JPH06506834A - 閉鎖アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドとそれらの適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 閉鎖アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドとそれらの適用 本発明はオリゴヌクレオチドタイプの化合物とそれらの適用に関する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは発現を特異的に阻止することが望まれる遺伝 子又はメツセンジャーＲＮＡに属するターゲット配列に相補的な配列の短鎖合成 りＮＡ又はＲＮＡ分子である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはメツセンジャ ーＲＮＡ配列に対するものでも又はそうではなく　ＤＮＡ配列に対するものであ ってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれらが相補的である配列とハ イブリッド形成し、そのためこの配列を有するメツセンジャーＲＮＡの発現を阻 止できる。

“オリゴヌクレオチド″という用語はリボ又はデオキシリポジリーズのポリヌク レオチドを表す一般的な意味で用いられる。デオキシリポジリーズ又はリボシリ ーズの使用に関連した具体的性質の問題が関与している場合には、完全な名称の オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドが用いられる。オ リゴヌクレオチドは一本鎖でもよく、即ち他の鎖と対合しない１本だけのヌクレ オチドを有しても又はそうではなく二本鎖であってもよく、即ち他のポリヌクレ オチド鎖と対合したヌクレオチドを有してもよい。２本の相補的オリゴヌクレオ チドが二本鎖構造を形成する。しかしながら、−末鎖オリゴヌクレオチドは開鎖 上におかれた相補配列の間における鎖内対合により二本鎖領域を有することがで きる。

ここで用いられるハイブリッド形成という用語は相補塩基の対の間における水素 結合の形成を意味し、グアニン及びシトシンは３つの水素結合を形成して、アデ ニン及びチミンは２つを形成する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学的方法により合成されて分子の現実的骨 格を変える修正をしばしばうけるか又はそれらはそれらの末端に位置した反応基 を更に有する。アンチセンスオリゴヌクレオチド中に導入されるこれら修正の目 的はヌクレオチド分解に対するこれら分子の耐性を高めるため、それらとそれら のターゲットとの相互作用を促進するため、ＲＮＡもしくはＤＮＡターゲットの 特別な分解／修正反応を行うため又はそれらの分子内侵入を増加させるためであ る。

アンチセンスオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ分解、主にエキソヌクレアーゼ の作用に感受性である。ヌクレアーゼはすべての画分−細胞内及び細胞外、特に 血清−に存在し、これら分子の急速な分解を起こす。アンチセンス分子の薬理学 的な使用では満足すべき薬物動態とひいてはこれら分子の効果の十分な永続化を 実現するためにこれら分解問題の解決を要する。多くの化学的修正はアンチセン スオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性にすることができる。一部の修正はホ スホジエステル結合（いくつかの例について言えば、メチルホスホネート類、ホ スホロチオエート類、α−オリゴヌクレオチド類、ホスホルアミデート類）の構 造又は性質に直接影響を与え、他は遮断基を分子の３′及び５′末端に加えるこ とである（Ｐｅ＋ｂｏ＋＋ら、　１９８９；Ｂｅ＋ｔ＋ａｎｄら、　１９８９； Ｂａｚｉｌｅら、１９８９；Ａｎｄ＋ｕ＋ら、　１９８９：Ｃａｒｅｎａｖｅら 、　１９８９＋Ｘｏｎ、　１９８８；Ｍａｈｅ＋及びＤｏｌｎｉｃｋ、　１９８ ８：Ｇａｇｎｏｔ　ら、　１９８７Ｊａ＋ｋｕｓ−５ｅｋｕ＋ａ、　１９８７） 。

オリゴヌクレオチドとそのターゲットとの相互作用の効力を増加させるためには 、挿入基（例えば、アクリジン類）がアンチセンスオリゴヌクレオチドの一端に 加えられてもよい。最後に、ターゲットで開裂又は永続的化学変化を起こすこと ができる反応基（例えば、アルキル化剤、ソラレン類、Ｆ　ｅ　−ＥＤＴＡ）も アンチセンスオリゴヌクレオチドに加えてよい（Ｓｕｎら、　１９８ＬＨｅｌｅ ｎｅ。

１９８９：Ｄｕｔａｎｄ　ら、　１９８９；Ｓｕｎ　ら、　１９８９；Ｈｅ１ｅ ｎｅ及びＴｈｕｏｎｇ。

１９８８：Ｖｅ＋＋ｐｉｅ＋ｅｎ　ら、　１９８７；Ｓｏｎ　ら、　１９８７； Ｃｘｘｅｎ＠ｙｅら。

１９８８．１９８７＋Ｌｅ　Ｄｏａｎ　ら、　１９８７：Ｔｏｕｌｍｅら、　１ ９８６：ｖｌａｓｓｏｙ　ら。

１９８６）。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの従来の修正の最終タイプはそれらの膜内通過 を容易化するために分子の電荷及び／又は親水性を修正する基を加えることであ る（Ｋａｂａｎｏｖら、　１９９０；Ｄｅｇｏｌｓら、　１９８９；５ｔｅｖｅ ｎｓｏｎ　ら、　１９１１９゜ＬｅｏｎｅＮｉら、　１９８８）。

すべてのこれら修正は明らかに互いに組合せることができる。

メツセンジャーＲＮＡのすべての領域がアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果 に同様に感受性であるわけではない。メツセンジャーＲＮＡは型通りの直鎖分子 ではなく、逆に多くの二次構造特徴（複合分子内ハイブリッド形成）と三次構造 特徴（再折り重ね及び特殊なコンホメーション、偽ノード）を有して、構造的及 び機能的核タンパク質（例えば、墳墓性タンパク質、スプライシング、ポリアデ ニル化及びキャップ化複合体、翻訳複合体）と相互作用する分子である。。メツ センジャーＲＮＡの異なる領域の効果的な利用性及び接近性はこれらの構造的特 徴におけるそれらの関連性に依存する。それに対応して、これと又はその配列と 相互作用する阻害剤の効力も特定機能に関するこの配列の関連性に依存する。ア ンチセンス分子に関するターゲット領域はそのオリゴヌクレオチドに接近できね ばならない。

二次構造の予測に関するソフトウェアの使用によれば理論的な接近度を予測し、 ひいてはアンチセンスオリゴヌクレオチド用ターゲットの選択を導くことができ る。

全体として、ターゲットとして最も広く用いられる領域は翻訳開始部位（ＡＵＧ 開始領域）と更にスプライシング部位（Ｓ　Ｄ／Ｓ　Ａ接合部）である。特別な 機能的性質を有さずかつ分子内対合に関与しない多くの他の配列もアンチセンス オリゴヌクレオチド用のターゲットとして有効であることがわかった（後記側参 照）。

アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡのある領域（ホモ プリン／ホモピリミジン配列又はプリン／ピリミジンに富む配列）にも向けられ 、こ７うして三重らせんを形成できる（Ｐｅｔｒｏ＋ｕＮら、　１９９０；Ｆｒ １ｎｃｏｉｓら（Ａ）、１９８９　；　Ｆｒｘｎｃｏｉｇら（Ｂ）、　１９８９ 　；　Ｆｒ１ｎｃｏｉｓら（Ｃ１，１９８９；　ＷｘＢら、　［９８９；Ｍｉｈ ｅ＋　ら、　１９ｇ９；Ｓ＋＋＋＋　ら、１９ｇ９；Ｂｏｉｄｏｌ−ＦｏＢｅｌ 　ら、　１９８８；Ｍｏ＋ｅｔ及びＤｅｒｒｔｎ、　１９ｇ７；Ｄｅ＋ｗ！ｎ。

ｌＨ６１゜このようにＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドは“アンチ遺伝子″又 は代わりに“アンチコード”と呼ばれた。特定配列における三重らせんの形成は 遺伝子の発現に関与するタンパク質の結合を阻止し及び／又は問題のオリゴヌク レオチドが特別な反応基を有するならばＤＮＡ中に不可逆的ダメージを導入する 。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは要求があれば特定配列アンチセ ンスオリゴヌクレオチドとターゲットメツセンジャーＲＮＡとのハイブリッド形 成はいくつかの様式で、即ち立体的又は疑似触媒的にいずれかで後者の発現を阻 止できる（Ｇａｇｎｏｒら、　１９０；／ｅｓｗｓ　ら、　１９８８；Ｍｔｔｋ ｗ＊−５ｅｋｕ＋ｘ、１９ｇ？　）　ニ ーメツセンジャーＲＮＡと相補的アンチセンスオリゴヌクレオチドとの相互作用 によればメツセンジャーＲＮＡの翻訳、成熟、安定化又は輸送に要求されるタン パク質又はタンパク質複合体の結合及び／又は進行を妨げる物理的バリアを形成 することができる。この物理的遮断から最後にターゲットメツセンジャーＲＮＡ の発現の阻害に至る。

−メッセンジャーＲＮＡとアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドとのハ イブリッド形成はすべての真核細胞に存在する酵素ＲＮアーゼＨ用の基質を作り 出す。

ＲＮアーゼＨはＲＮＡがＤＮＡとハイブリッド形成されたときにそれを特異的に 分解する酵素である。このためアンチセンスオリゴヌクレオチドとターゲットＲ ＮＡとのハイブリッド形成はこのハイブリッド形成箇所でこのターゲットＲＮＡ の開裂とひいてはその永続的不活性化を引き起こす。

一更に、前記のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドはターゲットＲＮＡ分 子において不可逆的ダメージを直接起こせる反応基を含むことができる。

ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、これらはターゲット 遺伝子（例えば、転写因子）の発現に必須な調節タンパク質の結合を阻害するか 又はＤＮＡ分子中に不可逆的ダメージ（開裂、架橋）を起こすかのいずれかで作 用でき、それを局所的に遺伝子発現させなくする。

リボザイムは特にターゲットＲＮＡでエンドヌクレアーゼ開裂を起こせる酵素活 性が付与されたＲＮＡ分子である。リボザイムは天然エンドヌクレアーゼ触媒活 性が付与された特別なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると考えてよい（Ｖ ａｓｓｅａ＋、　１９９０；Ｓｙａ＋ｏｎ＋、　１９１１９；Ｊｅｌｌ＋ｉｅ及 びＳ７ｍｏｎｓ、　１９Ｎ；Ｈ＠５ｅｌｏｆｌ及びＧｅｒｌｓｃｂ、　１９８８ ；ｔｌｈｌ！ｕｂｅｃｋ。

１９８７；５ｙｔｎｏｎｓ　ら、１！１８７）。典型的には、リボザイムは２つ の部分からなる；一方でそれは切断することが望まれるターゲット配列に相補的 な配列と他方で反応基として機能する触媒配列を含む（Ｆｅｄｏｒ及びＵｂｌｅ ｎｂｅｃｋ、　１９９０；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　ら、　１９８９；５ｈｅｌｄｏ ｎ及びＳｙｍｏｎ５１９８９；Ｓａｍｐｔｏｎら、　＋！１８７１゜ウイルスリ ボザイムの配列から導かれた共通活性部位を用いて、いかなるメツセンジャーＲ ＮＡも既定位置で理論的に切断することが現在可能である（）Ｉｘ＋ｅｌｏｌｌ 及びＧｅ＋ｌ！ｃｈ、　１９８１１；Ｕｂｌｅｎｂｅｃｋ、　１９８７１゜リボ ザイムは従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の使用問題に出会い、特 に分解の現象に関してＲＮＡはＤＮＡよりも更にヌクレオチド分解に感受性であ る。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞メツセンジャーＲＮＡ、例えば発癌性タ イプメツセンジャー（Ｔｏ＋ｌｏ＋ａら、　：９９０：ＣｈｘＨら、　１９１１ ９；Ａ＋ｌｏ＋＋ｉ　ら、　１９８９；Ｘｈｃ＋＋ｇ　ら。

１９８９；５ｈｕｔｔｌｅｖｏ＋ｌｈ　ら、　１９８８；Ｃｏｐｅ及びＷｉｌｌ ｅ、　１９８９；Ｃａｔｅｎａｖｅら、＋９１１９）とＶ　Ｓ　Ｖ　ＣＤｅｇｏ ｌｓら、　１９８９；Ｌｅｏｎｅｌｌｉら。

１９８９１　、Ｓ　Ｖ　４０　（Ｗｃｓｔｃｒ＋ｕａａら、１９１１９）、イン フルエンザウィルス（Ｋａｂａｎｏｙら、　１９９０；２ｅｔｉｚｌら、　１９ １１７）、脳心筋炎ウィルス（Ｓｘｎｋｘｔら、１９Ｎ）、アデノウィルス（Ｍ ｉ＋ｏｓｃｈｎｉｃｈｅｎｋｏら、　１９８９）、ＨＳ　Ｖ　（Ｇ＆ｏら、　１ ９８８）及びＨＩ　Ｖ　（Ｍｇｊｚａｋｕｒｉら、　１９８９；Ｓｌｇｙｅｉｓ ｏｎ　ら、１９８９；Ｍｓｌ！ｕｋｕ＋ａ　ら、　１９１１８；Ｇｏｏｄｃｈｉ ｌｄ　ら、　１９１１１１）のような様々なウィルスに由来する多くの異なるタ イプのウィルスメツセンジャーＲＮＡの発現を特異的に阻止することができる。

リボザイムによれば、ＣＡＴマーカー遺伝子についてコードするメツセンジャー ＲＮＡをインビボで開裂すること（Ｃｘｍｅ＋ｏｎ及びＩｅｎｎｉｎｇｓ、　１ ９８９１、ヒストンメツセンジャーＲＮＡの成熟プロセスを阻害すること（Ｃｏ ｌｌｅｎら。

１９ｇ９；Ｃｏｚｅｎ及びＢｉｒｎ＋１ｔｅｌ、　１９８９）又は部分的にＨＩ Ｖ−１感染に対する細胞を保護すること（５ｉｔｙｅｔら、　１９９０１ができ る。

オリゴヌクレオチドは“センス′タイプ戦略の関係でも用いてよい。このアプロ ーチは特定配列のデオキシリボ又はリボシリーズの一本鎖又は二本鎖オリゴヌク レオチドを、この配列に親和性を有して細胞内有効濃度が競合により減少させる ことが望まれるタンパク質を結合させるための剤として用いることからなる。こ のため、転写因子、ウィルス包膜因子、翻訳調節因子等と相互作用するオリゴヌ クレオチドを用いて考えることができる。

このアプローチはより慣用的なアンチセンス戦略と異なりまだ開発されていない 。このケースにおいて、オリゴヌクレオチドの安定性の問題もそれら作用の効力 及び持続性に関して特に重要なファクターである。このようなアプローチ用に修 正されたオリゴヌクレオチドの使用によればタンパク質による認識の構造的問題 と出会うことがある。血清及び細胞中で安定である天然オリゴヌクレオチドを思 いどおりに扱いうる可能性から、特に核酸に親和性を有する調節因子に向けられ た新規治療方法の開発を考えることができる。

このため、アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドは病原作用を発揮する産 物についてコードする発現メツセンジャーを阻害できる強力でかつ高度に特別な 可能性のある薬剤である。

しかしながら、オリゴヌクレオチドの治療使用では生理学的タイプのい（つかの 問題、特にこれら分子の分子内デリバリ−の問題及びヌクレオチド分解に対する それらの感受性の問題と出会う。修正された誘導体の使用によればヌクレアーゼ 感受性の問題を克服できるが、但し追加問題、即ち分子中に導入される化学的修 正で起こりつる毒性の問題を生じる。

修正されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は毒性学的性質の問題を実際 に起こす。一部の修正はかなり中立的であると言われるが、はとんどは潜在的な 毒性がないわけではない。

化学的に修正されたアンチセンスオリゴヌクレオチドはいくつかのレベルで、即 ち全分子の効果で直接的に又は分解産物の効果で間接的にいずれかで毒性を有す ることがある。このため化学的修正を有して細胞内に高濃度で存在するヌクレオ チドは薬理学的観点から無意味でない毒性、更に具体的には遺伝毒性を有するこ とがある。

例えば、修正アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用により生じる多くの問題、 特に非配列特異的抗ウイルス効果はアンチセンスオリゴヌクレオチドをヌクレア ーゼ耐性にするためにそれらの中に導入された化学的修正の一部の性質のせいで あると実際には思われる。

このため毒性学的観点から、オリゴヌクレオチドの天然構造が少なく修正される ほど、薬理学的問題に直面するリスクが低下することは明らかである。天然ＤＮ Ａ又はＲＮＡ分子とその分解産物は毒性学及び薬物動態の問題をほとんど又は全 く起こさないが、これは代謝された後に様々な潜在的毒性誘導体を生じうる修正 構造のケースではない。

このため、正常なホスホジエステル結合で互いに連結された正常なデオキシ又は リボヌクレオチドのみを含み、しかしながら分解に対する耐性も有する天然オリ ゴヌクレオチドを思いどおりに扱えることは有利である。

ここで提示された本発明の主題は化学的修正を安定化させる面倒さなしにエキソ ヌクレアーゼに耐性である新規構造タイプのアンチセンス又はセンスオリゴヌク レオチドである。本発明の主題を形成するオリゴヌクレオチドはエキソヌクレア ーゼ分解に利用できる末端を供しない閉鎖構造をとるという特徴を有している。

このようなオリゴヌクレオチドはそれらの天然状態で用いてもよいが、しかしな がら修正ヌクレオチド又は反応基も有することができ、即ちそれらの阻害効力、 それらの浸透性、それらのターゲットに対するそれらの親和性もしくはそれらの 細胞もしくは細胞内ターゲット性を強化する目的で又はいずれか他の性質を最適 化するために他の分子又は高分子と物理的に組合せることができる。

Ｉ＋、発明の説明 細胞、更には体内、例えば血液循環において、天然アンチセンスオリゴヌクレオ チドはヌクレアーゼに感受性である。ヌクレアーゼは一本もしくは二本鎖分子で 内部開裂を導くか又はこれらの分子をそれらの末端から攻撃することによりいず れかでＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合を切断できる分解酵素である。

内部攻撃する酵素はエンドヌクレアーゼと称され、末端で攻撃するものはエキソ ヌクレアーゼと称される。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、ひいてはそれらの効力は前記のよう に様々な化学的修正を導入してそれらを分解に対して耐性にすることでかなり高 めてもよい。

エキソヌクレアーゼは血清及び細胞中におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド の分解の主原因である種類であることがわかっている。更に詳しくは、３′−Ｏ Ｈで攻撃するエキソヌクレアーゼがこの現象に最も具体的に関与するらしい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端の構造に施された修正はそれらを保護し 、エキソヌクレアーゼ活性を遮断し、そのオリゴヌクレオチドに増加した安定性 を付与できる。

このため、ここで記載された発明は遊離末端を有しない閉鎖オリゴヌクレオチド が規定によりこのタイプの分解に耐性であるという新しい考えに基づいている。

閉鎖、例えば環状オリゴヌクレオチドは３′又は５′エキソヌクレアーゼに接近 しつる基質を与えず、このため安定化される。

更に詳しくは、本発明は１以上の一本鎖オリゴヌクレオチド配列からなり、その 末端が共有結合で互いに連結されて少くとも部分的に閉鎖された一本鎖構造を形 成するオリゴヌクレオチドタイプのアンチセンス及びセンス剤に関する。

これらの剤は、このタイプの化合物が好ましくは非ヌクレオチド構造と比較して 多くのヌクレオチドを有するかぎり、閉鎖オリゴヌクレオチド又は環状オリゴヌ クレオチドと以下で時々称される。

オリゴヌクレオチドという用語の定義は前記されたが、天然リボ及びデオキシリ ボ双方のシリーズと、全体として以下で非天然と称されしかも前記されたこれら 塩基の修正を包含する。

共有結合は以下で説明されるようにタンパク質、脂質又はグリコシドタイプの非 ヌクレオチド共有構造でも及び／又は混合構造であってもよい。それにもかかわ らず、ヌクレオチド共有構造、即ちホスホジエステル結合を用いることが好まし い。

本発明は遊離末端を有しないが、但し全タイプの結合、好ましくはホスホジエス テルタイプ結合で互いに結合されたヌクレオチド塩基の連続から構成される閉鎖 、例えば環状オリゴヌクレオチドに関する。これらの塩基はこれら塩基間の距離 が約３〜４人であるような結合で互いに組合されるが、これはヌクレオチド間結 合がホスホジエステル基で形成された場合に天然ＤＮＡ又はＲＮＡ分子でみられ る距離である。閉鎖、例えば環状オリゴヌクレオチドは好ましくは未修正ホスホ ジエステル結合で互いに結合された天然ヌクレオチドから構成されることが有利 であるが、但し塩基間の距離に応じたかつ核酸コンホメーションに特徴的ならせ ん軸回転を行える修正ヌクレオチド及び／又は修正結合も含んでよい。このため 閉鎖オリゴヌクレオチドはそれらのデオキシ又はリボヌクレオチド形で塩基Ａ１ ＴＳＧ、Ｃ又はＵから構成されることが有利である。したがって、閉鎖オリゴヌ クレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチドもしくはオリゴリボヌクレオチド でも又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む混合分子であっ てもよい。

このため本発明は生物学的に、化学的に又は合成化学の技術を生物学及び生化学 の技術と組合せた方法により得られ、同配列だが但し完全に直鎖で閉鎖構造を有 しないオリゴヌクレオチドの場合よりも大きなエキソヌクレアーゼ耐性を有する あらゆる閉鎖−末鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ又は混合Ｄ　Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａの環状 又は環状部分を有する分子に関する。

閉鎖オリゴヌクレオチドの例は図ＩＡ〜１ｃで示されている。

図ＩＡは閉鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造の例について示す。図ＩＢ は閉鎖センスオリゴヌクレオチドの構造の例について示す。Ｉｒ１Ｃはセンス及 びアンチセンス効果を発揮できる混合分子について示す。

閉鎖オリゴヌクレオチドを構成する単一ヌクレオチドの数は様々で、特に１０〜 ２００であるが、但し基準として、この数は閉鎖構造（環状の投縄又は風船構造 、二本鎖にされた構造等−後の異なる構造の記載参照）、使用（抗ＲＮＡアンチ センス分子、抗ＤＮＡアンチセンス分子、抗タンパク質センス分子）、オリゴヌ クレオチド、デオキシ又はリボヌクレオチドのタイプ（単純なアンチセンス又は リボザイムアンチセンス等）及び問題のターゲット（メツセンジャーＲＮＡ、プ レメツセンジャーＲＮＡ、特殊な二次構造等）に応じて約２０〜約５０のヌクレ オチドであることが有利である。

本発明の主題を形成する閉鎖オリゴヌクレオチドは図ＩＤで示された一般式を有 するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラ シル（Ｕ）を有する塩基の配列から構成されることが好ましい。

閉鎖オリゴヌクレオチドは稀なヌクレオチド（例えば、イノシンＩ又はｒＩ）又 はデオキシリボ又はリボシリーズいずれかの修正ヌクレオチドを含んでもよい。

閉鎖オリゴヌクレオチドは、例えば図２で示された様々な式に従い、ホスホジエ ステル結合で修正されたヌクレオチドを含んでもよい。例えば、閉鎖オリゴヌク レオチドはホスホロチオエート類、メチルホスホネート類、ホスホロジチオエー ト類、ホスホモレネート類、ホスホルアミデート類及びアルキルホスホトリエス テル類である１以上の周知基を含んでよい。しかしながら、閉鎖アンチセンスオ リゴヌクレオチドは好ましくは未修正ホスホジエステル結合で互いに結合された 天然ヌクレオチドからなることに留意されるべきである。

閉鎖オリゴヌクレオチドはそのオリゴヌクレオチドに相補的なターゲット分子の 配列と結合を形成できる反応性ヌクレオチドを含んでもよい。

このため、閉鎖オリゴヌクレオチドはそのオリゴヌクレオチドに相補的なターゲ ット分子の配列と反応できる、例えばソラレン基のようなヌクレオチドにグラフ ト化された反応基又は他の架橋剤もしくは挿入剤を有してもよい（図２で示され た様々な非網羅的な例を参照せよ）。

閉鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは閉鎖構造のヌクレオチド形成部分の中に 触媒活性を有するＲＮＡ配列を含んでもよい。このため、これらの環状オリゴヌ クレオチドは、ターゲットＲＮＡ配列において開裂又は修正を起こせうるいかな るＲＮＡ配列であってもよい触媒配列に加えて、ターゲット配列に相補的であっ てＲＮＡもしくはＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ混合物のいずれかからなるアンチセ ンスタイプ配列を含む末端が結合された環状リボザイムである（図３）。

細胞内浸透性を増加させつる分子、特に親油基、ポリペプチド又はタンパク質に カップリングされた閉鎖オリゴヌクレオチドも本発明の一部を形成する。

閉鎖搾りゴヌクレオチドは３′及び５′エキソヌクレアーゼに基質を供しないと いう主要特徴を有する。この性質を獲得する上で、最も簡単な構造は既に図示さ れたようにホスホジエステル結合で互いに結合されたヌクレオチドの連続から形 成され、鎖内対合を有するか又はそうでない環状オリゴヌクレオチドである（図 ＩＡ〜ＩＣ及び図４）。

非３−−５−ホスホジエステル結合で閉鎖された他の構造の分子も合成してよく 、エキソヌクレアーゼに対する部分的又は全体的耐性を有することができる。

デオキシ又はリボヌクレオチド残基から構成されて分子の３′末端又は５′末端 いずれかを伴う結合で閉鎖された投縄形分子（図ＩＡ〜ＩＣ及び図４）も本発明 の一部を形成する。これらの投縄形分子において、直鎖部分は単一ヌクレオチド 残基のみを含むか又は代わりに０＜っかの残基のヌクレオチド側鎖を含むことが できる。これらの構造において、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの１つ は塩基、糖又はホスホジエステル基で形成されうる結合により内部ヌクレオチド に力・ツブリングされる。このようなオリゴヌクレオチドは遊離末端又（よ遮断 末端を有する。このため、エキソヌクレアーゼ耐性（よ部分的であり、遊離末端 をヌクレオチド分解に付すことが可能である。オリゴヌクレオチドの５′及び３ ′末端は同等に分解に感受性でなく、３゛末端の方が感受性である。遊離５′末 端のみを有する投縄形環状オリゴヌクレオチドは分解からかなり保護される。加 えて、投縄の直鎖部分を分解できるエキソヌクレアーゼは分岐点て停止される。

この段階において、オリゴヌクレオチドはその末端が最初に遊離又は分岐してい たかにかかわらず３′及び５′エキソヌクレアーゼに完全に耐性になった。

このような投縄形分子は先のセクションで前記したように天然又は修正ヌクレオ チド残基を含むことができる。

投縄形分子の一般構造は図ＩＡ及び図４Ｂで示されている。

図ＩＡ、図ＩＢ及び図４０で記載されたような風船形閉鎖オリゴヌクレオチドも 本発明の一部を形成する。これらのオリゴヌクレオチドは２つの内部ヌクレオチ ド間で形成される鏡開架橋に相当する化学結合で閉鎖される。

この架橋は反応性、例えば光活性のヌクレオチドによって又は代わりにオリゴヌ クレオチドの２対領域間で結合を形成する外来試薬を用いることで行ってよい。

このような風船形オリゴヌクレオチドはエキソヌクレアーゼ用に制限された数の 基質部位を有するだけか又は全く有しない。オリゴヌクレオチド分子を閉鎖する 架橋がたとえ末端ヌクレオチドで行われないとしても、架橋箇所の各個に位置す るわずかなヌクレオチドは分子の末端においてエキソヌクレアーゼに接近できる 。エキソヌクレアーゼは未カップリング末端のヌクレオチドを結ぶホスホジエス テル結合を開裂するが、但し架橋部位から先で停止される。架橋に関与するヌク レオチドは全体的又は部分的にエキソヌクレアーゼ耐性であり、このため継続的 なヌクレオチド分解からオリゴヌクレオチドを保護する。

非ヌクレオチド分子で自ら閉鎖されたもう１つの群の環状オリゴヌクレオチドも 本発明の一部を形成する。これらの閉鎖オリゴヌクレオチドは塩基が未修正であ って第一ヌクレオシド単位が何らかの種類の分子構造を伴う結合で最後に結合さ れたＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相当するそれら分子構造の一部を有する。例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは何らかのタイプの力・ツブ１ノングで末端ヌ クレオシド単位に結合されるタンノ（り質又はポリペプチド構造で末端ヌクレオ チド間の力・ツブリング１こより環化してよい（図４）。このため、ヌクレオチ ド部分とタンパク質部分を有する環状オリゴヌクレオチドも本発明の一部を形成 する。このタン／々り質部分の挿入（よ様々なカップリング方法で行ってよい。

タンＩくり質分画は異なるメカニズムでヌクレオチド分子の効力を増加させるよ うにデザインしてよい。例えば、そのタンノ々り質部分は細胞でオリゴヌクレオ チドの取込みを促進し、用いられるタンパク質決定基を選択することで適宜１こ ある細胞をターゲット化できる。このタイプの環状第１ノゴヌクレオチドで用い られるタンノ＜り質又はペプチド成分（よシグナル化分子でもよく、これによれ ばオリゴヌクレオチドの細胞内ターゲット化を可能にする。例え（ｆ１天然細胞 内又はウィルスタンパク質に由来する核にタープ・ット化されたペプチドも用い てよい。このため、本発明のこの面は、細胞膜表面の特定レセプターと特異的に 反応し、上記細胞により取り込まれ、細胞内でそれらの生物活性を発揮できる化 合物を包含して新規構造のオリゴヌクレオチドを提案することにある。

親油基により又は親油基を有してこれら分子の細胞内取込みを促進する鎖により 自ら閉鎖された環状オリゴヌクレオチドも本発明の一部を形成する。

リポソームタイプ包膜構造又はいずれか他のりボタンバク質もしくはリポ多糖構 造との共有又は非共有カップリングで結ばれた環状オリゴヌクレオチドも本発明 の一部を形成する。

ホスホジエステル結合で自ら閉鎖されたが、但し自らの又は外部から供された分 子の構造に属する反応剤により形成された１以上の内部結合を更に含む環状オリ ゴヌクレオチドも本発明の一部を形成する。

これらの分子は環状オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ耐性の特徴を有し 、加えて特定の二次又は三次コンホメーションを有するターゲット自体における 特定部位の認識に向けることができる特殊な二次コンホメーションを供するが、 これらのタープ・ストは特定の一次及び二次構造のポリヌクレオチドに関して随 意的及び選択的親和性を有することができる核酸でも又はいずれか他の細胞もし くはウィルス構造であってもよい。

ターゲットＲＮＡと三重らせんを形成できる環状又は閉鎖アンチセンスオリゴヌ クレオチドも本発明の一部を形成する。三重らせんの形成によればアンチセンス 化合物とターゲット配列とのＤ　Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａ相互作用を安定化させること ができる。

一般的に言えば、環状アンチセンス化合物は直鎖アンチセンスオリゴヌクレオチ ドと比較して“プロドラッグ化合物であるとも言える。環状オリゴヌクレオチド の開裂は慣用的なアンチセンス効果を遅れて発揮する直鎖オリゴヌクレオチドを 生じる。

本発明による化合物は自己対合できないヌクレオチド配列を含むことがかなり多 いが、可変的鎖長の二本鎖構造を形成する自己対合領域を含む閉鎖オリゴヌクレ オチド（図５参照）も本発明の一部を形成する。この二本鎖構造はいくつかの役 割、例えば環状分子の合成時に環化できるように分子を安定化させる役割を有し てもよｔ）（後の製造方法を参照せよ）。この二本鎖構造は例えばこの配列に親 和性を有するタンパク質と相互作用するような活性役割を有してもよい。二本鎖 構造はタン、＜り質因子用の結合配列に対応することができる。特に、本発明の 一面は細胞又はウィルスタン／＜り質因子と結合でき、ひいてはこれらの因子と 係わる生物学的プロセスに干渉できる安定な天然オリゴヌクレオチド分子を提供 するこ−このような適用向けのオリゴヌクレオチドは単に環状であることが有利 であるーは転写因子との細胞内競合である。このケースにおいて、閉鎖オリゴヌ クレオチドの二本鎖部分は捕捉することが望まれる転写因子、レギュレーター又 はホルモン核レセプターの結合配列を有する。

二本鎖化された環状オリゴヌクレオチドと転写因子との相互作用はこの因子の細 胞内利用性を減少させ、ひいてはこの因子が関与する調節平衡を修正する。それ が促進効果を発揮する正の転写因子であるならば、この因子の遮断は問題の遺伝 子を阻害する；それが細胞ＤＮＡとの相互作用後に遺伝子発現を阻害する負の因 子であるならば、これら遺伝子の発現は促進される。一般的に言えば、デオキシ リポジリーズで二本鎖部分を有する環状タイプの閉鎖オリゴヌクレオチドはＤＮ Ａに親和性を有して所定の病的状況で効果を減少又は変化させることが望まれる いずれかのタンパク賀因子と治療目的で相互作用する。

使用はより大きな効力の目的のためアンチセンス及びセンスアプローチを組合せ る上でも閉鎖、有利には環状オリゴヌクレオチドについて考えられる。この方法 は転写因子のメツセンジャーＲＮＡに対する閉鎖アンチセンスオリゴヌクレオチ ドとＤＮＡで転写因子の結合部位に対応した配列の二本鎖構造を含む閉鎖“セン ス”オリゴヌクレオチドを同時に用いることからなる。このため２つの作用レベ ルが同一ターゲット分子で同時かつ相乗的にターゲット化され、アンチセンスは この因子の合成を減少させ、センス分子は存続できる残留分子で捕捉効果を発揮 する。組合せセンス及びアンチセンスアプローチは２つの異なるレベルの発現及 び機能性で同一タンパク質をターゲット化するか又はその方法の最大効力を探求 する目的で２つの異なるタンパク質を攻撃するために用いてもよい。

この二重アプローチでは一方がセンス及び他方がアンチセンスである２つの異な る分子の同時使用又は代わりにＳＩＣで記載されたような単一の閉鎖オリゴヌク レオチド分子を要する。

閉鎖オリゴヌクレオチドのもう１つの使用例はある二本鎖ＲＮＡ配列に関して親 和性因子との細胞内競合である。これはメツセンジャーＲＮＡ１特にウィルスメ ツセンジャーＲＮＡと相互作用するある調節タンパク質に関するケースである。

例えば、ウィルスメツセンジャーＲＮＡの５′末端の二本鎖領域に結合するＨＩ ｖｔａｔ遺伝子の産物のケースが挙げられる。ｔａｔと相互作用する剤として用 いられるためには、この例のケースにおいて、閉鎖−例えば環状−オリゴヌクレ オチドはリボシリーズの二本鎖部分を含み、そのオリゴヌクレオチドの残りはリ ボシリーズ又はデオキシリポジリーズいずれかのヌクレオチドから構成される。

一般的に言えば、本発明の主題を形成する閉鎖オリゴヌクレオチドは親和性部位 の一次構造（配列）と可能な二次構造（例えば、ヘアピン構造、十字形構造）の 双方に似せることにより一本鎖又は二本鎖核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡに親和性を有 するタンパク質因子を捕捉する上で安定化された分子として用いてもよい。

タンパク質因子で認識されるヌクレオチド配列を含むこのような閉鎖、有利には 環状オリゴヌクレオチドは自発的又は光活性な架橋を行える反応基を有してもよ く、タンパク質はそれらと相互作用する。

このため本発明の一面は、先のセクションで詳細に記載されたように、細胞に取 り込まれて特定の核酸配列暑こ親和性を有する細胞又はウィルス因子と相互作用 できる新規の安定な天然オリゴヌクレオチドを提供することである。

エキソヌクレアーゼに耐性である完全又は部分的二本鎖環状構造（別に“ミスマ ツチ”として知られる非対合を有することができる）を形成するために配列の相 補性の結果として対で組合された環状オリゴヌクレオチドも本発明の一部を形成 する。これらの環状二本鎖第１ノゴヌクレオチドはデオキシリポジリーズ又はリ ボシリーズの天然、稀有、人工又は修正ヌクレオチドから構成してもよい。これ らの二本鎖環状オリゴヌクレオチドは■型ＤＮＡ又はＶ型ＤＮＡから構成でき、 即ち複合Ｂ及びＺ型構造を含むことができる。Ｉ型ＤＮＡｔよ２本の鎖力（から み合いを有した超コイル化環状ＤＮＡである。■型ＤＮＡは相補鎖がからみ合わ されていないＤＮＡ、即ち横並びの２本の相補鎖から形成されたＤＮＡである。

二本鎖ＤＮＡは異なるコンホメーションＡ、Ｂ又はＺをとることができる。ＤＮ Ａの最も自然で最も普通の型はＢタイプ右回りらせんであり、一方少ない方のＺ 型は左回りらせんであって、Ｂ型よりも長い。からみ合わされていない２本の相 補鎖を含む前記のような環状構造は左回−りらせん及び右回りらせんを双方とも 含む。このような二本鎖環状オリゴヌクレオチドは問題のオリゴヌクレオチドに 存在する特定配列に親和性を有するタンパク質と相互作用するセンスタイプ剤と して用いてよい。特にリボシリーズのこのような環状二本鎖オリゴヌクレオチド は通常免疫促進剤として、更に詳しくはインターフェロン誘導剤として用いても よい。一部のＲＮＡにより有されるこの潜在的免疫促進機能は内部配列相補性の 結果として自己対合された二本鎖構造を有する一本鎖環状オリゴヌクレオチドを 用い、環状構造のエキソヌクレアーゼ耐性により付与される利点をよく利用する ことで活用されることに留意すべきである。

Ｉ１１閉鎖オリゴヌクレオチドの製造 本発明の主題を形成する閉鎖オリゴヌクレオチドは化学的に、生物学的に又は合 成化学及び分子生物学の技術の組合せを用いたアプローチにより得られる。

このため、閉鎖オリゴヌクレオチドは直鎖オリゴヌクレオチドから製造してその 後で化学的もしくは生物学的技術により閉鎖しても又は分子の環化に導く反応を 用いて化学的手段によりオリゴヌクレオチドとして直接製造してもよい。これら ２つのアプローチは以下で逐次考え天然オリゴヌクレオチドの化学合成の様々な 方法が開発され、当業界の規則に従い働く専門家に周知である。

例えば、１つの方法はＣＰＧ　（コントロールされた孔質ガラス）として知られ る固体支持体を用いることであり、それに第一のヌクレオシドがその３−−ＯＨ 末端でカップリングアームにより共有結合される。ヌクレオシドの５−−ＯＨ末 端は酸不安定性ジーｐ−メトキシトリチル基により保護される。亜リン酸トリエ ステル化学を用いかつデオキシヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトがシント ンとして用いられるこのアプローチはホスホルアミダイト法と称される（Ｃａ＋ ｕｔｈｅｒｓ、　１９８５）。このアプローチは現在量も広く用いられるもので あり、完全に自動であるという利点を有する。ＣＰＧに結合された第一単位から のオリゴヌクレオチドの合成は脱保護のステップで始まり、その際にトリチル基 が除去され、しかる後５′基で活性化されたヌクレオシド単位が加えられ、未反 応生成物がブロックされ、しかる後脱保護／活性化／カップリングの新しいサイ クルが再び始まる。典型的には、デオキシヌクレオチドの付加は下記４ステツプ ＝１）ジメトキシトリチル保護基の脱保護及び酸による除去、１１）デオキシヌ クレオシド亜リン酸トリエステルを生じる得られた生成物とデオキシヌクレオシ ド３′−ホスホルアミダイトとの縮合、１ｉｉ）アシル化、即ち反応しなかった ５′−ヒドロキシル基のブロック及びｉｔ）亜リン酸トリエステルからリン酸ト リエステルへの酸化に従い生じる。

このようなサイクルの反復から２００単位以上に伸びることができるオリゴヌク レオチドの合成に至る。

第二の例を引用するため、オリゴヌクレオチドの合成に用いられるもう１つのア プローチはホスホン酸化学のアプローチである（Ｆ＋ｏｅｈｌｅｒら、　＋９８ ６）。このアプローチはデオキシヌクレオシド３′−Ｈ−ホスホン酸とシリカガ ラス支持体にカップリングされたデオキシヌクレオシドとの縮合から始める。連 続縮合サイクルはオリゴヌクレオチドＨ−ホスホン酸の合成に至る。これらのオ リゴヌクレオチドはホスホジエステルを得るために１ステ・ツブで酸化される。

これら技術のうちあるもの又は規定配列のポリヌクレオチド鎖を化学合成できる いずれか他の連続操作を用いて、生物学的手段により環化できる直鎖オリゴヌク レオチドが結合酵素を用いて得られる。オリゴヌクレオチドを自ら閉鎖させる上 でリガーゼを使用できるためには、オリゴヌクレオチドは５′末端のリン酸化が 化学的に行われたか又は代わりにキナーゼ（好ましくは、ポリヌクレオチドキナ ーゼ）及びＡＴＰもしくはいずれか他のリン酸ドナーを用いて生物学的に行われ たかにかかわらず５′−Ｐ末端基を有しなければならない。

直鎖オリゴヌクレオチドの環化を有利に行う上で適した異なる操作は以下で記載 されている。

１−１−直鎖オリゴヌクレオチドは第一よりも短い第二オリゴヌクレオチドと第 一オリゴヌクレオチドの２末端に相補的な配列によりＴ４リガーゼのようなりガ ーゼを機能化させる上で対合された部分的二本鎖構造を形成することで環化して もよい。図６で示されるこのケースにおいて、第二の小さなオリゴヌクレオチド はアダプターとして作用し、オリゴヌクレオチドの２末端ヌクレオチドを端部間 で環化させておくことができる。その際に、Ｔ４リガーゼ又はＤＮＡでその作用 を発揮できるいずれか他の結合酵素の作用からこれら２つのヌクレオチド間でホ スホジエステル結合を形成することにより環化させる。この結合は溶液中で生じ つるが、２つのオリゴヌクレオチドは鎖内環化にとっては好ましいが、現実的環 化反応の収率を減少しうるオリゴヌクレオチド間結合にとり好ましくない適切な 温度及び濃度条件下においてノーイブリッド形成及び結合しうる培地でミックス される。

ｌ−２−（１）で記載された方法の変形例でもなおアダプターによりオリゴヌク レオチドの環化を行うが、但し核酸断片を共有又は非共有結合できてその後にこ の断片とオリゴヌクレオチドでハイブリッド形成させつる例えばニトロセルロー スもしくは誘導体、ナイロン膜、ガラス支持体、多糖構造又はいずれか他の支持 体であって、リガーゼの作用と適合しつる支持体に結合されたオリゴヌクレオチ ドを用いる。このため、この操作は共有結合又は非共有結合のいずれかで支持体 にアダプターオリゴヌクレオチドを結合させることからなる。多数のハイブリッ ド形成／結合サイクルを環化すべきオリゴヌクレオチドで行える共有結合を用い ることが有利である。アダプターオリゴヌクレオチドは末端ヌクレオチドで直接 又はカップリング剤により、又は内部位置に存在して反応基を有するヌクレオチ ドでいずれかによりその支持体に結合させてもよい。このような方法の原理につ いて示す図は図６で説明される。アダプターオリゴヌクレオチドを結合させる利 点は２つであるニ一方でコントロールされた物理的条件（単位面積当たりの結合 分子数）下で行われるこの結合によればオリゴヌクレオチド間結合後のハイブリ ッド形成反応時にコンカテマー形成の発生率を減少させることができ、他方でそ れは多環化サイクル用に何倍ものアダプターオリゴヌクレオチドを用いる結合リ アクターの生産を容易にする。

１−３−オリゴヌクレオチドは自ら折り返して部分的二本鎖構造を形成できる配 列を用意することで意図的に導入された二次構造を利用することにより環化させ てもよい。例えば、図６はループを形成する直鎖部分を含み、アンチセンスタイ プ配列、長さ９塩基対の二本鎖領域及びＴ５から構成される閉鎖配列を含む“ダ ンベル形”オリゴヌクレオチドのケースについて示す。この構造は自己対合を行 い、それによりＴ４リガーゼのような結合酵素により基質として利用されうる分 子を与えることができる。このケースにおいて、結合の収率は二本鎖構造におけ る対合の安定性に特に依存している。いくつかの対合配列が比較研究に付された が、（７５％程度の）有利な環化収率を与える配列の１つが図６で示されている 。

どのヌクレオチドが４〜８残基の様々な長さの閉鎖ループを形成するために用い られるかについてはかまわないが、主にＡ又はＴのいずれかが好ましくは用いら れる。

二本鎖対合領域は“ダンベル”構造の形成のみに用いられる配列又はターゲット 領域に一部に対応して分子間ハイブリッド形成により部分的に置換えつる配列を いずれか含んでもよい。

配列が図６で示されるオリゴヌクレオチドを有効に環化させる実験条件は後に実 験部分で詳細に記載されている（“閉鎖オリゴヌクレオチドの性質及び利点″参 照）。

この配列のケースにおいて、環化収率は７５％程度であこの技術は実験部分で取 り扱われる環状オリゴヌクレオチドを製造するために用いられた。

１−４−環状オリゴヌクレオチドは結合ヌクレオチドの短鎖ループにより各末端 においてそれ自体で閉鎖された二本鎖構造により形成してもよい。これらのオリ ゴヌクレオチドは前記のような“センス”タイプアプローチに用いてよい。セン スオリゴヌクレオチドの典型例は図６で示される。このオリゴヌクレオチドは２ ４ヌクレオチドの対合配列とＴ５により形成された２つの結合ループを含む。こ こで示された例において、この環状オリゴヌクレオチドは肝細胞転写因子ＨＮＦ −１の認識用配列に対応した二本鎖構造を含む。このようなオリゴヌクレオチド は相補配列により形成される二本鎖二次構造を利用することで単純に環化しても よい。オリゴヌクレオチドの閉鎖ポイント（即ち、末端）は分子内回折り重ねで 最大の環化効力を示すように選択される。このポイントは中心二次構造の中間点 と比較して真中でも又は多少遠くであってもよい。このようなオリゴヌクレオチ ドは分子内反応に基づくのではなく、部分的二本鎖構造を有して互いに対合しう る付着末端を形成する自ら折り返された２本の直鎖オリゴヌクレオチドを用いる 分子間反応により合成してよいことにも留意されるべきである（図６の図参照） 。

１−５−一方が長くて他方が短（、第二が第一の中心部分でハイブリッド形成す る２本の相補的オリゴヌクレオチドを製造することからなる技術は二本鎖中心領 域を含むことになるオリゴヌクレオチドを環化させるために用いてよい。Ｔ４リ ガーゼの作用により、３′及び５′還位配列で自己対合を形成できる配列相同性 がたとえないにしても、長鎖オリゴヌクレオチドの２末端を対合オリゴヌクレオ チドの末端に結合することができる。このようなメカニズムでは中心二本鎖部分 を含む閉鎖環状オリゴヌクレオチド構造を形成するようになる。

１−６−直鎖オリゴリボヌクレオチドからリボシリーズ（オリゴリボヌクレオチ ド）の環状オリゴヌクレオチドの製造に関して、使用できる技術は前記の場合と 同種類のものである。しかしながら、リボ又はデオキシリポジリーズのオリゴヌ クレオチドの環化を自発的に行えるＴ４ＲＮＡリガーゼ酵素を用いることも可能 である。この酵素は直鎖オリゴヌクレオチドをＡＴＰの存在下で閉鎖して環状オ リゴヌクレオチドに変換することができる。

このため、特別なマトリックスなしにいかなるアダプターオリゴヌクレオチドも 不存在下で、オリゴリボヌクレオチドをこのように環化することができる。この 同様の酵素もオリゴデオキシリボヌクレオチドを環化できるが、但しオリゴリボ ヌクレオチドのケースよりもかなり低い効力である。Ｔ４ＲＮＡリガーゼはリボ ザイム活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを環化するが又は代わりに 例えばＨＩＶ　ｔａｔタイプトランスアクチベーターと相互作用する配列のよう な“センス”ＲＮＡを環化するために有利に用いられる。

１−７＝前記すべての操作はホスホジエステル結合を形成して直鎖分子を閉鎖さ せる結合酵素を伴う。２つのヌクレオチド残基間でホスホジエステル結合を形成 させうるいかなる酵素もそれらをヌクレアーゼ作用に耐性にする目的でオリゴヌ クレオチドを環化するために用いてよいが、ここで記載された発明の精神におい てこのような酵素はＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼである。特に、熱耐性生 物に由来する熱安定酵素は有利に用いられ、連続結合／変性／ハイブリッド形成 サイクルを実施させることができる。本発明の主題を形成する環状分子を製造す るために、反応の収率を高める及び／又はそのコストを下げる目的で溶解状態の 結合酵素又は支持体に結合された酵素のいずれかが用いられる。

加えて、化学結合させるいかなる化学試薬も本発明の主題を形成する環状分子を 製造するために用いてよい。

例えば、制限を意味するわけではないが、カルボジイミド又は臭化シアンのよう な試薬が使用できる。

２−環状及び／又は閉鎖オリゴヌクレオチドの製造の他の化学的方法 薬理学的適用の目的のため閉鎖オリゴヌクレオチドの製造は、動物実験であろう と又は医薬化合物の製造であろうと、要求された多くの量を製造させうる化学的 方法を用いることが有利である。

いくつかの方法が用いられる。特に、直鎖オリゴヌクレオチドが有用な方法で合 成され、しかる後化学結合又は末端ヌクレオチドを伴う結合で閉鎖されるが、あ るいは化学合成の最終ステップで直接環化に付すことができるオリゴヌクレオチ ドが合成される。

２−１−環状オリゴヌクレオチドの化学合成環状オリゴヌクレオチドを製造する いくつかの操作が記載されている（Ｂａ＋ｂｘｔｏら、１９ｇ９．ｄｅ　ｖ＋ｏ ｏｉら、　１９８ｇ＋。これらのアプローチでは液相中又は支持体上で短鎖環状 オリゴヌクレオチドを得ることができる。例えば、理外アミン基で第一ヌクレオ チド残基を結合することからなる技術を用いることができる。このような支持体 からオリゴヌクレオチドの集合化が３′及び５′末端の双方で起きるが、これは 保護して利用できる。環化は合成が完了したときに２末端から保護基を取り除い た後で例えばＭＳＮＴを用いて行われる。

エキソヌクレアーゼ耐性アンチセンス又はセンス分子を製造する目的で環状オリ ゴヌクレオチドを合成するためには、３′及び５′末端の双方からポリヌクレオ チド鎖を伸長させて選択配列の伸長の完了後にこれら２末端を結合させるいかな る合成方法も用いてよい。２本の独立して合成された直鎖オリゴヌクレオチドを 化学結合させ、しかる後組換えて末端の特異的な化学反応により閉鎖構造を形成 させるあらゆる方法が用いられる。

２−２−直鎖オリゴヌクレオチドの閉鎖及び環化様々な方法が直鎖オリゴヌクレ オチドを閉鎖させて本発明の主題を形成する閉鎖構造を形成するために用いられ る。これらの構造において、２つの末端ヌクレオチドのうち一方又は双方がカッ プリング結合に関与する。結合又はいずれか他の化学反応のいずれかで得られる 前記された厳密な環状構造とは別に、既に記載された他の閉鎖構造のうちいくつ かは化学的カップリングにより得てよい。

これは特に投縄構造のケースであって、一方の末端ヌクレオチド、有利には３′ 末端ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５′部分のヌクレオチドの１つにカッ プリングされる。このような構造は分子の他の部分と架橋を形成しうる修正ヌク レオチドを用いて得てもよい。

それは更に風船構造のケースであり、その場合に架橋はオリゴヌクレオチドの末 端領域に位置する２又は３以上のヌクレオチド間でいずれかの剤により形成され 、これらの領域が少数のヌクレオチド、好ましくは４〜１０のヌクレオチドにわ たって対合される。

それは末端ヌクレオチドを互いに又は末端ヌクレオチドと内部ヌクレオチドをカ ップリングさせ、アンチセンス又はセンス細胞内作用に関して化合物の効力を増 加させることができるいずれかの基、いずれかの分子又は高分子により閉鎖され たオリゴヌクレオチドのケースでもある。例として、例えば長さ５〜１００アミ ノ酸のポリペプチドがオリゴヌクレオチドを環化するために用いられ、ポリペプ チド結合鎖は細胞レセプターにより認識されて良好な取込み又は良好なターゲッ ト化を行う上で十分な量を有することが必要である。

ＩＶ、適用の例 ここで記載された発明の主題を形成する閉鎖、特に環状オリゴヌクレオチドは直 鎖オリゴヌクレオチドと比較して高いエキソヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌ クレオチドを思いどおりに扱うことが有利であるすべてのケースで用いてよい。

閉鎖オリゴヌクレオチドはリサーチ又は治療目的から発現レベルを調節すること が望まれるタンパク質の転写又は翻訳において特異的に作用するアンチセンス又 はセンス剤として特に用いてよい。

下記のいくつかの可能な適用は、アンチセンス又はセンスタイプアプローチにつ いて考えることができ、最低の可能な毒性を有する天然エキソヌクレアーゼ耐性 オリゴヌクレオチドの使用が利点を与える状況の、決して制限ではない、単に非 網羅的な例である。

更に詳しくは、本発明による化合物は特に外部局所遇用又は全身適用向けの医薬 組成物において、治療剤、特に抗ウィルス又は抗癌剤として使用できる。

しかしながら、それらはインターフェロンのような天然免疫調節剤の誘導物質で もある。インビトロ又はインビボで診断にそれらを用いることもできる。

一般的に言えば、特に天然及び環状の閉鎖オリゴヌクレオチドは治療されるター ゲットの接近性とこれら化合物の最低又は非存在毒性のために皮膚科の分野で特 に適切な適用領域を有する。遺伝的機能不全のメカニズムに依存し、病原因子が 確認されて、遺伝子及び／又はメツセンジャーＲＮＡ配列が知られるすべての皮 膚病症状ではアンチセンスアプローチ又は一部の好ましいケースにおいては“セ ンス“アプローチであっても可能性として考えることができる。

このため、最低毒性を有する天然オリゴヌクレオチドの使用によればこの種類の アプローチの可能性を重度又は軽度の症状と適切であれば美容タイプ、即ち健常 な皮膚における使用及び製品の毒性ができるだけ低くなければならない適用分野 であっても考えることができる。

後で規定されるウィルスターゲットの他に、多くの皮膚病がエキソヌクレアーゼ 耐性環状又は閉鎖天然オリゴヌクレオチドで処理できる。このようなアプローチ で可能なターゲットの中には、アトピー性皮膚炎又は紅斑性狼癒のような炎症疾 患、魚鱗癖及び乾癖のような角質化疾患とメラノーマ又は皮膚Ｔリンパ腫のよう な新生物疾患がある。このため、例えば、皮膚科で適用される環状アンチセンス オリゴヌクレオチドはインターロイキンのような炎症媒介物質のメツセンジャー ＲＮＡ、表皮細胞の増殖障害に関与するタンパク質のメツセンジャーＲＮＡ又は 代わりに例えばコラゲナーゼ、エラスターゼ及びトランスグルタミナーゼのよう な表現型皮膚老化におそらく関与するタンパク質についてコードするメツセンジ ャーＲＮＡに向けられる。

更に一般的に言えば、主に天然及び環状の閉鎖オリゴヌクレオチドは例えば局所 （皮膚科）適応症又は全身適応症のいずれかでアンチセンス又はセンス抗ウィル ス剤として使用できる。例えば、このようなオリゴヌクレオチドハ抗ヘルペス（ ＨＢＶ−１及びＨ８Ｖ−２、ＣＭＶ。

ＥＢＶ）剤、抗パピローマウィルス（皮膚、性器、喉頭又は他）ＨＰ　Ｖ）剤、 抗肝炎（ＨＢＶ、ＨＣＶＳＨＤＶ）剤、抗ＨＩＶＣＨＩＶ−１及びＨＪＶ−２） 剤、抗ＨＴＬＶ　（ＨＴＬＶ−１又＋１ＨＴＬＶ−２）剤等として使用できる。

これらの環状オリゴヌクレオチドは細胞増殖及び分化の疾患の原因に直接係わる 又は関与するある細胞性タンパク質の発現を抑制する剤として用いてもよい。例 えば、これらの環状オリゴヌクレオチドは腫瘍細胞タイプ（ＲＡＳ、ＥＲＢ、Ｎ ＥＵ、Ｓ　Ｉ　Ｓ、ＭＹＣ％ＭＹＢ等）で過剰発現又は未制御的に発現される細 胞性発癌遺伝子の発現に向けられる。

特に、血清エキソヌクレアーゼに耐性のこれら天然環状オリゴヌクレオチドは白 血病細胞で発現され、それらの増殖に関与する発癌遺伝子のメツセンジャーＲＮ Ａに対するアンチセンス剤として又は代わりにこれら増殖性疾患の一部においで あるＤＮＡ配列に親和性を有して病的レベルで発現されるタンパク質に対する゛ センス”剤として使用できる。ある白血病の治療の関係において、骨髄移植のた めに環状の閉鎖オリゴヌクレオチドが“エキスビボ”（ｅｘマ１マ０）適用の関 係で用いてよい。

これら多くの適応症に関して、適切な医薬投与処方がこれら分子のそれらターゲ ット細胞へのデリノくり−を最適化させる上で確立される。このため、例えば、 閉鎖、特に環状オリゴヌクレオチドは適切に保存してターゲット化を促進するリ ポソーム、ナノ粒子、ＬＤＬ粒子又はいずれか他のタイプの微小球でカプセル化 してもよい。

閉鎖、例えば環状オリゴヌクレオチド分子はカチオン系界面活性剤と組合せるこ ともできる。これらいくつかの例は網羅的でも制限的でもないことは全く明らか である。

ここで記載された発明の主題を形成する閉鎖、特に環状オリゴヌクレオチドはこ のため全種類の医薬製剤中に適応症に応じて様々な濃度で含有させることができ る。

特に、前記された皮膚科適用ではクリーム、溶液、エマルシコン、ローション、 ゲル、スプレー、粉末、エアゾール等の製造を要し、これらは選択された配列の 環状又は閉鎖オリゴヌクレオチドをこれら製品の組成物に関与する一般医薬成分 と組合せることで製造される。例えば、皮膚科における局所適用向けの製剤にお いて、環状又は閉鎖オリゴヌクレオチドは例えばヒドロキシ安息香酸メチルもし くはプロピル又は塩化ベンザルコニウムのような全種類の保存剤と他の安定、乳 化、分散、懸濁、溶解、着色及び増粘剤、芳香剤等と組合される。これら組成物 の一部、特に皮膚科適応症の局所適用向は組成物では環状又は閉鎖双方のオリゴ ヌクレオチドを例えば静菌、防腐、抗菌、抗生、鎮痛又は抗そう痒剤等のような 他の活性剤と組合せてもよいことに留意されるべきである。

すべてのこれらの例は本発明を説明するためのみで示され、網羅的でも制限的で もない。

■、閉鎖オリゴヌクレオチドの性質及び利点実験例は同配列の直鎖“オーブン” オリゴヌクレオチドにはない閉鎖オリゴヌクレオチドの利点について立証するた めに以下で示されている。これらの例は“閉鎖オリゴヌクレオチドの産生９の部 、セクシヨン１〜３で記゛載された方法に従い環化されたオリゴヌクレオチドで 実施された実験から採用された。このため、ここで取り扱われる閉鎖オリゴヌク レオチドは未修正ホスホジエステ水結合で互いに結合された天然ヌクレオチドか ら構成される環状オリゴヌクレオチドである。

説明及び例においては添付図面に言及しているが、それには下記解説が付は加え られる： 図１： 八−閉鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造の例Ｂ−閉鎖センスオリゴヌク レオチドの構造の例Ｃ−センス及びアンチセンス効果を発揮できる混合分子 Ｄ−オリゴヌクレオチドが構成される塩基の構造及び天然ヌクレオチドを互いに 結合するホスホジエステル結合の構造 図２： Ａ−ホスホジエステル結合の安定性、特にそのエンドヌクレアーゼ耐性を増加さ せるために使用できる修正の一部の図示 Ｂ−アンチセンスオリゴヌクレオチドにカップリングできるいくつかの挿入タイ プ反応剤の表示図３ いわゆる“Ｔ形”触媒部位とターゲット配列に相補的であるＲＮＡループを含む 環状リポザイムの例図４゜ Ａ−未修正ホスホンエステル結合で互いに結合された天然ヌクレオチドから構成 される環状オリゴヌクレオチドの図示 Ｂ−遊離５′と鎖内架橋でブロックされた３′末端を有する投縄形閉鎖ヌクレオ チドの図示 Ｃ−最後から２番目の５′及び３′末端ヌクレオチド間で形成された鎖内結合を 有する風船形閉鎖オリゴヌクレオチドの図示。このタイプの構造は風船の尾部を 形成する対合ヌクレオチドの対のいずれか１つの間で１以上の鏡開結合を有する ことができる。

Ｄ−ペプチド（オリゴペプチド）で閉鎖されたオリゴヌクレオチドの図示 Ｅ−外部ペプチド伸長を有する環状オリゴヌクレオチドの図示 図５・ 八一部分的自己対合二本鎖領域を有する環状、閉鎖オリゴヌクレオチドの図示 Ｂ−長い自己対合二本鎖配列（例えば、転写因子の認識用配列）及び２つのポリ （Ｔ）結合ループから構成される環状、閉鎖オリゴヌクレオチドの図示図６゜ 八−ガイドとして部分的相補オリゴヌクレオチドとＴ４リガーゼを用いた直鎖オ リゴヌクレオチドの環化Ｂ−支持体に結合されたガイドとして部分的相補オリゴ ヌクレオチドとＴ４リガーゼを用いた直鎖オリゴヌクレオチドの環化 Ｃ−Ｔ４リガーゼによる自己対合領域を含むオリゴヌクレオチドの環化 り一長鎖二本鎖領域及び２つの適合ループを有するオリゴヌク１７オチドを形成 させることができる付着末端を有した２本の自己対合オリゴヌクレオチド間にお ける２分子反応の例 図７ 八一様々なオリゴヌクレオチド（環状及び直鎖）が異なるエキソヌクレオチド分 解酵素での処理後に移動せしめられたポリアクリルアミドゲルのオートラジオグ ラフオリゴヌクレオチドＣ７の配列は図６０で記載された配列である。オリゴヌ クレオチドＣ６及びＣ８は異なる配列たが、但しＣ７と同タイプの構造、即ち中 心二本鎖部分を有する閉鎖構造をとることができる配列から構成される。

オリゴヌクレオチドＣ６、Ｃ７及びＣ８の結合条件は“閉鎖オリゴヌクレオチド の性質及び利点−１″で記載された条件である。結合反応から生じる放射性オリ ゴヌクレオチド（列５〜８）１μｇ又は対応直鎖オリゴヌクレオチド（列１〜４ ）１μｇを後処理なしに（列４及び５）又はアルカリホスファターゼ（列３及び ６）、エキソヌクレアーゼＶ１１（列２及び７）もしくはホスホジェステラーゼ Ｉ　（列１及び８）とのインキュベート後に“閉鎖オリゴヌクレオチドの性質及 び利点−２”で記載された条件下で１５％ポリアクリルアミドゲル／７Ｍ尿素上 において分析した。

Ｌは直鎖オリゴヌクレオチドの移動位置を示す；Ｃは閉鎖オリゴヌクレオチドの 移動位置を示す。

Ｂ−直鎖又は環状オリゴヌクレオチドが血清の存在下でインキュベート後に移動 せしめられたポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ。

直鎖（Ｌ）又は閉鎖（Ｃ）の放射性オリゴヌクレオチドｃ７（その配列は図６Ｃ で示される）１μｇを“閉鎖オリゴヌクレオチドの性質及び利点−１”で記載さ れたように製造及び精製した。１０％牛脂児血清含有ＤＭＥＭの存在下で示され た時間にわたり３７℃でインキュベート後に、生成物は“閉鎖オリゴヌクレオチ ドの性質及び利点−３”で詳述された条件下で１５％ポリアクリルアミドゲル／ ７Ｍ尿素上において分析した。

Ｃ一時間ｔ＝Ｑ〜時間ｔ＝９６ｂ＋において前記のように１０％牛脂児血清中で インキュベート後にオリゴヌクレオチドｃ７Ｌ（直鎖）及びＣ７ｃ（環状）の分 解（前記のようなゲル上での分析により測定される）の図示。

定量するために、オートラジオグラフィーで観察されるバンドの局在化に対応す るゲル断片を切断し、それらの放射能をシンチレーションカウンターでカウント することにより測定した。結果は時間１＝０における放射能と比較した分解率と して表示される。

図８＝ Ａ−直鎖又は環状オリゴヌクレオチドがデオキシリボ又はリボシリーズの相補配 列を含むオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成後に移動せしめられた非変性 ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ。

閉鎖放射性オリゴヌクレオチドｃ７　（Ｃ）３００１１！又は直鎖オリゴヌクレ オチドｃ７　（Ｌ）１６０ｎｇを非相補的オリゴヌクレオチド（列ａ−ｇ）又は Ｃ７の大ループの２１ヌクレオチド（図６Ｃ）に相補的な４２マーオリゴヌクレ オチド（１２；列ｈ　−ｎ　）と共に増量させながらインキュベートした。加え られたコールドオリゴヌクレオチドの量は０（列ａ及びｈ）、３０ｎｇ（ｂ及び ｉ）、６０ｎｇ（ｃ及びｊ）、１５０ｎｇ（ｄ及びｋ）、３００ｎｇ（ｅ及びＩ ）　、７５０ｎｇ（ｆ及びｍ）又は１５００ｎｇ（ｇ及びｎ）である。“閉鎖オ リゴヌクレオチドの性質及び利点−４−１“で記載された条件下におけるハイブ リッド形成後、生成物は２０％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。

矢印は閉鎖（Ｃ）及び直鎖（Ｌ）オリゴヌクレオチドｃ７とｃ　７　Ｌ　／　１ ２及びＣ７Ｃ／１２ノ＼イブリツドの位置について示す。

Ｂ−相補領域を含むオリゴヌクレオチドと／＼イブリッド形成され又はそうされ ずその後に８１ヌクレアーゼで処理された直鎖又は環状オリゴヌクレオチドが移 動せしめられた変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ。

図８Ａで記載されたように合成及び精製された閉鎖（Ｃ）もしくは直鎖（Ｌ）オ リゴヌクレオチドｃ７３００ｎｇ又はコールド４２マーオリゴヌクレオチド（１ ２）３００ｎｇをインビトロで転写され３２Ｐで高比活性に標識された長さ４３ ヌクレオチドのＲＮＡ１＋＋ｇと共にインキュベートした（“閉鎖オリゴヌクレ オチドの性質及び利点−４−２”）。４３マーＲＮＡは大きなループの２１ヌク レオチド＋ｃ７ｃの自己対合領域の６ヌクレオチドに相補的な２７塩基を含む（ 図６０）；それは４２マーオリゴヌクレオチド１２の３７塩基にも相補的である 。ハイブリッド形成後、生成物は“閉鎖オリゴヌクレオチドの性質及び利点−４ −２″で記載された条件下で直接に（列１）、Ｓ１ヌクレアーゼ存在下で３分間 （列３）、３０分間（列４）又はＳ１ヌクレアーゼ非存在下で３０分間（列２） のインキュベート後に２０％ポリアクリルアミドゲル／７Ｍ尿素上において分析 する。

図の左部分（−）は単独でインキュベートされた４３７−ＲＮＡで得られた結果 について示す。

列５：転写後にいかなる処理もうけなかった４３マーＮＡ 矢印は４３マーＲＮＡ、閉鎖ｃ７（Ｃ）及び直鎖ｃ７（Ｌ）オリゴヌクレオチド の位置と保護ＲＮＡ（ＲＮＡ３７．２７及び２１）の位置について示す。

Ｃ−相補領域を含むオリゴリボヌクレオチドとハイブリッド形成され又はそうさ れずその後にＲＮアーゼＨで処理された直鎖又は環状オリゴヌクレオチドが移動 せしめられた変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ。

試験されるオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ４３、ｃ７Ｃ。

ｃ７Ｌ及び１２）とハイブリッド形成条件は図８Ｂで記載された場合と同じであ る。ハイブリッド形成後、反応の生成物は“閉鎖オリゴヌクレオチドの性質及び 利点−５°で記載された条件下においてＲＮアーゼＨの非存在下（−）又は存在 下（＋）でインキュベートし、２０％ポリアクリルアミドゲル／７Ｍ尿素上で分 析した。矢印ハ４３７−ＲＮＡ、　Ｖｒｆａｃ　７　（Ｃ）　又ハ直鎖ｃ　７　 （Ｌ）の位置について示す。

図９゜ 細胞増殖に関する直鎖又は環状オリゴヌクレオチドの効果の分析 図１０： Ｈ３Ｖ−１ウイルスの増殖に関する直鎖又は環状アンチセンスオリゴヌクレオチ ドの阻害効果の研究図１１： 二本鎖直鎖の又は環化で閉鎖されたセンスタイプオリゴヌクレオチドによる転写 因子ＨＮＦ−１の結合性について示す遅延ゲル。この解説で用いられた略号は例 ７で用いられた名称に相当する。

０１　液抽出物なしのＨＮＦ−Ｉ　０ＳＬ０２　ＨＮＩＩ　ＤＳＬ十肝臓核抽出 物１μｇ０３　液抽出物なしのＩＮＦ−Ｉ　ＣｌＯ４１１ＮＦ−Ｉ　ＣＩ＋肝臓 核抽出物１μｇ０５　液抽出物なしの未結合１１８Ｆ−Ｉ　Ｃｌ０６　未結合１ （ＮＦ−Ｉ　ＣＩ＋肝臓核抽出物１μｇＯ７液抽出物なしのＩＮＦ−Ｉ　Ｃ２ ０８１１ＮＦ−Ｉ　Ｃ２＋肝臓核抽出物１μｇ０９　咳抽出物なしの未結合ＩＮ Ｆ−Ｉ　Ｃ２１Ｏ未結合［ＩＮＦ−Ｉ　Ｃ２＋肝臓核抽出物１μｇ＋１　液抽出 物なしの）ＩＮＦ−Ｉ　Ｃ３１２ＨＮＦ−Ｉ　Ｃ３＋肝臓核抽出物ｌａｇ１３　 液抽出物なしの未結合ＨＨＦ−Ｉ　Ｃ３１４未結合ＨＮＦ−Ｉ　Ｃ３＋肝臓核抽 出物１μｇＨＮＦ−Ｉ　Ｃ１、Ｃ２及びＣ３はセンスオリゴヌクレオチドＨＮＦ −Ｉ　Ｃの３つの異なる調製物について表す。

Ａユ 配列が図７Ａで示されたオリゴヌクレオチドを有効に閉鎖／結合させる実験条件 は下記のとおりである：全容量１ｍｌ中５′末端において（７−３２Ｐ）−ＡＴ Ｐで標識された１１ＰＭ直鎖オリゴヌクレオチド（１５０μｇ：比活性＝　２〜 ３　ｘ　１０５ｃｐｍ／μｇ）、ｐＨ７，８の５０ｍ１リスＨＣ１，１０ｍＭＭ ｇＣＩ　２０ｍＭＤＴＴ、Ｍ２ゝ ＡＴＰ中１　ｍＭＢ　Ｓ　Ａ及び１０．０００単位のＴ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガー ゼＣ２０００ｕ／ューイングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ）　）　ｏ　４℃で４８時間インキュベート後、反応混合物をフ ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、無水エタノールで沈 降させ、８０％エタノールで洗浄し、乾燥させる。次いで結合生成物を２０％ポ リアクリルアミドゲル／７Ｍ尿素上で変性電気泳動により未結合オリゴヌクレオ チドから分離する。オリゴヌクレオチドの位置は紫外線でケイ光を発する発色原 を含むプレート上におかれたゲルを２１２ｎｍで照射するケイ光干渉により直接 又は代わりにオートラジオグラフィーにより観察される。結合されたモノマーオ リゴヌクレオチドはその未結合ホモログと比較してスローダウンされた移動によ り特徴化される（図７Ａ及びＢ）。閉鎖されたモノマーオリゴヌクレオチド及び その未結合直鎖ホモログに相当するバンドをゲルから切出し、ＤＮＡをポリアク リルアミドゲルから慣用的抽出技術により単離する。問題の配列のケースにおい て、閉鎖されたモノマーオリゴヌクレオチドの形成収率は６５〜７５％程度であ る。

一方、結合反応の生成物は結合培地を９０℃で２分間加熱することでＤＮＡリガ ーゼの不活性化後に事前精製なしで直接分析してもよい。

我々はアルカリホスファターゼ（ＤＮＡ及びＲＮＡの３′及び５′リン酸を加水 分解するホスホモノエステラーゼ）、エキソヌクレアーゼＶ１１（３”及び５′ 末端の双方から一本鎖ＤＮＡを切断するエキソデオキシリボヌクレアーゼ）及び ホスホジェステラーゼＩ　（３”−ＯＨからＤＮＡ又はＲＮＡを切断するエキソ ヌクレアーゼ）の作用に対する環状及び直鎖オリゴヌクレオチドの耐性について 比較した。

この実験のために、配列が図７Ａで示された〔５′−３２Ｐ〕オリゴヌクレオチ ドを前記のように製造した（セクション１）。結合後、反応混合物はＤ　Ｎ　Ａ 　ＩＪガーゼを不活性化するために９０℃で２分間加熱した。

結合反応から生じるオリゴヌクレオチド１μｇ又はコントロールとして用いられ る非環化相同的直鎖オリゴヌクレオチド１μｇをｐＨ７，５の５０ｍＭトリスＨ ＣＩ。

１０ｍＭＭｇ　Ｃｌ　２０ｍＭＤＴＴの１ｏｕｄ容量中３７℃において１単位の 子牛腸ホスファターゼＣＣＩ　Ｐ）もしくは１単位の大腸菌エキソヌクレアーゼ Ｖ１１の存在下で１時間又は５Ｘ１０−５単位のクロタルス・デュリサス（Ｃ＋ ｏ＋ａｌｕ＋　ｄｕｒｉ＋ｓｕ＋）ホスホジェステラーゼ■の存在下で１０分間 にわたりインキュベートした。インキュベート後、反応の生成物を変性条件下に おいて１５％ポリアクリルアミドゲル上で分析する。ゲルの結果は図７Ａで示さ れている。

以下のことがこのゲルのオートラジオグラフで観察される 一環状、閉鎖オリゴヌクレオチドはホスファターゼに耐性であり、一方直鎖オリ ゴヌクレオチドはそれに感受性であるニ 一環状、閉鎖オリゴヌクレオチドはエキソヌクレアーゼＶＩＩの作用に耐性であ り、一方直鎖オリゴヌクレオチドはそれに感受性である； 一環状、閉鎖オリゴヌクレオチドはホスホジェステラーゼＩの作用に耐性であり 、一方直鎖オリゴヌクレオチドはそれに感受性である； この実験は前記のように製造されたオリゴヌクレオチドが実際に共有で閉鎖され た環状分子であり、これらの分子がエキソヌクレオチド分解酵素に全耐性を有す ることを示している。

環状、閉鎖オリゴヌクレオチドはそれらが血清の存在下でインキュベートされた 場合に直鎖オリゴヌクレオチドの場合よりも大きなヌクレオチド分解耐性を有す る。

閉鎖オリゴヌクレオチド１μｇ及びセクション１で記載されたように結合後に製 造及び精製された対応直鎖オリゴヌクレオチド１μｇを１０％牛脂児血清含有Ｄ ＭＥＭ培地１０μｌ中３７℃でインキュベートする。

反応の速度を９６時間以内でモニターし、間隔をおいて採取されたサンプルを変 性条件下１５％ポリアクリルアミドゲル上で分析する。２４時間にわたり分解を 分析するゲルのオートラジオグラフは図７Ｂで示されている。

図７Ｃは前記条件下で環状オリゴヌクレオチド（ｃ７Ｃ）の分解と比較した直鎖 オリゴヌクレオチド（ｃ７Ｌ）の分解の９６時間にわたる研究の図示である。

このグラフはこれら２タイプのオリゴヌクレオチド間における安定性に関してか なりの差異を立証している。

これらの実験から下記結論を導くことができるニー直鎖オリゴヌクレオチドは血 清中でヌクレアーゼにより急速に分解される。分解は最初１分間のインキュベー トから起こり始め、数時間後に完了する；−未修正正常直鎖オリゴヌクレオチド の半減期は１時間よりもかなり短くか、この時間は用いられる血清に従い正又は 負の方向にわずかに変化することができる；−直鎖オリゴヌクレオチドの分解は 漸進的であり、鎖長を減少させて時間の経過に従い次第に短くなった分解産物の 出現が観察されるが、これは分解が主にエキソヌクレアーゼ、特に３′エキソヌ クレアーゼの結果であることを示している； 一対照的に、閉鎖オリゴヌクレオチドは血清酵素によるヌクレオチド分解に耐性 であり、６０％以下の分解産物変換率が３７℃で９６時間（４日間）のインキュ ベート後であっても観察される。

一血清中における閉鎖、環状オリゴヌクレオチドの半減期は２４時間よりもかな り長い。

これらの結果は血清中におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解が主にエ ンドヌクレアーゼではなくエキソヌクレアーゼの結果であることを確認させ、分 解に対する閉鎖オリゴヌクレオチドの耐性について証明している。

特別な化学的修正をうけていない天然閉鎖オリゴヌクレオチドは修正誘導体に関 して記載された耐性と類似した血清ヌクレアーゼ耐性を存する。このため、この 実験は血清の存在下におけるオリゴヌクレオチドのインキュベートの標準条件下 で本発明の主題を形成する閉鎖オリゴヌクレオチドが直鎖オリゴヌクレオチドと 比べて有意の利点を有することを示している。

例４ デオキシリポジリーズの閉鎖オリゴヌクレオチドとＤＮＡ及びＲＮＡとのハイブ リッド形成アンチセンス効果を有するためには、アンチセンスオリゴヌクレオチ ドは安定性の満足できる条件下でそれらのターゲットとハイブリッド形成できね ばならない。我々は閉鎖オリゴヌクレオチドとリボシリーズ又はデオキシリポジ リーズいずれかの相補配列を有するポリヌクレオチドとのハイブリッド形成につ いて分析した。

例４−１ 閉鎖オリゴヌクレオチドと直鎖ＤＮＡとのハイブリッド形成の証明 前記のように製造及び精製された閉鎖、環状オリゴヌクレオチド３００ｍｇ又は コントロールとして直鎖相同性オリゴヌクレオチド１６０ｎｇを閉鎖構造で大ル ープを形成する２１塩基と相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む長さ４２ヌク レオチドのコールドオリゴマーと共にインキュベートする（図６０の配列参照） 。標識オリゴヌクレオチド対コールド相補的オリゴヌクレオチドのモル比は１０ ：１〜１：５である。ハイブリッド形成はｌＸ５ＳＣ（１５０ｍＭＮａＣＩ、１ ５０１Ｍクエン酸Ｎ　ａ　ａ、ｐＨ７，０）中３７℃で１時間かけて生じる。イ ンキュベート後、生成物は非変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分析する。

ゲルのオートラジオグラフィーの結果は図８Ａで示されている。

一本鎖及び二本鎖位置間のバンドのシフト速度は直鎖オリゴヌクレオチド及び閉 鎖オリゴヌクレオチドに関して同一であることがこのゲルで観察される。この結 果は閉鎖オリゴヌクレオチドと相補的ＤＮＡとのハイブリッド形成効力が直鎖オ リゴヌクレオチドと相補配列との場合に一致することを意味している。

例４−２ 閉鎖オリゴヌクレオチドと直鎖ＲＮＡとのハイブリッド形成の地図化 下記実験は、閉鎖デオキシリボヌクレオチドと、閉鎖オリゴヌクレオチドのルー プ化領域に相補的な配列を含むオリゴリボヌクレオチドとのハイブリッド形成に ついて二本鎖領域の位置を８１ヌクレアーゼ保護技術により分析することからな る。Ｓ１ヌクレアーゼは一本鎖核酸に特異的なエンドヌクレアーゼであり、非対 合配列のみを切断する。それは二本鎖形である領域を地図化して一本鎖領域と区 別させつる酵素である。

前記のように合成及び精製された閉鎖オリゴヌクレオチドは閉鎖オリゴヌクレオ チドのループの２１ヌクレオチドと自己対合領域に関与するヌクレオチドの６つ に相補的な２７塩基の配列を含む長さ４３ヌクレオチドの直鎖ＲＮＡと共にイン キュベートする（図６０の配列参照）。このＲＮＡを合成鋳型からＴ７ＲＮＡポ リメラーゼで転写し、［α　Ｐ］−ＡＴＰで高比活性（２，３Ｘ　１０８ｃｐｍ ／μｇ）に標識した。転写後、転写されたＲＮＡを１５％ポリアクリルアミドゲ ル／７Ｍ尿素上で電気泳動により精製し、ゲルから溶出させ、エタノールで沈降 させ、しかる復水に懸濁する。

閉鎖オリゴヌクレオチド又はその直鎖ホモログ３００ｎｇと０．１５Ｍ　ＮａＣ ｌ５ｐＨ７，９の０．１Ｍへペス、０．３ｍＭＥＤＴＡ中ＲＮＡ１ｎｇとの３７ ℃で１時間のインキュベート後に、反応混合物を５０ｍＭＮａＣ１゜ｐＨ４，４ の３３ｍＭ酢酸ナトリウム及び３０ＭＭ３０分間後に採取し、得られた生成物を 変性条件下で２０％ポリアクリルアミドゲル上で分析する。コントロールとして 、放射性ＲＮＡも３７ヌクレオチドにわたりＲＮＡと相補的な直鎖オリゴヌクレ オチドの存在下において同一条件下でインキュベートした。

この実験の結果は図８Ｂで示されている。

以下がこのゲルで観察されるニ ー相補的オリゴヌクレオチドの非存在下又は非相補的オリゴヌクレオチドの存在 下でインキュベートされたＲＮＡは事実上ハイブリッド形成されず、ｓ１ヌクレ アーゼで完全に切断される； 一コントロール直鎖オリゴヌクレオチドと共にインキュベートされたＲＮＡは相 補配列の長さに相当する３７ヌクレオチドの長さにわたり切断から保護される； ３゜分間のインキュベート後、保護特性は二本鎖分子の“ブリージング（ｂ＋ａ ａｔｈｉｎｇ）”に相当する各々３５及び３４ヌクレオチドの２つの主要バンド の辺りに集中されるバンドの方にシフトされる； 一閉鎖オリゴヌクレオチドと共にインキュベートされたＲＮＡは特徴的な保護特 性を有し、いくつかのバンドが主要バンドに相当する長さ２７ヌクレオチドのバ ンドの辺りに集中される分布に従い広がる；３０分間のインキュベート後、主な 保護バンドは２０及び２１ヌクレオチドに位置する； 一環化されたオリゴヌクレオチドと同配列だが但し直鎖であるオリゴヌクレオチ ドとＲＮＡとのインキュベートで観察された保護特性は環化されたオリゴヌクレ オチドの場合と同一である； −このため、閉鎖オリゴヌクレオチドによるＲＮＡの保護パターンはＲＮＡとオ リゴヌクレオチドの環状ループとのハイブリッド形成が２１ヌクレオチドであっ てこのためループの全体を含む最適の長さにわたり生じることを示す。相補ＲＮ Ａはそれとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドの二本鎖部分において対合 ヌクレオチドに代わることもできる。

この実験は閉鎖オリゴヌクレオチドとループに相補的な領域を含むＲＮＡとのハ イブリッド形成が標準条件の温度及びイオン強度下で生じ、それにより形成され たハイブリッドが８１ヌクレアーゼに耐性な二本鎖分子の正常な特徴を有するこ とを証明している。

例５ 閉鎖、環化オリゴヌクレオチドと直鎖ＲＮＡとで形成されたハイブリッドによる ＲＮア〜ゼＨ活性の活性化メツセンジャーＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド のアンチセンス効果は多くのケースでそれにより形成された基質に対する細胞性 ＲＮアーゼＨの作用の結果であることが知られる。ＲＮＮアーゼはＲＮＡ／ＤＮ Ａハイブリッドの形で存在するときにＲＮＡを分解する酵素活性である。このた め、我々は閉鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと直鎖ＲＮＡとのハイブリッド 形成がＲＮアーゼＨ用の基質を実際に形成することを調べた。

この実験に用いられた直鎖ＲＮＡの構造とその製造は前セクションで記載された 。

閉鎖オリゴヌクレオチド又はその直鎖ホモログ３００ｎｇとアンチセンスオリゴ ヌクレオチドのループ化部分に相補的な領域を含む放射性ＲＮＡ１ｎｇ（２，３ ｘｌＯ８ｃｐｍ／μｇ）とのハイブリッド形成をセクション４−２で記載された 条件下で実施する。これらの条件はＲＮＡの全体と相補的ＤＮＡとのハイブリッ ド形成について用意する。ハイブリッド形成反応はＤＮＡにより“駆動”される と言われる。インキュベート後に容量を１０倍希釈し、インキュベート緩衝液を ｐＨ７，５の２０１１ＩＭトリスＨＣｌ、　１００ｍＭＫＣＩ、Ｉ　ＱｍＭＭｇ ＣＩ　０．　１ｍＭ２ゝ ＤＴＴに調整し、２単位のＲＮＮアーゼを加える。混合物を３７℃で２０分間イ ンキュベートし、反応の生成物を前記のように分析する。ゲルの結果は図８０で 示されている。

以下がこのゲルで観察される。

一相補的ＤＮＡ配列とハイブリッド形成しない標識ＲＮＡはＲＮＮアーゼの作用 に完全に耐性である；〜ＲＮＡの３７塩基に相補的なコントロール直鎖オリゴヌ クレオチドとハイブリッド形成した長さ４３ヌクレオチドの標識ＲＮＡはＲＮＮ アーゼの作用に部分的に感受性になり、分解産物を与える； 一ループがＲＮＡの２１ヌクレオチドに相補的な閉鎖オリゴヌクレオチドとハイ ブリッド形成した標識ＲＮＡはＲＮＮアーゼの作用に非常に感受性になり、長さ が前セクションで記載されたＳ１保護の分析き適合する一連の分解産物を与える 。

実際に、ＲＮＮアーゼ用基質の誘導実験はＳ１保護実験の鏡象であり、双方のケ ースで得られた結果は全く一致し、双方とも類似したハイブリッド形成位置を示 し、ＲＮアーゼＨ用の基質が直鎖ＲＮＡと環状オリゴデオキシリボヌクレオチド とのハイブリッド形成により造られることを示す。

このため、この実験は閉鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドと部分的にハイブリ ッド形成した直鎖ＲＮＡがＲＮアーゼＨ用の基質になることを示し、ターゲット メツセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成した環状ＤＮＡがこうして形成された 基質においてこの酵素の作用によりアンチセンス効果を発揮できることを意味す る。加えて、この実験は濃度の同一実験条件下で環状ＲＮＡ／ＤＮＡ基質が直鎖 ＲＮ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａ基質よりも大きなＲＮＮアーゼによる分解を起こすことも 示す。このように、すべて他のファクターが等しい同一条件下において、環状ア ンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドは直鎖アンチセンスオリゴヌクレオ チドにはない利点を更に有理状アンチセンスオリゴヌクレオチドによる単純ヘル ペスウィルスｌ型（Ｈ３Ｖ−１）の増殖の阻害配列が以下で示されたオリゴヌク レオチドＧＴを合成し、環化させ又はそうせず、直鎖形又は環状形のいずれかで ここで記載された実験に用いた。

１−実験プロトコール オリゴヌクレオチドＧＴの配列及び環化ＧＴの配列： ５’ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＣＧＴ　ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧＧ　ＡＡＧ　ＣＧＧ　Ｃ ３’化学的環化を有効に生じさせるために、オリゴヌクレオチドＧＴを３−Ｐ形 で合成し、環化させて、下記部分的相補配列のオリゴヌクレオチド：　５’ＣＣ Ａ　ＣＧＣＣＧ　３’　とのハイブリッド形成により５′及び３−Ｐ末端を位置 決めした。

用いられた結合条件は下記のとおりである：オリゴヌクレオチドＧＴ１００μｇ 当たり：相補的オリゴヌクレオチド１００μｇ ｐＨ７，４の０．２５Ｍ　ＭＥＳ ２０　ｍＷＭ　ｇ　ＣＩ　２ ０．２Ｍ　ＣｎＢｒ 反応液容量＋　５００μ！ ４℃で３０分間のインキュベート。反応は１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム及 び２．５倍容量の無水エタノールを加えることで停止させ、オリゴヌクレオチド を沈降させ、変性ポリアクリルアミドゲル上で精製する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在又は非存在下における細胞の感染 細胞〔ベロ（Ｖｅ「ｏ）細胞、ＡＴＣＣ−継代１２１−５又は１０％ＦＣ８，Ｌ −グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充され たＭＥＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で培養〕を感染前日に２ａＩｌウエル当 たり５×１０４細胞の密度まで継代培養する。１６〜２４時間後、細胞をオリゴ ヌクレオチドの存在又は非存在下３　ｐｆｕ／細胞の感染多重度でＨ３Ｖ−ＩＦ により感染させる。

オリゴヌクレオチドを５０μｌの容量で加えられるように望ましい最終濃度の２ 倍濃度まで無血清培地で希釈する。ウィルスもオリゴヌクレオチドの５分間後に ５０μｌの容量で加える。こうして細胞を１５分間毎に榎やかに攪拌しながら３ ７℃で１時間にわたり１００μ！の容量（オリゴヌクレオチド５０μ！＋ウイル ス５０μりで処理する。一方、オリゴヌクレオチドは感染の数時間前に加えても よい。

１時間のインキュベート後に培地を吸引し、５００μ！の完全培地を細胞に加え る。インキュベートは２４時間続けてからプレートを液体窒素で凍結させること により停止させる。

すべての阻害測定は二重又は三重に行う。

ウィルスの滴定 ウィルスは液体窒素凍結／３７℃解凍の３回の急速サイクル後に培地で直接回収 する。次いでそれらを無血清培地で希釈して、現実の滴定を行う。

インジケーター細胞は完全培地において１０５細胞／２ａｌウエルで前日に継代 培養する。

翌日に培地を吸引し、異なる希釈液１００μＩ／ウエルを導入する。１５分間毎 に攪拌しながら３７℃で１時間のインキュベート後に培地を吸引し、細胞を３７ ℃で３日間にわたり１．２％メチルセルロース（最終血清濃度２．５％）含有の 完全培地でカバーする。

３日間後に培地を除去し、細胞をＰ　Ｂ　Ｓ／１０％ホルマリン（３７％溶Ｉ＆ ）で２０分間かけて固定し、しかる後２％クリスタルバイオレット（Ｐ　Ｂ　Ｓ ／２０％エタノール中）で２０分間かけて染色する。次いでプレートをリンスし 、プラークを暗視野照明で顕微鏡を用いて透明性によりカウントする。滴定は各 ポイントで二重に行う。

阻害の計算はオリゴヌクレオチドの非存在下で観察されたウィルス力価と比較し て行う。

２−贅り 一細胞増殖に関する環状オリゴヌクレオチドの効果の分析 図９は、細胞単独の正常な増殖と比較して、様々な直鎖又は環状オリゴヌクレオ チドの存在下における細胞（ベロ細胞）増殖の測定の結果について示す。この実 験において、オリゴヌクレオチドは２０ＭＭの濃度で用いた。

結果は増殖曲線が重り合うことを示している。直鎖又は環状オリゴヌクレオチド は細胞増殖に関していがなる毒性効果も示さないようである。

−Ｈ５Ｖ−１の増殖に関する環状オリゴヌクレオチドの効果の分析 この実験において、直鎖形又は環状形におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド ＧＴ（その配列は前記されている）の効果を比較した。２つの異なる阻害条件を 比較した。Ａではアンチセンス化合物を感染時に加え、一方Ｂではそれらを感染 の４時間前に培地中に導入する。図１０で示された結果は環状アンチセンスオリ ゴヌクレオチドがウィルス増殖を阻害することを証明している。阻害は２μＭで ３０％であり、５μＭで６Ｓ％に達する。

これらの低い濃度において、環状オリゴヌクレオチドは直鎖オリゴヌクレオチド の場合よりも大きな阻害効果を配列がｌｆｆ１５−Ｂで示されたオリゴヌクレオ チドの効果的な結合が起きることを可能にする実験条件は例１で記載された場合 と同様である。

次いで、結合産物を１２％ポリアクリルアミドゲル７７Ｍ尿素で変性電気泳動に より分析する。

遅延ゲル試験に用いられる標識された閉鎖センスオリゴヌクレオチドの製造に関 して、条件は下記のとおりである： ２２　ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドを１０μｌの容量中〔γ−３２Ｐ〕−ＡＴ Ｐ　（比活性２〜５　ｘ　１０８ｃｐｍ／μｇ）、ｐＨ７，８の５０ｍＭｈ　Ｉ ＪスＨｃ　ｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ　２．２０ｍＭＤＴＴ、１＋ＩＩＭＡＴＰ、１ ｍＭＢＳＡ及び４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで５′末端において標識する。

インキュベートは１６℃で２時間行う。結合産物を１２％ポリアクリルアミドゲ ル／７Ｍ尿素で変性電気泳動により精製し、閉鎖オリゴヌクレオチドに相当する バンドをオートラジオグラフィーにより検出し、ゲルから切出し、ＤＮＡをポリ アクリルアミドゲルからの抽出に関する慣用的技術により単離する。

一方、結合反応の生成物は結合培地を２分間かけて９０℃に加熱することによる ＤＮＡリガーゼの不活性化、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール 抽出、同伴剤としてグリコーゲン２０μｇの存在下における無水アルコールでの 沈降及び８０％アルコールでの洗浄の後で先に精製せずに用いる。

“センス”オリゴヌクレオチドはそれらが血清の存在下でインキュベートされた 場合にヌクレオチド分解耐性を宵する。環化オリゴヌクレオチドの耐性と直鎖の 二本鎖オリゴヌクレオチドの場合との間で行われた比較では図７−Ｃで示された 場合と同様の結果を示す。すべてのケースにおいて、閉鎖オリゴヌクレオチドは 非閉鎖オリゴヌクレオチドの場合よりも大きな耐性を有する。閉鎖センスオリゴ ヌクレオチドの半減期は遊離３′及び５′末端を有する非閉鎖二本鎖の直鎖オリ ゴヌクレオチドの場合よりも少くとも１０倍長い。

３−自己対台形で認識配列を含むセンスタイプ環状オリゴヌクレオチドによる転 写因子ＩＮＦ−’ｌの結合の証明下記実験は配列が以下で示されるオリゴヌクレ オチドで実施した： ＨＮＦ−１、未結合： ＨＮＦ−１、環状（ＨＮＦ−Ｉ　Ｃ）：ＨＮＦ−１、二本鎖の直鎖（ＨＮＦ−Ｉ 　ＤＳＬ）ニーＧ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−’ｌ’−Ｔ−Ａ−Ａ−τ−Ｇ−Ａ−τ −Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ− Ｔ−丁−Ａ−Ｃ−丁−Ａ−Ｇ−Ａ−τ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−我々は未結合 の又はＴ４リガーゼの作用により閉鎖された二本鎖の直鎖オリゴヌクレオチド、 ヘアピン形オリゴヌクレオチド及び環状オリゴヌクレオチドに対する（肝臓液抽 出物から得られた）転写因子ＩＮＦ−１の結合効力を比較した（用いられた環状 オリゴヌクレオチドの配列は図５−Ｂで示されている）。

３　ｆｍｏｌの各オリゴヌクレオチド（二本鎖の直鎖オリゴヌクレオチドの場合 で比活性７０００　ｃｐＩｌ／１ｏｏｌ及び他のオリゴヌクレオチドの場合で３ ５００　ｃｐｍ／Ｉｍｏｌ）を１４μｌの最終容量中において非特異的競合物質 としてポリ（ｄＩ−ｄＣ）　・ポリ（ｄＩ−ｄＣ）１．５μｇ及び超音波処理サ ケ精子ＤＮＡ２５０ｎｇの存在下、ｐＨ７，９の１０ｍ１Ｊヘペス、５０ｍＭＫ Ｃｌ、　１０％グリセロール、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＤＴＴ、０．５ ｍＭＰＭＳＦ。

６ｍＭＭｇＣ１６ｍＭスペルミン中で肝臓液タンパク質２ゝ 抽出物１μｇと共にインキュベートする。４℃で１０分間後、反応混合物とタン パク質の添加が省略されたコントロールを天然６％ポリアクリルアミドゲル１０ ．２５ｘＴＢＥ上にスポットする。移動が完了したとき、ゲルを１０％酢酸、１ ０％メタノール溶液中で固定し、３　Ｍ　Ｍペーパー上に移し、乾燥させ、オー トラジオグラフィーに付す。この実験の結果は図１１で示されている。

以下が観察される： １、閉鎖環状オリゴヌクレオチドに対する転写因子の結合親和性は二本鎖の直鎖 オリゴヌクレオチドに対して（又はヘアピン形オリゴヌクレオチドに対して；結 果はここで示されていない）観察された結合性と同様である。

このため、このような構造は特異的ＤＮＡ配列と結合する転写因子、トランスア クチベーター又はいずれか他のタンパク質に結合する剤として用いてよい。

２、未結合環状オリゴヌクレオチドへの転写因子ＨＮＦ−１の結合性はりガーゼ の作用により環化されたオリゴヌクレオチドに対して観察される場合よりも５〜 １０倍少ない。センスオリゴヌクレオチドにおける結合の部位は二本鎖部分に集 中し、ＨＮＦ−１ダイマーの結合部位を構成する偽パリンドロームの軸に相当す る。このため“ニック”の存在はＤＮＡ／タンパク質結合を不安定にする。この 結果はＴ４リガーゼで処理された“センス”環状オリゴヌクレオチドの閉鎖性質 について確認している。

明細書で引用された参考文献 ｋｎｄｒｕｍ、入、；　Ｇｅｉｇａｒ、’ｒ、；　Ｚｏｎ、　ｃ、（１９Ｂ９） 、　Ｎｕｃｌｅｏｉｌｄａｚ　Ｎｕｃｌａｏ−ｔｌｄａｚ、８．　５−６．　９ ６７−８Ａｎｆｏｓｓｉ、Ｇｉｏｖａｎｎ幻Ｇｅｗｉｒｔｚ、ＡｌａｎＭ、；Ｃ ａ１ａｂｒａｔｔａ、Ｂｒｕｎｏ。

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Ｎｕｃｌｍｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ５ｐ　１５．１０５０７−１０５２１Ｆｒａ ｎｃｏｉｓ　ＪＣ；　Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｓｈｍｏａｒａｓ　Ｔ；　Ｂａｒｂｉａ ｒ　Ｃ；　Ｃｈａｓｇｉｇｎｏｌ　拘τｈｕｏｎｇＮＴ；　Ｈｅ１ｅｎｅＣ，（ １９Ｂ９）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ｓｃｌ、８６゜９フ０２−９７０ ６ Ｆｒａｎｃｏｉｓ　ＪＣ；　Ｓａｉｓｏｎ−Ｂａｈｍｏａｒａｓ　Ｔ；　Ｃｈａ ｇｓｉｇｎｏｌ　町Ｔｈｕｏｎｇ　８７）Ｈｓｌａｎｅ　Ｃ，（１９８り）、Ｊ 　ＢｌｏＩ　Ｃｈａｍ、２６４　５８９１−５８９８Ｆｒａｎｃｏｉｓ　ＪＣＨ Ｓａｉｓｏｎ−Ｂａｈｍｏａｒａｓ　Ｔ；　Ｈｅ１ｅｎｅ　Ｃ，（１９８８）　 、　ＮｕｃｌｍｌｃＡｃｌｄｚ　Ｒｏｓｙ　ユ６．　１１４３１−１１４４０Ｆ ｒａｎｃｏｉｇ　ＪＣ；　Ｓａｌｍｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｇ　Ｔ；　Ｔｈｕｏ ｎｇ　ＮＴ；　Ｈｅ１ａｎａ　Ｃ。

（１９８９）、　ＢｌｏｃｈａｒＩＬｉｓｔｒｙ、　２８．９６１７−９６１９ Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、Ｂ、Ｃ，、Ｎｇ、Ｐ　及び　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ、 （１９８６）Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｓ、、１４．　５３９９Ｇａｇｎｏｒ、Ｃ，、Ｂｓｒｔｒａｎ ｄ、Ｊ、Ｒ，、τｈａｎｅｔ、Ｓ、、　Ｌａｍａｉｔｒｅ、Ｍ、。

Ｍｏｒｖａｎ、　Ｆ、、　Ｒａｙｎａｒ、　Ｂ、、　Ｍｎ１ｖｙ、　Ｃ，、Ｌｅ ｂｌａｕ、　Ｂ、。

工ｍｂａｃｈ、　Ｊ、Ｌ、、　Ｐａｏｌｅｔｔｉ、　Ｃ，、、（１９８７）、　 Ｎｕｃｌａｌｃ　Ａｃ１ｄｚ　Ｒａｇ、　１５ｙＧａｏ、Ｗ、、５ｔａｉｎ、Ｃ ，Ａ、、Ｃｏｈｅｎ、Ｊ、Ｓ、、Ｄｕｔｅｈｍａｎｎ、Ｇ、及びＣｈｅｎｇ、　 Ｙ、Ｃ，、（１９８Ｂ）、　Ｊ、　Ｅｌｏｌ、　Ｃｈａｍ、、　２６４１１５２ １−１１５３２Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、　Ｊｏｈｎ；　Ａｇｒａｖａｌ、５ｕｃＬ ｉｉｒＨＣ１ｖａｉｒａ、Ｍａｒｉａ　Ｐ弓５ａｒｉｎ、　Ｐｒａｍ　Ｓ、＋　 Ｓｕｎ、Ｄａｉｓｙ；　Ｚａｍｅｃｎｉｋ、Ｐａｕｌ　Ｃ，、（１９８８）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃ１．　Ｕ、Ｓ、Ａ、、１３５．　５ ５０７−１１Ｈａｇａｌｏｆｆ　に　Ｇａｒｌａｃｈ　ＫＬ、　（１９８８）、 　Ｈａｔｕｒｍ、　３３４．５８５−９１Ｍｅｌｅｎａ　Ｃ，（１９８９）　Ｓ ｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ、６０．　１５７−６０ＨｅｌａｎｅＣ；　Ｔｈｕｏｎｇ 　ＮＩｒ、　（１９ｅｓ）、　Ｅｐｏｃｈｅｓ　Ｐｈａｒｍａｅｏｌ、　３フ。

１７９フー１７９８ Ｊ＠ｆｆｒＬｅｓＡＣ；　Ｓｙｍｏｎｓ　ＲＨ，（１９Ｅ１９）、ＮｕＣｌａｉ ＣＡＣｌｄｌ　ＲｍＭ、１７゜Ｊａｇｓｕｓ　Ｃ；　Ｃｈｅｖｒｉｅｒ　均０ｚ ｏｎ　Ｒ；　Ｈａｌａｎｅ　Ｃ；　Ｃａｚａｎａｖｅ　Ｃ。

（１９ｇ９１．　にａｎ（７２，３１１−３１２Ｋａｂａｎｏｖ、　Ａ、　Ｖ、 ；　Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ、　Ｓ、　Ｖ弓（）ｖｃｈａｒｅｎｋｏ、　Ａ、　Ｖ 、；Ｋｒｉｖｏｎｏｇ、　Ａ、　Ｖ、；　Ｍｅｌｉｋ−Ｎｕｂａｒｏｖ、　Ｎ、 Ｓ、；　Ｋ１５ｅｌａｖ、　Ｖ、　１弓５ｅｖｅｒｉｎ、　Ｅ、　Ｓ、、（１９ ９０）、　ＦＥＢＳ　Ｌａｔｔ、、　２５９．３２７−３０ＴＡ　Ｄｏａｎ　Ｔ ；　Ｃｈａｖａｎｙ　Ｃ；　Ｍｅｌｅｎａ　Ｃ，（１９８９）　Ｅｕ１ｌ　Ｃａ ｎｃｅｒ、７６゜Ｌ＠ｏｎａｔｔｉ、　Ｊ、Ｐ、／　Ｄｅｇｏｌｓ、　Ｇ、、Ｋ １１ｈａｕｄ、　Ｐ、ｐ　Ｇａｇｎｏｒ、　Ｃ−ｔＬａｍａｉｔｒａ、　Ｍ、、 　Ｌｅｂｌａｕ、　Ｂ、、　（１９８９）、　ＮｕｃｌｍｏｓｌｄｗＮｕｃｌａ ｏｔｌｄｅｚ、　Ａｃ５−６，８２５−８ Ｍａｈｅｒ、　Ｌｏｕｉｓ　Ｊ、Ｘエエ；　Ｄｏｌｎｉｃｋ、　Ｂｒｕｃｅ　Ｊ 、、（１９８Ｂ）、ＮｕｃｌｅｌｃＡｃｉｄｓ　Ｒａｇ、、１６．　３３４１− ５８Ｓｈｅｌｄｏｎ　ＣＣ；　５ｐｍｏｎｓ　ＲＨ，（１９８９）、Ｎｕｃｌａ ｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｇ、１７゜Ｐｒｏｃ　Ｈａｔｌ　Ａｃａｄ　ＳｃＬ　８ ６．９１９Ｂ−９２０２Ｓｙｍｏｎｍ　ＲＥ、（１９８９）、　Ｔｒｅｎｄｓ　 ＢＬＯｃｈａｒａ　Ｓｃ１．１４．４４５−５０Ｓｙｍｏｎｇ　ＲＨ；　Ｈｕｔ ｃｈｉｎｓ　ＣＭ；　Ｆｏｒｓｔｅｒ　ＡＣ；　Ｒａｔｈｊｅｎ　ＰＩＪ　Ｋｌ ｌ＠！ｌ＠　Ｐ；Ｖｉｓｖａｄｅｒ　ＪＥ、（１９８７）、　Ｊ　Ｃａ１ｌ　５ ｅＩ　５ｕｐｐｌ、　７．３０３−１８Ｔｏｒｔｏｒａ、　Ｇｉａｍｐａｏｌｏ ；　Ｃ１ａｉｒ、　ＴｉＪｎｏｔｈｙ；　Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ、　Ｙｏｏｎ　Ｓ ａｎｇ。

（１９９０）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．Ｕ、Ｓ、Ａ、、８フ、 　フ０５０５−８Ｔｏｕ１　Ｊに　Ｋｘｉｓｃｈ　ＫＭｉ　Ｌｏｚａａｕ　Ｎ； 　Ｔｈｕｏｎｇ　ＮＴ；　Ｍｅｌｅｎａ　Ｃ。

（１９８６）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ１．　８３．　１２２フ− ３１Ｔｒｕｎｑ　Ｌｅ　Ｄｏａｎ；　Ｐｅｒｒｏｕａｕｌｔ　恥Ｃｈａｓ＋ｓ＋ ｉｇｎｏｌ　均Ｎｇｕｙｅｎ　ＴＴ；Ｍｅｌｏｎｓ　ｃ、　（１９８７）、　Ｎ ｕｃｌａｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒａｇ、　１５．８６４３−７８６５９Ｕｈｌｅｎｂ ｅｃｋ、　０１ｋｅ　Ｃ，、（１９８７）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２８．５９６ −６００Ｕｈｌａｎｂｅｃｋ、　０１ｋａ　Ｃ，ＨＤａｈｍ、　Ｓｕｅ　Ａｎｎ 　Ｃ弓Ｒｕｆｆｎｅｒ、　Ｄｕａｎｅ　Ｅ、；Ｆｅｄｏｒ、Ｍａｒｔｈａ　Ｊ、 、（１９８り）、ＮｕｃｌａＬｃ　ＡｃＬｄＩＳｙｌＩＩＰ、Ｅａｒ、、２１． 　９５−６Ｖａｓｓｓｓｕｒ、　Ｍ、（１９９０）、　Ｂｌｏｆｕｔｕｒ、　Ａ ｐｒｉｌ　１９９０．１Ｂ−２８゜Ｖｅｒｓｐｉａｒｓｎ　Ｐ；　Ｃｏｒｎｅｌ ｉｍｓ＠ｎ　Ａ　町Ｔｈｕｏｎｑ　ＮＴ；　Ｈｅ１ａｎｅ　Ｃ；ＴＯｕｌＪｎ＠ ＪＪ（１９８７）、にｇｓｎｔｔ、６１，３０７−３１５Ｖｌａｓｓｏｖ、Ｖ、 Ｖ、、　Ｚａｒｙｔｏｖａ、Ｖ、Ｆ、、　東ｕｔｉａｖｉｎ、工、Ｖ、。

Ｍｍｎａ＠Ｙ、　Ｓ、Ｖ−及び　Ｐｏｄｙｍｉｎｏｇｉｎ、　Ｍ、％、（１９８ ６）　Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｚ、ｔ１４．４０６５−４０７６゜ Ｗａｎｇ　ＡＨ；　Ｃｏｔｔｏｎｓ　Ｓ；　Ｄｅｒｖａｎ　ＰＢ）　Ｙｓｉｓｉ ｎｏｗｓｋｉ　ＪＰ＋ｖａｎ　ｄ＠ｒ　ＭＡｒｅｌ　ＧＡ；　Ｖａｎ　Ｂｏｏ！ ＩＩ　ＪＨＨ（１９８９）＃　Ｊ　３１０１＋１０１５ｅｒｕｃｅ　ＤＦ＃７． １０１−１７ Ｗａｓｔｅｎａａｎｎ、　Ｐ弓Ｇｒｏｓｓ、　Ｂ弓Ｈｏｉｎｋｉｇ、　Ｇ、；　 （１９８９）、Ｂｌａｍｅｄ。

ＢＬｏｃｈＬｘｎ、　Ａｃｔａ、４Ｂ、８５−９３Ｚｅｒｉａｌ　Ａ；　Ｔｈｕ ｏｎｇ　ＮＴ；　Ｈ＠ｌ＠ｎ＠　Ｃ，（１９Ｂ））、ＨｕｃｌａＬｃ　ＡＣｌｄ ｇ　Ｒａｇ。

１５、　９９０９−９９１９ Ｆ’ｉｇｕｒｅ　ＩＡ Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＢ Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＣ ＦＩＧＵＲＥ　３゜ ＦＩＧＵＲＥ　４．Ａ。

ＦＩＧＵＲＥ　４．Ｂ。

ＦＩＧＵＲＥ　４．Ｃ。

ＦＩＧＵＲＥ　５・日。

ＦＩＧＵＲＥ　６−０゜ ＦＩＧＵＲＥ　７−Ａ Ｃ７ ＦＩＧＵＲＥ　８−Ｂ ＦＩＧＵＲＥ　８−Ｃ Ｆｔｇｕｒｔ　９ Ｆｉ脛ｄ０ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４９１００　Ａ 　９１６４−４ＣＣＯ７Ｈ２１１０４ Ｃ１２Ｎ　１５／１０ ＧＯＩＮ　３３１５０　Ｔ　７０５５−２ＪＩ

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．少くとも部分的に閉鎖された一本鎖構造を形成させるために末端が共有結合 で互いに結合された１以上の一本鎖オリゴヌクレオチド配列からなるオリゴヌク レオチドタイプのアンチセンス又はセンス剤。
2. ２．５′及び３′末端が非ヌクレオチド共有構造で結合された一本鎖オリゴヌク レオチド配列からなる、請求項１に記載のアンチセンス又はセンス剤。
3. ３．５′及び３′末端がヌクレオチド結合で互いに結合された一本鎖オリゴヌク レオチド配列からなる、請求項１に記載のアンチセンス又はセンス剤。
4. ４．オリゴヌクレオチド配列が遊離５′又は３′末端を有しない、請求項１〜３ のいずれか一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
5. ５．化合物のヌクレオチド配列が自己対合できる断片を含まない、請求項１〜４ のいずれか一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
6. ６．化合物のヌクレオチド配列が二本鎖自己対合を形成するために対合できる断 片を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
7. ７．対合できる断片が対合できない断片で分離されうる、請求項６に記載のアン チセンス又はセンス剤。
8. ８．オリゴヌクレオチド配列が天然又は非天然デオキシリポシリーズ又はリポシ リーズのヌクレオチドを含むことができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載 のアンチセンス又はセンス剤。
9. ９．生物活性を有する化合物が閉鎖一本鎖構造上にグラフト化されている、請求 項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
10. １０．成分が非ヌクレオチド共有構造上にグラフト化されている、請求項９に記 載のアンチセンス又はセンス剤。
11. １１．非ヌクレオチド共有構造がペプチド構造である、請求項１〜１０のいずれ か一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
12. １２．非ヌクレオチド共有構造が少くとも部分的に脂質構造である、請求項１〜 １１のいずれか一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
13. １３．オリゴヌクレオチド配列が天然又は非天然デオキシリポシリーズ又はリポ シリーズ単独からなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアンチセンス又 はセンス剤。
14. １４．少くとも１つのオリゴヌクレオチド配列がメッセンジャーＲＮＡ又は天然 ＤＮＡ断片の領域に相補的な配列である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載 のアンチセンス又はセンス剤。
15. １５．少くとも１つのオリゴヌクレオチド配列が天然タンパク質により特異的に 認識される配列に相当する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセン ス又はセンス剤。
16. １６．ＲＮＡでトランス開裂活性を発揮できるポリリボヌクレオチド部分を含む 、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
17. １７．ヌクレオチド配列がメビウスタイプコンホメーションで逆平行及び／又は 平行対合を伴う二本鎖構造をとらせることができる、請求項１〜１６のいずれか 一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
18. １８．オリゴヌクレオチド配列が１０〜２００ヌクレオチドを含む、請求項１〜 １７のいずれか一項に記載のアンチセンス又はセンス剤。
19. １９．オリゴヌクレオチド配列が１０〜１００ヌクレオチドを含む、請求項１８ に記載のアンチセンス又はセンス剤。
20. ２０．化合物の一本鎖の部分又は全化学合成が後者が環化される前に行われた、 請求項１〜１８のいずれか一項で記載された剤の製造方法。
21. ２１．オリゴヌクレオチド配列が生化学方法により得られる、請求項２０に記載 の方法。
22. ２２．治療目的に関する、請求項１〜１９のいずれか一項で記載された剤の適用 法。
23. ２３．剤が抗ウイルス又は抗癌剤として用いられる、請求項２２に記載の剤の適 用法。
24. ２４．剤が天然免疫調節剤の誘導物質として用いられる、請求項２３に記載の適 用法。
25. ２５．剤がインターフェロン誘導物質として用いられる、請求項２４に記載の適 用法。
26. ２６．インビトロ又はインビボ診断剤として請求項１〜１９のいずれか一項に記 載された剤の適用法。
27. ２７．剤が標識された、請求項２６に記載の剤の適用法。
28. ２８．化粧品における請求項１〜１９のいずれか一項に記載された剤の適用法。
29. ２９．請求項１〜１９のいずれか一項に記載された少くとも１種の剤を活性剤と して含有する医薬組成物。
30. ３０．医薬組成物が外部局所経路から投与できる形である、請求項２９に記載の 組成物。
31. ３１．剤が抗ウイルスとして用いられる、請求項３０に記載の組成物。