foram separadas do CPG e as frações de proteção foram removidas por uma reação de desproteção, respectivamente. A fita simples de RNA e cada estrutura RNA-polímero das quais a fração de proteção foi removida, foram tratadas com N-metilpirrolidona, trietilamina e trietilaminetrihidrofluoreto em uma proporção de volume de 10:3:4, em um forno a 70°C, para remover 2’ TBDMS (tert- butildimetilsilil).

[0234] O RNA do produto de reação foi separado e purificado por HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japão) equipado com coluna Daisogel C18 (Daiso, Japão), e foi confirmado se sim ou não o RNA purificado atende a sequência base alvo por espectrômetro de massa MALDI-TOF (Shimadzu, Japão). Então, de modo a preparar cada estrutura RNA oligo de fita dupla, a fita senso e a fita antissenso em uma quantidade equivalente foram misturadas uma à outra e colocadas em um tampão de anelamento 1X (30 mM HEPES, 100 mM acetato de potássio, 2 mM acetato de magnésio (pH 7,0 a 7,5)), seguido pela reação em um banho de água em temperatura constante a 90°C por 3 minutos, e reagidas novamente a 37°C, assim preparando cada estrutura de RNA oligo de fita dupla incluindo siRNA tendo uma sequência de Survivina como a fita senso (daqui em adiante, referida como SAMiRNA- Survivina, respectivamente). Foi confirmado por eletroforese que a estrutura de RNA oligo de fita dupla produzida foi anelada.

[0235] Exempl o 5.3. Preparação do SAMiRNA incluindo etileno glicol em que o grupo polihistidina está introduzido, como monômero de material hidrofílico

[0236] Uma estrutura de RNA oligo de fita dupla representada pela Fórmula Estrutural (27) abaixo em que peptídeo é introduzido no material hidrofílico, foi preparada.

[0237] Na Fórmula Estrutural (27), H é histidina, e C é cisteína.

[0238] A Fórmula Estrutural (27) é especificamente representadapela Fórmula Estrutural (28) abaixo:

[0239] Na Fórmulas Estruturais (27) e (28), S é uma fita senso do siRNA; AS é uma fita antissenso do siRNA; [Etileno Glicol]4 é um material hidrofílico; um ligante é uma ligação entre o peptídeo e o SAMiRNA, Peptídeo é um peptídeo que consiste na sequência HHHHHHC; C24 é um material hidrofóbico e tetradocosano incluindo uma ligação dissulfídica; e 5' e 3’ significam diretividades da extremidade do RNA oligo de fita dupla.

[0240] Ainda, o bloco de material hidrofílico está conectado a um grupo fosfato na extremidade 3’ da fita senso do siRNA.

[0241] A fita senso do siRNA nas Fórmulas Estruturais (27) e (28) foi preparada conectando um ligante tendo um grupo funcional (por exemplo: NHSéster) ligado a aminas e um grupo funcional (por exemplo: maleimida) ligado a um tiol (-SH) do peptídeo com o oligo representado pelas Fórmulas Estruturais (25) e (26) do Exemplo 5-2. Especificamente, o ligante foi ligado ao oligo tendo a estrutura das Fórmulas Estruturais (25) e (26), e então purificado por HPLC ou resina. O peptídeo foi ligado ao oligo purificado, e purificado por HPLC, assim preparando a fita senso do siRNA. Para uma fita antissenso em que o anelamento é realizado com a fita senso, a fita antissenso tendo uma sequência complementar à fita senso foi produzida pela reação descrita acima. O RNA do produto de reação foi separado e purificado por HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japão) equipado com coluna Daisogel C18 (Daiso, Japão), e foi confirmado se sim ou não o RNA purificado atende a sequência base alvo por espectrômetro de massa MALDI-TOF (Shimadzu, Japão). Então, de modo a preparar cada estrutura RNA oligo de fita dupla, a fita senso e a fita antissenso em uma quantidade equivalente foram misturadas uma à outra e colocadas em um tampão de anelamento 1X (30 mM HEPES, 100 mM acetato de potássio, 2 mM acetato de magnésio (pH 7,0 a 7,5)), seguido pela reação em um banho de água em temperatura constante a 90°C por 3 minutos, e reagidas novamente a 37°C, assim preparando cada estrutura de RNA oligo de fita dupla incluindo siRNA tendo a sequência de Survivina como a fita senso (daqui em diante, referida como SAMiRNA-Survivina, respectivamente). Foi confirmado por eletroforese que a estrutura de RNA oligo de fita dupla foi anelada.

[0242] Exemplo 6. Inibição da expressão do gene alvo na linhagem de célula HeLa pelas nanopartículas formadas da estrutura de polímero oligo de fita dupla (Hexa etileno glicol-SAMiRNA)

[0243] Uma linhagem de célula de câncer cervical (HeLa) foi transformada utilizando nanopartículas formadas de Hexa etileno glicol-SAMiRNA incluindo sequências de siRNA que podem reduzir a quantidade de expressão de Survivina, e o aspecto de expressão do gene alvo foi analisado na linhagem de célula de câncer cervical transformada (HeLa) em nível de RNA.

[0244] Exemplo 6-1. Cultura da linhagem de célula de câncer cervical humano

[0245] Linhagem de célula de câncer cervical humano (HeLa) obtido da American Type Culture Collection (ATCC) foi cultivada sob a mesma condição como o Exemplo 5-1.

[0246] Exemplo 6-2. A Transfecção do Hexa etileno glicol-SAMiRNA em que o grupo amina é introduzido, em linhagem de célula de câncer cervical humano.

[0247] 0,8x 105 linhagem de célula de câncer cervical (HeLa) cultivada no Exemplo 6-1 foi cultivada em meio EMEM por 18 horas em uma placa de 12 poços sob condição de 37°C e 5 %(v/v) de CO2, e o meio foi removido, e a mesma quantidade do meio Opti-MEM (GIBCO, EUA) para cada poço foi dispensada. A mistura obtida foi seca por congelamento na condição de -75°C e 5mTorr por 48 horas pelo mesmo método como no Exemplo 5-1 para produzir nanopartículas uniformes. O hexa etileno glicol-SAMiRNA preparado no Exemplo 3-2 foi adicionado e dissolvido em DPBS em uma concentração de 50 μg/m^, e tratado em meio Opti-MEM (1ml) de acordo com as concentrações de 50, 100 e 200 nM. Opti-MEM incluindo hexa etileno glicol-SAMiRNA foi dispensado e tratado em cada poço da linhagem de célula tumoral de acordo com a concentração, e o produto obtido foi cultivado sob condição de 37°C e 5 %(v/v) de CO2, pelo o total de 24 horas e 48 horas.

[0248] Exemplo 6-3. Análise quantitativa relativa do mRNA de gene alvo

[0249] O cDNA foi produzido extraindo o RNA total da linhagem de célula transfectada no Exemplo 6-2 através do mesmo método como no Exemplo 4-3, e uma quantidade de expressão de mRNA do gene alvo foi submetida a quantificação relativa por PCR de tempo real. A quantidade de inibição da expressão do gene alvo de acordo com o tratamento do hexa etileno glicol-SAMiRNA em que o grupo amina foi introduzido, foi observado para confirmar claramente a eficácia do hexa etileno glicol-SAMiRNA em que o grupo amina foi introduzido, como comparado ao grupo controle, hexa etileno glicol-SAMiRNA (FIG. 18).

Efeitos Vantajosos

[0250] A estrutura do oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção tem todas das mesmas porções de material hidrofílico, de modo que problemas tais como controle de qualidade, etc., causados pela característica de polidispersividade ocorrendo quando um material hidrofílico ligado ao oligonucleotídeo é um polímero sintético podem ser notavelmente melhorados. Ainda, como comparado aos processos de purificação existentes utilizando materiais hidrofílicos de polidispersividade, o método para preparar a estrutura de oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção pode ser simples, pode reduzir custos de síntese e pode facilmente realizar análise do material da estrutura de oligonucleotídeo. Ainda, o tamanho das nanopartículas pode ser regulado controlando o número de repetição dos blocos de material hidrofílico e monômeros de material hidrofílico em cada bloco de material hidrofílico.

[0251] Em particular, quando o ligante é adicionalmente ligado ao receptor que promove a internalização na célula alvo através de endocitose mediada por receptor (RME) na estrutura de oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção, a liberação dentro da célula alvo é mais eficazmente realizada. Ainda, quando o ligante é açúcar, junto com o efeito de direcionamento das nanopartículas, a hidrofilicidade que é diminuída dependendo do número de repetição dos blocos de material hidrofílico, pode ser complementada para melhorar a liberação intracelular do oligonucleotídeo e para melhorar a eficácia para controlar a expressão de gene do oligonucleotídeo.

[0252] Ainda, após a estrutura do oligonucleotídeo ser absorvida dentro da célula, o oligonucleotídeo pode facilmente escapar do endossomo, e pode ter um efeito de inibir a decomposição do lisossomo, de modo que um efeito do tratamento maior pode ser obtido introduzindo o grupo amina ou os grupos polihistidina no bloco de material hidrofílico.

[0253] A partir do acima exposto, será entendido pelos conhecedores da técnica à qual a presente invenção pertence que a presente invenção pode ser conduzida em outras modalidades concretas sem mudar o espírito técnico ou característica essencial da mesma. Neste respeito, deve ser entendido que os exemplos mencionados acima são ilustrativos em todos os aspectos, mas não limitados. O escopo da presente invenção deve ser interpretado para incluir o significado e escopo das reivindicações em anexo, e todas as alterações e formas modificadas que são derivadas do conceito equivalente da mesma, ao invés da descrição detalhada.

Claims (30)

1. Estrutura de oligonucleotídeo tipo nanopartícula melhorada tendo alta eficiência caracterizada por ter uma estrutura representada pela seguinte Fórmula estrutural (1) ou Fórmula estrutural (2)Q-(Am-J)n-X-R-Y-B Fórmula estrutural (1)Q-(J-Am)n-X-R-Y-B Fórmula estrutural (2)em que A é um monômero de material hidrofílico, B é um material hidrofóbico, J é um ligante para conectar entre m monômeros de material hidrofílico, ou um ligante para conectar entre m monômeros de material hidrofílico com oligonucleotídeos, X e Y são cada um independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante, R é um oligonucleotídeo de fita simples ou fita dupla, m é um inteiro de 1 a 15, e n é um inteiro de 1 a 10,Q é (Li-Zj) ou P-J1-J2,L é um ligante especificamente ligado a um receptor que promove a internalização da célula alvo através da endocitose mediada por receptor (RME),Z é um ligante que medeia uma ligação covalente simples ou uma ligação entre o monômero de material hidrofílico em um bloco de material hidrofílico e o ligante,i representa um inteiro de 0 a 5, preferencialmente, um inteiro de 0 a 3, e j significa 0 ou 1, contanto que quando i é 0, j é necessariamente 0, P significa um grupo amina ou um grupo polihistidina, eJ1 e J2 são independentemente ligantes que medeiam uma ligação covalente simples, ou uma ligação entre o grupo amina ou o grupo polihistidina com o material hidrofílico.

2. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que R é oligonucleotídeo de fita dupla, e a fita senso ou fita antissenso ter 19 a 31 nucleotídeos.

3. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que grupo fosfato é ligado à extremidade 5’ da fita antissenso de oligonucleotídeos de fita dupla.

4. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o grupo fosfato ligado à extremidade 5’ da fita antissenso é um a três.

5. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o material hidrofóbico tem um peso molecular de 250 a 1.000.

6. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o material hidrofóbico é um selecionado do grupo que consiste em um derivado de esteroide, um derivado de glicerídeo, éter de glicerol, polipropileno glicol, hidrocarboneto C12 a C50 saturado ou insaturado, diacilfosfatidilcolina, ácido graxo, fosfolipídeo e lipopoliamina.

7. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o derivado de esteroide é selecionado do grupo que consiste em colesterol, colestanol, ácido cólico, colesteril formato, colestanil formato, e colesteril amina.

8. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o derivado de glicerídeo é selecionado do grupo que consiste em mono-, di- e tri-glicerídeo.

9. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o monômero de material hidrofílico tem uma estrutura representada pelo seguinte Composto (1):

em que G é selecionado do grupo que consiste em CH2, O, S eNH.

10. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante (J) é selecionado do grupo que consiste em PO3-, SO3 e CO2.

11. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que X, Y e Z são respectivamente ligação não degradável ou uma ligação degradável.

12. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a ligação não degradável é a ligação amida ou uma ligação de fosforilação.

13. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a ligação degradável é uma ligação dissulfeto, uma ligação degradável por ácido, uma ligação éster, uma ligação anidrido, uma ligação biodegradável ou uma ligação degradável enzimaticamente.

14. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que Q é (Li-Zj), Z é um ligante que medeia uma ligação entre o monômero de material hidrofílico em um bloco de material hidrofílico e o ligante, e o ligante Z compreende hexaetileno glicol.

15. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o ligante Z éComposto (4):

em que T refere-se a 1 a 15 Composto (1) repetitivo representado abaixo, e G é selecionado do grupo que consiste em CH2, O, S e NH.

16. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que Q é (Li-Zj), e tem uma estrutura representada pela Fórmula estrutural (19) abaixo:

em que A, B, R, m, n, Z e L são os mesmos como definido na Fórmula estrutural (2) da reivindicação 1.

17. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que Q é (Li-Zj), e o ligante (L) é selecionado do grupo que consiste em carboidrato, peptídeo, e anticorpo.

18. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que carboidrato é selecionado do grupo que consiste em hexoamina, monossacarídeo, dissacarídeo e polissacarídeo.

19. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que Q é P-J1-J2, e P é um selecionado do grupo que consiste em grupos de amina primária à terciária ou grupo polihistidina compreendendo 5 a 8 histidinas.

20. Estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que J1 e J2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em ligação covalente simples, C2-12 alquil, alquenil, alquinil, PO3-, SO3, e CO2.

21. Método para preparar estrutura de oligonucleotídeo de fita simples ou fita dupla, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que utiliza um suporte solido representado pela Fórmula estrutural (20) abaixo:

em que L é um ligante especificamente ligado ao receptor que promove a internalização da célula alvo através da endocitose mediada por receptor (RME), T é um composto em que composto (1) é repetido 1 a 15 vezes (G é selecionado do grupo que consiste em CH2, O, S e NH no Composto (1)),

um de C e D refere-se a um suporte sólido, outro de C e D refere-se a Dimetoxitritil, i é um número inteiro de 0 a 3, e E e F são independentemente de 1 a 10.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:(1) ligar covalentemente um bloco de material hidrofílico ao suporte sólido representado pela Fórmula estrutural (20) repetidamente n vezes;(2) sintetizar um oligonucleotídeo de fita simples baseado no suporte sólido ao qual o bloco do material hidrofílico é ligado;(3) ligar covalentemente um material hidrofóbico à extremidade 5’ de oligonucleotídeo ao qual o bloco de material hidrofílico é ligado; e(4) separar a estrutura de oligonucleotídeo a partir do suporte sólido.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:(1) ligar covalentemente um bloco de material hidrofílico ao suporte sólido representado pela Fórmula estrutural (20) repetidamente n vezes;(2) sintetizar um RNA de fita simples baseado no suporte sólido ao qual o bloco do material hidrofílico é ligado;(3) ligar covalentemente um material hidrofóbico à extremidade 5’ de RNA ao qual o bloco de material hidrofílico é ligado;(4) separar a estrutura de RNA-polímero e um RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta a partir do suporte sólido; e(5) formar o oligonucleotídeo de fita dupla através do anelamento da estrutura de RNA-polímero e o RNA de fita simples tendo uma sequência complementar a esta.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de fita simples complementar ao oligonucleotídeo de fita simples da etapa (2) tem um grupo fosfato, ligado à extremidade 5’ do oligonucleotídeo de fita simples.

25. Nanopartículas caracterizadas por compreender a estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1.

26. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 25, caracterizadas pelo fato de serem liofilizadas.

27. Composição farmacêutica caracterizada por compreender estrutura de oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1.

28. Composição farmacêutica caracterizada por compreender nanopartícula(s) de acordo com a reivindicação 25 ou a reivindicação 26.

29. Método para controlar uma expressão de gene in vitro ou in vivo caracterizado por compreender utilizar estrutura de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1.

30. Método para controlar uma expressão de gene in vitro ou in vivo caracterizado por compreender usar nanopartículas, de acordo com a reivindicação 25 ou a reivindicação 26.

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