RU2466188C2 - Ингибитор репродукции вируса гриппа а на основе комплекса наночастиц диоксида титана и олигонуклеотида - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, медицины и ветеринарии. Предложен ингибитор репродукции вируса гриппа А. Ингибитор представляет собой комплекс наночастиц диоксида титана и вирус-специфического дезоксирибозима. В качестве дезоксирибозима используют олигонуклеотид со следующей последовательностью нуклеотидов - 5′-GAAATAAGAGGCTAGCTACAACGACCTTCATTA. Изобретение может быть использовано для ингибирования репродукции вирусов гриппа А в инфицированных эукариотических клетках. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл, 6 пр.

Description

Изобретение относится к противовирусным средствам на основе ген-направленных каталитически активных нуклеиновых кислот, а именно для ингибирования репродукции вируса гриппа А в инфицированных эукариотических клетках с помощью вирус-специфического каталитически активного олигодезоксирибонуклеотида - дезоксирибозима, иммобилизованного на неорганический носитель - наноразмерные частицы диоксида титана, и может быть использовано в молекулярной биологии, медицине и ветеринарии.

В настоящее время наиболее эффективными противогриппозными препаратами считаются низкомолекулярные ингибиторы вирусных нейраминидаз Тамифлю® (озельтамивир) производства F.Hoffmann-La Roche, Ltd. (Швейцария) и Реленза® (занамивир) производства GlaxoSmithKline Inc. (Великобритания). Однако еще в период 2004-2006 гг. у ряда больных гриппом птиц подтипа H5N1 в Юго-Восточной Азии были зафиксированы случаи устойчивости к Тамифлю и Релензе [Hurt A.C. et al. Susceptibility of highly pathogenic A(H5N1) avian influenza viruses to the neuraminidase inhibitors and adamantanes // Antivir. Res. - 2007. - V.73. - P.228-231]. В сезон 2007-2008 гг. уже 24% выделенных на территории 22 из 30 Европейских стран изолятов вируса гриппа А человека подтипа H1N1 оказались устойчивыми к Тамифлю [Ciancio B.C. et al. Oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses detected in Europe during season 2007-8 had epidemiologic and clinical characteristics similar to co-circulating susceptible A(H1N1) viruses // Euro Surveill. - 2009. - V.14. - P.19412]. А в следующий сезон 2008-2009 гг. уже 100% из 745 изолятов гриппа А H1N1, выделенных от больных гриппом на территории Японии, были Тамифлю-устойчивыми (>300-кратное падение восприимчивости к препарату) [Baranovich T. et al. Emergence of H274Y oseltamivir-resistant A(H1N1) influenza viruses in Japan during the 2008-2009 season // J Clin Virol. - 2010. - V.47. - P.23-28]. Установлено, что резистентность к Тамифлю обусловлена новой генетической мутацией, приводящей к замене гистидина на тирозин в 274-м положении аминокислотной последовательности вирусной нейраминидазы.

В последние годы значительное развитие получили работы по созданию новых терапевтических средств, в том числе противовирусных, основанных на применении адресованных молекул нуклеиновых кислот (как нативных, так и химически модифицированных) - антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов (РНКзимов), дезоксирибозимов (ДНКзимов), аптамеров и малых интерферирующих РНК, способных селективно подавлять экспрессию определенных генов, ингибировать активность определенных ферментов либо выполнять другие специфические функции. Многочисленные исследования на различных модельных системах подтвердили перспективность этого подхода, а два олигонуклеотидных препарата уже вышли на фармацевтический рынок - фосфотиилированный антисмысловой олигонуклеотид Vitravene® (ISIS Pharmaceuticals Inc.) для лечения ретинитов, вызванных цитомегаловирусной инфекцией, и фосфотиилированный аптамер Macugen® (OSI Pharmaceuticals Inc.) для лечения влажной формы сенильной макулодистрофии.

Нуклеозимы (РНК- и ДНКзимы) имеют то преимущество, что они обладают определенной собственной каталитической активностью, в том числе способностью расщеплять комплементарные последовательности РНК. Растущее число публикаций описывает эффективное подавление нуклеозимами экспрессии генов, вызывающих инфекционные и онкологические заболевания, заболевания нервной и сердечно-сосудистой систем [Silverman S.K. In vitro selection, characterization, and application of deoxyribozymes that cleave RNA // Nucleic Acids Res. - 2005. - V.33. - P.6151-6163; Bhindi R. et al. DNA enzymes, short interfering RNA, and emerging wave of small-molecule nucleic acid-based gene-silencing strategies // Am. J. Path. - 2007. - V.171. - P.1079-1088; Zhang G. et al. Effect of deoxyribozymes targeting c-Jun on solid tumor growth and angiogenesis in rodents // J. Natl. Cancer Inst. - 2004. - V.96. - P.683-696]. Следует также отметить отсутствие токсичности нуклеозимов в клеточных культурах и побочных эффектов у животных [Dass C.R. Preclinical anticancer activity of DNA-based cleavage molecules // Drug Dev. Ind. Pharm. - 2006. - V.32. - P.1-5]. В сравнении с РНКзимами несомненным преимуществом ДНКзимов является их существенно более высокая устойчивость к действию сывороточных и клеточных нуклеаз in vivo. Наиболее эффективным из известных является ДНКзим типа «10-23», полученный методом SELEX [Santoro S.W., Joyce G.F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 4262-4266]. ДНКзим представляет собой дезоксирибонуклеотидную последовательность вида N_n-RGGCTAGCTACAACGA-N_n, состоящую из центрального 15-звенного каталитически активного мотива «10-23», фланкированного двумя РНК-узнающими последовательностями. Катализируемая ДНКзимом типа «10-23» реакция не требует ионов металлов или иных дополнительных кофакторов и заключается в расщеплении фосфодиэфирной связи в РНК с образованием 2′,3′-циклофосфата и 5′-гидроксильной группы.

Однако серьезной проблемой на пути терапевтического применения адресованных молекул нуклеиновых кислот является их внутриклеточная доставка, что обусловлено неустойчивостью нуклеиновых кислот к действию многочисленных нуклеаз, находящихся в клетках и средах организма, и их низкой способностью проникать через мембраны эукариотических клеток. Одним из перспективных подходов к решению данной задачи считается использование в качестве средств доставки наночастиц химически нейтральных металлов, их оксидов и сплавов, характеризующихся низким уровнем токсичности и высокой сорбционной емкостью.

Известны статьи Woloschak G. с соавторами (США), впервые получивших TiO₂-олигонуклеотидные нанокомпозиты и показавших способность таких нанокомпозитов проникать в клетки млекопитающих и адресно связываться с комплементарными нуклеиновыми последовательностями в ядрах и митохондриях клеток [Paunesku T. et al. Biology of TiO₂-oligonucleotide nanocomposites // Nature materials. - 2003. - V.2. - P.343-346; Paunesku T. et al. Intracellular distribution of TiO₂-DNA oligonucleotide nanoconjugates directed to nucleolus and mitochondria indicates sequence specificity // Nano Lett. - 2007. - V.7. - P.596-601; Thurn K.T. et al. Labeling TiO₂ nanoparticles with dyes for optical fluorescence microscopy and determination of TiO₂-DNA nanoconjugate stability // Small. - 2009. - V.5. - P.1318-1325].

Однако для трансфекции культуры клеток полученными нанокомпозитами авторы применяли вспомогательные методы электропорации или трансфекции при помощи реагента SuperFect (Qiagen, США), что неприемлемо при лечении организма человека или животного.

Наиболее близким аналогом (прототипом) являются нанокомпозиты диоксида титана для адресной инактивации внутриклеточного генетического материала [Заявка на изобретение РФ №2008121609, МПК А61К 48/00, опубл. 10.12.2009], где группой отечественных авторов был предложен более простой и технологичный метод приготовления TiO₂-олигонуклеотидных нанокомпозитов с использованием полиаминовых производных олигонуклеотидов, в том числе содержащих дополнительные метки или функциональные группы, способные воздействовать на генетический, в том числе вирусный, материал. В отличие от предыдущего аналога авторы показали прямое проникновение полученных ими TiO₂-олигонуклеотидных нанокомпозитов в цитоплазму клеток путем естественного эндоцитоза без применения каких-либо дополнительных методов трансфекции. Также авторы получили нанокомпозит, адресованный при помощи антисмыслового олигонуклеотида к РНК вируса диареи крупного рогатого скота (BVDV), показавший определенную противовирусную активность. Кроме того, данные препараты показали некоторую противовирусную активность на инфицированной гриппом культуре клеток MDCK.

Однако известные аналоги обладают недостаточной противовирусной активностью, в частности, против вируса гриппа А.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение противовирусной активности нанокомпозитов, предназначенных для ингибирования репродукции вирусов гриппа А, за счет применения дезоксирибозима.

Указанный технический результат достигается тем, что в ингибиторе репродукции вируса гриппа А на основе комплекса наночастиц диоксида титана и олигонуклеотида согласно изобретению в качестве олигонуклеотида применяется вирус-специфический дезоксирибозим, иммобилизованный на наночастицы диоксида титана с использованием поли-L-лизинового линкера.

Вирус-специфический дезоксирибозим представляет собой олигодезоксирибонуклеотидную последовательность:

5′-GAAATAAGAGGCTAGCTACAACGACCTTCATTA.

Наночастицы диоксида титана представляют собой частицы размером 4-6 нм в кристаллической модификации анатаз, получаемые методом гидролиза тетраизопропоксида титана.

В качестве линкера между наночастицами и дезоксирибозимом ингибитор содержит поли-L-лизин с молекулярным весом 15000-30000 Да.

Наноразмерные частицы диоксида титана служат агентом трансфекции для эффективного транспорта дезоксирибозима в цитоплазму эукариотических клеток. Механизм действия нанокомпозита состоит в инактивации вирусов гриппа А путем направленного расщепления последовательностей мРНК, кодирующих вирусный нуклеопротеин NP. Данный белок играет центральную роль в процессе внедрения генетической информации вируса в ядро инфицированной клетки и необходим для его последующей репликации и сборки.

Синтез нанокомпозита проводят по известному методу [Заявка РФ №2008121609, МПК А61К 48/00, опубл. 10.12.2009], получая полиаминовые производные олигонуклеотидов с их последующей иммобилизацией на наночастицы диоксида титана. Оптимальные структура и размер наночастиц диоксида титана, так же как оптимальные способы синтеза наночастиц и нанокомплекса на их основе, определены опытным путем.

Следует отметить, что предлагаемый для ингибирования репродукции вирусов гриппа А ген-направленный препарат может быть быстро реориентирован на любой вновь возникший штамм вируса гриппа, включая мутантные лекарственно устойчивые формы.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими чертежами. На фиг.1а представлена структура ДНКзима типа «10-23» в комплексе с РНК-субстратом. На фиг.1б приведена схема катализируемой дезоксирибозимом реакции расщепления РНК с образованием 2′,3′-циклофосфата и 5′-гидроксильной группы. На фиг.2 дан пример зависимости цитотоксической активности нанокомпозита TiO₂-PL-ДНКзим как функции его массовой концентрации. На фиг.3а и 3б даны примеры зависимостей титров вирусов A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) соответственно от массовой концентрации нанокомпозита TiO₂-PL-ДНКзим. На фиг.4 приведена конструкция ингибитора в виде нанокомплекса.

Описание конструкции ингибитора репродукции вируса гриппа А

Каждая наночастица 1 состоит из двуокиси титана в кристаллической модификации анатаз, полученная методом гидролиза тетраизопропоксида титана, имеет размер 4-6 нм и связана посредством линкера 2 с вирус-специфическим дезоксирибозимом 3 (фиг.4), представляющим собой олигодезоксирибонуклеотидную последовательность:

5′-GAAATAAGAGGCTAGCTACAACGACCTTCATTA.

Линкер 2 представляет собой поли-L-лизин с молекулярным весом 15000-30000 Да.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Технология синтеза (первый вариант) и характеризации наночастиц диоксида титана

В общем случае наночастицы диоксида титана в форме анатаз получают гидролизом тетраизопропоксида титана (Ti(i-OC₃H₇)₄) в среде изопропилового или этилового спирта в присутствии кислотного катализатора (HNO₃, HCl, H₂SO₄ или H₃PO₄) при температуре 20-95ºС на воздухе. После гидролиза золи диоксида титана с рН 1.0-2.0 подвергают нейтрализации растворами щелочей (NaOH, LiOH, KOH или NH₄OH) или многостадийной обработке, включающей диализ (1) против деионизированной воды до рН 3.0-3.5, защелачивание и диализ (2) против деионизированной воды или раствора фосфатов щелочных металлов (раствор KH₂PO₄ с рН 7.3 или раствор смеси KH₂PO₄ и Na₂HPO₄ с рН 6.8). Обработку проводят до получения конечного препарата с рН, близким к нейтральному (рН 6.5-7.5).

Размер частиц и структурные свойства образцов исследуют методом рентгенофазового анализа на дифрактометре HZG-4 (производства Германии) с монохроматизированным кобальтовым излучением. Фазовый анализ проводят с использованием рентгенографической базы данных Международного союза кристаллографов (JCPDS). Размер частиц оценивают по области когерентного рассеяния в соответствии с формулой Шеррера: D=kλ/β·cosθ, где k - коэффициент формы, λ - длина волны (1.79021), β - полуширина линии, θ - положение линии. Получаемые в виде коллоидных растворов наночастицы диоксида титана имеют структуру анатаз с размером частиц 4-6 нм.

Пример 2. Синтез наночастиц диоксида титана (второй вариант)

Пример аналогичен примеру 1, отличается тем, что 11.9 г Ti(i-OC₃H₇)₄ смешивают при комнатной температуре с 2 мл изопропилового спирта. При интенсивном перемешивании в смесь по каплям добавляют 150 мл деионизированной воды, содержащей 1.4 мл 70%-ной HNO₃. Смесь нагревают до 75°С и перемешивают при этой температуре в течение 6 часов, затем нагрев отключают и охлаждают при перемешивании до комнатной температуры. В результате получают прозрачный коллоидный раствор (золь) с концентрацией 0.5 М в пересчете на TiO₂. Затем на первой стадии обработки проводят диализ (1) против деионизированной воды при 4°С в течение ночи; на второй стадии золь разбавляют деионизированной водой до концентрации 0.0125 М и к золю быстро добавляют 0.2 М раствор LiOH до значения рН 9.0-10.0; на последнем этапе обработки доводят рН среды до нейтрального значения диализом (2) против деионизированной воды.

Полученный образец по данным рентгенофазового анализа представляет собой диоксид титана со структурой анатаз и средним размером частиц 4.7 нм и используется для последующего синтеза противовирусных нанокомпозитов.

Пример 3. Получение вирус-специфического дезоксирибозима

В качестве вирус-специфического дезоксирибозима используют ДНКзим (обозначаемый далее как dzNP-1500+), состоящий из 33-звенной нуклеотидной последовательности 5′-GAA ATA AGA GGC TAG CTA CAA CGA CCT TCA TTA-p, где p обозначает 3′-концевой фосфат, необходимый для последующего конъюгирования с TiO₂-наночастицами. ДНКзим dzNP-1500+ предназначен для расщепления гриппспецифических 19-звенных РНК-последовательностей:

5′-UAAUGAAGGA↓UCUUAUUUC и 5′-UAAUGAAGGG↓UCUUAUUUC.

Структура данного ДНКзима определена на основе сравнительного анализа геномных последовательностей ряда штаммов вирусов гриппа А подтипов H5N1, H3N2 и H1N1 и последующего скрининга противовирусной активности более сорока ДНКзимов, адресованных к различным консервативным участкам генома вирусов гриппа А. ДНКзим dzNP-1500+ адресован к наиболее протяженному консервативному участку пятого сегмента генома вирусов гриппа А, кодирующего вирусный нуклеопротеин NP, и катализирует расщепление образующихся в ходе репликации вируса комплементарной (+)РНК и мРНК. Расщепление фосфодиэфирной связи происходит по 3′-концу рибонуклеотида (A или G) в позиции 1500 комплементарной (+)РНК или по 3′-концу соответствующего рибонуклеотида в мРНК. Нуклеопротеин NP формирует вирусные рибонуклеопротеиды, является структурным компонентом вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, играет центральную роль в процессе внедрения генетической информации вируса в ядро инфицированной клетки и необходим для последующей сборки зрелых вирионов. Выбранный в качестве мишени для расщепления консервативный участок 5-го сегмента почти инвариантен для большинства штаммов вирусов гриппа А, включая штаммы актуальных сегодня подтипов H3N2 человека, H1N1 человека, H5N1 птиц и H1N1 свиней. Это определяет потенциально широкий спектр противогриппозного действия ДНКзима dzNP-1500+.

Дезоксирибозим dzNP-1500+ синтезируют по стандартной схеме олигодезоксирибонуклеотидного синтеза с использованием фосфорамидитов и последующей ВЭЖХ-очисткой. Концентрацию ДНКзима определяют спектрофотометрически. Полученный препарат ДНКзима используют для его последующей иммобилизации на наночастицы диоксида титана через поли-L-лизиновый линкер. На фиг.1а представлена структура ДНКзима типа «10-23» в комплексе с РНК-субстратом. На фиг.1б приведена схема катализируемой дезоксирибозимом реакции расщепления РНК с образованием 2′,3′-циклофосфата и 5′-гидроксильной группы.

Пример 4. Синтез конъюгата поли-L-лизина с ДНКзимом

Получение конъюгата поли-L-лизина (PL) с ДНКзимом проводят следующим образом. К раствору содержащего на 3'-конце фосфатную группу ДНКзима (10-100 нмоль в 40 мкл диметилсульфоксида, DMSO) добавляют по 10 мг трифенилфосфина (Ph₃P) и дипиридилдисульфида (Py₂S₂) и 20 мкл раствора DMSO, содержащего 1 мг N-окиси диметиламинопиридина (DMAPO). Реакционную смесь перемешивают при 37°С в течение 15 мин, после чего активированный олигонуклеотид осаждают эфиром и переосаждают 2 раза эфиром из DMSO. Остаток растворяют в DMSO (100-1000 мкл) и добавляют 10-100 мкл 0.1 М раствора поли-L-лизина в DMSO (концентрация дана в расчете на остаток лизина). Используют фракцию поли-L-лизина с молекулярным весом 15000-30000 (в среднем 100 аминогрупп в молекуле полилизина). Реакционную смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Образование конъюгата PL-ДНКзим проверяют с помощью тонкослойной хроматографии в системе изопропанол-аммиак-вода (6:1:3). Продукт имеет нулевую подвижность в отличие от исходного олигонуклеотида. Концентрация конъюгата PL-ДНКзим в конечном растворе составляет 0.1-1.0·10^-4 М. Молярное отношение аминогрупп к олигонуклеотиду в конъюгате составляет 100:1. Раствор конъюгата PL-ДНКзим может храниться при температуре ниже 0°C в течение, по крайней мере, полугода перед его дальнейшим использованием для иммобилизации на наночастицы диоксида титана.

Пример 5. Иммобилизация конъюгата PL-ДНКзим на TiO₂-наночастицы

Получение нанокомпозита вида TiO₂-PL-ДНКзим проводят, добавляя 100 мкл 10^-4 М раствора полилизинсодержащего ДНКзима dzNP-1500+ (10 нмоль) к 1 мл суспензии TiO₂-наночастиц анатаза (1 мг/мл). Смесь выдерживают при встряхивании в течение 0.5-1 ч при комнатной температуре, после чего центрифугируют и отделяют супернатант. К осадку нанокомпозита добавляют 0.5 мл 0.1 М NaCl, выдерживают 5-10 мин при встряхивании и снова центрифугируют. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок суспендируют в 1 мл 0.1 М NaCl. Количество конъюгата PL-ДНКзим, присоединившегося к наночастицам диоксида титана, определяют по разности оптического поглощения раствора конъюгата PL-ДНКзим перед добавлением к частицам и в промывных растворах после его иммобилизации. Выход иммобилизации, т.е. образования нанокомпозитов TiO₂-PL-ДНКзим, достигает 90-100%. Сохранение сайт-специфической рибонуклеазной активности ДНКзима в составе нанокомпозита проверяют in vitro на модельном комплементарном рибонуклеотиде. Конечная концентрация TiO₂-наночастиц в суспензии нанокомпозита составляет 1 мг/мл, емкость по олигонуклеотиду - 9-10 нмоль/мг. На одну наночастицу в среднем приходится 1 молекула поли-L-лизина и 1-2 молекулы ДНКзима, весовое соотношение TiO₂/PL/ДНКзим в комплексе составляет ~100/13/8.

Пример 6. Исследования цитотоксичности и противовирусной активности

В работе использовали грипп-чувствительную культуру клеток MDCK (культура клеток почки собаки) из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и штаммы вирусов гриппа А человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. При работе с вирусом гриппа А соблюдались требования по технике безопасности для работ с микроорганизмами 3-4 групп патогенности согласно СП 1.3.2322-08. В качестве препарата сравнения (аналога) использовали известное противогриппозное средство Тамифлю® (озельтамивир) производства F.Hoffman-La Roche Ltd. (Швейцария).

Для оценки противовирусной активности препаратов клетки MDCK выращивали в 96-луночных планшетах 1-1.5 сут до образования монослоя на среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) в присутствии 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Наработку вирусов производили на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах. Исходные концентрации вирусов в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) при титровании на культуре клеток MDCK составляли 8.5 и 7.0 lgТЦД₅₀/мл (десятичных логарифмов 50% тканевых цитопатических доз в мл) для вирусов A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и А/Aichi/2/68 (H3N2) соответственно. Готовили разведения ВАЖ от 1 до 6 с 10-кратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Разведения вируса вносили на культуру клеток в объеме 100 мкл/лунку. Через 12-14 ч на клетки вносили 100 мкл питательной среды RPMI-1640 на лунку, содержащей серийные разведения исследуемых препаратов (нанокомпозита или озельтамивира). Затем клетки инкубировали при температуре 37°C в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 или 4 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток, после чего выявляли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации с 0.5% эритроцитами петуха.

При оценке цитотоксичности препаратов за исключением внесения вируса процедуры культивирования клеток, внесения препаратов и т.д. были аналогичны описанным выше. Монослой культуры клеток MDCK выращивали в 96-луночных планшетах 1-1.5 сут до образования монослоя на среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) в присутствии 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). На культуральной среде готовили серийные разведения исследуемых препаратов (нанокомпозита или озельтамивира) для внесения в культуру клеток. После инкубирования в течение 2 или 4 сут при температуре 37°C в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия) клетки окрашивали 0.2%-ным раствором красителя трипанового синего и считали процент мертвых клеток под микроскопом в камере Горяева согласно общепринятым методикам. В качестве контролей использовали клетки, не обработанные препаратом.

Оценка эффективности препаратов проводилась согласно общепринятым требованиям [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. проф. Р.У.Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - С.532-558]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили стандартными методами [Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990]. Полученные зависимости цитотоксической активности препаратов от их концентрации (C) анализировали с помощью программы для нелинейного регрессионного анализа Origin 8.0, вычисляя концентрации, вызывающие 50%-ный цитотоксический эффект (TC₅₀) по выражению:

% живых клеток = 100%/(1+(C/TC₅₀)ⁿ).

Аналогичным образом обрабатывали данные по противовирусной активности препаратов, вычисляя концентрации, вызывающие 50%-ное подавление репродукции вируса (EC₅₀):

Титр вируса = Титр вируса _max/(1+(C/EC₅₀)ⁿ).

Индекс селективности препаратов рассчитывали согласно выражению:

Индекс селективности = TC₅₀/EC₅₀.

Результаты изучения токсичности препаратов для используемых клеток MDCK представлены в табл.1. На фиг.2 дан пример зависимости цитотоксической активности нанокомпозита TiO₂-PL-ДНКзим как функции его массовой концентрации. Показатели токсичности нанокомпозита и препарата сравнения (озельтамивира) для клеток MDCK оказались практически идентичны (TC₅₀ ~320 мкг/мл).

Результаты изучения противовирусной активности препаратов на культуре клеток MDCK, инфицированных вирусами гриппа А, представлены в табл.1. На фиг.3а и 3б даны примеры зависимостей титров вирусов A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) соответственно от массовой концентрации нанокомпозита TiO₂-PL-ДНКзим.

Из табл.1 видно, что оба препарата проявляют более высокую (~ в 3 раза выше) противовирусную активность в отношении штамма A/Aichi/2/68 (H3N2) по сравнению со штаммом A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1). С другой стороны, видно, что при одинаковом уровне токсичности для клеток MDCK по показателям противовирусной активности (EC₅₀ и индексу селективности) предлагаемый нанокомпозит TiO₂-PL-ДНКзим уступает озельтамивиру примерно в два раза. Это справедливо для обоих использованных штаммов гриппа.

Таблица 1.

Показатели цитотоксичности и противовирусной активности Тамифлю® и нанокомпозита TiO₂-PL-ДНКзим, полученные на культуре клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) или вирусом гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2).

Образец	Показатель	Штамм вируса гриппа А
		A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)	A/Aichi/2/68 (H3N2)
Нанокомпозит TiO2-PL-ДНКзим /заявляемый/	TC50, мкг/мл	323
	EC50, мкг/мл	13.7	4.14
	Индекс селективности	24	78
Тамифлю® (озельтамивир) /аналог/	TC50, мкг/мл	319
	EC50, мкг/мл	6.50	2.13
	Индекс селективности	49	150

Однако полезно отметить, что массовая доля ДНКзима в нанокомпозите составляет лишь 6.6%. С учетом этого показатель EC₅₀ для отдельно взятого действующего вещества нанокомпозита (ДНКзима) в наших экспериментах оказался даже потенциально лучше, чем у озельтамивира - действующего вещества Тамифлю.

Следует отметить, что полученные ранее варианты нанокомпозитов на базе антисмысловых олигонуклеотидов, адресованных к РНК вирусов гриппа А, кодирующих нуклеопротеин NP, также проявляли определенную противовирусную активность. Однако их концентрации, вызывающие 50%-ное подавление репродукции вируса (EC₅₀), составляли от ~50 мкг/мл и выше. Как видно из табл.1, использование ДНКзима в качестве олигонуклеотидного компонента нанокомпозита позволило существенно улучшить данный показатель. По-видимому, это связано с тем преимуществом дезоксирибозима, что он обладает собственной рибонуклеазной активностью - способностью расщеплять комплементарные последовательности РНК, тогда как для инактивации целевой РНК антисмысловыми олигонуклеотидами дополнительно требуется рибонуклеазная активность клеточной РНКазы H.

Механизм противовирусного действия предлагаемого нанокомпозита состоит в инактивации вирусов гриппа А путем направленного расщепления дезоксирибозимом последовательностей мРНК, кодирующих вирусный нуклеопротеин NP. Данный белок играет центральную роль в процессе внедрения генетической информации вируса в ядро инфицированной клетки и необходим для его последующей репликации и сборки. Для эффективного транспорта препарата в цитоплазму эукариотических клеток применяются наночастицы диоксида титана.

Предлагаемый ген-направленный нанокомпозит может быть быстро реориентирован на любой вновь возникший штамм вируса гриппа, включая мутантные лекарственно устойчивые формы, тогда как поиск новых эффективных низкомолекулярных химических соединений занимает, как правило, годы. В дальнейшем данный вариант синтеза противовирусных дезоксирибозимсодержащих нанокомпозитов может быть распространен и на другие вирусы, в первую очередь РНК-содержащие (гриппы В и С, краснуха, корь, паротит, гепатит С, ВИЧ и т.д.).

Claims (3)

1. Ингибитор репродукции вируса гриппа А на основе комплекса наночастиц диоксида титана и олигонуклеотида в инфицированных эукариотических клетках, отличающийся тем, что в качестве олигонуклеотида он содержит вирус-специфический дезоксирибозим, иммобилизированный на наночастице диоксида титана с использованием поли-L-лизинового линкера, причем вирус-специфический дезоксирибозим представляет собой олигодезоксирибонуклеотидную последовательность следующего вида: 5'-GAAATAAGAGGCTAGCTACAACGACCTTCATTA.

2. Ингибитор по п.1, отличающийся тем, что наночастицы диоксида титана представляют собой частицы размером 4-6 нм в кристаллической модификации анатаз, получаемые методом гидролиза тетраизопропоксида титана.

3. Ингибитор по п.1, отличающийся тем, что в качестве линкера между наночастицами и дезоксирибозимом он содержит поли-L-лизин с молекулярным весом 15000-30000 Да.

Images