JPH07508656A - アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ｒｎａ二次構造へのハイブリダイゼーションによるシュード−ハーフ−ノットｒｎａの形成 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡ二次構造へのハイブリダイーゼー ションによるシュードーハーフノットＲＮＡの形成発明の分野 本発明はＲＮＡ活性を調節するための組成物及び方法に関する。オリゴヌクレオ チドは、新規な方法に従ってＲＮＡとハイブリダイズし、ＲＮＡ活性の調節に影 響する。 発明の背景 ＲＮＡの機能を特異的に阻害するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドあるい はりボザイムをデザインする多くの研究者は、ハイプリダイゼーシコンを容易に するために、強固な二次構造をとっている領域を標的とすることは避けるのが一 般的である（Ｅ，ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ．ｆ．Ｓ．Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｋ．Ｍｅｄｌ ｏｃｋ．Ｉ．Ｒｕｉｚ−Ｒａｂｉｅｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．i， ４９．　１５（１９８６））。しかしながら、二次構造をとったＲＮＡは一般に 塩基対の形成に利用できる一重鎖の部分を有している。こうした領域を標的とす ることは、熱力学的、動力学的、あるいは機能的に利点があるかも知れない。例 えば、Ｅ．Ｃｏｌｉにおける天然のアンチセンス認識システムには、ハイブリダ イゼーション速度の速い２個の高次構造を有するヘアピンループの２分子間相互 作用が関わっている（Ｙ．Ｅｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｉｔｏｈ，Ｊ．Ｔｏｍｉｚａｗａ ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ，Ｂｉｏｃｈｅａ＋．６０．６３１（１９９１））。 特異的な調節蛋白質は、例えばＨＩＶ　ＴＡＲやＲＲＥエレメント（Ｃ．　Ｄｉ ｎｇｗａ１１．　Ｉ．　Ｅｒｎｂｅｒｇ，　Ｍ．　Ｊ．　Ｇａｉｔ，　ｅｔ　ａ ｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳ＾８６．@６９２５ （１９８９）　；Ｃ．　Ｄｉｎｇｖａｌｌ，　Ｉ．Ｅｒｎｂｅｒｇ，　Ｍ．　Ｊ ，　Ｇａｉｔ，　ｅｔ　ａｌ，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９．　４１４５（１９９０） 　；Ｓ．　Ｒｏ凵C　Ｕ．　Ｄｅｌｌｉｎｇ，　Ｃ．　−Ｈ．　Ｃｈｅｎ．　Ｃ ．＾．　Ｒｏｓｅｎ．　Ｎ．　Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　 ４．　１３６５（１９９０）　；Ｃ．　Ａ．　Ｒ盾唐■氏C　Ｇ．　Ｎ．　Ｐａ ｖｌａｋｉｓ，　ＡＩＤＳ　４，　４９９（１９９０）　；Ｋ．　Ｍ，　ｌｅｅ ｋｓ，　Ｃ．　Ａｍｐｅ，　Ｓ，　Ｃ，　Ｓｃｈｕｔｚ．　Ｔ．Ａ．　Ｓｔｅｉ 狽噤C　Ｄ．　ＩＩ．　Ｃｒｏｔｈｅｒｓ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１２ ８１（１９９０））　、哺乳動物細胞における鉄応答性エレメント（Ｊ，　Ｌ． 　Ｃａｓｅｙ，麗，　１．　Ｈｅｎｔｚｅ，　Ｄ．　Ｍ．　Ｋｏｅｌｌｅｒ，　 ｅｔ　ａｔ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０，　９２４（１９８８））　、Ｒ　P７ ファージのコ ート蛋白質（Ｇ．　ｆ，　ｆｉｔｈｅｒｅｌｌ，　）ｌ．−Ｎ．Ｗｕ，　Ｏ．　 Ｃ，　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Q９．　１１０５１ （１９ ９０））のように、しばしば二次構造をとったＲＮＡ領域を認識する。 ＲＮＡウィルスは、二次構造をとったＲＮＡ領域に結合することによってウィル スのゲノムのみを特異的に包み込むカプシド蛋白質を有している（Ｍ、　Ｊｕｎ ｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎ、　Ｒ，Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ、　Ｈ，５ｃ ｈａｌｌｅｒ、　ＥＭＢＯＪ、９．３３８９（１９９０））、これらの■■ を標的とすることにより、生物学的な特異性を高めることができる。細胞には、 アンチセンス化合物が密接にあるいは正確に相補的な多くの非標的ＲＮＡ配列が あるであろう。リボザイムは標的ＲＮＡに結合してこれを切断するが、他のアン チセンス分子は標的を切断せず、標的部位において生体分子と効果的に競合しな い場合には意味のある生物学的効果を引き起こさないかもしれない。今のところ 、近付きやすい標的部位を決定する信頼のおける方法は得られていない。 二次構造をとったＲＮＡに結合することに潜在的な有効性があるとの観点から、 二次構造を有する領域に結合する組成物及び方法が望まれていた。 発明の目的 本発明の目的は、ＲＮＡ活性を調節するための組成物、及びそれらの設計と製造 のための方法を提供することである。 さらにはＲＮＡ活性を調節するための方法を提供することである。 これらの目的及び征の目的は、本発明の萌細書及び請求の範囲の記載から、この 分野の通常の技術を有する者には明らかになるであろう。 発明の要約 ＲＮＡ活性を調節するための組成物及び方法を提供する。オリゴヌクレオチドを 特定のＲＮＡの二次構造とハイブリダイズさせて、オリゴヌクレオチドの結合後 はもはやＲＮＡが調節蛋白質によって認識されないようにする。オリゴヌクレオ チド及びＲＮＡ構造は、標的の構造、複合体の安定性、及び熱力学的な分析によ って選択し、機能的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び最適化をする 。オリゴヌクレオチドを、ヘアピンループのようなＲＮＡ二次構造の３°あるい は５°側にハイブリダイズすることにより、いくつかの対のないヌクレオチドが でき、ヘアピンの元のステムに戻る。オリゴヌクレオチドは７−２５個の塩基数 のものが好ましい。ヌクレオシドユニットの２′−デオキシフラノシル部の少な くとも１個が修飾されているオリゴヌクレオチドが好ましい。主鎖が修飾された オリゴヌクレオチドもまた好ましい。 図面の説明 図ＩＡはシュード−ハーフ−ノット（ｐｓｅｕｄｏ−ｈａｌｆ−ｋｎｏｔ）の構 造を示している。 図に示すように、ヘアピン構造のループの５゛または３′側のいずれかに結合す ることができ、いくつかの対のないヌクレオチドができ、ヘアピンの元のステム に戻る。５′または３°側のどちらを選ぶかによって、三次構造の異なるものが できる。シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）の慣習的な命名法は、ステム 及びループに５°から３°に向かって構造中に現れる順に番号をつけるものであ る。ループ１（Ｌｌ）はステム２（Ｓ２）と交差し、ルーフ２　（Ｌ２”）　ｌ ｔスｙム１　（Ｓ　１）と交差することに留意せよ。二次元で描くと明らかでは ないが、ＬｌとＬ２は位相学的に異なる。すなわち、ＬｌはＲＮＡの主溝（ｍａ ｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）と交差するのに対し、Ｌ２は小溝（ｍｉｎｏｒ　ｇｒｏ ｏｖｅ）と交差する。図ＩＡはオリゴヌクレオチドのＲＮＡヘアピンの３°側（ 上図）または５′側（下図）への結合によって、２個の重層したステムと、主溝 （上図）または小溝（下図）と交差する１本のループを有する、シュードノット の異なる半分と位相学的に類似の構造が作られることを描いている。図ＩＢ及び ＩＣはＬｌの、ＩＤ及びＩＥはＬ２のシュード−ハーフ−ノット及び同様に向き を揃えたシュードノットのＬｌのリボン状図を糸す。 図２Ａは１個のヌクレオチドがらせん構造に最小の影響を与えるだけでＡ型らせ んの主溝をまたぐことができることを示している。標的となるループの大きさが 増すにつれて、ループ１とループ２とのループ長の差は小さくなる。図２Ｂに示 すように、ループ長が長くなるにつれて、通常これに続（主溝によって制限され るループ１が、図２０に示すように主溝からはみ出し、らせんの外側のより短い 経路をとる可能性がある。図２Ａは８塩基のヘアピンループを標的とした７量体 のオリゴヌクレオチドにより形成された１塩基のシュード−ハーフ−ノットルー プ（ループ１）を示し、図２Ｂは１７塩基のループを標的とした１２量体のオリ ゴヌクレオチドにより形成された（ループ１）を示す。図２０は２３塩基のルー プを標的とした１７量体のオリゴヌクレオチドにより幾何的にはみ出した部分を 作った（ループ１）を示す。 図３はシュード−ハーフ−ノットの形になったＴＡＲＲＮＡにおミオる核酸分解 酵素感受性を有する部位を示している。１１００ｐのＴＡＲを１１００ｎのルー プ１（１２量体のオリゴヌクレオチド）、１１００ｎのループ２（１２量体のオ リゴヌクレオチド）、１ｍＭの”不規則”オリゴヌクレオチド（ＡＴＷＡ）と、 またはオリゴヌクレオチドなしで、５０ｍＭＮａＣＬ　５ｍＭＭｇＣＬ、１０ｍ ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７，４中で３７℃で３０分間ハイブリダイズさせた後、核酸分 解酵素と共にインキュベートした。ＲＮＡ５ｅＴ１及びＡはそれぞれ一重鎖のＧ 及びピリミジン部分を切断し、ＲＮＡ５ｅＶ１は２重鎖の領域を切断する。ＡＴ ＷＡ複合体についてはＴ１による切断のみを示す。 図４はゲル移動度シフトアッセイの結果を示している。シュード−ハーフ−ノッ トオリゴヌクレオチドによるＨＩＶ　ｔａｔペプチドの結合阻害が示されている 。 図５は二次構造を有するＲＮＡとのシュード−ハーフ−ノット形成のエネルギー 論を説明する熱力学的サイクルを示す。ＲＮＡフォールディング規則を使って、 標的ヘアピンの二次構造を破壊するための自由エネルギー、ΔＧ″Ｉを評価した 。 ＴＡＲエレメントの３塩基のバルジが構造を不安定化し、ＴＡＲステムの最初の ４塩基の対合を破壊して１７塩基のループを形成し、その結果５　、　２　ｋｃ ａｌ／ｍｏｌという最も低い熱力学的消費で結合できる最大数の塩基を作り出す 。ＲＮＡフォールディング規則はまた、標的への結合の前にオリゴヌクレオチド をほどくのに必要な自由エネルギー、△Ｇ６　、を評価するためにも使用した。 ΔＧ６３はほどかれたオリゴヌクレオチドの束縛されたヘアピンループへの結合 に関する。３つの成分がΔＧ　ｏ　、に寄与する。すなわち、ヘテロ２本鎖によ って形成される新しい塩基対、Δ６０□ｅ１１＋へテロ２本鎖のステムと標的の ステムとの間の重層、ΔＧ’＋ｌａｇｋ；そして新しいンユードノットルーブと 元のＲＮＡヘアピンループとのループペナルティ−の差、△△Ｇ’＋。。、であ る。Ｋｏ値はゲルシフト分析によって実験的に測定され、実験間で５％以下で再 現可能である。 図６は、シュード−ハーフ−ノットオリゴヌクレオチド上の適当な切断部をつな ぐことによってＴＡＲが切断され得ることを示している。 図７はシュード−ハーフ−ノットを形成するオリゴヌクレオチドによるＨＩＶ遺 伝子の発現の阻害を示している。遺伝子発現の阻害は、リポータ−遺伝子として アルカリ性脱リン酸化酵素の代わりにルシフェラーゼを用いた以外はＶｉｃｋｅ ｒｓらの方法（Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１９（１２）：３３５９−３３６ ８（１９９１））で測定した。実験で用いたオリゴヌクレオチドは、表２に示す ように２°−〇−メチルの１７量体であつた。 細胞を、オリゴヌクレオチドで３時間前処理し、プラスミドでトランスフェクト してから所定の濃度で後処理した。対照のオリゴヌクレオチドはＬｌ−１２に合 わせた組成及び長さであるが、ランダムな配列のものとした。 最近、治療の目的のために、ＲＮＡを特異的に標的とすることを目指す多くの努 力がなされている。ｍＲＮＡの標的配列が与えられると、アンチセンスまたはり ボザイムの標的となる相補的な領域を選択できる。しかしながら、標的として効 果的な領域を決定することはより複雑であり、現時点において、与えられたメツ セージ上の近付き得る標的部位を決定する信頼性のある方法は得られていない。 アル意味で、全てのｍＲＮＡは高次構造をとっている。コンピューターにょるＲ ＮＡフォールディングプログラムは、いかなる長さのＲＮＡに対しても復雑な折 り返しパターンを常に予想するが、どの領域が真に結合のために近付けるかを決 定するためには更なる実験が必要である。例えば、ＨＩＶのＬＴＲＲＮＡの３つ の異なる領域を標的とするりボザイムは、ＲＫＡの二次構造のため畝対応する短 い合成オリゴリボヌクレオチド基質よりも１．０００倍も切断効率が悪いことが 報告されている（０．　Ｂｅ１ｄｅｎｒｅｉｃｈ、　Ｆ、　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６７、１９０４（P９９２））。 ヘアピンループのような短く、比較的簡単なＲＮＡ構造を選択することによって 、結合前後の標的の構造の予想の信頼性がより高まることは良（理解できるであ ろう。一般に、二次構造を有するＲＮＡへの結合は、存在する塩基対のある程度 の破壊及び再配置、そして新しい構造との三次元的相互作用を必要とする。最も 重要な生物学的標的部位は二次構造を有する可能性があることから、理論的及び 実験的な結果に基づき、オリゴヌクレオチドの単位長さあたりの、標的に対する 親和性が最も高くを達成されるための方法が見いだされている。最適化は二次構 造を有する標的の分析から始まる。親和性は標的ＲＮＡの塩基対を破壊すること によって失われる。結合の戦略としては、ループ領域、短いステム、バルジ塩基 等の、熱力学的に構造を不安定化させる最も弱いエレメントを利用することによ って、標的構造中で破壊する塩基対の数を最小とするべきである。反対に、構造 を安定化するのに寄与している長い連続したステムを標的にすることは避ける。 ノ＼イブリッド複合体における、結合に関与する総数を最大にすることによって 親和性は増大する。これは、オリゴヌクレオチドと標的間の塩基対、再配置され た標的における新しい分子内塩基対、及び構造中のへテロ２本鎖と分子内ステム の間の三次元的相互作用を含む。複合体中のステムの長さを最大にし、ループの 長さを最小にするためには、位相学的な考察が必要である。 最も安定なヘテロ２本鎖は、ＲＮＡ近傍の熱力学的パラメーターを用いて塩基の 重層を最大にするような配列を標的とすることにより形成されることが見いださ れた。表１に示すように、ΔＧ’、、、、は、ハイブリダイゼーション全体の主 要な要素である。“線状”ＲＮＡと異なり、ＲＮＡの二次構造を標的とする場合 、生産的に相補できる塩基対の数は、しばしば制限される。従って、１塩基あた りの親和性が最も高い型のオリゴヌクレオチドが用いられるべきである。２′− 〇−アルキルオリゴヌクレオチドは、高い親和性をもったアナログである。これ らは核酸分解酵素による分解に抵抗性があり、培養細胞の実験において利用する ことができる（Ｓ、　Ｍ、　Ｆｒｅｉｅｒ、　Ｖ、　Ｆ、　Ｌｉｍａ、　Ｙ、　 Ｓ、　Ｓａｎｇｈｖｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ　Ｒｅｇｕｌ≠狽奄盾氏@ ｂｙ　Ａｎｔｉｓｅ ｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　１９９１）。陰性荷電が減少するよう に主鎖を修飾されたオリゴヌクレオチドも、ＲＮＡと結合したときに安定な構造 を形成する。オリゴヌクレオチドにおける潜在的な分子内構造も考慮しなければ ならない（Ａｃ０．）。オリゴヌクレオチドは強い内部構造をもっていたり、安 定な２量体をつくってはならない。オリゴマー中の全ての塩基は、標的と対にな るか、三次元的な相互作用を安定化するのにかかわるべきである。対をなさない 塩基は、非標的部位に対する親和性を増加させるため特異性の喪失を引き起こす 。更に、より長いオリゴヌクレオチドは、内部構造をとるポテンシャルがより大 きい。ハイブリダイゼーションは標的ＲＮＡの重層されやすい一重鎖領域で始ま り、続いて標的のより強い構造をもった領域へとジッパ−リング（ｚｉｐｐｅｒ ｉｎｇ）　Ｌなければならない。ＲＮＡとの結合の目的が調節蛋白質と競合する ことであれば、オリゴヌクレオチドの結合後、ＲＮＡはもはやその調節蛋白質に よって認識されてはならない。 薬剤／標的複合体の構造を知ることは、薬剤設計において重要な利点がある。 本発明において、標的ＲＮＡの一重鎖領域はオリゴヌクレオチド薬剤と非常に近 接した位置にある。−重鎖ＲＮＡ標的を選択的に切断する試薬をオリゴヌクレオ チドの様々な位置につなぎ、切断を達成することができる。このようにして、標 的と相互作用するオリゴヌクレオチドに薬剤部分を結合することができる。 シュード−ハーフ−ノットのＲＮＡへの結合ＲＮＡ二次構造の最も単純な例は、 二重鎖のステム領域と一重鎖のループからなるヘアピンである。ループ内の対合 していない塩基全てに／’％イブリダイズさせることは、魅力的な標的戦略のよ うに思われる。しかしながら、ステムでの塩基対を維持したままで一重鎖のＲＮ Ａヘアピンループの全ての塩基にハイブリダイズさせることは、位相学的に不可 能である。二重鎖／”１イブリツドは比較的堅く、コンホメーションがよりフレ キシブルな一重鎖ＲＮＡループと同じような環状経路をたどることができない。 シュードノットは、ヘアピンループ中の対合していない塩基に位相学的に安定な 構造で結合する、自然に見られる方法である。シュードノットは、ＲＮＡヘアピ ンのループ領域の一重鎖の塩基がそのヘアピンに近接した塩基と対になり、２番 目のステムとループを形成することにより形成される（Ｃ，Ｙ、＾、Ｐｌｅｉｊ 、ＴｌＢ５１５．１４３（１９９０）；Ｃ，ｆ、Ｐｌｅｉ　ｊ、Ｌ、Ｂｏｓｃｈ 、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｅｎｚｙ高盾戟A　１８０゜ ２８９（１９８９）　；Ｊ、　Ｄ、　Ｐｕｇｌｉｓｉ、　Ｊ、　Ｒ，Ｗｙａｔｔ 、　１．　Ｔｉｎｏｃｏ、　Ｊｒ、　、　Ａｃｃｏｕｎｔｓ@Ｃｈｅｗ、　Ｒｅ ｓ、　２４．１５２（１９９１））。得られる構造は、互いに重層した２個のス テムと２本のループからなる。 図１を参照せよ。 本発明は、自然に生じるシュードノットの結合パターンを模倣するものである。 自然に生じるシュードノットのように、いくつかの対のないヌクレオチドを残し てループの５°　または３′側のどちらにも結合し、元のステムに戻ることが可 能である（図１）。５°側に結合するか３゛側に結合するかの２通りによって、 著しく異なる三次構造が生じる。 シュードノットの慣習的な命名法は、ステム及びループに５゛から３′に向かッ テ構造中に現れる順に番号をつけるものである（Ｃ，ｆ、　Ｐｌｅｉ　ｊ、　Ｋ 、　Ｒｉｅｔｖｅｌｄ、　Ｌ、　Ｂｏｓｃｈ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ、 　Ｒｅｓ、　１３．１７１７（１９８５））、図１に示すように、ループ１　（ Ｌｌ）はステム２（Ｎ２）と交差し、ループ２　（Ｌ２）はステム１（ＳＬ）と 交差する。 二次元で描くと明らかではないが、ＬｌとＬ２は位相学的に異なる。すなわち、 ＬｌはＲＮＡの主溝と交差するのに対し、Ｌ２は小溝と交差する。このことは、 それぞれのループが与えられた長さのステムと交差するために必要な塩基の数に 著しく影響する。この関係は複雑である。すなわち、らせんの周期数やそれぞれ の溝をまたぐ距離によって変化する。 本発明は、ＲＮＡ二次構造のループにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを 用いる。本発明において、”オリゴヌクレオチド”の語は、自然に生じる塩基と リン酸ジエステル結合によってつながれたペントフラノシル基からなるポリヌク レオチドを意味する。この語は自然に生じた種、あるいは自然に生じたサブユニ ットまたはこれらに非常によく類似したものから合成した種を指す。”オリゴヌ クレオチド”の語はまた、自然にはない部分を有するが、自然に生じるオリゴヌ クレオチドと同じように機能するものをもいう。このように、オリゴヌクレオチ ドは、異なった糖部分あるいは糖量結合を有していても良い。これらの中で典型 的なものは、当該分野で用いることの知られているホスホロチオエート及び他の 硫黄含有種である。い（つかの好ましい具体例に従って、少なくともオリゴヌク レオチドのホスホジエステル結合のいくつかが、組成物の安定性を高めたり、あ るいは活性を調節しようとするＲＮＡまたはＤＮＡの存在する細胞内領域に組成 物が到達する能力を高めたりするように機能する構造と置換された。このような 置換は、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル、メチルホスホネート結 合、短鎖のアルキルまたはシクロアルキル構造、短鎖のへテロ原子または複素環 構造を含むことが好ましい。最も好ましいものは、ＣＨＩ−ＮＵ−０−ＣＲ２、 ＣＨ２−Ｎ（ＣＩ’１３）−０−ＣＨ２、ＣＨｒＯ−Ｎ（ＣＩｌｓ）−ＣＨｚ、 ＣＨｚ−Ｎ（ＣＨｓ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨｚ、及び　０−Ｎ（ＣＨ５）−Ｃ［ ＩｒＣgｚ の構造である（ここでホスホジエステルはｏ−ｐ−ｏ−ｃ■２である）。モルホ リノ構造もまた好ましい（例えば、米国特許５．０３４．５０６号を参照せよ） 。蛋白−核酸（ＰＮＡ）主鎖等の、他の好ましい具体例としては、オリゴヌクレ オチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖と置き変わったもの、塩基がポ リアミド主鎖のアザ窒素原子に直接あるいは間接的に結合したものがある（Ｐ、 Ｅ、　Ｎ１ｅｌｓｅｎ、　Ｍ、　Ｅｇｈｏｌｍ。 Ｒ，Ｉｌ、　Ｂｅｒｇ、　Ｏ，Ｂｕｃｈａｒｄｔ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４． １４９７（１９９１））　ｏ他の好ましい具体例に従えば、ホスホジエステル結 合は実質上非イオン及び非キラルな他の構造、あるいはキラルでエナンチオマー 特異性のある構造で置換される。この分野で通常の技術を有する者は、本発明を 実施するために他の結合を選択することができるであろう。 オリゴヌクレオチドはまた少なくともいくつかの修飾された塩基形を含む種をも 含む。すなわち、自然界で通常見られる以外のプリン及びピリミジンを使用して も良い。同様に、本発明の本質的主義が維持されている限り、ヌクレオチドサブ ユニットのペントフラノシル部分を修飾してもよい。こうした修飾の例としては ２°−０−アルキル−及び２゛−ハロゲン−置換ヌクレオチドがある。本発明に 有用な糖の２゛位の修飾の具体例としては、０ＨＳＳＨ１ＳＣＨ３、ＦｌｏＣＮ 、　０（ＣＨｘ）、ＮＵ２または０（ＣＨ２）、ＣＦ３　（ここでｎは１から約 １０までである）：Ｃ１からＣｔａの低級アルキル、置換低級アルキル、アルカ リルまたはアラルキル：　Ｃ１；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ、、０−１Ｓ−１ またはＮ−アルキル；０−１Ｓ−１またはＮ−アルケニル；５ＯＣＨ３；５ＯＩ Ｃ■、；ＯＮＯ，、ＮＯ，：Ｎ３．ＮＩ（、、ヘテロシクロアルキル：ヘテロシ クロアルカリル；アミノアルキルアミノ：ポリアルキルアミノ；置換シリル、Ｒ ＮＡ切断基：コンジュゲート：リポータ−基：インター力レーター；オリゴヌク レオチドの薬物動態学的な性質を改善するための基；オリゴヌクレオチドの薬効 学的な性質を改善するための基及び同様の性質を有する他の置換基が挙げられる 。ペントフラノシル基の代わりにシクロブチル等の糖模倣物を用いることもでき る。 このようなオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチドあるいは天然のも のと類似であるが、天然の構造と１つまたはそれ以上の違いがある合成オリゴヌ クレオチドと機能的に交換できるものとしてよく記載される。これら全てのオリ ゴヌクレオチドは、ＲＮＡとハイブリダイズする上で効果的に機能する限り本発 明に用いられる。本発明に従うオリゴヌクレオチドは、好ましくは約５から約５ ０の核酸塩基ユニットを含む。約７から２５核酸塩基ユニツトを含むオリゴヌク レオチドがより好ましく、約１２から２５核酸ユニツトを有するものが更に好ま しい。 本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、よく知られた固相合成技術で 簡単にかつ日常的に作ることができる。このような合成法のための装置は、＾ｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）を含むい くつかの業者によって販売されている。合成のために他の手段を用いることも可 能であるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成はルーチンな技術者の能力の範囲 内である。ホスホロチオエート及びアルキル化された誘導体等の他のオリゴヌク レオチドを製造するために同様の技術を用いることもよく知られている。 アンチセンスオリゴリボヌクレオチドをヘアピン構造のループとハイブリダイズ させる場合、得られる複合体のトポロジーはシュードノットの半分に似ており、 シュード−ハーフ−ノットと命名される。ループの３′側にハイブリダイズする と、シュードノットのステム２と同等の構造が形成され、ループとしてはみ出し たＲＮＡはシュードノットのループ１と同等である（図１、上段）。ループの５ ゛側にハイブリダイズすると、シュード−ハーフ−ノットのステム１が形成され 、ループとしてはみ出したＲＮＡはループ２である（図１、下段）。２分子のシ ュード−ハーフ−ノットは、形成されたループまたはステムの型によって定義す ることができる。我々は、勝手ながらシュード−ハーフ−ノットをループの型に よって定義することを選択した。すなわちループ１　（ＬＬ）またはループ２　 （Ｌ２）シュード−ハーフ−ノットである。 天然のＲＮＡシュードノットと同様に、シュード−ハーフ−ノットのステム及び ループの長さは三次元構造の束縛によって制限されている。Ａ型らせんの主溝及 び小溝をまたぐ距離が異なるため、ループ１がループ２よりずっと短くなること が可能である。１個めヌクレオチドからなるループ１をもつシュードノットが報 告された（Ｄ、　Ｓ、　ＭｃＰｈｅｅｔｅｒｓ、　Ｇ、　Ｄ、　Ｓｔｏｒｍｏ、 　Ｌ、　Ｇｏｌｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２０１D５１７（１９８８ ））。 分子モデルの研究から、１個のヌクレオチドがらせん構造に最小の影響しか与え ずにＡ−型らせんの主溝をまたぐことが可能であることが示された（図２Ａ）。 標的のループサイズが大きくなると、ループ１モチーフとループ２モチーフのル ープ長の差が小さくなる。１７塩基のループでは、１２塩基のオリゴヌクレオチ ドが３゛または５°側のどちらにもハイブリダイズし、らせんの周期性のために ５塩基のループを残すことができることが見いだされた。ループ長が更に太き（ なると、ループ１は、通常主溝に沿うように制限されている（図２Ｂ）が、主溝 がら”はみ出す“可能性があり、らせんの外側のより短い経路をたどる（図２Ｃ ）。 シュード−ハーフ−ノット形成によるＨＩＶ　ＴＡＲへの結合ＨＩＶ　ＴＡＲエ レメントは、ウィルスの調節蛋白質ｔａｔのレセプターである重要なＲＮＡヘア ピン構造である。ｔａｔ蛋白質のＴＡＲ構造への結合は、ウィルスのライフサイ クルにおいて必須のできごとである。異なる様式のシュード−ハーフ−ノット結 合、及び、既知の調節蛋白質の結合を阻害することが細胞の遺伝子発現に与える 影響を調べる例としてＴＡＲ構造を用いた。 理想的には、標的構造の他の場所には最小限の影響のみで調節蛋白質の結合部位 に結合し、破壊することが好ましい。標的構造の塩基対を壊すことは熱力学的に 好ましくない。しかしながら、ＴＡＲの場合には、ループは６塩基を有するのみ であり、ｔａｔ蛋白質の結合部位は３塩基のバルジ及び隣接するステム部分を含 む。シュード−ハーフ−ノットＴＡＲ結合全体の熱力学は、熱力学的サイクルを 用いて評価することができる（図５）。二次構造を破壊する自由エネルギーは直 接測定できないが、ＲＮＡフォールディング規則（３」、　Ｆｒｅｉ６ｒ、　Ｒ ，Ｋｉｅｒｚｅｋ、　Ｊ、＾、Ｊａｅｇｅｒ、　Ｎ、　Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、　Ｍ 、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔ、　Ｎｅ１ｌｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　ＡｃａпA　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、＾、　８３．９３７３（１９８６）） を用いて△Ｇ６１を評価することができる。ＴＡＲエレメント（図３）はそれぞ れ４．３及び６．０　ｋｃａｌ／ｍｏｌで構造を不安定化する６塩基のループと ３塩基のバルジを含み、これらは９　、　１　ｋｃａｌ／ｍｏｌで構造を安定化 する４塩基対を囲んでいる。もしも４塩基対が破壊されて１７塩基のループが形 成されると、結合のために１７個の連続したフリーの塩基を有するループを作る ための紛然力学的消費は５　、　２　ｋｃａｌ／ａｏｌに過ぎない。このように 、ループとバルジの間の塩基対を破壊することにより、最低の熱力学的消費量で 結合に利用できる最大数の塩基を生み出す。 標的への結合前に熱力学的値（ΔＧ６２）でほどかれなければならないオリゴリ ボヌクレオチドの二次構造もまた考慮されなければならない。この因子は、ステ ムループ標的に結合する場合、特に重要である。ステムループＲＮＡのまわりを 対称的に標的とした相補的なオリゴヌクレオチドはそれ自体ステム−ループを形 成することができる。オリゴリボヌクレオチド及び類似構造のアナログに対して も、△Ｑ６２を評価するためにＲＮＡフォールディング規則を用いることができ る。 オリゴヌクレオチドを束縛されたヘアピンループに結合させてシュード−ハーフ −ノットを形成させるために評価すべき最も複雑なパラメーターはΔＧ″、であ る。３つの成分がΔＧ″３に寄与する。すなわち、ヘテロ２本鎖によって形成さ れる新しい塩基対のΔＧ’＋＋ｅｓ；ヘテロ２本鎖のステムと標的のステムとの 間の重層を示すΔＧ’１ｌａｔｋ；そして新しいシュードノットループと元のＲ ＮＡヘアピンループとのループペナルティ−の差を示す△△Ｇ’　＋　６゜、で ある。このように、△Ｑｅ、は二次構造を有するＲＮＡに結合する上で好ましく ない熱力学的パラメーターであり、ΔＧ’＊１ｍｇｋは典型的なアンチセンス相 互作用で利用できない好ましい寄与であり、△△Ｇ’　ｌ　ｅ。、はループのサ イズによって好ましい場合と好ましくない場合がある。 これらのパラメーターはループ１、ループ２、及び”不規則”　（ＡＴＷＡ）結 合剤（図４）を用いて不自然なＴＡＲ塩基のループを標的とした３つのオリゴヌ クレオチド、及びバルジの下のステムの塩基対をさらに３個破壊する２つのオリ ゴヌクレオチドに対して評価された。計算値はゲルシフトによって実験的にめた 親和性と比較し、表１に示す。△Ｇ１１　、、標的ヘアピンの二次構造を破壊す るための自由エネルギーを評価するためにＲＮＡフォールディング規則を用いた 。構造を不安定化するＴＡＲエレメントの３塩基の膨出のために、ＴＡＲステム の最初の４塩基対が破壊され、その結果１７塩基のループを形成し、わずか５． 　２ｋｃａｌ／ｍｏｌという最小の熱力学的消費量で、結合できる最大数の塩基 を生み出す。ＲＮＡフォールディング規則は△Ｇ６２、標的への結合前にオリゴ ヌクレオチドをほどくために必要な自由エネルギーを評価するためにも用いられ た。ΔＧ＋１．はほどかれたオリゴヌクレオチドの不自然なヘアピンループへの 結合に関する。３つの成分が△Ｇ６３に寄与する。すなわち、ヘテロ２本鎖によ って形成される新しい塩基対、△ｃ’＋＋＊ｓ’＋ヘテロ２本鎖のステムと標的 のステムとの間の重層、ΔＧ’１ｌｉｔｋ；そして新しいシュードノットループ と元のＲＮＡヘアピンループとのループペナルティ−の差、△△Ｇ０１゜。、で ある。Ｋｏ値はゲルシフト分析によって実験的にめられ、実験間で５％以下で再 現可能であった。 これらの評価が妥当であることは、ＲＮＡフォールディング規則がＩＭのナトリ ウムイオンから生理的条件まで適用できることによっている。表１に示すように 、予想値と実験値が一致したことから、規則は少なくとも低イオン強度では理に かなっていることが示唆される。ループ１の１２量体及びループ２の１２量体オ リゴリボヌクレオチドは共に予想値に近い親和性が実験的に測定された。 不規則（ＡＴＷＡ）１７量体オリゴヌクレオチドはループ中に結合できる塩基を 多（有しているが、その親和性を測定すると、ループ１またはループ２の１２量 体よりも１桁低い値が得られ、このことは”不規則“と結合することは位相学的 に不可能であるという考えと一致する。さらに、不規則１７量体オリゴヌクレオ チドは、結合には好ましくない有意な内部構造（Ａｃ０２）を有している。しか しながら、もし１７量体のオリゴヌクレオチドがシュード−ハーフ−ノット（Ｌ Ｌ−１７及びＬ２−１７）を形成するやり方でＴＡＲを標的とすると、結合親和 性は２桁大きくなる。１７量体のシュード−ハーフ−ノットオリゴヌクレオチド は１２量体よりも大きな親和性でＴＡＲへ結合することが計算される。しかしな がら、これはオリゴヌクレオチドと標的との間に形成される塩基対の数が増大す ることに直接起因するものではない。標的に結合する塩基の数を増すことで得ら れる親　゛相性（ΔＧ’ｌｌ＃Ｊは標的における塩基対の好ましくない破壊（Ａ ｃ０、）によって相殺されるため、より長いことは必ずしも良いことではない。 これが正味増大になるか減少になるかは、どの近隣の塩基対かへテロ２本鎖の１ 部になるか、ループ長による△△Ｇ’ｌ。。、の違い、長くなることによりより 多くの内部構造がオリゴヌクレオチド中に形成されるか否かに依存する。表１に 示すように、シュード−ハーフ−ノット１７量体オリゴヌクレオチドの観察され た結合親和性は１２量体より１桁高く、予想された親和性の順序とほぼ一致して いた。 絶対値における不一致は、ループペナルティ−の不確実性及びＩＭＮａ’″で計 算した予想値と生理的塩濃度での測定値の違いによるかも知れない。 １塩基対あたりの結合親和性及び形成されるらせんの構造は、シュード−ハーフ −ノット結合戦略において考察すべき重要な点である。近傍のハイブリダイゼー ションパラメーターはＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＤＮＡへテロ２本鎖に対し てのみ利用できる（Ｋ、　Ｊ、　Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ、　Ｒ，Ｆｒａｎｋ、　Ｈ ，Ｂｌｏｃｋｅｒ、　Ｌ、　Ａ、　Ｍａｒｋｙ、　ＰｒｏメA　Ｎａｔｌ。 ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８３．３７４６（１９８６））が、 ＲＮＡ−ＤＮＡへテロ２本鎖には利用できない。ＲＮＡ−ＲＮＡヘテロ２本鎖は Ａ−型らせんを形成しくｆ、　Ｓａｅｎｇｅｒ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｉｅｓ　ｏｆ 　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ ｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３）j　、これは 全ての位相学的測定のための構造モデルとして使われた。２°　−Ｏ−メチルオ リゴヌクレオチドはＲＮＡとほとんど同じハイブリダイゼーション親和性を有し 、ＲＮＡに結合したときにＡ型２重らせん構造を形成し、核酸分解酵素による分 解に抵抗性を有するＲＮＡの近似構造アナログである（Ｂ、　Ｓ、　５ｐｒｏａ ｔ、　Ａ、　Ｉ、　Ｌａｌ１ａｎｄ、　Ｂ。 Ｂｅｉ　ｊｅｒ、　Ｐ、　Ｎｅｕｎｅｒ、　Ｕ、　Ｒｙｄｅｒ、　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１７．３３７３（ＷＢ２）j　、　Ｔ　Ａ　Ｒ 結合に おける２゛−〇−メチルオリゴヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを比較 したゲルソフト実験は、小さな違いを示したのみであった。後に記載する構造マ ツピング実験においても、２°　−０−メチルオリゴヌクレオチドとオリゴリボ ヌクレオチドを区別することはできなかった。 対照的に、ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びホスホロチオニー１−ＤＮＡオリゴヌ クレオチドでは、ループ１及びループ２の１２量体オリゴヌクレオチドによる結 合は見られず、ループ１及びループ２の１７量体オリゴヌクレオチドと非常に弱 い結合を示した。２’−’Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは 、２’　−０−メチルホスホジエステルよりも約１０倍低い親和性でＴＡＲと結 合した。表２を参照せよ。 オリゴヌクレオチドのＴＡＲＲＮＡへの結合におけるＫｏに対する化学組成及び ループ構造の影響 アンチセンス　ＴＡＲ結合 オリゴヌクレオチド　ＫＤ （標的部位）　組成物　（ｎＭ） Ｌｌ−１２（２８−３９）　ＲＮＡ　７５ＤＮＡ　＞１００μＭ Ｐ＝Ｓ　＞１００μＭ −Ｍｅ７０ Ｌ２−１２　（２３−３４）　ＲＮＡ　６０−Ｍｅ２Ｏ ＩＴＷＡ−１７（２３−３９）　ＲＮＡ　５００Ｌｌ−１７（２６−４２）　Ｒ ＮＡ　２５ＤＮＡ　＞１ｏｏｍＭ −Ｍｅ１８ Ｐ＝Ｓ、　Ｏ−Ｍｅ　２００ Ｌ２−１７　（２０−３６）　ＲＮＡ　１５ＤＮＡ　＞１００μＭ 結合は１００　ｍＭＮａｃ１中で５′末端を標識したＴＡＲを用いて行い、ゲル シフトで分析した。ＴＡＲの標的部位の数字は図３Ａに示した。 シュード−ハーフ−ノット構造の同定 ５個のハイブリッド複合体の構造について、酵素及びケミカルプローブを用いて 性状解析を行なった。図３に示すンユードーハーフーノスト１２量体のオリゴヌ クレオチド及び１７量体のオリゴヌクレオチドは、共に予想された構造と一致し た切断パターンを示した。−重鎮に特異的な核酸分解酵素であるＲＮＡ５ｅ　Ａ 及びＲＮＡ５ｅ　Ｔｌに感受性のあったＴＡＲのループ及びバルジは、シュード −ハーフ−ノットオリゴヌクレオチドの結合によって保護された。元は切断され ない場所であるが新たにシュード−ハーフ−ノットで一重鎖であると予想された 領域に相当する所は感受性が現れた。同様に、ＴＡＲにおける２重鎖の領域は、 ２重鎖に特異的なＲＮＡ５ｅ　Ｖｌに感受性を有していた。オリゴヌクレオチド 結合後、新たなＶ１切断パターンは、予想されたシュード−ハーフ−ノット構造 に一致していた。図３に示すように、ｖ１切断パターンによって決定された全て のケースにおいて、バルジの下部のステム領域の完全さは維持されていた。不規 則な１７量体のオリゴヌクレオチドの切断パターンもまた、１７個の塩基対形成 可能な塩基のうち１２個のみが塩基対を形成し、構造からオリゴヌクレオチドの 結合してない断片がぶら下がったシュード−ハーフ−ノット構造と一致していた 。ｖ１切断パターンからは、ステムがバルジの下部で破壊されたという証拠は得 られなかった。不規則１７量体はループ１モチーフまたはループ２モチーフを介 しての結合を選択できるが、切断パターンからは、不規則１７量体オリゴヌクレ オチドはＨＩＶ　ＴＡＲに結合してループ１及びループ２シュード−ハーフ−ノ ットの混合集団を形成することが示唆される。これは、１２量体のループ１及び ループ２のオリゴヌクレオチドがＴＡＲに対してほとんど同じ親和性を有すると いう観察と１７量体のンユードーハーフーノットのループ１の構造を、オルトフ ェナントロリン（ＯＰ）を結合したオリゴヌクレオチドにより得られる切断パタ ーンによって更に性状解析した。ＯＰ−オリゴヌクレオチドは、銅と還元剤の存 在下、ＯＰの近くでＲＮＡを切断することが示されている（Ｄ、　Ｓ、　Ｓｉｇ ｍａｎ、＾ｃｃ、　Ｃｈｅａｐ、　Ｒｅｓ、　１９．１８０（１９８６））。Ｏ ＰはＬｌ−１７量体のオリゴヌクレオチドの５′末端のリボースの５′の位置に チオールリンカ−を用いてつながっていた（Ｃ，Ｂ、　Ｃｈｅｎ、　Ｄ、　Ｓ、 　Ｓｉｇｍａｎ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１１０．６５７０（１９９２） ）　（図６）。ゲルシフト分析では０Ｐ−ＬＬ−１７量体とつながっていないＬ Ｌ−１７量体の結合親和性の違いは観察されず、酵素マツピングパターンで変化 が観察されないことから、ＯＰの結合はＬｌ−１７シユードーハーフーノツト構 造に影響を与えないことが示唆された。 ＬＬ−１７量体シュードーハーフーノット構造の分子モデルでは、ＯＰはＬＬ− １７量体シュード−ハーフ−ノットの３重鎖が交差する所で主溝中に置かれる。 ＯＰ切断を開始する還元剤の添加によって、ＨＩＶ　ＴＡＲではＣ−１９とＵ− ４２で主に２つの切断が観察される。 Ｌｌ−１フループが構造の頂点に戻るには、実験的に区別することが難しい２つ の可能な経路がある。１つは図２Ｂに示すように主溝をたどる経路である。これ はより短いシュードノットループ１にとっては位相学的に可能な唯一の経路であ る。他の経路は図２０に示すようにらせんから”はみ出した”ものである。分子 モデルによると、１７塩基のステムとらせんの周期性から二重らせんの同じ面に 連結部位が生じるため、はみ出し経路の方が短いことが示される（図２Ｃ）。 主溝の中よりもらせんの外側の方が好ましくないリン酸の混雑が少ないことから も、はみ出し経路であるように思われる。実験の結果より、主溝中につながった ＯＰ部はＬｌ−１７複合体の結合親和性や構造に影響しないことが示された。さ らに、ＲＮＡ５ｅ　Ｔｌは、ループが主溝の内側にあれば切断されなかったであ ろうＬｌ−１７複合体のＧ−２１を強く切断した。 シュード−ハーフ−ノットモチーフのＲＮＡに結合する大きな利点は、標的ＲＮ Ａの一重鎖ループ領域に反応性部位を直接作用させられることである。ＯＰの例 に示すように、切断試薬は特に有効である。 光学的融解 シュード−ハーフ−ノット構造を調べるもう１つの方法は光学的融解である。Ｔ ＡＲＲＮＡについて温度に対する吸収を測定すると、７０℃で強い熱吸収を示す 相転移が示され、（らせんの）巻いたモデルとほどけたモデルの２つの状態であ ることが示唆された。対照的に、ＬＬ−１７及びＬ２−１７シユードーハーフー ノツト構造は７０℃と８２℃の２つの転移を示した。相補的な二次構造を有しな いＲＮＡに対するＬｌ−１７及びＬ２−１７オリゴヌクレオチドの光学的融解で は、約８０℃で転移が示された。光学的融解のデータは、まずＴＡＲの低級ステ ム構造が分子内でほどけ、次にオリゴヌクレオチドの高温による解離が生じると いう、高度に構造化した複合体の化学的及び酵素的切断モデルと一致する。３つ の構造全てに７０℃の融解転移があることがら、シュード−ハーフ−ノットは低 級ステムを共同的に安定化することに寄与しないことが示唆される。 ｔａｔペプチド結合の破壊 シュード−ハーフ−ノットの形成は、ｔａｔ蛋白質によって特異的に認識される 領域のＴＡＲの天然の構造を破壊する。ＴＡＲ結合ドメインを含有するｔａｔの ペプチドフラグメントは、ＴＡＲのバルジに２番目及び３番目の結合部位よりも 約５倍大きな親和性で特異的に結合することが示された（Ｋ、　Ｍ、　１ｅｅｋ ｓ、　Ｃ，Ａｍｐｅ、　Ｓ、　Ｃ。 ５ｃｈｕｌｔｚ、　Ｔ、＾５ｔｅｉｔｚ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｃｒｏｔｈｅｒｓ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１２８１（１９９０））　ｏ　２T個のアミノ 酸からなるｔａｔ断片（ｔａｔ蛋白質配列の４８−７２番、ｔａｔ２５）は、Ｔ ＡＲエレメントに１：１の量比で結合すると、ＲＮＡａｓｅ　Ａによる酵素的切 断からバルジを特異的に保護した。非変性系アクリルアミドゲルにおいて、ｔａ ｔ２５とＴＡＲの１：１の複合体は、競合しないＴＡＲ及びシュード−ハーフ− ノットに結合したＴＡＲのいずれとも異なる位置に移動した。 オリゴヌクレオチドがＴＡＲに対してｔａｔ２５と競合できるがどうが決定する ために、予め結合させたｔａｔ２５とＴＡＲの１＝１の複合体をループ１を形　 。 成する１２量体のオリゴヌクレオチド５００ｎＭとインキュベートした。ゲルシ フト実験から、オリゴヌクレオチドはＴＡＲに対してｔａｔペプチドと完全に置 き変わり（図４、第４列）、シュード−ハーフ−ノットを形成することが示され た。 ペプチドをより高濃度にすると、予想通り第二の結合（非バルジ）が生じ、シュ ード−ハーフ−ノット複合体はゲルのより高い位置にシフトした（図４、第６列 ）。 アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｔａｔ２５の添加順序は、最初の３０分 間のインキュベーション後に形成される複合体の性質及び濃度依存性に影響しな かった。同様の結果がループ２を形成する１２量体で得られた。ランダムな構造 の対照のオリゴマーは、ｔａｔ２５またはアンチセンス化合物にょるＴＡＲの滴 定に効果がなかった。 これらの結果から、ＬＬ−１２及びＬ２−１２がＴＡＲのｔａｔ結合部位に結合 してこれを破壊すること、及び、オリゴヌクレオチドはおそらくは最初にループ 位置でハイブリダイゼーションをした後、分枝点移動をしてバルジ構造を破壊し 、ペプチドと置き変わることにより、予め形成されたｔａｔ２５−ＴＡＲの１＝ １の複合体に結合することができることが更に確認される。 細胞培養中におけるＴＡＲ／ｌａｔ　トランスアクティベーションの阻害ＨＩＶ 　ＴＡＲ／ｌａｔ　トランスアクティベーションにおける分子レベルのできごと は、容易に定量できるリポータ−遺伝子に融合させたＨＩＶの長末端反復（Ｌ７ ｒＲ）を含有するプラスミドと、ｔａｔ蛋白質を細胞中で発現させるプラスミド とをコトランスフエクトすることにより広く研究されている（Ｃ，Ｄｉｎｇｖａ ｌｌ。 １、　Ｅｒｎｂｅｒｇ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ 、　９．４１４５（１９９０）　；Ｓ、　Ｒａｙ、　ＩＩ）A　Ｄｅｌｌｉｎｇ 、　Ｃ，−■、Ｃｈｅｎ、　Ｃ。 Ａ、　Ｒｏｓｅｎ、　Ｎ、　Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　４ ．１３６５（１９９０）　；Ｃ，＾、　Ｒｏｓｅｎ、　Ｇ、@Ｎ、　Ｐａｖｌａ ｋｉｓ、　ＡＩＤＳ　４゜４９９（１９９０）；Ｍ、−Ｃ，Ｈｓｕ、Ａ、　Ｄ、 ５ｃｈｕｔｔ、Ｍ、Ｈｏ１ｉｙ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２５４．１７９ ９（１X９１））、後 者のプラスミドから生産されるｔａｔ蛋白質は、ＴＡＲエレメントに結合し、リ ポータ−を測定することにより定量して、ＨＩＶ　ＬＴＲからの遺伝子発現を１ ００倍以上増強させるだろう。我々はＨＩＶ　ＬＴＲルシフェラーゼプラスミド を作成し、ンユードーハーフーノットオリゴヌクレオチドが細胞中におけるＴＡ Ｒ／ｌａｔ　トランスアクティベーンヨンを特異的に阻害することができるかど うか調べるためにコトランスフエクトする方法を用いた。 ２°　−〇−メチル　Ｌｌ−１７量体及びＬ２−１７量体オリゴヌクレオチドを プラスミドと共に細胞中にコトランスフエクトすると、双方とも配列に依存して トランスアクティベーションを阻害した（図７）。 治療または予防の目的で、本発明に従ってオリゴヌクレオチドを投与する。オリ ゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの他に担体、シックナー、希釈剤、緩衝剤 、防腐剤、界面活性剤等を含有する医薬組成物として処方することができる。 医薬組成物はまた殺菌剤、消炎剤、麻酔薬等の１種またはそれ以上の活性成分を オリゴヌクレオチドに加えて含有しても良い。 医薬組成物は、局所的治療が望まれているか、全身的治療かによって、あるいは 治療すべき場所によって様々な方法で投与できる。投与は、局所的（目、膣、ま たは筋肉注射を行なってもよい。 局所的投与のための処方としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、球薬、 生薬、噴霧剤、液剤、散剤が含まれる。一般的な薬用担体としては、液状、粉状 、油状のベース、シックナー等が必須あるいは望まれる。コートされたコンドー ムもまた用いられる。 経口的投与のための組成物としては、散剤、顆粒剤、懸濁剤、水性または非−水 性の溶媒による溶液、カプセル剤、香粉、錠剤が含まれる。シックナー、香料、 希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤も望ましい。 非経口的投与のための処方としては、緩衝剤、希釈剤他の適当な添加剤をも含有 する無菌の水溶液が含まれる。 投与は、治療すべき状態の重さ及び反応性に依存するが、数日から数カ月続く治 療期間の間または、治癒または疾患の縮小が達せられるまで、通常１日に１回ま たは数回であろう。通常の技術を有する者であれば、最適の投与量、投与方法及 び反復速度を容易に決定できる。 次の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。 オリゴヌクレオチドがＴＡＲに対してｔａｔ２５と競合することができるか否か を決定するために、３２Ｐで標識したＴＡＲをｔａｔ２５及び／またはＬｌ−１ ２オリゴヌクレオチドとインキュベートした。ｔａｔ２５：ＴＡＲが１＝１の複 合体が優位を占めるペプチド濃度では、オリゴヌクレオチドが完全にｔａｔペプ チドに置きかわる（図４、第４列）。ペプチド濃度が高濃度になると、第二の（ 非バルジ）部位の結合が生じ、シュード−ハーフ−ノット複合体はオリゴヌクレ オチドがついたままの状態でゲルの高い位置にシフトした（図４、第６列）。Ｌ ２−１２量体でも同一の結果が得られ、これは添加順序にょらながった。 使用したＮ−７セチル化ｔａｔ２５はＵＣ３Ｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ　Ｃｏｒｅ　ｆａｃｉｌｉｔｙより得た。ゲル移動度シフトア ッセイは１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，７０ｍＭＮａＣ１，０，２ｍ 〜Ｉ　ＥＤＴＡ、５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、５００ｎＭ　ＢＳＡ、４Ｑｎｇ 　ｐｄＩｄＣを含有する１０μ＋の反応液中に、５°−Ｐ３２−ＴＡＲＲＮＡ及 びＴａｔ２５を５００ｎＭＳ０．０２量Ｍ、１２．５ｎＭの濃度でそれぞれ添加 して行った。それぞれの混合物は４℃で３０分間インキュベートし、１５％の非 変性系ＰＡＧＥの上に直接のせた。結果は図４に示す。

【配列表】

配列番号＝１ 配列の長さ＝５７塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 アンチセンス： 配列： 配列番号：２ 配列の長さ二６６塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 アンチセンス： 配列： 配列番号＝３ 配列の長さ＝５９塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 アンチセンス： 配列： ＧＧＧＵＣＵＣＵＣＵ　ＧＧＵＵＡＧＡＣＣＡ　ＧＡＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧ ＡＧＣｌｌＣＵ　ＣＵＧＧＣＵＡＡＣＵ　５０ＡＧＧＧＡＡＣＣＣ５９ 配列番号＝４ 配列の長さ＝１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー、直線状 アンチセンス： 配列： ＾ＧＡＣＵＣＧＧＡＣＣＣＵＣＧＡＧ　１７配列番号＝５ 配列の長さ：１２塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 アンチセンス。 配列： ＧＡＧＣＵＣＣＣＡＧ　ＧＣ１２ 配列番号二６ 配列の長さ：１２塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 アンチセンス： 配列： ＾ＧＡＣＵＣＧＧＡＣＣＧ　１２ −ｆ々、２Ａ　−Ｅｉｇ、２Ｂ　し６勺、２ＣＦＩＧ、　４ （束縛）　（束縛） Ｃ−Ｃ 革繞補正書ｃ方式） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。 ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ、　ＣＡ。 ＣＺ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、 ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ Ｉ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１個のステムーループ構造を有する選択されたＲＮＡとハイブリ ダイズしうるオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、ａ．該ステムールー プ構造と相補的なオリゴヌクレオチドを選択する；ｂ．選択されたオリゴヌクレ オチドが該ステムーループ構造とシュードーハーフーノットを形成する能力を決 定する；及びｃ．選択されたオリゴヌクレオチドが該ステムーループ構造とシュ ードーハーフーノットを形成することができると決定された場合に、選択された オリゴヌクレオチドを合成する； ことを含む方法。
2. ２．ステムーループ構造がＨＩＶＴＡＲエレメントまたはｒｅｖ応答性エレメン トである請求項１の方法。
3. ３．該合成オリゴヌクレオチドが、その５′末端、３′末端、糖の２′位、リン 酸または複素環に反応性部分を連結している請求項１の方法。
4. ４．該ステムーループ構造に相補的な複数のオリゴヌクレオチドが選択され、該 複数のそれぞれについて該ステムーループ構造とシュードーハーフーノットを形 成する能力を決定し、そして、オリゴヌクレオチドが該シュードーハーフーノッ ト構造を形成する最大の能力を有するように合成される請求項１の方法。
5. ５．少なくとも１個のステムーループ構造を有する選択されたＲＮＡとハイブリ ダイズしうるオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、ａ．該ステムールー プ構造と相補的であり、選択されたＲＮＡとシュードーハーフーノットを形成し うると予想されるオリゴヌクレオチド配列を選択する；及び ｂ．該配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する；ことを含む方法。
6. ６．少なくとも１個のステムーループ構造を有する選択されたＲＮＡの発現を調 節する方法であって、 ａ．該ステムーループ構造と相補的なオリゴヌクレオチドを選択する；ｂ．選択 されたオリゴヌクレオチドが該ステムーループ構造とシュードーハーフーノット を形成する能力を決定する；及びｃ．選択されたオリゴヌクレオチドが該ステム ーループ構造とシュードーハーフーノットを形成することができると決定された 場合に、ＲＮＡを選択されたオリゴヌクレオチドと接触させる； ことを含む方法。
7. ７．少なくとも１個のステムーループ構造を有する選択されたＲＮＡの発現を調 節する方法であって、 ａ．該ステムーループ構造と相補的であり、選択されたＲＮＡとシュードーハー フーノットを形成しうると予想されるオリゴヌクレオチド配列を選択する；及び ｂ．オリゴヌクレオチドをＲＮＡと接触させる；ことを含む方法。
8. ８．オリゴヌクレオチドのＲＮＡとハイブリダイズする能力を改良する方法であ って、 ａ．該ＲＮＡの少なくとも１個のステムーループ構造と相補的な配列を有するオ リゴヌクレオチドを同定する； ｂ．選択されたオリゴヌクレオチドが該ステムーループ構造とシュードーハーフ ーノットを形成する能力を決定する；及びｃ．該オリゴヌクレオチドとして、選 択されたＲＮＡとシュードーハーフーノットを形成しうると予想されるものを選 択する；ことを含む方法。
9. ９．複数のオリゴヌクレオチドが同定されている請求項８の方法。
10. １０．少なくとも１個のステムーループ構造を有する選択されたＲＮＡとハイブ リダイズしうるオリゴヌクレオチドのための配列を選択する方法であって、ａ． ステムーループ構造と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを選択する；及 び ｂ．選択されたＲＮＡとシュートーハーフーノットを形成しうると予想される相 補的なオリゴヌクレオチドを選択する：ことを含む方法。