JP2023522701A - Ｍｓｈ３調節のためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本開示は、新規ＭＳＨ３標的化配列に関する。神経変性疾患の治療のための新規ＭＳＨ３標的化オリゴヌクレオチドも提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２０日に出願の米国仮出願第６３／０１２，６０３号の利益を主張するものであり、その開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、新規ＭＳＨ３標的化配列、新規分岐オリゴヌクレオチド、及びＭＳＨ３関連神経変性を治療及び予防するための新規方法に関する。
ＭＳＨ３ （ＭｕｔＳ Ｈｏｍｏｌｏｇ３）は、ＤＮＡミスマッチ修復システムにおいて重要なタンパク質をコードする。重要なことに、ＭＳＨ３は、ハンチントン病及びアルツハイマー病を含む神経変性疾患の発症において重要な役割を果たす可能性がある。最近の研究は、ＭＳＨ３の機能喪失を引き起こす変異を有する個人は、正常の形態の遺伝子を有する個人と比較して、ハンチントン病の発症が遅れることを示す（Ｔｏｍｅ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１３． ９（２）：ｅ１００３２８０；Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１７．１６（９）：７０１－７１１；Ｆｌｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ．２０１９．ｐｉｉ：ａｗｚ１１５）。したがって、本出願において対処されている、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ発現を効果的かつ強力にサイレンシングする必要性が存在する。
一態様では、本開示は、約８ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド長を有するＲＮＡ分子、及び配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を提供する。特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、約８ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド長（例えば、長さ、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５１ヌクレオチド、５２ヌクレオチド、５３ヌクレオチド、５４ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、５６ヌクレオチド、５７ヌクレオチド、５８ヌクレオチド、５９ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６１ヌクレオチド、６２ヌクレオチド、６３ヌクレオチド、６４ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６６ヌクレオチド、６７ヌクレオチド、６８ヌクレオチド、６９ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７１ヌクレオチド、７２ヌクレオチド、７３ヌクレオチド、７４ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、７６ヌクレオチド、７７ヌクレオチド、７８ヌクレオチド、７９ヌクレオチド、または８０ヌクレオチド）である。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、１０～５０ヌクレオチド長が（例えば、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド、または５０ヌクレオチド長）である。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、約１５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド長を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、１５～２５ヌクレオチド長（例えば、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチド長）である。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡまたは二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡである。アンチセンスは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を含み得る。例えば、特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号４の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号５の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号６の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１９の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２０の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２１の核酸配列に実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２２の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２３の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２４の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２５の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２６の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２７の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２８の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号２９の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３０の核酸配列と実質的に相補的である。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の少なくとも１０、１１、１２、または１３の連続ヌクレオチドに対して相補性を有するアンチセンス鎖を含む。例えば、特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つの核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有するアンチセンス鎖を含む（例えば、配列番号１の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号３の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号４の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号５の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号６の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号１９の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２０の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２１の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２２の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２３の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２４の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２５の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２６の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２７の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２８の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２９の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号３０の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント）。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つの核酸配列の１５～２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。例えば、アンチセンス鎖は、配列番号１の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有し得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１９の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２０の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２１の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２２の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２３の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２４の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２５の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２６の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２７の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２８の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２９の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３０の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、または２５の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有する。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と３つ以下のミスマッチを有するアンチセンス鎖を含む。例えば、アンチセンス鎖は、配列番号１の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１９の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２０の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２１の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２２の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２３の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２４の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２５の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２６の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２７の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２８の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２９の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３０の核酸に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に完全に相補的なアンチセンス鎖を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な核酸配列を含む。例えば、特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１３の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１４の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１５の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１６の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１７の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号１８の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３１の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３２の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３３の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３４の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３５の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３６の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３７の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３８の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号３９の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号４０の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号４１の核酸配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス配列は、配列番号４２の核酸配列と実質的に相補的である。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の少なくとも１０、１１、１２または１３の連続ヌクレオチドに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。例えば、特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１３の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１４の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１５の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１６の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１７の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１８の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３１の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３２の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３３の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３６の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３７の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３８の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号３９の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号４０の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号４１の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号４２の核酸配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３の連続ヌクレオチドのセグメントに相補性を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と３個以下のミスマッチを有するアンチセンス鎖を含む。例えば、アンチセンス鎖は、配列番号１３の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有し得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１４の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１５の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１６の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１７の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１８の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３１の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３２の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３３の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３４の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３５の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３６の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３７の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３８の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３９の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４０の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４１の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４２の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１３～１８及び３１～４２のＭＳＨ３核酸に完全に相補的なアンチセンス鎖を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖は、約１５ヌクレオチド長～約３０ヌクレオチド長である（例えば、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る）。特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖は、約１５ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長を含む。例えば、特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長または１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長または１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長または２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長または２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５塩基対～３０塩基対（例えば、１５塩基対、１６塩基対、１７塩基対、１８塩基対、１９塩基対、２０塩基対、２１塩基対、２２塩基対、２３塩基対、２４塩基対、２５塩基対、２６塩基対、２７塩基対、２８塩基対、２９塩基対、または３０塩基対）の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５塩基対～２０塩基対（例えば、１５塩基対、１６塩基対、１７塩基対、１８塩基対、１９塩基対、または２０塩基対）の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１６塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１８塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２０塩基対の二本鎖領域を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、平滑末端を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約２ヌクレオチド～５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、またはそれらの混合物を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、４～１６のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のホスホロチオエート連結）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、８～１３のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（例えば、９、１０、１１、１２、または１３のホスホロチオエート連結）を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、式Ｉの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む：
Figure 2023522701000002
 （式中、
Ｂは、塩基対部分であり；
Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され；
Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、
Ｙは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
Ｚは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
Ｒは、保護基であり、
Figure 2023522701000003
 は、任意の二重結合である）。
特定の実施形態では、ＷがＣＨである場合、
Figure 2023522701000004
 は、二重結合である。
特定の実施形態では、ＷがＯ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２からなる群から選択される場合、
Figure 2023522701000005
 は、単結合である。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチド（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の化学修飾ヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、完全に化学修飾されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約８０％～約９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約８３％～約８６％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約８３％、８４％、８５％、または８６％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約７０％～約８０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約７５％～約７８％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％、７６％、７７％、または７８％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチド（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の化学修飾ヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、完全に化学修飾されている。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾）を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約７０％～９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約８５％～約９０％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約７５％～８５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約７６％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、センス鎖は、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチド（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の化学修飾ヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、完全に化学修飾されている。特定の実施形態では、センス鎖は、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。
特定の実施形態では、センス鎖は、約７０％～約８５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾）を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾）を含む。
特定の実施形態では、センス鎖は、約６５％～約７５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、または７５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾）を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、約６７％～約７３％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、約６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、または７３％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾）を含む。
特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖とセンス鎖との間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む。特定の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドミスマッチは、センス鎖の５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する。特定の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、センス鎖の５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’ホスフェート、５’－アルキルホスホネート、５’アルキレンホスホネート、または５’アルケニルホスホネートを含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’ビニルホスホネートを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％または約８５％～約９０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約６５％～約７５％または約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から４位、５位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（（２）アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約８５％～約９０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチドであり得る）；（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（７）センス鎖の３’末端から７位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシリボヌクレオチドではない（例えば、センス鎖の３’末端から７位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチドである）；（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端からの位置２、４、５、６、及び１４のヌクレオチドは２’－メトキシ－リボヌクレオチドではなく（例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２、６、１４、及び１６のヌクレオチドは２’－フルオロヌクレオチドであり得る）；（４）３’末端からの１～２から１～７のヌクレオチドは、ホスホロチオアート内部ヌクレオチド連結を介して、互いに結合している；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部と相補的である；（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の５’末端からの位置１～２のヌクレオチドは、ホスホロチオアート内部ヌクレオチド連結を介して、互いに結合している。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、１４位、及び１６位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、１４位、及び１６位のヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチドであり得る）；（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約６５％～約７５％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（７）センス鎖の３’末端から７位、９位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシリボヌクレオチドではない（例えば、センス鎖の３’末端から７位、９位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチドである）；（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも８０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の３’末端から７位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシリボヌクレオチドではない；（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートのヌクレオチド間連結により、互いに接続されている。
特定の実施形態では、機能部分は、アンチセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、センス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、センス鎖の３’末端に連結されている。
特定の実施形態では、機能部分は、疎水性部分を含む。
特定の実施形態では、疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド、ヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ビタミン、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ステロイドは、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ビタミンは、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、及び誘導体、またはそれらの代謝物からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ビタミンは、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される。
特定の実施形態では、機能部分は、リンカーにより、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に連結されている。
特定の実施形態では、リンカーは、二価または三価のリンカーを含む。
特定の実施形態では、二価または三価のリンカーは、以下からなる群から選択される：
Figure 2023522701000006
 （式中、ｎは、１、２、３、４、または５である）。
特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、アミド、カルバメート、またはそれらの組み合わせを含む。
特定の実施形態では、リンカーが三価リンカーである場合、リンカーは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体をさらに連結する。
特定の実施形態では、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体は、以下からなる群から選択される：
Figure 2023522701000007
 （式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＢＨ３である）。
特定の実施形態では、センス鎖の３’末端から１位及び２位のヌクレオチド、及びアンチセンス鎖の５’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。
一態様では、本開示は、上記のｄｓＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも８０％阻害する。
一態様では、本開示は、細胞におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本方法は、（ａ）上記の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）で産生された細胞を、ＭＳＨ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するステップと、を含む。
一態様では、本開示は、神経変性疾患を治療または管理する方法であって、こうした治療または管理を必要とする患者に、治療有効量の上記のｄｓＲＮＡを投与することを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、患者の脳に投与される。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、脳・脳室内（ＩＣＶ）注射、線条体内（ＩＳ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下（ＳＱ）注射、またはそれらの組み合わせによって投与される。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、海馬、線条体、皮質、小脳、視床、視床下部、及び脊髄のうちの１つ以上において、ＭＳＨ３遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも８０％阻害する。
一態様では、本開示は、配列番号１～６及び１９～３０のＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的なＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むベクターを提供する。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも８０％阻害する。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む。
一態様では、本開示は、上記のベクターを含む細胞を提供する。
一態様では、本開示は、上記ベクター及びＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
一態様では、本開示は、それぞれ、２つ以上のＲＮＡ分子、例えば、１５～４０ヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド長）を含む分岐ＲＮＡ化合物を提供し、ここで各ＲＮＡ分子は、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡのセグメントに実質的に相補的な核酸配列を有する部分を含む。２つのＲＮＡ分子は、リンカー、スペーサー及び分岐点から独立して選択される１つ以上の部分によって互いに結合され得る。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ分子は、ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの一方または両方を含む。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、各ＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡを含み、各アンチセンス鎖は、配列番号：１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を独立して含む。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物は、互いに共有結合により結合した（例えば、リンカー、スペーサー、または分岐点によって）本開示の上記の態様または実施形態のいずれかのＲＮＡ分子の２つ以上のコピーを含む。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列の部分を含む。例えば、分岐ＲＮＡ化合物は、（例えば、リンカー、スペーサー、または分枝点によって）互いに共有結合により結合し、それぞれ配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の少なくとも１０、１１、１２、または１３個の連続ヌクレオチドに対して相補性を有するアンチセンス鎖を含む２つ以上のｄｓＲＮＡ分子を含み得る。例えば、特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つの核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント（例えば、配列番号１の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号２の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号３の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号４の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、配列番号５の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント、または配列番号６の核酸配列の１０～２５の連続ヌクレオチドのセグメント）に対して相補性を有するアンチセンス鎖を含む。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物中の各ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つの核酸配列の１５～２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有するアンチセンス鎖を含む。例えば、アンチセンス鎖は、配列番号１の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有し得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６の核酸配列の１５の連続ヌクレオチド、１６の連続ヌクレオチド、１７の連続ヌクレオチド、１８の連続ヌクレオチド、１９の連続ヌクレオチド、２０の連続ヌクレオチド、２１の連続ヌクレオチド、２２の連続ヌクレオチド、２３の連続ヌクレオチド、２４の連続ヌクレオチド、２５の連続ヌクレオチドのセグメントに対して相補性を有する。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物中の各ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と３以下のミスマッチを有するアンチセンス鎖を含む。例えば、アンチセンス鎖は、配列番号１の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有し得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６の核酸配列に対して、０～３個のミスマッチ（例えば、０個のミスマッチ、１個のミスマッチ、２個のミスマッチ、または３個のミスマッチ）を有する。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物中の各ｄｓＲＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と完全に相補的であるアンチセンス鎖を含む。
特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物は、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の１つ以上に実質的に相補的な核酸配列を有する部分を含む。
特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、各ＲＮＡ分子は、１５～２５ヌクレオチド長を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖は、約１５ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長を含む。例えば、特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長または１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長または１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長または２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長または２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、センス鎖は、１６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５塩基対～２０塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１６塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１８塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２０塩基対の二本鎖領域を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、平滑末端を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２ヌクレオチド～５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、または非天然塩基を含むヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物は、４～１６のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、分岐ＲＮＡ化合物は、８～１３のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、式Ｉの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む：
Figure 2023522701000008
 （式中、
Ｂは、塩基対部分であり；
Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され；
Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、
Ｙは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
Ｚは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
Ｒは、保護基であり、
Figure 2023522701000009
 は、任意の二重結合である）。
特定の実施形態では、ＷがＣＨである場合、
Figure 2023522701000010
 は、二重結合である。
特定の実施形態では、ＷがＯ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２からなる群から選択される場合、
Figure 2023522701000011
 は、単結合である。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチド（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の化学修飾ヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、完全に化学修飾されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、完全に化学修飾されている。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、７０％～９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約８５％～約９０％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約７５％～８５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約７６％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む。
特定の実施形態では、センス鎖は、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、完全に化学修飾されている。特定の実施形態では、センス鎖は、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾（を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。
特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖とセンス鎖との間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む。特定の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドミスマッチは、センス鎖の５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する。特定の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、センス鎖の５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’ホスフェート、５’－アルキルホスホネート、５’アルキレンホスホネート、５’アルケニルホスホネート、またはそれらの混合物を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’ビニルホスホネートを含む。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド連結を介して互いに結合している。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％、または約８５％～約９０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約６５％～約７５％、または約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（７）アンチセンス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から４位、５位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約８５％～約９０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチドであり得る）；（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（７）センス鎖の３’末端から７位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシリボヌクレオチドではない（例えば、センス鎖の３’末端から７位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチドである）；（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、４位、５位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から２位、４位、５位、６位、１４位、及び１６位のヌクレオチドが、２’－フルオロヌクレオチドであってもよい）；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合されている；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約７５％～約８０％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、１４位、及び１６位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、１４位、及び１６位のヌクレオチドは、２’－フルオロヌクレオチドであり得る）；（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、約６５％～約７５％の２’－Ｏ－メチル修飾）を含む；（７）センス鎖の３’末端から７位、９位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシリボヌクレオチドではない；（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖は、５’末端及び３’末端を有し、ここで、（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を有する；（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；（４）アンチセンス鎖の３’末端の１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；（５）アンチセンス鎖の一部は、センス鎖の一部に相補的である；（６）センス鎖は、少なくとも８０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；（７）センス鎖の３’末端から７位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシリボヌクレオチドではない；（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートのヌクレオチド間連結により、互いに結合している。
特定の実施形態では、機能部分は、アンチセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、センス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、センス鎖の３’末端に連結されている。
特定の実施形態では、機能部分は、疎水性部分を含む。
特定の実施形態では、疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド、ヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ビタミン、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ステロイドは、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ビタミンは、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、それらの誘導体、及びそれらの代謝物からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ビタミンは、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される。
特定の実施形態では、機能部分は、リンカーにより、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に連結されている。
特定の実施形態では、リンカーは、二価または三価のリンカーを含む。
特定の実施形態では、二価または三価のリンカーは、以下からなる群から選択される：
Figure 2023522701000012
 （式中、ｎは、１、２、３、４、または５である）。
特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、アミド、カルバメート、またはそれらの組み合わせを含む。
特定の実施形態では、リンカーが三価リンカーである場合、リンカーは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体をさらに連結する。
特定の実施形態では、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体は、以下からなる群から選択される：
Figure 2023522701000013
 （式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＢＨ３である）。
特定の実施形態では、センス鎖の３’末端から１位及び２位のヌクレオチド、及びアンチセンス鎖の５’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。
１つの態様において、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供する：
Figure 2023522701000014
 （式中：
Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み、任意により、式（Ｉ）は、１つ以上の分岐点Ｂ、及び１つ以上のスペーサーＳをさらに含み、式中、
Ｂは、出現ごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり；
Ｓは、出現ごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み；
ｎは、２、３、４、５、６、７または８であり；
Ｎは、本開示の上記の態様または実施形態のいずれかのｄｓＲＮＡ分子などの二本鎖核酸である）。特定の実施形態では、各Ｎは、１５～４０塩基長である。
特定の実施形態では、各Ｎは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み：
アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含み；
センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、１つ以上の化学修飾を含む。
特定の実施形態では、化合物は、式（Ｉ－１）～（Ｉ－９）から選択される構造を含み：













Figure 2023522701000015
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、以下からなる群から選択される５’末端基Ｒを含む：
Figure 2023522701000016
特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の構造を含む：
Figure 2023522701000017
 （式中、
Ｘは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
Ｙは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
－は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を表し；
＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し；
－－－は、出現ごとに独立して、塩基対相互作用またはミスマッチを表す。
特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＶ）の構造を含む：
Figure 2023522701000018
 （式中、
Ｘは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
Ｙは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
－は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を表し；
＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し；
－－－は、出現ごとに独立して、塩基対相互作用またはミスマッチを表す。
特定の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１である：
Figure 2023522701000019
特定の実施形態では、Ｒは、Ｒ３であり、ｎは２である。
特定の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２である：
Figure 2023522701000020
特定の実施形態では、Ｒは、Ｒ３であり、ｎは２である。
一態様では、本開示は、式（ＶＩ）の構造を有する治療用核酸のための送達系を提供する：
Figure 2023522701000021
 （式中、
Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み、式（ＶＩ）は、任意により、１つ以上の分岐点Ｂ、及び１つ以上のスペーサーＳをさらに含み、式中、
Ｂは、出現ごとに独立して、多価有機種またはその誘導体を含み；
Ｓは、出現ごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み；
各ｃＮＡは、独立して、１つ以上の化学修飾を含むキャリア核酸であり、
各ｃＮＡは、独立して、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み；
ｎは、２、３、４、５、６、７、または８である）。
特定の実施形態では、送達系は、式（ＶＩ－１）～（ＶＩ－９）から選択される構造を含み：
Figure 2023522701000022
特定の実施形態では、各ｃＮＡは、独立して、化学修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、送達系は、ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含み、各ＮＡは、少なくとも１つのｃＮＡにハイブリダイズする。
特定の実施形態では、各ＮＡは、独立して、少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１６～２０の連続ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも２ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。
特定の実施形態では、オーバーハングのヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を介して結合されている。
特定の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマー、及びガイドＲＮＡからなる群から選択される。
特定の実施形態では、各ＮＡは、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的である。
一態様では、本開示は、生物におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、上記の化合物または上記の系と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
特定の実施形態では、化合物または系は、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、化合物または系は、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも８０％阻害する。
一態様では、本開示は、細胞におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本方法は、（ａ）上記の化合物または上記の系を細胞内に導入するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）で産生された細胞を、ＭＳＨ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む。
一態様では、本開示は、神経変性疾患を治療または管理する方法であって、こうした治療または管理を必要とする患者に、治療有効量の上記の化合物または上記の系を投与することを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、患者の脳に投与される。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、脳・脳室内（ＩＣＶ）注射、線条体内（ＩＳ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下（ＳＱ）注射、またはそれらの組み合わせによって投与される。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、海馬、線条体、皮質、小脳、視床、視床下部、及び脊髄のうちの１つ以上において、ＭＳＨ３遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ３遺伝子の発現を少なくとも８０％阻害する。
一態様では、本開示は、細胞におけるＨＴＴ ｍＲＮＡを低減するための方法を提供し、方法は、（ａ）ＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを細胞に導入することと、（ｂ）ＨＴＴ ｍＲＮＡの分解を得るのに十分な時間、ステップ（ａ）で産生された細胞を維持し、それによって細胞中のＨＴＴ ｍＲＮＡを低減することと、を含む。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む。
別の態様では、本開示は、細胞におけるＨＴＴ ｍＲＮＡを低減するための方法を提供し、方法は、（ａ）上記のｄｓＲＮＡ、上記のベクター、上記の化合物、または上記のシステムを細胞に導入することと、（ｂ）ＨＴＴ ｍＲＮＡの分解を得るのに十分な時間、ステップ（ａ）で産生された細胞を維持し、それによって細胞中のＨＴＴ ｍＲＮＡを低減することと、を含む。
特定の実施形態では、ＨＴＴ ｍＲＮＡは、ＨＴＴ１ａ ｍＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、ＨＴＴ１ａ ｍＲＮＡは、配列番号４３に記載の核酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、ハンチントン病（ＨＤ）を治療または管理する方法を提供し、ＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む治療有効量のオリゴヌクレオチドを、そのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、トリヌクレオチドリピート疾患または障害を治療または管理する方法を提供し、ＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む治療有効量のオリゴヌクレオチドを、そのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む。
別の態様では、本開示は、ハンチントン病（ＨＤ）を治療または管理する方法を提供し、上記のｄｓＲＮＡ、上記のベクター、上記の化合物、または上記のシステムの治療有効量を、そのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、トリヌクレオチドリピート疾患または障害を治療または管理する方法を提供し、上記のｄｓＲＮＡ、上記のベクター、上記の化合物、または上記のシステムの治療有効量を、そのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む。
本開示の上記及び他の特徴及び利点は、添付図面と併せることにより、例示的実施形態の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞におけるヒトＭＳＨ３ ｍＲＮＡの配列を標的とするｓｉＲＮＡのスクリーニングを示す図である。１２の配列のスクリーニングにより、ＭＳＨ３ ８８５、ＭＳＨ３ １０００、ＭＳＨ３ １４６８、ＭＳＨ３ ２０４８、ＭＳＨ３ ２１７０、及びＭＳＨ３ ２６７５が効果的な標的領域であると同定された。 ＭＳＨ３ ８８５、ＭＳＨ３ １０００、ＭＳＨ３ １４６８、ＭＳＨ３ ２０４８、ＭＳＨ３ ２１７０、及びＭＳＨ３ ２６７５で得られた８点用量応答曲線を示す図である。 ヒーラ細胞におけるヒトＭＳＨ３ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ標的配列のスクリーニングを示す図である。ｓｉＲＮＡは、それぞれ１．５μＭの濃度で試験され、ｍＲＮＡは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ遺伝子発現アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により７２時間の地点で評価した。 ＭＳＨ３ ５６６、ＭＳＨ３ １５２１、ＭＳＨ３ １５４８、ＭＳＨ３ １６５４、ＭＳＨ３ １６６５、ＭＳＨ３ １６７５、ＭＳＨ３ １９０３、ＭＳＨ３ ２０１９、ＭＳＨ３ ２７９０、ＭＳＨ３ ２９７５、ＭＳＨ３ ３６２１、及びＭＳＨ３ ３７１５ ｓｉＲＮＡによって得られた、８点用量応答曲線を示す図である。ｓｉＲＮＡは、それぞれ濃度範囲で試験し、ｍＲＮＡは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ遺伝子発現アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により７２時間の地点で評価した。 ＭＳＨ３、ＨＴＴ、またはＨＴＴ１ａを標的とするｓｉＲＮＡを受けた後のマウス線条体、内側皮質、後部皮質、及び視床のＭＳＨ３、ＷＴ ＨＴＴ、及び変異体ＨＴＴの相対的タンパク質レベルを示す図である。マウスは、１０ｎｍｏｌの用量のｓｉＲＮＡを１０μｌ体積で投与され、脳室内（ＩＣＶ）経路を介して投与された。比較のために、治療なしの対照マウスを使用した。 ＭＳＨ３、ＨＴＴ、またはＨＴＴ１ａを標的とするｓｉＲＮＡを受けた後のマウス線条体のＭＳＨ３、ＷＴ ＨＴＴ、及び変異体ＨＴＴの相対的タンパク質レベルを示す図である。 ＭＳＨ３、ＨＴＴ、またはＨＴＴ１ａを標的とするｓｉＲＮＡを受けた後のマウス内側皮質のＭＳＨ３、ＷＴ ＨＴＴ、及び変異体ＨＴＴの相対的タンパク質レベルを示す図である。 ＭＳＨ３、ＨＴＴ、またはＨＴＴ１ａを標的とするｓｉＲＮＡを受けた後のマウス後部皮質のＭＳＨ３、ＷＴ ＨＴＴ、及び変異体ＨＴＴの相対的タンパク質レベルを示す図である。 ＭＳＨ３、ＨＴＴ、またはＨＴＴ１ａを標的とするｓｉＲＮＡを受けた後のマウス視床のＭＳＨ３、ＷＴ ＨＴＴ、及び変異体ＨＴＴの相対的タンパク質レベルを示す図である。 ＰＢＳ、ＭＳＨ３ １０００ ｓｉＲＮＡ、及びＨＴＴ １０１５０ ｓｉＲＮＡと共にインキュベートした、共焦点顕微鏡観察によって検出される、ＨＴＴ１ａ ｍＲＮＡ ｆｏｃｉを示す図である。 Ｑ１１１マウスにおけるＨＴＴ ｐｏｌｙＱ ｔｒａｃｔの体腔拡張を示す図である。マウスは１０ｎｍｏｌの用量の１０μｌ体積のｓｉＲＮＡが与えられ、ＩＣＶを介して投与された。
新規ＭＳＨ３標的配列が提供される。また、本開示の１つ以上の標的配列などのＭＳＨ３ ｍＲＮＡを標的とする、ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを含む分岐ＲＮＡ化合物などの新規ＲＮＡ分子も提供される。
別段の指定がない限り、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質ならびに核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。別段の指定がない限り、本明細書で提供される方法及び技術は、当技術分野で周知の従来の方法に従って、また別段の指定がない限り、本明細書全体で引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されているとおりに実施される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に達成されるように、本明細書に記載されるように実行される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学及び薬学・医薬化学に関連して用いられる用語、並びに実験室での手順及び技術は、当分野において周知であり、一般的に用いられるものである。患者の化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、送達、及び治療には標準的技術が用いられる。
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。潜在的なあらゆるあいまいさがある場合は、ここで提供される定義があらゆる辞書または外部の定義よりも優先される。別段文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「または（ｏｒ）」の使用は、別途記述されない限り、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は、限定的ではない。
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語を最初に定義する。
「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖に共有結合により連結したプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的ヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、及びチミジンが挙げられる。さらなる例示的ヌクレオシドとしては、イノシン、１－メチルイノシン、プシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ－メチルグアノシン及びＮ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（「希少」ヌクレオシドとも呼ばれる）が挙げられる。「ヌクレオチド」という用語は、エステル連結内で糖部分に結合された１つ以上のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。例示的ヌクレオチドとしては、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸、及び三リン酸が挙げられる。「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、５’及び３’炭素原子間のホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結によって一緒に結合されたヌクレオチドのポリマーを指す。
「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドのポリマー（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のリボヌクレオチド）を指す。「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡ及びＲＮＡは、自然に合成され得る（例えば、それぞれＤＮＡの複製またはＤＮＡの転写によって）。ＲＮＡは、転写後に修飾され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡも化学的に合成され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡ及びｓｓＤＮＡ）または多重鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡ及びｄｓＤＮＡ）であり得る。「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、１つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖ＲＮＡである。この情報は、リボソームがｍＲＮＡに結合するときに、タンパク質合成中に変換される。
本明細書で使用される用語「低分子干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）（当技術分野では「短鎖干渉ＲＮＡ」とも呼ばれる）は、約１０～５０のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）を指し、ＲＮＡ干渉を指示または媒介できる。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５～３０のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、または約１６～２５のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、または約１８～２３のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、または約１９～２２のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１または２２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）を含む。「短い」ｓｉＲＮＡという用語は、約２１ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。「長い」ｓｉＲＮＡという用語は、約２４～２５ヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。短いｓｉＲＮＡは、場合によっては、短いｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力を保持するという条件で、１９未満のヌクレオチド、例えば、１６、１７または１８ヌクレオチドを含み得る。同様に、長いｓｉＲＮＡは、場合によっては、より長いｓｉＲＮＡが、短いｓｉＲＮＡへのさらなるプロセシング、例えば酵素プロセシングなく、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持するという条件で、２６を超えるヌクレオチドを含み得る。
「ヌクレオチド類似体」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドなど、非標準ヌクレオチドを指す。例示的ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学的性質を改変させるが、その意図された機能を実行するヌクレオチド類似体の能力を保持するように、任意の位置で修飾される。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジン；６位、例えば６－（２－アミノ）プロピルウリジン；及びアデノシン及び／またはグアノシンの８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンが挙げられる。また、ヌクレオチド類似体としては、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－及びＮ－修飾（例えば、アルキル化、例えばＮ６－メチルアデノシン、または当技術分野で知られているもの）ヌクレオチド；及び他の複素環修飾ヌクレオチド類似体、例えば、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，２０００ Ａｕｇ．１０（４）：２９７－３１０に記載のものが挙げられる。
ヌクレオチド類似体はまた、ヌクレオチドの糖部分への修飾を含み得る。例えば、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＯＯＲから選択される基によって置換されてもよく、ここでＲは、置換または非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の考えられる修飾は、米国特許第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号に記載されているものが挙げられる。
ヌクレオチドのリン酸基はまた、例えば、リン酸基の酸素の１つ以上を硫黄（例えば、ホスホロチオエート）で置換することによって、またはヌクレオチドがその意図された機能を実行できるように、他の置換を行うことによって、修飾され得る。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２０００ Ａｐｒ．１０（２）：１１７－２１，Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２０００ Ｏｃｔ．１０（５）：３３３－４５，Ｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２００１ Ｏｃｔ．１１（５）：３１７－２５，Ｖｏｒｏｂｊｅｖ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２００１ Ａｐｒ．１１（２）：７７－８５、及び米国特許第５，６８４，１４３号に記載されている。上で参照した特定の修飾（例えば、リン酸基修飾）は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、類似体を含むポリヌクレオチドの加水分解速度を低下させる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の短いポリマーを指す。
「ＲＮＡ類似体」という用語は、対応する未改変または未修飾のＲＮＡと比較して、少なくとも１つの改変または修飾されたヌクレオチドを有するが、対応する未改変または未修飾のＲＮＡと同じまたは類似の性質または機能を保持するポリヌクレオチド（例えば、化学的に合成されたポリヌクレオチド）を指す。上述のとおり、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結を有するＲＮＡ分子と比較して、結果としてＲＮＡ類似体の加水分解速度を低下させる連結により連結され得る。例えば、類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホロアミデート、及び／またはホスホロチオエート連結を含み得る。一部のＲＮＡ類似体には、糖及び／または骨格修飾リボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチドが含まれる。そのような改変または修飾は、ＲＮＡの末端（複数可）または内部（ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチド）などへの非ヌクレオチド物質の付加をさらに含むことができる。ＲＮＡ類似体は、ＲＮＡ干渉を媒介する能力を有する天然のＲＮＡと十分に類似していることのみを必要とする。
本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）という用語は、ＲＮＡの選択的な細胞内分解を指す。ＲＮＡｉは、細胞内で自然に発生し、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡなど）を除去する。天然のＲＮＡｉは、遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行し、分解機構を他の同様のＲＮＡ配列に向ける。あるいは、例えば標的遺伝子の発現をサイレンシングするために、ヒトの手によって、ＲＮＡｉを開始させ得る。
「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指示するために、標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補的な配列」である鎖を有するＲＮＡｉ剤、例えば、ＲＮＡサイレンシング剤は、その鎖が、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによる標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な配列を有することを意味する。
本明細書で使用される「単離ＲＮＡ」（例えば、「単離ｓｉＲＮＡ」または「単離ｓｉＲＮＡ前駆体」）は、組換え技術によって産生された場合は、実質的に他の細胞材料または培養培地を含まないＲＮＡ分子を指し、化学合成された場合は、実質的に化学前駆体または他の化学物質を含まない。
本明細書で使用される「ＲＮＡサイレンシング」という用語は、ＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的調節機構（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエルリング、共抑制、及び翻訳抑制）の一群を指し、これらは、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらす。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、及び菌類など、多くの種類の生物で観察されている。
「識別的ＲＮＡサイレンシング」という用語は、例えば、両方のポリヌクレオチド配列が同じ細胞中に存在する場合、ＲＮＡ分子が「第１」または「標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害する一方で、「第２」または「非標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害しない能力を指す。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対応し、非標的ポリヌクレオチド配列は、非標的遺伝子に対応する。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的対立遺伝子に対応し、非標的ポリヌクレオチド配列は、非標的対立遺伝子に対応する。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサーエレメント）をコードするＤＮＡ配列である。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡである。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、例えば精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を含む、その技術分野で認識されている意味を有する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語はまた、例えば、生きている細胞、例えば、不死化細胞、一次細胞、細胞株、及び／または生物内の細胞を含む、当業者によって認識されている意味を有する。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、人工的に細胞に挿入され、細胞から発生する生物のゲノムの一部となる任意の核酸分子を指す。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して部分的または完全に異種（すなわち、外来）である遺伝子を含み得るか、または生物の内因性遺伝子に相同である遺伝子を表し得る。「導入遺伝子」はまた、トランスジェニック生物、例えば、動物中に発現する、１つ以上の操作されたＲＮＡ前駆体をコードする、１つ以上の選択された核酸配列、例えば、ＤＮＡを含む核酸分子を意味し、これは、一部または完全にトランスジェニック動物と異種である、すなわち外来性であるか、またはトランスジェニック動物の内因性遺伝子と相同であるが、天然遺伝子とは異なる場所で、動物のゲノムに挿入されるように設計されている。導入遺伝子は、選択された核酸配列の発現に必要な１つ以上のプロモーター及び任意の他のＤＮＡ、例えば、イントロンを含み、すべてが、選択された配列に作動可能に連結され、エンハンサー配列を含んでもよい。
疾患または障害に「関与する」遺伝子には、遺伝子、その正常または異常な発現または機能が、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状に影響を及ぼすまたはこれらを引き起こす遺伝子が含まれる。
本明細書で使用される「機能獲得型変異」という用語は、遺伝子によってコードされるタンパク質（すなわち、変異タンパク質）が、通常はそのタンパク質（すなわち、野生型タンパク質）に関連しない機能を獲得し、疾患または障害を引き起こすか、またはそれらの一因となる、遺伝子における任意の変異を指す。機能獲得型変異は、コードされたタンパク質の機能の変化を引き起こす、遺伝子中のヌクレオチド（複数可）の欠失、付加、または置換であり得る。一実施形態では、機能獲得型変異は、変異タンパク質の機能を変化させるか、または他のタンパク質との相互作用を引き起こす。別の実施形態では、機能獲得型変異は、例えば、改変変異タンパク質と正常野生型タンパク質との相互作用によって、正常な野生型タンパク質の減少または除去を引き起こす。
本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、その発現が実質的に阻害されるか、または「サイレンシング」される遺伝子である。このサイレンシングは、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断または標的遺伝子の翻訳抑制によるＲＮＡのサイレンシングによって達成することができる。「非標的遺伝子」という用語は、その発現が実質的にサイレンシングを受けない遺伝子である。一実施形態では、標的遺伝子及び非標的遺伝子のポリヌクレオチド配列（例えば、標的遺伝子及び非標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ）は、１つ以上のヌクレオチドが異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的遺伝子は、１つ以上の多型（例えば、一塩基多型またはＳＮＰ）によって異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的遺伝子は、１００％未満の配列同一性を共有できる。別の実施形態では、非標的遺伝子は、標的遺伝子の相同体（例えばオルソログまたはパラログ）であってもよい。
「標的対立遺伝子」は、その発現が選択的に阻害または「サイレンシング」される対立遺伝子（例えば、ＳＮＰ対立遺伝子）である。このサイレンシングは、ＲＮＡサイレンシングによって、例えば、ｓｉＲＮＡによって標的遺伝子または標的対立遺伝子のｍＲＮＡを切断することによって達成することができる。「非標的対立遺伝子」という用語は、発現が実質的にサイレンシングを受けない対立遺伝子である。特定の実施形態では、標的対立遺伝子及び非標的対立遺伝子は、同じ標的遺伝子に対応することができる。他の実施形態では、標的対立遺伝子は、標的遺伝子に対応するか、または関連しており、非標的対立遺伝子は、非標的遺伝子に対応するか、または関連している。一実施形態では、標的対立遺伝子及び非標的対立遺伝子のポリヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチドが異なり得る。別の実施形態では、標的対立遺伝子及び非標的対立遺伝子は、１つ以上の対立遺伝子多型（例えば、１つ以上のＳＮＰ）が異なり得る。別の実施形態では、標的対立遺伝子及び非標的対立遺伝子は、１００％未満の配列同一性を共有できる。
本明細書で使用される「多型」という用語は、異なる源または対象（しかし、同じ生物）からの同じ遺伝子配列を比較する場合に同定または検出される遺伝子配列中の変形（例えば、１つ以上の欠失、挿入、または置換）を指す。例えば、異なる対象からの同じ遺伝子配列を比較する場合、多型を同定することができる。このような多型の同定は、当技術分野では日常的であり、その方法論は、例えば、乳がんの点変異を検出するために使用されるものと類似している。同定は、例えば、対象のリンパ球から抽出されたＤＮＡから行うことができ、その後多型領域に対する特異的プライマーを使用して、多型領域を増幅することができる。あるいは、同じ遺伝子の２つの対立遺伝子を比較する場合に、多型を同定できる。特定の実施形態では、多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。
生物内の同じ遺伝子の２つの対立遺伝子間の配列の変形は、本明細書では「対立遺伝子多型」と呼ばれる。特定の実施形態では、対立遺伝子多型は、ＳＮＰ対立遺伝子に対応する。例えば、対立遺伝子多型は、ＳＮＰの２つの対立遺伝子間の単一ヌクレオチド変形を含み得る。多型は、コード領域内のヌクレオチドにあり得るが、遺伝暗号の縮重により、アミノ酸配列の変化はコードされない。あるいは、多型配列は、特定の位置において異なるアミノ酸をコードできるが、アミノ酸の変化は、タンパク質の機能に影響しない。多型領域は、遺伝子の非コード領域にも見られる。例示的な実施形態では、多型は、遺伝子のコード領域または遺伝子の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）に見出される。
本明細書で使用される「対立遺伝子頻度」という用語は、個体集団中の単一遺伝子座における対立遺伝子（例えば、ＳＮＰ対立遺伝子）の相対頻度の尺度（例えば、割合またはパーセンテージ）である。例えば、個体の集団が、体細胞のそれぞれ内に特定の染色体遺伝子座（及びその遺伝子座を占める遺伝子）のｎ遺伝子座を保有する場合、対立遺伝子の対立遺伝子頻度は、集団中に対立遺伝子が占める遺伝子座の割合またはパーセンテージである。特定の実施形態では、対立遺伝子（例えば、ＳＮＰ対立遺伝子）の対立遺伝子頻度は、サンプル集団中において、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％またはそれ以上）である。
本明細書で使用される場合、「サンプル集団」という用語は、統計的に有意な数の個体を含む個体の集団を指す。例えば、サンプル集団は、５０人、７５人、１００人、２００人、５００人、１０００人、またはそれ以上の個体を含み得る。特定の実施形態では、サンプル集団は、少なくとも共通の疾患表現型（例えば、機能獲得型障害）または変異（例えば、機能獲得型変異）を共有する個体を含み得る。
本明細書で使用する場合、「ヘテロ接合性」という用語は、特定の遺伝子座（例えば、ＳＮＰ）においてヘテロ接合性である（例えば、２つ以上の異なる対立遺伝子を含む）、任意のある集団内の個体の割合を指す。ヘテロ接合性は、当業者に周知の方法を用いて、サンプル集団について計算し得る。
本明細書で使用される「ポリグルタミンドメイン」という用語は、ペプチド結合に連結された連続したグルタミン残基からなるタンパク質のセグメントまたはドメインを指す。一実施形態では、連続領域は、少なくとも５つのグルタミン残基を含む。
本明細書に記載のとおり、「ＭＳＨ３」という用語は、タンパク質ＭｕｔＳ Ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ＭＳＨ３）をコードする遺伝子を指す。ＭＳＨ３は、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質であり、他のミスマッチ修復タンパク質であるＭｕｔＳ Ｈｏｍｏｌｏｇ ２（ＭＳＨ２）とヘテロ二量体を形成して、複合体ＭｕｔＳβを形成する。ＭｕｔＳβは、ＤＮＡ合成中にマイクロサテライトで、長い挿入／欠失ループ及び塩基－塩基ミスペアを補正する。
本明細書で使用される「伸長ポリグルタミンドメイン」または「伸長ポリグルタミンセグメント」という用語は、ペプチド結合によって連結された少なくとも３５の連続したグルタミン残基を含むタンパク質のセグメントまたはドメインを指す。このような伸長セグメントは、本明細書に記載のポリグルタミン障害に罹患した対象において、対象が症状を示すか否かにかかわらず見出される。
本明細書で使用される「トリヌクレオチドリピート」または「トリヌクレオチドリピート領域」という用語は、特定のトリヌクレオチド配列の連続したリピートからなる核酸配列のセグメントを指す。一実施形態では、トリヌクレオチドリピートは、少なくとも５つの連続したトリヌクレオチド配列を含む。例示的なトリヌクレオチド配列としては、これらに限定されないが、ＣＡＧ、ＣＧＧ、ＧＣＣ、ＧＡＡ、ＣＴＧ及び／またはＣＧＧが挙げられる。
本明細書で使用される「トリヌクレオチドリピート疾患」という用語は、遺伝子内に位置する伸長トリヌクレオチドリピート領域を特徴とする任意の疾患または障害を指し、伸長トリヌクレオチドリピート領域は、疾患または障害の原因である。トリヌクレオチドリピート疾患の例としては、これらに限定されないが、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳性運動失調症１２型、脊髄小脳性運動失調症８型、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、フリードライヒ運動失調症及び筋強直性ジストロフィーが挙げられる。本開示による治療のための代表的なトリヌクレオチドリピート疾患は、遺伝子のコード領域の５’末端での伸長トリヌクレオチドリピート領域を特徴とするか、またはこれによって引き起こされるものであり、遺伝子は、変異タンパク質をコードし、疾患もしくは障害を引き起こすか、またはその原因となる。特定のトリヌクレオチド疾患、例えば、変異がコード領域に関連していない脆弱Ｘ症候群は、ＲＮＡｉによって標的とされる好適なｍＲＮＡが存在しないため、本開示の方法論による治療に好適でない可能性がある。対照的に、フリードライヒ運動失調症などの疾患は、本開示の方法論による治療に好適であり得る。なぜなら、原因となる変異が、コード領域内にはない（すなわち、イントロン内にある）が、変異は、例えば、ｍＲＮＡ前駆体（例えば、プレスプライシングされたｍＲＮＡ前駆体）内にある。
「細胞または生物における遺伝子の機能を検査する」という語句は、そこから生じる発現、活性、機能または表現型を検査または研究することを指す。
本明細書で使用される「ＲＮＡサイレンシング剤」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害または「サイレンシング」することができるＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後のサイレンシング機構により、ｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳及び／または発現）を防ぐことができる。ＲＮＡサイレンシング剤としては、小さい（＜５０ｂ．ｐ．）、非コードＲＮＡ分子、例えば、対合した鎖を含むＲＮＡ二本鎖、ならびにそのような小さい非コードＲＮＡを生成することができる前駆体ＲＮＡが挙げられる。例示的なＲＮＡサイレンシング剤としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様二本鎖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＡＰＭＥＲ分子、及び二重機能オリゴヌクレオチド、ならびにそれらの前駆体が挙げられる。一実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。
本明細書で使用される場合、「希少ヌクレオチド」という用語は、低頻度で生じる天然のヌクレオチド、例えば、低頻度で生じる天然のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、例えば、グアノシン、アデノシン、シトシン、またはウリジンではない天然のリボヌクレオチドを指す。希少ヌクレオチドの例としては、これらに限定されないが、イノシン、１－メチルイノシン、シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ－メチルグアノシン及び２，２Ｎ，Ｎ－ジメチルグアノシンが挙げられる。
「操作された」という用語は、操作されたＲＮＡ前駆体または操作された核酸分子のように、前駆体または分子の核酸配列のすべてまたは一部が、作成されるかまたはヒトによって選択されるという点で、前駆体または分子が自然界に見出されないことを示す。一旦作成されるかまたは選択されると、配列は、細胞内の機構によって複製、翻訳、転写、または他の方法でプロセシングされる。したがって、操作された核酸分子を含む導入遺伝子から細胞内で産生されたＲＮＡ前駆体は、操作されたＲＮＡ前駆体である。
本明細書で使用される用語「マイクロＲＮＡ」（「ｍｉＲＮＡ」）は、当技術分野において「一時的低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）」（「ｓｔＲＮＡ」）としても知られており、（例えば、ウイルス、哺乳動物、または植物のゲノムによって）遺伝的にコードされ、ＲＮＡサイレンシングを指示または媒介することができる小さい（例えば、１０～５０ヌクレオチド）ＲＮＡを指す。「ｍｉＲＮＡ障害」は、ｍｉＲＮＡの異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害を指すものとする。
本明細書で使用される場合、用語「二重官能性オリゴヌクレオチド」は、式Ｔ－Ｌ－μを有するＲＮＡサイレンシング剤を指し、式中、Ｔは、ｍＲＮＡ標的化部分であり、Ｌは、連結部分であり、μは、ｍｉＲＮＡ動員部分である。本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡ標的化部分」、「標的化部分」、「ｍＲＮＡ標的化部分」または「標的化部分」は、十分なサイズ及びサイレンシングのために選択または標的化されたｍＲＮＡの部分または領域（すなわち、その部分は、標的ｍＲＮＡを捕捉するのに十分な配列を有する）に対して十分な相補性を有する二重機能性オリゴヌクレオチドのドメイン、部分または領域を指す。
本明細書で使用される「連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）」または「連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語は、ｍＲＮＡを共有結合により接合させるまたは連結するＲＮＡサイレンシング剤のドメイン、部分または領域を指す。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤の「アンチセンス鎖」という用語は、サイレンシングのために標的化された遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０ヌクレオチド、例えば約１５～３０ヌクレオチド、１６～２５、１８～２３または１９～２２ヌクレオチドのセクションに実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第１の鎖は、標的特異的サイレンシングを指示するために、所望の標的ｍＲＮＡ配列に対して十分に相補的である、例えば、ＲＮＡｉの機構またはプロセス（ＲＮＡｉ干渉）によって所望の標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分に相補的である、または所望の標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を引き起こすのに十分に相補的である配列を有する。
ＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤の「センス鎖」または「第２の鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第１の鎖に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖及びセンス鎖はまた、第１の鎖または第２の鎖と称することができ、第１の鎖または第２の鎖は、標的配列に対して相補性を有し、それぞれの第２の鎖または第１の鎖は、第１の鎖または第２の鎖に対して相補性を有する。ｍｉＲＮＡ二本鎖中間体またはｓｉＲＮＡ様二本鎖には、サイレンシングの標的とされる遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０のヌクレオチドのセクションに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ鎖、及びｍｉＲＮＡ鎖と二本鎖を形成するのに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ＊鎖が含まれる。
本明細書で使用される用語「ガイド鎖」は、ＲＩＳＣ複合体に入り、標的ｍＲＮＡの切断を指示する、ＲＮＡサイレンシング剤の鎖、例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖を指す。
本明細書で使用される「非対称性」という用語は、ＲＮＡサイレンシング剤の二重鎖領域（例えば、ｓｈＲＮＡのステム）の非対称性におけるように、ＲＮＡサイレンシング剤の末端間の結合強度または塩基対強度が不均等（例えば、第１の鎖またはステム部分上の末端ヌクレオチドと、対向する第２の鎖またはステム部分上の末端ヌクレオチドとの間）であることを指す。これにより、二本鎖の一方の鎖の５’末端が、相補鎖の５’末端よりも一過性の不対合状態、例えば一本鎖の状態にある頻度が高くなる。この構造上の違いにより、二重鎖の一方の鎖が、ＲＩＳＣ複合体に優先的に組み込まれることが決定する。５’末端が相補鎖とあまり強固に対合していない鎖は、優先的にＲＩＳＣに組み込まれ、ＲＮＡｉを媒介するであろう。
本明細書で使用される「結合強度」または「塩基対強度」という用語は、主に、Ｈ結合、ファンデルワールス相互作用などによるオリゴヌクレオチド二本鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖）の対抗する鎖上のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の対間、及びこれらのヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の相互作用の強度を指す。
本明細書で使用される「５’末端」は、アンチセンス鎖の５’末端のように、５’末端ヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の１～約５ヌクレオチドの間を指す。本明細書で使用される「３’末端」は、センス鎖の３’末端のように、相補的なアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドに相補的な領域、例えば、１～約５ヌクレオチドの領域を指す。
本明細書で使用される「不安定化ヌクレオチド」という用語は、塩基対が従来の塩基対（すなわち、ワトソン－クリック塩基対）よりも結合強度が低くなるように、第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と塩基対を形成することができる第１のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を指す。特定の実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、第２のヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成することができる。他の実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、第２のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成することができる。さらに他の実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、第２のヌクレオチドと曖昧な塩基対を形成することができる。
本明細書で使用される「塩基対」という用語は、オリゴヌクレオチド二重鎖（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤の鎖及び標的ｍＲＮＡ配列によって形成される二重鎖）の対向する鎖上のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の対間の、主に、ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間のＨ結合、ファンデルワールス相互作用などによる相互作用を指す。本明細書で使用される「結合強度」または「塩基対強度」という用語は、塩基対の強度を指す。
本明細書で使用される用語「ミスマッチ塩基対」は、例えば、正常な相補的なＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ塩基対ではない、非相補的または非ワトソンクリック塩基対からなる塩基対を指す。本明細書で使用される用語「曖昧な塩基対」（非識別塩基対としても知られる）は、ユニバーサルヌクレオチドによって形成される塩基対を指す。
本明細書で使用される「ユニバーサルヌクレオチド（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」（「中性ヌクレオチド」としても知られる）という用語は、塩基対を形成するときの相補的なポリヌクレオチド上で塩基間を有意に識別しない塩基（「ユニバーサル塩基」または「中性塩基」）を有するヌクレオチド（例えば、ある特定の不安定化ヌクレオチド）を含む。ユニバーサルヌクレオチドは、主に疎水性分子であり、スタッキング相互作用により逆平行二本鎖核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）に効率よくパックすることができる。ユニバーサルヌクレオチドの塩基部分は、典型的には、窒素含有芳香族複素環部分を含む。
本明細書で使用される「十分な相補性」または「十分な程度の相補性」という用語は、ＲＮＡサイレンシング剤が、それぞれ、所望の標的に結合する、及び標的ｍＲＮＡのＲＮＡサイレンシングを誘発するのに十分な配列を（例えば、アンチセンス鎖、ｍＲＮＡ標的化部分またはｍｉＲＮＡ動員部分中に）有することを意味する。
本明細書で使用される「翻訳抑制」という用語は、ｍＲＮＡ翻訳の選択的阻害を指す。自然な翻訳抑制は、ｓｈＲＮＡ前駆体から切断されたｍｉＲＮＡを介して進行する。ＲＮＡｉ及び翻訳抑制の両方が、ＲＩＳＣによって媒介される。ＲＮＡｉ及び翻訳抑制の両方が自然に発生するか、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングするためにヒトの手によって開始され得る。
本開示の様々な方法論は、値、レベル、特徴、特性、性質などを、本明細書では交換可能に「適切な対照」と呼ばれる「好適な対照」と比較することを含むステップを含む。「好適な対照」または「適切な対照」は、比較目的に有用な、当業者によく知られている任意の対照または標準である。一実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、本明細書に記載のとおり、ＲＮＡｉ方法論を実施する前に決定された値、レベル、特徴、特性、性質などである。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特徴または性質、遺伝子型、表現型などは、本開示のＲＮＡサイレンシング剤を細胞または生物に導入する前に決定することができる。別の実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、細胞または生物、例えば対照または例えば、正常な形質を呈する正常な細胞もしくは生物において、決定された値、レベル、特徴、特性、性質などである。さらに別の実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、事前定義された値、レベル、特徴、特性、性質などである。
特に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法及び材料が、本開示の実施または試験において使用され得るものの、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。
Ｉ．新規標的配列
特定の例示的な実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、表４及び表６に列挙されるとおり、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列を標的とすることができる。特定の例示的な実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、表５及び表６に列挙されている、配列番号１３～１８及び３１～４２からなる群から選択されるＭＳＨ３核酸配列の１つ以上を標的とすることができる。
各標的配列のゲノム配列は、例えば、ＮＣＢＩによって維持されている公的に利用可能なデータベースで見つけることができる。
ＩＩ．ｓｉＲＮＡの設計
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下のように設計される。最初に、標的遺伝子（例えば、ＭＳＨ３遺伝子）の一部、例えば、表４に示される標的配列のうちの１つ以上が選択される。これらの部位におけるｍＲＮＡの切断は、対応するタンパク質の翻訳が不要になるものである。アンチセンス鎖は、標的配列に基づいて設計され、センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的であるように設計した。アンチセンス鎖とセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、ｓｉＲＮＡ二重鎖が形成される。アンチセンス鎖は、約１９～２５ヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドを含む。センス鎖は、約１４～２５ヌクレオチド、例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、センス鎖は、１５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖は、１８ヌクレオチドである。他の実施形態では、センス鎖は、２０ヌクレオチドである。しかし、当業者であれば、１９ヌクレオチド未満の長さまたは２５ヌクレオチドを超える長さを有するｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉを媒介するように機能し得ることを理解するであろう。したがって、そのような長さのｓｉＲＮＡもまた、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持する限り、本開示の範囲内である。より長いＲＮＡｉ剤が、特定の哺乳動物細胞でインターフェロンまたはＰＫＲ応答を誘発することが実証されているが、これは望ましくない場合がある。特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＰＫＲ応答を誘発しない（すなわち、十分に短い長さのものである）。しかし、より長いＲＮＡｉ剤は、例えば、ＰＫＲ応答を生じさせることができない細胞型、または代替手段によってＰＫＲ応答が下方制御または抑制されている状況では有用であり得る。
センス鎖配列は、標的配列が本質的に鎖の中央にあるように設計することができる。標的配列を中心からずれた位置に移動させることにより、場合によっては、ｓｉＲＮＡによる切断の効率が低下し得る。こうした組成物、すなわち効率の低い組成物は、野生型ｍＲＮＡのオフサイレンシングが検出された場合に使用するのに望ましいかもしれない。
アンチセンス鎖は、センス鎖と同じ長さであってもよく、相補的ヌクレオチドを含む。一実施形態では、鎖は、完全に相補的である。すなわち、鎖は、アラインまたはアニーリングさせたときに、平滑末端となる。別の実施形態では、鎖は、１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチドオーバーハングが、生成されるようにアラインまたはアニールされる。すなわちセンス鎖の３’末端が、アンチセンス鎖の５’末端よりも１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド伸長している、及び／またはアンチセンス鎖の３’末端が、センス鎖の５’末端よりも１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド伸長している。オーバーハングは、標的遺伝子配列（またはその相補体）に対応するヌクレオチドを含む（またはからなる）ことができる。あるいは、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばｄＴ、またはヌクレオチド類似体、または他の好適な非ヌクレオチド物質を含む（またはそれらからなる）ことができる。
ＲＩＳＣへのアンチセンス鎖の侵入を容易にする（したがって、標的の切断及びサイレンシングの効率を上昇させるまたは改善する）ために、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端との間の塩基対強度を改変（低下または減少）させ得る。これらは、以下に詳細に記載され、米国特許第７，４５９，５４７号、第７，７７２，２０３号及び第７，７３２，５９３号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」、（２００３年６月２日出願）及び米国特許第８，３０９，７０４号、７，７５０，１４４号、第８，３０４，５３０号、第８，３２９，８９２号及び第８，３０９，７０５号表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡｉ」（２００３年６月２日出願）、これらの内容全体がこの参照によりその組み込まれる。本開示のこれらの態様の一実施形態では、第１の鎖またはアンチセンス鎖の５’末端と第２の鎖またはセンス鎖の３’末端との間のＧ：Ｃ塩基対が、第１の鎖またはアンチセンス鎖の３’末端と第２の鎖またはセンス鎖の５’末端との間よりも少ないため、塩基対強度は低い。別の実施形態では、塩基対強度は、第１の鎖またはアンチセンス鎖の５’末端と第２の鎖またはセンス鎖の３’末端との間の少なくとも１つのミスマッチ塩基対により小さい。特定の例示的な実施形態では、ミスマッチ塩基対は、以下からなる群から選択される：Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ及びＵ：Ｕ。別の実施形態では、塩基対強度は、第１またはアンチセンス鎖の５’末端と第２またはセンス鎖の３’末端との間の少なくとも１つのゆらぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕにより低い。別の実施形態では、塩基対強度は、希少ヌクレオチド、例えばイノシン（Ｉ）を含む少なくとも１つの塩基対により低い。特定の例示的な実施形態では、塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ及びＩ：Ｃからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、塩基対強度は、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対により低い。特定の例示的な実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２－アミノ－Ｇ、２－アミノ－Ａ、２，６－ジアミノ－Ｇ、及び２，６－ジアミノ－Ａからなる群から選択される。
表４に示されるＭＳＨ３標的配列を標的とするのに好適であるｓｉＲＮＡの設計は、以下に詳細に記載する。ｓｉＲＮＡは、ＭＳＨ３遺伝子中に見られる任意の他の標的配列について、上記の例示的な教示に従って設計することができる。さらに、この技術は、例えば疾患を引き起こさない標的配列など、任意の他の標的配列を標的とすることに適用可能である。
ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ）を破壊することによる有効性を検証するために、キイロショウジョウバエをベースにしたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ発現系において、ｓｉＲＮＡをｃＤＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｃＤＮＡ）と共にインキュベートすることができる。３２Ｐで放射性標識された、新しく合成されたｍＲＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ）は、アガロースゲル上でオートラジオグラフィーにより検出される。切断されたｍＲＮＡの存在は、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。好適な対照には、ｓｉＲＮＡの省略が含まれる。あるいは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に対して有意な配列相補性を有さない対照ｓｉＲＮＡが選択される。こうした陰性対照は、選択したｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることによって設計できる。相同性検索を実行して、陰性対照が、適切なゲノム内の任意の他の遺伝子との相同性を欠いていることが確認できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡは、１つ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計できる。最適なｍＲＮＡ特異性及び最大ｍＲＮＡ切断をもたらすｓｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ相補部位が選択される。
ＩＩＩ．ＲＮＡｉ剤
本開示は、例えば上記のように設計されたｓｉＲＮＡ分子などのＲＮＡｉ分子を含む。本開示のｓｉＲＮＡ分子は、化学的に合成することができ、またはＤＮＡ鋳型からｉｎ ｖｉｔｒｏで、または例えばｓｈＲＮＡからｉｎ ｖｉｖｏで転写することができ、または組換えヒトＤＩＣＥＲ酵素を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｄｓＲＮＡ鋳型を切断して、２０、２１、または２３ｂｐの二本鎖ＲＮＡ媒介ＲＮＡｉのプールにする。ｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、設計することができる。
一態様では、ＲＮＡｉ剤が干渉リボ核酸、例えば上記のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである代わりに、ＲＮＡｉ剤は、干渉リボ核酸、例えば上記のｓｈＲＮＡをコードすることができる。換言すれば、ＲＮＡｉ剤は、干渉リボ核酸の転写鋳型となり得る。したがって、本開示のＲＮＡｉ剤はまた、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｈＲＮＡを発現するように操作された発現構築物を含み得る。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターで開始され、４－５－チミン転写終結部位の２位で終結すると考えられている。発現時に、ｓｈＲＮＡは、折り畳まれて、３’ＵＵオーバーハングを有するステムループ構造になると考えられ、その後、これらのｓｈＲＮＡの末端がプロセシングされ、ｓｈＲＮＡが、約２１～２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換される（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００２上記；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記。ｓｈＲＮＡの設計及び使用に関するさらなる情報は、インターネットの次のアドレスで確認できる：ｋａｔａｎｄｉｎ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ：９３３１／ＲＮＡｉ／ｄｏｃｓ／ＢｓｅＲＩ－ＢａｍＨＩ＿Ｓｔｒａｔｅｇｙ．ｐｄｆ ａｎｄ ｋａｔａｎｄｉｎ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ：９３３１／ＲＮＡｉ／ｄｏｃｓ／Ｗｅｂ＿ｖｅｒｓｉｏｎ＿ｏｆ＿ＰＣＲ＿ｓｔｒａｔｅｇｙ１．ｐｄｆ）。
本開示の発現構築物としては、適切な発現系での使用に好適である任意の構築物が挙げられ、当技術分野において知られているとおり、これらに限定されないが、レトロウイルスベクター、線形発現カセット、プラスミド、及びウイルスまたはウイルス由来のベクターが挙げられる。そのような発現構築物は、１つ以上の誘導性プロモーター、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター系、例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーターもしくはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、または当技術分野で知られている他のプロモーターを挙げることができる。構築物は、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖を含むことができる。両方の鎖を発現する発現構築物はまた、両方の鎖を連結するループ構造を含むことができ、または各鎖は、同じ構築物内の別々のプロモーターから別々に転写することができる。各鎖は、別々の発現構築物から転写できる（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，２００２，上記）。
合成ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソームトランスフェクション及びエレクトロポレーションなど、当技術分野で知られている方法によって細胞に送達することができる。標的遺伝子（例えば、ＭＳＨ３遺伝子）の長期的な抑制を得るため、及び特定の状況下での送達を容易にするために、１つ以上のｓｉＲＮＡを組換えＤＮＡ構築物から細胞内で発現させることができる。組換えＤＮＡ構築物から細胞内でｓｉＲＮＡ二本鎖を発現させて、細胞内でより長期の標的遺伝子抑制を可能にするためのそのような方法は、機能的な二本鎖ｓｉＲＮＡを発現することができる哺乳動物Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター系（例えば、Ｈ１またはＵ６／ｓｎＲＮＡプロモーター系（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，２００２，上記）など、当該分野で既知である（Ｂａｇｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記）。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩによる転写終結は、ＤＮＡ鋳型内の一連の４つの連続するＴ残基で生じ、これにより、ｓｉＲＮＡ転写産物を特定の配列で終結させる機構がもたらされる。ｓｉＲＮＡは、５’－３’及び３’－５’方向で標的遺伝子の配列に相補的であり、ｓｉＲＮＡの２本の鎖は、同じ構築物または別々の構築物内で発現し得る。Ｈ１またはＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動され、細胞内で発現するヘアピンｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害することができる（Ｂａｇｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００２），上記；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記）。Ｔ７プロモーターの制御下にあるｓｉＲＮＡ 配列を含む構築物は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するベクターと共に細胞に同時トランスフェクトされたときに、機能的なｓｉＲＮＡも作成される（Ｊａｃｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記）。単一の構築物は、同じ遺伝子または複数の遺伝子を標的とするＭＳＨ３をコードする遺伝子の複数の領域など、ｓｉＲＮＡをコードする複数の配列を含んでもよく、また、例えば、別のＰｏｌＩＩＩ プロモーター部位によって駆動され得る。
動物細胞は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる約２２ヌクレオチドの一連の非コードＲＮＡを発現する。これは、動物の発育中に転写後または翻訳レベルで遺伝子発現を調節できる。ｍｉＲＮＡの共通の特徴の１つは、おそらくＲＮａｓｅ ＩＩＩ型酵素であるＤｉｃｅｒ、またはその相同体によって、約７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステムループからすべてが切り出されることである。ｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を標的ｍＲＮＡに相補的な配列で置換することにより、操作された前駆体を発現するベクター構築物を使用して、ｓｉＲＮＡを産生し、哺乳動物細胞内の特定のｍＲＮＡ標的に対してＲＮＡｉを開始できる（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記，２００２）。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むＤＮＡベクターによって発現したときに、マイクロＲＮＡ設計ヘアピンは、遺伝子発現のサイレンシングを行うことができる（ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記）。多型を標的とするマイクロＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングがない場合、変異タンパク質の翻訳をブロックするのにも有用であり得る。このような用途は、例えば、設計されたｓｉＲＮＡが、野生型タンパク質のオフターゲット サイレンシングを引き起こした状況において、有用であり得る。
ウイルス媒介性送達機構は、ｓｉＲＮＡの発現を介して、例えば、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ プロモーター転写制御下で、ｓｉＲＮＡを保有する組換えアデノウイルスを生成することによって、標的とした遺伝子の特異的サイレンシングを誘導するためにも使用できる（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記）。これらの組換えアデノウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染により、内因性標的遺伝子の発現が減少し得る。ｓｉＲＮＡの標的遺伝子を発現するトランスジェニックマウスへ組換えアデノウイルスベクターを注入することにより、標的遺伝子発現のｉｎ ｖｉｖｏ減少がもたらされる。同上。動物モデルでは、全胚エレクトロポレーションにより、合成ｓｉＲＮＡを移植後のマウス胚に効率的に送達できる（Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。成体マウスでは、ｓｉＲＮＡの効率的な送達は、「高圧」送達技術、大量のｓｉＲＮＡ含有溶液を動物の尾静脈から急速に（５秒以内に）注入することにより達成できる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，上記；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，上記；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２。ナノ粒子及びリポソームを使用して、ｓｉＲＮＡを動物に送達することもできる。特定の例示的な実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）及びそれらの関連ベクターを使用して、１つ以上のｓｉＲＮＡを細胞、例えば神経細胞（例えば脳細胞）に送達することができる（米国特許出願第２０１４／０２９６４８６号、同第２０１０／０１８６１０３号、同第２００８／０２６９１４９号、同第２００６／００７８５４２号、及び同第２００５／０２２０７６６号）。
本開示の核酸組成物は、非修飾ｓｉＲＮＡ及び修飾ｓｉＲＮＡ、例えば、架橋ｓｉＲＮＡ誘導体または例えばそれらの３’末端または５’末端に連結した非ヌクレオチド部分を有する誘導体など、を両方とも含む。このようにｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することにより、対応するｓｉＲＮＡと比較して、細胞への取込みを改善する、または得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞標的活性を向上させることができ、また、ｓｉＲＮＡ誘導体を細胞内で追跡する、または対応するｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善するのに有用である。
本明細書に記載のとおり、細胞または生物全体に導入された操作されたＲＮＡ前駆体により、所望のｓｉＲＮＡ分子の産生がもたらされる。次いで、そのようなｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ経路の内因性タンパク質成分と会合して、特定のｍＲＮＡ配列に結合し、切断及び破壊のための標的とする。このようにして、操作されたＲＮＡ前駆体から生成されたｓｉＲＮＡによって標的とされるｍＲＮＡは、細胞または生物から枯渇し、これにより、細胞または生物中のそのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の濃度の低下となる。ＲＮＡ前駆体は、典型的には、ｄｓＲＮＡの１つの鎖を個別にコードするか、またはＲＮＡヘアピンループ構造の全ヌクレオチド配列をコードするかのいずれかである核酸分子である。
本開示の核酸組成物は、コンジュゲートしていなくてもよく、またはナノ粒子などの別の部分にコンジュゲートしてもよく、これにより、組成物の性質、例えば、吸収、効果、バイオアベイラビリティ及び／または半減期などの薬物動態パラメータを向上させる。コンジュゲーションは、例えば、本技術で知られている方法、以下の方法を用いて、達成することができる；Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．：４７（１），９９－１１２（２００１）（ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子に付加された核酸について記載）；Ｆａｔｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３（１－３）：１３７－４３（１９９８）（ナノ粒子に結合した核酸について記載）；Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．５ Ｓｕｐｐｌ．４：５５－８（１９９４）（インターカレーション剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子と連結した核酸について記載）；及びＧｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２（２）：４０４－１０（１９９５）（ナノ粒子に連結した核酸について記載）。
本開示の核酸分子は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して標識することもできる。例えば、核酸組成物は、フルオロフォア、例えば、Ｃｙ３、フルオレセイン、またはローダミンで標識することができる。標識は、キット、例えば、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ標識キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して行うことができる。さらに、ｓｉＲＮＡは、例えば、３Ｈ、３２Ｐまたは別の適切な同位体を使用して、放射標識させ得る。
さらに、ＲＮＡｉは、少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ中間体を介して進行すると考えられているため、当業者であれば、ｓｓ－ｓｉＲＮＡ（例えば、ｄｓ－ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖）も、本明細書に記載のとおり、（例えば、化学合成のために）設計され、生成され（例えば、酵素的に生成され）るか、または（例えば、ベクターまたはプラスミドから）発現され、特許請求される方法論に従って利用され得ることを理解するであろう。さらに、無脊椎動物では、ＲＮＡｉは、ＲＮＡｉのエフェクターとして作用する長いｄｓＲＮＡ（例えば、約１００～１０００ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡ、例えば、約２００～５００、例えば、約２５０、３００、３５０、４００または４５０ヌクレオチド長など）によって効果的に誘発され得る （Ｂｒｏｎｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１ Ｄｅｃ．４；９８（２５）：１４４２８－３３．Ｅｐｕｂ ２００１ Ｎｏｖ．２７．）
ＩＶ．抗ＭＳＨ３ ＲＮＡサイレンシング剤
特定の実施形態では、本開示は、新規抗ＭＳＨ３ ＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＲＮＡサイレンシング剤を作製する方法、及びＭＳＨ３タンパク質のＲＮＡサイレンシングのために、改善されたＲＮＡサイレンシング剤（またはその一部）を使用するための方法（例えば、研究及び／または治療方法）を提供する。ＲＮＡサイレンシング剤は、アンチセンス鎖（またはその一部）を含み、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ媒介サイレンシング機構（例えば、ＲＮＡｉ）を媒介するために標的ＭＳＨ３ ｍＲＮＡに十分な相補性を有する。
特定の実施形態では、以下の特性のうちの１つまたは任意の組み合わせを有するｓｉＲＮＡ化合物が提供される：（１）完全に化学的に安定化している（すなわち、未修飾の２’－ＯＨ残基がない）；（２）非対称；（３）１１～２０塩基対の二重鎖；（４）５０％を超える２’－メトキシ修飾、例えば、７０％～１００％ ２’－メトキシ修飾、化学的修飾ヌクレオチドの交互パターン（例えば、２’－フルオロ及び２’－メトキシ修飾）も企図される；及び（５）一本鎖、完全にホスホロチオ化された５～８塩基のテール。特定の実施形態では、ホスホロチオエート修飾の数は、合計４～１６で変動する。特定の実施形態では、ホスホロチオエート修飾の数は、合計８～１３まで変動する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ化合物は、これらに限定されないが、コレステロール、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、フェニルトロパン、コルチゾール、ビタミンＡ、ビタミンＤ、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）及びガングリオシドなど、様々な標的化剤にコンジュゲートすることができる。コレステロール修飾型は、広範囲の細胞型（例えば、ＨｅＬａ、ニューロン、肝細胞、栄養芽層）において、以前に使用された化学的安定化パターン（例えば、ピリミジンではなくすべてのプリンが修飾されている）と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効果が５～１０倍改善したことを示した。
上記及び本明細書に記載の構造特性を有する本開示の特定の化合物は、「ｈｓｉＲＮＡ－ＡＳＰ」（高度安定化パターンを特徴とする疎水的に修飾された低分子干渉ＲＮＡ）と称され得る。さらに、このｈｓｉＲＮＡ－ＡＳＰパターンは、脳、脊髄から、肝臓、胎盤、腎臓、脾臓、及び他のいくつかの組織への送達を介して劇的に改善された分布を示し、治療的介入に利用できるようになった。
本開示の化合物は、以下の態様及び実施形態で説明することができる。
第１の態様では、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が本明細書に提供され、各鎖は、５’末端及び３’末端を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含み、
（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
（２）アンチセンス鎖は、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；
（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；
（６）センス鎖は、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；
（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
第２の態様では、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡが本明細書に提供され、各鎖は、５’末端及び３’末端を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含み、
（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（３）アンチセンス鎖の５’末端から１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；
（６）センス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
第３の態様では、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡが本明細書に提供され、各鎖は、５’末端及び３’末端を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含み、
（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
（２）アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；
（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
第４の態様では、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡが本明細書に提供され、各鎖は、５’末端及び３’末端を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含み、
（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（３）アンチセンス鎖の５’末端から４位、５位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；
（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
第５の態様では、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡが本明細書に提供され、各鎖は、５’末端及び３’末端を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含み、
（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、４位、５位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；
（６）センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（７）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
第６の態様では、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡが本明細書に提供され、各鎖は、５’末端及び３’末端を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含み、
（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、１４位、及び１６位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；
（６）センス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（７）センス鎖の３’末端から７位、９位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
第７の態様では、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡが本明細書に提供され、各鎖は、５’末端及び３’末端を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含み、
（１）アンチセンス鎖は、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
（２）アンチセンス鎖は、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（３）アンチセンス鎖の５’末端から２位、６位、及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（４）アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
（５）アンチセンス鎖の一部が、センス鎖の一部に相補的である；
（６）センス鎖は、少なくとも８０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
（７）センス鎖の３’末端から７位、１０位、及び１１位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
（８）センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。
ａ）抗ＭＳＨ３ ｓｉＲＮＡ分子の設計
本願のｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖から作られた二重鎖であり、このアンチセンス鎖は、ＲＮＡｉを媒介するために、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡに十分に相補性を有する。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０～５０以上のヌクレオチド長を有する、すなわち、各鎖は、１０～５０のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖中に約１５～３０、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチド長を有する。ここで、鎖のうちの１つは、標的領域に十分に相補的である。特定の実施形態では、鎖は、アラインしない（すなわち、対向する鎖中に、相補的な塩基が生じない）鎖の末端に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の塩基が存在するように配列される。これにより、鎖がアニールされるときに、二本鎖の一端または両端で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基のオーバーハングが発生するようになる。
通常、ｓｉＲＮＡは、当技術分野において公知である任意の方法を使用して、例えば、以下のプロトコルを使用して設計することができる：
１．ｓｉＲＮＡは、標的配列、例えば、実施例に記載の標的配列に特異的であるものとする。第１の鎖は、標的配列に相補的であるものとし、他の鎖は、第１の鎖に実質的に相補的である。（例示的なセンス及びアンチセンス鎖については実施例を参照されたい。）例示的標的配列は、強力な遺伝子サイレンシングをもたらす標的遺伝子の任意の領域から選択される。標的遺伝子の領域には、これらに限定されないが、標的遺伝子の５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、標的遺伝子の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、標的遺伝子のエクソン、または標的遺伝子のイントロンが挙げられる。これらの部位でのｍＲＮＡの切断は、対応するＭＳＨ３タンパク質の翻訳を不要とするものである。ＭＳＨ３遺伝子の他の領域からの標的配列も標的化に好適である。センス鎖は、標的配列に基づいて設計される。
２．ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、選択した標的部位の配列に基づいて設計される。特定の実施形態では、センス鎖は、約１５～２５ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２０ヌクレオチド長である。しかし、当業者であれば、１５ヌクレオチド未満の長さまたは２５ヌクレオチドを超える長さを有するｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉを媒介するように機能し得ることを理解するであろう。したがって、そのような長さのｓｉＲＮＡもまた、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持する限り、本開示の範囲内である。より長いＲＮＡサイレンシング剤が、特定の哺乳動物細胞でインターフェロンまたはプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）応答を誘発することが実証されているが、これは望ましくない場合がある。特定の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、ＰＫＲ応答を誘発しない（すなわち、十分に短い長さのものである）。しかし、より長いＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、ＰＫＲ応答を生じさせることができない細胞型、または代替手段によって、ＰＫＲ応答が下方制御または抑制されている状況では有用であり得る。
本開示のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介できるように、標的配列との十分な相補性を有する。一般に、標的遺伝子の標的配列部分に十分に相補的なヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡが、標的遺伝子のＲＩＳＣ媒介切断をもたらすことが企図される。したがって、特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的の一部に十分に相補的な配列を有するように設計される。例えば、アンチセンス鎖は、標的部位に対して１００％の相補性を有し得る。しかし、相補性が１００％である必要はない。アンチセンス鎖と標的ＲＮＡ配列との間で、８０％を超える同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％の相補性が企図される。本願は、ＲＮＡｉの効率及び特異性を高めるために、特定の配列の変形を許容できるという利点を有する。一実施形態では、アンチセンス鎖は、野生型対立遺伝子と突然変異対立遺伝子との間で少なくとも１つの塩基対が異なる標的領域などの標的領域と４、３、２、１、または０個のミスマッチヌクレオチドを有する。例えば、標的領域は、機能獲得型変異を含み、他の鎖は、第１の鎖と同一であるかまたは実質的に同一である。さらに、１または２ヌクレオチドの小さい挿入または欠失を有するｓｉＲＮＡ配列も、ＲＮＡｉの媒介に有効であり得る。あるいは、ヌクレオチド類似体の置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効であり得る。
配列同一性は、当技術分野で知られている配列比較及びアラインメントアルゴリズムによって決定され得る。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）の同一性パーセントを決定するために、最適な比較のために配列をアラインさせる（例えば、最適なアラインのために第１の配列または第２の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置のヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じ残基で占有されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、その配列が共有する同一位置の数に対応し（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数ｘ１００）、任意により、導入されたギャップの数及び／または導入されたギャップの長さのスコアにペナルティを付与する。
配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。一実施形態では、アラインメントは、十分な同一性を有するアラインされた配列の特定の部分において生成され、低い程度の同一性を有する部分では生成されない（すなわち、局所的アラインメント）。配列の比較に利用される局所アラインメントアルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８、改訂Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０に組み込まれる。
別の実施形態では、アラインメントは、適切なギャップを導入することによって最適化され、パーセント同一性は、アラインされた配列の長さ（すなわち、ギャップのあるアラインメント）にわたって決定される。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載のとおり使用できる。別の実施形態では、適切なギャップを導入することによってアラインメントを最適化し、アラインされた配列の全長においてパーセント同一性を決定する（すなわち、グローバルアラインメント）。配列のグローバル比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）である。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。
３．ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖は、日常的に、センス鎖と同じ長さであり、相補的ヌクレオチドを含む。一実施形態では、ガイド鎖及びセンス鎖は、完全に相補的である。すなわち、鎖は、アラインまたはアニーリングされたときに、平滑末端化される。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの鎖は、１～７（例えば、２、３、４、５、６または７）、または１～４の３’オーバーハング、例えば、２、３、または４ヌクレオチドを有するように、対合させ得る。オーバーハングは、標的遺伝子配列（またはその相補体）に対応するヌクレオチドを含む（またはからなる）ことができる。あるいは、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばｄＴ、またはヌクレオチド類似体、または他の好適な非ヌクレオチド物質を含む（またはそれらからなる）ことができる。したがって、別の実施形態では、核酸分子は、ＴＴなどの２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し得る。オーバーハングヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。上記のとおり、変異体：野生型のミスマッチがプリン：プリンのミスマッチである標的領域を選択することが望ましい。
４．当技術分野で知られている任意の方法を使用して、潜在的な標的を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と比較して、他のコード配列と有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮する必要がなくなる。このような配列相同性検索の方法の１つは、ＢＬＡＳＴとして知られており、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＷｅｂサイトで入手できる。
５．評価基準を満たす１つ以上の配列を選択する。
ｓｉＲＮＡの設計及び使用に関する一般的な情報は、Ｔｈｅ Ｍａｘ－Ｐｌａｎｋ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｃｈｅ ＣｈｅｍｉｅのＷｅｂサイトで入手可能な「Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」に見ることができる。
あるいは、ｓｉＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズできる（例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡと、５０℃または７０℃、１２～１６時間ハイブリダイズし、その後洗浄する）ヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義され得る。追加のハイブリダイゼーション条件には、１ｘＳＳＣで７０℃または１ｘＳＳＣで５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、その後０．３ｘＳＳＣ、７０℃での洗浄、または４ｘＳＳＣで７０℃または４ｘＳＳＣで５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、その後１ｘＳＳＣで６７℃での洗浄が含まれる。長さが５０塩基対未満であることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５～１０℃低いものとする。ここで、Ｔｍは、次式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数＃）。長さが１８～４９塩基対のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）（式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーションバッファ中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件の追加の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０及び６．３－６．４に記載され、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
陰性対照ｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成物を有するものとするが、適切なゲノムとの有意な配列相補性はない。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることによって設計され得る。相同性検索を実施して、陰性対照が、適切なゲノム内の任意の他の遺伝子との相同性を欠いていることを確認できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡは、１つ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計できる。
６．ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡ（例えば、野生型または変異体ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ）を破壊することによる有効性を検証するために、キイロショウジョウバエをベースにしたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ発現系において、ｓｉＲＮＡを標的ｃＤＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｃＤＮＡ）と共にインキュベートさせ得る。３２Ｐで放射性標識された、新しく合成された標的ｍＲＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ）は、アガロースゲル上でオートラジオグラフィーにより検出される。切断された標的ｍＲＮＡの存在は、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。好適な対照には、ｓｉＲＮＡの省略及び非標的ｃＤＮＡの使用が含まれる。あるいは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に対して有意な配列相補性を有さない対照ｓｉＲＮＡが選択される。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることによって設計できる。相同性検索を実施して、陰性対照が、適切なゲノム内の任意の他の遺伝子との相同性を欠いていることを確認できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡは、１つ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計できる。
抗ＭＳＨ３ ｓｉＲＮＡは、上記の標的配列のいずれかを標的とするように設計され得る。ｓｉＲＮＡは、標的配列のサイレンシングを媒介するために標的配列と十分に相補的であるアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡである。
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、表５に示される配列を含むセンス鎖、及び表５に示される配列を含むアンチセンス鎖を含む。
最適なｍＲＮＡ特異性及び最大ｍＲＮＡ切断をもたらすｓｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ相補部位が選択される。
ｂ）ｓｉＲＮＡ様分子
本開示のｓｉＲＮＡ様分子は、ＲＮＡｉまたは翻訳抑制による遺伝子サイレンシングを指示するために、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡの標的配列に「十分に相補的」である配列を有する（すなわち、配列を有する鎖を有する）。ｓｉＲＮＡ様分子は、ｓｉＲＮＡ分子と同じ方法で設計されるが、センス鎖と標的ＲＮＡ間の配列同一性の程度は、ｍｉＲＮＡとその標的間で観察されるものに近似する。一般に、ｍｉＲＮＡ配列と対応する標的遺伝子配列との間の配列同一性の程度が低下したときに、ＲＮＡｉではなく翻訳抑制によって転写後の遺伝子サイレンシングが媒介される傾向が上昇する。したがって、標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが所望される別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、標的遺伝子配列と部分的な相補性を有する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡ内（例えば、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内）に分散した１つ以上の短い配列（相補部位）との部分的な相補性を有する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００２；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２００３；Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，２００３）。翻訳抑制の機構は協調的であるため、特定の実施形態では、複数の相補性部位（例えば、２、３、４、５、または６）を標的とし得る。
ＲＮＡｉまたは翻訳抑制を媒介するｓｉＲＮＡ様二本鎖の能力は、標的遺伝子配列と相補部位におけるサイレンシング剤のヌクレオチド配列との間の非同一ヌクレオチドの分布によって予測され得る。翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが所望される一実施形態では、ｍｉＲＮＡガイド鎖及び標的ｍＲＮＡによって形成される二重鎖が、中央の「バルジ」を含むように、少なくとも１つの同一でないヌクレオチドが相補性部位の中央部分に存在する（Ｄｏｅｎｃｈ Ｊ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，２００３）。別の実施形態では、２、３、４、５、または６の連続したまたは連続していない非同一ヌクレオチドが導入される。非同一ヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対（例えば、Ｇ：Ｕ）またはミスマッチ塩基対（Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ）を形成するように選択され得る。さらなる実施形態では、「バルジ」は、ｍｉＲＮＡ分子の５’末端から１２位及び１３位のヌクレオチドを中心とする。
ｃ）ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子
特定の特徴的な実施形態では、本開示は、高選択性を有するＭＳＨ３標的配列のＲＮＡサイレンシングを媒介することができるｓｈＲＮＡを提供する。ｓｉＲＮＡとは対照的に、ｓｈＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の天然の前駆体を模倣し、遺伝子サイレンシング経路の最上部に入る。このため、ｓｈＲＮＡは、天然遺伝子サイレンシング経路全体を介して供給されることにより、遺伝子サイレンシングをより効率的に媒介すると考えられている。
ｍｉＲＮＡは、約２２ヌクレオチドの非コードＲＮＡであり、植物及び動物の発育中に、転写後または翻訳レベルで遺伝子発現を調節できる。ｍｉＲＮＡの共通の特徴の１つは、おそらくＲＮａｓｅ ＩＩＩ型酵素であるＤｉｃｅｒ、またはその相同体によって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと称される約７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステムループからすべてが切り出されることである。天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）は、一般に相補的な２つの部分を含む二本鎖ステムを形成する一本鎖と、ステムの２つの部分を接続するループとを有する。典型的なｐｒｅ－ｍｉＲＮＡでは、ステムは、１つ以上のバルジ、例えば、ステムの一部内に単一のヌクレオチド「ループ」を作成する余分なヌクレオチド、及び／またはステムの２つの部分の相互のハイブリダイゼーション内にギャップを作る１つ以上の不対ヌクレオチドを含む。本願のショートヘアピンＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体は、これらの天然に存在するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡに基づく人工構築物であるが、所望のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、本開示のｓｉＲＮＡ）を送達するように操作されている。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステム配列を標的ｍＲＮＡに相補的な配列に置換することにより、ｓｈＲＮＡが形成される。ｓｈＲＮＡは、細胞の遺伝子サイレンシング経路全体によってプロセシングし、それによってＲＮＡｉを効率的に媒介する。
ｓｈＲＮＡ分子の必要なエレメントは、アニーリングまたはハイブリダイズして二重鎖または二本鎖ステム部分を形成するのに十分な相補性を有する、第１の部分及び第２の部分を含む。２つの部分は、完全にまたは完璧に相補的である必要はない。第１及び第２の「ステム」部分は、ｓｈＲＮＡの他の部分にアニーリングまたはハイブリダイズするには十分でない配列相補性を有する配列を有する部分によって結合される。この後者の部分は、ｓｈＲＮＡ分子内の「ループ」部分と呼ばれる。ｓｈＲＮＡ分子は、プロセシングされて、ｓｉＲＮＡが生成される。ｓｈＲＮＡは、１つ以上のバルジ、すなわち、ステムの一部中に小さいヌクレオチド「ループ」、例えば１、２、または３ヌクレオチドループを作成する余分のヌクレオチドも含むことができる。ステム部分は、同じ長さであることができ、または一部は、例えば、１～５ヌクレオチドのオーバーハングを含むことができる。オーバーハングヌクレオチドは、例えば、ウラシル（Ｕ）、例えばすべてのＵを含み得る。このようなＵは、転写の終結をシグナル伝達するｓｈＲＮＡコードＤＮＡ内のチミジン（Ｔ）によって特にコードされる。
本開示のｓｈＲＮＡ（または操作された前駆体ＲＮＡ）では、二重鎖ステムの一部は、ＭＳＨ３標的配列に相補的（またはアンチセンス）な核酸配列である。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡのステム部分の一方の鎖は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列に対して十分に相補的（例えば、アンチセンス）であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的ＲＮＡの分解または切断を媒介する。したがって、操作されたＲＮＡ前駆体は、２つの部分を有する二重ステムと、２つのステム部分を結合するループとを含む。アンチセンス部分は、ステムの５’または３’末端にあり得る。ｓｈＲＮＡのステム部分は、約１５～約５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、２つのステム部分は、約１８または１９から約２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、３７、３８、３９、または４０、またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ステム部分の長さは、２１ヌクレオチド以上であるものとする。哺乳動物細胞で使用する場合、ステム部分の長さは、インターフェロン経路のような非特異的応答の誘発を避けるために、約３０ヌクレオチド未満であるものとする。非哺乳類細胞では、ステムは、３０ヌクレオチドを超えてもよい。実際、ステムには、標的ｍＲＮＡに相補的なはるかに大きいセクション（最大でｍＲＮＡ全体、及びｍＲＮＡ全体を含む）が含まれる場合がある。実際、ステム部分には、標的ｍＲＮＡに相補的なはるかに大きいセクション（最大でｍＲＮＡ全体、及びｍＲＮＡ全体を含む）が含まれる場合がある。
二重ステムの２つの部分は、ハイブリダイズして二重ステムを形成するのに十分に相補的である必要がある。したがって、２つの部分は、完全にまたは完璧に相補的であり得るが、そうである必要はない。さらに、２つのステム部分は、同じ長さであり得るか、または１つの部分が、１、２、３、または４ヌクレオチドのオーバーハングを含み得る。オーバーハングヌクレオチドは、例えば、ウラシル（Ｕ）、例えばすべてのＵを含み得る。ｓｈＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体内のループは、ループ配列を修飾して、対合ヌクレオチドの数を増減させる、またはループ配列のすべてもしくは一部をテトラループまたは他のループ配列に置き換えることにより、天然のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列とは異なり得る。したがって、ｓｈＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体中のループは、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上、例えば、１５または２０またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
ｓｈＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体内のループは、ループ配列を修飾して、対合ヌクレオチドの数を増減させる、またはループ配列のすべてもしくは一部をテトラループまたは他のループ配列に置き換えることにより、天然のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列とは異なり得る。したがって、ｓｈＲＮＡ内のループ部分は、約２～約２０ヌクレオチド長、すなわち、約２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上、例えば、１５または２０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、ループは、「テトラループ」配列からなるか、または「テトラループ」配列を含む。例示的テトラループ配列としては、これらに限定されないが、配列ＧＮＲＡ（式中、Ｎが任意のヌクレオチドであり、Ｒがプリンヌクレオチドである）、ＧＧＧＧ、及びＵＵＵＵである。
特定の実施形態では、本願のｓｈＲＮＡは、上述の所望のｓｉＲＮＡ分子の配列を含む。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分の配列は、本質的に上記のとおり、または一般に、標的ＲＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ）内から、例えば、翻訳開始点の上流または下流の１００～２００または３００ヌクレオチドの領域から、１８、１９、２０、２１ヌクレオチド、またはそれより長い配列を選択することによって設計することができる。一般に、配列は、５’ＵＴＲ（非翻訳領域）、コード配列、または３’ＵＴＲなど、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の任意の部分から選択することができる。この配列は、任意により、隣接する２つのＡＡヌクレオチドを含む標的遺伝子の領域の直後に続くことができる。ヌクレオチド配列の最後の２つのヌクレオチドは、ＵＵになるように選択することができる。この約２１のヌクレオチド配列を使用して、ｓｈＲＮＡの二本鎖ステムの一部を作製する。この配列は、野生型ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列のステム部分を、例えば酵素的に置換することができるか、または合成される完全な配列に含まれる。例えば、ステムループ操作ＲＮＡ前駆体全体をコードする、または前駆体の二本鎖ステムに挿入される部分のみをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成すること、及び制限酵素を使用して、例えば、野生型ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡから、操作ＲＮＡ前駆体構築物を構築することができる。
操作されたＲＮＡ前駆体は、二重鎖ステム中にｉｎ ｖｉｖｏで産生されることが望まれるｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様二重鎖の２１～２２程度のヌクレオチド配列を含む。したがって、操作されたＲＮＡ前駆体のステム部分は、発現が減少されるかまたは阻害される遺伝子のエクソン部分の配列に対応する少なくとも１８または１９のヌクレオチド対を含む。ステムのこの領域に隣接する２つの３’ヌクレオチドは、操作されたＲＮＡ前駆体からのｓｉＲＮＡの産生を最大化するように、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＲＮＡｉによる翻訳抑制または破壊のために対応するｍＲＮＡを標的とする際に、結果として得られるｓｉＲＮＡの有効性を最大化するように選択される。
特定の実施形態では、本開示のｓｈＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ配列、任意により末端修飾ｍｉＲＮＡ配列を含み、ＲＩＳＣへの侵入を増強する。ｍｉＲＮＡ配列は、任意の天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と類似であるかまたは同一であり得る（例えば、Ｔｈｅ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００４）。現在までに１，０００を超える天然のｍｉＲＮＡが同定されており、それらを合わせるとゲノム内のすべての予測遺伝子のうち約１％を含むと考えられる。多くの天然のｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン中で共にクラスター化されており、相同性ベースの検索（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓ，２００１）、または候補ｍｉＲＮＡ遺伝子が、ｐｒｉ－ｍＲＮＡのステムループ構造を形成する能力を予測するコンピューターアルゴリズム（例えば、ＭｉＲＳｃａｎ、ＭｉＲＳｅｅｋｅｒ）（Ｇｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２００３；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００３；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３；Ｌａｉ Ｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏ．，２００３）を用いて、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで特定できる。オンラインレジストリは、公開されているすべてのｍｉＲＮＡ配列の検索可能なデータベースを提供する（Ｔｈｅ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｗｅｂｓｉｔｅ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００４）。例示的な天然ｍｉＲＮＡとしては、ｌｉｎ－４、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１０、ｍｉｒＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１６８、ｍｉＲ－１７５、ｍｉＲ－１９６及びそれらの相同体、ならびにヒト由来及び特定のモデル生物、例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌａｎｉａ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、及びドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０３／０２９４５９に記載）の他の天然ｍｉＲＮＡが挙げられる。
天然に存在するｍｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで内因性遺伝子によって発現され、Ｄｉｃｅｒまたは他のＲＮＡｓｅｓによってヘアピンまたはステムループ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ またはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）からプロセシングされる（Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２００２；Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００２；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２；Ａｍｂｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２００３；Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２００３；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００３；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３）。ｍｉＲＮＡは、二本鎖二重鎖としてｉｎ ｖｉｖｏで一過性に存在することができるが、遺伝子サイレンシングを指示するために、１本の鎖のみ、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれる。特定のｍｉＲＮＡ、例えば植物ｍｉＲＮＡは、それらの標的ｍＲＮＡに対して完全なまたはほぼ完全な相補性を有するため、標的ｍＲＮＡを直接切断する。他のｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに対して完全ではない相補性を有するため、標的ｍＲＮＡの翻訳を直接抑制する。ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの相補性の程度によって、その作用機序が決定すると考えられている。例えば、ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の完全またはほぼ完全な相補性は、切断機構を予測するものであり（Ｙｅｋｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４）、一方で、完全でない相補性は、翻訳抑制機構を予測するものである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、その異常な発現またはその活性がｍｉＲＮＡ障害と相関している、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列のものである。
ｄ）二重機能性オリゴヌクレオチド繋留因子
他の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡの細胞間動員に有用な二重機能性オリゴヌクレオチド繋留因子を含む。動物細胞は、転写後または翻訳レベルで遺伝子発現を調節できる約２２ヌクレオチドの非コードＲＮＡである一連のｍｉＲＮＡを発現する。二重機能性オリゴヌクレオチド繋留因子は、ＲＩＳＣに結合したｍｉＲＮＡを結合し、それを標的ｍＲＮＡに動員することにより、例えば動脈硬化プロセスに関与する遺伝子の発現を抑制することができる。オリゴヌクレオチド繋留因子の使用は、特定の遺伝子の発現を抑制する既存の技術よりもいくつかの利点を提供する。第一に、本明細書に記載の方法では、内因性分子（多くの場合、豊富に存在する）、ｍｉＲＮＡがＲＮＡサイレンシングを媒介することが可能になる。したがって、本明細書に記載の方法により、ＲＮＡサイレンシングを媒介するために外来分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を導入する必要がなくなる。第２に、ＲＮＡサイレンシング剤及び連結部分（例えば、オリゴヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチド）を安定させ、ヌクレアーゼ活性に対して耐性にすることができる。結果として、本開示の繋留因子は、直接送達する用に設計することができ、細胞内で所望の剤を作製するように設計された前駆体分子またはプラスミドの間接送達（例えば、ウイルス）が必要なくなる。第３に、繋留因子及びそれぞれの部分は、特定のｍＲＮＡ部位及び特定のｍｉＲＮＡに適合するように設計できる。設計は、細胞及び遺伝子産物に特異的であり得る。第四に、本明細書に開示される方法では、ｍＲＮＡが無傷のままであり、これにより、当業者は、細胞自身の機構を使用して、短いパルスでタンパク質合成を遮断することが可能になる。その結果、これらのＲＮＡサイレンシングの方法は、高度に調節可能である。
本開示の二重機能性オリゴヌクレオチド繋留因子（「繋留因子」）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、内因性細胞ｍｉＲＮＡ）を標的ｍＲＮＡに動員して、目的の遺伝子の調節を誘導するように設計される。特定の実施形態では、繋留因子は、式Ｔ－Ｌ－μを有し、式中、Ｔは、ｍＲＮＡ標的化部分、Ｌは連結部分、μは、ｍｉＲＮＡ動員部分である。任意の１つ以上の部分が、二本鎖であり得る。特定の実施形態では、各部分は、一本鎖である。
繋留因子内の部分は、式Ｔ－Ｌ－μに示すとおり、配置されるか、または連結され得る（５’から３’方向）（すなわち、連結部分の５’末端に連結された標的化部分の３’末端及びｍｉＲＮＡ動員部分の５’末端に連結された連結部分の３’末端）。あるいは、これらの部分は、次のとおり、繋留因子内に配置または連結することができる：μ－Ｔ－Ｌ（すなわち、ｍｉＲＮＡの動員部分の３’末端は、連結部分の５’末端に連結し、連結部分の３’末端は、標的化部分の５’末端に連結する）。
上記のｍＲＮＡ標的化部分は、特定の標的ｍＲＮＡを捕捉することができる。本開示によれば、標的ｍＲＮＡの発現は望ましくないため、ｍＲＮＡの翻訳抑制が望まれる。ｍＲＮＡ標的化部分は、標的ｍＲＮＡに効果的に結合するのに十分なサイズであるものとする。標的化部分の長さは、標的ｍＲＮＡの長さ、及び標的ｍＲＮＡと標的化部分との間の相補性の程度に部分的に依存して、大きく変動する。様々な実施形態では、標的化部分は、約２００未満、１００、５０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化部分は、約１５～約２５ヌクレオチド長である。
上述のとおり、ｍｉＲＮＡ動員部分は、ｍｉＲＮＡと会合することができる。本願によれば、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを抑制することができる任意のｍｉＲＮＡであり得る。哺乳動物は、２５０を超える内因性ｍｉＲＮＡを有することが報告されている（Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．１２：７３５－７３９；Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：８５８－８６２；ａｎｄ Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１５４０）。様々な実施形態では、ｍｉＲＮＡは、当技術分野で認識されている任意のｍｉＲＮＡであり得る。
連結部分は、標的化部分の活性が維持されるように標的化部分を連結することができる任意の剤である。連結部分は、標的化剤がそれぞれの標的と十分に相互作用できるように、十分な数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド部分であり得る。連結部分は、細胞のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列との配列相同性をほとんどまたはまったく有しない。例示的な連結部分としては、１つ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、例えば、２’－β－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルチミジン、２’－Ｏ－メチルグアノシンまたは２’－Ｏ－メチルウリジンが挙げられる。
ｅ）遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド
特定の例示的な実施形態では、遺伝子発現（すなわち、ＭＳＨ３遺伝子発現）は、ＭＳＨ３遺伝子発現を効果的に阻害または減少させるために、２つ以上の接近可能な３’末端の存在が可能になるそれらの５’末端を介して連結された２つ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物を使用して、調節することができる。このような連結オリゴヌクレオチドは、遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド（ＧＳＯ）としても知られている （例えば、Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃに譲渡された米国特許第８，４３１，５４４号を参照されたい。これは、参照により、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。
ＧＳＯの５’末端での連結は、他のオリゴヌクレオチド連結とは独立しており、５’、３’、または２’ヒドロキシル基を介して直接的に、または非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオシドを介して、ヌクレオシドの２’または３’ヒドロキシル位置のいずれかを使用して、間接的であり得る。連結はまた、５’末端ヌクレオチドの機能化された糖または核酸塩基を利用し得る。
ＧＳＯは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または非ヌクレオシドリンカーを介して、それらの５’－５’末端でコンジュゲートされた２つの同一または異なる配列を含むことができる。そのような化合物は、遺伝子産物のアンチセンスの下方制御のために目的のｍＲＮＡ標的の特定の部分に相補的である１５～２７ヌクレオチドを含み得る。同一の配列を含むＧＳＯは、ワトソン－クリック水素結合相互作用を介して特定のｍＲＮＡに結合し、タンパク質の発現を阻害することができる。異なる配列を含むＧＳＯは、１つ以上のｍＲＮＡ標的の２つ以上の異なる領域に結合し、タンパク質発現を阻害することができる。このような化合物は、標的ｍＲＮＡに相補的なヘテロヌクレオチド配列で構成され、ワトソン－クリック水素結合により安定した二重鎖構造を形成する。特定の条件下で、２つの遊離３’末端（５’－５’付着アンチセンス）を含むＧＳＯは、単一の遊離３’末端または遊離３’末端を含まないものよりも強力な遺伝子発現阻害剤となり得る。
いくつかの実施形態では、非ヌクレオチドリンカーは、グリセロールまたは式ＨＯ－（ＣＨ２）ｏ－ＣＨ（ＯＨ）－（ＣＨ２）ｐ－ＯＨのグリセロール相同体であり、式中、ｏ及びｐは、独立して１～約６、１～約４、または１～約３の整数である。いくつかの他の実施形態では、非ヌクレオチドリンカーは、１，３－ジアミノ－２－ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのそのような誘導体は、式ＨＯ－－（ＣＨ２）ｍ－－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－－ＣＨ２－－ＣＨ（ＯＨ）－－ＣＨ２－－ＮＨＣ（Ｏ）－－（ＣＨ２）ｍ－－ＯＨを有し、式中、ｍは、０～約１０、０～約６、２～約６、または２～約４の整数である。
いくつかの非ヌクレオチドリンカーでは、３つ以上のＧＳＯ成分の付着が可能になる。例えば、非ヌクレオチドリンカーグリセロールは、ＧＳＯ成分が共有結合により付着され得る３つのヒドロキシル基を有する。したがって、本開示のいくつかのオリゴヌクレオチドベースの化合物は、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーに連結された２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。本開示によるそのようなオリゴヌクレオチドは、「分岐している」と呼ばれる。
特定の実施形態では、ＧＳＯは、少なくとも１４ヌクレオチド長である。特定の例示的な実施形態では、ＧＳＯは、１５～４０ヌクレオチド長または２０～３０ヌクレオチド長である。したがって、ＧＳＯの成分オリゴヌクレオチドは、独立して、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド長であり得る。
これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダートまたはＨ－ホスホネート化学などの当技術分野で認められた方法によって調製することができ、これらは、手動または自動合成装置によって実施できる。これらのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡにハイブリダイズする能力を損なうことなく、複数の方法で修飾することもできる。そのような修飾は、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端の間でのアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カーボネート、ホスフェートヒドロキシル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、またはこれら及び他のヌクレオチド間連結の組合せであるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間連結を含み得、ここで、５’ヌクレオチドのホスホジエステル連結が、任意の数の化学基で置換されている。
Ｖ．修飾された抗ＭＳＨ３ ＲＮＡサイレンシング剤
本開示の特定の態様では、本出願のＲＮＡサイレンシング剤（またはその任意の部分）は、上記のとおり、剤の活性がさらに改善されるように修飾され得る。例えば、上記セクションＩＩに記載のＲＮＡサイレンシング剤は、以下に記載の修飾のいずれかで修飾され得る。修飾は、部分的に、標的識別をさらに向上させるため、剤の安定性を向上させるため（例えば、分解を防止するため）、細胞取り込みを促進するため、標的効率を向上させるため、結合（例えば、標的への）の有効性を改善するため、剤に対する患者の耐性を改善するため、及び／または毒性を軽減するために、作用し得る。
１）標的識別を向上させるための修飾
特定の実施形態では、本出願のＲＮＡサイレンシング剤は、単一ヌクレオチド標的識別を向上させるために、不安定化ヌクレオチドで置換され得る（米国出願第１１／６９８，６８９号、２００７年１月２５日に出願、米国仮出願第６０／７６２，２２５号、２００６年１月２５日に出願を参照されたい。これらは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。そのような修飾は、標的ｍＲＮＡ（例えば、機能獲得型変異ｍＲＮＡ）に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性に目に見える影響を与えることなく、非標的ｍＲＮＡ（例えば、野生型ｍＲＮＡ）に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性を無効にするのに十分であり得る。
特定の実施形態では、本願のＲＮＡサイレンシング剤は、そのアンチセンス鎖に少なくとも１つのユニバーサルヌクレオチドを導入することによって修飾される。ユニバーサルヌクレオチドは、４つの従来のヌクレオチド塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）のいずれかと無差別に塩基対形成できる塩基部分を含む。ユニバーサルヌクレオチドは、ＲＮＡ二重鎖の安定性、またはＲＮＡサイレンシング剤のガイド鎖と標的ｍＲＮＡによって形成される二重鎖の安定性に比較的小さい効果のみを有するために企図される。例示的なユニバーサルヌクレオチドとしては、デオキシイノシン（例えば、２’－デオキシイノシン）、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２’－アザ－２’－デオキシイノシン、ＰＮＡ－イノシン、モルホリノ－イノシン、ＬＮＡ－イノシン、ホスホルアミデート－イノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－イノシン、及び２’－ＯＭｅ－イノシンからなる群から選択されるイノシン塩基部分またはイノシン類似塩基部分を有するものが挙げられる。特定の実施形態では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン残基またはその天然類似体である。
特定の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、特異性決定ヌクレオチド（すなわち、疾患関連多型を認識するヌクレオチド）から５ヌクレオチド以内に少なくとも１つの不安定化ヌクレオチドを導入することによって修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから５、４、３、２、または１ヌクレオチド以内の位置に導入され得る。例示的な実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチド離れた位置に（すなわち、不安定化ヌクレオチドと特異性決定ヌクレオチドとの間に２つの安定化ヌクレオチドが存在するように）導入される。２つの鎖または鎖部分を有するＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）では、特異性決定ヌクレオチドを含まない鎖または鎖部分内に不安定化ヌクレオチドを導入することができる。特定の実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含む同じ鎖または鎖部分に導入される。
２）有効性及び特異性を高めるための修飾
特定の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、非対称設計規則に従って、ＲＮＡｉを媒介する際の有効性及び特異性を容易に高めるように改変され得る（米国特許第８，３０９，７０４号、第７，７５０，１４４号、第８，３０４，５３０号、第８，３２９，８９２号及び第８，３０９，７０５号を参照されたい）。このような改変により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、本願発明の方法を用いて設計されたｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡから産生されたｓｉＲＮＡ）のＲＩＳＣへの侵入をセンス鎖に有利に進めることが容易になる。これにより、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの切断または翻訳抑制を優先的に誘導し、したがって、標的の切断及びサイレンシングの効率を増大または改善するようになる。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端（ＡＳ３’）とセンス鎖５’末端（Ｓ’５）との間の結合強度または塩基対強度に対して、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端（ＡＳ５’）とセンス鎖３’末端（Ｓ３’）との間の塩基対強度を低下させることによって向上される。
一実施形態では、本出願のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第１またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間のＧ：Ｃ塩基対が、第１またはアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端との間のＧ：Ｃ塩基対よりも少なくなるように、向上され得る。別の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第１またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在するように向上され得る。特定の実施形態では、ミスマッチ塩基対は、以下からなる群から選択される：Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ及びＵ：Ｕ。別の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、少なくとも１つのゆらぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕが、第１またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に存在するように向上され得る。別の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、希少ヌクレオチド、例えばイノシン（Ｉ）を含む少なくとも１つの塩基対が存在するように向上され得る。特定の実施形態では、塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ、及びＩ：Ｃからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対が存在するように、向上され得る。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２－アミノ－Ｇ、２－アミノ－Ａ、２，６－ジアミノ－Ｇ、及び２，６－ジアミノ－Ａからなる群から選択される。
３）安定性の向上を有するＲＮＡサイレンシング剤
本願のＲＮＡサイレンシング剤は、血清中または細胞培養用の成長培地中での安定性を改善するために修飾させ得る。安定性を向上させるために、３’－残基を分解に対して安定化させてよく、例えば、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドからなるように選択され得る。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’－デオキシチミジンによるウリジンの置換は許容され、ＲＮＡ干渉の効率に影響を与えない。
一態様では、本願は、第１及び第２の鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤を特徴とし、第２の鎖及び／または第１の鎖は、対応する非修飾ＲＮＡサイレンシング剤と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性が向上するように、内部ヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置換することによって、修飾される。本明細書で定義されるように、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外の任意の位置に存在するものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内にあっても、二本鎖もしくは二本鎖分子の鎖内にあってもよい。一実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、少なくとも１つの内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の内部ヌクレオチドによって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の内部ヌクレオチドによって修飾される。さらに別の実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドのすべての置換によって修飾される。
一態様では、本願は、少なくとも８０％が化学修飾されたＲＮＡサイレンシング剤を特徴とする。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、完全に化学修飾されていてよく、すなわち、ヌクレオチドの１００％が化学修飾されている。別の態様では、本出願は、少なくとも８０％が化学修飾された２’－ＯＨリボース基を含むＲＮＡサイレンシング剤を特徴とする。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％化学修飾されている２’－ＯＨリボース基を含む。
特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチド類似体は、標的特異的サイレンシング活性、例えばＲＮＡｉ媒介活性または翻訳抑制活性が、実質的に影響を受けない位置、例えばｓｉＲＮＡ分子の５’末端及び／または３’末端にある領域に配置され得る。さらに、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことによって、末端を安定化させ得る。
例示的なヌクレオチド類似体としては、糖－及び／または骨格修飾リボヌクレオチド（すなわち、リン酸糖骨格への修飾を含む）。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル連結は、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに結合するリン酸エステル基は、例えばホスホチオエート基の修飾基によって置換される。例示的な糖修飾リボヌクレオチドでは、２’ＯＨ－基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基で置き換えられ、式中、Ｒは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
特定の実施形態では、修飾は、２’－フルオロ、２’－アミノ、及び／または２’－チオ修飾である。修飾としては、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジン、及び／または５－アミノ－アリル－ウリジンが挙げられる。特定の実施形態では、２’－フルオロリボヌクレオチドは、すべてのウリジン及びシチジンである。追加の例示的な修飾としては、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、リボ－チミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロ－シチジン、及び５－フルオロウリジンが挙げられる。２’－デオキシ－ヌクレオチド及び２’－Ｏｍｅヌクレオチドも、本開示の修飾ＲＮＡサイレンシング剤部分内で使用することができる。追加の修飾残基としては、デオキシ脱塩基、イノシン、Ｎ３－メチル－ウリジン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシド、及びリバビリンが挙げられる。特定の実施形態では、連結部分が２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドであるように、２’部分がメチル基である。
特定の実施形態では、本願のＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に抵抗する（高度に安定である）糖修飾ヌクレオチドを含み、ｍＲＮＡについて単一ヌクレオチド識別を有する（Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（２００５），３３（１）：４３９－４４７；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：７９６７－７９７５，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：７４－８１）。これらの分子は、２’－デオキシ－２’’－フルオロウリジンなど、修飾が可能な２’－Ｏ、４’－Ｃ－エチレン架橋核酸を有する。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’－エンドコンフォメーションに拘束することによってオリゴヌクレオチドの特異性を増大し、それによって塩基対合形成のためにヌクレオチドを事前に組織化し、オリゴヌクレオチドの融解温度を１塩基あたり１０℃ほど上昇させる。
別の例示的な実施形態では、本願のＲＮＡサイレンシング剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡは、ヌクレオチドの糖－リン酸部分が、ポリアミド骨格を形成できる中性の２－アミノエチルグリシン部分で置換され、ヌクレアーゼ消化に対して高い抵抗性があり、分子に対して、改善された結合特異性を付与する修飾ヌクレオチドを含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００１），２５４：１４９７－１５００）。
天然に存在する核酸塩基の代わりに、少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有する核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチドも企図される。アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するために、塩基を修飾することができる。修飾核酸塩基の例としては、これらに限定されないが、５位で修飾されたウリジン及び／またはシチジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／またはグアノシン、例えば８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンが挙げられ、好適である。上記の修飾を組み合わせてもよいことに留意されたい。
他の実施形態では、架橋を使用して、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を変化させ、例えば、身体内での半減期を延長することができる。したがって、本願は、核酸の２つの相補鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含み、２つの鎖は、架橋されている。したがって、本出願は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）または有機化合物（例えば、染料）などに対して（例えば、その３’末端において）コンジュゲートされているかまたはコンジュゲートされていないＲＮＡサイレンシング剤を含む。このようにｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することにより、対応するｓｉＲＮＡと比較して、細胞への取込みを改善する、または得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞標的活性を向上させることができ、ｓｉＲＮＡ誘導体を細胞内で追跡する、または対応するｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善するのに有用である。
他の例示的な修飾としては、以下が挙げられる：（ａ）２’の修飾、例えば、センスまたはアンチセンス鎖における、特にセンス鎖における、Ｕ上の２’ＯＭｅ部分の提供、または、３’オーバーハング中、例えば、３’末端での２’ＯＭｅ部分の提供（３’末端は、分子の３’原子または最大３’部分、例えば、文脈によって示されるように、最も３’のＰまたは２’の位置を意味する）；（ｂ）リン酸骨格における、例えばＯのＳによる置換による骨格の修飾、例えば、特にアンチセンス鎖におけるＵまたはＡまたは両方へのホスホロチオエート修飾の提供；例えば、ＯのＳによる置換による；（ｃ）ＵのＣ５アミノリンカーでの置換；（ｄ）ＡのＧによる置換（配列変化は、特定の実施形態では、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖に配置され得る）；及び（ｄ）２’、６’、７’、または８’位での修飾。例示的な実施形態は、これらの修飾の１つ以上がセンス上に存在するが、アンチセンス鎖には存在しない実施形態、またはアンチセンス鎖が、そのような修飾をほとんど有さない実施形態である。さらに他の例示的な修飾としては、３’オーバーハング中、例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用；２’修飾の組み合わせ、例えば２’ＯＭｅ部分の提供と骨格の修飾、例えばＯのＳによる置換、例えばホスホロチオエート修飾の提供、または３’オーバーハング中、例えば３’末端でのメチル化Ｐの使用；３’アルキルによる修飾；３’オーバーハング中、例えば３’末端での脱塩基ピロリドンによる修飾；ナプロキセン、イブプロフェン、または３’末端での分解を阻害する他の部分による修飾が挙げられる。
高度に修飾されたＲＮＡサイレンシング剤
特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、完全に化学修飾されおり、すなわち、ヌクレオチドの１００％が化学修飾されている。
特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、２’－Ｏ－メチルリッチである、すなわち、５０％を超える２’－Ｏ－メチル含有量を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド含有量を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも約７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、約７０％～約９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡである。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも約７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約７０％～約９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、少なくとも約７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、約７０％～約９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。
２’－Ｏ－メチルリッチＲＮＡサイレンシング剤及び特定の化学修飾パターンについては、ＵＳＳＮ １６／５５０，０７６（２０１９年８月２３日提出）及びＵＳＳＮ ６２／８９１，１８５（２０１９年８月２３日に出願）にさらに記載され、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチド間連結修飾
特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド間連結、サブユニット間連結、またはヌクレオチド骨格が、ＲＮＡサイレンシング剤中で修飾される。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤中のヌクレオチド間連結のすべてが修飾される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、４～１６のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、８～１３のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡであり、それぞれ５’末端及び３’末端を含む。特定の実施形態では、センス鎖の５’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、センス鎖の３’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端から１～２位及び１～８位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端から１～２位、１～３位、１～４位、１～５位、１～６位、１～７位、または１～８位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端から１～２位及び１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。
一態様では、本開示は、修飾オリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドは標的に相補的な５’末端、３’末端を有し、オリゴヌクレオチドは、センス及びアンチセンス鎖、及び式（Ｉ）の少なくとも１つの修飾サブユニット間連結を含む：













Figure 2023522701000023
 （式中、
Ｂは、塩基対部分であり；
Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され；
Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、
Ｙは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
Ｚは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
Ｒは、保護基であり、
Figure 2023522701000024
 は、任意の二重結合である）。
式（Ｉ）の実施形態では、ＷがＣＨである場合、
Figure 2023522701000025
 は、二重結合である。
式（Ｉ）の実施形態では、ＷがＯ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２からなる群から選択される場合、
Figure 2023522701000026
 は、単結合である。
式（Ｉ）の実施形態では、Ｙが、Ｏ－である場合、ＺまたはＷのどちらか一方は、Ｏではない。
式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、ＣＨ２であり、Ｗは、ＣＨ２である。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000027
式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、ＣＨ２であり、ＷはＯである。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾サブユニット間連結は、式（ＩＩＩ）の修飾サブユニット間連結である：
Figure 2023522701000028
式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、Ｏであり、Ｗは、ＣＨ２である。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＩＶ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000029
式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、Ｏであり、Ｗは、ＣＨである。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾サブユニット間連結は、式Ｖの修飾サブユニット間連結である：
Figure 2023522701000030
式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、Ｏであり、Ｗは、ＯＣＨ２である。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式ＶＩの修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000031
式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、ＣＨ２であり、Ｗは、ＣＨである。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾サブユニット間連結は、式ＶＩＩの修飾サブユニット間連結である：
Figure 2023522701000032
式（Ｉ）の実施形態では、塩基対部分Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルからなる群から選択される。
一実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡに組み込まれ、修飾ｓｉＲＮＡは、標的に相補的な５’末端、３’末端を有し、標的に対して、相補性であり、ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖、ならびに式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、または式（ＶＩＩ）のうちのいずれか１つ以上の少なくとも１つの修飾サブユニット間連結を含む。
一実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡに組み込まれ、修飾ｓｉＲＮＡは、５’末端、３’末端を有し、標的に相補的であり、センス及びアンチセンス鎖を含み、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾サブユニット間連結を含み、式ＶＩＩＩである：
Figure 2023522701000033
 （式中、
Ｄは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され；
Ｃは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ１、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
Ａは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
Ｒ１は、保護基であり；
Figure 2023522701000034
 は、任意の二重結合であり；
サブユニット間は、任意により修飾された２つのヌクレオシドを架橋している。
一実施形態では、ＣがＯ－である場合、ＡまたはＤのどちらか一方はＯではない。
一実施形態では、Ｄは、ＣＨ２である。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間連結は、式（ＩＸ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000035
一実施形態では、Ｄは、Ｏである。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間連結は、式（Ｘ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000036
一実施形態では、Ｄは、ＣＨ２である。別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000037
一実施形態では、Ｄは、ＣＨである。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000038
別の実施形態では、式（ＶＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩＶ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000039
一実施形態では、Ｄは、ＯＣＨ２である。別の実施形態では、式（ＶＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000040
別の実施形態では、式（ＶＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＸａ）の修飾されたサブユニット間連結である：
Figure 2023522701000041
修飾ｓｉＲＮＡ連結の一実施形態では、任意により修飾された各ヌクレオシドは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びウリジンからなる群から選択される。
式（Ｉ）のある例示的な実施形態では、Ｗは、Ｏである。別の実施形態では、Ｗは、ＣＨ２である。さらに別の実施形態では、Ｗは、ＣＨである。
式（Ｉ）の特定の例示的な実施形態では、Ｘは、ＯＨである。別の実施形態では、Ｘは、ＯＣＨ３である。さらに別の実施形態では、Ｘは、ハロである。
式（Ｉ）の特定の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、２’－フルオロ置換基を含まない。
式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、Ｏ－である。別の実施形態では、Ｙは、ＯＨである。さらに別の実施形態では、Ｙは、ＯＲである。さらに別の実施形態では、Ｙは、ＮＨ－である。一実施形態では、Ｙは、ＮＨ２である。別の実施形態では、Ｙは、Ｓ－である。さらに別の実施形態では、Ｙは、ＳＨである。
式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、Ｏである。別の実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
一実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の１位～２位に挿入される。別の実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の６位～７位に挿入される。さらに別の実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の１０位～１１位に挿入される。さらに別の実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の１９位～２０位に挿入される。一実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の５位～６位及び１８位～１９位に挿入される。
式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の例示的な実施形態では、Ｃは、Ｏ－である。別の実施形態では、Ｃは、ＯＨである。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＯＲ１である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＮＨ－である。一実施形態では、Ｃは、ＮＨ２である。別の実施形態では、Ｃは、Ｓ－である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＳＨである。
式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の例示的な実施形態では、Ａは、Ｏである。別の実施形態では、Ａは、ＣＨ２である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＯＲ１である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＮＨ－である。一実施形態では、Ｃは、ＮＨ２である。別の実施形態では、Ｃは、Ｓ－である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＳＨである。
式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の特定の実施形態では、任意により修飾されたヌクレオシドは、アデノシンである。式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の別の実施形態では、任意により修飾されたヌクレオシドは、グアノシンである。式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の特定の実施形態では、任意により修飾されたヌクレオシドは、シチジンである。式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の特定の実施形態では、任意により修飾されたヌクレオシドは、ウリジンである。
修飾されたｓｉＲＮＡ連結の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１～２位に挿入される。別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の６～７位に挿入される。さらなる別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１０～１１位に挿入される。さらに別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１９～２０位に挿入される。一実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の５位～６位及び１８位～１９位に挿入される。
特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、アデニンである。式（Ｉ）の特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、グアニンである。式（Ｉ）の特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、シトシンである。式（Ｉ）の特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、ウラシルである。
式（Ｉ）の一実施形態では、Ｗは、Ｏである。式（Ｉ）の一実施形態では、Ｗは、ＣＨ２である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｗは、ＣＨである。
式（Ｉ）の実施形態では、Ｘは、ＯＨである。式（Ｉ）の実施形態では、Ｘは、ＯＣＨ３である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｘは、ハロである。
式（Ｉ）の例示的な実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’－フルオロ置換基を含まない。
式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、Ｏ－である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＯＨである。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＯＲである。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＮＨ－である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＮＨ２である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、Ｓ－である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＳＨである。
式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、Ｏである。式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
式（Ｉ）の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１～２位に挿入される。式（Ｉ）の別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の６～７位に挿入される。式（Ｉ）のさらなる別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１０～１１位に挿入される。式（Ｉ）のさらなる別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１９～２０位に挿入される。式（Ｉ）の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の５位～６位及び１８位～１９位に挿入される。
修飾サブユニット間連結は、米国特許公開第２０２０／０３８５７４０Ａ１号及び米国特許第１７／２１３，８５２号でさらに説明され、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
４）コンジュゲート機能部分
他の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、１つ以上の機能部分で修飾され得る。機能部分は、ＲＮＡサイレンシング剤に１つ以上の追加の活性を付与する分子である。特定の実施形態では、機能部分は、標的細胞（例えば神経細胞）による細胞取り込みを向上させる。したがって、本開示は、他の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）または有機化合物（例えば、染料）などに対して、（例えば、その５’及び／または３’末端において）コンジュゲートされているまたはコンジュゲートされていないＲＮＡサイレンシング剤を含む。コンジュゲーションは、例えば、本技術で知られている方法、以下の方法を用いて、達成することができる；Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．：４７（１），９９－１１２（２００１）（ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子に付加された核酸について記載）；Ｆａｔｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３（１－３）：１３７－４３（１９９８）（ナノ粒子に結合した核酸について記載）；Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．５ Ｓｕｐｐｌ．４：５５－８（１９９４）（インターカレーション剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子と連結した核酸について記載）；及びＧｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２（２）：４０４－１０（１９９５）（ナノ粒子に連結した核酸について記載）。
特定の実施形態では、機能部分は、疎水性部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド、及びヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、及びビタミンからなる群から選択される。特定の実施形態では、ステロイドは、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ビタミンは、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、及び誘導体、またはそれらの代謝物からなる群から選択される。特定の実施形態では、ビタミンは、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される。
特定の実施形態では、開示のＲＮＡサイレンシング剤は、親油性部分にコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性部分は、カチオン基を含むリガンドである。別の実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖に付着している。例示的な実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一端に付着している。別の例示的な実施形態では、親油性部分は、センス鎖の３’末端に付着している。特定の実施形態では、親油性部分は、コレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸、カチオン色素（例えば、Ｃｙ３）からなる群から選択される。例示的な実施形態では、親油性部分は、コレステロールである。他の親油性部分としては、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが挙げられる。
特定の実施形態では、機能部分は、例えばエンドサイトーシス依存性機序または非依存性機序による、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型へのターゲティング、または細胞透過性を改善するために、ＲＮＡサイレンシング剤に繋留された１つ以上のリガンドを含んでもよい。リガンド及び関連する修飾は、配列の特異性を高め、その結果、オフサイトターゲティングを減少させることもできる。繋留因子リガンドは、インターカレーターとして機能できる１つ以上の修飾塩基または糖を含むことができる。これらは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的二重鎖のバルジ内などの内部領域内に位置することもできる。インターカレーターは、芳香族、例えば、多環式芳香族または複素環式芳香族化合物であり得る。多環式インターカレーターは、スタッキング能力を有し得、２つ、３つ、または４つの縮合環を有する系を含むことができる。本明細書に記載のユニバーサル塩基は、リガンドに含めることができる。一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断による標的遺伝子の阻害に寄与する切断基を含むことができる。切断基は、例えば、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシン－Ａ５、ブレオマイシン－Ａ２、またはブレオマイシン－Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えば、Ｏ－フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えば、ｌｙｓ－ｔｙｒ－ｌｙｓトリペプチド）、または金属イオンキレート基であり得る。金属イオンキレート基としては、例えば、Ｌｕ（ＩＩＩ）またはＥＵ（ＩＩＩ）大環状錯体、Ｚｎ（ＩＩ）２，９－ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン、またはアクリジンを挙げることができ、これらは、Ｌｕ（ＩＩＩ）などの遊離金属イオンによるバルジ部位での標的ＲＮＡの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリガンドは、例えばバルジ領域で、標的ＲＮＡの切断を促進するためにＲＮＡサイレンシング剤に繋留することができる。例えば、１，８－ジメチル－１，３，６，８，１０，１３－ヘキサアザシクロテトラデカン（サイクラム）は、標的ＲＮＡ切断を促進するために（例えば、アミノ酸誘導体によって）ペプチドにコンジュゲートすることができる。繋留リガンドは、アミノグリコシドリガンドであり得、これは、ＲＮＡサイレンシング剤に改善されたハイブリダイゼーション特性または改善された配列特異性を持たせることができる。例示的なアミノグリコシドとしては、グリコシル化ポリリジン、ガラクトシル化ポリリジン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡ、及びアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲート、例えば、Ｎｅｏ－Ｎ－アクリジン、Ｎｅｏ－Ｓ－アクリジン、Ｎｅｏ－Ｃ－アクリジン、Ｔｏｂｒａ－Ｎ－アクリジン、及びＫａｎａＡ－Ｎ－アクリジンが挙げられる。アクリジン類似体の使用により、配列の特異性を高めることができる。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較して、ＲＮＡに対して高い親和性を有するが、配列特異性は低くなる。アクリジン類似体であるネオ－５－アクリジンは、ＨＩＶ Ｒｅｖ－応答エレメント（ＲＲＥ）に対する親和性が高くなる。いくつかの実施形態では、アミノグリコシドリガンドのグアニジン類似体（グアニジノグリコシド）は、ＲＮＡサイレンシング剤に繋留されている。グアニジノグリコシド内では、アミノ酸上のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン類似体が付着することにより、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性が増大し得る。繋留リガンドは、オリゴヌクレオチド剤の細胞取り込みを増大することができるポリアルギニンペプチド、ペプトイドまたはペプチド模倣体であり得る。
例示的なリガンドは、直接、または介在繋留因子を介して間接的に、リガンドコンジュゲート担体にカップリングされる。特定の実施形態では、カップリングは、共有結合を介する。特定の実施形態では、リガンドは、介在繋留因子を介して担体に付着している。特定の実施形態では、リガンドにより、それが組み込まれるＲＮＡサイレンシング剤の分布、標的化または寿命が変化する。特定の実施形態では、リガンドは、そのようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞または器官コンパートメント、身体の組織、器官または領域に対して、例えば、より高い親和性を提供する。
例示的なリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、及び特異性特性を改善することができ、結果として得られる天然のまたは修飾されたＲＮＡサイレンシング剤、または本明細書に記載のモノマーの任意の組み合わせを含むポリマー分子及び／または天然または修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性も改善し得る。リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増大するための治療修飾因子、例えば、分布を監視するための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性付与部分；及び天然または異常な核酸塩基を含むことができる。一般的な例としては、親油性物質、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、及びペプチド模倣物が挙げられる。リガンドとしては、天然に存在する物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；アミノ酸、または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）であるポリアミノ酸、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコール化）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレインコポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファらせんペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する標的基、例えば細胞または組織標的剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体を挙げることができる。標的基はまた、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体、Ｎ－アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例としては、色素、インターカレーション剤（例えば、アクリジン及び置換アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン）、ｌｙｓ－ｔｙｒ－ｌｙｓ トリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウムアミノグリコジ、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール（及びそのチオ類似体）、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えば、エステル（例えば、モノ、ビス、またはトリス脂肪酸エステル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０脂肪酸）及びそのエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル；例えば、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３－ビス－Ｏ（オクタアデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミット酸、ステアリン酸（例えば、ジステアリン酸グリセリル）、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋなど）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。特定の実施形態では、リガンドは、ＧａｌＮＡｃまたはその誘導体である。
リガンドは、糖タンパク質などのタンパク質、またはコリガンドに対して特異的親和性を有する分子などのペプチド、またはがん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドとしては、ホルモン及びホルモン受容体を挙げることもできる。それらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースを含むことができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーター、またはＮＦ－ｋＢのアクチベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／または中間フィラメントを破壊することにより、細胞へのＲＮＡサイレンシング剤の取り込みを増加させることができる物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ、ラトランキュリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することにより、細胞へのＲＮＡサイレンシング剤の取り込みを増加させることができる。そのような効果を有する例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ ）、インターロイキン－１ベータ、またはガンマインターフェロンが挙げられる。一態様では、リガンドは、脂質または脂質系分子である。かかる脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することができる。ＨＳＡ結合リガンドでは、標的組織、例えば身体の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布が可能になる。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞などの肝臓であり得る。ＨＳＡに結合することができる他の分子もまたリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの耐分解性を向上させること、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増加させること、及び／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。脂質系リガンドは、コンジュゲートの標的組織への結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、より強固にＨＳＡに結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、それ故、体内から排出される可能性が低い。ＨＳＡにあまり強固に結合しない脂質または脂質系リガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化するために使用することができる。特定の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに結合する。脂質系リガンドは、コンジュゲートが腎臓以外の組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合することができる。しかし、ＨＳＡ－リガンド結合を逆転させることができないほど親和性は強くないことが企図される。別の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、全く結合しないため、本コンジュゲートは、腎臓に分布する。脂質系リガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的とする他の部分もまた使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、望ましくない細胞増殖、例えば、悪性または非悪性型の、例えば、がん細胞を特徴とする障害の治療に特に有用であり得る。代表的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫが挙げられる。他のビタミンの例としては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または他のビタミンもしくはがん細胞によって取り込まれる栄養素が挙げられる。同様に含まれるのは、ＨＳＡ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）である。
別の態様では、リガンドは、らせん細胞透過剤などの細胞透過剤である。特定の実施形態では、剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａなどのペプチドである。該薬剤がペプチドの場合、それはペプチジル模倣、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド結合、及びＤ－アミノ酸の使用を含め、修飾されていてもよい。らせん剤は、親油性相及び疎油性相を有し得るアルファらせん剤であり得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）とは、天然のペプチドと同様の一定の三次元構造に折りたたむことが可能な分子である。オリゴヌクレオチド剤へのペプチド及びペプチド模倣体の付着は、細胞の認識及び吸収を向上させることなどによって、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態分布に影響を与えることができる。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分は、Ｌ－ペプチドまたはＤ－ペプチドであり得る。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性膜トランスロケーション配列（ＭＴＳ）を含むことができる。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージ提示ライブラリ、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリから同定されたペプチドなどのランダムなＤＮＡ配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－８４，１９９１）。例示的な実施形態では、組み込まれたモノマーユニットを介してＲＮＡサイレンシング剤に繋留されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤミミックなどの細胞標的ペプチドである。あるペプチド部分は、長さが約５アミノ酸から約４０アミノ酸に及び得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を向上させるまたは配座性を指示するなどの構造修飾を有することができる。以下に記載されるに構造修飾のいずれかを使用することができる。
特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤のセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤のセンス鎖の３’末端に連結されている。
特定の実施形態では、機能部分は、リンカーによってＲＮＡサイレンシング剤に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、リンカーにより、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、リンカーにより、センス鎖の３’末端に連結されている。特定の実施形態では、リンカーは、二価または三価のリンカーを含む。特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、アミド、カルバメート、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、二価または三価のリンカーは、以下から選択される：
Figure 2023522701000042
 （式中、ｎは、１、２、３、４または５である）。
特定の実施形態では、リンカーは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体をさらに含む。特定の実施形態では、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体は、以下からなる群から選択される：
Figure 2023522701000043
 （式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＢＨ３である）。
本開示の様々な機能部分及びそれらをＲＮＡサイレンシング剤にコンジュゲートするための手段は、ＷＯ２０１７／０３０９７３Ａ１及びＷＯ２０１８／０３１９３３Ａ２にさらに詳細に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩ．分岐オリゴヌクレオチド
上に開示の２つ以上のＲＮＡサイレンシング剤、例えば、抗ＭＳＨ３ ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド構築物は、リンカー、スペーサー及び分岐点から独立して選択される１つ以上の部分によって互いに結合されて、分岐オリゴヌクレオチドＲＮＡサイレンシング剤を形成し得る。特定の実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドＲＮＡサイレンシング剤は、２つのｓｉＲＮＡを送達するための二分岐ｓｉＲＮＡ（「ｄｉ－ｓｉＲＮＡ」）足場を形成するための２つのｓｉＲＮＡからなる。代表的な実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドの核酸は、それぞれアンチセンス鎖（またはその一部）を含み、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ）に対して十分な相補性を有し、ＲＮＡ媒介サイレンシング機構（例えばＲＮＡｉ）を媒介する。
例示的な実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して付着させた２～８のＲＮＡサイレンシング剤を有し得る。リンカーは、疎水性であってもよい。一実施形態では、本願の分岐オリゴヌクレオチドは、２～３のオリゴヌクレオチドを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、独立して、実質的な化学的安定化を有する（例えば、構成塩基の少なくとも４０％が化学修飾されている）。例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全な化学的安定化を有する（すなわち、すべての構成塩基が化学修飾されている）。いくつかの実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、それぞれが独立して２～２０のヌクレオチドを有する１つ以上の一本鎖ホスホロチオエートテールを含む。非限定的な実施形態では、各一本鎖テールは、２～１０のヌクレオチドを有する。
特定の実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、３つの特性を特徴とする：（１）分岐構造、（２）完全な代謝安定化、及び（３）ホスホロチオエートリンカーを含む一本鎖テールが存在すること。特定の実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、２つまたは３つの分岐を有する。分岐構造の全体的なサイズの増加は、取り込みの増加を促進すると考えられている。また、活性に関する特定の理論に拘束されるものではないが、複数の隣接する分岐（例えば、２つまたは３つ）は、各分岐が協調して作用することができ、したがって、内在化、転送、及び放出の速度を劇的に向上させると考えられている。
分岐オリゴヌクレオチドは、構造的に多様な様々な実施形態で提供される。いくつかの実施形態では、分岐点で付着している核酸は、一本鎖または二本鎖であり、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ギャップマー、ミックスマー、ＳＳＯ、ＰＭＯ、またはＰＮＡからなる。これらの一本鎖は、３’末端または５’末端に付着させ得る。ｓｉＲＮＡと一本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせも、二重機能に使用できる。別の実施形態では、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯ、及びＰＮＡに相補的な短い核酸を使用して、これらの活性一本鎖核酸を運び、分布及び細胞内在化を増強する。短い二重鎖領域は、分岐構造を細胞内に取り込む時に、急速に解離させるために、低い溶融温度（Ｔｍ約３７℃）を有する。
Ｄｉ－ｓｉＲＮＡ分岐オリゴヌクレオチドは、上記の機能部分などの化学的に多様なコンジュゲートを含み得る。コンジュゲート生理活性リガンドは、細胞特異性を向上させ、膜結合、内在化、及び血清タンパク質結合を促進するために使用されてもよい。コンジュゲーションに使用される生理活性部分の例としては、ＤＨＡ、ＧａｌＮＡｃ、及びコレステロールが挙げられる。これらの部分は、接続リンカーまたはスペーサーを介してＤｉ－ｓｉＲＮＡに付着するか、別の遊離ｓｉＲＮＡ末端に付着した追加のリンカーまたはスペーサーを介して付加することができる。
分岐構造が存在することにより、同じ化学組成の非分岐化合物と比較して、脳内の組織保持レベルが１００倍を超えて改善され、これは、細胞の保持及び分布の新しい機構を示唆するものである。分岐オリゴヌクレオチドは、脊髄及び脳全体に予想外に均一に分布している。さらに、分岐オリゴヌクレオチドは、様々な組織への予想外に効率的な全身送達、及び非常に高レベルの組織蓄積を呈する。
分岐オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチング、ＰＭＯ、ＰＮＡなど、様々な治療用核酸を含む。いくつかの実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートされた疎水性部分をさらに含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、前例のないサイレンシング及び効果を呈する。
リンカー
分岐オリゴヌクレオチドの一実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、及びそれらの組み合わせから独立して選択され；ここで、リンカーの任意の炭素原子または酸素原子は、任意により窒素原子で置換されているか、ヒドロキシル置換基を保有しているか、またはオキソ置換基を保有している。一実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、アルキル鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、ペプチドである。別の実施形態では、各リンカーは、ＲＮＡである。別の実施形態では、各リンカーは、ＤＮＡである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホネートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホルアミデートである。別の実施形態では、各リンカーは、エステルである。別の実施形態では、各リンカーは、アミドである。別の実施形態では、各リンカーは、トリアゾールである。
ＶＩＩ．式（Ｉ）の化合物：
別の態様では、本明細書において、式（Ｉ）の分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供される：
Figure 2023522701000044
 （式中、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、及びそれらの組み合わせから選択され、式（Ｉ）は、任意により、さらに１つ以上の分岐点Ｂ、及び１つ以上のスペーサーＳを含み；ここで、Ｂは、出現ごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり、Ｓは、出現ごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、及びそれらの組み合わせから選択される）。
部分Ｎは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡ二本鎖であり；ｎは、２、３、４、５、６、７または８である。一実施形態では、Ｎのアンチセンス鎖は、表４及び表６に記載の配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む。さらなる実施形態では、Ｎは、表５及び表６に記載の配列番号１３～１８及び３１～４２からなる群から選択されるＭＳＨ３核酸配列の１つ以上を標的とすることができる鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、１つ以上の化学修飾を含み得る。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、表１の式（Ｉ－１）～（Ｉ－９）から選択される構造を有する。
Figure 2023522701000045
１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－１）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－２）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－３）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－４）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－５）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－６）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－７）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－８）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－９）である。
式（Ｉ）の化合物の実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、及びそれらの組み合わせから独立して選択され；ここで、リンカーの任意の炭素原子または酸素原子は、任意により窒素原子で置換されているか、ヒドロキシル置換基を保有しているか、またはオキソ置換基を保有している。式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、アルキル鎖である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ペプチドである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ＲＮＡである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ＤＮＡである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホネートである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ホスホルアミデートである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、エステルである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、アミドである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、トリアゾールである。
式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｂは、多価有機種である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、Ｂは、多価有機種の誘導体である。式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｂは、トリオールまたはテトロール誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、トリまたはテトラカルボン酸誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、アミン誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、トリまたはテトラアミン誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、アミノ酸誘導体である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、Ｂは、以下からなる式から選択される：
Figure 2023522701000046
多価有機種は、炭素及び３つ以上の原子価を含む部分（すなわち、上記で定義したＳ、ＬまたはＮなどの部分との付着点）である。多価有機種の非限定的な例としては、トリオール（例えば、グリセロール、フロログルシノールなど）、テトロール（例えば、リボース、ペンタエリスリトール、１，２，３，５－テトラヒドロキシベンゼンなど）、トリカルボン酸（例えば、クエン酸、１，３，５－シクロヘキサントリカルボン酸、トリメシン酸など）、テトラカルボン酸（例えば、エチレンジアミン四酢酸、ピロメリット酸など）、第三級アミン（例えば、トリプロパルギルアミン、トリエタノールアミンなど）、トリアミン（例えば、ジエチレントリアミンなど）、テトラミン、及びヒドロキシル、チオール、アミノ及び／またはカルボキシル部分の組み合わせを含む種（例えば、リジン、セリン、システインなどのアミノ酸）が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物の実施形態では、各核酸は、１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。式（Ｉ）の化合物の実施形態では、各核酸は、化学修飾ヌクレオチドからなる。式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態では、超各核酸の９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超または５０％超は、化学修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、各アンチセンス鎖は独立して、表２の群から選択される５’末端基Ｒを含む。


Figure 2023522701000047
一実施形態では、Ｒは、Ｒ１である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ２である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ３である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ４である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ５である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ６である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ７である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ８である。
式（ＩＩ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）の構造を有する：
Figure 2023522701000048
 （式中、Ｘは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、Ｙは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され；－は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；及び－－－は、発現ごとに個別に、塩基対相互作用またはミスマッチを表す）。
特定の実施形態では、式（ＩＩ）の構造は、ミスマッチを含まない。１つの実施形態では、式（ＩＩ）の構造は、１つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、２つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、３つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、４つのミスマッチを含む。一実施形態では、各核酸は、化学修飾ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態では、式（ＩＩ）の構造のＸ’の９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超、または５０％超は、化学修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、式（ＩＩ）の構造のＸ’の９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超、または５０％超は、化学修飾ヌクレオチドである。
式（ＩＩＩ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）の構造を有する：





Figure 2023522701000049
ここで、Ｘは、出現ごとに独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、出現ごとに独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドであり；Ｙは、出現ごとに独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｙは、出現ごとに独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドである。
一実施形態では、Ｘは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｘは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｙは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｙは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の構造は、ミスマッチを含まない。１つの実施形態では、式（ＩＩＩ）の構造は、１つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、２つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、３つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、４つのミスマッチを含む。
式（ＩＶ）の構造
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）の構造を有する：
Figure 2023522701000050
 （式中、Ｘは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、Ｙは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され；－は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；及び－－－は、発現ごとに個別に、塩基対相互作用またはミスマッチを表す）。
特定の実施形態では、式（ＩＶ）の構造は、ミスマッチを含まない。１つの実施形態では、式（ＩＶ）の構造は、１つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、２つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、３つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、４つのミスマッチを含む。一実施形態では、各核酸は、化学修飾ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態では、式（ＩＶ）の構造のＸ’の９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超、または５０％超は、化学修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、式（ＩＶ）の構造のＸ’の９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超、または５０％超は、化学修飾ヌクレオチドである。
式（Ｖ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）の構造を有する：
Figure 2023522701000051
 ここで、Ｘは、出現ごとに独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、出現ごとに独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドであり；Ｙは、出現ごとに独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｙは、出現ごとに独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドである。
特定の実施形態では、Ｘは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｘは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｙは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｙは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。
特定の実施形態では、式（Ｖ）の構造は、ミスマッチを含まない。１つの実施形態では、式（Ｖ）の構造は、１つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、２つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、３つのミスマッチを含む。別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、４つのミスマッチを含む。
可変リンカー
式（Ｉ）の化合物の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１を有する：
Figure 2023522701000052
 Ｌ１の実施形態では、Ｒは、Ｒ３であり、ｎは、２である。
式（ＩＩ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１を有する。式（ＩＩＩ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１を有する。式（ＩＶ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１を有する。式（Ｖ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１を有する。式（ＶＩ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１を有する。式（ＶＩ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ１を有する。
式（Ｉ）の化合物の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２を有する：
Figure 2023522701000053
Ｌ２の一実施形態において、Ｒは、Ｒ３であり、ｎは、２である。式（ＩＩ）の構造の一実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２を有する。式（ＩＩＩ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２を有する。式（ＩＶ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２を有する。式（Ｖ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２を有する。式（ＶＩ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２を有する。式（ＶＩ）の構造の実施形態では、Ｌは、構造Ｌ２を有する。
送達系
第３の態様では、式（ＶＩ）の構造を有する治療用核酸のための送達系が本明細書に提供される：
Figure 2023522701000054
式中、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、及びそれらの組み合わせから選択され、式（ＶＩ）は、任意により、さらに１つ以上の分岐点Ｂ、及び１つ以上のスペーサーＳを含み；ここで、Ｂは、出現ごとに、独立して、出現時に、多価有機種またはその誘導体であり、Ｓは、出現ごとに、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、及びそれらの組み合わせから選択される。各ｃＮＡは、独立して、１つ以上の化学的修飾を含むキャリア核酸であり、ｎは、２、３、４、５、６、７または８である。
送達系の一実施形態では、Ｌは、エチレングリコール鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｌは、アルキル鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ペプチドである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ＲＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ＤＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスフェートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスホネートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスホルアミデートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、エステルである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、アミドである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、トリアゾールである。
送達系の一実施形態では、Ｓは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、Ｓは、アルキル鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ペプチドである。別の実施形態では、Ｓは、ＲＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ＤＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスフェートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスホネートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスホルアミデートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、エステルである。別の実施形態では、Ｓは、アミドである。別の実施形態では、Ｓは、トリアゾールである。
送達系の一実施形態では、ｎは２である。送達系の別の実施形態では、ｎは３である。送達系の別の実施形態では、ｎは４である。送達系の別の実施形態では、ｎは５である。送達系の別の実施形態では、ｎは６である。送達系の別の実施形態では、ｎは７である。送達系の別の実施形態では、ｎは８である。
特定の実施形態では、各ｃＮＡは、９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超、または５０％超の化学修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、表３の式（ＶＩ－１）～（ＶＩ－９）から選択される構造を有する。
Figure 2023522701000055
ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－１）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－２）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－３）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－４）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－５）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－６）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－７）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－８）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－９）の構造である。
一実施形態では、式（ＶＩ）（例えば、式（ＶＩ－１）～（ＶＩ－９）など）の化合物は、各ｃＮＡが、独立して、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ｃＮＡは、独立して、化学修飾ヌクレオチドからなる。
一実施形態では、送達系は、ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含み、ここで、各ＮＡは、表４及び表６に示される配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む。さらなる実施形態では、ＮＡは、表５及び表６に記載の配列番号１３～１８及び３１～４２からなる群から選択されるＭＳＨ３核酸配列の１つ以上を標的とすることができる鎖を含む。
また、各ＮＡは、少なくとも１つのｃＮＡにハイブリダイズする。一実施形態では、送達系は、２つのＮＡから構成される。別の実施形態では、送達系は、３つのＮＡから構成される。別の実施形態では、送達系は、４つのＮＡから構成される。別の実施形態では、送達系は、５つのＮＡから構成される。別の実施形態では、送達系は、６つのＮＡから構成される。別の実施形態では、送達系は、７つのＮＡから構成される。別の実施形態では、送達系は、８つのＮＡから構成される。
一実施形態では、各ＮＡは、独立して、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、１５～２５の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、１５の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、１６の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１７の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１８の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１９の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、２０の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、２１の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、２２の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、２３の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、２４の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、２５の連続ヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、各ＮＡは、少なくとも２ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも３ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも４ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも５ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも６ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。ある実施形態では、オーバーハングのヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を介して結合されている。
ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマー、またはガイドＲＮＡからなる群から選択される。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立してｓｉＲＮＡである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ａｎｔａｇｏｍｉＲである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ｍｉＲＮＡである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ギャップマーである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ミックスマーである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ガイドＲＮＡである。ある実施形態では、各ＮＡは、同じである。ある実施形態では、各ＮＡは、同じではない。
ある実施形態では、ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む送達系は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、２つの治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。別の実施形態では、送達系は、３つの治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、４つの治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、５つの治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、６つの治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、７つの治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、８つの治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び本明細書に記載のそれらの実施形態から選択される構造を有する。
一実施形態では、送達系は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、構造Ｌ１またはＬ２のリンカーをさらに含み、式中、Ｒは、Ｒ３であり、ｎは２である。別の実施形態では、送達系は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、構造Ｌ１のリンカーをさらに含み、式中、Ｒは、Ｒ３であり、ｎは２である。別の実施形態では、送達系は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、構造Ｌ２のリンカーさらに含み、式中、Ｒは、Ｒ３であり、ｎは２である。
送達系の一実施形態では、送達の標的は、脳、肝臓、皮膚、腎臓、脾臓、膵臓、結腸、脂肪、肺、筋肉、及び胸腺からなる群から選択される。一実施形態では、送達の標的は、脳である。別の実施形態では、送達の標的は、脳の線条体である。別の実施形態では、送達の標的は、脳の皮質である。別の実施形態では、送達の標的は、脳の線条体である。一実施形態では、送達の標的は、肝臓である。一実施形態では、送達の標的は、皮膚である。一実施形態では、送達の標的は、腎臓である。一実施形態では、送達の標的は、脾臓である。一実施形態では、送達の標的は、膵臓である。一実施形態では、送達の標的は、結腸である。一実施形態では、送達の標的は、脂肪である。一実施形態では、送達の標的は、肺である。一実施形態では、送達の標的は、筋肉である。一実施形態では、送達の標的は、胸腺である。一実施形態では、送達の標的は、脊髄である。
特定の実施形態では、本開示の化合物は、以下の特性を特徴とする：（１）２つ以上の分岐オリゴヌクレオチド、例えば、３’末端及び５’末端の数が等しくない；（２）実質的に化学的に安定化している、例えば、４０％超、最適には１００％のオリゴヌクレオチドが、化学修飾されている（例えば、ＲＮＡが不在であり、任意によりＤＮＡが不在である）；（３）少なくとも３つのホスホロチオエート結合を含むホスホロチオエート単一オリゴヌクレオチド。特定の実施形態では、ホスホロチオエート単一オリゴヌクレオチドは、４～２０個のホスホロチオエート結合を含有する。
本開示に記載される方法は、本明細書に開示される特定の方法及び実験条件に限定されないことが理解されるべきである。そのため、方法及び条件は、変動し得る。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
さらに、本明細書に記載の実験は、別段の指示がない限り、当業者の範囲内の従来の分子及び細胞生物学的及び免疫学的技術を使用する。このような技術は、当業者にはよく知られており、文献内で十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８７－２００８），すべての補足を含む，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＭＲ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２０１３，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい。
合成及び使用方法を含む分岐オリゴヌクレオチドについては、ＷＯ２０１７／１３２６６９にさらに詳細に記載されている。これは、参照により本明細書に組み込まれる。
核酸、ベクター及び宿主細胞の導入方法
本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、細胞（例えば、神経細胞）に（すなわち、細胞内に）直接導入することができる。または細胞外から空洞、間隙、生物の循環に導入される、経口的に導入される、または核酸を含む溶液に細胞もしくは生物を浸すことによって導入され得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液は、核酸が導入され得る部位である。
本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、核酸を含む溶液の注入、核酸によって覆われた粒子による衝撃、核酸の溶液への細胞または生物の浸漬、または核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションなど、当技術分野において知られている核酸送達法を使用して、導入され得る。核酸を細胞に導入するための当技術分野で公知の他の方法、例えば脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどを使用してもよい。核酸は、以下の活性のうちの１つ以上を行う他の成分と共に導入され得る：細胞による核酸の取り込みを増強する、さもなければ標的遺伝子の阻害を増加させる。
核酸を導入する物理的方法としては、ＲＮＡを含む溶液の注入、ＲＮＡで覆われた粒子による衝撃、ＲＮＡの溶液への細胞または生物の浸漬、またはＲＮＡの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションが挙げられる。ウイルス粒子にパッケージ化されたウイルス構築物は、細胞への発現構築物の効率的な導入、及び発現構築物によってコードされるＲＮＡの転写の両方を達成する。核酸を細胞に導入するための当技術分野で公知の他の方法、例えば脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、例えば、リン酸カルシウムなどを使用してもよい。したがって、ＲＮＡは、以下の活性のうちの１つ以上を行う成分と共に導入され得る：細胞によるＲＮＡ取り込みの増強、一本鎖のアニーリングの阻害、一本鎖の安定化、またはさもなければ標的遺伝子の阻害の増加。
ＲＮＡは、細胞に（すなわち、細胞内に）直接導入することができる。または細胞外から空洞、間隙、生物の循環に導入される、経口的に導入される、またはＲＮＡを含む溶液に細胞もしくは生物を浸すことによって導入され得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液は、ＲＮＡが導入され得る部位である。
標的遺伝子を有する細胞は、生殖系列または体細胞、全能性または多能性、分裂または非分裂、柔組織または上皮、不死化または形質転換などに由来し得る。細胞は、幹細胞または分化細胞であり得る。分化する細胞型としては、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が挙げられる。
特定の標的遺伝子及び送達される二本鎖ＲＮＡ材料の用量に応じて、このプロセスは、標的遺伝子の部分的または完全な機能喪失をもたらし得る。少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％、またはそれ以上の標的細胞における遺伝子発現の減少または喪失が典型的である。遺伝子発現の阻害とは、標的遺伝子からのタンパク質及び／またはｍＲＮＡ産物のレベルの欠如（または観察可能な減少）を指す。特異性とは、細胞の他の遺伝子に明らかな影響を与えることなく、標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞または生物の外部特性を調べることによって（以下の実施例に示されているとおり）、または生化学的手法、例えば、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって確認することができる。
細胞株または生物全体におけるＲＮＡ媒介阻害の場合、タンパク質産物が容易にアッセイされるレポーターまたは薬剤耐性遺伝子を使用することによって、遺伝子発現は、簡便にアッセイされる。このようなレポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｒｎｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノスリシン、ピューロマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。アッセイに応じて、遺伝子発現量の定量化により、本開示により治療されていない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％を超える阻害度を判定することができる。注入された材料の用量が少なく、ＲＮＡｉ剤の投与後の時間が長い場合には、細胞のより少ない割合（例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、または９５％）で阻害され得る。細胞内の遺伝子発現の定量化は、標的ｍＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルで、同様の量の阻害を示し得る。一例として、細胞内の遺伝子産物の量を評価することにより、阻害の効率を判定してもよい。ｍＲＮＡは、阻害性二本鎖ＲＮＡに使用される領域外にヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブにより検出され得るか、または翻訳されたポリペプチドが、その領域のポリペプチド配列に対して産生された抗体で検出され得る。
ＲＮＡは、細胞当たり少なくとも１コピーの送達が可能になる量で導入され得る。高用量の材料（例えば、少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー／細胞）は、より効果的な阻害をもたらし得、低用量は、特定の用途にも有用であり得る。
例示的態様では、本開示のＲＮＡｉ剤（例えば、ＭＳＨ３標的配列を標的とするｓｉＲＮＡ）の効果は、細胞、中枢神経系中の細胞において、変異型ｍＲＮＡ（例えば、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ及び／またはＭＳＨ３タンパク質の産生）を特異的に分解する能力について、試験する。特定の実施形態では、中枢神経系中の細胞としては、これらに限定されないが、ニューロン（例えば、線条体または皮質ニューロンクローン系、及び／または一次ニューロン）、グリア細胞、及び星状細胞が挙げられる。また、細胞ベースの検証アッセイに好適であるのは、他の容易にトランスフェクト可能な細胞、例えばＨｅＬａ細胞またはＣＯＳ細胞である。細胞は、ヒトの野生型または変異体ｃＤＮＡ（例えば、ヒトの野生型または変異体のＭＳＨ３ ｃＤＮＡ）でトランスフェクトされる。標準的なｓｉＲＮＡ、修飾ｓｉＲＮＡ、またはＵループ型ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡを生成できるベクターを同時トランスフェクトする。標的ｍＲＮＡの選択的減少（例えば、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ）及び／または標的タンパク質（例えば、ＭＳＨ３タンパク質）を測定する。標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の減少は、ＲＮＡｉ剤の非存在下またはＭＳＨ３ ｍＲＮＡを標的としないＲＮＡｉ剤の存在下での標的ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することができる。外因的に導入されたｍＲＮＡまたはタンパク質（または内因性のｍＲＮＡまたはタンパク質）は、比較目的でアッセイできる。標準的なトランスフェクション技術に対してある程度耐性があることが知られている神経細胞を利用する場合、受動的取り込みによって、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を導入することが望ましい場合がある。
組換えアデノ随伴ウイルス及びベクター
特定の例示的な実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）及びそれらの関連ベクターを使用して、１つ以上のｓｉＲＮＡを細胞、例えば神経細胞（例えば脳細胞）に送達することができる。ＡＡＶは、カプシドタンパク質の配列によって決定される血清型に基づいて感染効率が異なるが、多くの異なる細胞型に感染できる。いくつかのネイティブＡＡＶ血清型が特定されており、血清型１～９が、組換えＡＡＶに最も一般的に使用されている。ＡＡＶ－２は、最もよく研究され、公開されている血清型である。ＡＡＶ－ＤＪ系としては、血清型ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ－ＤＪ／８が挙げられる。これらの血清型は、複数のＡＡＶ血清型のＤＮＡシャッフリングによって作成され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ＡＡＶ－ＤＪ）及びｉｎ ｖｉｖｏ（ＡＡＶ－ＤＪ／８）において、様々な細胞及び組織中に改善された形質導入効率を有するハイブリッドキャプシドを含むＡＡＶを産生する。
特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス７（ｒＡＡＶ７）、ＲＡＡＶ９及びｒＡＡＶ１０、または他の好適なｒＡＡＶの血管内送達によって、広範な中枢神経系（ＣＮＳ）の送達を達成することができる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９（８）：１４４０－８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１１．９８．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｍａｙ２４）。ｒＡＡＶ及びそれらに関連するベクターは、当技術分野で周知であり、米国特許出願第２０１４／０２９６４８６号、同第２０１０／０１８６１０３号、同第２００８／０２６９１４９号、同第２００６／００７８５４２号及び同第２００５／０２２０７６６号に記載され、そのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の適切な方法に従って、組成物中で対象に送達され得る。ｒＡＡＶは、生理学的に適合する担体（すなわち、組成物）に懸濁することができ、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、非ヒト霊長類（例えば、マカク）などの宿主動物に投与してもよい。ある特定の実施形態では、動物は、非ヒト宿主動物である。
哺乳動物対象への１つ以上のｒＡＡＶの送達は、例えば、筋肉内注射によって、または哺乳動物対象の血流への投与によって行うことができる。血流への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管導管への注射によるものであり得る。特定の実施形態では、１つ以上のｒＡＡＶは、外科技術において周知の技法である単離された四肢灌流によって血流に投与され、この方法は、当業者がｒＡＡＶビリオンの投与前に全身循環から四肢を単離することが本質的に可能になる。米国特許第６，１７７，４０３号に記載されている単離肢灌流技術の変形はまた、筋細胞または組織への形質導入を潜在的に増強するために、単離された四肢の脈管構造にビリオンを投与するために当業者によって使用され得る。さらに、場合によっては、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）にビリオンを送達することが望ましい場合がある。「ＣＮＳ」とは、脊椎動物の脳及び脊髄のすべての細胞及び組織を意味する。したがって、この用語には、これらに限定されないが、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔、骨、軟骨などが挙げられる。組換えＡＡＶは、針、カテーテル、または関連する装置を用いて、定位注射など、当技術分野で知られている神経外科技術を使用して、例えば心室領域、ならびに線条体（例えば、線条体の尾状核または被殻）、脊髄及び神経筋接合部、または小脳小葉への注射によって、ＣＮＳまたは脳に直接送達され得る（例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４－３４２９，１９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９－２２３，１９９３；及びＡｌｉｓｋｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２３１５－２３２９，２０００）。
本開示の組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１つ以上の他のウイルスと組み合わせて含み得る（例えば、１つ以上の異なる導入遺伝子を有する第２のｒＡＡＶコード化）。特定の実施形態では、組成物は、それぞれが１つ以上の異なる導入遺伝子を有する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるｒＡＡＶを含む。
ｒＡＡＶの有効量は、動物を標的感染させ、所望の組織を標的にするのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、安定した体細胞トランスジェニック動物モデルを作製するのに十分な量である。有効量は主に、対象の種、年齢、体重、健康状態、及び標的とする組織などの要因に依存し、したがって動物及び組織によって異なり得る。例えば、１つ以上のｒＡＡＶの有効量は、一般に、約１０９～１０１６のゲノムコピーを含む約１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液の範囲である。場合によっては、約１０１１～１０１２のｒＡＡＶゲノムコピーの投与量が適切である。特定の実施形態では、１０１２のｒＡＡＶゲノムコピーが、心臓、肝臓、及び膵臓組織を標的とするのに有効である。場合によっては、安定したトランスジェニック動物は、ｒＡＡＶの複数回投与によって産生される。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に高ｒＡＡＶ濃度が存在する場合（例えば、約１０１３ゲノムコピー／ｍＬ以上）、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を減少させるために、製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を減少させるための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などが挙げられる（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：１７１－１７８，その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、少なくとも、導入遺伝子及びその調節配列、ならびに５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。キャプシドタンパク質にパッケージされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組換えＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ベクター配列とは異種の核酸配列であり、この配列は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）または他の遺伝子産物をコードする。核酸コード配列は、標的組織の細胞中における導入遺伝子の転写、翻訳、及び／または発現を可能にする様式で調節成分に作動可能に連結される。
ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、通常、約１４５塩基対長である。特定の実施形態では、実質的に、ＩＴＲをコードする配列全体が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾できることは、当業者の範囲内である（例えば、テキスト、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本開示で使用されるそのような分子の例は、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントが、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、本明細書にさらに記載される哺乳動物ＡＡＶタイプなど、任意の既知のＡＡＶから得ることができる。
ＶＩＩＩ．治療方法
一態様では、本開示は、ハンチントン病またはアルツハイマー病などの神経変性疾患が生じるリスクがある（または生じやすい）対象を治療する予防及び治療方法の両方を提供する。一実施形態では、疾患または障害は、ハンチントン病などのヌクレオチドリピート障害である。特定の実施形態では、ＣＮＳにおけるＭＳＨ３の減少が、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病などの神経変性疾患で見られる臨床症状を減少させる疾患または障害である。
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、患者への治療剤（例えば、ＲＮＡ剤またはベクターもしくはそれをコードする導入遺伝子）の適用もしくは投与、または患者から単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義され、患者は、その疾患もしくは障害、その疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害の素因を有し、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患の素因を治療する、治癒させる、軽減させる、緩和させる、変更させる、修復させる、回復させる、改善させるまたは影響を与えるために行う。
一態様では、本開示は、対象に治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤またはベクターまたはそれをコードする導入遺伝子）を投与することによって、対象において上記の疾患または障害を予防する方法を提供する。疾患のリスクがある対象は、例えば、本明細書に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害に特徴的な症状が現れる前に行うことができ、これにより、その疾患または障害を予防するか、あるいはその進行を遅らせるようになる。
本開示の別の態様は、対象を治療的に処置する方法、すなわち、疾患または障害の症状の発症を変化させる方法に関する。例示的な実施形態では、本開示の調節方法は、ＭＳＨ３を発現するＣＮＳ細胞を、遺伝子内の標的配列（例えば、表４のＭＳＨ３標的配列）に特異的な治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤、ベクター、またはこれらをコードする導入遺伝子）と接触させることを含み、これにより、配列特異的に遺伝子を干渉させることが得られる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞を剤と共に培養することにより）で、あるいはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、剤を対象に投与することにより）で行うことができる。
ＩＸ．医薬組成物及び投与方法
本開示は、以下に記載の予防的及び／または治療的治療のための上記剤の使用に関する。したがって、本開示の調節因子（例えば、ＲＮＡｉ剤）は、投与に好適である医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、抗体、または調節化合物及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書において「薬学的に許容される担体」という用語は、薬剤投与に適合する任意の及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張性及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的活性物質のためのそのような培地及び剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の培地または剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、及び経粘膜投与が挙げられる。特定の例示的な実施形態では、本開示の医薬組成物は、静脈内投与され、血液脳関門を通過して中枢神経系に入ることができる。特定の例示的な実施形態では、本開示の医薬組成物は、これらに限定されないが、線条体内（ＩＳ）投与、脳・脳室内（ＩＣＶ）投与及び髄腔内（ＩＴ）投与（例えば、ポンプ、注入などを介して）などの投与経路によって、脳脊髄液（ＣＳＦ）に送達される。
本開示の核酸分子は、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクターなどの発現構築物中に、例えば、これに限定されないが、上記のＸｉａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）に記載されたものなど、本技術で知られている方法を用いて挿入することができる。発現構築物は、例えば、吸入、経口、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３０５４－３０５７）を参照）によって対象に送達することができる。送達ベクターの薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中のベクターを含むことができ、または送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な送達ベクターが組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから無傷で産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
本開示の核酸分子はまた、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｈＲＮＡを発現するように操作された発現構築物を含み得る。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターで開始され、４－５－チミン転写終結部位の２位で終結すると考えられている。発現時に、ｓｈＲＮＡは、３’ＵＵオーバーハングを有するステムループ構造に折り畳まれると考えられている。その後、これらのｓｈＲＮＡの末端がプロセシングされ、これにより、ｓｈＲＮＡが約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換される。Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０－５５３；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，（２００２）．上記；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，４９７－５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），上記；Ｐａｕｌ（２００２），上記；Ｓｕｉ（２００２）上記；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００２），上記。
発現構築物は、適切な発現系での使用に好適な任意の構築物であってもよく、これらに限定されないが、当技術分野で知られている、レトロウイルスベクター、線形発現カセット、プラスミド、及びウイルスまたはウイルス由来のベクターが挙げられる。こうした発現構築物は、１つ以上の誘導性プロモーター、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター系、例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、または当技術分野で公知の他のプロモーターを含み得る。構築物は、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖を含むことができる。両方の鎖を発現する発現構築物はまた、両方の鎖を連結するループ構造を含むことができ、または各鎖は、同じ構築物内の別々のプロモーターから別々に転写することができる。各鎖は、別の発現構築物から転写することもできる（Ｔｕｓｃｈｌ（２００２）、上記）。
特定の実施形態では、本開示の化合物を含む組成物は、様々な経路によって対象の神経系に送達され得る。例示的経路としては、髄腔内、実質（例えば、脳内）、鼻、及び眼への送達が挙げられる。組成物はまた、例えば、静脈内、皮下または筋肉内注射によって、全身的に送達することができる。送達の１つの経路は、脳へ、例えば、脳室もしくは脳の視床下部へ、または脳の外側領域もしくは背側領域へ直接行う。神経細胞送達のための化合物は、投与に好適である医薬組成物に組み込むことができる。
例えば、組成物は、本開示の１つ以上の種の化合物及び薬学的に許容される担体を含むことができる。本開示の医薬組成物は、局所または全身治療が望まれるか否か、及び治療される領域に応じて、複数の方法で投与され得る。投与は、局所（眼、鼻腔内、経皮など）、経口、または非経口であってよい。非経口投与としては、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、髄腔内、または脳室内（例えば、脳・脳室内）投与が挙げられる。特定の例示的な実施形態では、本開示のＲＮＡサイレンシング剤は、本明細書に記載の様々な好適な組成物及び方法を用いて、血液脳関門（ＢＢＢ）で送達される。
送達経路は、患者の障害に依存し得る。例えば、神経変性疾患と診断された対象は、本開示の抗ＭＳＨ３化合物を脳（例えば、大脳基底核の淡蒼球または線条体、及び線条体の中型有棘ニューロンの近く）に直接投与することができる。本開示の化合物に加えて、患者には、第２の治療法、例えば緩和治療法及び／または疾患特異的治療法を施すことができる。第２の治療法は、例えば、対症療法（例えば、症状を緩和するため）、神経保護（例えば、疾患の進行を遅延または停止させるため）、または回復（例えば、疾患プロセスの逆転させるため）であり得る。他の治療法としては、心理療法、理学療法、言語療法、コミュニケーション及び記憶の補助、社会的支援サービス、ならびに食事のアドバイスを挙げることができる。
本開示の化合物は、脳の神経細胞に送達することができる。特定の実施形態では、本開示の化合物は、中枢神経系に直接投与することなく脳に送達され得る、すなわち、化合物は、静脈内に送達され、血液脳関門を通過して脳に入ることができる。組成物が血液脳関門を通過する必要のない送達方法を利用することができる。例えば、本開示の化合物を含有する医薬組成物は、疾患が影響を及ぼす細胞を含有する領域に直接注射することによって患者に送達することができる。例えば、医薬組成物は、脳への直接注射によって送達することができる。注射は、脳の特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、または淡蒼球）への定位注射によるものであり得る。化合物は、中枢神経系の複数の領域に（例えば、脳の複数の領域に、及び／または脊髄に）送達することができる。化合物は、脳のびまん性領域に送達することができる（例えば、脳の皮質へのびまん性送達）。
一実施形態では、化合物は、組織、例えば、脳、例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球に移植された一端を有するカニューレまたは他の送達デバイスによって送達され得る。カニューレは、化合物を含むリザーバに接続され得る。流れまたは送達は、ポンプ、例えば浸透圧ポンプまたはミニポンプ、例えばＡｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）によって媒介され得る。一実施形態では、ポンプ及びリザーバは、組織から離れた領域、例えば腹部に移植され、送達は、ポンプまたはリザーバから放出部位に通じる導管によって行われる。脳へ送達するためのデバイスは、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号及び第５，８１４，０１４号に記載されている。
本明細書に開示された実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を使用して、本明細書に記載された方法の他の好適な修正及び適合を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。これまで特定の実施形態を詳細に記載してきたが、以下の実施例を参照することにより、同じことがより明確に理解されるであろう。これは説明の目的でのみ含まれ、制限することを意図するものではない。
実施例１．ＭＳＨ３標的配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ同定
ＭＳＨ３遺伝子は、ｍＲＮＡノックダウンの標的として使用した。ヒト及びマウスＭＳＨ３ ｍＲＮＡのいくつかの異なる配列を標的とするｓｉＲＮＡのパネルが開発され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞でスクリーニングを行い、未処置対照細胞と比較した。ｓｉＲＮＡは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を標的とするように設計した。ｓｉＲＮＡは、それぞれ１．５μＭの濃度で試験し、ｍＲＮＡは、７２時間の時点で、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ遺伝子発現アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて評価した。図１は、ヒトＭＳＨ３ ｍＲＮＡに対するスクリーニングの結果を報告するものであり、図２は、最初のスクリーニングで同定された６つのＭＳＨ３標的の８点用量応答曲線を報告する。
以下の表４は、未処置対照％に対して、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ発現の減少を示したヒトＭＳＨ３標的配列を列挙している。以下の表５は、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡの強力かつ有効なサイレンシングが生じた６のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖及びセンス鎖を列挙する。表６は、新規ｓｉＲＮＡの開発の候補であるｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニングによって同定したＭＳＨ３標的を列挙している。


























Figure 2023522701000056
Figure 2023522701000057
Figure 2023522701000058
Figure 2023522701000059
Figure 2023522701000060
Figure 2023522701000061
Figure 2023522701000062
Figure 2023522701000063
Figure 2023522701000064
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Figure 2023522701000069
Figure 2023522701000070
Figure 2023522701000071
Figure 2023522701000072
実施例２．ＭＳＨ３標的配列の拡大されたインビトロスクリーニング
ＭＳＨ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡの追加のスクリーニングを実施した。ヒト及びマウスＭＳＨ３ ｍＲＮＡのいくつかの異なる配列を標的とするｓｉＲＮＡのパネルインビトロでヒーラ細胞において培養及びスクリーニングし、未処置対照細胞と比較した。ｓｉＲＮＡを１．５μＭの濃度でそれぞれ試験し、７２時間の時点で、ｍＲＮＡをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ遺伝子発現アッセイで評価した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。図３は、ヒトＭＳＨ３は ｍＲＮＡに対するスクリーニングの結果を報告し、図４は、初期のスクリーニングで同定された６つのＭＳＨ３標的に対する８点用量応答曲線を報告する。４５ヌクレオチド及び２０ヌクレオチドＭＳＨ３標的配列が以下の表７に示される。ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、以下の表８に示される。次のｓｉＲＮＡ化学修飾パターンをインビトロスクリーニングで使用した：
アンチセンス鎖、５’から３’（長さ２１ヌクレオチド）：
Ｐ（ｍＸ）＃（ｆＸ）＃（ｍＸ）（ｆＸ）（ｆＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）＃（ｍＸ）＃（ｆＸ）＃（ｍＸ）＃（ｍＸ）＃（ｍＸ）＃（ｆＸ）＃（ｍＸ）
センス鎖、５’から３’（長さ１６ヌクレオチド）：
（ｍＸ）＃（ｍＸ）＃（ｍＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）（ｍＸ）（ｍＸ）（ｍＸ）（ｆＸ）＃（ｍＸ）＃（ｍＸ）
「ｍ」は、２’－Ｏ－メチル修飾に対応する。「ｆ」は、２’－フルオロ修飾に対応する；「Ｘ」は、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣに対応する；「＃」は、ホスホロチオエートのヌクレオチド間連結に対応する；「Ｐ」は、５’ホスファートに対応する。
Figure 2023522701000073
Figure 2023522701000074
Figure 2023522701000075
Figure 2023522701000076
Figure 2023522701000077
実施例３．マウス脳におけるＭＳＨ３のインビボサイレンシング
実施例１及び実施例２で実施したスクリーニングの結果に基づいて、ＭＳＨ３標的部位はＭＳＨ３ １０００を設計し、マウス脳における更なる試験のために選択した。ｓｉＲＮＡを標的とする２つの異なるハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子も使用し、配列を以下に記載する。
ＨＴＴ＿１０１５０：
アンチセンス鎖：ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ
センス鎖：ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ
ＨＴＴ１ａ＿６３４：
アンチセンス鎖：ＵＵＡＡＣＵＡＣＡＣＵＡＣＡＣＣＡＣＡＡ
センス鎖：ＧＵＧＵＡＧＵＧＵＡＧＵＵＡＡ
ＨＴＴ１ａ＿４８６：
アンチセンス鎖：ＵＵＡＡＡＡＧＣＡＵＵＡＵＧＵＣＡＵＣＣ
センス鎖：ＡＣＡＵＡＡＵＧＣＵＵＵＵＡＡ
ＨＴＴ＿１０１５０を単独で使用し、一方、ＨＴＴ１ａ＿４８６及びＨＴＴ１ａ＿６３４をカクテルとして使用した。ｐｏｌｙＱ ｔｒａｃｔ ｏｆｆ １１１ Ｑアミノ酸をコードする変異ＨＴＴ遺伝子を含有するＱ１１１マウスモデル（ＣＡＧ１１１マウスモデル）を使用した。マウスに、１０ｎｍｏｌの用量のｓｉＲＮＡを１０μｌ体積で投与し、脳室内（ＩＣＶ）経路を介して投与した。比較のために、治療なしの対照マウスを使用した。１ケ月のインキュベーション期間の後、マウスを屠殺し、ＭＳＨ３、ＷＴ ＨＴＴ、及び変異ＨＴＴ（ｐｏｌｙＱ ｔｒａｃｔを有する）のタンパク質レベルを測定した（図５～図９）。タンパク質レベルは、マウスの線条体、内側皮質、後部皮質、及び視床で測定した。全ての脳構造において、ＭＳＨ３ ｓｉＲＮＡを受けるマウスは、対象と比較して、相当量の低下したレベルのＭＳＨ３を有していた。
ＨＴＴ１ａ ｍＲＮＡ ｆｏｃｉ（ＨＴＴ遺伝子のイントロン１を保持するＨＴＴ ｍＲＮＡ）を顕微鏡によって検出した。図１０に示されるように、ＭＳＨ３ ｓｉＲＮＡとインキュベートした細胞は、ＨＴＴ１ａ ｍＲＮＡ ｆｏｃｉの減少を導いた。
全長ＨＴＴイントロン１配列を以下の表９に記載する。
Figure 2023522701000078
Figure 2023522701000079
Figure 2023522701000080
Figure 2023522701000081
Figure 2023522701000082
実施例４．ＨＴＴ遺伝子のインビボ体腔反復拡張
次に、ＨＴＴ ｐｏｌｙＱ ｔｒａｃｔの体腔反復拡張に対する影響を観察するために、ニ分岐ＭＳＨ３サイレンシングｓｉＲＮＡを試験した。上記のＱ１１１マウスに、１０ｎｍｏｌ用量のｓｉＲＮＡを１０μｌ体積で与え、ＩＣＶを介して投与した。体腔反復拡張に対する効果は、ＨＴＴ ＣＡＧ反復不安定化指数を測定することによって決定した。不安定化指数を測定する手順は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１０．４：２９）に記載されており、参照により組み込まれる。簡潔には、トリヌクレオチドリピートのＰＣＲ増幅が実施され、複数のＰＣＲ産物が生成される。これらのＰＣＲ産物は、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを使用して調べて、単一ＣＡＧリピート単位異なるピークのクラスターを表示する。バックグラウンドを制御し、不安定化指数を生成するために、以下のステップを実施した。１）各分析の最高ピークを同定した。２）２０％（閾値係数）の最高ピークの高さを、最高ピーク閾値に対して設定した。３）バックグラウンド補正のために、閾値より低い高さのピークを排除した。４）正規化されたピーク高を、各ピークのピーク高を、すべての信号ピークの高さの合計で割ることによって計算した。５）各ピークのＣＡＧ長の変化を、テール分析（主要アレル）における最高ピークによって決定されるマウスの構成的ＣＡＧ長から差し引く。６）正規化されたピーク高に腫瘍アレルからの変化を掛ける。７）不安定化指数を得るために、これらの値を加算する。不安定化指数は、所与の組織における細胞に対する、主要アレルからの平均ＣＡＧ長変化を表す。収縮及び拡張の対称的分布が０の不安定化指数において生じる。しかし、Ｑ１１１マウスにおける不安定性は拡張に偏っており、収縮は組織間であまり変化がなかったため、この定量化は効果的にリピート拡張を捕捉する。
図１１に示されるように、ＭＳＨ３ ｓｉＲＮＡは、不安定化指数アッセイにおいて測定されたように、体腔の反復拡張を抑制することができた。
参照による援用
本出願全体において引用され得るすべての引用文献（文献参照、特許、特許出願、及びウェブサイトなど）の内容は、本明細書に記載されている引用文献と同様に、いかなる目的のためにもその全体が、参照により明示的に組み込まれる。本開示は、特に明記されない限り、従来技術として周知の免疫学、分子生物学、及び細胞生物学の手法を使用する。
本開示はまた、分子生物学及び薬物送達の分野において周知である手法全体を参照により組み込む。これらの手法としては、これらに限定されないが、次の刊行物に記載されている手法が挙げられる：
Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，２７０：２６－３５；
Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；
Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（４ｔｈ Ｅｄ．１９９９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ．（ＩＳＢＮ０－４７１－３２９３８－Ｘ）；
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；
Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ ｅａ．，ｐｐ．２０ １－１６，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９９）；
Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）；
Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１；
Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；
Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）及び（１９９１）；
Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２；
Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．７９０ ｐｐ．（ＩＳＢＮ３－５４０－４１３５４－５）．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；
Ｌｕ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ ｅｄｓ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｐｒｅｓｓ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ．２９８ ｐｐ．（ＩＳＢＮ １－８８１２９９－２１－Ｘ）．
Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；
Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．＆Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（３ｄ Ｅｄ．１９８５）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｖ．２：４０９ ｐｐ．（ＩＳＢＮ ０－６３２－０１３１８－４）．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．Ｖｏｌｓ．１－３．（ＩＳＢＮ０－８７９６９－３０９－６）．
Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８
Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ Ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ Ｈｏｒｓｔ Ｉｂｅｌｇａｕｆｔｓ）．６３４ｐｐ．（ＩＳＢＮ０－８９５７３－６１４－４）．
均等物
本開示は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本開示を限定するものではなく、あらゆる点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本開示の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内に入るすべての変更は、本明細書に含まれることが意図される。

Claims (197)

  1. センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、
    前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む、前記分子。
  2. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つに記載のＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. 配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つの前記ＭＳＨ３核酸配列の少なくとも１０、１１、１２、または１３の連続ヌクレオチドに対する相補性を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. 配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つの前記ＭＳＨ３核酸配列との３つ以下のミスマッチを含む、請求項１または３に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. 配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つの前記ＭＳＨ３核酸配列に対する完全な相補性を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. 前記アンチセンス鎖が、約１５ヌクレオチド～２５ヌクレオチド長を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. 前記センス鎖が、約１５ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. 前記アンチセンス鎖が、２０ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. 前記アンチセンス鎖が、２１ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  10. 前記アンチセンス鎖が、２２ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. 前記センス鎖が、１５ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. 前記センス鎖が、１６ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 前記センス鎖が、１８ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. 前記センス鎖が、２０ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. １５塩基対～２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. １５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. １６塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. １８塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. ２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. 前記ｄｓＲＮＡが、平滑末端を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  21. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  22. 前記ｄｓＲＮＡが、約２ヌクレオチド～５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
  23. 前記ｄｓＲＮＡが、２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
  24. 前記ｄｓＲＮＡが、５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
  25. 前記ｄｓＲＮＡが、天然に存在するヌクレオチドを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  26. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  27. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、またはそれらの混合物を含む、請求項２６に記載のｄｓＲＮＡ。
  28. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  29. 前記修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ。
  30. ４～１６のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  31. ８～１３のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  32. 前記ｄｓＲＮＡが、式Ｉの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ：
    Figure 2023522701000083
     （式中、
    Ｂは、塩基対部分であり；
    Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され；
    Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、
    Ｙは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
    Ｚは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
    Ｒは、保護基であり、
    Figure 2023522701000084
     は、任意の二重結合である）。
  33. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  34. 前記ｄｓＲＮＡが、完全化学修飾されている、請求項１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  35. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  36. 前記アンチセンス鎖が、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  37. 前記アンチセンス鎖が、７０％～９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ。
  38. 前記センス鎖が、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  39. 前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項３８に記載のｄｓＲＮＡ。
  40. 前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と前記センス鎖との間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  41. 前記１つ以上のヌクレオチドミスマッチが、センス鎖の５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ。
  42. 前記のヌクレオチドミスマッチが、前記センス鎖の５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ。
  43. 前記アンチセンス鎖が、５’リン酸、５’－アルキルホスホネート、５’アルキレンホスホネート、または５’アルケニルホスホネートを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  44. 前記アンチセンス鎖が、５’ビニルホスホネートを含む、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ。
  45. アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；
    （７）前記センス鎖の５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、前記ｄｓＲＮＡ。
  46. アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、前記ｄｓＲＮＡ。
  47. アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも８５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、前記ｄｓＲＮＡ。
  48. アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から４位、５位、６位、及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、前記ｄｓＲＮＡ。
  49. アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位、４位、５位、６位、及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、前記ｄｓＲＮＡ。
  50. アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位、６位、１４位、及び１６位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記３’末端から７位、９位、１０位、及び１１位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （８）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、前記ｄｓＲＮＡ。
  51. アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記３’末端から７位、１０位、及び１１位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （８）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、前記ｄｓＲＮＡ。
  52. 機能部分が、前記アンチセンス鎖の前記５’末端及び／または３’末端に連結されている、請求項１～５１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  53. 機能部分が、前記センス鎖の前記５’末端及び／または３’末端に連結されている、請求項１～５１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  54. 機能部分が、前記センス鎖の前記３’末端に連結されている、請求項１～５１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  55. 前記機能部分が、疎水性部分を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  56. 前記疎水性部分が、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド、ヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ビタミン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５５に記載のｄｓＲＮＡ。
  57. 前記ステロイドが、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択される、請求項５６に記載のｄｓＲＮＡ。
  58. 前記脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される、請求項５６に記載のｄｓＲＮＡ。
  59. 前記ビタミンが、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、及び誘導体、またはそれらの代謝物からなる群から選択される、請求項５６に記載のｄｓＲＮＡ。
  60. 前記ビタミンが、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される、請求項５９に記載のｄｓＲＮＡ。
  61. 前記機能部分が、リンカーにより前記アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に連結されている、請求項５４～６０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  62. 前記リンカーが、二価または三価のリンカーを含む、請求項６１に記載のｄｓＲＮＡ。
  63. 前記二価または三価のリンカーが、
    Figure 2023522701000085
     （式中、ｎは、１、２、３、４、または５である）から選択される、請求項６２に記載のｄｓＲＮＡ。
  64. 前記リンカーが、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、アミド、カルバメート、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６１または６２に記載のｄｓＲＮＡ。
  65. 前記リンカーが、三価リンカーである場合、前記リンカーは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体をさらに連結する、請求項６２または６３に記載のｄｓＲＮＡ。
  66. 前記ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体が、以下からなる群から選択される、請求項６５に記載のｄｓＲＮＡ：
    Figure 2023522701000086
     （式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＢＨ３である）。
  67. センス鎖の前記３’末端から１位及び２位の前記ヌクレオチド、及びアンチセンス鎖の前記５’末端から１位及び２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される、請求項１～６６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  68. 請求項１～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  69. 前記ｄｓＲＮＡが、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも５０％阻害する、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. 前記ｄｓＲＮＡが、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも８０％阻害する、請求項６８に記載の医薬組成物。
  71. 細胞におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を調節するための方法であって、
    （ａ）請求項１～６７のいずれか一項に記載の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を前記細胞に導入するステップと；
    （ｂ）ステップ（ａ）で産生された前記細胞を、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記ｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって前記細胞中の前記ＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む、前記方法。
  72. 神経変性疾患を治療または管理する方法であって、こうした治療を必要とする患者に、治療有効量の請求項１～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、前記方法。
  73. 前記ｄｓＲＮＡが、前記患者の脳に投与される、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ｄｓＲＮＡが、脳・脳室内（ＩＣＶ）注射、線条体内（ＩＳ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下（ＳＱ）注射、またはそれらの組み合わせによって投与される、請求項７２に記載の方法。
  75. 前記ｄｓＲＮＡを投与することは、海馬、線条体、皮質、小脳、視床、視床下部、及び脊髄のうちの１つ以上において、ＭＳＨ３遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす、請求項７２に記載の方法。
  76. 前記ｄｓＲＮＡが、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも５０％阻害する、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ｄｓＲＮＡが、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも８０％阻害する、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  78. 配列番号１～６及び１９～３０のＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的なｄｓＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むベクター。
  79. 前記ＲＮＡ分子が、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも３０％阻害する、請求項７８に記載のベクター。
  80. 前記ＲＮＡ分子が、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも５０％阻害する、請求項７８に記載のベクター。
  81. 前記ＲＮＡ分子が、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも８０％阻害する、請求項７８に記載のベクター。
  82. 前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む、請求項７８に記載のベクター。
  83. 請求項７８～８２のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
  84. 請求項７８～８２のいずれか一項に記載のベクター及びＡＡＶキャプシドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  85. 互いに共有結合により結合されている請求項１～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子の２つ以上を含む、分岐ＲＮＡ化合物。
  86. 前記ｄｓＲＮＡ分子が、リンカー、スペーサー、または分岐点によって互いに共有結合により結合している、請求項８５に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  87. １５～３５ヌクレオチド長を含む２つ以上のＲＮＡ分子、及び
    ＭＳＨ３ ｍＲＮＡに実質的に相補的な配列を含み、
    前記２つのＲＮＡ分子が、リンカー、スペーサー及び分岐点から独立して選択される１つ以上の部分によって互いに結合される、分岐ＲＮＡ化合物。
  88. 配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む、請求項８７に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  89. 配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の１つ以上に実質的に相補的な核酸配列を含む、請求項８７に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  90. 前記ＲＮＡ分子が、ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの一方または両方を含む、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  91. 前記ＲＮＡ分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  92. 各ＲＮＡ分子が、１５～２５ヌクレオチド長を含む、請求項８７～９１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  93. 各ＲＮＡ分子が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡを含み、各アンチセンス鎖が、独立して、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  94. 配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の少なくとも１０、１１、１２、または１３の連続ヌクレオチドに対する相補性を含む、請求項９３に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  95. 各ＲＮＡ分子が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列との３つ以下のミスマッチを含む、請求項９３に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  96. 配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に対して完全な相補性を含む、請求項９３に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  97. 前記アンチセンス鎖が、配列番号７～１２のいずれか１つの前記核酸配列を有する部分を含む、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  98. 前記アンチセンス鎖及び／または前記センス鎖が、約１５ヌクレオチド～２５ヌクレオチド長を含む、請求項９３～９７のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  99. 前記アンチセンス鎖が、２０ヌクレオチド長である、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  100. 前記アンチセンス鎖が、２１ヌクレオチド長である、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  101. 前記アンチセンス鎖が、２２ヌクレオチド長である、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  102. 前記センス鎖が、１５ヌクレオチド長である、請求項９３～１０１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  103. 前記センス鎖が、１６ヌクレオチド長である、請求項９３～１０１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  104. 前記センス鎖が、１８ヌクレオチド長である、請求項９３～１０１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  105. 前記センス鎖が、２０ヌクレオチド長である、請求項９３～１０１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  106. 前記ｄｓＲＮＡが、１５塩基対～２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項９０～１０５のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  107. 前記ｄｓＲＮＡが、１５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項９０～１０６のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  108. 前記ｄｓＲＮＡが、１６塩基対の二本鎖領域を含む、請求項９０～１０６のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  109. 前記ｄｓＲＮＡが、１８塩基対の二本鎖領域を含む、請求項９０～１０６のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  110. 前記ｄｓＲＮＡが、２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項９０～１０６のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  111. 前記ｄｓＲＮＡが、平滑末端を含む、請求項９０～１１０のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  112. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項９０～１１０のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  113. 前記ｄｓＲＮＡが、２ヌクレオチド～５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項９０～１１２のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  114. 前記ｄｓＲＮＡが、天然に存在するヌクレオチドを含む、請求項９０～１１３のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  115. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項９０～１１４のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  116. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、またはヌクレオチドを含む非天然塩基を含む、請求項１１５に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  117. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項９０～１１６のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  118. 前記修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１１７に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  119. ４～１６のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項９０～１１８のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  120. ８～１３のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項９０～１１８のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  121. 前記ｄｓＲＮＡが、式（Ｉ）の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項９０～１１７のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物：
    Figure 2023522701000087
     （式中、
    Ｂは、塩基対部分であり；
    Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され；
    Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、
    Ｙは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
    Ｚは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
    Ｒは、保護基であり、
    Figure 2023522701000088
     は、任意の二重結合である）。
  122. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項９０～１２１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  123. 前記ｄｓＲＮＡが、完全に化学修飾されている、請求項９０～１２１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  124. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項９０～１２１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  125. 前記アンチセンス鎖が、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項９０～１２４のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  126. 前記アンチセンス鎖が、７０％～９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１２５に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  127. 前記センス鎖が、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項９０～１２４のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  128. 前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１２７に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  129. 前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と前記センス鎖との間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む、請求項９３～１２８のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  130. 前記１つ以上のヌクレオチドミスマッチが、センス鎖の前記５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する、請求項１２９に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  131. 前記ヌクレオチドミスマッチが、前記センス鎖の５’末端から２位、６位、及び１２位に存在する、請求項１２９に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  132. 前記アンチセンス鎖が、５’リン酸、５’－アルキルホスホネート、５’アルキレンホスホネート、５’アルケニルホスホネート、またはそれらの混合物を含む、請求項９３～１３１のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  133. 前記アンチセンス鎖が、５’ビニルホスホネートを含む、請求項１３２に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  134. 前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有し、ここで：
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む；
    （７）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項９０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  135. 前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有し、ここで：
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項９０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  136. 前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有し、ここで：
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも８５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項９０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  137. 前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有し、ここで：
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から４位、５位、６位、及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項９０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  138. 前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有し、ここで：
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位、４位、５位、６位、及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項９０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  139. 前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有し、ここで：
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位、６位、１４位、及び１６位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記３’末端から７位、９位、１０位、及び１１位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （８）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項９０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  140. 前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各鎖が５’末端及び３’末端を有し、ここで：
    （１）前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含む；
    （２）前記アンチセンス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （３）前記アンチセンス鎖の前記５’末端から２位及び１４位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （４）前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～２位から１～７位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している；
    （５）前記アンチセンス鎖の一部が、前記センス鎖の一部に相補的である；
    （６）前記センス鎖が、少なくとも７５％の２’－Ｏ－メチル修飾を含む；
    （７）前記センス鎖の前記３’末端から７位、１０位、及び１１位の前記ヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
    （８）前記センス鎖の前記５’末端から１～２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項９０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  141. 機能部分が、前記アンチセンス鎖の前記５’末端及び／または３’末端に連結されている、請求項９３～１４０のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  142. 機能部分が、前記センス鎖の前記５’末端及び／または３’末端に連結されている、請求項９３～１４０のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  143. 機能部分が、前記センス鎖の前記３’末端に連結されている、請求項９３～１４０のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  144. 前記機能部分が、疎水性部分を含む、請求項１４１～１４３のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  145. 前記疎水性部分が、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド、ヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ビタミン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４４に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  146. 前記ステロイドが、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択される、請求項１４５に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  147. 前記脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される、請求項１４５に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  148. 前記ビタミンが、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、それらの誘導体、及びそれらの代謝物からなる群から選択される、請求項１４５に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  149. 前記ビタミンが、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される、請求項１４５に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  150. 前記機能部分が、リンカーにより前記アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に連結されている、請求項１４１～１４９のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  151. 前記リンカーが、二価または三価のリンカーを含む、請求項１５０に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  152. 前記二価または三価のリンカーが、
    Figure 2023522701000089
     （式中、ｎは、１、２、３、４、または５である）からなる群から選択される、請求項１５１に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  153. 前記リンカーが、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、アミド、カルバメート、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５０または１５２に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  154. 前記リンカーが、三価リンカーである場合、前記リンカーは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体をさらに連結する、請求項１５１に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  155. 前記ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体が、以下からなる群から選択される、請求項１５１に記載の分岐ＲＮＡ化合物：





























    Figure 2023522701000090
     （式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＢＨ３である）。
  156. センス鎖の前記３’末端から１位及び２位の前記ヌクレオチド、及びアンチセンス鎖の前記５’末端から１位及び２位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される、請求項９３～１５５のいずれか一項に記載の分岐ＲＮＡ化合物。
  157. 式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2023522701000091
     （式中：
    Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み；並びに式（Ｉ）は任意選択で、１つまたは複数の分岐点Ｂ、及び１つまたは複数のスペーサーＳを含み、
    Ｂは出現ごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり、
    Ｓは、各出現ごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み、
    Ｎは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む長さ１５～３５塩基を含む二本鎖核酸であり；ここで
    前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的な配列を含み；
    前記センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、１つ以上の化学修飾を含み；
    ｎは、２、３、４、５、６、７、または８である）。
  158. 式（Ｉ－１）～（Ｉ－９）から選択される構造を有する、請求項１５７に記載の化合物：
    Figure 2023522701000092
  159. 前記アンチセンス鎖が、以下からなる群から選択される５’末端基Ｒを含む、請求項１５７記載の化合物：
    Figure 2023522701000093
  160. 式（ＩＩ）の構造を有する、請求項１５７に記載の化合物：
    Figure 2023522701000094
     （式中、
    Ｘは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
    Ｙは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
    －は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を表し；
    ＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し；
    －－－は、出現ごとに独立して、塩基対相互作用またはミスマッチを表す）。
  161. 式（ＩＶ）の構造を有する、請求項１５７に記載の化合物：
    Figure 2023522701000095
     （式中、
    Ｘは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
    Ｙは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、及びそれらの化学修飾誘導体から選択され、
    －は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を表し；
    ＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し；
    －－－は、出現ごとに独立して、塩基対相互作用またはミスマッチを表す）。
  162. Ｌが構造Ｌ１である、請求項１５７～１６１のいずれか一項に記載の化合物：
    Figure 2023522701000096
  163. ＲがＲ３であり、ｎが２である、請求項１６２に記載の化合物。
  164. Ｌが構造Ｌ２である、請求項１５７～１６１のいずれか一項に記載の化合物：
    Figure 2023522701000097
  165. ＲがＲ３であり、ｎが２である、請求項１６４に記載の化合物。
  166. 式（ＶＩ）の構造を有する治療用核酸のための送達系：
    Figure 2023522701000098
     （式中、
    Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み、式（ＶＩ）は、１つ以上の分岐点Ｂ、及び１つ以上のスペーサーＳをさらに含み、式中、
    Ｂは、出現ごとに独立して、多価有機種またはその誘導体を含み；
    Ｓは、出現ごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、またはそれらの組み合わせを含み；
    各ｃＮＡは、独立して、１つ以上の化学修飾を含むキャリア核酸であり、
    各ｃＮＡは、独立して、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み；
    ｎは、２、３、４、５、６、７、または８である）。
  167. 式（ＶＩ－１）～（ＶＩ－９）から選択される構造を有する、請求項１６６に記載の送達系：
    Figure 2023522701000099
  168. 各ｃＮＡが、独立して、化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１６６に記載の送達系。
  169. ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含み、各ＮＡは、少なくとも１つのｃＮＡにハイブリダイズする、請求項１６６に記載の送達系。
  170. 各ＮＡが独立して、少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含む、請求項１６９に記載の送達系。
  171. 各ＮＡが、独立して、少なくとも１６～２０の連続ヌクレオチドを含む、請求項１７０に記載の送達系。
  172. 各ＮＡが、少なくとも２ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む、請求項１６９に記載の送達系。
  173. 前記オーバーハングの前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結を介して結合されている、請求項１７２に記載の送達系。
  174. 各ＮＡが、独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマー、及びガイドＲＮＡからなる群から選択される、請求項１６９に記載の送達系。
  175. 各ＮＡが、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列に実質的に相補的である、請求項１６９に記載の送達系。
  176. 請求項８５～１６５のいずれか一項に記載の化合物または請求項１６６～１７５のいずれかに記載の系、及び薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  177. 前記化合物または前記系が、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも５０％阻害する、請求項１７６に記載の医薬組成物。
  178. 前記化合物または前記系が、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも８０％阻害する、請求項１７６に記載の医薬組成物。
  179. 細胞におけるＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害するための方法であって、
    （ａ）請求項８５～１６５のいずれか一項に記載の化合物または請求項１６６～１７５のいずれか一項に記載の系を前記細胞に導入するステップと；
    （ｂ）ステップ（ａ）で産生された前記細胞を、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記ｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって前記細胞中の前記ＭＳＨ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む、前記方法。
  180. 神経変性疾患を治療または管理する方法であって、こうした治療または管理を必要とする患者に、治療有効量の請求項８５～１６５のいずれか一項に記載の化合物または請求項１６６～１７５のいずれか一項に記載の系を投与することを含む、前記方法。
  181. 前記ｄｓＲＮＡが、前記患者の脳に投与される、請求項１８０に記載の方法。
  182. 前記ｄｓＲＮＡが、脳・脳室内（ＩＣＶ）注射、線条体内（ＩＳ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下（ＳＱ）注射、またはそれらの組み合わせによって投与される、請求項１８０に記載の方法。
  183. 前記ｄｓＲＮＡを投与することは、海馬、線条体、皮質、小脳、視床、視床下部、及び脊髄のうちの１つ以上において、前記ＭＳＨ３遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす、請求項１８０に記載の方法。
  184. 前記ｄｓＲＮＡが、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも５０％阻害する、請求項１７９～１８３のいずれか一項に記載の方法。
  185. 前記ｄｓＲＮＡが、前記ＭＳＨ３遺伝子の前記発現を少なくとも８０％阻害する、請求項１７９～１８３のいずれか一項に記載の方法。
  186. 細胞におけるＨＴＴ ｍＲＮＡを低減するための方法であって、
    （ａ）ＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを前記細胞に導入することと、
    （ｂ）前記ＨＴＴ ｍＲＮＡの分解を得るのに十分な時間、ステップ（ａ）で産生された前記細胞を維持し、それによって前記細胞中のＨＴＴ ｍＲＮＡを低減することと、
    を含む、前記方法。
  187. 前記オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、
    前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む、請求項１８６に記載の方法。
  188. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む、請求項１８７に記載の方法。
  189. 細胞におけるＨＴＴ ｍＲＮＡを低減するための方法であって、
    （ａ）請求項１～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ、請求項７８～８２のいずれか一項に記載のベクター、請求項８５～１６５のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１６６～１７５のいずれか一項に記載のシステムを前記細胞に導入することと、
    （ｂ）前記ＨＴＴ ｍＲＮＡの分解を得るのに十分な時間、ステップ（ａ）で産生された前記細胞を維持し、それによって前記細胞中のＨＴＴ ｍＲＮＡを低減することと、
    を含む、前記方法。
  190. 前記ＨＴＴ ｍＲＮＡが、ＨＴＴ１ａ ｍＲＮＡを含む、請求項１８６～１８９のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記ＨＴＴ１ａ ｍＲＮＡが、配列番号４３に記載の核酸配列を含む、請求項１９０に記載の方法。
  192. ハンチントン病（ＨＤ）を治療または管理する方法であって、ＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む治療有効量のオリゴヌクレオチドを、そのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  193. トリヌクレオチドリピート疾患または障害を治療または管理する方法であって、ＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む治療有効量のオリゴヌクレオチドを、そのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  194. 前記オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、
    前記アンチセンス鎖が、配列番号１～６及び１９～３０のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む、
    請求項１９２または１９３に記載の方法。
  195. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１３～１８及び３１～４２のいずれか１つのＭＳＨ３核酸配列と実質的に相補的な配列を含む、
    請求項１９４に記載の方法。
  196. ハンチントン病（ＨＤ）を治療または管理する方法であって、
    請求項１～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ、請求項７８～８２のいずれか一項に記載のベクター、請求項８５～１６５のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１６６～１７５のいずれか一項に記載のシステムの治療有効量をそのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  197. トリヌクレオチドリピート疾患または障害を治療または管理する方法であって、
    請求項１～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ、請求項７８～８２のいずれか一項に記載のベクター、請求項８５～１６５のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１６６～１７５のいずれか一項に記載のシステムの治療有効量をそのような治療または管理を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
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