TW202304472A - 經聚醣修飾之核酸、製備方法及治療用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於醣核酸，諸如本文所描述之醣RNA及醣DNA。所提供者為醣基化核糖核酸(醣RNA)相關方法及組合物。

Description

經聚醣修飾之核酸、製備方法及治療用途
本發明係關於醣核酸，諸如本文所描述之醣RNA及醣DNA。所提供者為醣基化核糖核酸(醣RNA)相關方法及組合物。
聚醣為單醣(單一糖分子)聚合物，其已顯示可調節各種關鍵之生物過程，範圍為細胞-細胞接觸至宿主-病原體相互作用，且甚至調節多細胞生物體之組織化(參見例如Varki及Gagneux, 2015)。聚醣在細胞表面事件之情形下尤其調節基本細胞功能且存在於所有活物之細胞中(參見例如Varki及Gagneux, 2015)。聚醣調節無數的基本細胞功能，尤其在細胞表面事件之情形下。舉例而言，複合聚醣促進蛋白質及脂質之摺疊及有目的的遷移以用於分泌或膜呈現。因此，許多基本過程，諸如胚胎發生、宿主-病原體識別及腫瘤-免疫相互作用依賴於醣基化。迄今為止，聚醣存在於所研究之整個生命範圍內的每個細胞中，且在哺乳動物中，聚醣由大致10個單體碳水化合物單元構成。聚醣可包含連接至聚醣之核心或聚醣之臂上之GlcNAc殘基的岩藻糖。唾液酸殘基可以存在於聚醣之末端。另外，一些聚醣為二等分型N-聚醣。
RNA代表所有活物均需要之另一種生物聚合物。RNA典型地由四個鹼基構成，但轉錄後修飾(PTM)可顯著地擴大RNA之化學多樣性。迄今為止，已識別出超過100種PTM (參見例如Frye等人, 2018；Machnicka等人, 2013；Nachtergaele, 2016)。非典型或非天然核苷酸之使用進一步增加RNA之化學多樣性。除了作為信使之外，RNA可作為骨架、分子誘餌、酶及橫跨細胞核及胞溶質之網路調節因子發揮作用(參見例如Cech及Steitz, 2014；Sharp, 2009；Wang及Chang, 2011)。
DNA為所有已知生命形式之另一種核心生物聚合物。DNA為生物體提供其進行發育、生存及繁殖之功能需要的指令。
RNA及DNA均為核酸，儘管其具有若干差異。其典型限定的鹼基係不同的。其亦含有不同的糖。DNA傳統地受限於細胞核中，但RNA能夠離開細胞核。
仍需要用於將核酸遞送至個體身體內之特定細胞的治療方法及組合物。
本發明係關於天冬醯胺連接(N連接)之聚醣與例如經由雙正交點擊化學連接之核酸(DNA、RNA)之間的新穎結合物。開發此類新穎結合物至關重要，其可調節結合物之生理特性，例如調節核酸在生物系統(例如血清)中之穩定性及/或調節核酸遞送(例如靶向遞送至特定膜、細胞器)。在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含有包含聚醣部分之經修飾之RNA。在一些實施例中，醫藥組合物包含經修飾之RNA，其包含有包含至少6個單醣的聚醣部分。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可包含：醣核酸，該醣核酸包含核酸及至少一個結合至該核酸之包含至少6個單醣的聚醣部分；及醫藥學上可接受之載劑。聚醣部分可包含至少8個單醣。聚醣部分可包含至少10個單醣。聚醣部分可包含N-連接之聚醣或O-連接之聚醣。
聚醣部分可包含雙觸角聚醣。雙觸角聚醣可包含第一末端殘基及第二末端殘基。聚醣部分可包含三觸角聚醣。三觸角聚醣可包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基。
在一些實施例中，聚醣部分包含唾液酸、岩藻糖或其組合。在一些實施例中，聚醣部分包含GlcNAc、甘露糖、半乳糖、唾液酸、岩藻糖或其組合。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含唾液酸。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含岩藻糖。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含GlcNAc。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含甘露糖。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含NeuNAc。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含半乳糖。
醫藥組合物之核酸可為RNA。醫藥組合物之核酸可為siRNA。醫藥組合物之核酸可為mRNA。醫藥組合物之核酸可為環狀RNA。醫藥組合物之核酸可為嚮導RNA。醫藥組合物之核酸可為適體RNA。醫藥組合物之核酸可為DNA。
至少一個聚醣部分可包含表2A或2B之化合物。經修飾之核酸可包含表1之核酸。至少一個聚醣部分可經由點擊化學反應與經修飾之核酸結合。核酸可經由共價結合至核酸末端之連接子基團與聚醣結合。核酸可經由共價結合至核酸中間之經化學修飾之核苷酸的連接子與聚醣結合。核酸可經由共價結合至經化學修飾之核苷酸的連接子與聚醣結合，該經化學修飾之核苷酸不位於該核酸之3'末端或5'末端。核酸可經由插入核酸之兩個核苷酸之間的化學手柄與聚醣結合。在實施例中，兩個核苷酸不包括核酸之3'末端或5'末端處之核苷酸。
在另一態樣中，本文提供式(I)化合物： A-L-B     (I)， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。
本文亦提供製備式(I)化合物之方法，該方法包含使包含第一點擊化學手柄之核酸A與化合物B反應，該化合物B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；其中第一步驟之反應在雙正交點擊化學條件下進行。
醣核酸化合物可具有式(I)： A-L-B(I)，或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。A可為包含第一點擊化學手柄之RNA。A可為包含第一點擊化學手柄之siRNA。A可為包含第一點擊化學手柄之mRNA。A可為包含第一點擊化學手柄之環狀RNA。A可為包含第一點擊化學手柄之DNA。
A可包含選自表4中在「試劑A」下所列出之彼等的第一點擊化學手柄，且B可包含選自表4中在「試劑B」下所列出之彼等的第二點擊化學手柄。A可包含選自表4中在「試劑B」下所列出之彼等的第一點擊化學手柄，且B可包含選自表4中在「試劑A」下所列出之彼等的第二點擊化學手柄。B可為包含雙觸角聚醣之天冬醯胺連接之聚醣，其中該雙觸角聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基。B可為包含三觸角聚醣之天冬醯胺連接之聚醣，其中該三觸角聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基。
第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含唾液酸。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含岩藻糖。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含GlcNAc。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含甘露糖。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含NeuNAc。第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基(若存在)中之至少一者可包含半乳糖。
本發明亦係關於治療疾病或病況之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所揭示之醫藥組合物或本文所揭示之醣核酸。該疾病或病況可選自發炎病症、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、凝血疾病、抗凝血疾病、過敏、病毒性疾病及微生物感染。在實施例中，疾病或病況為發炎。在實施例中，疾病或病況為癌症。在實施例中，疾病或病況為自體免疫疾病。在實施例中，疾病或病況為IgE介導之過敏。在實施例中，疾病或病況為全身性紅斑狼瘡。在實施例中，疾病或病況為微生物感染。在實施例中，疾病或病況為病毒性感染。在實施例中，疾病或病況為代謝疾病。
在另一態樣中，提供醣基化核糖核酸(醣RNA)相關方法及組合物。在某些態樣中，提供用於減少表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞與呈現細胞表面醣基化核糖核酸(醣RNA)之細胞之間的相互作用的方法。在一些實施例中，此類方法包含使表現GBP之細胞及/或呈現細胞表面醣RNA之細胞與結合GBP及/或細胞表面醣RNA之試劑接觸，使得表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用減少。此類方法可活體外、活體內或離體進行。亦提供可用於例如實踐本發明之方法之結合物、融合蛋白及組合物。亦提供使試劑靶向表現GBP之細胞之方法及評估用於醣RNA之生物樣品的方法。
本發明進一步係關於用於減少表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞與呈現細胞表面醣基化核糖核酸(醣RNA)之細胞之間的相互作用的方法，其包含：使表現GBP之細胞與結合至表現GBP之細胞的表面上表現的GBP的可溶性醣RNA以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。
可溶性醣RNA可包含來自Y RNA家族之RNA。可溶性醣RNA可包含Y5 RNA。可溶性醣RNA可包含snoRNAs、tRNA、snRNAs、rRNA或其任何組合。可溶性醣RNA可包含可溶性唾液酸化RNA。可溶性唾液酸化RNA可包含Neu5Ac、Neu5Gc或其組合。使可溶性醣RNA與一或多種試劑結合。一或多種試劑可包含治療劑。一或多種試劑包含可偵測標記。GBP包含唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)。Siglec可包含Siglec-11。Siglec可包含Siglec-14。GBP可包含C型凝集素。GBP可包含半乳糖凝集素。GBP可包含選擇素。
相關申請案
本申請案主張2021年4月23日申請之美國臨時申請案第63/179,065號、2021年5月14日申請之美國臨時申請案第63/188,930號及2021年5月17日申請之美國臨時申請案第63/189,492號的權益，該等美國臨時申請案中之每一者以引用的方式併入本文中。 序列表之引用
本申請案含有呈電腦可讀形式之序列表。該電腦可讀形式以引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2022年4月22日，命名為772233_202320_SL.txt且大小為16,179位元組。 政府支持
本發明係在政府支持下在由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予的授權號R24 GM137763下進行。在本發明中政府具有某些權利。 具體實施方式
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含有包含聚醣部分之經修飾之核酸。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。聚醣修飾脂質及蛋白質以在所有生命域中介導分子間及分子內相互作用。RNA不被認為係天然存在之醣基化的主要標靶。本文中出人意料地展現哺乳動物使用RNA作為醣基化之第三骨架。使用一連串化學及生化方法，發現保守性小非編碼RNA攜帶唾液酸化聚醣。此等「醣RNA」存在於多種細胞類型及哺乳動物物種中，存在於經培養細胞中且在活體內。聚醣RNA組裝視典型N-聚醣生物合成機制而定且產生富集唾液酸及岩藻糖之結構。對活細胞之分析揭露大部分醣RNA存在於細胞表面上且可與抗dsRNA抗體及Siglec受體家族之成員相互作用。總體而言，此等發現指出RNA在細胞外生物學中之擴展作用。
使用合成化學或酶過程，聚醣可連接至RNA或DNA以形成醣核酸，諸如醣RNA或醣DNA。特定言之，連接至RNA或DNA的聚醣含有至少1個單醣。在其他實施例中，連接至RNA或DNA的聚醣含有至少10個單醣。較佳地，連接至RNA或DNA的聚醣含有至少6個單醣。較佳地，連接至RNA或DNA的聚醣含有至少10個單醣。藉由使聚醣連接至RNA或DNA，可產生更穩定的生理材料。聚醣可促進RNA靶向細胞群體，且細胞可在有或無內化之情況下靶向。內源性哺乳動物醣RNA聚醣似乎在結構上獨特於蛋白質上發現之彼等者(Flynn等人, 2019)。可存在不同聚醣組合物，包括岩藻糖基化、唾液酸化及去唾液酸化聚醣。大部分天然細胞醣RNA存在於細胞表面上且RNA物種為小的、高度保守的RNA。
核酸之醣結合物，諸如直鏈或環狀DNA及RNA提供若干優點。特定言之，可投與醣結合物以靶向遞送至所要器官或細胞類型而不需要使用額外遞送媒劑，諸如脂質奈米粒子(LNP)。某些器官及細胞類型之選擇性可藉由選擇適當聚醣陣列用於與核酸結合來提供。醣結合之核酸，特別係RNA，亦比未糖化之核酸更穩定。
在核酸(諸如RNA)之醣結合物之情況下，可進行細胞靶向，且潛在地進行胞內體逃脫。已知靶向部分，諸如三重N-乙醯基半乳糖胺(GalNac)，三個化學連接之單醣，可有助於使RNA靶向細胞群體諸如肝臟，且最終允許內化。聚醣亦可靶向細胞而無需內化。包括醣RNA之醣結合物可直接定位至細胞表面。一旦醣RNA到達細胞，醣結合物可隨後結合至細胞表面上之醣-受體且活化細胞信號轉導。舉例而言，醣RNA結合Siglec細胞表面受體可引起Siglec蛋白之基於免疫受體酪胺酸之抑制(ITIM)域的活化，從而引起細胞抑制。醣RNA亦可遞送至細胞中。環狀RNA (circRNA)或mRNA上之聚醣可產生更穩定的生理材料，尤其其可適用於穩定性或填充至脂質奈米粒子(LNP)中。
聚醣可與生物分子(包括RNA，諸如直鏈mRNA、環狀mRNA、siRNA、miRNA及其類似者)或DNA (包括直鏈DNA或環狀DNA)結合。另外，聚醣組合物可經由使用醣基轉移酶經不同單醣以酶方式修飾(參見例如Van Delft等人, 2015)。此外，用於產生聚醣受體之可程式化結合界面的聚醣取向可以使用RNA定義，該RNA形成特定結構且在特定位置包括經修飾之核苷酸。
在產生醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)之後，其可藉由任何所需方法調配用於向身體投與，諸如非經腸投與，諸如靜脈內注射(IV)、肌肉內注射、鞘內注射、腹膜內注射、皮下注射或注射至所需器官或組織中(例如玻璃體內注射)、局部施用或經鼻或經口吸入，例如氣霧化後。醣RNA可封裝於LNP中，或其可為裸的。小RNA治療劑可在使用裸RNA時更好地起作用，因為長RNA可被單切割破壞。對於大的裸RNA，局部施用可最佳用於全身遞送。 定義
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。一般而言，與本文所描述之生物化學、酶學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交結合使用之命名法為此項技術中眾所周知及常用的命名法。
除非另外指明，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般及更特定文獻中所描述來進行。參見例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, 且於2002增刊)；Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)；Taylor及Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003)； Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.； Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, 第I卷, CRC Press (1976)；Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, 第II卷, CRC Press (1976)； Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)。
在提供值範圍時，應理解該等方法及組合物涵蓋彼範圍之上限與下限之間的各中間值(除非上下文另外明確指出，否則至下限單位之十分之一)及彼所陳述範圍內之任何其他所陳述或中間值。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內且亦涵蓋於該等方法及組合物內，受規定範圍內之任何具體排除的限制。在所陳述範圍包括限制中之一個或兩個之情況下，該等方法及組合物亦包括不包括彼等所包括限制中之一個或兩個之範圍。
本文在數值前存在術語「約」之情況下呈現某些範圍。術語「約」在本文中用以提供其後之準確數值以及接近或近似該術語之後之數值的數值的文字支持。在確定數值是否接近或近似特定敍述之數值時，接近或近似未敍述之數值可為在呈現其之上下文中提供特定敍述之數值的實質性等效物的數值。
應注意，除非上下文另外清晰地指示，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該/該等」包括複數個(種)提及物。進一步應注意，申請專利範圍可經起草以排除任何視情況存在之要素。因此，此陳述意欲與對所主張要素之敍述結合充當使用諸如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似術語之此類排他性術語或使用「否定性」限制之前提基礎。
本文提及之所有公開案、專利及其他參考案均以全文引用之方式併入本文中。
除非另外指明，否則以下術語應理解為具有以下含義：
在本說明書及申請專利範圍通篇中，字組「包含(comprise/comprises/comprising)」或其變化形式應理解為意謂包括所陳述之整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。
如本文所用，術語「經醣基化核酸」及「醣核酸」應理解為係指包含如本文所描述及揭示之聚醣部分的經修飾之核酸。如本文所用，術語「經醣基化核糖核酸」及「醣RNA」應理解為係指包含如本文所描述及揭示之聚醣部分的經修飾之核糖核酸。如本文所用，術語「經醣基化去氧核糖核酸」及「醣DNA」應理解為係指包含如本文所描述及揭示之聚醣部分的經修飾之去氧核糖核酸。
如本文所用，術語「聚合物」係指由天然或合成單體(諸如核糖核苷酸)構成的物質。
如本文所用，術語「部分」係指分子。舉例而言，「碳水化合物部分」或「寡醣部分」一般係指聚醣組合物。
「經修飾之序列」為包括至少一種與天然存在之核酸分子之差異的核酸分子。經修飾之序列包括所有外源性經修飾及未經修飾之異源序列(亦即，來源於除含有經修飾序列以外之生物體或細胞的序列)以及內源性基因、操縱子、編碼序列或非編碼序列，該等序列已經修飾、突變或相比於天然存在之序列包括缺失或插入。此類序列亦包括所有序列，無論來源如何，均連接於誘導性啟動子或與其不天然相關之另一對照序列。此類序列進一步包括可用於下調或基因剔除內源性基因之表現的所有序列。此等包括反義分子、RNAi分子、用於產生同源重組之構築體、cre-lox構築體及其類似者。
術語「聚核苷酸」或「核酸分子」或「核苷酸序列」係指長度為至少10個鹼基之聚合物形式的核苷酸。該等術語包括DNA分子(例如cDNA或基因體或合成DNA)及RNA分子(例如mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸類似物、非天然核苷間鍵或兩者之DNA或RNA的類似物。核酸可處於任何拓樸構形。舉例而言，核酸可為單股、雙股、三股、四股、部分雙股、分支、髮夾、環形或呈掛鎖構形。
除非另外指明，且作為本文中在通用格式「SEQ ID NO:」下描述之所有序列的一個實例，否則「包含SEQ ID NO: 1之核酸」係指一種核酸，其至少一部分具有(i) SEQ ID NO: 1之序列或(ii)與SEQ ID NO: 1互補之序列。該兩者之間的選擇由上下文規定。舉例而言，若核酸用作探針，則兩者之間的選擇由探針與所需標靶互補之要求規定。
「經分離之」RNA、DNA或混合聚合物為與在天然宿主細胞中天然聚核苷酸天然伴隨之其他細胞組分(例如核糖體、聚合酶及其天然相關之基因體序列)實質上分離的RNA、DNA或混合性聚合物。
如本文所用，「經分離之」組合物(例如，醣-配體)為與其源自之宿主細胞之細胞組分(膜脂質、染色體、蛋白質)或自經培養之宿主細胞的培養基實質上分離的組合物。該術語不需要生物分子與所有其他化學品分離，不過可以將某些分離的生物分子純化至幾乎均勻性。
本發明之核酸(亦稱為聚核苷酸)可包括RNA、cDNA、基因體DNA及合成形式之有義股及反義股兩者及以上之混合聚合物。熟習此項技術者應容易地瞭解，其可經化學或生物化學修飾，或可含有非天然或衍生之核苷酸鹼基。此類修飾包括例如標記物、甲基化、用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者、核苷酸間修飾(諸如不帶電鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)、帶電鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側接部分(例如多肽)、嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷基化劑及經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等))。亦包括模擬聚核苷酸的合成分子，其能夠經由氫鍵結及其他化學相互作用結合至指定序列。此類分子為此項技術中已知的且包括例如其中肽鍵取代分子主鏈中之磷酸酯鍵的彼等分子。其他修飾可包括例如其中核糖環含有橋接部分或其他結構之類似物，諸如在「鎖定」核酸中發現之修飾。
術語「下調」，如同「下調信號」，意謂在與糖-配體接觸之前及之後可以比較靶基因表現量之過程，例如，在mRNA或蛋白質層面上。若確定在與醣-配體接觸後由靶基因表現之RNA或蛋白質的量較低，則可得出如下結論：醣-配體下調靶基因表現。細胞中目標RNA或蛋白質之含量可藉由任何所需方法測定。舉例而言，目標RNA之含量可藉由北方墨點分析、伴隨聚合酶鏈反應之反轉錄(RT-PCR)或RNA酶保護分析測定。蛋白質含量可例如藉由西方墨點分析測定。
「以可操作方式連接之」或「可操作地連接之」表現控制序列係指其中表現控制序列與相關基因連續以控制相關基因的連接，以及以反式起作用或在一定距離處起作用以控制相關基因的表現控制序列。該術語亦相對於如本文所描述之與合成骨架域結合的聚醣部分而用於本文中。
如本文所用之術語「肽」係指短多肽，例如長度通常少於約50個胺基酸且更通常少於約30個胺基酸之多肽。如本文所用之術語涵蓋模擬結構且因此模擬生物功能之類似物及模擬物。
術語「多肽」涵蓋天然存在之蛋白質及非天然存在之蛋白質兩者，及其片段、突變體、衍生物及類似物。多肽可為單體或聚合物。此外，多肽可包含多個不同的域，其中每一者具有一或多種不同活性。
術語「經分離之蛋白質」或「經分離之多肽」為一種蛋白質或多肽，由於其來源或衍生來源，(1)不與在其原始狀態下與之伴隨的天然結合組分相關聯，(2)以自然界中不存在的純度存在，其中純度可以就其他細胞物質(例如，不含來自同一物種的其他蛋白質)的存在進行判斷，(3)由不同物種的細胞表現，或(4)在自然界中不存在(例如，其為自然界中發現之多肽的片段，或其包括自然界中未發現的胺基酸類似物或衍生物或標準肽鍵以外的鍵聯)。因此，化學合成或在不同於其天然來源的細胞之細胞系統中合成之多肽將與其天然結合組分「分離」。多肽或蛋白質亦可藉由使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術進行分離而使得實質上不含天然結合組分。如此定義，「經分離」不一定需要如此描述之蛋白質、多肽、肽或寡肽以物理方式自其原始環境移除。
如本文所用，術語「多肽片段」係指相比於全長多肽，具有缺失，例如胺基端及/或羧基端缺失之多肽。在一較佳實施例中，多肽片段為連續序列，其中片段之胺基酸序列與天然存在之序列中之對應位置一致。片段通常為至少5、6、7、8、9或10個胺基酸長，較佳至少12、14、16或18個胺基酸長，更佳至少20個胺基酸長，更佳至少25、30、35、40或45個胺基酸長，甚至更佳至少50或60個胺基酸長，且甚至更佳至少70個胺基酸長。
如本文所用，二十種習知胺基酸及其縮寫遵循習知用途。參見 Immunology- A Synthesis(Golub及Gren編, Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 第2版, 1991)，其以引用之方式併入本文中。二十種習知胺基酸之立體異構物(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如α-胺基酸、α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸)及其他非習知胺基酸亦可為適用於本發明之多肽之組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所使用之多肽符號中，根據標準用法及慣例，左手端對應於胺基末端，且右側端對應於之羧基末端。
如本文中所使用，術語「區」係指生物分子之主要結構的物理上連續部分。在蛋白質之情況下，區由該蛋白質之胺基酸序列之連續部分界定。
如本文所用，術語「域」係指生物分子之結構，其有助於生物分子之已知或疑似功能。域可與區或其部分共同延伸；域亦可包括生物分子之不同、非相鄰區域。蛋白域之實例包括(但不限於) Ig域、細胞外域、跨膜域及細胞質域。
如本文所用，術語「分子」意謂任何化合物，包括(但不限於)小分子、肽、蛋白質、糖、核苷酸、核酸、脂質等，且此類化合物可為天然或合成的。
如本文所用，術語「單醣」係指無法水解成兩種或更多種更簡單碳水化合物的碳水化合物分子。單醣之實例包括(但不限於) GlcNAc、甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、果糖及半乳糖。
術語「 N-連接之聚醣」或「 N-聚醣」係指N-連接之寡醣結構，其視情況經由醯胺鍵共價結合於氮原子，視情況作為經由糖基轉移酶在聚醣上經由N-乙醯基葡糖胺殘基結合於天冬醯胺或精胺酸殘基處的 N-聚醣。此等「N-連接之醣基化位點」出現在含有例如典型胺基酸序列天冬醯胺-X-絲胺酸/蘇胺酸之肽一級結構中，其中X為除脯胺酸及天冬胺酸之外的任何胺基酸殘基。「 N-連接之聚醣」係指N-連接之寡醣結構。 N-聚醣可連接至蛋白質或骨架，其可在活體外或活體內進一步操縱。常見N-連接之聚醣通常包括複合、雜交、高度甘露糖、分支鏈及多觸角結構。關於聚醣之術語「 N-連接之類型」可指具有連接至蛋白質或骨架上之天冬醯胺殘基( N-連接)之醯胺氮的連接之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基的骨架，其與人類產生之彼等者類似或甚至相同。
「 O-聚醣」或「 O-連接之聚醣」係指 O-連接之寡醣結構。 O-聚醣可連接至蛋白質或骨架，其可在活體外或活體內進一步操縱。常見 O-GalNAc核心結構通常包括核心1、核心2及聚-N-乙醯基半乳糖胺(LacNAc)結構。在一些實施例中，O-連接之寡醣經由絲胺酸殘基上之氧原子共價鍵結。關於聚醣之術語「 O-連接之類型」可指具有連接的N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)殘基之結合物，該等殘基連接於蛋白質或骨架上之絲胺酸或蘇胺酸殘基之氧原子，亦即與人類中產生之彼等者類似或甚至一致。
術語「聚醣」係指寡醣結構—醣蛋白上發現之主要寡醣結構包括葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、 N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、 N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、 N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)及唾液酸(例如 N-乙醯基-神經胺酸(NeuAc或NANA))。分類為具有6個碳原子之單醣的己糖(Hex)，諸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖，不容易經由質譜法辨別且亦可存在。 N-聚醣在包含添加至「三甘露糖基核心」之周邊糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖及唾液酸)的分支(「觸角」或「臂」)之數目方面不同。術語「三甘露糖基核心」，亦稱為「M3」、「M3GN2」、「三甘露糖核心」、「五醣核心」或「寡甘露糖核心」反映了Man3GlcNAc2寡醣結構，其中Manα1，3臂及Manα1，6臂自二-GlcNAc結構(GlcNAc2)：β1,4GlcNAc-β1,4GlcNAc延伸。 N-聚醣根據其分支組分(例如高度甘露糖、複合或雜交)分類。
「高度甘露糖」型 N-聚醣在二-GlcNAc寡醣結構上包含四個或更多個甘露糖殘基。「M9」反映Man9GlcNAc2。「M5」反映Man5GlcNAc2。
「雜交」N-聚醣在三甘露糖核心之α1,3甘露糖(Man α1,3)臂之末端上具有至少一個GlcNAc殘基且在三甘露糖核心之α1,6甘露糖(Man α1,3)臂上具有零或多個甘露糖。雜交聚醣之實例為GlcNAcMan3GlcNAc2。
「複合」型N-聚醣通常具有至少一個連接至Manα1,3臂之GlcNAc殘基及至少一個連接至三甘露糖核心之Manα1,6臂之GlcNAc (有時稱為「G0」或岩藻糖基化之「G0F」)。複合 N-聚醣亦可具有視情況經唾液酸(「G2S2」或岩藻糖基化之「G2FS2」)或衍生物(例如「Neu」係指神經胺酸且「Ac」係指乙醯基)修飾的半乳糖或N-乙醯基半乳糖胺殘基(「G2」或岩藻糖基化之「G2F」)。複合N-聚醣亦可具有包含「二等分」GlcNAc及核心岩藻糖之鏈內取代。複合N-聚醣亦可在三甘露糖核心上具有多個觸角，常常稱為「多觸角聚醣」或亦稱為「多分支聚醣」，該等聚醣可為三觸角、四觸角或五觸角聚醣。
如本文所用，術語「主要」或諸如「主要的」或「其中主要」等變異體應理解為在移除醣-配體(例如，用PNG酶處理且釋放聚醣)且藉由質譜，例如MALDI-TOF MS進行分析後，所量測的聚醣物種在總N-聚醣中具有最高的莫耳百分比(%)。換言之，片語「主要地」定義為個別實體，諸如特定醣型，其以比任何其他個別實體大的莫耳百分比存在。舉例而言，若組合物由40莫耳%中之物種A、35莫耳%中之物種B及25莫耳%中之物種C組成，則該組合物主要包含物種A。關於一或多種聚醣，術語「富集」、「均勻」、「均質」及「主要由…組成」亦與「主要」同義。
如藉由MALDI-TOF-MS在正模式中所量測之 N-聚醣之莫耳%係指相對於總N-聚醣之莫耳%的醣轉移。某些陽離子加成物(諸如K+及Na+)通常與藉由各別加成物之分子質量逐漸增加N-聚醣之質量的峰相關聯。
「有效量」或「治療有效量」意指與對照組相比足以產生所要結果，例如足以實現有益或所要(包括預防性及/或治療性)結果，諸如醫學病況(例如癌症、傳染病、免疫介導之病症(例如自體免疫病症、發炎性病症)等)之症狀減少的量。在一些實施例中，關於癌症，治療有效量足以減緩腫瘤生長、減小腫瘤尺寸及/或類似者。有效量可以一或多次投藥投與。
當列出值範圍時，希望該範圍內涵蓋各值及子範圍。舉例而言，「C 1-6烷基」意圖涵蓋C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 1-6、C 1-5、C 1-4、C 1-3、C 1-2、C 2-6、C 2-5、C 2-4、C 2-3、C 3-6、C 3-5、C 3-4、C 4-6、C 4-5及C 5-6烷基。
術語「烷基」係指具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴基的基團(「C 1-10烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至9個碳原子(「C 1-9烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至8個碳原子(「C 1-8烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至7個碳原子(「C 1-7烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至6個碳原子(「C 1-6烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至5個碳原子(「C 1-5烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至4個碳原子(「C 1-4烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至3個碳原子(「C 1-3烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至2個碳原子(「C 1-2烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個碳原子(「C 1烷基」)。在一些實施例中，烷基具有2至6個碳原子(「C 2-6烷基」)。C 1-6烷基之實例包括甲基(C 1)、乙基(C 2)、丙基(C 3)(例如正丙基、異丙基)、丁基(C 4)(例如正丁基、三級丁基、二級丁基、異丁基)、戊基(C 5)(例如正戊基、3-戊基、戊基、新戊基、3-甲基-2-丁基、第三戊基)及己基(C 6)(例如正己基)。烷基之其他實例包括正庚基(C 7)、正辛基(C 8)及其類似基團。除非另外說明，否則烷基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之丁烯烷基」)或經一或多個取代基(例如鹵素，諸如F)取代(「經烴基取代之烷基」)。在某些實施例中，烷基為未經取代之C 1-10烷基(諸如未經取代之C 1-6烷基，例如-CH 3(Me)、未經取代之乙基(Et)、未經取代之丙基(Pr，例如未經取代之正丙基(n-Pr)、未經取代之異丙基(i-Pr))、未經取代之丁基(Bu，例如未經取代之正丁基(n-Bu)、未經取代之三級丁基(tert-Bu或t-Bu)、未經取代之二級丁基(sec-Bu)、未經取代之異丁基(i-Bu))。在某些實施例中，烷基為經取代之C 1-10烷基(諸如經取代之C 1-6烷基，例如−CF 3、Bn)。
術語「雜烷基」係指進一步包括至少一個選自氧、氮或硫之雜原子(例如1、2、3或4個雜原子)的烷基，該雜原子位於主鏈內(亦即，插入相鄰碳原子之間)及/或位於主鏈之一或多個末端位置。在某些實施例中，雜烷基係指在母鏈內具有1至20個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-20烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至18個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-18烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至16個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-16烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至14個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-14烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至12個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-12烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至10個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-10烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至8個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-8烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至6個碳原子及1或多個雜原子的飽和基團(「雜C 1-6烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至4個碳原子及1或2個雜原子的飽和基團(「雜C 1-4烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至3個碳原子及1個雜原子的飽和基團(「雜C 1-3烷基」)。在一些實施例中，雜烷基為母鏈內具有1至2個碳原子及1個雜原子的飽和基團(「雜C 1-2烷基」)。在一些實施例中，雜烷基係具有1個碳原子及1個雜原子的飽和基團(「雜C 1烷基」)。在一些實施例中，本文中所定義之雜烷基為母鏈內具有1或多個雜原子及至少一個不飽和碳(諸如羰基)的部分不飽和基團。舉例而言，雜烷基可在其母鏈中包含醯胺或酯官能基，使得一或多個碳原子為不飽和羰基。除非另外規定，否則雜烷基之各例子獨立地未經取代(「未經取代之雜烷基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之雜烷基」)。在某些實施例中，雜烷基係未經取代之雜C 1-20烷基。在某些實施例中，雜烷基係未經取代之雜C 1-10烷基。在某些實施例中，雜烷基係經取代之雜C 1-20烷基。在某些實施例中，雜烷基係未經取代之雜C 1-10烷基。
術語「烯基」係指具有2至10個碳原子及一或多個碳-碳雙鍵(例如1、2、3或4個雙鍵)之直鏈或分支鏈烴基之基團。在一些實施例中，烯基具有2至9個碳原子(「C 2-9烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至8個碳原子(「C 2-8烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至7個碳原子(「C 2-7烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至6個碳原子(「C 2-6烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至5個碳原子(「C 2-5烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至4個碳原子(「C 2-4烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至3個碳原子(「C 2-3烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2個碳原子(「C 2烯基」)。一或多個碳-碳雙鍵可位於內部(諸如在2-丁烯基中)或末端(諸如在1-丁烯基中)。C 2-4烯基之實例包括乙烯基(C 2)、1-丙烯基(C 3)、2-丙烯基(C 3)、1-丁烯基(C 4)、2-丁烯基(C 4)、丁二烯基(C 4)及其類似基團。C 2-6烯基之實例包括前述C 2-4烯基以及戊烯基(C 5)、戊二烯基(C 5)、己烯基(C 6)及其類似基團。烯基之額外實例包括庚烯基(C 7)、辛烯基(C 8)、辛三烯基(C 8)及其類似基團。除非另外說明，否則烯基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之烯基」)或經一或多個取代基取代的(「經取代之烯基」)。在某些實施例中，烯基為未經取代之C 2-10烯基。在某些實施例中，烯基為經取代之C 2-10烯基。在烯基中，未指定立體化學構型之C=C雙鍵(例如-CH=CHCH 3或
Figure 02_image001
)可呈(E)-雙鍵或(Z)-雙鍵。
術語「炔基」係指具有2至10個碳原子及一或多個碳-碳參鍵(例如1、2、3或4個參鍵)之直鏈或分支鏈烴基之基團(「C 2-10炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至9個碳原子(「C 2-9炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至8個碳原子(C 2-8炔基)。在一些實施例中，炔基具有2至7個碳原子(「C 2-7炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至6個碳原子(「C 2-6炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至5個碳原子(「C 2-5炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至4個碳原子(「C 2-4炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至3個碳原子(「C 2-3炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2個碳原子(「C 2炔基」)。一或多個碳-碳參鍵可位於內部(諸如在2-丁炔基中)或末端(諸如在1-丁炔基中)。C 2-4炔基之實例包括(但不限於)乙炔基(C 2)、1-丙炔基(C 3)、2-丙炔基(C 3)、1-丁炔基(C 4)、2-丁炔基(C 4)及其類似基團。C 2-6烯基之實例包括前述C 2-4炔基以及戊炔基(C 5)、己炔基(C 6)及其類似基團。炔基之額外實例包括庚炔基(C 7)、辛炔基(C 8)及其類似基團。除非另外說明，否則炔基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之炔基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之炔基」)。在某些實施例中，炔基為未經取代之C 2-10炔基。在某些實施例中，炔基為經取代之C 2-10炔基。
術語「碳環基」或「碳環」係指非芳族環系統中具有3至14個環碳原子(「C 3-14碳環基」)及零個雜原子的非芳族環烴基之基團。在一些實施例中，碳環基具有3至10個環碳原子(「C 3-10碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3至8個環碳原子(「C 3-8碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3至7個環碳原子(「C 3-7碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3至6個環碳原子(「C 3-6碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有4至6個環碳原子(「C 4-6碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有5至6個環碳原子(「C 5-6碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有5至10個環碳原子(「C 5-10碳環基」)。例示性C 3-6碳環基包括(但不限於)環丙基(C 3)、環丙烯基(C 3)、環丁基(C 4)、環丁烯基(C 4)、環戊基(C 5)、環戊烯基(C 5)、環己基(C 6)、環己烯基(C 6)、環己二烯基(C 6)及其類似基團。例示性C 3-8碳環基包括(但不限於)前述C 3-6碳環基以及環庚基(C 7)、環庚烯基(C 7)、環庚二烯基(C 7)、環庚三烯基(C 7)、環辛基(C 8)、環辛烯基(C 8)、雙環[2.2.1]庚基(C 7)、雙環[2.2.2]辛基(C 8)及類似基團。例示性C 3-10碳環基包括(但不限於)前述C 3-8碳環基以及環壬基(C 9)、環壬烯基(C 9)、環癸基(C 10)、環癸烯基(C 10)、八氫-1H-茚基(C 9)、十氫萘基(C 10)、螺[4.5]癸基(C 10)及其類似基團。如前述實例說明，在某些實施例中，碳環基為單環(「單環碳環基」)或多環(例如，含有稠合、橋接或螺接的環系統，諸如雙環系統(「雙環碳環基」))或三環系統(「三環碳環基」)且可為飽和的或可含有一或多個碳-碳雙鍵或參鍵。「碳環基」亦包括如上文所定義之碳環基環與一或多個芳基或雜芳基稠合之環系統，其中連接點在碳環基環上，且在此等情況下，碳之數量繼續指示碳環系統中之碳之數量。除非另外說明，否則碳環基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之碳環基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之碳環基」)。在某些實施例中，碳環基為未經取代之C 3-14碳環基。在某些實施例中，碳環基為經取代之C 3-14碳環基。
在一些實施例中，「碳環基」為具有3至14個環碳原子之單環飽和碳環基(「C 3-14環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3至10個環碳原子(「C 3-10環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3至8個環碳原子(「C 3-8環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3至6個環碳原子(「C 3-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有4至6個環碳原子(「C 4-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有5至6個環碳原子(「C 5-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有5至10個環碳原子(「C 5-10環烷基」)。C 5-6環烷基之實例包括環戊基(C 5)及環己基(C 6)。C 3-6環烷基之實例包括前述C 5-6環烷基以及環丙基(C 3)及環丁基(C 4)。C 3-8環烷基之實例包括前述C 3-6環烷基以及環庚基(C 7)及環辛基(C 8)。除非另外說明，否則環烷基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之環烷基」)或經一或多個取代基取代的(「經取代之環烷基」)。在某些實施例中，環烷基為未經取代之C 3-14環烷基。在某些實施例中，環烷基為經取代之C 3-14環烷基。
術語「雜環基」或「雜環」係指具有環碳原子及1至4個環雜原子之3員至14員非芳族環系統的基團，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「3-14員雜環基」)。在含有一或多個氮原子之雜環基中，在價數允許時，連接點可為碳或氮原子。雜環基可為單環(「單環雜環基」)或多環(例如稠合、橋接或螺接的環系統，諸如雙環系統(「雙環雜環基」)或三環系統(「三環雜環基」))，且可為飽和的或可含有一或多個碳-碳雙鍵或參鍵。雜環基多環系統可在一個或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜環基」亦包括如上文所定義之雜環基環與一或多個碳環基稠合之環系統，其中連接點在碳環基或雜環基環上，或如上文所定義之雜環基與一或多個芳基或雜芳基稠合之環系統，其中連接點在雜環基環上，且在此等情況下，環成員之數量繼續指示雜環基環系統中之環成員之數量。除非另外說明，否則雜環基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之雜環基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之雜環基」)。在某些實施例中，雜環基為未經取代之3-14員雜環基。在某些實施例中，雜環基為經取代之3-14員雜環基。
在一些實施例中，雜環基為具有環碳原子及1至4個環雜原子之5至10員非芳族環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5至10員雜環基」)。在一些實施例中，雜環基為具有環碳原子及1至4個環雜原子之5員至8員非芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5員至8員雜環基」)。在一些實施例中，雜環基為具有環碳原子及1-4個環雜原子之5-6員非芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-6員雜環基」)。在一些實施例中，5員至6員雜環基具有1至3個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5至6員雜環基具有1-2個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5至6員雜環基具有1個選自氮、氧及硫之環雜原子。
含有1個雜原子之例示性3員雜環基包括(但不限於)氮丙啶基、環氧乙烷基及硫雜環丙烷基。含有1個雜原子之例示性4員雜環基包括(但不限於)氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基及硫雜環丁烷基。含有1個雜原子之例示性5員雜環基包括(但不限於)四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫噻吩基、吡咯啶基、二氫吡咯基及吡咯基-2,5-二酮。含有2個雜原子之例示性5員雜環基包括(但不限於)二氧雜環戊烷基、氧硫雜環戊烷基及二硫雜環戊烷基。含有3個雜原子之例示性5員雜環基包括(但不限於)三唑啉基、㗁二唑啉基及噻二唑啉基。含有1個雜原子之例示性6員雜環基包括(但不限於)哌啶基、四氫哌喃基、二氫吡啶基以及噻烷基。含有2個雜原子之例示性6員雜環基包括(但不限於)哌𠯤基、𠰌啉基、二噻烷基及二㗁烷基。含有3個雜原子之例示性6員雜環基包括(但不限於)三𠯤基。含有1個雜原子之例示性7員雜環基包括(但不限於)氮雜環庚烷基、氧雜環庚烷基及硫雜環庚烷基。含有1個雜原子之例示性8員雜環基包括(但不限於)氮雜環辛基、氧雜環辛基及硫雜環辛基。例示性雙環雜環基包括(但不限於)吲哚啉基、異吲哚啉基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、四氫苯并噻吩基、四氫苯并呋喃基、四氫吲哚基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、十氫異喹啉基、八氫𠳭烯基、八氫異𠳭烯基、十氫㖠啶基、十氫-1,8-㖠啶基、八氫吡咯并[3,2-b]吡咯、吲哚啉基、鄰苯二甲醯亞胺基、萘二甲醯亞胺基、𠳭烷基、𠳭烯基、1H-苯并[e][1,4]二氮呯基、1,4,5,7-四氫哌喃并[3,4-b]吡咯基、5,6-二氫-4H-呋喃并[3,2-b]吡咯基、6,7-二氫-5H-呋喃并[3,2-b]哌喃基、5,7-二氫-4H-噻吩并[2,3-c]哌喃基、2,3-二氫-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氫-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氫呋喃并[3,2-c]吡啶基、4,5,6,7-四氫噻吩并[3,2-b]吡啶基、1,2,3,4-四氫-1,6-㖠啶基及其類似基團。
術語「芳基」係指單環或多環(例如雙環或三環) 4n+2芳族環系統(例如環陣列中共有6、10或14個π電子)之基團，該芳族環系統中提供有6至14個環碳原子及零個雜原子(「C 6 -14芳基」)。在一些實施例中，芳基具有6個環碳原子(「C 6芳基」；例如，苯基)。在一些實施例中，芳基具有10個環碳原子(「C 10芳基」；例如萘基，諸如1-萘基及2-萘基)。在一些實施例中，芳基具有14個環碳原子(「C 14芳基」；例如，蒽基)。「芳基」亦包括如上文所定義之芳環與一或多個碳環基或雜環基稠合之環系統，其中連接基團或連接點在芳環上，且在此等情況下，碳原子的編號繼續指示芳環系統中碳原子的編號。除非另外說明，否則芳基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之芳基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之芳基」)。在某些實施例中，芳基為未經取代之C 6-14芳基。在某些實施例中，芳基為經取代之C 6-14芳基。
術語「雜芳基」係指5至14員單環或多環(例如雙環、三環) 4n+2芳族環系統(例如環狀陣列中共有6、10或14個π電子)之基團，該芳族環系統中提供有環碳原子及1至4個環雜原子，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5至14員雜芳基」)。在含有一或多個氮原子之雜芳基中，在價數允許時，連接點可為碳或氮原子。雜芳基多環系統可以在一個或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜芳基」包括如上文所定義之雜芳基環與一或多個碳環基或雜環基稠合之環系統，其中連接點在雜芳基環上，且在此等情況下，環成員之數量繼續指示雜芳基環系統中環成員之數量。「雜芳基」亦包括其中如上文所定義之雜芳基環與一或多個芳基稠合之環系統，其中連接點位於芳基或雜芳基環上，且在此類情況下，環成員數目表示稠合多環(芳基/雜芳基)環系統中之環成員數目。對於其中一個環不含雜原子之多環雜芳基(例如吲哚基、喹啉基、咔唑基及其類似基團)，連接點可以位於任一環上，亦即攜帶雜原子之環(例如2-吲哚基)或不含雜原子之環(例如5-吲哚基)。
在一些實施例中，雜芳基為具有芳環系統中所提供之環碳原子及1至4個環雜原子之5員至10員芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5員至10員雜芳基」)。在一些實施例中，雜芳基為5員至8員芳環系統，該芳環系統中提供有環碳原子及1至4個環雜原子，其中各雜原子係獨立地選自氮、氧及硫(「5員至8員雜芳基」)。在一些實施例中，雜芳基為具有提供於芳環系統中之環碳原子及1至4個環雜原子之5員至6員芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5員至6員雜芳基」)。在一些實施例中，5員至6員雜芳基具有1至3個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5至6員雜芳基具有1至2個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5員至6員雜芳基具有1個選自氮、氧及硫之環雜原子。除非另外說明，否則雜芳基之各實例獨立地為未經取代的(「未經取代之雜芳基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之雜芳基」)。在某些實施例中，雜芳基為未經取代之5至14員雜芳基。在某些實施例中，雜芳基為經取代之5至14員雜芳基。
含有1個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)吡咯基、呋喃基及噻吩基。含有2個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)咪唑基、吡唑基、㗁唑基、異㗁唑基、噻唑基及異噻唑基。含有3個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)三唑基、㗁二唑基及噻二唑基。含有4個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)四唑基。含有1個雜原子之例示性6員雜芳基包括(但不限於)吡啶基。含有2個雜原子之例示性6員雜芳基包括(但不限於)嗒𠯤基、嘧啶基及吡𠯤基。含有3或4個雜原子之例示性6員雜芳基分別包括(但不限於)三𠯤基及四𠯤基。含有1個雜原子之例示性7員雜芳基包括(但不限於)氮呯基、氧呯基及噻呯基。例示性5,6-雙環雜芳基包括(但不限於)吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、異苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并異呋喃基、苯并咪唑基、苯并㗁唑基、苯并異㗁唑基、苯并㗁二唑基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并噻二唑基、吲哚𠯤基及嘌呤基。例示性6,6-雙環雜芳基包括但不限於㖠啶基、喋啶基、喹啉基、異喹啉基、㖕啉基、喹喏啉基、呔𠯤基及喹唑啉基。例示性三環雜芳基包括(但不限於)啡啶基、二苯并呋喃基、咔唑基、吖啶基、啡噻𠯤基、啡㗁𠯤基及啡𠯤基。
一種基團附有前綴「伸」表示該基團為二價部分，例如伸烷基為烷基之二價部分，伸烯基為烯基之二價部分，伸炔基為炔基之二價部分，伸雜烷基為雜烷基之二價部分，伸雜烯基為雜烯基之二價部分，伸雜炔基為雜炔基之二價部分，伸碳環基為碳環基之二價部分，伸雜環基為雜環基之二價部分，伸芳基為芳基之二價部分且伸雜芳基為雜芳基之二價部分。
除非另外明確提供，否則基團視情況經取代。術語「視情況經取代」係指經取代或未經取代。在某些實施例中，烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基視情況經取代。「視情況經取代」係指可以經取代或未經取代之基團(例如「經取代」或「未經取代」之烷基、「經取代」或「未經取代」之烯基、「經取代」或「未經取代」之炔基、「經取代」或「未經取代」之雜烷基、「經取代」或「未經取代」之雜烯基、「經取代」或「未經取代」之雜炔基、「經取代」或「未經取代」之碳環基、「經取代」或「未經取代」之雜環基、「經取代」或「未經取代」之芳基，或「經取代」或「未經取代」之雜芳基)。一般而言，術語「經取代」意謂存在於基團上的至少一個氫被可容許的取代基置換，例如取代後產生穩定化合物(例如不會自發地經歷轉化(諸如重排、環化、消去或其他反應)的化合物)的取代基。除非另外指明，否則「經取代」之基團在該基團之一或多個可取代位置處具有取代基，且當任何給定結構中之多於一個位置經取代時，取代基在各位置處相同或不同。術語「經取代」預期包括有機化合物之所有容許取代基的取代，且包括引起穩定化合物形成之本文所描述任何取代基。本發明考慮任何及所有此類組合以便獲得穩定化合物。出於本發明之目的，雜原子(諸如氮)可具有氫取代基及/或滿足雜原子價數且導致穩定部分形成之如本文所描述之任何適合取代基。本發明不欲以任何方式受本文所描述之例示性取代基限制。
當經取代時，例示性碳原子取代基包括(但不限於)鹵素、−CN、−NO 2、−N 3、−SO 2H、−SO 3H、−OH、−OR aa、−ON(R bb) 2、−N(R bb) 2、−N(R bb) 3 +X −、−N(OR cc)R bb、−SH、−SR aa、−SSR cc、−C(=O)R aa、−CO 2H、−CHO、−C(OR cc) 3、−CO 2R aa、−OC(=O)R aa、−OCO 2R aa、−C(=O)N(R bb) 2、−OC(=O)N(R bb) 2、−NR bbC(=O)R aa、−NR bbCO 2R aa、−NR bbC(=O)N(R bb) 2、−C(=NR bb)R aa、−C(=NR bb)OR aa、−OC(=NR bb)R aa、−OC(=NR bb)OR aa、−C(=NR bb)N(R bb) 2、−OC(=NR bb)N(R bb) 2、−NR bbC(=NR bb)N(R bb) 2、−C(=O)NR bbSO 2R aa、−NR bbSO 2R aa、−SO 2N(R bb) 2、−SO 2R aa、−SO 2OR aa、−OSO 2R aa、−S(=O)R aa、−OS(=O)R aa、−Si(R aa) 3、−OSi(R aa) 3−C(=S)N(R bb) 2、−C(=O)SR aa、−C(=S)SR aa、−SC(=S)SR aa、−SC(=O)SR aa、−OC(=O)SR aa、−SC(=O)OR aa、−SC(=O)R aa、−P(=O)(R aa) 2、−P(=O)(OR cc) 2、−OP(=O)(R aa) 2、−OP(=O)(OR cc) 2、−P(=O)(N(R bb) 2) 2、−OP(=O)(N(R bb) 2) 2、−NR bbP(=O)(R aa) 2、−NR bbP(=O)(OR cc) 2、−NR bbP(=O)(N(R bb) 2) 2、−P(R cc) 2、−P(OR cc) 2、−P(R cc) 3 +X −、−P(OR cc) 3 +X −、−P(R cc) 4、−P(OR cc) 4、−OP(R cc) 2、−OP(R cc) 3 +X −、−OP(OR cc) 2、−OP(OR cc) 3 +X −、−OP(R cc) 4、−OP(OR cc) 4、−B(R aa) 2、−B(OR cc) 2、−BR aa(OR cc)、C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 2-10烯基、C 2-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 2-10烯基、雜C 2-10炔基、C 3-10碳環基、3至14員雜環基、C 6-14芳基及5至14員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個R dd基團取代；其中X −為相對離子； 或碳原子上的兩個成對氫經基團=O、=S、=NN(R bb) 2、=NNR bbC(=O)R aa、=NNR bbC(=O)OR aa、=NNR bbS(=O) 2R aa、=NR bb或=NOR cc置換； R aa之各實例獨立地選自C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 2-10烯基、C 2-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 2-10烯基、雜C 2-10炔基、C 3-10碳環基、3至14員雜環基、C 6-14芳基及5至14員雜芳基，或兩個R aa基團連接而形成3至14員雜環基或5至14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個R dd基團取代； R bb之各實例獨立地選自氫、−OH、−OR aa、−N(R cc) 2、−CN、−C(=O)R aa、−C(=O)N(R cc) 2、−CO 2R aa、−SO 2R aa、−C(=NR cc)OR aa、−C(=NR cc)N(R cc) 2、−SO 2N(R cc) 2、−SO 2R cc、−SO 2OR cc、−SOR aa、−C(=S)N(R cc) 2、−C(=O)SR cc、−C(=S)SR cc、−P(=O)(R aa) 2、−P(=O)(OR cc) 2、−P(=O)(N(R cc) 2) 2、C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 2-10烯基、C 2-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 2-10烯基、雜C 2-10炔基、C 3-10碳環基、3至14員雜環基、C 6-14芳基及5至14員雜芳基，或兩個R bb基團連接以形成3至14員雜環基或5至14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個R dd基團取代；其中X −為相對離子； R cc之各實例獨立地選自氫、C 1-10烷基、C 1-10全鹵烷基、C 2-10烯基、C 2-10炔基、雜C 1-10烷基、雜C 2-10烯基、雜C 2-10炔基、C 3-10碳環基、3至14員雜環基、C 6-14芳基及5至14員雜芳基，或兩個R cc基團連接而形成3至14員雜環基或5至14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個R dd基團取代； R dd之各實例獨立地選自鹵素、−CN、−NO 2、−N 3、−SO 2H、−SO 3H、−OH、−OR ee、−ON(R ff) 2、−N(R ff) 2、−N(R ff) 3 +X −、−N(OR ee)R ff、−SH、−SR ee、−SSR ee、−C(=O)R ee、−CO 2H、−CO 2R ee、−OC(=O)R ee、−OCO 2R ee、−C(=O)N(R ff) 2、−OC(=O)N(R ff) 2、−NR ffC(=O)R ee、−NR ffCO 2R ee、−NR ffC(=O)N(R ff) 2、−C(=NR ff)OR ee、−OC(=NR ff)R ee、−OC(=NR ff)OR ee、−C(=NR ff)N(R ff) 2、−OC(=NR ff)N(R ff) 2、−NR ffC(=NR ff)N(R ff) 2、−NR ffSO 2R ee、−SO 2N(R ff) 2、−SO 2R ee、−SO 2OR ee、−OSO 2R ee、−S(=O)R ee、−Si(R ee) 3、−OSi(R ee) 3、−C(=S)N(R ff) 2、−C(=O)SR ee、−C(=S)SR ee、−SC(=S)SR ee、−P(=O)(OR ee) 2、−P(=O)(R ee) 2、−OP(=O)(R ee) 2、−OP(=O)(OR ee) 2、C 1-6烷基、C 1-6全鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、雜C 1-6烷基、雜C 2-6烯基、雜C 2-6炔基、C 3-10碳環基、3至10員雜環基、C 6-10芳基、5至10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個R gg基團取代，或兩個成對R dd取代基可連接以形成=O或=S；其中X −為相對離子； R ee在各情況下獨立地選自C 1-6烷基、C 1-6全鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、雜C 1-6烷基、雜C 2-6烯基、雜C 2-6炔基、C 3-10碳環基、C 6-10芳基、3至10員雜環基及3至10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個R gg基團取代； R ff在各情況下獨立地選自氫、C 1-6烷基、C 1-6全鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、雜C 1-6烷基、雜C 2-6烯基、雜C 2-6炔基、C 3-10碳環基、3至10員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，或兩個R ff基團連接而形成3至10員雜環基或5至10員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個R gg基團取代；及
R gg之各實例獨立地為鹵素、−CN、−NO 2、−N 3、−SO 2H、−SO 3H、−OH、−OC 1-6烷基、−ON(C 1-6烷基) 2、−N(C 1-6烷基) 2、−N(C 1-6烷基) 3 +X −、−NH(C 1-6烷基) 2 +X −、−NH 2(C 1-6烷基) +X −、−NH 3 +X −、−N(OC 1-6烷基)(C 1-6烷基)、−N(OH)(C 1-6烷基)、−NH(OH)、−SH、−SC 1-6烷基、−SS(C 1-6烷基)、−C(=O)(C 1-6烷基)、−CO 2H、−CO 2(C 1-6烷基)、−OC(=O)(C 1-6烷基)、−OCO 2(C 1-6烷基)、−C(=O)NH 2、−C(=O)N(C 1-6烷基) 2、−OC(=O)NH(C 1-6烷基)、−NHC(=O)(C 1-6烷基)、−N(C 1-6烷基)C(=O)( C 1-6烷基)、−NHCO 2(C 1-6烷基)、−NHC(=O)N(C 1-6烷基) 2、−NHC(=O)NH(C 1-6烷基)、−NHC(=O)NH 2、−C(=NH)O(C 1-6烷基)、−OC(=NH)(C 1-6烷基)、−OC(=NH)OC 1-6烷基、−C(=NH)N(C 1-6烷基) 2、−C(=NH)NH(C 1-6烷基)、−C(=NH)NH 2、−OC(=NH)N(C 1-6烷基) 2、−OC(=NH)NH(C 1-6烷基)、−OC(=NH)NH 2、−NHC(=NH)N(C 1-6烷基) 2、−NHC(=NH)NH 2、−NHSO 2(C 1-6烷基)、−SO 2N(C 1-6烷基) 2、−SO 2NH(C 1-6烷基)、−SO 2NH 2、−SO 2(C 1-6烷基)、−SO 2O(C 1-6烷基)、−OSO 2(C 1-6烷基)、−SO(C 1-6烷基)、−Si(C 1-6烷基) 3、−OSi(C 1-6烷基) 3−C(=S)N(C 1-6烷基) 2、C(=S)NH(C 1-6烷基)、C(=S)NH 2、−C(=O)S(C 1-6烷基)、−C(=S)SC 1-6烷基、−SC(=S)SC 1-6烷基、−P(=O)(OC 1-6烷基) 2、−P(=O)(C 1-6烷基) 2、−OP(=O)(C 1-6烷基) 2、−OP(=O)(OC 1-6烷基) 2、C 1-6烷基、C 1-6全鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、雜C 1-6烷基、雜C 2-6烯基、雜C 2-6炔基、C 3-10碳環基、C 6-10芳基、3至10員雜環基、5至10員雜芳基；或兩個成對R gg取代基可連接以形成=O或=S；其中X -為相對離子。
在更詳細地描述本發明之方法及組合物之前，應理解，該等方法及組合物不限於所描述之特定實施例，因此當然可變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的而並不意欲為限制性的，因為該等方法及組合物之範疇將僅由所附申請專利範圍限制。
除非另外定義，否則本發明所使用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。儘管與本文所描述之方法及材料類似或等效之方法及材料亦可用於實施本發明，但下文描述例示性方法及材料。本文所提及之所有公開案及其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。在有矛盾的情況下，將以本發明(包括定義)為準。材料、方法及實施例僅為說明性的，且並不意欲為限制性的。
應瞭解，為清楚起見而在各別實施例之上下文中描述的方法及組合物之某些特徵亦可以組合形式提供於單一實施例中。相反，為簡潔起見而描述於單一實施例之上下文中的該等方法及組合物之各種特徵亦可分別或以任何適合的子組合形式提供。實施例之所有組合尤其由本發明包涵且在此類組合包涵可操作方法及/或組合物之程度上如同個別且明確地揭示各組合及每一組合一般揭示於本文中。另外，描述此類變量之實施例中所列之所有子組合亦尤其由本發明方法及組合物包涵且揭示於本文中，如同各此類子組合及每一此類子組合個別且明確揭示於本文中一般。
如熟習此項技術者在閱讀本發明之後將顯而易知，本文中所描述及說明之個別實施例中之每一者具有離散組分及特徵，其容易與其他若干實施例中之任一者的特徵分離或與其組合而不悖離本發明方法之範疇或精神。任何所引述方法均可以所述事件順序或以邏輯上可能的任何其他順序進行。
如本文所用，術語「鹽」係指任何及所有鹽，且涵蓋醫藥學上可接受之鹽。鹽包括由酸與鹼的中和反應產生的離子化合物。鹽由一或多個陽離子(帶正電離子)及一或多個陰離子(負離子)構成，使得該鹽為電中性的(無淨電荷)。本發明的化合物的鹽包括自衍生無機酸及有機酸以及無機鹼及有機鹼的鹽。酸加成鹽之實例為胺基與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸)或與有機酸(諸如乙酸、草酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、丁二酸或丙二酸)形成的鹽，或藉由使用此項技術中已知的其他方法(諸如離子交換)形成的鹽。其他鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽、馬尿酸鹽以及類似鹽。衍生自適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽以及N +(C 1-4烷基) 4鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及其類似者。其他鹽包括銨鹽、四級銨鹽以及使用相對離子形成的胺陽離子鹽，諸如鹵化物、氫氧化物、甲酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、低碳數烷基磺酸鹽以及芳基磺酸鹽。
術語「溶劑合物」係指化合物或其鹽與溶劑締合(通常藉由溶劑分解反應來締合)之形式。此物理性締合可包括氫鍵結。習知溶劑包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚及其類似物。本文所描述之化合物可以例如結晶形式製備且可溶劑化。適合溶劑合物包括醫藥學上可接受之溶劑合物且更包括化學計量溶劑合物及非化學計量溶劑合物兩者。在某些情況下，例如當一或多個溶劑分子併入結晶固體的晶格時，溶劑合物將能夠分離。「溶劑合物」涵蓋溶液相與可分離溶劑合物。代表性溶劑合物包括水合物、乙醇合物及甲醇合物。
術語「水合物」係指與水締合之化合物。典型地，化合物之水合物中所含的水分子數目相對於水合物中之化合物分子數目呈確定的比率。因此，化合物之水合物可例如由通式R×x H2O表示，其中R為化合物且其中x為大於0之數值。給定化合物可形成超過一種類型之水合物，包括例如單水合物(x為1)、更低級水合物(x為大於0且小於1之數值，例如半水合物(R×0.5 H2O))及多水合物(x為大於1之數值，例如二水合物(R×2 H2O)及六水合物(R×6 H2O))。
術語「互變異構物」或「互變異構」係指兩種或更多種可相互轉化的化合物，其由氫原子之至少一次形式遷移及價數之至少一次變化(例如單鍵變為雙鍵、參鍵變為單鍵，或反之亦然)產生。互變異構物之確切比率視若干因素而定，包括溫度、溶劑及pH。互變異構化(亦即，提供互變異構對之反應)可由酸或鹼催化。例示性互變異構化包括酮相對於烯醇、醯胺相對於醯亞胺、內醯胺相對於內醯亞胺、烯胺相對於亞胺及烯胺相對於(不同烯胺)的互變異構化。
亦應理解，具有相同分子式但在其原子之鍵結性質或順序或其原子之空間排列方面存在不同的化合物稱為「異構物」。原子空間排列不同之異構物稱為「立體異構物」。彼此不為鏡像之立體異構物稱為「非鏡像異構物」且彼此為不可重疊之鏡像的立體異構物稱為「鏡像異構物」。當化合物具有不對稱中心時，例如，其與四個不同基團鍵結時，可能存在一對鏡像異構物。鏡像異構物可以藉由其不對稱中心之絕對組態表徵且藉由Cahn及Prelog之R定序規則及S定序規則，或藉由分子繞偏振光之平面旋轉之方式進行描述且指定為右旋或左旋(亦即，分別為(+)或(-)-異構物)。對掌性化合物可以個別鏡像異構物形式或以其混合物形式存在。含有相等比例之鏡像異構物的混合物稱為「外消旋混合物」。
術語「同質異晶物」係指呈特定晶體填充佈置之化合物(或其鹽、水合物或溶劑合物)之結晶形式。所有同質異晶物具有相同的元素組成。不同的結晶形式通常具有不同的X射線繞射圖案、紅外光譜、熔點、密度、硬度、晶體形狀、光學及電學特性、穩定性及溶解性。再結晶溶劑、結晶速率、儲存溫度及其他因素可使一種結晶形式占主導。化合物之各種同質異晶物可以藉由在不同條件下結晶來製備。
術語「結晶」或「結晶形式」係指實質上展現三維次序的固體形式。在某些實施例中，固體之結晶形式為實質上不為非晶形的固體形式。在某些實施例中，結晶形式之X射線粉末繞射(XRPD)模式包括一或多個清晰界定的峰。
術語「共晶體」係指包含至少兩個不同組分(例如本文所揭示化合物及酸)的結晶結構，其中各組分獨立地為原子、離子或分子。在某些實施例中，組分中無一者為溶劑。在某些實施例中，組分中之至少一者為溶劑。本文所揭示化合物與酸之共晶體不同於由本文所揭示化合物與酸形成之鹽。在鹽中，本文所揭示化合物與酸以自酸至本文所揭示化合物的質子轉移(例如完全質子轉移)容易在室溫下發生的方式錯合。然而，在共晶體中，本文所揭示化合物與酸以自酸至本文所揭示化合物的質子轉移不容易在室溫下發生的方式錯合。在某些實施例中，在共晶體中，不存在自酸至本文所揭示化合物的質子轉移。在某些實施例中，在共晶體中，存在酸至本文所揭示化合物的部分質子轉移。共晶體可適用於改良本文所揭示化合物之特性(例如溶解性、穩定性以及調配容易度)。
術語「同位素」係指特定化學元素之變異體，使得儘管給定元素之所有同位素共用該元素之各原子中之相同質子數目，但彼等同位素在中子數目方面不同。
考慮投與之「個體」包括但不限於人類(亦即，任何年齡組之男性或女性，例如兒科個體(例如，嬰兒、兒童、青少年)或成人個體(例如，年輕人、中年人或老年人))及/或其他非人類動物，例如哺乳動物(例如，靈長類動物(例如，食蟹獼猴、恆河猴)；商業相關的哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、山羊、貓及/或狗)及鳥類(例如，商業相關的鳥類，諸如雞、鴨、鵝及/或火雞)。在某些實施例中，動物為哺乳動物。動物可為雄性或雌性且處於任何發育階段。非人類動物可為轉殖基因動物。「患者」係指需要治療疾病之人類個體。
術語「投與(administer/administering/administration)」係指植入、吸收、攝取、注入、吸入或以其他方式引入本發明化合物或其醫藥組合物。
術語「治療(treatment/treat/treating)」指代逆轉、減緩、延遲本文中所描述之「病理性病況」(例如，疾病、病症或病況，或一或多種病徵或其症狀)之發病，或阻止該「病理性病況」之發展。在一些實施例中，可在已出現或已觀測到一或多種病徵或症狀之後投與治療。在其它實施例中，可在無疾病或病況之病徵或症狀存在下投與治療。舉例而言，治療可在症狀發作之前向易感個體投與(例如，根據症狀病史及/或根據遺傳性或其他易感性因素)。亦可在症狀已消退之後繼續治療，例如以延遲或預防復發。
術語「生物樣本」指代包括以下之任何樣本：組織樣本(諸如組織切片及組織之穿刺生檢)；細胞樣本(例如，細胞學抹片(諸如子宮頸抹片(Pap smear)或血液抹片)或藉由顯微切割獲得之細胞樣本)；整個生物之樣本(諸如酵母或細菌之樣本)；或細胞碎片、片段或細胞器(諸如藉由以離心或以其他方式裂解細胞及分離其組分而獲得)。生物樣本之其他實例包括血液、血清、尿液、精液、糞便物質、腦脊髓液、間質液、黏液、淚液、汗液、膿、生檢組織(例如，藉由外科生檢或穿刺生檢獲得)、乳頭抽出物、乳汁、陰道液、唾液、拭子(諸如，口腔拭子)或含有衍生自第一生物樣本之生物分子的任何物質。 核酸特徵
如本文別處所描述，本發明提供一種醫藥組合物，其包含有包含聚醣部分之經修飾之核酸。如本文所用，術語「經修飾之核酸」係指相比於天然存在之核酸，以一或多種方式進行化學改變之核酸。
在一些實施例中，經修飾之核酸經修飾以使核酸與聚醣部分結合。在一些實施例中，經修飾之核酸包含使得核酸能夠與聚醣部分結合之非核苷酸化學手柄。在一些實施例中，經修飾之核酸包含點擊化學手柄，從而允許與包含第二點擊化學手柄之聚醣部分結合。在一些實施例中，經修飾之核酸包含連接至核苷酸鹼基之點擊化學手柄。在經修飾之核酸包含直鏈核酸之一些實施例中，經修飾之核酸包含連接至聚核苷酸鏈之末端的點擊化學手柄。在一些實施例中，經修飾之核酸包含連接至核酸主鏈之點擊化學手柄。
在一些實施例中，經修飾之核酸係以與核酸之類似天然存在形式相比使得核酸之穩定性增加的方式進行修飾。在一些實施例中，本發明涵蓋此項技術中已知用於產生相比於類似的未經修飾之核酸具有增加之穩定性的經修飾之核酸的任何及所有糖、主鏈及鹼基修飾。在一些實施例中，經修飾之核酸包含至少一種Ochoa等人, Molecules 2020, 25(20), 4659中所描述之化學修飾，其以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，經修飾之核酸可包含至少一個由Ochoa等人在圖1及其中所揭示之表1中所描述之修飾。
在一些實施例中，經修飾之核酸為包含經修飾之主鏈的siRNA。
在一些實施例中，經修飾之核酸以使得免疫反應最小化的方式進行修飾。舉例而言，經修飾之核酸可為經修飾之mRNA，其包含相比於未經修飾之mRNA，在投與個體時引起免疫原性反應減少的一或多種化學修飾。
在一些實施例中，經修飾之核酸為環狀RNA，其中該環狀RNA與天然存在之RNA相比藉由自行接合進而缺乏封端或尾部而經修飾。在一些實施例中，經修飾之核酸為封端RNA，由此5'及/或3'末端藉由化學變化進行封端。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含非天然存在之核苷酸。經修飾之核苷酸(諸如非天然存在之核苷酸)的實例包括(但不限於)二胺基嘌呤、S 2T、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖苷基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖苷基Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二胺基嘌呤。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含至少一個非天然存在之核苷酸。在一些實施例中，至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%之鹼基經修飾，以便成為非天然存在的。在一些實施例中，約100%或所有鹼基經修飾。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含對至少一個磷酸酯基之修飾。在一些實施例中，磷酸酯鍵中之至少一者為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含對至少一個糖基團之修飾。在一些實施例中，經修飾之核酸包含至少一個2-氟核糖。在一些實施例中，經修飾之核酸包含至少一種2-甲氧基核糖。
在一些實施例中，經修飾之核酸不包含任何非天然核苷酸。舉例而言，經修飾之核酸包含僅包含天然存在之核苷酸的核酸部分，且經修飾之核酸僅經修飾，因為核酸部分與聚醣部分結合。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含經修飾之RNA或經修飾之DNA。
在一些實施例中，醫藥組合物包含作為經修飾之裸核酸的經修飾之核酸。如本文所用，術語「裸」係指不經奈米粒子(諸如(但不限於)脂質奈米粒子)調配之經修飾之核酸。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含約15、約20、約25、約30、約50、約100、約500、約1000、約1500、約2000、約2500、約3000、約4000、約5000、約6000、約7000、約8000、約9000或約10000個核苷酸或其間的任何值及範圍。在一些實施例中，經修飾之核酸包含至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約50、至少約100、至少約500、至少約1000、至少約1500、至少約2000、至少約2500、至少約3000、至少約4000、至少約5000、至少約6000、至少約7000、至少約8000、至少約9000或至少約10000個核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核酸包含超過10000個核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核酸包含少於約15個、少於約20個、少於約25個、少於約30個、少於約50個、少於約100個、少於約500個、少於約1000個、少於約1500個、少於約2000個、少於約2500個、少於約3000個、少於約4000個、少於約5000個、少於約6000個、少於約7000個、少於約8000個、少於約9000個或少於約10000個核苷酸。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含一或多種非天然存在之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核酸包含一或多個非天然存在之核苷酸或經修飾之核苷酸，其經修飾使得其可在經修飾之核酸與聚醣部分之間形成共價鍵。允許與聚醣部分結合的一或多個經修飾之核苷酸可發生在核酸中之任何位置。在某些實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目不同。在某些實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目為1。在其他實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目在經聚醣修飾之1個核苷酸至經聚醣修飾之全部核苷酸的任何位置範圍內。在其他實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目在經聚醣修飾之1個核苷酸至經聚醣修飾之所有核苷酸的任何範圍及其間的任何範圍及個別值範圍內。在某些實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目為2。在某些實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目為3。在某些實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目為5。在某些實施例中，經聚醣修飾之核苷酸的數目為10。在一些實施例中，經修飾之核酸包含至少一個經化學修飾之含氮鹼基。在一些實施例中，經修飾之核酸包含兩個、三個、四個、五個或更多個經化學修飾之含氮鹼基。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含經修飾之RNA。在本文所描述之任何實施例中，在整個本發明中，在此類實施例係指經修飾之核酸之情況下，實施例應理解為亦適用於經修飾之RNA。經修飾之RNA可為全部髮夾RNA或短髮夾RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、嚮導RNA (gRNA)、轉移RNA (tRNA)、反義RNA (asRNA)、異質核RNA (hnRNA)、編碼RNA、非編碼RNA (ncRNA)、長非編碼RNA (長ncRNA或lncRNA)、衛星RNA、病毒衛星RNA、信號識別粒子RNA、小細胞質RNA、小核RNA (snRNA)、核糖體RNA (rRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、聚肌胞苷酸、核糖核酸酶、彈性酶(flexizyme)、小核仁RNA (snoRNA)、剪接前導RNA、病毒RNA、病毒衛星RNA、環狀RNA、裸RNA、胞外RNA (exRNA)、小卡哈爾體RNA (small cajal body-specific RNA，scaRNA)、Xist RNA或HOTAIR RNA。在一些實施例中，經修飾之核酸包含經修飾之RNA，其包含微小RNA結合部分。在一些實施例中，經修飾之RNA包含編碼多肽之序列。在一些實施例中，經修飾之RNA為經修飾之裸RNA。在一些實施例中，經修飾之RNA為直鏈RNA。在一些實施例中，經修飾之RNA為環狀RNA。在一些實施例中，經修飾之RNA為mRNA。在一些實施例中，經修飾之RNA為miRNA。
在一些實施例中，醣RNA包含編碼嵌合抗原受體之序列。嵌合抗原受體可包含抗原結合域、跨膜域及胞內域。在一些實施例中，抗原結合蛋白包含抗原結合域、跨膜域及胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗原結合域連接至跨膜域，該跨膜域連接至細胞內信號傳導域以產生嵌合抗原受體。在一些實施例中，抗原結合域結合至腫瘤抗原、耐受原或病原體抗原，或抗原為腫瘤抗原或病原體抗原。在一些實施例中，抗原結合域為抗體或其抗體片段(例如，scFv、Fv、Fab、dAb)。在一些實施例中，抗原結合域為雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體具有結合第一抗原決定基之第一免疫球蛋白可變域及結合第二抗原決定基之第二免疫球蛋白可變域。在一些實施例中，第一抗原決定基及第二抗原決定基相同。在一些實施例中，第一抗原決定基及第二抗原決定基不同。
在一些實施例中，跨膜域連接結合域及胞內信號傳導域。在一些實施例中，跨膜域為鉸鏈蛋白(例如免疫球蛋白鉸鏈)、多肽連接子(例如GS連接子)、KIR2DS2鉸鏈、CD8a鉸鏈或間隔子。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含T細胞信號傳導分子之至少一部分。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含基於免疫受體酪胺酸之活化模體。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含CD3ζ、常見FcRγ (FCER1G)、FcγRlla、FcRβ (Fc ε Rib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12或其任何組合的至少一部分。在一些實施例中，胞內信號傳導域進一步包含共刺激胞內信號傳導域。
在一些實施例中，共刺激胞內信號傳導域包含以下中之至少一或多者：TNF受體蛋白質、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子或活化NK細胞受體蛋白質。在一些實施例中，共刺激胞內信號傳導域包含以下中之至少一或多種：CD27、CD28、4-1BB、0X40、GITR、CD30、CD40、PD-1、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、LFA-1、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD103、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、TRAN CE/TRANKL、CD226、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD 160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAMF1、SLAMF8、CD162、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、B7-H3及結合至CD83之配體。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含經修飾之DNA。在本文所描述之任何實施例中，在整個本發明中，在此類實施例係指經修飾之核酸之情況下，實施例應理解為亦適用於經修飾之DNA。在一些實施例中，經修飾之DNA為經修飾之裸DNA。在一些實施例中，經修飾之DNA為直鏈DNA。在一些實施例中，經修飾之DNA為環狀DNA。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含選自表1中所描述之彼等核苷酸序列的核苷酸序列。表1中描述之經修飾之核酸可包含視情況選用之鹼基修飾、視情況選用之糖修飾及/或視情況選用之磷酸酯修飾。在表1中，術語「pos.」係指核酸位置。 表 1- 例示性核酸
參考 編號 序列 SEQ ID NO 視情況選用之鹼基修飾 視情況選用之糖修飾 視情況選用之磷酸酯修飾
I-1 UUUCGAAUCAAUCCAACAGUAGC 3 無 Pos. 1：2-OMe核糖 Pos. 2：2-氟核糖 Pos. 3：2-OMe核糖 Pos. 4：2-氟核糖 Pos. 5：2-OMe核糖 Pos. 6：2-氟核糖 Pos. 7：2-OMe核糖 Pos. 8：2-氟核糖 Pos. 9：2-OMe核糖 Pos. 10：2-氟核糖 Pos. 11：2-OMe核糖 Pos. 12：2-OMe核糖 Pos. 13：2-OMe核糖 Pos. 14：2-氟核糖 Pos. 15：2-OMe核糖 Pos. 16：2-氟核糖 Pos. 17：2-OMe核糖 Pos. 18：2-氟核糖 Pos. 19：2-OMe核糖 Pos. 20：2-氟核糖 Pos. 21：2-OMe核糖: Pos. 22：2-OMe核糖: Pos. 23：2-OMe核糖 Pos. 1：硫代磷酸酯鍵 Pos. 2：硫代磷酸酯鍵 Pos. 3：磷酸酯(標準) Pos. 4：磷酸酯(標準) Pos. 5：磷酸酯(標準) Pos. 6：磷酸酯(標準) Pos. 7：磷酸酯(標準) Pos. 8：磷酸酯(標準) Pos. 9：磷酸酯(標準) Pos. 10：磷酸酯(標準) Pos. 11：磷酸酯(標準) Pos. 12：磷酸酯(標準) Pos. 13：磷酸酯(標準) Pos. 14：磷酸酯(標準) Pos. 15：磷酸酯(標準) Pos. 16：磷酸酯(標準) Pos. 17：磷酸酯(標準) Pos. 18：磷酸酯(標準) Pos. 19：磷酸酯(標準) Pos. 20：磷酸酯(標準) Pos. 21：硫代磷酸酯鍵 Pos. 22：硫代磷酸酯鍵 Pos. 23：磷酸酯(標準)
I-2 UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA 4 5'：Cy5 3' DBCO    Pos. 1：2-氟核糖 Pos. 2：2-OMe核糖 Pos. 3：2-氟核糖 Pos. 4：2-OMe核糖 Pos. 5：2-氟核糖 Pos. 6：2-OMe核糖 Pos. 7：2-氟核糖 Pos. 8：2-OMe核糖 Pos. 9：2-氟核糖 Pos. 10：2-氟核糖 Pos. 11：2-氟核糖 Pos. 12：2-OMe核糖 Pos. 13：2-氟核糖 Pos. 14：2-OMe核糖 Pos. 15：2-氟核糖 Pos. 16：2-OMe核糖 Pos. 17：2-氟核糖 Pos. 18：2-OMe核糖 Pos. 19：2-氟核糖 Pos. 20：2-OMe核糖 Pos. 21：2-氟核糖    Pos. 1：硫代磷酸酯鍵 Pos. 2：硫代磷酸酯鍵 Pos. 3：磷酸酯(標準) Pos. 4：磷酸酯(標準) Pos. 5：磷酸酯(標準) Pos. 6：磷酸酯(標準) Pos. 7：磷酸酯(標準) Pos. 8：磷酸酯(標準) Pos. 9：磷酸酯(標準) Pos. 10：磷酸酯(標準) Pos. 11：磷酸酯(標準) Pos. 12：磷酸酯(標準) Pos. 13：磷酸酯(標準) Pos. 14：磷酸酯(標準) Pos. 15：磷酸酯(標準) Pos. 16：磷酸酯(標準) Pos. 17：磷酸酯(標準) Pos. 18：磷酸酯(標準) Pos. 19：磷酸酯(標準) Pos. 20：磷酸酯(標準) Pos. 21：磷酸酯(標準)   
I-3 UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA 5 5'無 3' DBCO Pos. 1：2-氟核糖: Pos. 2：2-OMe核糖 Pos. 3：2-氟核糖 Pos. 4：2-OMe核糖 Pos. 5：2-氟核糖 Pos. 6：2-OMe核糖 Pos. 7：2-氟核糖 Pos. 8：2-OMe核糖 Pos. 9：2-氟核糖 Pos. 10：2-氟核糖 Pos. 11：2-氟核糖 Pos. 12：2-OMe核糖 Pos. 13：2-氟核糖 Pos. 14：2-OMe核糖 Pos. 15：2-氟核糖 Pos. 16：2-OMe核糖 Pos. 17：2-氟核糖 Pos. 18：2-OMe核糖 Pos. 19：2-氟核糖 Pos. 20：2-OMe核糖 Pos. 21：2-氟核糖 Pos. 1：硫代磷酸酯鍵 Pos. 2：硫代磷酸酯鍵 Pos. 3：磷酸酯(標準) Pos. 4：磷酸酯(標準) Pos. 5：磷酸酯(標準) Pos. 6：磷酸酯(標準) Pos. 7：磷酸酯(標準) Pos. 8：磷酸酯(標準) Pos. 9：磷酸酯(標準) Pos. 10：磷酸酯(標準) Pos. 11：磷酸酯(標準) Pos. 12：磷酸酯(標準) Pos. 13：磷酸酯(標準) Pos. 14：磷酸酯(標準) Pos. 15：磷酸酯(標準) Pos. 16：磷酸酯(標準) Pos. 17：磷酸酯(標準) Pos. 18：磷酸酯(標準) Pos. 19：磷酸酯(標準) Pos. 20：磷酸酯(標準) Pos. 21：磷酸酯(標準)   
I-4 UUCGAAUCAAUCCAACAGUAGC 6 無 Pos. 1：2-氟核糖 Pos. 2：2-OMe核糖 Pos. 3：2-氟核糖 Pos. 4：2-OMe核糖 Pos. 5：2-氟核糖 Pos. 6：2-OMe核糖 Pos. 7：2-氟核糖 Pos. 8：2-OMe核糖 Pos. 9：2-氟核糖 Pos. 10：2-OMe核糖 Pos. 11：2-OMe核糖 Pos. 12：2-OMe核糖 Pos. 13：2-氟核糖 Pos. 14：2-OMe核糖 Pos. 15：2-氟核糖 Pos. 16：2-OMe核糖 Pos. 17：2-氟核糖 Pos. 18：2-OMe核糖 Pos. 19：2-氟核糖 Pos. 20：2-OMe核糖: Pos. 21：2-OMe核糖: Pos. 22：2-OMe核糖 Pos. 1：硫代磷酸酯鍵 Pos. 2：磷酸酯(標準) Pos. 3：磷酸酯(標準) Pos. 4：磷酸酯(標準) Pos. 5：磷酸酯(標準) Pos. 6：磷酸酯(標準) Pos. 7：磷酸酯(標準) Pos. 8：磷酸酯(標準) Pos. 9：磷酸酯(標準) Pos. 10：磷酸酯(標準) Pos. 11：磷酸酯(標準) Pos. 12：磷酸酯(標準) Pos. 13：磷酸酯(標準) Pos. 14：磷酸酯(標準) Pos. 15：磷酸酯(標準) Pos. 16：磷酸酯(標準) Pos. 17：磷酸酯(標準) Pos. 18：磷酸酯(標準) Pos. 19：磷酸酯(標準) Pos. 20：硫代磷酸酯鍵 Pos. 21：硫代磷酸酯鍵 Pos. 22：磷酸酯(標準)
I-5 UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA 7 5'：(Cy5Lumi-Mal)(SHC6)    3'：(NHC6)(DBCO-C6NHS)    Pos. 1：2-氟核糖 Pos. 2：2-OMe核糖 Pos. 3：2-氟核糖 Pos. 4：2-OMe核糖 Pos. 5：2-氟核糖 Pos. 6：2-OMe核糖 Pos. 7：2-氟核糖 Pos. 8：2-OMe核糖 Pos. 9：2-氟核糖 Pos. 10：2-氟核糖 Pos. 11：2-氟核糖 Pos. 12：2-OMe核糖 Pos. 13：2-氟核糖 Pos. 14：2-OMe核糖 Pos. 15：2-氟核糖 Pos. 16：2-OMe核糖 Pos. 17：2-氟核糖 Pos. 18：2-OMe核糖 Pos. 19：2-氟核糖 Pos. 20：2-OMe核糖 Pos. 21：2-氟核糖 Pos. 1：硫代磷酸酯鍵 Pos. 2：硫代磷酸酯鍵 Pos. 3：磷酸酯(標準) Pos. 4：磷酸酯(標準) Pos. 5：磷酸酯(標準) Pos. 6：磷酸酯(標準) Pos. 7：磷酸酯(標準) Pos. 8：磷酸酯(標準) Pos. 9：磷酸酯(標準) Pos. 10：磷酸酯(標準) Pos. 11：磷酸酯(標準) Pos. 12：磷酸酯(標準) Pos. 13：磷酸酯(標準) Pos. 14：磷酸酯(標準) Pos. 15：磷酸酯(標準) Pos. 16：磷酸酯(標準) Pos. 17：磷酸酯(標準) Pos. 18：磷酸酯(標準) Pos. 19：磷酸酯(標準) Pos. 20：磷酸酯(標準) Pos. 21：磷酸酯(標準)   
I-6 UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA 8 5'無 3' 3'：(NHC6)(DBCO-C6NHS) Pos. 1：2-氟核糖 Pos. 2：2-OMe核糖 Pos. 3：2-氟核糖 Pos. 4：2-OMe核糖 Pos. 5：2-氟核糖 Pos. 6：2-OMe核糖 Pos. 7：2-氟核糖 Pos. 8：2-OMe核糖 Pos. 9：2-氟核糖 Pos. 10：2-氟核糖 Pos. 11：2-氟核糖 Pos. 12：2-OMe核糖 Pos. 13：2-氟核糖 Pos. 14：2-OMe核糖 Pos. 15：2-氟核糖 Pos. 16：2-OMe核糖 Pos. 17：2-氟核糖 Pos. 18：2-OMe核糖 Pos. 19：2-氟核糖 Pos. 20：2-OMe核糖 Pos. 21：2-氟核糖    Pos. 1：硫代磷酸酯鍵 Pos. 2：硫代磷酸酯鍵 Pos. 3：磷酸酯(標準) Pos. 4：磷酸酯(標準) Pos. 5：磷酸酯(標準) Pos. 6：磷酸酯(標準) Pos. 7：磷酸酯(標準) Pos. 8：磷酸酯(標準) Pos. 9：磷酸酯(標準) Pos. 10：磷酸酯(標準) Pos. 11：磷酸酯(標準) Pos. 12：磷酸酯(標準) Pos. 13：磷酸酯(標準) Pos. 14：磷酸酯(標準) Pos. 15：磷酸酯(標準) Pos. 16：磷酸酯(標準) Pos. 17：磷酸酯(標準) Pos. 18：磷酸酯(標準) Pos. 19：磷酸酯(標準) Pos. 20：磷酸酯(標準) Pos. 21：磷酸酯(標準)   
I-7 UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA 9 5'：(Cy5Lumi-Mal)(SHC6)    3'：無    Pos. 1：2-氟核糖 Pos. 2：2-OMe核糖 Pos. 3：2-氟核糖 Pos. 4：2-OMe核糖 Pos. 5：2-氟核糖 Pos. 6：2-OMe核糖 Pos. 7：2-氟核糖 Pos. 8：2-OMe核糖 Pos. 9：2-氟核糖 Pos. 10：2-氟核糖 Pos. 11：2-氟核糖 Pos. 12：2-OMe核糖 Pos. 13：2-氟核糖 Pos. 14：2-OMe核糖 Pos. 15：2-氟核糖 Pos. 16：2-OMe核糖 Pos. 17：2-氟核糖 Pos. 18：2-OMe核糖 Pos. 19：2-氟核糖 Pos. 20：2-OMe核糖 Pos. 21：2-氟核糖 Pos. 1：硫代磷酸酯鍵 Pos. 2：硫代磷酸酯鍵 Pos. 3：磷酸酯(標準) Pos. 4：磷酸酯(標準) Pos. 5：磷酸酯(標準) Pos. 6：磷酸酯(標準) Pos. 7：磷酸酯(標準) Pos. 8：磷酸酯(標準) Pos. 9：磷酸酯(標準) Pos. 10：磷酸酯(標準) Pos. 11：磷酸酯(標準) Pos. 12：磷酸酯(標準) Pos. 13：磷酸酯(標準) Pos. 14：磷酸酯(標準) Pos. 15：磷酸酯(標準) Pos. 16：磷酸酯(標準) Pos. 17：磷酸酯(標準) Pos. 18：磷酸酯(標準) Pos. 19：磷酸酯(標準) Pos. 20：磷酸酯(標準) Pos. 21：磷酸酯(標準)      
      式(I) 5'- GGC TGG TCC GAG TGC AGT GGT GTT TAC AAC TAA TTG ATC ACA ACC AGT TAC AGA TTT CT/i5OctdU/ TGT TCC TTC TCC ACT CCC ACT GCT TCA CTT GAC TAG CCT T-3' 1         
式(II) AGUUGGTCCGAGUGUUGUGGGUUAUUGUUAAGUU/i5OctdU/AUUUAACAUUGUCU CCCCCCACAACCGCGCUUGACUAGCUUGCUG 2         
在一些實施例中，經修飾之核酸包含與選自表1中之彼等序列具有至少約70%序列一致性、至少約75%序列一致性、至少約80%序列一致性、至少約85%序列一致性、至少約90%序列一致性、至少約91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少約93%序列一致性、至少約94%序列一致性、至少95%序列一致性、約96%序列一致性、約97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少約99%序列一致性或更高之序列的核苷酸。 聚醣特徵
如本文別處所描述，本發明提供一種醫藥組合物，其包含有包含聚醣部分之經修飾之核酸。在一些實施例中，聚醣部分包含至少一個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少兩個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少三個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少四個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少五個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少六個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少七個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少八個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少九個單醣。在一些實施例中，聚醣部分包含至少十個單醣。聚醣部分可包含至少約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個單醣。在某些實施例中，經修飾之核酸上之每聚醣的糖數目不同。在某些實施例中，經修飾之核酸上之每聚醣糖的數目為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在某些實施例中，經修飾之核酸上之至少一個或全部聚醣含有至少約10個糖殘基。在某些實施例中，經修飾之核酸上之至少一個或全部聚醣含有至少約9個糖殘基。在某些較佳實施例中，經修飾之核酸上之至少一個或全部聚醣含有至少約6個糖殘基。
在一些實施例中，聚醣部分包含GlcNAc、甘露糖、半乳糖、唾液酸及岩藻糖或其組合。在一些實施例中，聚醣部分包含唾液酸、岩藻糖或其組合。在一些實施例中，聚醣部分包含唾液酸。在一些實施例中，聚醣部分包含岩藻糖。在一些實施例中，聚醣部分包含甘露糖。在一些實施例中，聚醣部分包含GlcNAc (N-乙醯基葡糖胺)。在一些實施例中，聚醣部分包含半乳糖。在一些實施例中，聚醣部分包含連接至GlcNAc殘基之岩藻糖。
在一些實施例中，聚醣部分包含雙觸角聚醣，其中雙觸角聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基。在一些實施例中，雙觸角聚醣之第一末端殘基或第二末端殘基中之至少一者包含唾液酸。在一些實施例中，雙觸角聚醣之第一末端殘基或第二末端殘基中之至少一者包含唾液酸殘基，其包含一或多個聚唾液酸末端修飾。在一些實施例中，雙觸角聚醣之第一末端殘基或第二末端殘基中之至少一者包含岩藻糖。在一些實施例中，雙觸角聚醣之第一末端殘基或第二末端殘基中之一者包含岩藻糖且另一者包含唾液酸。
在一些實施例中，聚醣部分包含三觸角聚醣，其中三觸角聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基。在一些實施例中，三觸角聚醣之第一末端殘基、第二末端殘基或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸。在一些實施例中，三觸角聚醣之第一末端殘基、第二末端殘基或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸殘基，其包含一或多個聚唾液酸末端修飾。在一些實施例中，三觸角聚醣之第一末端殘基或第二末端殘基中之至少一者包含岩藻糖。在一些實施例中，三觸角聚醣之第一末端殘基、第二末端殘基或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸，且剩餘末端殘基中之至少一者包含岩藻糖。
在聚醣部分包含雙觸角聚醣或三觸角聚醣之一些實施例中，聚醣包含連接至聚醣之核心或鹼基區域中之GlcNAc殘基的岩藻糖。在聚醣部分包含雙觸角聚醣或三觸角聚醣之一些實施例中，聚醣包含連接至聚醣之樹狀、分支或臂區域中之GlcNAc殘基的岩藻糖。
在一些實施例中，聚醣部分包含二等分聚醣。在一些實施例中，聚醣部分包含雙觸角聚醣，該雙觸角聚醣包含結合於單醣之GlcNAc部分，該單醣連接雙觸角聚醣之兩個分支，由此形成二等分聚醣。
在一些實施例中，聚醣部分為N-連接之聚醣，使得聚醣經由氮原子與經修飾之核酸結合。
在一些實施例中，聚醣部分包含在非還原末端包含N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之結合手柄。如本文中所使用，術語「非還原末端GlcNAc」及「在非還原末端處之GlcNAc」係指為聚醣部分之一部分且形成該聚醣之末端的GlcNAc單醣殘基。作為一說明性實例，在例示性聚醣G-1中，IUPAC名稱末端之「 GlcNAc(b1- 」為非還原末端GlcNAc： GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)] GlcNAc(b1-
在一些實施例中，聚醣部分包含在非還原末端包含GlcNAc之聚醣，其進一步包含共價結合至聚醣之非還原末端GlcNAc之天冬醯胺殘基。在一些實施例中，天冬醯胺殘基共價結合至聚醣之非還原末端GlcNAc，如圖所示：
Figure 02_image003
，其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點且**指示與經修飾之RNA的連接點或連接至經修飾之RNA的連接子基團。
在一些實施例中，天冬醯胺殘基共價結合至非還原末端GlcNAc，如圖所示：
Figure 02_image005
其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點。
在一些實施例中，聚醣部分包含在非還原末端包含GlcNAc之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之精胺酸殘基。在一些實施例中，聚醣部分包含在非還原末端包含GlcNAc之聚醣，其進一步包含直接或經由連接子基團共價結合至非還原末端GlcNAc之疊氮化物點擊化學手柄。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含一或多個聚乙二醇單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含1至10個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含一個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含兩個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含三個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含四個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含五個PEG單元。
在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含一或多個肽殘基。
在一些實施例中，聚醣部分包含在非還原末端包含GlcNAc之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之結合手柄，其中該結合手柄包含胺氧基-PEG3-疊氮化物：
Figure 02_image007
，或其係關於作為整體之醣核酸結合物，為胺氧基-PEG3-疊氮化物與連接至醣核酸結合物之核酸部分的炔烴部分之間的點擊化學反應之產物。
在一些實施例中，聚醣部分包含在非還原末端包含GlcNAc之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之胺氧基-PEG3-疊氮化物，如圖所示：
Figure 02_image009
，其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點。
在一些實施例中，聚醣部分包含在非還原末端包含GlcNAc之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之連接子，如圖所示：
Figure 02_image011
，其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點且**指示與經修飾之RNA的連接點或連接至經修飾之RNA的連接子基團。
在一些實施例中，聚醣部分包含選自圖7A-圖7C中描繪之彼等者的聚醣。在一些實施例中，聚醣部分包含選自描繪於圖7A中之彼等的聚醣。在一些實施例中，聚醣部分包含選自描繪於圖7B中之彼等的聚醣。在一些實施例中，聚醣部分包含選自描繪於圖7C中之彼等的聚醣。
在一些實施例中，聚醣部分包含選自表2A中所描述之彼等聚醣的聚醣： 表 2A- 例示性聚醣
參考 編號 IUPAC 名稱
G-1 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1-
G-2 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1-
G-3 Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-4 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-5 NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-6 Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-7 Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-8 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-9 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-10 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
G-11 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1-
G-34 Neu5Ac(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1-
在一些實施例中，聚醣部分為或包含藉由置換單個單醣而不同於表2A中列舉之聚醣的聚醣。在一些實施例中，聚醣部分為或包含藉由置換兩個單醣而不同於表2A中列舉之聚醣的聚醣。作為非限制性實例，聚醣部分可包含表2A中所引述之聚醣，其中甘露糖經半乳糖置換(或反之亦然)，但其他方面剩餘聚醣部分保持相同。
在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之結合手柄。
在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之天冬醯胺殘基。在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之任一個聚醣中所示的聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之天冬醯胺殘基，如圖所示：
Figure 02_image013
其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點且**指示與經修飾之RNA的連接點或連接至經修飾之RNA的連接子基團。
在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之天冬醯胺殘基，如圖所示：
Figure 02_image015
其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點。
在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之精胺酸殘基。在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含直接或經由連接子基團共價結合至非還原末端GlcNAc之疊氮化物點擊化學手柄。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含一或多個肽殘基。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含一或多個聚乙二醇(PEG)單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含1至10個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含一個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含兩個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含三個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含四個PEG單元。在一些實施例中，橋接非還原末端GlcNAc及疊氮化物之連接子基團包含五個PEG單元。
在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之結合手柄，其中該結合手柄包含胺基氧-PEG3-疊氮化物：
Figure 02_image017
，或其係關於作為整體之醣核酸結合物，為胺氧基-PEG3-疊氮化物與連接至醣核酸結合物之核酸部分的炔烴部分之間的點擊化學反應之產物。
在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之胺氧基-PEG3-疊氮化物，如圖所示：
Figure 02_image019
其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點。
在一些實施例中，聚醣部分包含表2A中所描述之聚醣，其進一步包含共價結合至非還原末端GlcNAc之連接子，如圖所示：
Figure 02_image021
其中，*指示與聚醣之非還原末端GlcNAc的連接點且**指示與經修飾之RNA的連接點或連接至經修飾之RNA的連接子基團。
在一些實施例中，聚醣部分包含選自表2B中所描述之彼等聚醣的聚醣： 表 2B- 例示性經修飾之聚醣
參考 編號 IUPAC 名稱
G-12 Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-13 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-14 NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-15 Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-16 Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-17 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-18 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-19 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-20 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-21 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-22 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-23 Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-24 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-25 NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-26 Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-27 Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-28 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-29 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-30 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-31 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-32 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-33 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-35 Neu5Ac(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物
G-36 Neu5Ac(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
聚醣 - 核酸結合特徵
如上文所描述，在一個態樣中，本發明提供一種醣核酸，其包含：i)經修飾之核酸；及ii)至少一個與經修飾之核酸結合的聚醣部分。
在一些實施例中，經修飾之核酸經由氮原子與聚醣部分結合。在一些實施例中，經修飾之核酸經由醯胺鍵與聚醣部分結合。在一些實施例中，聚醣部分為N-連接之聚醣，其中該聚醣經由天冬醯胺之醯胺氮或精胺酸殘基經由N-乙醯基葡糖胺殘基連接。
在一些實施例中，經修飾之核酸經由點擊化學反應與聚醣結合。在一些實施例中，經修飾之核酸部分包含第一點擊化學手柄且聚醣部分包含第二點擊化學手柄，使得經修飾之核酸部分及聚醣部分藉由由第一與第二手柄之間的點擊化學反應形成的化學部分共價連接。在一些實施例中，經修飾之核酸部分包含炔烴手柄且聚醣部分包含疊氮化物手柄，使得經修飾之核酸部分與聚醣部分藉由由疊氮化物手柄與炔烴手柄之間的點擊化學反應形成之化學部分共價連接。在一些實施例中，經修飾之核酸部分包含炔烴手柄且聚醣部分包含疊氮化物手柄，使得經修飾之核酸部分與聚醣部分藉由由疊氮化物手柄與炔烴手柄之間的點擊化學反應形成的三唑共價連接。在一些實施例中，經修飾之核酸部分包含疊氮化物手柄且聚醣部分包含炔烴手柄，使得經修飾之核酸部分與聚醣部分藉由由疊氮化物手柄與炔烴手柄之間的點擊化學反應形成的化學部分共價連接。在一些實施例中，經修飾之核酸部分包含疊氮化物手柄且聚醣部分包含炔烴手柄，使得經修飾之核酸部分與聚醣部分藉由由疊氮化物手柄與炔烴手柄之間的點擊化學反應形成的三唑共價連接。
在一些實施例中，經修飾之核酸部分包含核糖之修飾，使得核糖用能夠進行點擊化學反應之疊氮化物部分進行修飾。在一些實施例中，經修飾之核酸部分包含核糖之修飾，使得核糖用能夠進行點擊化學反應之炔烴部分進行修飾。在一些實施例中，核糖在選自2'OH、3'OH及5'OH之位置處經修飾。
在一些實施例中，聚醣部分之非還原端包含能夠進行點擊化學反應之疊氮化物部分。在一些實施例中，聚醣部分之非還原端包含能夠進行點擊化學反應之炔烴部分。
在一些實施例中，經修飾之核酸經由較強非共價相互作用與聚醣結合。在一些實施例中，經修飾之核酸經由高親和力生物素/鏈黴抗生物素蛋白相互作用與聚醣結合。在一些實施例中，經修飾之核酸包含生物素部分且聚醣包含鏈黴抗生物素蛋白部分，使得生物素與鏈黴抗生物素蛋白部分相互作用。在一些實施例中，經修飾之核酸包含鏈黴抗生物素蛋白部分且聚醣包含生物素部分，使得生物素與鏈黴抗生物素蛋白部分相互作用。
在一些實施例中，經修飾之核酸經由共價結合至經修飾之核酸之末端的連接子基團與聚醣結合。在一些實施例中，經修飾之核酸經由共價結合至聚核苷酸中間之經化學修飾之核苷酸的連接子與聚醣結合。在一些實施例中，經修飾之核酸經由插入聚核苷酸中間之兩個核苷酸之間的化學手柄與聚醣結合。
在一些實施例中，經修飾之核酸包含核酸與聚醣部分之間的可裂解連接子。在一些實施例中，可裂解連接子為pH依賴性可裂解鍵。在一些實施例中，可裂解連接子為二硫鍵。在一些實施例中，可裂解連接子為肽裂解位點。在一些實施例中，可裂解連接子為cit-val連接子。
在一些實施例中，經修飾之核酸結合至兩個或更多個聚醣部分。在一些實施例中，兩個或更多個聚醣部分為不同的聚醣部分。在一些實施例中，核酸包含用正交修飾進行修飾之核苷酸，其允許偶合至另外兩個化學上不同的聚醣。舉例而言，核酸可經兩個或更多個不同結合手柄修飾，從而允許選擇性結合至兩個或更多個化學上不同的聚醣，其中聚醣中之每一者包含不同的互補結合手柄。
在一些實施例中，經修飾之核酸經由生物正交反應與一或多種聚醣結合。在一些實施例中，生物正交反應為生物正交點擊化學反應。在一些實施例中，生物正交反應包含應變促進之疊氮化物-炔環加成。在一些實施例中，生物正交反應包含反式環辛烯與四𠯤之反應。 例示性聚醣 - 核酸結合物
在一個態樣中，本發明提供式(I)化合物： A-L-B(I)， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。
在式(I)之某些實施例中， A為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)之核酸； B為天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含連接子。在某些實施例中， L為如本文所定義之任何連接子。
在式(I)之某些實施例中， A為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)之核酸； B為天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由第一點擊化學手柄與第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。
在式(I)之某些實施例中， A為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)之核酸； B為天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由第一點擊化學手柄與第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子，其中第一點擊化學手柄在點擊化學反應之前連接至 A且第二點擊化學手柄在點擊化學反應之前連接至 B。
在某些實施例中，在式(I)中，A為DNA (例如包含第一點擊化學手柄)。在某些實施例中，在式(I)中，A為反義寡核苷酸(ASO)。在某些實施例中，在式(I)中，A為反義寡核苷酸(ASO) (例如包含第一點擊化學手柄)。在某些實施例中，在式(I)中，A為單股DNA (ssDNA)、雙股DNA (dsDNA)、質體DNA (pDNA)、基因體DNA (gDNA)、互補DNA (cDNA)、反義DNA、葉綠體DNA (ctDNA或cpDNA)、微衛星DNA、粒線體DNA (mtDNA或mDNA)、動質體DNA (kDNA)、原病毒、溶源、重複DNA、衛星DNA或病毒DNA。在某些實施例中，在式(I)中，A為單股DNA (ssDNA)、雙股DNA (dsDNA)、質體DNA (pDNA)、基因體DNA (gDNA)、互補DNA (cDNA)、反義DNA、葉綠體DNA (ctDNA或cpDNA)、微衛星DNA、粒線體DNA (mtDNA或mDNA)、動質體DNA (kDNA)、原病毒、溶源、重複DNA、衛星DNA或病毒DNA；其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為包含以下序列之DNA：
Figure 02_image023
在某些實施例中，A具有與SEQ ID NO: 1之全長序列具有至少70%序列一致性、至少75%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性或至少90%序列一致性、至少92%序列一致性、至少95%序列一致性或至少98%序列一致性的序列。在某些實施例中，A具有與SEQ ID NO: 1之全長序列具有至少80%序列一致性之序列。
在某些實施例中，在式(I)中，A為RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為小干擾RNA (siRNA)。在某些實施例中，在式(I)中，A為小干擾RNA (siRNA)，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為包含修飾(例如在2'位置)之siRNA。在某些實施例中，在式(I)中，A為siRNA，其包含選自由以下組成之群的修飾：2'OMe修飾、氟修飾(例如在2'位置)、硫代磷酸酯修飾。在某些實施例中，在式(I)中，A為siRNA，其包含選自由以下組成之群的修飾：2'OMe修飾、氟修飾、硫代磷酸酯修飾，其亦包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為mRNA。在某些實施例中，在式(I)中，A為mRNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為嚮導RNA。在某些實施例中，在式(I)中，A為嚮導RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為環狀RNA (circRNA)。在某些實施例中，在式(I)中，A為環狀RNA (環狀RNA)，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為適體RNA。在某些實施例中，在式(I)中，A為適體RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式(I)中，A為單股RNA (ssRNA)、雙股RNA (dsRNA)、小干擾RNA (siRNA)、信使RNA (mRNA)、前驅信使RNA (pre-mRNA)、小髮夾RNA或短髮夾RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、嚮導RNA (gRNA)、轉移RNA (tRNA)、反義RNA (asRNA)、異質核RNA (hnRNA)、編碼RNA、非編碼RNA (ncRNA)、長非編碼RNA (長ncRNA或lncRNA)、衛星RNA、病毒衛星RNA、信號識別粒子RNA、小細胞質RNA、小核RNA (snRNA)、核糖體RNA (rRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、聚肌胞苷酸、核糖核酸酶、彈性酶、小核仁RNA (snoRNA)、剪接前導RNA、病毒RNA或病毒衛星RNA。在某些實施例中，在式(I)中，A為單股RNA (ssRNA)、雙股RNA (dsRNA)、小干擾RNA (siRNA)、信使RNA (mRNA)、前驅信使RNA (pre-mRNA)、小髮夾RNA或短髮夾RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、嚮導RNA (gRNA)、轉移RNA (tRNA)、反義RNA (asRNA)、異質核RNA (hnRNA)、編碼RNA、非編碼RNA (ncRNA)、長非編碼RNA (長ncRNA或lncRNA)、衛星RNA、病毒衛星RNA、信號識別粒子RNA、小細胞質RNA、小核RNA (snRNA)、核糖體RNA (rRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、聚肌胞苷酸、核糖核酸酶、彈性酶、小核仁RNA (snoRNA)、剪接前導RNA、病毒RNA或病毒衛星RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，A具有與以下全長序列具有至少70%序列一致性、至少75%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少92%序列一致性、至少95%序列一致性或至少98%序列一致性的序列：
Figure 02_image025
在某些實施例中，A具有與SEQ ID NO: 2之全長序列具有至少80%序列一致性之序列。在某些實施例中，在式(I)中，A為包含SEQ ID NO: 2之RNA。
在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由雙正交點擊化學反應形成之連接子(例如銅催化之疊氮化物-炔烴環化(CuAAC)、應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)、反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合、反式環辛烯-四𠯤接合、烯烴-四𠯤接合、一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯、反式環辛炔-疊氮化物偶合或環丙烷-疊氮化物偶合、疊氮化物-施陶丁格接合(azide-Staudinger ligation))。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由雙正交點擊化學反應形成之連接子(例如銅催化之疊氮化物-炔烴環化(CuAAC)、應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)、反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合、反式環辛烯-四𠯤接合、一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯、反式環辛炔-疊氮化物偶合或環丙烯-疊氮化物偶合、疊氮化物-施陶丁格接合)。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由第一點擊化學手柄與第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由以下表3或4中所示之第一點擊化學手柄與第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。在某些實施例中，在式(I)中，L包含由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為銅催化之疊氮化物-炔烴環化(CuAAC)。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為無銅反應。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)、反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合、反式環辛烯-四𠯤接合、疊氮化物-施陶丁格接合、一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯、反式環辛炔-疊氮化物偶合或環丙烯-疊氮化物偶合。在某些實施例中，在式(I)中，L包含由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合或反式環辛烯-四𠯤接合。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為反式環辛烯-四𠯤接合。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為疊氮化物-施陶丁格接合、一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯、反式環辛炔-疊氮化物偶合或環丙烷-疊氮化物偶合。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為疊氮化物-施陶丁格接合。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為反式環辛炔-疊氮化物偶合。在某些實施例中，在式(I)中，L包含藉由點擊化學反應形成之連接子，該點擊化學反應為環丙烷-疊氮化物偶合。
點擊化學手柄(click chemistry handle)或點擊化學手柄(click-chemistry handle)可為反應物或反應性基團，其可參與點擊化學反應。舉例而言，應變炔烴(例如環辛炔)為點擊化學手柄，因為其可發生應變促進之環加成。一般而言，點擊化學反應需要至少兩個包含可彼此反應之點擊化學手柄的分子。彼此可反應之此類點擊化學手柄對在本文中有時被稱作搭配物點擊化學手柄。舉例而言，疊氮化物為環辛炔或任何其他炔烴之搭配物點擊化學手柄。適合於根據本發明之一些態樣使用之例示性點擊化學手柄(點擊化學手柄1及點擊化學手柄2)描述於本文中，例如表3及表4中。其他適合點擊化學手柄為熟習此項技術者已知。對於經由點擊化學結合之兩個分子，分子之點擊化學手柄可與彼此反應，例如，此係因為點擊化學手柄中之一者的反應性部分可與第二點擊化學手柄之反應性部分反應以形成共價鍵。此類反應成對之點擊化學手柄為熟習此項技術者所熟知且包括(但不限於)表3中描述之彼等者： 表 3- 例示性點擊化學手柄及反應
流程 反應名稱
Figure 02_image027
末端              疊氮化物 炔烴 		1,3-雙極環加成
Figure 02_image029
應變                 疊氮化物 炔烴 		應變促進之環加成
Figure 02_image031
二烯        親二烯物 		狄爾斯-阿爾德反應(Diels-Alder reaction)
Figure 02_image033
硫醇              烯烴 		硫醇-烯反應
表3提供點擊化學手柄及反應之實例。R、R1及R2可表示包含分選酶識別模體之任何分子。在一些實施例中，R、R1及R2在每次出現時獨立地為RR-LPXT-[X] y-或-[X] y-LPXT-RR，其中X在每次出現時獨立地表示任何胺基酸殘基，y在每次出現時為0與10之間的整數(包括端點)，且RR在每次出現時獨立地表示蛋白質或試劑(例如蛋白質、肽、可偵測標記、結合劑、小分子等)即視情況選用之額外連接子。
在一些實施例中，使用點擊化學手柄，其可在無金屬催化劑存在下反應形成共價鍵。此類點擊化學手柄為熟習此項技術者所熟知，且包括描述於以下中之點擊化學手柄：Becer, Hoogenboom, and Schubert, Click Chemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition, Angewandte Chemie International Edition (2009) 48: 4900 - 4908。參見以下表4。 表 4- 例示性點擊化學手柄及反應
   試劑 A 試劑 B 機制 反應之備註
0 疊氮化物 炔烴 Cu催化之[3+2]疊化物-炔烴環加成(CuAAC) 在60℃下於H 2O中2小時
1 疊氮化物 環辛炔 應變促進之[3+2]疊化物-炔烴環加成(SPAAC) 在室溫下1小時
2 疊氮化物 經活化之炔烴 [3+2]胡伊斯根環加成(Huisgen cycloaddition) 在50℃下4小時
3 疊氮化物 缺電子之炔烴 [3+2]環加成 在室溫下於H 2O中12小時
4 疊氮化物 芳炔 [3+2]環加成 在室溫下於含有冠醚之THF中4小時，或在室溫下於CH 3CN中24小時
5 四𠯤 烯烴 狄爾斯-阿爾德逆-[4+2]環加成 在25℃下40分鐘(100%產率)；N 2僅為副產物
6 四唑 烯烴 1,3-雙極環加成(光點擊) UV照射極少分鐘且隨後在4℃下隔夜
7 二硫酯 二烯 雜-狄爾斯-阿爾德環加成 在室溫下10分鐘
8 蒽 順丁烯二醯亞胺 [4+2]狄爾斯-阿爾德反應 在回流下於甲苯中2天
9 硫醇 烯烴 自由基添加(硫基點擊) UV(定量濃度) 30分鐘或UV照射(＞96%) 24小時
10 硫醇 烯酮 邁克爾加成(Michael addition) 在室溫下於CH 3CN中24小時
11 硫醇 順丁烯二醯亞胺 邁克爾加成 在40℃下於THF中1小時或在室溫下於二㗁烷中16小時
12 硫醇 對-氟 親核取代 在室溫下於DMF中隔夜或在40℃下於DMF中60分鐘
13 胺 對-氟 親核取代 在95℃下於NMP溶劑中微波20分鐘
RT=室溫，DMF=N,N-二甲基甲醯胺，NMP=N-甲基吡咯啶酮，THF=四氫呋喃，CH 3CN=乙腈
在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為炔烴。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為炔烴，例如其中該炔烴包含以下結構：
Figure 02_image035
在某些實施例中，核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸鹼基之炔烴。在某些實施例中， A包含以下結構：
Figure 02_image037
(5-辛二炔基dU, 亦稱為i5OctdU)，且 A為RNA或DNA。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為烯烴(乙烯基)，且 B包含第二點擊化學手柄，其為四𠯤。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為以下中之烯烴(乙烯基) (例如Kubota等人中之圖2B及/或2C)：Kubota等人, 「Expanding the Scope of RNA Metabolic Labeling with Vinyl Nucleosides and Inverse Electron-Demand Diels-Alder Chemistry.」 ACS Chemical Biology第14卷,8 (2019): 1698-1707，其以引用之方式併入本文中。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為以下中之烯烴(乙烯基) (例如Kubota等人中之圖2B及/或2C)，以及第二點擊化學手柄，其為以下中之四𠯤(例如Kubota等人中之圖3A)：Kubota等人, 「Expanding the Scope of RNA Metabolic Labeling with Vinyl Nucleosides and Inverse Electron-Demand Diels-Alder Chemistry.」 ACS Chemical Biology 第14卷,8 (2019): 1698-1707，其以引用之方式併入本文中。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為烯烴，其中 A包含
Figure 02_image039
Figure 02_image041
Figure 02_image043
。
在某些實施例中，L為或包含經取代或未經取代之伸烷基、伸炔基、經取代或未經取代之伸烯基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸碳環基、經取代或未經取代之伸雜環基、經取代或未經取代之伸芳基、經取代或未經取代之伸雜芳基、-O-、-N(R A)-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NR A-、-NR AC(=O)-、-NR AC(=O)R A-、-C(=O)R A-、-NR AC(=O)O-、-NR AC(=O)N(R A)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-OC(=O)N(R A)-、-S(O) 2NR A-、-NR AS(O) 2-或其組合；且R A各自獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基。
在某些實施例中，L為或包含經取代或未經取代之伸烷基、伸炔基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸碳環基、經取代或未經取代之伸雜環基、經取代或未經取代之伸芳基、經取代或未經取代之伸雜芳基、-O-、-N(R A)-、-S-或其組合；且R A各自獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基。
在某些實施例中，L為或包含經取代或未經取代之伸烷基、伸炔基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸碳環基、經取代或未經取代之伸雜環基、經取代或未經取代之伸芳基、經取代或未經取代之伸雜芳基、-O-或其組合。
在某些實施例中，L為或包含經取代或未經取代之伸烷基、伸炔基、經取代或未經取代之伸碳環基、經取代或未經取代之伸雜環基、經取代或未經取代之伸芳基、經取代或未經取代之伸雜芳基、-O-或其組合。
在某些實施例中，L為或包含伸炔基、經取代或未經取代之伸烷基及經取代或未經取代之伸雜芳基之組合。在某些實施例中，L為或包含伸炔基、未經取代之伸烷基及未經取代之伸雜芳基之組合。
在某些實施例中，L為或包含經取代或未經取代之伸雜芳基。在某些實施例中，L為或包含經取代或未經取代之5至6員伸雜芳基。在某些實施例中，L為或包含在雜芳基環中具有2至3個氮原子之經取代或未經取代之5至6員伸雜芳基。在某些實施例中，L為或包含在雜芳基環中具有2至3個氮原子之經取代或未經取代之5員伸雜芳基。在某些實施例中，L為或包含經取代或未經取代之三唑。
在某些實施例中，L包含經取代或未經取代之伸雜環基。在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸碳環基稠合之經取代或未經取代之伸雜環基。在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸環辛基稠合之經取代或未經取代之伸雜環基。在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸環辛基稠合之經取代或未經取代之6員伸雜環基。在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸環辛基稠合之經取代或未經取代之二氫嗒𠯤。在某些實施例中，L包含與未經取代之伸環辛基稠合之經取代之二氫嗒𠯤。在某些具體例中，L包含八氫環辛烯[d]嗒𠯤。
在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸碳環基稠合之經取代或未經取代之伸雜芳基。在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸環辛基稠合之經取代或未經取代之伸雜芳基。在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸環辛基稠合之經取代或未經取代之5員伸雜芳基。在某些實施例中，L包含與經取代或未經取代之伸環辛基稠合之經取代或未經取代之三唑。
在某些實施例中，在式(I)中，L具有下式：
Figure 02_image045
Figure 02_image047
Figure 02_image049
，其中*指示與A之連接點，且#指示與B之連接點。在某些實施例中，在式(I)中，L具有下式：
Figure 02_image051
Figure 02_image053
，其中*指示與A之連接點，且#指示與B之連接點。在某些實施例中具有下式：
Figure 02_image055
，其中*指示與A之連接點，且#指示與B之連接點。
在某些實施例中，在式( I)中，L連接至核酸 A之鹼基。在某些實施例中，在式( I)中，L連接至核酸 A之核糖之2'OH位置、核糖或去氧核糖之3'OH位置或核糖或去氧核糖之5'OH位置。在某些實施例中，在式( I)中，L連接至核酸 A之核糖之2'OH位置。在某些實施例中，在式( I)中，L連接至核酸 A之核糖或去氧核糖之3'OH位置。在某些實施例中，在式( I)中，L連接至核酸 A之內部部分、核酸 A之3'端或核酸 A之5'端。在某些實施例中，在式( I)中，L連接至核酸 A之內部。在某些實施例中，在式( I)中， A為環狀RNA (circRNA)，且L連接至 A之內部。在某些實施例中，在式( I)中，L連接至核酸 A之核糖或去氧核糖之5'OH位置。在某些實施例中，在式( I)中，L連接至N-聚醣 B之非還原末端。在某些實施例中， B為N-聚醣，其為單觸角N-聚醣、雙觸角N-聚醣、三觸角N-聚醣或五觸角N-聚醣。在某些實施例中， B為N-聚醣，其為單觸角N-聚醣。在某些實施例中， B為N-聚醣，其為雙觸角N-聚醣。在某些實施例中， B為N-聚醣，其為三觸角N-聚醣。在某些實施例中， B為N-聚醣，其為五觸角N-聚醣。在某些實施例中， B為包含唾液酸之N-聚醣。在某些實施例中， B為下式之N-聚醣：
Figure 02_image057
。 N-聚醣B及式(I)化合物中之符號之結構一般如一般熟習此項技術者所識別之用於聚醣化學之標準命名法(例如，其中正方形表示N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)，黑圈表示D-甘露糖(Man)，三角形表示L-岩藻糖(Fuc)，光圈表示D-半乳糖(Gal)，且菱形表示唾液酸；且作為另一實例，如聚醣的符號命名法中(SNFG)指定，聚醣可在NCBI網站上找到。
在某些實施例中，式(I)化合物為圖9中所示之化合物。在一些實施例中，式(I)化合物為圖9中所示之化合物，其中A為siRNA。在一些實施例中，式(I)化合物為圖9中所示之化合物，其中A為ASO。在一些實施例中，式(I)化合物為圖9中所示之化合物，其中A為mRNA。在一些實施例中，式(I)化合物為圖9中所示之化合物，其中A為適體。在一些實施例中，式(I)化合物為圖9中所示之化合物，其中A為環狀RNA (circRNA)。在一些實施例中，式(I)化合物為圖9中所示之化合物，其中A為嚮導RNA。
在某些實施例中，式(I)化合物包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合至G-28以形成：
Figure 02_image059
。
在某些實施例中，式(I)化合物包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合至G-35以形成：
Figure 02_image061
。
在某些實施例中，式(I)化合物包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合至G-29以形成：
Figure 02_image063
。
在某些實施例中，式(I)化合物包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合至G-30以形成：
Figure 02_image065
。
在一些實施例中，式(I)化合物為上文所描述之化合物中之任一者，或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物。
在某些實施例中，式( I)化合物不為以下所揭示(例如，圖4中，圖1至圖4中之任一者所揭示)之核酸-聚醣結合物：Flynn等人, Mammalian Y RNAs are modified at discrete guanosine residues with N-glycans, bioRxiv, 2019年9月30日。 製造聚醣 - 核酸結合物之例示性方法
本發明提供用於製備式( I)化合物之方法： A-L-B(I)， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)； 且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子； 該方法包含第一步驟：使包含第一點擊化學手柄之核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)之核酸A與化合物B反應，該化合物B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；其中第一步驟之反應在雙正交點擊化學條件下進行。
在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中，取代基 A、 B及連接子 L如本文所描述。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A為DNA或RNA，例如ASO、siRNA、mRNA、嚮導RNA、環狀RNA或適體RNA。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A為DNA (例如包含第一點擊化學手柄)。在某些實施例中，在式( I)中， A為反義寡核苷酸(ASO)。在某些實施例中，在式( I)中， A為反義寡核苷酸(ASO) (例如包含第一點擊化學手柄)。在某些實施例中，在式( I)中， A為siRNA、mRNA、嚮導RNA、環狀RNA或適體RNA。在某些實施例中，在式( I)中， A為單股DNA (ssDNA)、雙股DNA (dsDNA)、質體DNA (pDNA)、基因體DNA (gDNA)、互補DNA (cDNA)、反義DNA、葉綠體DNA (ctDNA或cpDNA)、微衛星DNA、粒線體DNA (mtDNA或mDNA)、動質體DNA (kDNA)、原病毒、溶源、重複DNA、衛星DNA或病毒DNA。在某些實施例中，在式( I)中， A為單股DNA (ssDNA)、雙股DNA (dsDNA)、質體DNA (pDNA)、基因體DNA (gDNA)、互補DNA (cDNA)、反義DNA、葉綠體DNA (ctDNA或cpDNA)、微衛星DNA、粒線體DNA (mtDNA或mDNA)、動質體DNA (kDNA)、原病毒、溶源、重複DNA、衛星DNA或病毒DNA；其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A為包含SEQ ID NO: 1之DNA。在某些實施例中， A具有與SEQ ID NO: 1之全長序列具有至少70%序列一致性、至少75%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少92%序列一致性、至少95%序列一致性或至少98%序列一致性的序列。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A具有與SEQ ID NO: 1之全長序列具有至少80%序列一致性之序列。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A為DNA，其中DNA包含SEQ ID NO: 1。
在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A為RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式( I)中， A為小干擾RNA (siRNA)。在某些實施例中，在式( I)中， A為小干擾RNA (siRNA)，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式( I)中， A為siRNA，其包含選自由以下組成之群的修飾：2'OMe修飾、氟修飾、硫代磷酸酯修飾。在某些實施例中，在式( I)中， A為siRNA，其包含選自由以下組成之群的修飾：2'OMe修飾、氟修飾、硫代磷酸酯修飾，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式( I)中， A為mRNA。在某些實施例中，在式( I)中， A為mRNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式( I)中， A為嚮導RNA。在某些實施例中，在式( I)中， A為嚮導RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式( I)中， A為環狀RNA (circRNA)。在某些實施例中，在式( I)中， A為環狀RNA (環狀RNA)，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式( I)中， A為適體RNA。在某些實施例中，在式( I)中， A為適體RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中，在式( I)中， A為單股RNA (ssRNA)、雙股RNA (dsRNA)、小干擾RNA (siRNA)、信使RNA (mRNA)、前驅信使RNA (pre-mRNA)、小髮夾RNA或短髮夾RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、嚮導RNA (gRNA)、轉移RNA (tRNA)、反義RNA (asRNA)、異質核RNA (hnRNA)、編碼RNA、非編碼RNA (ncRNA)、長非編碼RNA (長ncRNA或lncRNA)、衛星RNA、病毒衛星RNA、信號識別粒子RNA、小細胞質RNA、小核RNA (snRNA)、核糖體RNA (rRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、聚肌胞苷酸、核糖核酸酶、彈性酶、小核仁RNA (snoRNA)、剪接前導RNA、病毒RNA或病毒衛星RNA。在某些實施例中，在式( I)中， A為單股RNA (ssRNA)、雙股RNA (dsRNA)、小干擾RNA (siRNA)、信使RNA (mRNA)、前驅信使RNA (pre-mRNA)、小髮夾RNA或短髮夾RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、嚮導RNA (gRNA)、轉移RNA (tRNA)、反義RNA (asRNA)、異質核RNA (hnRNA)、編碼RNA、非編碼RNA (ncRNA)、長非編碼RNA (長ncRNA或lncRNA)、衛星RNA、病毒衛星RNA、信號識別粒子RNA、小細胞質RNA、小核RNA (snRNA)、核糖體RNA (rRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、聚肌胞苷酸、核糖核酸酶、彈性酶、小核仁RNA (snoRNA)、剪接前導RNA、病毒RNA或病毒衛星RNA，其包含第一點擊化學手柄。在某些實施例中， A具有與SEQ ID NO: 2之全長序列具有至少70%序列一致性、至少75%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少92%序列一致性、至少95%序列一致性或至少98%序列一致性的序列。在某些實施例中， A具有與SEQ ID NO: 2之全長序列具有至少80%序列一致性之序列。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A為RNA，其包含序列SEQ ID NO: 2。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中， A為RNA，其中RNA包含SEQ ID NO: 2。
在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中，第一步驟在雙正交點擊化學反應之條件下進行，例如以下各者之點擊化學反應：銅催化之疊氮化物-炔烴環化(CuAAC)應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC，例如環辛炔-疊氮化物環加成、環辛烯-四𠯤環加成)、反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合或疊氮化物-施陶丁格接合。在某些實施例中，第一步驟係在以上表3或4中所示之反應的條件下進行。在某些實施例中，第一步驟在CuAAC之條件下進行，包含在水中稀釋經炔烴修飾之核酸 A且視情況在90至100℃之間的溫度下變性約1至5分鐘以產生反應混合物。在某些實施例中，第一步驟在無銅點擊化學反應之條件(例如表4中反應1至13中之一者)下進行，其包含在水中稀釋經修飾之核酸 A(例如經烯烴修飾之DNA、經炔烴修飾之RNA、經烯烴修飾之DNA、經炔烴修飾之RNA)以產生反應混合物。在某些實施例中，第一步驟在CuAAC之條件下進行，包含在水中稀釋經炔烴修飾之核酸 A且在90至100℃之間的溫度下變性約1至5分鐘以產生反應混合物。在某些實施例中，第一步驟在CuAAC之條件下進行，包含在水中稀釋經炔烴修飾之核酸 A且在90至100℃之間(例如約95℃)的溫度下進行變性約1至5分鐘(例如約2分鐘)以產生反應混合物。在某些實施例中，第一步驟在CuAAC之條件下進行，包含在水中將經炔烴修飾之核酸 A稀釋至90 µM至125 µM或95 µM至115 µM之間，例如100 µM至125 µM之間(例如100 µM)的最終濃度。在某些實施例中，第一步驟在SPAAC之條件下進行，例如環辛炔-疊氮化物環加成，包含在水中將經炔烴修飾(例如經應變炔烴修飾，例如經環辛炔修飾)之核酸 A稀釋至1 µM至115 µM或5 µM至100 µM之間的最終濃度，例如1 µM至100 µM之間。在某些實施例中，經炔烴修飾之核酸 A係藉由使用N-羥基丁二醯亞胺(NHS)反應之條件，將在5'端用內部胺基修飾劑(例如用核酸之內部胺基修飾劑，例如可用於整合DNA技術(Integrated DNA Technologies)中)/iUniAmM/修飾之RNA或DNA偶合至DIBAC (二苯偶氮雜環辛炔，或「DBCO」，二苯并環辛炔)來製備的。
在某些實施例中，第一步驟之後為將反應混合物置放於冰上之步驟，之後為摺疊於MgCl (例如200 µM MgCl)及中性緩衝液(例如以pH 7.0之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))中之步驟。在某些實施例中，第一步驟之後為將反應混合物置放在冰上之步驟，之後為在35至39℃下在MgCl (例如200 µM MgCl)及中性緩衝液(例如以pH 7.0之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))中摺疊大約5至10分鐘之步驟。在某些實施例中，方法進一步包含將配體2-(4-((雙((1-(三級丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸(BTTAA)添加至反應物混合物中且在室溫，例如大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)中進行培育。在某些實施例中，該方法進一步包含以下步驟：使 A(例如，大約10µM A、大約10-20 µM A)、 B(例如，大約20 µM或大約20-30 µM B)及視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)反應。在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使 A(例如，大約10µM A)、B (例如，大約20 µM B)及視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)反應。在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使 A(例如，大約10µM A)、 B(例如，大約20 µM B)、視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)及含緩衝劑(例如，PBS)之抗壞血酸鈉在大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)下反應至少大約6-48小時。在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使 A(例如，大約10-20 µM A)、 B(例如，大約20-30 µM B)、視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)及含緩衝劑(例如，PBS)之抗壞血酸鈉在大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)下反應至少大約6-48小時。在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使包含環辛炔(例如DIBAC/DBCO)作為第一點擊化學手柄之 A(例如，大約1-100 µM A)、 B(例如，大約100-1000 µM B，例如包含疊氮化物作為第二點擊化學手柄)、視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)、含緩衝液(例如，PBS)之抗壞血酸鈉及0-50% (例如25-50%)反應物中緩衝液或溶劑之溶劑(例如乙腈，DMSO)在大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)下反應至少大約6-48小時。
在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使包含環辛炔(例如DIBAC/DBCO)作為第一點擊化學手柄之 A(例如，大約1-100 µM A)、 B(例如，大約100-1000 µM B，例如包含疊氮化物作為第二點擊化學手柄)、緩衝液(例如，PBS)及最終濃度高達0-50% (例如25-50%)反應物中緩衝液或溶劑之溶劑(例如乙腈，DMSO)在大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)下反應至少大約6-48小時。
在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使包含烯烴作為第一點擊化學手柄之 A(例如，大約1-100 µM A)、 B(例如，大約100-1000 µM B)、視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)、緩衝液(例如，PBS)及最終濃度高達0-50% (例如25-50%)反應物中緩衝液或溶劑之溶劑(例如乙腈，DMSO)在大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)下反應至少大約6-48小時。在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使 A(例如，大約10-20 µM A)、 B(例如，大約20-30 µM B)、視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)、緩衝液(例如，PBS)及最終濃度高達0-50% (例如25-50%)反應物中緩衝液或溶劑之溶劑(例如乙腈，DMSO)在大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)下反應至少大約6-24小時。在某些實施例中，方法進一步包含以下步驟：使 A(例如，大約10-20 µM A)、 B(例如，大約20-30 µM B)、視情況Cu-BTTAA (例如，大約100-110 µM Cu-BTTAA)、緩衝液(例如，PBS)及最終濃度高達0-50% (例如25-50%)反應物中緩衝液或溶劑之溶劑(例如乙腈，DMSO)在大約18-75℃(例如18-23℃、20-25℃、25-40℃、40-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃、70-75℃)下反應至少大約24-48小時。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)、反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合、反式環辛烯-四𠯤接合、疊氮化物-施陶丁格接合、一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯、反式環辛炔-疊氮化物偶合或環丙烯-疊氮化物偶合)。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)，其涉及環辛炔(例如DIBAC/DBCO)作為第一點擊化學手柄與疊氮化物作為第二點擊化學手柄之間的反應。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合或反式環辛烯-四𠯤接合。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為反式環辛烯-四𠯤接合。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為疊氮化物-施陶丁格接合、一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯、反式環辛炔-疊氮化物偶合或環丙烷-疊氮化物偶合。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為疊氮化物-施陶丁格接合。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為反式環辛炔-疊氮化物偶合。在某些實施例中，第一步驟在點擊化學反應之條件下進行，該點擊化學反應為環丙烷-疊氮化物偶合。在某些實施例中，該方法進一步包含添加大約10-25 mM乙二胺四乙酸(EDTA) (例如，大約15-20 mM EDTA、大約18-20 mM EDTA、大約20-22 mM EDTA、大約20 mM EDTA)以例如淬滅反應之步驟。在某些實施例中，該方法進一步包含式( I)化合物之N-聚醣之酶轉化步驟，例如包含藉由唾液酸轉移酶或岩藻糖基轉移酶或甘露糖苷酶裂解(例如現有糖之裂解)添加糖(例如糖)。在某些實施例中，該方法進一步包含例如經由基於二氧化矽之RNA或DNA脫鹽管柱沈澱及/或管柱純化式( I)化合物之步驟。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中，第一點擊化學手柄及第二點擊化學手柄如本文所描述。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中，第一點擊化學手柄及第二點擊化學手柄為表3或4中所示之點擊化學手柄對中之一者。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中，第一點擊化學手柄及第二點擊化學手柄為用於CuAAC之點擊化學手柄。在某些實施例中，第一點擊化學手柄為炔烴或疊氮化物。在某些實施例中，第一點擊化學手柄為炔烴(例如未發生應變之炔烴、發生應變之炔烴)。在某些實施例中，第一點擊化學手柄為包含下式之炔烴：在某些實施例中，核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸鹼基之炔烴。在某些實施例中， A包含以下結構：
Figure 02_image067
(5-辛二炔基dU, 亦稱為i5OctdU)，且 A為RNA或DNA。
在某些實施例中，核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸之核糖的2'OH位置之炔烴。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中，第一點擊化學手柄及第二點擊化學手柄為用於無銅雙正交點擊化學反應之點擊化學手柄，例如表4之反應1至13中所展示之點擊化學手柄搭配物(例如，疊氮化物-環辛炔、疊氮化物-活化炔烴、四𠯤-烯烴、四唑-烯烴、硫醇-烯烴)。在某些實施例中，在製備式( I)化合物之方法中，第一點擊化學手柄及第二點擊化學手柄分別為環辛炔及疊氮化物。在某些實施例中，第一點擊化學手柄及第二點擊化學手柄為表4中所示的烯烴-四𠯤狄爾斯-阿爾德逆[4+2]環加成或烯烴-四唑1,3-雙極環加成(光點擊)中所用的點擊化學手柄。在某些實施例中，第一點擊化學手柄為烯烴(例如，反式環辛烯、降冰片烯、環丙烯、1-甲基環丙烯(MCp))。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為烯烴(例如，反式環辛烯、降冰片烯及1-甲基環丙烯(MCp))。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為烯烴(乙烯基)，且 B包含第二點擊化學手柄，其為四𠯤。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為以下中之烯烴(乙烯基) (例如Kubota等人中之圖2B及/或2C)：Kubota等人, 「Expanding the Scope of RNA Metabolic Labeling with Vinyl Nucleosides and Inverse Electron-Demand Diels-Alder Chemistry.」 ACS Chemical Biology第14卷,8 (2019): 1698-1707，其以引用之方式併入本文中，且 B包含第二點擊化學手柄，其為四𠯤(例如Kubota等人中之圖3A)。在某些實施例中，核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸A之核糖之2'OH位置、核糖或去氧核糖之3'OH位置或核糖或去氧核糖之5'OH位置的炔烴(例如未發生應變的炔烴、發生應變的炔烴)。在某些實施例中，在式( I)中， A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸 A之核糖之2'OH位置的炔烴(例如未發生應變的炔烴、發生應變的炔烴)。在某些實施例中，在式( I)中， A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸 A之核糖或去氧核糖之3'OH位置的炔烴(例如未發生應變的炔烴、發生應變的炔烴)。在某些實施例中，在式( I)中，A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸 A之內部、核酸 A之3'端或核酸 A之5'端的炔烴(例如未發生應變的炔烴、發生應變的炔烴)。在某些實施例中，在式( I)中， A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸 A之內部的炔烴(例如未發生應變的炔烴、發生應變的炔烴)。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為環辛炔(例如DIBAC，DBCO)。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為環辛炔(例如DIBAC，DBCO)，且 B包含第二點擊化學手柄，其為疊氮化物。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為烯烴。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為以下中之烯烴(乙烯基) (例如Kubota等人中之圖2B及/或2C)：Kubota等人, 「Expanding the Scope of RNA Metabolic Labeling with Vinyl Nucleosides and Inverse Electron-Demand Diels-Alder Chemistry.」 ACS Chemical Biology第14卷,8 (2019): 1698-1707，其以引用之方式併入本文中。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為烯烴，其中 A包含
Figure 02_image069
Figure 02_image071
Figure 02_image073
。
在某些實施例中，第一點擊化學手柄為疊氮化物。在某些實施例中，核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸鹼基之疊氮化物。在某些實施例中，第二點擊化學手柄為炔烴(例如未發生應變之炔烴、發生應變之炔烴)。在某些實施例中，化合物 B包含連接至N-聚醣之非還原末端的第二點擊化學手柄(例如表3或4中之手柄)。在某些實施例中，化合物 B包含第二點擊化學手柄，其為連接至N-聚醣之非還原末端的炔烴或疊氮化物。在某些實施例中，化合物 B包含第二點擊化學手柄，其為連接至N-聚醣之非還原末端的炔烴。在某些實施例中，化合物 B包含第二點擊化學手柄，其為連接至N-聚醣之非還原端的疊氮化物。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為連接至DNA或RNA之炔烴(例如未發生應變之炔烴、環辛炔)，且化合物 B包含第二點擊化學手柄，其為連接至N-聚醣之疊氮化物。在某些實施例中， A包含第一點擊化學手柄，其為炔烴(例如未發生應變之炔烴、環辛炔)，且化合物 B包含第二點擊化學手柄，其為連接至N-聚醣之非還原末端的疊氮化物。
在某些實施例中， B為N-聚醣，其為單觸角N-聚醣、雙觸角N-聚醣、三觸角N-聚醣或五觸角N-聚醣。在某些實施例中， B為包含唾液酸之N-聚醣。在某些實施例中，化合物 B具有下式：
Figure 02_image075
。
在某些實施例中，化合物 B為G-28、G-35、G-29或G-30。
在某些實施例中，化合物 B為表2B之化合物。
在某些實施例中，化合物B藉由經由氟硫醯基疊氮化物介導之重氮基轉移將胺基N-聚醣轉化成相應疊氮基-N-聚醣製備。在某些實施例中，作為疊氮基-N-聚醣之化合物 B藉由在鹼性pH (例如大約8.5至9.5、大約9.0)下在室溫(例如大約18至23℃)下向具有式
Figure 02_image077
之胺基N-聚醣添加氟硫醯基疊氮化物、水、鹼(例如Na 2CO 3)大約1至2小時(例如1小時)來製備。在某些實施例中，為疊氮基-N-聚醣之化合物 B經由以下流程1製備： 流程 1.製備疊氮基-N-聚醣，例示性化合物 B
Figure 02_image079
(化合物 B)
在某些實施例中，所製備之式(I)化合物為圖9中所示之化合物。在某些實施例中，製備之式(I)化合物為本文別處所揭示之化合物。 醣核酸之用途
在一個態樣中，本文中提供利用本發明之經修飾之醣核酸的方法及製程。
在一個實施例中，本發明提供方法，由此使經分離細胞或複數個經分離細胞與本發明之經修飾之醣核酸接觸。在一個實施例中，本發明提供一種製造經處理細胞或複數個細胞之方法，其包含提供經分離細胞或複數個經分離細胞，提供包含如本發明中所描述之聚醣的經修飾之核酸，及使經修飾之核酸與經分離細胞或複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或複數個細胞能夠結合經修飾之核酸。在一些實施例中，包含聚醣之經修飾之核酸包含小型經修飾之RNA，諸如siRNA。在一些實施例中，包含聚醣之經修飾之核酸包含較大經修飾之RNA，諸如mRNA。在一些實施例中，經分離細胞或複數個細胞之接觸進一步包含電穿孔。
在一個實施例中，本發明提供產生嵌合抗原受體之方法，其包含使適當細胞與本發明之醣核酸接觸，其中該醣核酸包含經修飾之RNA，該RNA包含編碼嵌合抗原受體多肽之序列。在一些實施例中，方法包含向個體投與有效量之包含本發明之醫藥學上可接受之載劑及經修飾之RNA的醫藥組合物，其中經修飾之RNA包含編碼嵌合抗原受體多肽之序列。
在一些實施例中，本發明之醣核酸內化至細胞中。在一些實施例中，本發明之醣核酸以比類似未經修飾之核酸更大的效率內化至細胞中。在一些實施例中，醣核酸以比類似未經修飾之核酸多至少約10%以上、至少約15%以上、至少20%以上、至少約25%以上、至少約30%以上、至少約35%以上、至少約40%以上、至少約45%以上、至少50%以上、至少55%以上、至少60%以上、至少65%以上、至少70%以上、至少75%以上、至少80%以上、至少85%以上、至少90%以上、至少95%以上、至少100%以上或至少200%以上內化至細胞中。
在一些實施例中，本發明之醣核酸結合至細胞表面。在一些實施例中，細胞表面結合影響細胞信號傳導中之至少一種變化。在一些實施例中，醣核酸與細胞表面之結合增加至少一種細胞信號傳導路徑。在一些實施例中，醣核酸與細胞表面之結合降低至少一種細胞信號傳導路徑。 投與途徑、調配及藥效學作用
本文提供醫藥組合物，其包含適於投與個體之醣核酸，諸如醣RNA及醣DNA。醫藥組合物一般包含呈適於向個體投與之形式的醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)及醫藥學上可接受之載劑。醫藥學上可接受之載劑部分由所投與之特定組合物以及由用於投與組合物之特定方法決定。因此，存在廣泛多種適合之醫藥組合物調配物，其包含醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)。醫藥組合物通常經調配為無菌、實質上等張的，且完全符合美國食品藥物管理局之所有良好製造實務(Good Manufacturing Practice，GMP)法規。
適合載劑之實例包括(但不限於)水、鹽水、林格氏溶液(Ringer's solutions)、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。該等介質及化合物用於醫藥活性物質之用途在此項技術中眾所周知。除非任何習知介質或化合物與本文所描述之醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)不相容，否則涵蓋其在組合物中之用途。亦可將補充治療劑併入組合物中。通常，醫藥組合物經調配成可與其預期投與途徑相容。醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)可藉由非經腸、局部、靜脈內、經口、皮下、動脈內、皮內、經皮、經直腸、顱內、腹膜內、鼻內、肌內途徑或以吸入劑形式進行投與。醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)可視情況與其他治療劑組合投與，該等治療劑至少部分有效治療意欲用醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)治療之疾病、病症或病況。
用於非經腸、皮內或皮下施用之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌化合物，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑化合物，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節化合物，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉加以調節。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，適合的載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物通常為無菌的且流動性應達到存在易於注射性之程度。其應在製造及儲存條件下穩定且必須抵抗諸如細菌及真菌之微生物的污染作用而保藏。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇以及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散介質。所需流動性程度可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。微生物體行動之防止可藉由例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉及其類似物之各種抗細菌化合物及抗真菌化合物來達成。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張化合物，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括例如單硬脂酸鋁及明膠之延遲吸收之化合物來實現。
無菌可注射溶液可藉由將醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)按需要以有效量併入具有一種或多種本文列舉之成分之組合的適當溶劑中來製備。
一般而言，分散液係藉由將醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)併入含有鹼性分散介質及任何所需其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前此前經無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何其他所需成分之散劑。醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)可以儲槽式注射劑或植入式製劑之形式投與，該儲槽式注射劑或植入式製劑可以使得准許醣核酸持續或脈衝式釋放之方式來調配。
無菌可注射溶液可藉由將醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)按需要以有效量併入具有一種或多種本文列舉之成分之組合的適當溶劑中來製備。
一般而言，分散液係藉由將醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)併入含有鹼性分散介質及任何所需其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前此前經無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何其他所需成分之散劑。醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)可以儲槽式注射劑或植入製劑形式投與，該儲槽式注射劑或植入製劑可以使得准許醣核酸及/或其有效負載(例如編碼之蛋白質)持續或脈衝式釋放之方式來調配。
對於藉由吸入投與，可使用任何適合之裝置，諸如氣溶膠噴霧自含有適合之推進劑(例如氣體，諸如二氧化碳)之加壓容器或分配器或使用乾燥粉末吸入器之乾粉，呈任何適合形式遞送醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)。
醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)亦可以醫藥組合物形式製備以用於經直腸遞送之栓劑(例如具有習知栓劑基質，諸如可可豆油及其他甘油酯)或保留灌腸劑形式製備。
在一些實施例中，使用將降低自個體身體消除醣核酸之速率的載劑製備醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)。舉例而言，控制釋放調配物為適合的，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法為熟習此項技術者顯而易見的。
在一個實施例中，包含醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)之醫藥組合物經靜脈內投與至將受益於醫藥組合物之個體中。在其他實施例中，例如藉由淋巴管內注射或藉由結節內注射(參見例如Senti等人, 2008 PNAS 105(46):17908)或藉由肌內注射、藉由皮下投與、藉由直接注射至胸腺中或至肝臟中來將組合物投與至淋巴系統。
醫藥學上可接受之載劑可用於遞送本文所描述之醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)。醫藥學上可接受之載劑一般與化合物一起使用，以便製備適用於療法或產品之化合物。一般而言，對於任何物質，醫藥學上可接受之載劑為與物質組合用於傳遞至個體之物質。
習知醫藥載劑、水性、散劑或油性基劑、增稠劑及其類似物可為必需或合需要的。在一些情況下，載劑對於傳遞係必需的，例如溶解用於液體遞送之不溶性化合物；用於控制物質之pH以保持其活性之緩衝劑；或用於防止物質在儲存容器中之損失的稀釋劑。然而，在其他情況下，載劑為方便起見，例如用於更方便的投與之液體。本文所描述之化合物之醫藥學上可接受之鹽可根據熟習此項技術者已知之方法合成。
通常，醫藥學上可接受之組合物經高度純化為不含污染物，具有生物相容性且不具有毒性，且適合於向個體投與。若水為載劑之成分，則水經高度純化且經處理為不含例如內毒素之污染物。
醫藥學上可接受之載劑可為乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、褐藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、苯甲酸甲基羥酯、苯甲酸丙基羥酯、滑石、硬脂酸鎂及/或礦物油，但不限於此。醫藥組合物可進一步包括潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、香味增強劑、乳化劑、懸浮劑及/或防腐劑。
在特定實例中，醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)可儲存於適當緩衝液中，例如經FDA批准之抗凝血劑防腐劑溶液，諸如抗凝血劑檸檬酸鹽右旋糖A (ACD-A)、檸檬酸鹽磷酸酯右旋糖(CPD)、檸檬酸鹽磷酸酯-右旋糖-右旋糖(CP2D)或檸檬酸鹽-磷酸酯-右旋糖-腺嘌呤(CPDA-1)。組合物可儲存至多21天。
在其他實例中，醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)可儲存於經審批通過之添加劑溶液中，例如AS-1 (Adsol)、AS-3 (Nutricel)、AS-5 (Optisol)或AS-7 (SOLX)。
提供醫療裝置，其包含容納包含本文所描述之醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)之醫藥組合物的容器及用於向個體靜脈內注射醫藥組合物的施加器。
提供醫藥套組，其包含有包含本文所描述之醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)之醫藥組合物及用於向個體靜脈內注射醫藥組合物之醫療裝置。
在一些實施例中，包含脂質組分及醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)之奈米粒子可例如藉由非經腸或局部投與或局部施用來投與。在一些實施例中，由醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)表現之蛋白質的至少一部分經由局部投與定位於所需目標組織或目標細胞位置。
向個體投與包含至少一種奈米粒子之醫藥組合物可涉及經由局部投與或局部施用使一或多種細胞與醫藥組合物接觸。
在一些實施例中，投與方法包含提供電穿孔。在一些實施例中，方法包含提供包含如本文別處所揭示及描述的聚醣部分的經修飾之RNA，及向個體提供電穿孔。
在一些實施例中，調配本文所揭示之醫藥組合物以用於向有需要之人類個體全身投與。在一些實施例中，調配本文所揭示之醫藥組合物以用於向有需要之哺乳動物個體全身投與。在一些實施例中，調配本文所揭示之醫藥組合物以用於向有需要之人類個體多次全身性投與。在一些實施例中，調配本文所揭示之醫藥組合物用於向有需要之哺乳動物個體多次全身投與。
在一些實施例中，包含與聚醣結合之經修飾之核酸的醫藥組合物在向個體投與時產生持久的藥效學作用。在一些實施例中，包含與聚醣結合之經修飾之核酸的醫藥組合物在向個體投與之後提供至少一週的藥效學作用。在一些實施例中，包含與聚醣結合之經修飾之核酸的醫藥組合物在向個體投與之後提供至少一個月的藥效學作用。在一些實施例中，包含與聚醣結合之經修飾之核酸的醫藥組合物在向個體投與之後提供至少三個月的藥效學作用。在一些實施例中，包含與聚醣結合之經修飾之核酸的醫藥組合物在向個體投與之後提供至少六個月的藥效學作用。在一些實施例中，包含與聚醣結合之經修飾之核酸的醫藥組合物在向個體投與之後提供至少一年的藥效學作用。在一些實施例中，包含與聚醣結合之經修飾之核酸的醫藥組合物在向個體投與之後提供至少18個月的藥效學作用。在一些實施例中，與未與聚醣結合之可比核酸相比，經修飾之核酸結合物在個體體內提供增加的循環時間。在一些實施例中，與未與聚醣結合之可比核酸相比，經修飾之核酸結合物在個體體內具有增加之半衰期。在一些實施例中，與未與聚醣結合之可比核酸相比，經修飾之核酸結合物在個體體內的穩定性增加。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含調配為奈米粒子組合物之一部分的本發明之醣核酸。在一個實施例中，醣核酸存在於奈米粒子內部或之內。在另一實施例中，醣核酸存在於奈米粒子之表面上。在一些實施例中，奈米粒子為脂質奈米粒子(LNP)。在一些實施例中，奈米粒子為LNP，諸如(但不限於)專利申請公開案WO2017049245A2、WO2019089828A1及US20170210697A1中所描述之彼等LNP，其中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。在另一實施例中，奈米粒子為聚合奈米粒子。在另一實施例中，奈米粒子為聚合奈米粒子，諸如(但不限於)Begines等人, (Nanomaterials 2020 Jul; 10(7): 1403)描述之彼等。在另一態樣中，本發明提供製造包含本發明之醣核酸的奈米粒子調配物的方法。在一個實施例中，產生醣核酸奈米粒子之方法包含提供核酸，使該核酸與聚醣在使得核酸與聚醣結合的條件下接觸以產生包含聚醣部分的經修飾之核酸，且隨後使該包含聚醣部分的經修飾之核酸與奈米粒子在使得形成包含該醣核酸的奈米粒子的條件下接觸。在一些實施例中，該奈米粒子為LNP。
在一些實施例中，本發明之醣核酸為血清穩定的。在一些實施例中，聚醣與核酸之結合使結合物整體上具有穩定性，使得結合物在血清中之儲存期限比不具有結合聚醣之相同核酸更長。在一個態樣中，本發明提供一種產生包含本發明之醣核酸的血清的方法，該方法包含提供包含有包含至少十個單醣之聚醣部分的經修飾之核酸，及提供血清，其中聚醣向血清內之核酸提供穩定。 劑量
醣RNA及其醫藥組合物之投與劑量及頻率可例如由主治醫師基於諸如疾病嚴重程度、患者年齡、性別及膳食、任何發炎嚴重程度、投與時間及其他臨床因素之各種因素來決定。在一個實例中，靜脈內投與係以最低限度有效之劑量開始，且在經預先選擇之時程內增加劑量直至觀測到正效應為止。隨後，將遞增之劑量增加限於產生有效對應增加之水準，同時考慮可能出現之任何副作用。
適合劑量之非限制性實例可在例如1×10 10至1×10 14、1×10 11至1×10 13或5×10 11至5×10 12個醣RNA範圍內。特定實例包括約5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、1×10 11、2×10 11、3×10 11、4×10 11、5×10 11、6×10 11、7×10 11、8×10 11、9×10 11、1×10 12或更多個醣RNA。各劑量之醣RNA可以諸如每天一次、每週一次、每週兩次、每月一次或每月兩次之間隔投與。
提供含有有效含量之醣RNA的醫藥組合物。此類組合物含有複數個醣RNA，例如1×10 3個醣RNA，或1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10、1×10 11、1×10 12或大於1×10 12個醣RNA。在特定實施例中，可在鹽水溶液中以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或大於90%質量/體積比(m/v%)之濃度投與醣RNA。向患者投與之時間可在10分鐘至四小時範圍內，或更久。
劑型之限制條件為包含有包含本文所描述之醣RNA的醫藥組合物。在一些實施例中，劑型經調配為呈液體懸浮液形式以用於靜脈內注射。
醣RNA之醫藥學上可接受之懸浮液較佳封裝於大約10至大約250 ml之體積中。該封裝可為注射器或適用於輸血之IV袋。例如藉由靜脈內或動脈內注射，視情況使用來自IV袋之滴注或其類似者進行懸浮液之投與。投與典型地在臂中經靜脈內或經由中心導管進行。對於超過50 ml之投與，使用滴注為較佳的。
在某些實施例中，如本文所揭示之奈米粒子可以一日一或多次足以每天每個體體重遞送約0.0001 mg/kg至約100 mg/kg、約0.001 mg/kg至約0.05 mg/kg、約0.005 mg/kg至約0.05 mg/kg、約0.001 mg/kg至約0.005 mg/kg、約0.05 mg/kg至約0.5 mg/kg、約0.01 mg/kg至約50 mg/kg、約0.1 mg/kg至約40 mg/kg、約0.5 mg/kg至約30 mg/kg、約0.01 mg/kg至約10 mg/kg、約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或約1 mg/kg至約25 mg/kg之醣RNA的劑量濃度進行投與以獲得所需治療效果。
在一些實施例中，如本文所揭示之奈米粒子以單次投與向個體投與。在一些實施例中，如本文所揭示之奈米粒子以多次(例如兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次)投與以固定劑量投與個體。在此段落中之各實施例中，「多次投與」可藉由短(1至5分鐘)、中等(6至30分鐘)或長(超過30分鐘、數小時或甚至數天)時間間隔彼此分開。
奈米粒子可使用能有效治療疾病、病症及/或病況之任何劑量的投與來投與至個體。視個體之年齡及一般狀況、疾病之嚴重程度、特定調配物、其投與模式、其活動模式及其類似因素而定，所需之精確劑量將因個體而異。然而，應理解，組合物之每天總用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範疇內決定。任何特定患者之特定醫藥學上有效劑量將視多種因素而定，包括疾病之嚴重程度、所用特定組合物、患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、投與時間、投與途徑、治療持續時間及醫學技術中熟知之類似因素。 疾病、病症及病況
在一個態樣中，本文提供調節目標濃度以治療或預防與目標在個體中之存在、不存在、升高或降低的濃度相關的疾病、病症或病況的方法。如本文所用，術語「標靶」係指涉及疾病、病症或病況之病因或為診斷性或疾病、病症或病況的分子或其他化學實體。個體可患有疾病、病症或病況或可處於罹患疾病、病症或病況之風險下。本文所提供之方法包括以可有效地調節標靶之濃度之量投與本文所描述之適合的醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)，由此預防或治療疾病、病症或病況。在一些實施例中，將醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)調配為醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於非經腸投與，諸如靜脈內注射至個體。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於向個體局部投與。可以任何所需方案向個體投與組合物，諸如藉由向個體投與一次或可在一段時間內進行多次投與。舉例而言，可給與個體兩次、三次、四次、五次或更多次投與。在一些實施例中，可視需要投與，例如只要與疾病、病症或病況相關的症狀持續存在。在一些實施例中，可在個體生命之剩餘時間內指定重複投與。治療期可變化且可例如不長於一年、六個月、三個月、兩個月、一個月、兩週、一週、三天、兩天或不長於一天。
在一些實施例中，組合物經治療時段投與至少兩次，使得疾病、病症或病況得到治療，或其症狀減少。在一些實施例中，在治療期內投與至少兩次組合物以使得治療疾病、病症或病況，或預防其症狀。在一些實施例中，在治療期內投與足夠次數之醫藥組合物以使得在治療期期間實質上降低目標濃度。在其中目標為自行抗體之一些實施例中，醫藥組合物在治療期內投與足夠次數，使得目標自行抗體之濃度在治療期期間基本上降低，使得預防、減少或延遲自行抗體介導之疾病、病症或病況之一或多種症狀。在一些實施例中，降低目標之濃度包括降低峰值濃度，而在其他實施例中，其包括降低平均濃度。在一些實施例中，治療期間之實質性下降可藉由比較個體中之預治療期或治療期後或藉由比較進行治療之種群中進行的量測與經匹配之未經治療對照種群中進行的量測來測定。在一些實施例中，在部分或整個治療期間，目標之濃度減少至少約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、99.99%或超過99.99%。在一些實施例中，在投與約1、5、10、15、20、30、40或50分鐘，或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時，或1、2、3、4、5或6天或約1、2、3、4、5或6週內，目標之濃度減少至少約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、99.99%或超過99.99%。
在一些實施例中，醫藥組合物在治療期內投與足夠次數，使得目標濃度以大於i)人類個體對標靶之內源性清除速率，或ii)人類個體對標靶之內源性產生速率，或iii) i)及ii)兩者之速率降低。在一些實施例中，醫藥組合物在治療期內投與足夠次數，使得目標濃度實質上減少至少約一週、兩週、三週、四週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或超過六個月。在一些實施例中，醫藥組合物在治療期內投與足夠次數，使得目標濃度在至少與治療期一樣長的一段時間內實質上降低。
在一些實施例中，以足以有效地將目標之濃度降低至低於與疾病、病症或病況之症狀相關之水準的頻率投與醫藥組合物。
在一些實施例中，治療期內投與之間的時間間隔不長於如下時段，其中醣RNA之數目減少至所投與之醫藥組合物中所存在之醣RNA數目的小於約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
與目標相關之疾病、病症及病況描述於本文中，該等疾病、病症及病況可藉由投與醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)來治療或預防。
與藉由投與醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)而調節治療益處之目標相關的疾病、病症及病況包括(但不限於)：抗自行抗體介導之疾病、補體調節異常相關疾病、免疫複合體相關疾病、澱粉樣變性、與傳染劑或病原體相關之疾病(例如細菌、真菌、病毒、寄生蟲感染)、與毒性蛋白相關之疾病、與脂質堆積相關之疾病、與凋亡、壞死、異常或致癌哺乳動物細胞相關之疾病，以及代謝疾病。
在一些實施例中，本文提供用於治療或預防與可出於治療作用調節之目標(例如分子或實體)相關之疾病或病況的方法。在某些實施例中，該等方法包含向有需要之個體投與有效治療或預防與分子或實體相關之疾病或病況之量的醣核酸(諸如醣RNA及醣DNA)，或組合物，較佳包含醣核酸之醫藥組合物。
提供用於治療或預防發炎及與發炎相關之疾病(包括敗血症、自體免疫疾病、癌症及微生物感染)的方法，該等方法包含向有需要之個體投與有效治療或預防發炎或相關疾病之量的醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)。在一些實施例中，醣RNA包含編碼趨化介素或細胞介素受體之序列。
提供用於調節發炎部位之趨化介素穩態之方法，該等方法包含向有需要之個體投與有效調節發炎部位之趨化介素穩態之量的醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)。在一些實施例中，醣核酸為包含編碼趨化介素受體之序列的醣DNA或醣RNA。
進一步提供誘導毒素清除之方法。該等方法包括向有需要之個體以有效清除來自循環之毒素之量投與醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)，該等醣核酸包含編碼能夠與毒素(諸如抗體、scFv或奈米抗體)相互作用的肽的序列。此類方法可用於螯合毒素且減少將另外發生在血管內之組織損害的量，且以較不急性的方式耗散其病原效應。
在一些實施例中，提供治療疾病，包括(但不限於)代謝疾病、癌症、凝血及抗凝血疾病之方法。該等方法包括向有需要之個體投與包含編碼本文所提供之肽之量足以治療個體之代謝疾病、癌症、凝血疾病或抗凝血疾病的序列的醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)之醫藥組合物。
在一些實施例中，疾病、病症或病況為代謝疾病。在一些實施例中，疾病、病況或病症為癌症。在一些實施例中，疾病、病症或病況為凝血疾病。在一些實施例中，疾病、病症或病況為抗凝血疾病。在一些實施例中，疾病、病症或病況為自體免疫疾病。在實施例中，疾病、病症或病況為IgE介導之過敏。在實施例中，疾病、病症或病況為全身性紅斑狼瘡。在一些實施例中，疾病、病症或病況為病毒性感染。
在一些實施例中，醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)增加目標表現。在一些實施例中，醣RNA包含環狀RNA，該環狀RNA包含編碼肽或蛋白質之序列。
在另一態樣中，提供包含本發明之醣核酸的醫藥組合物，其用於治療本文所揭示之疾病、病症及病況。在又一態樣中，提供包含本發明之醣核酸的醫藥組合物，其用於製造供治療本文所揭示之疾病、病症及病況用之藥劑。 組合療法
在一個實施例中，本發明係針對一種藉由向個體投與治療有效量之醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)來殺滅個體中之癌細胞的方法。在此實施例之一個態樣中，將醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)靜脈內投與個體。在此實施例之另一態樣中，將醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)投與至個體之腫瘤中。在此實施例之再一態樣中，醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)在允許遞送至腫瘤之媒劑中接近於腫瘤投與或全身性投與。
在另一實施例中，本發明係針對一種治療個體之癌症的方法，其藉由向該個體投與治療有效量之醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)。在此實施例之一個態樣中，經靜脈內向個體投與醣RNA。在此實施例之另一態樣中，醣RNA投與至個體中之腫瘤中。在此實施例之另一態樣中，醣RNA在允許遞送至腫瘤之媒劑中接近於腫瘤投與或全身性投與。
癌症(及癌細胞)為罹患個體之任何癌症。此類癌症包括肝癌、結腸癌、胰臟癌、肺癌及膀胱癌。肝癌可為原發性肝癌或已自另一組織轉移至肝臟之癌症。原發性肝癌包括肝細胞癌及肝母細胞瘤。轉移性癌症包括結腸癌及胰臟癌。
在一個實施例中，本發明係針對一種藉由向個體投與治療有效量之免疫檢查點抑制劑與治療有效量之醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)來殺滅該個體之癌細胞的方法。在此實施例之一個態樣中，免疫檢查點抑制劑與醣核酸(例如醣RNA)一起投與會增加醣核酸(例如醣RNA)之功效。
在另一實施例中，本發明係關於一種治療個體之癌症的方法，其藉由投與個體治療有效量之免疫檢查點抑制劑與治療有效量之醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)。在此實施例之一個態樣中，免疫檢查點抑制劑與醣核酸(例如醣RNA)一起投與會增加醣核酸(例如醣RNA)之功效。
如上所述，免疫檢查點抑制劑及醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)係在允許遞送至腫瘤之媒劑中經靜脈內投與個體、個體腫瘤中接近腫瘤或全身性投與。
在此實施例之一個態樣中，免疫檢查點抑制劑係阻斷受體(諸如PD-1、PD-L1、CTLA4、Lag3及Tim3)與哺乳動物細胞(諸如人類細胞)上之彼等受體之配體之間的相互作用的單株抗體。在一特定態樣中，單株抗體為針對PD1或PDL1之單株抗體。
單株抗體之實例包括阿特珠單抗(Atezoluzimab)、度伐利尤單抗(Durvalumab)、納武單抗(Nivolumab)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)及伊匹單抗(Ipilimumab)。在此實施例之另一態樣中，免疫檢查點抑制劑係阻斷受體(諸如PD-1、PD-L1、CTLA4、Lag3及Tim3)與哺乳動物細胞(諸如人類細胞)上之彼等受體之配體之間的相互作用的小分子。在一特定態樣中，小分子阻斷PD1與PDL1之間的結合。BMS202及類似配體為此類小分子之實例。
與醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)一起投與的免疫檢查點抑制劑分子為單株抗體或如上文所描述之小分子。其可在醣核分子之組合之前、之後或與其同時投與。
在另一實施例中，此醫藥組合物與如本文所描述之免疫檢查點抑制劑結合使用。因此，本發明之此實施例係關於治療藥物之組合，其包含免疫檢查點抑制劑及醫藥組合物，該醫藥組合物在如本文所描述之醫藥學上可接受之載劑中包含醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)。
在一些實施例中，經修飾之核酸進一步包含至少一個可操作地連接於經修飾之核酸之治療部分。在一些實施例中，至少一種治療部分選自由以下組成之群：抗體、小分子、同位素、酶或肽。在一些實施例中，至少一種治療部分經由點擊化學反應可操作地連接於經修飾之核酸。在一些實施例中，至少一個治療部分經由高親和力生物素/鏈黴抗生物素蛋白相互作用可操作地連接於經修飾之核酸。在一些實施例中，至少一個治療部分經由共價結合至經修飾之核酸之末端的連接子基團可操作地連接至經修飾之核酸。在一些實施例中，至少一個治療部分經由共價結合至聚核苷酸中間之經化學修飾之核苷酸的連接子可操作地連接至經修飾之核酸。在一些實施例中，至少一個治療部分經由插入聚核苷酸中間之兩個核苷酸之間的化學手柄可操作地連接至經修飾之核酸。
在某些實施例中，醣核酸(如醣RNA及/或醣DNA)與毒素或放射性核苷酸結合。在一些實施例中，與毒素或放射性核苷酸結合之此類醣核酸與目標細胞上之受體結合且殺滅細胞。
必要時，醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)可與靶向抗體或抗體片段結合。此可提供醣核酸至所需細胞或器官之增強的靶向，且可進一步使醣核酸穩定(例如增加其血清半衰期)。
在另一實施例中，包含醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)之醫藥組合物與化學治療劑結合使用。可與醫藥組合物一起投與且具有細胞毒性作用之化學治療劑的說明性實例包括：阿紮立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、氮胞苷(azacytidine)、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素-1 (bryostatin-1)、白消安(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、10-羥基喜樹鹼、卡莫司汀(carmustine)、西樂葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑、伊立替康(irinotecan)、卡鉑、克拉屈濱(cladribine)、環磷醯胺、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、多西他賽(docetaxel)、更生黴素(dactinomycin)、柔紅黴素葡萄糖苷酸(daunomycin glucuronide)、道諾黴素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、小紅莓(doxorubicin)、小紅莓葡萄糖苷酸、表柔比星(epirubicin)、乙炔基雌二醇、雌氮芥(estramustine)、依託泊苷(etoposide)、依託泊苷葡萄糖苷酸、氟尿苷、氟達拉濱(fludarabine)、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他濱(gemcltabine)、羥孕酮巳酯、羥基脲、伊達比星(idarubicine)、異環磷醯胺、甲醯四氫葉酸、洛莫司汀(lomustine)、二氯甲二乙胺、乙酸甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、甲胺喋呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素、米托坦(mitotane)、苯丁酸鹽、普賴松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、太平洋紫杉醇、噴司他丁(pentostatin)、司莫司汀(semustine)、鏈佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉烷、紫杉醇、丙酸睪固酮、沙立度胺(thalidomide)、硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓樸替康(topotecan)、尿嘧啶氮芥、長春花鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、及長春新鹼(vincristine)。
在一些實施例中，化學治療劑係選自由以下組成之群：帕比諾他(panobinostat)、放線菌素(actinomycin)、全反式視黃酸、阿紮胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、博萊黴素、硼替佐米、卡鉑、卡培他濱(capecitabine)、順鉑、苯丁酸氮芥、環磷醯胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、道諾黴素、多西他賽、5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷、小紅莓、表柔比星、阿德力黴素(adriamycin)、埃坡黴素(epothilone)、依託泊苷、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、伊馬替尼(imatinib)、伊立替康(irinotecan)、氮芥、巰基嘌呤、甲胺喋呤、米托蒽醌、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、拓樸替康、伐柔比星(valrubicin)、維羅非尼(vemurafenib)、長春花鹼、長春新鹼、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱及羥基喜樹鹼。
在一些實施例中，化學治療劑係選自由以下組成之群：多西他賽、帕比司他(panobinostat)、5-氟尿嘧啶、太平洋紫杉醇、順鉑、伊立替康、拓朴替康及依託泊苷。
必要時，治療部分，諸如放射性同位素、化學治療劑或本文所揭示之治療劑中之任一者可結合至醣核酸(諸如醣RNA及/或醣DNA)。
術語「化學治療劑」為可用於治療癌症之生物學(大分子)或化學(小分子)化合物。化學治療藥物之類型包括(但不限於)組蛋白去乙醯酶抑制劑(HDACI)、烷基化劑、抗代謝物、生物鹼、細胞毒性/抗癌抗生素、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白抑制劑、蛋白質、抗體、激酶抑制劑及其類似者。化學治療藥物包括用於靶向療法及習知化學療法之非靶向化合物的化合物。
化學治療劑之非限制性實例包括：埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、多西他賽、阿德力黴素、5-FU (5-氟尿嘧啶)、帕比司他、吉西他濱、順鉑、卡鉑、太平洋紫杉醇、貝伐單抗(bevacizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、二甲雙胍、替莫唑胺(替莫唑胺)、他莫昔芬、小紅莓、雷帕黴素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、羥基喜樹鹼、曲美替尼。其他化學治療藥物之實例包括：奧沙利鉑(oxaliplatin)、硼替佐米(bortezomib)、舒尼替尼(sunitinib)、來曲唑(letrozole)、伊馬替尼(imatinib)、PI3K抑制劑、氟維司群(fulvestrant)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、洛那法尼(lonafarnib)、索拉非尼(sorafenib)、吉非替尼(gefitinib)、克卓替尼(crizotinib)、伊立替康(irinotecan)、拓樸替康(topotecan)、伐柔比星(valrubicin)、維羅非尼(vemurafenib)、替比維尼(telbivinib)、卡培他濱(capecitabine)、凡德他尼(vandetanib)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、帕尼單抗(panitumumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、托西莫單抗(tositumomab)、坦羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、帕佐泮尼(pazopanib)、堪佛司非米德(canfosfamide)、噻替派(thiotepa)、環磷醯胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；伸乙亞胺(ethyleneimine)、苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)、尤利多巴(uredopa)、甲基三聚氰胺(methylmelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三乙基磷酸胺(triethyl phosphamide)、三乙基硫代磷醯胺(triethyl thiophosphamide)及三甲基三聚氰胺(trimethylenemelamine)；布拉他辛(bullatacin)、布拉他辛酮(bullatacinone)；苔蘚抑素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)、CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)、比折來新(bizelesin)合成性類似物)、克瑞托欣(cryptophycin) (特定言之，克瑞托欣1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)、倍癌黴素(duocarmycin) (包括合成性類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海綿抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙-氯乙基-甲胺(bis-chloroethyl-methylamine)、氧化氮芥(Mechlorethaminoxide) (美法侖)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、烏拉莫司汀(uramustine)、亞硝基脲(nitrosourea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)、卡奇黴素γ1I、卡奇黴素ωI1、達內黴素(dynemicin)、達內黴素A；二磷酸酯，例如氯屈膦酸鹽(clodronate)、埃斯培拉黴素(esperamicin)及新製癌菌素發色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、全反式視黃酸(all-trans retinoic acid)、安麴黴素(anthramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、去氧氟尿苷(deoxy-fluorouridine)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、N-𠰌啉基-小紅莓(morpholino-doxorubicin)、cyno-N-𠰌啉基-小紅莓(cyno-morpholino- doxorubicin)、2-吡咯啉-小紅莓(2-pyrroline-doxorubicin)、去氧小紅莓(deoxy doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非羅黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝產物，例如甲胺喋呤(methotrexate)；葉酸類似物，例如二甲基葉酸(dimethylfolate)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、甲胺喋呤(methotrexate)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(tioguanine)；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、博萊黴素(bleomycin)、6-硝基尿苷(6-nitrouridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；男性荷爾蒙(androgen)、卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素藥劑，例如胺麩精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸(folinate)；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、貝斯布西(bestrabucil)、比山群(bisantrene)、艾達曲克(edatraxate)、得弗伐胺(defofamine)、地美可辛(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾弗利散(elfornithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、埃坡黴素(epothilone)、依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；磨菇多糖(lentinan)、氯尼達明(lonidainine)、類美登素(maytansinoid)、美登素(maytansine)、安絲菌素(ansamitocin)、丙脒腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌達醇(mopidamol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、噴司他丁(pentostatin)、苯來美特(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙肼；丙卡巴肼(procarbazine)、PSK®多醣複合物(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.)、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西索菲蘭(sizofiran)、螺旋鍺(spirogermanium)、細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯-三乙胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecene) (特定言之，T-2毒素、黏液黴素A (verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及胺癸叮(anguidine)；胺基甲酸乙脂、長春地辛(vindesine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴半乳糖醇；哌泊溴烷(pipobroman)、甲托辛(gacytosine)、阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；硫鳥嘌呤；6-巰基嘌呤；甲胺喋呤；長春花鹼；依託泊苷、異環磷醯胺、米托蒽醌、長春新鹼、長春瑞濱、諾安托(novantrone)；曲美他塞；替尼泊苷(teniposide)、依達曲沙(edatrexate)、柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；DMFO；類視色素，例如視黃酸；及醫藥學上可接受之鹽或其衍生物。 與表現聚醣結合蛋白之細胞相關之方法
本發明之態樣包括用於減少表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞與呈現細胞表面醣基化核糖核酸(醣RNA)之細胞之間的相互作用的方法。該等方法部分基於本文首先描述之出人意料的發現，細胞在其表面上展示醣RNA，且此類醣RNA藉由細胞表面表現GBP識別。因此，在本發明之益處下，應理解，與GBP與醣RNA之間的相互作用相關之多種方法及試劑為可能的且提供於本文中。此類方法及試劑可用於多種情形中，包括(但不限於)研究、治療及診斷情形。
根據一些實施例，提供用於減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用的方法，該等方法包含使表現GBP之細胞與結合至表現GBP之細胞的表面上表現的GBP的可溶性醣RNA以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。在此情形下，「可溶性」意謂當與表現GBP之細胞接觸開始時，醣RNA不與細胞膜結合。如本文中所使用，「減少相互作用」或「減少的相互作用」同在不存在接觸之情況下表現GBP之細胞與顯示細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用相比較。可溶性醣RNA包含彼等可溶性醣RNA，其中可溶性醣RNA與在表現GBP之細胞表面上表現的GBP的結合干擾(例如阻斷)GBP與呈現細胞表面醣RNA之細胞表面呈現的醣RNA結合的能力。
可採用多種醣RNA。在某些實施例中，可溶性醣RNA包含來自Y RNA家族之醣基化(例如唾液酸化) RNA，其非限制性實例包括Y5 RNA。可用於方法中之額外醣RNA包括醣基化(例如唾液酸化)小核仁RNA (snoRNA)、轉移RNA (tRNA)、小核RNA(snRNA)及其任何組合。醣RNA可包含多種聚醣。在某些實施例中，醣RNA包含N-聚醣。根據一些實施例，當醣RNA包含N-聚醣時，此類醣RNA不包含O-聚醣。在某些實施例中，醣RNA包含唾液酸化聚醣，例如唾液酸化N-聚醣。唾液酸化聚醣包括(但不限於)用Neu5Ac、Neu5Gc或其組合唾液酸化之聚醣。
可使可溶性醣RNA與一或多種試劑結合。相關試劑與RNA結合之多種策略可用於相關結合物藥試劑與可溶性醣RNA之結合。非限制性實例包括以下中所描述之彼等實例：Lau等人, (2012) Mol. Pharm.9:71-8；Liu等人, (2014) Nucleic Acids Res.42:11805-11817；Xia等人, (2009) Mol. Pharm.6:747-751；Sugo等人, (2016) J. Control. Release237:1-13；及其他處，其揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，為了促進醣RNA與一或多種相關試劑之穩定結合，醣RNA具有或經工程改造以包括MS2-RNA莖環模體(MS2)。此類模體已展示結合至MS2-鞘蛋白(MS2-CP)且因此將提供醣RNA與包含MS2-CP之試劑的非共價結合。
在某些實施例中，可溶性醣RNA與一或多種治療劑結合。如本文所用，「治療劑」為生理學上或藥理學上活性物質，其可在動物(諸如哺乳動物)中或人類中之靶向位點中產生所需生物學作用。治療劑可為任何無機或有機化合物。治療劑可減少、抑制、減弱、減輕、遏制或穩定動物(諸如哺乳動物或人類)之疾病、病症之發展或進展或細胞生長。實例包括(但不限於)肽、蛋白質、核酸(包括siRNA、miRNA及DNA)、聚合物及小分子。在各種實施例中，治療劑可表徵或未表徵。
根據一些實施例，可溶性醣RNA與一或多種試劑結合，該一或多種試劑使得將可溶性醣RNA所結合之表現GBP之細胞殺滅、預防細胞增殖及/或類似者。此類試劑可變化且包括細胞生長抑制劑及細胞毒性劑，例如能夠在有或無內化至目標細胞中之情況下殺死目標細胞的試劑。在一些實施例中，試劑為選自以下之細胞毒性劑：烯二炔、萊希菌素(lexitropsin)、倍癌黴素、紫杉烷、嘌呤黴素、海兔毒素、類美登素及長春花生物鹼。根據某些實施例，細胞毒性劑為太平洋紫杉醇、多西他賽、CC-1065、CPT-11 (SN-38)、拓朴替康、小紅莓、N-𠰌啉基-小紅莓、根瘤菌素、氰基-N-𠰌啉基-小紅莓、海兔毒素-10、棘黴素(echinomycin)、康柏斯達汀(combretastatin)、卡奇黴素、類美登素、美登素、美登素DM1、美登素DM4、DM-1、奧瑞他汀或其他海兔毒素衍生物，諸如奧瑞他汀E或奧瑞他汀F、AEB (AEB-071)、AEVB (5-苯甲醯基戊酸-AE酯)、AEFP (抗體-內皮生長抑素融合蛋白)、MMAE (單甲基奧瑞他汀E)、MMAF (單甲基奧瑞他汀F)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、紡錘菌素(netropsin)或其任何組合。
在某些實施例中，可溶性醣RNA包含可偵測標記。可採用之可偵測標記包括(但不限於)螢光標記、比色標記、化學發光標記、酶聯試劑、多色試劑、抗生素蛋白-鏈黴抗生物素蛋白相關偵測試劑及其類似物。
根據一些實施例，可偵測標記為螢光標記。螢光標記為可藉由螢光偵測器偵測之標記部分。舉例而言，螢光標記與所關注分析物(例如，表現GBP細胞的GBP)之結合允許藉由螢光偵測器偵測所關注分析物。螢光標記之實例包括(但不限於)在與試劑接觸之後發螢光的螢光分子、在用電磁輻射(例如UV、可見光、x射線等)照射時發螢光的螢光分子、可藉由光聲成像偵測之螢光標記，及其類似者。
根據一些實施例，可偵測標記為活體內顯影劑。如本文所用之片語「活體內成像」係指在整個活哺乳動物中偵測醣RNA (且依次偵測可溶性醣RNA結合之GBP及/或表現GBP之細胞)之方法。光學可偵測試劑，諸如螢光試劑(例如吲哚花青綠(ICG))、生物發光試劑(例如螢光素酶，諸如奈米螢光素酶)及放射性標記之試劑可藉由活體內成像偵測。可使用活體內成像提供哺乳動物或其中之組織或細胞的2D以及3D影像。電荷耦合裝置攝像機、光電二極體、雪崩光電二極體、光電倍增管、CMOS或3D斷層掃描器可用以進行活體內成像。舉例而言，Burdette JE (2008) Journal of Mol. Endocrin. 40: 253-261綜述電腦斷層攝影術、磁共振成像、超音波檢查、正電子發射斷層掃描、單光子發射電腦斷層攝影術等用於活體內成像之用途。使用可偵測標記用於活動物中螢光素酶表現之即時成像的方法可容易地適用於本文揭示之主題方法(例如Greer LF等人, (2002) Luminescence 17: 43-74)。活動物中螢光蛋白之活體內成像描述於例如Hoffman (2002) Cell Death and Differentiation 9:786-789中。在一些實施例中，活體內成像可藉由偵測發射經設計以穿透活組織之波長之光的標籤來進行。此類標記包括長波長發射螢光染料或蛋白質，諸如紅外線及近紅外染料或蛋白質，包括(但不限於)在約600 nm至約800 nm、約650 nm至約800 nm或約700 nm至約800 nm範圍內發射之染料或蛋白質。替代地，經設計以發射光穿過活性組織之標記可包括非螢光試劑，包括(但不限於)紅移螢光素酶。
活體內成像亦可涉及電腦斷層攝影術、磁共振成像、超音波檢查、正電子發射斷層掃描、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT) (詳細參見Burdette JE (2008) Journal of Mol. Endocrin., 40:253-261)。SPECT亦可在本發明方法中與整合之x射線CAT (CT)掃描儀(SPECT/CT)一起使用。來自如上所述之許多活體內成像方法之資訊可在個體中提供醣RNA (且反過來，表現GBP之細胞)之3D分佈。
根據一些實施例，可溶性醣RNA包含活體內顯影劑，其中活體內顯影劑為光聲波顯影劑。光聲成像(PAI)橋接常規光學成像之傳統深度限制及擴散光學成像之解析度限制。使用回應於脈衝式雷射光之吸收而產生之聲波，其提供在若干公分深度處吸收之光學能量密度的非侵入性影像，解析度為約100 μm。已證實此通用及可調式成像模態適用於分子成像，其使得能夠用全身性引入之造影劑觀測生物過程。可用於光聲成像中之試劑包括描述於Weber等人, (2016) Nature Methods 13:639-650中之彼等試劑。在某些實施例中，可溶性醣RNA包含光聲顯影劑，且光聲顯影劑為吲哚花青綠(ICG)、對於靜脈內投藥安全之三花青染料。
在某些實施例中，可溶性醣RNA所結合之GBP包含凝集素。在一些非限制性實例中，醣RNA包含唾液酸化聚醣及可溶性醣RNA所結合之GBP為唾液酸聚醣結合凝集素。唾液酸聚醣結合凝集素之非限制性實例包括唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglecs)。
Siglec為其功能藉由其聚醣配體調節之免疫調節受體家族。Siglec家族由人類中之15個家族成員組成，其表現於造血譜系中之細胞之限制集合上，已知例外狀況包括在寡樹突神經膠質細胞上之Siglec-4 (MAG)及在胎盤胚細胞上之神經結合細胞及Siglec-6。經由其最外部N端V設置域，Siglec識別醣蛋白及醣脂上具有獨特但重疊之特異性的含唾液酸之聚醣配體。識別其配體可經由基於免疫受體酪胺酸之抑制性模體(ITIM)對其細胞質尾部影響細胞信號傳導。對於大部分Siglec，此等TIM具有募集磷酸酶之能力，因此，此等成員稱為抑制劑型Siglec。受體包括缺乏此類模體之Siglec-1及MAG，及活化型Siglec (Siglec -14至Siglec-16)，其經由其跨膜區中之正電荷胺基酸與基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)負載銜接子蛋白質相關。
Siglec可基於其在哺乳動物物種間基因同源性劃分成兩組。第一組存在於所有哺乳動物中且由Siglec-1 (唾液酸黏附素)、Siglec-2 (CD22)、Siglec -4及Siglec-15組成。第二組由包括Siglec-3 (CD33)、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-14及-16的CD33相關之Siglec組成。單核球、單核球衍生之巨噬細胞及單核球衍生之樹突狀細胞基本上具有相同的Siglec概況，亦即高Siglec-3、-7、-9表現、低Siglec-10表現及在經IFN-α刺激後具有Siglec-1表現。相比之下，巨噬細胞主要表現Siglec-1、-3、-8、-9、-11、-15及-16，此視其分化狀態而定。習知樹突狀細胞表現Siglec-3、-7及-9，類似於單核球衍生之樹突狀細胞，但另外亦表現低量之Siglec-2及Siglec-15。漿細胞樣樹突狀細胞表現Siglec-1及Siglec-5。在用LPS刺激48小時之後觀測到Siglec-7及Siglec-9在單核球衍生之樹突狀細胞上之表現之下調，然而，在LPS觸發後，觀測到單核球衍生之巨噬細胞Siglec之表現不改變。Siglec亦存在於其他免疫細胞上，諸如B細胞、嗜鹼性球、嗜中性白血球及NK細胞。關於Siglec之其他細節可見於例如Angata等人(2015) Trends Pharmacol Sci. 36(10): 645-660；Lübbers等人(2018) Front. Immunol. 9:2807；Bochner等人(2016) J Allergy Clin Immunol. 135(3):598-608；及Duan等人(2020) Annu. Rev. Immunol. 38(1):365-395；其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，可溶性醣RNA結合之GBP包含CD33相關之Siglec。在一個非限制性實例中，CD33相關之Siglec為Siglec-11。在另一非限制性實例中，CD33相關之Siglec為Siglec-14。
在某些實施例中，可溶性醣RNA所結合之GBP包含C型凝集素。C型凝集素為由至少一個C型凝集素類域(CTLD)之存在限定且識別廣泛配體譜系且調節不同範圍之生理功能的蛋白質超家族。大多數研究注意力集中於C型凝集素在先天性及適應性抗微生物免疫反應中起作用之能力，但此等蛋白質愈來愈公認在自體免疫疾病中具有主要作用且促成多細胞存在之許多其他態樣。引入術語C型凝集素以區分Ca 2+依賴性與Ca 2+非依賴性碳水化合物結合凝集素。C型凝集素共用至少一個碳水化合物識別域，該至少一個碳水化合物識別域為一種含有保守殘基模體且決定CLR之碳水化合物特異性的緊密結構模組。作為其在偶合先天性及適應性免疫性中之作用，備受關注的為位於自然殺手基因集群之端粒區域上的Dectin-1及Dectin-2家族之基因。此兩組C型凝集素主要由骨髓譜系之細胞進行表現，諸如單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)及嗜中性球。C型凝集素不僅充當內化及呈遞至T細胞之抗原吸收受體，且亦觸發引起NF-κB、I型干擾素(IFN)及/或炎性體活化之多個信號傳導路徑。此轉而引起促炎性細胞介素或抗炎細胞介素及趨化介素之產生，隨後精細調整適應性免疫反應。關於C型凝集素之其他細節可見於例如Zelensky等人(2005) FEBS J. 272:6179-6217；Geijtenbeek及Grinhuis (2009) Nature Reviews Immunology 9:465-479；Brown等人(2018) Nature Reviews Immunology 18:374-389；Dambuza及Brown (2015) Curr. Opin. Immunol. 32:21-7；及Chiffoleau (2018) Front. Immunol. 9:227；其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。根據一些實施例，可溶性醣RNA結合之GBP包含選自以下之C型凝集素：DECTIN-1、凝集素類經氧化之低密度脂蛋白受體-1 (LOX-1)、C型凝集素類受體-1 (CLEC-1)、C型凝集素類受體2 (CLEC-2)、骨髓抑制性C型凝集素類受體(MICL)、CLEC9A、DC免疫受體(DCIR)、DECTIN-2、血液DC抗原-2 (BDCA-2)、巨噬細胞可誘導型C型凝集素(MINCLE)、巨噬細胞半乳糖凝集素(MGL)及去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)。
在某些實施例中，可溶性醣RNA所結合之GBP包含選擇素。選擇素為介導白血球運輸及白血球、血小板及內皮細胞與腫瘤細胞之特異性黏著相互作用的C型跨膜凝集素。此等凝集素存在於內皮細胞(E-選擇素)、白血球(L-選擇素)及血小板(P-選擇素)上，且優先結合大量表現於若干腫瘤類型中之含有SLe X及SLe A醣抗原決定基之聚醣。在TME中，選擇素在白血球募集、促腫瘤發炎及獲取轉移潛力之情況下功能上相關。P-選擇素(CD62P)涉及腫瘤生長及癌轉移，因為其介導活化血小板與癌細胞之間的相互作用，從而導致腫瘤發生。E-選擇素(CD62E)亦在轉移性級聯反應之不同事件下在癌細胞黏附性中起主要作用，從而促進腫瘤細胞外滲。最後，組成性表現於白血球上之L-選擇素(CD62L)調節腫瘤-白血球相互作用且藉由有助於栓塞形成而促進細胞黏附及造血轉移。關於選擇抑制劑之其他細節可見於例如Cagnoni等人(2016) Front Oncol. 6:109；Barthel等人(2007) Expert Opin Ther Targets 11(11):1473-91；及Chen及Geng (2006) Arch Immunol Ther Exp 54(2):75-84；其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。根據一些實施例，可溶性醣RNA所結合之GBP包含選自P-選擇素(CD62P)、E-選擇素(CD62E)及L-選擇素(CD62L)之選擇素。
在某些實施例中，可溶性醣RNA所結合之GBP包含半乳糖凝集素。半乳糖凝集素為高度保守之聚醣結合可溶性凝集素之家族，其由保守性碳水化合物識別域(CRD)及常見結構摺疊定義。Vasta GR (2012) Adv Exp Med Biol946:21-36基於結構特徵，哺乳動物半乳糖凝集素已分為三種類型：原型半乳糖凝集素(Gal-1、-2、-5、-7、-10、-11、-13、-14及-15，含有一種CRD且經由非共價相互作用以單體或二聚體形式存在)、串聯重複型半乳糖凝集素(Gal-4、-6、-8、-9及-12)，其以含有由連接子肽連接之兩種不同CRD的二價半乳糖凝集素的形式存在，以及最後Gal-3，半乳糖凝集素家族之唯一嵌合體型成員。半乳糖凝集素調節腫瘤發生及轉移之不同事件。半乳糖凝集素經由效應T細胞之細胞凋亡、純系擴增之調節、調節T細胞(Treg)之功能及細胞介素分泌之控制來促成免疫耐受性及逃逸。一些半乳糖凝集素之表現量亦在惡性轉化期間變化，證實其在癌症進展中之作用。已將幾乎所有惡性腫瘤細胞大量分泌之Gal-1表徵為免疫抑制促致瘤微環境之主要啟動子。Gal-3為家族之另一成員，在大量腫瘤中展示顯著的致瘤性作用。類似於Gal-1，Gal-3信號傳導藉由與特異性聚醣相互作用而有助於使平衡向免疫抑制TME傾斜，且削弱抗腫瘤反應。就此而言，Gal-3已顯示促使腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)失能。根據一些實施例，聚醣結合部分包含選自Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-9、Gal-10、Gal-11、Gal-12、Gal-13、Gal-14及Gal-15之半乳糖凝集素的聚醣結合域。在某些實施例中，可溶性醣RNA所結合之GBP包含Gal-1。根據一些實施例，可溶性醣RNA所結合之GBP包含Gal-3。
在某些態樣中，提供用於減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用的方法，該等方法包含使表現GBP之細胞與結合至表現GBP之細胞的表面上表現的GBP且識別為結合至細胞表面醣RNA的試劑(亦即GBP為在作為結合至細胞表面醣RNA之GBP接觸之前識別的GBP)以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。試劑為一種試劑，其中試劑與在表現GBP之細胞表面上表現的GBP的結合干擾(例如阻斷)GBP與呈現細胞表面醣RNA之細胞表面呈現的醣RNA結合的能力。
根據一些實施例，結合至在表現GBP之細胞之表面上表現的GBP的試劑為GBP之配體。如本文所用，「配體」為與生物分子形成複合物以提供生物目的之物質。配體可為選自以下之物質：循環因子、分泌因子、細胞介素、生長因子、激素、肽、多肽、小分子及核酸，其在表現GBP之細胞之表面上與GBP形成複合物。在某些實施例中，當試劑為配體時，配體以使得與GBP形成複合物之方式進行修飾，但此類複合物形成之正常生物結果並未出現。
在某些實施例中，結合至在表現GBP之細胞之表面上表現的GBP的試劑為小分子。「小分子」意指分子量為1000個原子質量單位(amu)或更小的化合物。在一些實施例中，小分子為750 amu或更少、500 amu或更少、400 amu或更少、300 amu或更少或200 amu或更少。在某些實施例中，小分子並非由諸如存在於聚合物中之重複分子單元製成。
根據一些實施例，結合至在表現GBP之細胞之表面上表現的GBP的試劑為抗體。「抗體」意謂任何同型之抗體或免疫球蛋白(例如，IgG (例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgE、IgD、IgA、IgM等)、全抗體(例如，由四聚體組成的抗體，其轉而四聚體由重鏈及輕鏈多肽的兩個二聚體組成)；單鏈抗體(例如scFv)；與GBP保持特異性結合之抗體片段(例如，整鏈或單鏈抗體之片段)，包括但不限於單鏈Fv (scFv)、Fab、(Fab') 2、(scFv') 2及雙功能抗體；嵌合抗體；單株抗體、人類抗體、人源化抗體(例如人源化全抗體、人源化半抗體或人源化抗體片段，例如人源化scFV)；以及包含抗體及非抗體蛋白之抗原結合部分的融合蛋白。在某些實施例中，抗體選自IgG、Fv、單鏈抗體、scFv、Fab、F(ab') 2或Fab'。抗體可例如用活體內顯影劑、放射性同位素、產生可偵測產物之酶、螢光蛋白及其類似物可偵測地標記。抗體可進一步結合於其他部分，諸如特異性結合對之成員，例如生物素(生物素-抗生素蛋白特異性結合對之成員)及其類似者。
結合至在表現GBP之細胞之表面上表現的GBP的試劑可經選擇以結合一或多個特定GBP。此類試劑之非限制性實例包括結合一或多種Siglec (例如Siglec-11、Siglec-14及/或其類似物)、一或多種C型凝集素、一或多種半乳糖凝集素及/或一或多種選擇素之彼等藥劑。該試劑可基於呈現細胞表面醣RNA之細胞表面所呈現的醣RNA之類型，與在表現GBP之細胞表面上表現的GBP的所識別之醣RNA結合特性偶合來進行選擇。在一個非限制性實例中，當呈現細胞表面醣RNA之細胞呈現包含唾液酸化聚醣之醣RNA且表現GBP之細胞表現一或多種Siglec (例如Siglec-11、Siglec-14及/或其類似者)時，所選試劑可為結合至Siglec中之一或多者且阻斷Siglec與包含唾液酸化聚醣之醣RNA之相互作用的試劑。能夠結合至各種類型之GBP且阻斷GBP結合之抗體、配體及其他試劑為已知的且可在實踐本發明之方法時使用。舉例而言，Siglec阻斷抗體為可用的且描述於例如Pia Lenza等人(2020) Cell 9(12):2691，其揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在某些態樣中，提供用於減少表現聚醣GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用的方法，該等方法包含使呈現細胞表面醣RNA之細胞與結合至及/或編輯細胞表面醣RNA之試劑以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。
根據一些實施例，該試劑編輯細胞表面醣RNA。在某些實施例中，此類試劑包含自細胞表面醣RNA移除聚醣之酶。舉例而言，當細胞表面醣RNA包含唾液酸化聚醣時，可採用包含唾液酸酶之試劑。適合的唾液酸酶包括(但不限於)原核唾液酸酶及真核唾液酸酶。可採用之原核唾液酸酶包括細菌唾液酸酶。發現用於本發明之結合物中之細菌唾液酸酶之一個實例為鼠傷寒沙門桿菌唾液酸酶( Salmonella typhimuriumsialidase) ( (例如UniProtKB-P29768)。發現用於本發明之結合物中之細菌唾液酸酶之另一實例為霍亂弧菌唾液酸酶( Vibrio cholerasialidase) (例如UniProtKB-P0C6E9)。可採用之真核唾液酸酶包括例如哺乳動物唾液酸酶及非哺乳動物真核唾液酸酶。相關哺乳動物唾液酸酶(或哺乳動物神經胺糖酸酶)包括來自靈長類動物(例如人類或非人類神經胺糖酸酶)之彼等。在某些實施例中，唾液酸酶為人類唾液酸酶。根據一些實施例，人類唾液酸酶選自人類神經胺糖酸酶1 (例如UniProtKB-Q99519)、人類神經胺糖酸酶2 (例如UniProtKB-Q9Y3R4)、人類神經胺糖酸酶3 (例如UniProtKB-Q9UQ49)及人類神經胺糖酸酶4 (例如UniProtKB-Q8WWR8)。應理解，唾液酸酶可為野生型唾液酸酶之衍生物，諸如截短衍生物；包括比對應野生型唾液酸酶更多的胺基酸之衍生物；包括一或多個胺基酸取代(例如一或多個保守取代、一或多個非保守取代、用非天然胺基酸取代天然胺基酸及/或類似者)之衍生物。衍生物保留親本野生型唾液酸酶之至少一部分醣苷水解酶活性。
在某些實施例中，當採用包含唾液酸酶之試劑時，唾液酸酶可與靶向部分(諸如抗體、配體或其類似物)結合(例如與其結合、融合等)，該靶向部分在呈現細胞表面醣RNA之細胞的表面上結合至細胞表面分子(例如腫瘤抗原、細胞表面受體及/或其類似物)。此類試劑之非限制性實例包括描述於美國專利申請公開案第US 2019/0248919號中之彼等，其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。
根據一些實施例，當採用編輯細胞表面醣RNA之試劑時，該試劑包含核糖核酸酶(RNA酶)。可用於實踐本發明之方法的RNA酶之非限制性實例包括RNA酶A、T1 RNA酶、T2 RNA酶及RNA酶1。在一些實施例中，RNA酶為人類RNA酶，其非限制性實例包括人類RNA酶1 (UniProtKB - P07998)。
在某些實施例中，試劑結合但不編輯細胞表面醣RNA。根據一些實施例，此類試劑為結合至細胞表面醣RNA之抗體。適合抗體包括抗RNA抗體，包括(但不限於)抗雙股RNA (dsRNA)抗體。可採用之抗dsRNA抗體之一個非限制性實例為可獲自絕對抗體且在本文實例部分中證實結合醣RNA之J2抗體，或具有J2抗體(例如與J2抗體競爭結合於醣RNA之抗體)之結合特性的抗體。
根據一些實施例，當試劑結合但不編輯細胞表面醣RNA時，該試劑包含結合於細胞表面醣RNA之聚醣結合部分。舉例而言，試劑可為用於干擾(例如阻斷)細胞表面GBP與細胞表面所呈現之醣RNA之結合的醣RNA的可溶性「誘餌受體」。在某些實施例中，聚醣結合部分包含唾液酸聚醣結合凝集素之唾液酸聚醣結合域。唾液酸聚醣結合部分之非限制性實例包括包含Siglec (例如CD33相關之Siglec，包括(但不限於) Siglec-11、Siglec-14等)之唾液酸聚醣結合域的彼等物。凝集素之「聚醣結合域」或「唾液酸聚醣結合域」意指凝集素或其聚醣/唾液酸聚醣結合變異體(例如聚醣/唾液酸聚醣結合片段)負責結合至各別聚醣的域。Siglec例如包含負責唾液酸苷配體結合之細胞外N端V設置Ig (Ig-V)域。Siglec及其他凝集素之胺基酸序列及域(例如細胞外域)為已知的，且任何此類域可視需要包括於聚醣結合部分中。
本發明之態樣進一步包括使試劑靶向表現GBP之細胞的方法，該等方法包含使表現GBP之細胞與與試劑穩定結合之可溶性醣RNA接觸。在某些實施例中，「穩定相關」意謂其中在4℃下PBS中平均半衰期為一天或更多的兩個實體之間的物理性締合。在一些實施例中，在4℃下在PBS中兩個實體之間的物理性締合之平均半衰期為一天或更多、一週或更多、一個月或更多，包括六個月或更多，例如1年或更多。根據一些實施例，穩定締合由兩個實體之間的共價鍵、兩個實體之間的非共價鍵(例如，離子鍵或金屬鍵)或其他形式之化學吸引力(諸如，氫鍵結、凡得瓦爾力及其類似者)產生。
根據一些實施例，與可溶性醣RNA穩定締合(例如結合至可溶性醣RNA)之試劑為治療劑。舉例而言，可採用可溶性醣RNA將治療劑靶向遞送至表現結合可溶性醣RNA之細胞表面GBP之細胞。在某些實施例中，試劑為表現GBP之細胞調節劑。「調節劑」意指在可溶性醣RNA結合至表現GBP之細胞的GBP後，調節(例如誘導或抑制)表現GBP之細胞之一或多種活性的藥劑。在一些實施例中，表現GBP之細胞調節劑結合至表現GBP之細胞表面上之細胞表面分子(例如受體)且經由細胞表面分子誘導信號傳導(其可為活化或抑制信號傳導)。根據一些實施例，例如當需要中斷表現GBP之細胞增殖或殺死表現GBP之細胞時，與可溶性醣RNA穩定締合(例如結合至可溶性醣RNA)之試劑為如本文中其他地方所描述之細胞生長抑制劑或細胞毒性劑。
在某些實施例中，與可溶性醣RNA穩定締合(例如結合至可溶性醣RNA)之試劑包含可偵測標記，本文中其他地方描述其非限制性實例。此類方法可例如在需要例如藉由活體內成像來活體外及/或活體內偵測表現GBP之細胞時使用。
本發明之態樣進一步包括用於經由在表現GBP之細胞表面上表現之GBP誘導信號傳導之方法，該等方法包含使表現GBP之細胞與可溶性醣RNA接觸，其中將可溶性醣RNA結合至在表現GBP之細胞表面上表現之GBP可誘導經由GBP進行的信號傳導。可溶性醣RNA可具有本文別處所描述之醣RNA特性中之一者或任何組合，包括本文別處所描述之可溶性醣RNA結合物中之任一者。在某些實施例中，選擇可溶性醣RNA以使其結合聚醣結合凝集素且經由其誘導信號傳導。聚醣結合凝集素可為唾液酸聚醣結合凝集素，其非限制性實例包括Siglec。Siglec可為本文別處所描述之Siglec中的任一者。在某些實施例中，採用結合至一或多種CD33相關之Siglec (例如Siglec-11，Siglec-14及/或類似者)的可溶性醣RNA。
用於減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用、用於使試劑靶向表現GBP之細胞、用於經由表現GBP之細胞表面上表現之GBP誘導信號傳導等之本文所描述之方法中之任一者可在活體外、活體內或離體進行。
關於活體內實施例，在一些實施例中提供的方法為如下方法，其中接觸包含以有效減少個體中表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量向有需要之個體(例如需要減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之個體)投與可溶性醣RNA。亦藉助於實例，提供以下方法，其中接觸包含以有效減少個體中表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量向有需要之個體(例如需要減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之個體)投與試劑。在某些實施例中，提供如下方法，其中接觸包含向有需要之個體(例如需要經由GBP信號傳導之個體)投與可溶性醣RNA，其中將可溶性醣RNA結合至在表現GBP之細胞表面上表現之GBP可誘導經由GBP進行的信號傳導。本文所描述之任何可溶性醣RNA(包括其結合物)及其他試劑可經由適當投與途徑投與，其非限制性實例包括經口(例如呈錠劑形式、膠囊形式、液體形式或其類似形式)、非經腸(例如藉由靜脈內、動脈內、皮下、肌內或硬膜外注射)、局部、經鼻或腫瘤內投與。
根據本文所描述之活體內實施例中之任一者，有需要之個體可具有醫學病況，其非限制性實例包括癌症、自體免疫病症、發炎性病症、傳染病或其任何組合。
本發明之態樣進一步包括評估用於醣基化核糖核酸(醣RNA)之生物樣品的方法，其包含對生物樣品進行醣RNA偵測分析。在一些實施例中，樣品為細胞樣品，亦即包含細胞之樣品。細胞樣品可來源於活組織或經培養細胞之集合或其類似物。細胞樣品可為異質的，含有不同類型(包括2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種等)之細胞，或可實質上同質的，含有基本上一種類型之細胞，視細胞樣品所來源而定。當樣品為細胞樣品時，分析可為細胞表面醣RNA偵測分析。在本揭示案之益處下，應瞭解，可進行多種細胞表面醣RNA偵測分析。在某些實施例中，細胞表面醣RNA偵測分析包含使細胞樣品之細胞與醣RNA結合劑接觸，及評估醣RNA結合劑與樣品中之細胞表面醣RNA之結合。根據一些實施例，醣RNA結合劑為結合至細胞表面醣RNA之抗體。適合抗體包括抗RNA抗體，包括(但不限於)抗雙股RNA (dsRNA)抗體。可採用之抗dsRNA抗體之一個非限制性實例為可獲自絕對抗體且在本文實例部分中證實結合醣RNA之J2抗體，或具有J2抗體(例如與J2抗體競爭結合於醣RNA之抗體)之結合特性的抗體。
在某些實施例中，細胞表面醣RNA偵測分析包含使細胞樣品之細胞與核糖核酸酶(RNA酶)接觸以消化細胞表面醣RNA (若存在)及評估細胞表面醣RNA之降解。可用於實踐本發明之方法的RNA酶之非限制性實例包括RNA酶A、T1 RNA酶、T2 RNA酶及RNA酶1。在一些實施例中，RNA酶為人類RNA酶，其非限制性實例包括人類RNA酶1 (UniProtKB - P07998)。
評估用於醣RNA之生物樣品的方法可包含對生物樣品進行游離醣RNA偵測分析。「游離醣RNA」意指已自細胞釋放(例如分泌、排出及/或其類似方式)的RNA。游離醣RNA偵測分析可在細胞樣品或非細胞樣品上進行。
評定用於醣RNA之生物樣品的方法可對多種生物樣品進行，包括細胞培養基樣品、組織樣品、體液樣品等。在一些實施例中，樣品為獲自任何活細胞或生物體之任何固體或流體樣品，包括(但不限於)人類或動物組織、器官、組織培養物、生物反應器樣品、真核生物體、原核生物體。舉例而言，樣品可為或獲自例如羊膜液、水狀液、玻璃體液、膽汁、血液、血清、腦脊髓液、耵聹、乳糜、食糜、內淋巴液、外淋巴液、糞便、泌出物、糞便、胃液、淋巴、黏液、心包液、腹膜液、胸膜液、膿液、汗液、唾液、皮脂、漿液、精液、陰垢、痰、滑液、汗水、淚液、尿液、陰道分泌物、陰道排出物、嘔吐物等。
用於本發明方法中之樣品可藉由任何便利方式收集。在一些情況下，適用的細胞樣品可為或可來源於活檢體。活檢體組織可獲自健康或病變組織，包括例如癌症組織。視癌症類型及/或進行之活檢體類型而定，樣品可由固體組織活檢體或液體活檢體製備。
在一些情況下，樣品可由手術活檢製備。用於手術活檢之任何便利且適當之技術均可用於收集本文所描述之方法中待採用之樣品，包括(但不限於)例如切除活檢、切取活檢、有線定位活檢及其類似方式。在一些情況下，手術活檢可以作為手術程序之一部分獲得，該手術程序具有除獲得樣品以外的主要目的，例如包括(但不限於)腫瘤切除、輸精管結紮、淋巴結手術、腋窩淋巴結解剖、標記淋巴結手術及其類似者。
可採用各種其他活檢技術以獲得活檢組織，用作如本文所描述之樣品。作為非限制性實例，樣品可藉由穿刺活檢獲得。用於穿刺生檢之任何方便且適當之技術均可用於收集樣品，包括(但不限於)例如細針抽吸(FNA)、芯針活檢、立體定位芯針活檢、真空輔助活檢及其類似者。
本發明之態樣進一步包括產生醣基化核糖核酸(醣RNA)之方法，該等方法包含在產生醣RNA之條件下培養產生醣RNA之細胞，且分離所產生之醣RNA。此類方法可用於多種情形中，包括(但不限於)生產用於包括於本發明之結合物及/或醫藥組合物中之可溶性醣RNA。可用於實踐本發明之可溶性醣RNA產生方法之培養條件、分離方法及其類似物詳細描述於以下實例部分中。
在一些實施例中，產生所關注之醣RNA可包含產生(例如大規模生產)給定類型(野生型或經醣基工程改造)之細胞，隨後對其進行生物分離以首先分離膜，隨後藉由化學手段(例如沈澱)將RNA與蛋白質及其他生物分子分離。在某些實施例中，使用凝集素或其他聚醣結合蛋白富集聚醣以純化醣RNA，使其遠離RNA-膜製劑中之任何其他RNA。在一些實施例中，進行純化後進行醣基工程改造，其非限制性實例包括唾液酸、岩藻糖及/或其類似物之移除或添加。
在一些實施例中，在細胞培養/產生階段期間，方法可包含以下中之一者或任何組合：向細胞提供過量核苷酸以相比於在無過量核苷酸存在下之通量，增加RNA生物合成之通量；向該等細胞提供過量糖(例如過量葡萄糖、半乳糖、GlcNAc或其任何組合)以相較於在無過量糖下之通量，增加聚醣生物合成之通量；抑制該等細胞中之一或多個細胞膜轉換路徑以增強細胞表面醣RNA之累積；及抑制聚醣生物合成路徑之一部分以促進RNA聚醣之產生，例如抑制O-聚醣產生以促進N-聚醣產生。
本發明之態樣進一步包括在細胞表面上工程改造顯示醣基化核糖核酸(醣RNA)之方法。在某些實施例中，此類方法包含將一或多種編碼一或多種核糖核酸及/或聚醣生物合成酶之表現構築體引入細胞中，使得細胞在其表面上呈現一或多種類型之相關醣RNA。根據一些實施例，利用一或多種類型之所呈現之醣RNA獨特地識別細胞。舉例而言，一或多個細胞可經工程改造以呈現用於充當唯一地識別該一或多個細胞之「識別碼」的一或多個經工程改造類型之醣RNA。 結合物、融合蛋白及組合物
本發明之態樣進一步包括結合物、融合蛋白及組合物。在一些實施例中，結合物、融合蛋白及組合物可用於實踐本發明之方法中之任一者，包括本文其他地方所描述之方法中之任一者。本發明提供描述於本文方法部分中之結合物、融合蛋白及組合物中之任一者。
在某些態樣中，提供本文別處所描述之與本文別處所描述之試劑中之任一者結合的可溶性醣RNA中之任一者。舉例而言，試劑可為治療劑、包含可偵測標記之試劑等。
在一些態樣中，提供與核糖核酸酶(RNA酶)結合之靶向部分(例如抗體、配體、小分子、適體及/或其類似物)。可在結合物中採用的RNA酶之非限制性實例包括RNA酶A、T1 RNA酶、T2 RNA酶及RNA酶1。在某些實施例中，RNA酶為人類RNA酶。根據一些實施例，RNA酶為人類RNA酶1 (UniProtKB - P07998)。
在某些態樣中，提供融合蛋白，其包含與RNA酶融合之靶向部分(例如，抗體、配體及/或任何其他蛋白質靶向部分)。靶向部分可基於其特異性結合表現於呈現醣RNA之目標細胞之表面上的分子的能力來加以選擇，例如當需要降解此類細胞之表面上的醣RNA時。
亦提供包含本發明之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白中之任一者的組合物。在某些實施例中，本發明之組合物包含存在於液體介質中之本發明之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白中之任一者。液體介質可為水性液體介質，諸如水、緩衝溶液或其類似物。一或多種添加劑，諸如鹽(例如NaCl、MgCl 2、KCl、MgSO 4)、緩衝劑(Tris緩衝液、N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N'-(2-乙磺酸) (HEPES)、2-(N-N-𠰌啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-N-𠰌啉基)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-N-𠰌啉基)丙磺酸(MOPS)、N-三[羥基甲基]甲基-3-胺基丙烷磺酸(TAPS)等)、增溶劑、清潔劑(例如非離性清潔劑，諸如Tween-20等)、核酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、丙三醇、螯合劑等可存在於此類組合物中。
本發明之態樣進一步包括醫藥組合物。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物包含本發明之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。
可將可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白併入多種調配物中以用於治療性投與。更特定言之，可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白可藉由與適當醫藥學上可接受之賦形劑或稀釋劑組合調配成醫藥組合物，且可調配成呈固體、半固體、液體或氣體形式之製劑，諸如錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、注射液、吸入劑及氣霧劑。
用於投與個體(例如適合於人類投與)之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白之調配物通常為無菌的且可進一步不含針對根據所選投與途徑向患者投與而禁止的可偵測熱原質或其他污染物。
在醫藥劑型中，可投與呈其醫藥學上可接受之鹽形式的可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白，或其亦可單獨或以適當締合以及與其他醫藥學上活性之化合物組合使用。以下方法及載劑/賦形劑僅為實例且決不為限制性的。
對於口服製劑，可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白可單獨或與適當添加劑組合使用以製成錠劑、散劑、粒劑或膠囊；例如與習知添加劑，諸如乳糖、甘露醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；與結合劑，諸如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；與崩解劑，諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑，諸如滑石或硬脂酸鎂；及視需要與稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、保存劑及調味劑組合使用。
可調配可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白以用於非經腸(例如靜脈內、動脈內、骨間、肌肉內、腦內、腦室內、鞘內、皮下等)投與。在某些態樣中，調配可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白以藉由在水性或非水性溶劑(諸如植物油或其他類似油、合成脂族酸甘油酯、高級脂族酸之酯或丙二醇)中溶解、懸浮或乳化可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白；且必要時使用習知添加劑(諸如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑)來注射。
包括可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白之醫藥組合物可藉由將具有所需純度之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白與視情況選用之生理學上可接受之載劑、賦形劑、穩定劑、界面活性劑、緩衝劑及/或張力劑混合來製備。可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸、麩胱甘肽、半胱胺酸、甲硫胺酸及檸檬酸；防腐劑(諸如乙醇、苯甲醇、苯酚、間甲酚、對氯間甲酚、對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、苯紮氯銨或其組合)；胺基酸，諸如精胺酸、甘胺酸、鳥胺酸、離胺酸、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、異白胺酸、白胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、脯胺酸及其組合；單醣、雙醣及其他碳水化合物；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如明膠或血清白蛋白；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖醇、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺及神經胺糖酸；及/或非離子界面活性劑，諸如Tween、Brij Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。
醫藥組合物可呈液體形式、凍乾形式或自凍乾形式復原之液體形式，其中凍乾製劑在投與之前用無菌溶液復原。復原凍乾組合物之標準程序為使一定體積之純水(通常相當於凍乾期間移除的體積)再添加；然而，包含抗菌劑之溶液可用於產生用於非經腸投與之醫藥組合物。
水性調配物可在pH緩衝溶液中，例如在約4.0至約7.0，或約5.0至約6.0，或約5.5範圍內之pH值下製備。適合於此範圍內之pH值的緩衝劑實例包括磷酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽、丁二酸鹽、乙酸鹽緩衝劑及其他有機酸緩衝劑。例如視緩衝劑及調配物之所需張力而定，緩衝劑濃度可為約1 mM至約100 mM、或約5 mM至約50 mM。
可包括張力劑以調節調配物之張力。例示性張力劑包括氯化鈉、氯化鉀、甘油及來自胺基酸、糖之群的任何組分以及其組合。在一些實施例中，水性調配物為等張的，但高張溶液或低張溶液可為適合的。術語「等張」表示溶液具有與其所比較之一些其他溶液(諸如生理鹽溶液或血清)相同的張力。張力劑可以約5 mM至約350 mM之量，例如以100 mM至350 nM之量使用。
界面活性劑亦可添加至調配物中以減少聚集及/或使調配物中微粒之形成減至最少及/或減少吸附。實例界面活性劑包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer，Pluronic)及十二烷基硫酸鈉(SDS)。適合之聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯的實例為聚山梨醇酯20 (以商標Tween 20™出售)及聚山梨醇酯80 (以商標Tween 80™出售)。適合之聚乙烯-聚丙烯共聚物的實例為以名稱Pluronic® F68或Poloxamer 188™出售之彼等聚乙烯-聚丙烯共聚物。適合之聚氧乙烯烷基醚的實例為以商標Brij™出售之彼等聚氧乙烯烷基醚。界面活性劑之實例濃度可在約0.001%至約1% w/v範圍內。
亦可添加凍乾保護劑以便保護可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白在凍乾過程期間抵抗去穩定化條件。舉例而言，已知的凍乾保護劑包括糖(包括葡萄糖及蔗糖)；多元醇(包括甘露糖醇、山梨糖醇及丙三醇)；及胺基酸(包括丙胺酸、甘胺酸及麩胺酸)。可包括凍乾保護劑，例如其量為約10 mM至500 nM。
在一些實施例中，醫藥組合物包括可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白及上文鑑別之組分中之一或多者(例如界面活性劑、緩衝劑、穩定劑、張力劑)且基本上不含一或多種防腐劑，諸如乙醇、苯甲醇、苯酚、間甲酚、對氯間甲酚、對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、苯紮氯銨及其組合。在其他實施例中，調配物中包括防腐劑，例如濃度在約0.001至約2% (w/v)範圍內。 套組
本發明之態樣進一步包括套組。在某些實施例中，套組可用於實踐本發明之方法，例如用於活體外、活體內或離體減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之方法；用於使試劑靶向表現GBP之細胞之方法；用於誘導經由在表現GBP之細胞表面上表現之GBP的信號傳導的方法等。
因此，本發明之套組可包含本發明之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白中之任一者，包括在別處描述但出於簡潔起見在本文中不重複之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白中之任一者。套組可包含存在於醫藥組合物中之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白。當本發明之套組包含醫藥組合物時，套組可包含以單位劑量(例如安瓿)或多劑量形式存在之一定量組合物。因此，在某些實施例中，套組可包括一或多個(例如兩個或更多個)單位劑量(例如安瓿)之醫藥組合物，其包括本發明之可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白中之任一者。如本文中所使用，術語「單位劑量」係指適合作為人類及動物個體之單位劑量的物理離散單位，各單位含有經計算以足以產生所需效應之量的預定量之組合物。單位劑量之量視個體中之各種因素而定，諸如所用特定可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白、待實現之作用及與可溶性醣RNA、結合物及/或融合蛋白相關之藥效學。在其他實施例中，套組可包括單一多劑量之組合物。
在某些實施例中，本發明之套組包括使用套組之內容物的說明書以用於活體外、活體內或離體減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用；用於使試劑靶向表現GBP之細胞之方法；用於誘導經由在表現GBP之細胞表面上表現之GBP的信號傳導的方法，及/或類似方法。
套組中所包括之說明書(例如使用說明書(IFU))可以記錄在適合記錄介質上。舉例而言，說明書可印刷於基板上，諸如紙或塑膠等上。因此，說明書可作為藥品說明書存在於套組中、存在於套組或其組分之容器的標記中(亦即，與封裝或子封裝相關)等。在其他實施例中，說明書以呈現於適合電腦可讀儲存介質(例如可攜式快閃驅動機、DVD、CD-ROM、磁片等)上之電子儲存資料文件之形式存在。在又其他實施例中，實際說明書不存在於套組中，但提供自遠端源，例如經由網際網路獲得說明書之方式。此實施例之實例為包括可觀看到說明書及/或可下載說明書之網路位址之套組。如同說明書一樣，用於獲得說明書之方式記錄於合適基板上。
在某些實施例中，本發明提供組合物，其包含本文所描述之式( I)化合物或其鹽、溶劑合物、水合物、同質異晶物、共晶體、互變異構物、立體異構物、經同位素標記之衍生物或前藥及視情況存在之賦形劑。在某些實施例中，組合物用於人類應用(例如醫療、工業、研究用途)。在某些實施例中，組合物用於非人類獸醫應用(例如用於非人類動物(例如農畜、伴侶動物))中。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如靈長類動物(例如食蟹獼猴或恆河猴)、商業相關之哺乳動物(例如牛、豬、馬、綿羊、山羊、貓或狗)或鳥類(例如商業相關之鳥類，諸如雞、鴨、鵝或火雞))。在某些實施例中，非人類動物為研究動物(例如靈長類動物、大鼠、小鼠、狗、魚)。在某些實施例中，非人類動物為魚類、爬行動物或兩棲動物。非人類動物在任何發育階段可為雄性或雌性。在某些實施例中，非人類伴侶動物為狗。在某些實施例中，非人類伴侶動物為貓。在某些實施例中，非人類伴侶動物為鳥。本文所描述之組合物可藉由此項技術中已知之任何方法製備。在另一態樣中，提供套組，其包括第一容器及使用說明書(例如用於投與個體或接觸生物樣品與化合物或其組合物)，該第一容器包含本文所描述之化合物或組合物。套組可進一步包含容器(例如小瓶、安瓿、瓶、注射器及/或施配器封裝，或其他適合容器)。在一些實施例中，所提供之套組可視情況進一步包括第二容器，其包含用於稀釋或懸浮本文所描述之化合物或組合物的賦形劑。 例示性實施例 - 部分 A
以下描述性實施例意欲說明本文中所涵蓋的發明： 1.         一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 2.         如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含唾液酸、岩藻糖或其組合。 3.         如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含GlcNAc、甘露糖、半乳糖、唾液酸及岩藻糖或其組合。 4.         如實施例1之醫藥組合物，其經調配用於向有需要之人類個體全身投與。 5.         如實施例1之醫藥組合物，其經調配用於向有需要之哺乳動物個體全身投與。 6.         如實施例1之醫藥組合物，其適用於向有需要之人類個體多次全身投與。 7.         如實施例1之醫藥組合物，其適用於向有需要之哺乳動物個體多次全身投與。 8.         如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基，其中該第一或第二末端殘基中之至少一者包含唾液酸。 9.         如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一或第二或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸。 10.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一或第二或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸殘基，該殘基包含一或多個聚唾液酸末端修飾。 11.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含連接至該聚醣之核心或鹼基中之GlcNAc殘基的岩藻糖。 12.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含連接至存在於樹或臂中之GlcNAc殘基的岩藻糖。 13.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含超過一個臂，該等兩個臂之間具有GlcNAc，從而產生二等分聚醣。 14.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一及第二末端殘基中之至少一者包含岩藻糖。 15.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基，其中至少一個末端殘基包含唾液酸且至少一個末端殘基包含岩藻糖。 16.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中至少一個末端殘基為唾液酸且一個末端殘基為岩藻糖。 17.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中RNA包含經修飾之核苷酸。 18.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中該核酸包括經修飾之核苷酸，其中該經修飾之核苷酸的核酸位置可不同。 19.      如實施例1之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中該核酸包括經修飾之核苷酸，其中該等修飾正交以偶合兩個或更多個聚醣。 20.      如實施例1之醫藥組合物，其中該經修飾之RNA包含至少約15、20、25、30、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或大於10000個核苷酸。 21.      如實施例1之醫藥組合物，其中該經修飾之RNA不包含非天然核苷酸。 22.      如實施例1之醫藥組合物，其中該經修飾之RNA包含少於約15、20、25、30或50個核苷酸。 23.      如實施例1之醫藥組合物，其中該經修飾之RNA包含微小RNA結合部分。 24.      如實施例1之醫藥組合物，其中該經修飾之RNA包含編碼多肽之序列。 25.      如實施例1之醫藥組合物，其進一步包含可操作地連接於該經修飾之RNA的治療部分，其中該治療部分係選自抗體、小分子、同位素、酶及肽。 26.      如實施例1之醫藥組合物，其中經修飾之RNA包含RNA與聚醣之間的可裂解連接子。 27.      如實施例1之醫藥組合物，其中經修飾之RNA包含RNA與聚醣之間的可裂解連接子，其中該可裂解連接子為pH依賴性的二硫鍵、肽裂解位點或cit-val連接子。 28.      一種產生長藥效學作用之方法，其包含向有需要之個體投與經聚醣修飾之RNA。 29.      一種治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 30.      一種治療自體免疫疾病之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 31.      一種治療IgE介導之過敏之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 32.      一種治療全身性紅斑性狼瘡症之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 33.      一種治療病毒性感染之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 34.      一種遞送嵌合抗原受體之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣，其中該經修飾之RNA包含編碼嵌合抗原受體多肽之序列。 35.      一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之經修飾之RNA的製劑；及 c)         使該經修飾之RNA與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該經修飾之RNA。 36.      一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之小型經修飾之RNA的製劑；及 c)         使該小型經修飾之RNA與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該小型經修飾之RNA。 37.      一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之大型經修飾之RNA的製劑；及 c)         使該大型經修飾之RNA與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該大型經修飾之RNA。 38.      一種產生經修飾之RNA之方法，其包含： a)         提供RNA；及 b)         使該RNA與聚醣在使得該RNA藉由使該RNA與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸。 39.      一種產生脂質奈米粒子(LNP)之方法，其包含： a)         提供RNA； b)         使該RNA與聚醣在使得該RNA藉由使該RNA與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸； c)         使該經修飾之RNA與脂質在使得形成LNP之條件下接觸。 40.      一種產生經修飾之RNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣； b)         提供LNP；及 c)         使該經修飾之RNA與LNP在使得該經修飾之RNA存在於該LNP中及/或該LNP之表面上的條件下接觸。 41.      一種產生RNA-奈米粒子(RNA NP)之方法，其包含： a)         提供RNA； b)         使該RNA與聚醣在使得該RNA藉由使該RNA與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸； c)         使該經修飾之RNA與奈米粒子在使得形成RNA NP之條件下接觸。 42.      一種產生經修飾之RNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣； b)         提供奈米粒子；及 c)         使該經修飾之RNA與奈米粒子在使得該經修飾之RNA存在於該奈米粒子中及/或該奈米粒子之表面上的條件下接觸。 43.      一種遞送經修飾之RNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣；及 b)         提供電穿孔。 44.      一種產生經修飾之RNA之方法，其包含經修飾之RNA，該經修飾之RNA包含有包含至少十個單醣的聚醣部分，其中該經修飾之RNA調節細胞表面受體，該方法包含使含有受體之細胞與經修飾之RNA接觸。 45.      一種產生經修飾之RNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少十個單醣；及 b)         提供血清，其中該聚醣向該血清內之該RNA提供穩定。 46.      一種產生經修飾之RNA之方法，其包含： a)         提供RNA；及 b)         使該RNA與聚醣在使得該RNA藉由該RNA與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸，其中該聚醣包含N-乙醯基半乳糖胺。 47.      一種包含經修飾之裸RNA之醫藥組合物，其包含有包含至少十個單醣之聚醣部分。 48.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少一個單醣。 49.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少兩個單醣。 50.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少三個單醣。 51.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少四個單醣。 52.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少五個單醣。 53.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少六個單醣。 54.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少七個單醣。 55.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少八個單醣。 56.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之RNA，該聚醣部分包含至少九個單醣。 57.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣。 58.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含唾液酸、岩藻糖或其組合。 59.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含GlcNAc、甘露糖、半乳糖、唾液酸及岩藻糖或其組合。 60.      如實施例57之醫藥組合物，其經調配用於向有需要之人類個體全身投與。 61.      如實施例57之醫藥組合物，其經調配用於向有需要之哺乳動物個體全身投與。 62.      如實施例57之醫藥組合物，其適用於向有需要之人類個體多次全身投與。 63.      如實施例57之醫藥組合物，其適用於向有需要之哺乳動物個體多次全身投與。 64.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基，其中該第一或第二末端殘基中之至少一者包含唾液酸。 65.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一或第二或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸。 66.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一或第二或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸殘基，該殘基包含一或多個聚唾液酸末端修飾。 67.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含連接至該聚醣之核心或鹼基中之GlcNAc殘基的岩藻糖。 68.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含連接至存在於樹或臂中之GlcNAc殘基的岩藻糖。 69.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含超過一個臂，該等兩個臂之間具有GlcNAc，從而產生二等分聚醣。 70.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一及第二末端殘基中之至少一者包含岩藻糖。 71.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基，其中至少一個末端殘基包含唾液酸且至少一個末端殘基包含岩藻糖。 72.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中至少一個末端殘基為唾液酸且一個末端殘基為岩藻糖。 73.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中該核酸包含經修飾之核苷酸。 74.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中該核酸包括經修飾之核苷酸，其中該經修飾之核苷酸的核酸位置可不同。 75.      如實施例57之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中該核酸包括經修飾之核苷酸，其中該等修飾正交以偶合兩個或更多個聚醣。 76.      如實施例57之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸包含至少約15、20、25、30、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或大於10000個核苷酸。 77.      如實施例57之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸不包含非天然核苷酸。 78.      如實施例57之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸包含少於約15、20、25、30或50個核苷酸。 79.      如實施例57之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸包含微核酸結合部分。 80.      如實施例57之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸包含編碼多肽之序列。 81.      如實施例57之醫藥組合物，其進一步包含可操作地連接於經修飾之核酸之治療部分，其中該治療部分係選自抗體、小分子、同位素、酶及肽。 82.      如實施例57之醫藥組合物，其中經修飾之核酸包含核苷與聚醣之間的可裂解連接子。 83.      如實施例57之醫藥組合物，其中經修飾之核酸包含核酸與聚醣之間的可裂解連接子，其中該可裂解連接子為pH依賴性的二硫鍵、肽裂解位點或cit-val連接子。 84.      一種產生持久的藥效學作用之方法，其包含向有需要之個體投與經聚醣修飾之核酸。 85.      一種治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣。 86.      一種治療自體免疫疾病之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣。 87.      一種治療IgE介導之過敏之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣。 88.      一種治療全身性紅斑性狼瘡症之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣。 89.      一種治療病毒性感染之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣。 90.      一種遞送嵌合抗原受體之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣，其中該經修飾之核酸包含編碼嵌合抗原受體多肽之序列。 91.      一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之經修飾之核酸的製劑；及 c)         使該經修飾之核酸與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該經修飾之核酸。 92.      一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之小型經修飾之核酸的製劑；及 c)         使該小型經修飾之核酸與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該小型經修飾之核酸。 93.      一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之大型經修飾之核酸的製劑；及 c)         使該大型經修飾之核酸與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該大型經修飾之核酸。 94.      一種產生經修飾之核酸之方法，其包含： a)         提供核酸；及 b)         使該核酸與聚醣在使得該核酸藉由使該核酸與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸。 95.      一種產生脂質奈米粒子(LNP)之方法，其包含： a)         提供核酸； b)         使該核酸與聚醣在使得該核酸藉由使該核酸與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸； c)         使該經修飾之核酸與脂質在使得形成LNP之條件下接觸。 96.      一種產生經修飾之核酸之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣； b)         提供LNP；及 c)         使該經修飾之核酸與LNP在使得該經修飾之核酸存在於該LNP中及/或該LNP之表面上的條件下接觸。 97.      一種產生核酸-奈米粒子之方法，其包含： a)         提供核酸； b)         使該核酸與聚醣在使得該核酸藉由使該核酸與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸； c)         使該經修飾之核酸與奈米粒子在使得形成核酸-奈米粒子之條件下接觸。 98.      一種產生經修飾之核酸之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣； b)         提供奈米粒子；及 c)         使該經修飾之核酸與奈米粒子在使得該經修飾之核酸存在於該奈米粒子中及/或該奈米粒子之表面上的條件下接觸。 99.      一種遞送經修飾之核酸之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣；及 b)         提供電穿孔。 100.    一種產生經修飾之核酸之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少十個單醣；及 b)         提供血清，其中該聚醣向該血清內之該核酸提供穩定。 101.    一種產生經修飾之核酸之方法，其包含經修飾之核酸，該經修飾之核酸包含有包含至少十個單醣的聚醣部分，其中該經修飾之核酸調節細胞表面受體，該方法包含使含有受體之細胞與經修飾之核酸接觸。 102.    一種產生經修飾之核酸之方法，其包含： a)         提供核酸；及 b)         使該核酸與聚醣接觸，其中該聚醣包含N-乙醯基半乳糖胺。 103.    一種包含經修飾之裸核酸之醫藥組合物，其包含有包含至少十個單醣之聚醣部分。 104.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少一個單醣。 105.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少兩個單醣。 106.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少三個單醣。 107.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少四個單醣。 108.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少五個單醣。 109.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少六個單醣。 110.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少七個單醣。 111.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少八個單醣。 112.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之核酸，該聚醣部分包含至少九個單醣。 113.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 114.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含唾液酸、岩藻糖或其組合。 115.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含GlcNAc、甘露糖、半乳糖、唾液酸及岩藻糖或其組合。 116.    如實施例113之醫藥組合物，其經調配用於向有需要之人類個體全身投與。 117.    如實施例113之醫藥組合物，其經調配用於向有需要之哺乳動物個體全身投與。 118.    如實施例113之醫藥組合物，其適用於向有需要之人類個體多次全身投與。 119.    如實施例113之醫藥組合物，其適用於向有需要之哺乳動物個體多次全身投與。 120.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基，其中該第一或第二末端殘基中之至少一者包含唾液酸。 121.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一或第二或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸。 122.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一或第二或第三末端殘基中之至少一者包含唾液酸殘基，該殘基包含一或多個聚唾液酸末端修飾。 123.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含連接至該聚醣之核心或鹼基中之GlcNAc殘基的岩藻糖。 124.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含連接至存在於樹或臂中之GlcNAc殘基的岩藻糖。 125.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含超過一個臂，該等兩個臂之間具有GlcNAc，從而產生二等分聚醣。 126.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中該第一及第二末端殘基中之至少一者包含岩藻糖。 127.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含雙觸角N-連接之聚醣，該雙觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基，其中至少一個末端殘基包含唾液酸且至少一個末端殘基包含岩藻糖。 128.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含三觸角N-連接之聚醣，該三觸角N-連接之聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基，其中至少一個末端殘基為唾液酸且一個末端殘基為岩藻糖。 129.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中DNA包含經修飾之核苷酸。 130.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中該核酸包括經修飾之核苷酸，其中該經修飾之核苷酸的核酸位置可不同。 131.    如實施例113之醫藥組合物，其中該聚醣部分包含N-連接之聚醣，且其中該核酸包括經修飾之核苷酸，其中該等修飾正交以偶合兩個或更多個聚醣。 132.    如實施例113之醫藥組合物，其中經修飾之DNA包含至少約15、20、25、30、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或大於10000個核苷酸。 133.    如實施例113之醫藥組合物，其中該經修飾之DNA不包含非天然核苷酸。 134.    如實施例113之醫藥組合物，其中該經修飾之DNA包含少於約15、20、25、30或50個核苷酸。 135.    如實施例113之醫藥組合物，其中該經修飾之DNA包含微小RNA結合部分。 136.    如實施例113之醫藥組合物，其中該經修飾之DNA包含編碼多肽之序列。 137.    如實施例113之醫藥組合物，其進一步包含可操作地連接於該經修飾之DNA的治療部分，其中該治療部分係選自抗體、小分子、同位素、酶及肽。 138.    如實施例113之醫藥組合物，其中經修飾之DNA包含DNA與聚醣之間的可裂解連接子。 139.    如實施例113之醫藥組合物，其中經修飾之DNA包含DNA與聚醣之間的可裂解連接子，其中該可裂解連接子為pH依賴性的二硫鍵、肽裂解位點或cit-val連接子。 140.    一種產生持久的藥效學作用之方法，其包含向有需要之個體投與經聚醣修飾之DNA。 141.    一種治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 142.    一種治療自體免疫疾病之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 143.    一種治療IgE介導之過敏之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 144.    一種治療全身性紅斑性狼瘡症之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 145.    一種治療病毒性感染之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣。 146.    一種遞送嵌合抗原受體之方法，其包含向有需要之人類個體投與有效量之包含以下之醫藥組合物： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣，其中該經修飾之DNA包含編碼嵌合抗原受體多肽之序列。 147.    一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之經修飾之DNA的製劑；及 c)         使經修飾之DNA與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該經修飾之DNA。 148.    一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之小型經修飾之DNA的製劑；及 c)         使該小型經修飾之DNA與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該小型經修飾之DNA。 149.    一種製造細胞或複數個細胞之方法，其包含： a)         提供分離細胞或複數個經分離細胞； b)         提供包含聚醣之大型經修飾之DNA的製劑；及 c)         使該大型經修飾之DNA與該經分離之細胞或該複數個細胞接觸，其中該經分離細胞或該複數個細胞能夠結合該大型經修飾之DNA。 150.    一種產生經修飾之DNA之方法，其包含： a)         提供DNA；及 b)         使該DNA與聚醣在使得該DNA藉由使該DNA與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸。 151.    一種產生脂質奈米粒子(LNP)之方法，其包含： a)         提供DNA； b)         使該DNA與聚醣在使得該DNA藉由使該DNA與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸； c)         使該經修飾之DNA與脂質在使得形成LNP之條件下接觸。 152.    一種產生經修飾之DNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣； b)         提供LNP；及 c)         使該經修飾之DNA與LNP在使得該經修飾之DNA存在於該LNP中及/或該LNP之表面上的條件下接觸。 153.    一種產生DNA-奈米粒子(DNA NP)之方法，其包含： a)         提供DNA； b)         使該DNA與聚醣在使得該DNA藉由使該DNA與該聚醣結合而經修飾的條件下接觸； c)         使該經修飾之DNA與奈米粒子在使得形成DNA NP之條件下接觸。 154.    一種產生經修飾之DNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣； b)         提供奈米粒子；及 c)         使該經修飾之DNA與奈米粒子在使得該經修飾之DNA存在於該奈米粒子中及/或該奈米粒子之表面上的條件下接觸。 155.    一種遞送經修飾之DNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣；及 b)         提供電穿孔。 156.    一種產生經修飾之DNA之方法，其包含： a)         提供包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少十個單醣；及 b)         提供血清，其中該聚醣向該血清內之該DNA提供穩定。 157.    一種產生經修飾之DNA之方法，其包含經修飾之DNA，該經修飾之DNA包含有包含至少十個單醣的聚醣部分，其中該經修飾之DNA調節細胞表面受體，該方法包含使含有受體之細胞與經修飾之DNA接觸。 158.    一種產生經修飾之DNA之方法，其包含： a)         提供DNA；及 b)         使該DNA與聚醣接觸，其中該聚醣包含N-乙醯基半乳糖胺。 159.    一種包含經修飾之裸DNA之醫藥組合物，其包含有包含至少十個單醣之聚醣部分。 160.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少一個單醣。 161.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少兩個單醣。 162.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少三個單醣。 163.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少四個單醣。 164.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少五個單醣。 165.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少六個單醣。 166.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少七個單醣。 167.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少八個單醣。 168.    一種醫藥組合物，其包含： a)         醫藥學上可接受之載劑；及 b)         包含聚醣部分之經修飾之DNA，該聚醣部分包含至少九個單醣。 169.    如前述實施例中任一例之醫藥組合物，其限制條件為該醫藥組合物不包括LNP或其他核酸遞送媒劑。 例示性實施例 - 部分 B
以下描述性實施例意欲說明本文中所涵蓋的發明： 1.      一種用於減少表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞與呈現細胞表面醣基化核糖核酸(醣RNA)之細胞之間的相互作用的方法，其包含： 使表現GBP之細胞與結合至表現GBP之細胞的表面上表現的GBP的可溶性醣RNA以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。 2.      如實施例1之方法，其中該等可溶性醣RNA包含來自Y RNA家族之RNA。 3.      如實施例2之方法，其中該等可溶性醣RNA包含Y5 RNA。 4.      如實施例1至3中任一例之方法，其中該等可溶性醣RNA包含snoRNA、tRNA、snRNA、rRNA或其任何組合。 5.      如實施例1至4中任一例之方法，其中該等可溶性醣RNA包含可溶性唾液酸化RNA。 6.      如實施例5之方法，其中該等可溶性唾液酸化RNA包含Neu5Ac、Neu5Gc或其組合。 7.      如實施例1至6中任一例之方法，其中該等可溶性醣RNA與一或多種試劑結合。 8.      如實施例7之方法，其中該一或多種試劑包含治療劑。 9.      如實施例7或實施例8之方法，其中一或多種試劑包含可偵測標記。 10.    如實施例1至9中任一例之方法，其中該GBP包含唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)。 11.    如實施例10之方法，其中該等Siglec包含Siglec-11。 12.    如實施例10或實施例11之方法，其中該等Siglec包含Siglec-14。 13.    如實施例1至12中任一例之方法，其中該GBP包含C型凝集素。 14.    如實施例1至13中任一例之方法，其中該等GBP包含半乳糖凝集素。 15.    如實施例1至14中任一例之方法，其中該等GBP包含選擇素。 16.    一種用於減少表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用的方法，其包含： 使表現GBP之細胞與結合至表現GBP之細胞的表面上表現的GBP且識別為結合至細胞表面醣RNA的試劑以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。 17.    如實施例16之方法，其中該試劑為在該表現GBP之細胞表面上表現的GBP的配體。 18.    如實施例16之方法，其中該試劑為結合至在該表現GBP之細胞表面上表現的GBP的抗體。 19.    如實施例16至18中任一例之方法，其中該試劑結合之GBP為一或多種唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)。 20.    如實施例19之方法，其中該一或多種Siglec包含Siglec-11。 21.    如實施例19或實施例20之方法，其中該一或多種Siglec包含Siglec-14。 22.    如實施例16至21中任一例之方法，其中該試劑結合之GBP包含C型凝集素。 23.    如實施例16至22中任一例之方法，其中該試劑結合之GBP包含半乳糖凝集素。 24.    如實施例16至23中任一例之方法，其中該試劑結合之GBP包含選擇素。 25.    一種用於減少表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用的方法，其包含： 使呈現細胞表面醣RNA之細胞與結合至及/或編輯細胞表面醣RNA之試劑以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。 26.    如實施例25之方法，該試劑編輯細胞表面醣RNA。 27.    如實施例26之方法，其中該試劑為自細胞表面醣RNA移除聚醣之酶。 28.    如實施例27之方法，其中細胞表面醣RNA包含細胞表面唾液酸化RNA，且其中該試劑包含唾液酸酶。 29.    如實施例26之方法，其中該試劑包含核糖核酸酶(RNA酶)。 30.    如實施例29之方法，其中該RNA酶為RNA酶A、T1 RNA酶或T2 RNA酶。 31.    如實施例29或實施例30之方法，其中該RNA酶為人類RNA酶。 32.    如實施例31之方法，其中該人類RNA酶為人類RNA酶1。 33.    如實施例25至32中任一例之方法，其中該試劑與使該試劑靶向呈現細胞表面醣RNA之細胞的靶向部分穩定結合。 34.    如實施例33之方法，其中該靶向部分為抗體、配體、適體或小分子。 35.    如實施例25之方法，該試劑結合至細胞表面醣RNA。 36.    如實施例35之方法，其中該試劑為結合至細胞表面醣RNA之抗體。 37.    如實施例36之方法，其中該抗體為抗RNA抗體。 38.    如實施例37之方法，其中該抗RNA抗體為抗雙股RNA (dsRNA)抗體。 39.    如實施例35之方法，其中該試劑包含結合至細胞表面醣RNA之聚醣結合部分。 40.    一種使試劑靶向表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞的方法，其包含： 使表現GBP之細胞與穩定與該試劑結合之可溶性醣基化核糖核酸(醣RNA)進行接觸。 41.    如實施例40之方法，其中該等可溶性醣RNA結合至該試劑。 42.    如實施例40或實施例41之方法，其中該試劑為表現GBP之細胞調節劑。 43.    如實施例40或實施例41之方法，其中該試劑為治療劑。 44.    如實施例40或實施例41之方法，其中該試劑包含可偵測標記。 45.    如實施例1至44中任一例之方法，其中該方法係在活體外、活體內或離體進行。 46.    如實施例1至15中任一例之方法，其中該方法係在活體內進行，且其中該接觸包含以有效減少個體中表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量向有需要之個體投與可溶性醣RNA。 47.    如實施例16至39中任一例之方法，其中該方法係在活體內進行，且其中該接觸包含以有效減少個體中表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量向有需要之個體投與試劑。 48.    如實施例40至44中任一例之方法，其中該方法係在活體內進行，且其中該接觸包含向個體投與與該試劑穩定結合之可溶性醣RNA。 49.    如實施例46至48中任一例之方法，其中該投與藉由非經腸或經口投與進行。 50.    一種醫藥組合物，其包含： 可溶性醣基化核糖核酸(醣RNA)；及 醫藥學上可接受之載劑。 51.    如實施例50之醫藥組合物，其中該等可溶性醣RNA包含來自Y RNA家族之RNA。 52.    如實施例51之醫藥組合物，其中該等可溶性醣RNA包含Y5 RNA。 53.    如實施例50至52中任一例之醫藥組合物，其中該等可溶性醣RNA包含snoRNA、tRNA、snRNA或其任何組合。 54.    如實施例50至53中任一例之醫藥組合物，其中該等可溶性醣RNA包含可溶性唾液酸化RNA。 55.    如實施例54之醫藥組合物，其中該等可溶性唾液酸化RNA包含Neu5Ac、Neu5Gc或其組合。 56.    如實施例50至55中任一例之醫藥組合物，其中該等可溶性醣RNA與一或多種試劑結合。 57.    如實施例56之醫藥組合物，其中該一或多種試劑包含治療劑。 58.    如實施例56或實施例57之醫藥組合物，其中該一或多種試劑包含可偵測標記。 59.    一種結合物，其包含： 如實施例51至55中任一例中所定義之與一或多種試劑結合的可溶性醣基化核糖核酸(醣RNA)。 60.    如實施例59之結合物，其中一或多種試劑包含治療劑。 61.    如實施例59或實施例60之結合物，其中一或多種試劑包含可偵測標記。 62.    一種結合物，其包含： 與核糖核酸酶(RNA酶)結合之靶向部分。 63.    如實施例62之結合物，其中該靶向部分係抗體、配體、適體或小分子。 64.    一種融合蛋白，其包含： 與核糖核酸酶(RNA酶)融合之靶向部分。 65.    如實施例64之融合蛋白，其中該靶向部分為抗體或配體。 66.    如實施例62或實施例63之結合物或如實施例64或實施例65之融合蛋白，其中該RNA酶係RNA酶A、T1 RNA酶或T2 RNA酶。 67.    如實施例62至66中任一例之結合物或融合蛋白，其中該RNA酶為人類RNA酶。 68.    如實施例67之結合物或融合蛋白，其中該人類RNA酶為人類RNA酶1。 69.    一種評估用於醣基化核糖核酸(醣RNA)之生物樣品的方法，其包含對該生物樣品執行醣RNA偵測分析。 70.    如實施例69之方法，其中該生物樣品係細胞樣品。 71.    如實施例70之方法，其中該分析為細胞表面醣RNA偵測分析。 72.    如實施例71之方法，其中細胞表面醣RNA偵測分析包含使細胞樣品之細胞與醣RNA結合劑接觸，及評估醣RNA結合劑與樣品中之細胞表面醣RNA之結合。 73.    如實施例72之方法，其中該醣RNA結合劑為結合至細胞表面醣RNA之抗體。 74.    如實施例73之方法，其中該抗體為抗RNA抗體。 75.    如實施例74之方法，其中該抗RNA抗體為抗雙股RNA (dsRNA)抗體。 76.    如實施例71之方法，其中該細胞表面醣RNA偵測分析包含使細胞樣品之細胞與核糖核酸酶(RNA酶)接觸以消化細胞表面醣RNA (若存在)及評估細胞表面醣RNA之降解。 77.    如實施例69或實施例70之方法，其中該分析為游離醣RNA偵測分析。 78.    如實施例69至77中任一例之方法，其中該生物樣品為組織樣品或體液樣品。 79.    如實施例69至78中任一例之方法，其中該生物樣品為活檢樣品。 80.    一種產生醣基化核糖核酸(醣RNA)之方法，其包含： 在產生醣RNA之條件下培養產生醣RNA之細胞；及 分離所產生之醣RNA。 81.    如實施例80之方法，其中分離該所產生之醣RNA包含分離由該等細胞產生之膜醣RNA。 82.    如實施例81之方法，其中分離所產生之醣RNA包含分離由該等細胞產生之質膜醣RNA。 83.    如實施例82之方法，其中分離由該等細胞產生之質膜醣RNA包含自該等細胞之質膜裂解該等醣RNA。 84.    如實施例80之方法，其中分離該所產生之醣RNA包含分離由該等細胞產生之游離醣RNA。 85.    如實施例84之方法，其包含分離由該等細胞分泌之游離醣RNA。 86.    如實施例80至85中任一例之方法，其包含向細胞提供過量核苷酸以相比於在無過量核苷酸存在下之通量，增加RNA生物合成之通量。 87.    如實施例80至86中任一例之方法，其包含向該等細胞提供過量糖以相較於在無過量糖下之通量，增加聚醣生物合成之通量。 88.    如實施例87之方法，其中過量糖包含過量葡萄糖、半乳糖、GlcNAc或其任何組合。 89.    如實施例80至88中任一例之方法，其包含抑制該等細胞中之一或多個細胞膜轉換路徑以增強細胞表面醣RNA之累積及分離該等累積之細胞表面醣RNA。 90.    如實施例80至89中任一例之方法，其包含抑制一部分聚醣生物合成路徑以促進產生RNA聚醣。 91.    如實施例90之方法，其包含抑制O-聚醣產生以促進N-聚醣產生。 92.    一種在細胞表面上工程改造呈現醣基化核糖核酸(醣RNA)之方法，其包含： 將編碼一或多種核糖核酸及/或聚醣生物合成酶之一或多個表現構築體引入細胞中，使得細胞在其表面上呈現一或多種類型之相關醣RNA。 93.    如實施例92之方法，其中利用一或多種類型之所呈現之醣RNA獨特地識別細胞。 例示性實施例 - 部分 C 1.         一種式(I)之化合物：
Figure 02_image081
， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。 2.         如實施例1之化合物，其中 A為DNA。 3.         如實施例1之化合物，其中 A為RNA。 4.         如實施例1至3中任一例之化合物，其中A為反義寡核苷酸(ASO)。 5.         如實施例1或3之化合物，其中A為siRNA。 6.         如實施例1或3之化合物，其中A為siRNA，其包含選自由以下組成之群的修飾：2'OMe修飾、氟修飾、硫代磷酸酯修飾。 7.         如實施例1或3之化合物，其中A為mRNA。 8.         如實施例1或3之化合物，其中A為嚮導RNA。 9.         如實施例1或3之化合物，其中A為環狀RNA (circRNA)。 10.       如實施例1或3之化合物，其中A為適體RNA。 11.       如實施例1至10中任一例之化合物，其中點擊化學反應為銅催化之疊氮化物-炔烴環化(CuAAC)。 12.       如實施例1至10中任一例之化合物，其中點擊化學反應為應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)。 13.       如實施例1至10中任一例之化合物，其中點擊化學反應為反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合或反式環辛烯-四𠯤接合。 14.       如實施例1至10中任一例之化合物，其中點擊化學反應為疊氮化物-施陶丁格接合、一級胺及N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)之間的交聯、反式環辛炔-疊氮化物偶合或環丙烷-疊氮化物偶合。 15.       如實施例1至13中任一例之化合物，其中L具有下式：
Figure 02_image083
Figure 02_image085
Figure 02_image087
，其中*指示與A之連接點，且#指示與B之連接點。 16.       如實施例1至11或15中任一例之化合物，其中L具有下式：
Figure 02_image089
Figure 02_image091
，其中*指示與A之連接點，且#指示與B之連接點。 17.       如實施例1至16中任一例之化合物，其中L連接至核酸 A之鹼基。 18.       如實施例1至16中任一例之化合物，其中L連接至核酸 A之核糖之2'OH位置。 19.       如實施例1至16中任一例之化合物，其中L連接至核酸 A之核糖或去氧核糖之3'OH位置。 20.       如實施例1至16中任一例之化合物，其中L連接至核酸 A之核糖或去氧核糖之5'OH位置。 21.       如實施例1至20中任一例之化合物，其中L連接至 B之非還原末端。 22.       如實施例1至21中任一例之化合物，其中該N-聚醣為單觸角N-聚醣。 23.       如實施例1至21中任一例之化合物，其中該N-聚醣為雙觸角N-聚醣。 24.       如實施例1至21中任一例之化合物，其中該N-聚醣為三觸角N-聚醣。 25.       如實施例1至21中任一例之化合物，其中該N-聚醣為四觸角N-聚醣。 26.       如實施例1至25中任一例之化合物，其中該N-聚醣包含唾液酸。 27.       如實施例1至26中任一例之化合物，其中N-聚醣具有下式：
Figure 02_image093
。 28.       如實施例1、2、4或11至27中任一例之化合物，其中 A具有與5'- GGC TGG TCC GAG TGC AGT GGT GTT TAC AAC TAA TTG ATC ACA ACC AGT TAC AGA TTT CT/i5OctdU/ TGT TCC TTC TCC ACT CCC ACT GCT TCA CTT GAC TAG CCT T-3' (SEQ ID NO: 1)之全長序列具有至少80%序列一致性的序列。 29.       如實施例1或3至28中任一例之方法，其中 A具有與以下全長序列具有至少80%序列一致性之序列：
Figure 02_image095
30.       如實施例1至29中任一例之化合物，其中當A為siRNA、ASO、mRNA、適體RNA、環狀RNA或嚮導RNA時，式( I)化合物具有圖9中所描繪之式；或 SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image097
；或 SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image099
；或 SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image101
SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image103
；或 SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image105
或； SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image107
或； SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image109
；或 SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image111
； 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物。 31.       一種製備式(I)化合物之方法：
Figure 02_image113
， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子； 該方法包含 第一步驟使：包含該第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的該核酸 A； 與化合物 B反應，其為包含該第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)； 其中該第一步驟之反應在雙正交點擊化學條件下進行。 32.       如實施例31之方法，其中該第一步驟在以下點擊化學反應之條件下進行：銅催化之疊氮化物-炔烴環化(CuAAC)、應變促進之疊氮化物-炔烴環加成(SPAAC)、反式環辛炔(TCO)-四𠯤接合或疊氮化物-施陶丁格接合。 33.       如實施例31之方法，其中該第一步驟在CuAAC之條件下進行，包含在水中稀釋經炔烴修飾之核酸 A且視情況在90至100℃之間的溫度下變性約1至5分鐘以產生反應混合物。 34.       如實施例33之方法，其中在水中稀釋經炔烴修飾之核酸 A為將其稀釋至100 µM至125 µM之間的最終濃度。 35.       如實施例33或34之方法，其中變性在約95℃之溫度下進行兩分鐘。 36.       如實施例31至35中任一例之方法，其進一步包含將該反應混合物置於冰上，之後為在35至39℃下摺疊於MgCl及中性磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中大約5-10分鐘之步驟。 37.       如實施例31至36中任一例之方法，其進一步包含向反應物混合物添加配體2-(4-((雙((1-(三級丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸(BTTAA)且在約18至23℃下培育。 38.       如實施例31至37中任一例之方法，其進一步包含使 A、 B、Cu-BTTAA及含PBS之抗壞血酸鈉在大約20至24℃下反應至少大約6至48小時。 39.       如實施例38之方法，其包含使大約10 µM A、大約20 µM B及大約100-110 µM Cu-BTTAA反應。 40.       如實施例31至39中任一例之方法，其進一步包含添加大約15至20 mM乙二胺四乙酸(EDTA)。 41.       如實施例31至40中任一例之方法，其進一步包含酶轉化式( I)化合物之N-聚醣的步驟。 42.       如實施例41之方法，其中該酶轉化包含藉由唾液酸轉移酶或岩藻糖基轉移酶來添加糖。 43.       如實施例41之方法，其中該酶轉化包含甘露糖苷酶裂解。 44.       如實施例31至43中任一例之方法，其進一步包含沈澱該式( I)化合物。 45.       如實施例31至44中任一例之方法，其中 A為DNA。 46.       如實施例31至44中任一例之方法，其中 A為RNA。 47.       如實施例31至46中任一例之方法，其中 A為ASO。 48.       如實施例31至47中任一例之方法，其中 A為siRNA、mRNA、嚮導RNA、環狀RNA或適體RNA。 49.       如實施例31至48中任一例之方法，其中該第一點擊化學手柄為炔烴。 50.       如實施例49之方法，其中炔烴包含下式：
Figure 02_image115
。 51.       如實施例31至50中任一例之方法，其中核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸鹼基之炔烴。 52.       如實施例31至51中任一例之方法，其中 A包含以下結構：
Figure 02_image117
(5-辛二炔基dU)，且 A為RNA或DNA。 53.       如實施例31至52中任一例之方法，其中核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸之核糖的2'OH位置之炔烴。 54.       如實施例31至52中任一例之方法，其中核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸之去氧核糖或核糖之3'OH位置的炔烴。 55.       如實施例31至52中任一例之方法，其中核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸之去氧核糖或核糖之5'OH位置的炔烴。 56.       如實施例31至48中任一例之方法，其中該第一點擊化學手柄為疊氮化物。 57.       如實施例56之方法，其中核酸 A包含第一點擊化學手柄，其為連接至核酸鹼基之疊氮化物。 58.       如實施例31至57中任一例之方法，其中該第二點擊化學手柄為炔烴。 59.       如實施例31至58中任一例之方法，其中化合物 B包含第二點擊化學手柄，其為連接至N-聚醣之非還原末端的炔烴。 60.       如實施例31至57中任一例之方法，其中該第二點擊化學手柄為疊氮化物。 61.       如實施例31至57或60中任一例之方法，其中化合物 B包含第二點擊化學手柄，其為連接至N-聚醣之非還原末端的疊氮化物。 62.       如實施例31至61中任一例之方法，其中化合物 B具有下式：
Figure 02_image119
、 G-28、G-29、G-35或G-30。 63.       如實施例31至62中任一例之方法，其中該化合物 B為G-28、G-29、G-35或G-30。 64.       如實施例31至45、47或49至63中任一例之方法，其中該DNA包含以下序列：5'- GGC TGG TCC GAG TGC AGT GGT GTT TAC AAC TAA TTG ATC ACA ACC AGT TAC AGA TTT CT/i5OctdU/ TGT TCC TTC TCC ACT CCC ACT GCT TCA CTT GAC TAG CCT T-3' (SEQ ID NO: 1)。 65.       如實施例31至44或46至63中任一例之方法，其中該RNA包含以下序列：AGUUGGTCCGAGUGUUGUGGGUUAUUGUUAAGUU/i5OctdU/AUUUAACAUUGUCUCCCCCCACAACCGCGCUUGACUAGCUUGCUG (SEQ ID NO: 2)。 66.       如實施例31至65中任一例之方法，其中當A為siRNA、ASO、mRNA、適體RNA、環狀RNA或嚮導RNA時，式( I)化合物具有圖9中所描繪之式；或 SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image121
；或 SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image123
；或 SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image125
；或 SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image127
；或 SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image129
或； SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image131
或； SEQ ID NO: 1，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image133
；或 SEQ ID NO: 2，其中i5OctdU結合形成以下結構：
Figure 02_image135
; 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物。 67.       一種組合物，其包含如實施例1至66中任一例之化合物或其鹽、溶劑合物、水合物、同質異晶物、共晶體、互變異構物、立體異構物、經同位素標記之衍生物或前藥及視情況選用之賦形劑。 68.       一種套組，其包含： 如實施例1至66中任一例之化合物或如實施例67之組合物；及 用於向個體投與或使生物樣品與該化合物或其組合物接觸之說明書。 例示性實施例 - 部分 D 1.      一種醫藥組合物，其包含： a)         醣核酸，該醣核酸包含： i)核酸；及 ii)至少一個結合至該核酸之包含至少6個單醣的聚醣部分；及 b)         醫藥學上可接受之載劑。 2.      如實施例1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含至少8個單醣。 3.      如實施例1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含至少10個單醣。 4.      如前述實施例中任一例之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含 N-連接之聚醣。 5.      如實施例1至3中任一例之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含 O-連接之聚醣。 6.      如前述實施例中任一例之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含雙觸角聚醣，其中該雙觸角聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基。 7.      如實施例1至5中任一例之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含三觸角聚醣，其中該三觸角聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基。 8.      如實施例6或7中任一例之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含唾液酸。 9.      如實施例6或7中任一例之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含岩藻糖。 10.    如實施例6或7中任一例之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含GlcNAc。 11.    如實施例6或7中任一例之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含甘露糖。 12.    如實施例6或7中任一例之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含NeuNAc。 13.    如實施例6或7中任一例之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含半乳糖。 14.    如前述實施例中任一例之醫藥組合物，其中該核酸為RNA。 15.    如實施例14之醫藥組合物，其中該核酸為siRNA。 16.    如實施例14之醫藥組合物，其中該核酸為mRNA。 17.    如實施例14之醫藥組合物，其中該核酸為環狀RNA。 18.    如實施例14之醫藥組合物，其中該核酸為嚮導RNA。 19.    如實施例14之醫藥組合物，其中該核酸為適體RNA。 20.    如實施例1至13中任一例之醫藥組合物，其中該核酸為DNA。 21.    如前述實施例中任一例之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含表2A或2B之化合物。 22.    如前述實施例1至20中任一例之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸包含表1之核酸。 23.    如前述實施例中任一例之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分經由點擊化學反應與該經修飾之核酸結合。 24.    如前述實施例中任一例之醫藥組合物，其中該核酸經由共價結合至該核酸之末端的連接子基團與該聚醣結合。 25.    如實施例1至23中任一例之醫藥組合物，其中該核酸經由共價結合至該核酸中間之經化學修飾之核苷酸的連接子與該聚醣結合。 26.    如實施例1至23中任一例之醫藥組合物，其中該核酸經由共價結合至經化學修飾之核苷酸的連接子與該聚醣結合，該經化學修飾之核苷酸不位於該核酸之3'末端或5'末端。 27.    如實施例1之醫藥組合物，其中該核酸經由插入該核酸之兩個核苷酸之間的化學手柄與該聚醣結合。 28.    如實施例27之醫藥組合物，其中該兩個核苷酸不包括在該核酸之3'末端或5'末端處之核苷酸。 29.    如實施例1之醫藥組合物，其中該醣核酸包含式(I)化合物： A-L-B(I)， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。 30.    一種式(I)之醣核酸化合物： A-L-B(I)， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。 31.    如實施例30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之DNA。 32.    如實施例30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之siRNA。 33.    如實施例30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之mRNA。 34.    如實施例30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之環狀RNA。 35.    如實施例30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之DNA。 36.    如實施例30之醣核酸，其中A包含選自表4中在「試劑A」下所列出之彼等的第一點擊化學手柄，且其中B包含選自表4中在「試劑B」下所列出之彼等的第二點擊化學手柄。 37.    如實施例30之醣核酸，其中A包含選自表4中在「試劑B」下所列出之彼等的第一點擊化學手柄，且其中B包含選自表4中在「試劑A」下所列出之彼等的第二點擊化學手柄。 38.    如實施例30至37中任一例之醣核酸，其中B為包含雙觸角聚醣之天冬醯胺連接之聚醣，其中該雙觸角聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基。 39.    如實施例30至37中任一例之醣核酸，其中B為包含三觸角聚醣之天冬醯胺連接之聚醣，其中該三觸角聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基。 40.    如實施例38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含唾液酸。 41.    如實施例38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含岩藻糖。 42.    如實施例38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含GlcNAc。 43.    如實施例38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含甘露糖。 44.    如實施例38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含NeuNAc。 45.    如實施例38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基(若存在)中之至少一者包含半乳糖。 46.    一種治療疾病或病況之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例1至29中任一例之醫藥組合物或如實施例30至45中任一例之醣核酸；其中該疾病或病況係選自發炎病症、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、凝血疾病、抗凝血疾病、過敏、病毒性疾病及微生物感染。 47.    如實施例46之方法，其中該疾病或病況為發炎。 48.    如實施例46之方法，其中該疾病或病況為癌症。 49.    如實施例46之方法，其中該疾病或病況為自體免疫疾病。 50.    如實施例46之方法，其中該過敏為IgE介導之過敏。 51.    如實施例46之方法，其中該自體免疫疾病為全身性紅斑狼瘡。 52.    如實施例46之方法，其中該疾病或病況為微生物感染。 53.    如實施例46之方法，其中該疾病或病況為病毒性感染。 54.    如實施例46之方法，其中該疾病或病況為代謝疾病。 55.    一種如實施例1至29中任一例之醫藥組合物或如實施例30至45中任一例之醣核酸的用途，其用於製造供治療疾病或病況用之藥劑，其中該疾病或病況係選自發炎病症、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、凝血疾病、抗凝血疾病、過敏、病毒性疾病及微生物感染。 56.    一種如請求項1至29中任一項之醫藥組合物或如實施例30至45中任一例之醣核酸的用途，其係用於治療有需要之個體之疾病或病況，其中該疾病或病況係選自發炎病症、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、凝血疾病、抗凝血疾病、過敏、病毒性疾病及微生物感染。 57.    一種用於減少表現聚醣結合蛋白(GBP)之細胞與呈現細胞表面醣基化核糖核酸(醣RNA)之細胞之間的相互作用的方法，其包含： 使表現GBP之細胞與結合至表現GBP之細胞的表面上表現的GBP的可溶性醣RNA以有效減少表現GBP之細胞與呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量進行接觸。 58.    如實施例57之方法，其中該等可溶性醣RNA包含來自Y RNA家族之RNA。 59.    如實施例58之方法，其中該等可溶性醣RNA包含Y5 RNA。 60.    如實施例57至59中任一例之方法，其中該等可溶性醣RNA包含snoRNA、tRNA、snRNA、rRNA或其任何組合。 61.    如實施例57至59中任一例之方法，其中該等可溶性醣RNA包含可溶性唾液酸化RNA。 62.    如實施例61之方法，其中該等可溶性唾液酸化RNA包含Neu5Ac、Neu5Gc或其組合。 63.    如實施例57至62中任一例之方法，其中該等可溶性醣RNA與一或多種試劑結合。 64.    如實施例63之方法，其中該一或多種試劑包含治療劑。 65.    如實施例63或64之方法，其中該一或多種試劑包含可偵測標記。 66.    如實施例57至65中任一例之方法，其中該GBP包含唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)。 67.    如實施例66之方法，其中該等Siglec包含Siglec-11。 68.    如實施例66之方法，其中該等Siglec包含Siglec-14。 69.    如實施例57至65中任一例之方法，其中該等GBP包含C型凝集素。 70.    如實施例57至65中任一例之方法，其中該等GBP包含半乳糖凝集素。 71.    如實施例57至65中任一例之方法，其中該等GBP包含選擇素。
以下實例係為了說明，而非為了限制而提供。 實例 實例 1- 聚醣代謝報導子併入至細胞 RNA 中
為探究可能存在的經唾液酸聚醣修飾之RNA(下文稱為醣RNA)，HeLa細胞用100 µM Ac 4ManNAz標記長達48小時，且隨後使用嚴格流程以化學及酶方式提取具有高純度之RNA：RNA經溫TRIzol (酸酚及胍鹽)提取，隨後用乙醇沈澱，經由二氧化矽管柱去鹽，經由高濃度蛋白酶K消化以剝離蛋白質污染物，且經二氧化矽管柱再純化(圖1A)。為了觀察經疊氮化物標記之組分，藉由在變性條件(50%甲醯胺)下在55℃下將RNA樣品添加至二苯并環辛炔-生物素(DBCO-生物素)中來使用無銅(Cu)點擊化學方法，隨後藉由變性凝膠電泳分離且藉由墨點法分析(圖1B)。以Ac 4ManNAz依賴性及時間依賴性方式，觀測到極高(＞10千鹼基)分子量(MW)區域中之經生物素標記之物種。最近已報導，高劑量疊氮基糖可產生非酶性蛋白質標記，然而，總RNA與至多20 mM Ac 4ManNAz的活體外培育在高MW區域中之RNA上不產生先前觀測到的經生物素標記之物種。在28S rRNA上顯而易見少量背景活體外標記，在一些經Ac 4ManNAz標記之細胞RNA實驗中亦可看到更多的變化(例如，圖1B)，但在推定醣RNA物種中未觀測到此類背景標記。此外，用DNA酶處理來自Ac 4ManNAz標記之HeLa細胞的RNA並不影響醣RNA信號，而用RNA酶混合物(A及T1)來進行處理有效地消化了總RNA以及經生物素標記之醣RNA (圖1C)。此效應需要RNA酶的酶活性，因為用抑制劑SUPERaseIn預阻斷RNA酶，完全拯救經生物素標記之醣RNA (圖1C)。因此，用Ac 4ManNAz處理之細胞將疊氮化物標記併入細胞RNA中，其作為高MW物種在瓊脂糖凝膠上遷移。
使用相同代謝標記方法，研究醣RNA在其他細胞類型及動物中之存在。人類胚胎幹細胞(H9)、人類骨髓性白血病株(K562)、人類淋巴母細胞瘤細胞株(GM12878)、小鼠T細胞急性淋巴母細胞白血病細胞株(T-ALL 4188)及中國倉鼠卵巢細胞(CHO)皆顯示醣RNA存在之證據。H9及4188細胞相較於其他細胞類型，每質量總RNA顯示出顯著較多的Ac 4ManNAz標記。接著評估此標記是否可在活體內發生。為此目的，向小鼠中腹膜內注射Ac 4ManNAz進行2、4或6天。在肝臟及脾臟此等產生足以用於分析之總RNA的器官中，觀測到與來自經培養細胞之醣RNA相同MW區域中RNA的劑量依賴性及RNA酶敏感的Ac 4ManNAz標記(圖1D)。此等資料表明醣RNA並非組織培養之產物，且廣泛發生於多種細胞及組織類型中且具有各種豐度。 實例 2- 作為小型非編碼 RNA 之醣 RNA
在所有測試之細胞類型及器官中，發現醣RNA藉由變性瓊脂糖凝膠電泳遷移地極其緩慢(圖1A-圖1D)。假設若醣RNA實際上為大型RNA，則其將可能被聚腺苷酸化(poly-A)。然而，來自經由poly-A富集提取的RNA的醣RNA始終不能純化(圖2A)。此並非歸因於醣RNA在poly-A富集程序期間之裂解或降解。作為替代富集策略，使用一種商業分級分離方法，其利用長度依賴性RNA沈澱且與二氧化矽管柱結合以分離出「大型」(＞200 nts)及「小型」(＜200 nts)轉錄本(參見材料及方法)。出人意料地，醣RNA完全與總RNA之小RNA群體分級分離(圖2B)。為了用獨立分級分離策略驗證此觀測結果，經Ac 4ManNAz標記之RNA應用於蔗糖梯度，且經由SYBR Gold染色及醣RNA分析總RNA之分佈。蔗糖梯度穩固地分離了主要的可見RNA，諸如小RNA/tRNA、18S rRNA及28S rRNA (圖2C)。醣RNA與小RNA分級分離，但仍在瓊脂糖凝膠中展現出極其緩慢的遷移(高表觀MW) (圖2C)。醣RNA的異常遷移性行為可能係由其相關聚醣引起的。 實例 3- 一組常見轉錄本在不同細胞類型中經醣基化
為鑑別醣RNA轉錄本，利用蔗糖梯度以僅自經Ac 4ManNAz標記之H9及HeLa細胞中分離小RNA部分。由在鏈黴抗生物素蛋白下拉之後增濃之小RNA(輸入)以及醣RNA產生RNA定序庫。如所預期，生物複本在樣品中展示高度一致性且大部分讀段相對於小、非聚腺苷酸化RNA定位。接著評估何種RNA經Ac 4ManNAz處理而選擇性標記。tRNA及非tRNA轉錄本之輸入表現在HeLa與H9細胞之間呈正相關。發現一組Y RNA、snRNA、rRNA、snoRNA及tRNA在H9及HeLa細胞兩者中均富集。HeLa及H9細胞醣RNA之富集值顯示強烈的正相關，儘管此等細胞類型之譜系不同(圖2D)。因此，Ac 4ManNAz富集將193 RNA轉錄本定義為候選醣RNA。
發現經修飾之RNA具有許多公認且關鍵的細胞作用。Y RNA家族脫穎而出，因為其結合蛋白及核糖核蛋白(RNP) (在所鑑別之其他一些醣RNA轉錄本中)已知為與自體免疫疾病(諸如全身性紅斑狼瘡(SLE))相關的抗原。此等RNA在脊椎動物中高度保守且被認為有助於胞溶質RNP監視，尤其有助於5S rRNA。鑒於此等特徵，需要藉由經由CRISPR/Cas9基因剔除來將Y5驗證為醣RNA。使用兩個單一嚮導RNA (sgRNA)生成293T Y5基因剔除細胞株，該等單一嚮導RNA靶向Y5基因體基因座的5'及3'區域。分離單細胞純系且選擇KO以用於表徵：Y5基因座之PCR擴增產生兩個對應於兩個不同插入/缺失之擴增子。KO未產生可觀測的Y5轉錄本，且無嚴重的生長缺陷，此與先前關於Y RNA冗餘之報導一致。相較於WT細胞，Y5 KO細胞之Ac 4ManNAz標記使生物素信號之量顯著(約30%，p=0.033)下降，但無任何明顯的MW變化(圖2E)。醣RNA信號之降低與定序資料一致，定序資料確認Y5為強烈富集的，但在其他候選醣RNA池中。 實例 4- 醣 RNA 中唾液酸之標記及無標記偵測
接下來尋求的係定義醣RNA上之聚醣結構。人類細胞中之Ac 4ManNAz代謝的主要路徑需要轉化成唾液酸，接著轉化成CMP-唾液酸，且最後添加至聚醣末端。為排除Ac 4ManNAz分流至出人意料之代謝路徑的可能性，使用9-疊氮基唾液酸(9Az-唾液酸)，其直接轉化為CMP-唾液酸作為代謝標記。與Ac 4ManNAz標記一致，9Az-唾液酸產生緩慢遷移的細胞RNA之類似的時間依賴性標記(圖3A)。用霍亂弧菌唾液酸酶(VC-Sia)處理經Ac 4ManNAz標記之細胞RNA完全消除了生物素信號而不影響RNA樣品之完整性，而熱不活化(HI) VC-Sia無法降低信號(圖3B)。經由使用P-3F AX-Neu5Ac，一種細胞可滲透之唾液酸苷生物合成的代謝抑制劑，評估了典型唾液酸生物合成酶的貢獻。用P-3F AX-Neu5Ac處理HeLa細胞引起總醣RNA信號之劑量依賴性降低，且伴隨在墨點上向更高表觀MW的轉移(圖3C)。此醣RNA之移動性之降低(在凝膠中呈現較高移動性)可能由較少唾液酸引起，且因此每醣RNA分子產生較少負電荷，如針對蛋白質所觀測到的一樣。
為了證實醣RNA經唾液酸化，使用不依賴於代謝報導子之獨立方法。螢光形成的1,2-二胺基-4,5-亞甲基二氧基苯(DMB)探針用於衍生游離唾液酸以供HPLC-螢光偵測及定量。對來自HeLa、H9及4188細胞之天然總RNA進行DMB標記程序，且觀測到存在動物中常見的兩種形式之唾液酸，亦即Neu5Ac及Neu5Gc (圖3D)。當樣品用VC-Sia或RNA酶預處理時，此等峰消失，此增強醣RNA用含唾液酸之聚醣修飾的概念。值得注意的是，自基因體DNA釋放之唾液酸不能使用DMB分析偵測。
定量地發現H9、HeLa及4188細胞分別具有每μg總RNA中大約40、20及20皮莫耳(pmol)總唾液酸(圖3E)。來自4188細胞之醣RNA含有更多Neu5Gc，而H9細胞主要含有Neu5Ac，且HeLa細胞具有類似量之Neu5Ac及Neu5Gc (圖3E)。重要的係，此定量分析係一致的，在此等細胞株中觀測到所觀測到之Ac 4ManNAz標記強度的差異。人類細胞缺乏功能 CMAH基因(其負責將Neu5Ac轉化為Neu5Gc)，而此路徑存在於小鼠細胞中。相應地與HeLa或H9細胞相比，發現小鼠4188細胞之醣RNA中的Neu5Gc量較高(圖3E)。HeLa醣RNA中Neu5Gc之存在可能來自生長培養基中之牛血清；H9細胞在無血清培養基中生長。 實例 5- 典型 N- 聚醣生物合成機制有助於醣 RNA 產生
在蛋白質上存在兩種主要類別的聚醣，亦即N-聚醣及O-聚醣，且均可經唾液酸化。為確定醣RNA結構是否與醣蛋白相關之聚醣結構相關，使用基因、藥理學及酶方法之組合。 ldlD突變型CHO細胞株缺乏將UDP-葡萄糖(Glc)/GlcNAc互換為UDP-半乳糖(Gal)/GalNAc之能力。因此，在最小生長培養基中，來自 ldlDCHO細胞之醣蛋白具有發育不良之N-聚醣及O-聚醣，因為細胞無法產生UDP-Gal (此為N-聚醣伸長所需)及UDP-GalNAc (此為起始O-醣基化所需)。生長在最小培養基中之經Ac 4ManNAz處理之 ldlDCHO細胞中觀測到極少的醣RNA標記(圖4A)。然而，用半乳糖而非GalNAc來補充培養基，恢復醣RNA標記，且用半乳糖與GalNAc兩者之補充進一步強化標記強度(圖4A)。此結果使用人類K562細胞株再現，該細胞株具有UDP-半乳糖-4-表異構酶(GALE)之CRISPR-Cas9靶向基因剔除，模擬 ldlDCHO細胞株之表型。此等結果之模式類似於在此等細胞類型中標記醣蛋白時所觀測到之模式，表明醣RNA聚醣在結構上與蛋白質上所發現之彼等醣蛋白相關。
接著測試醣基化抑制劑對醣RNA生物合成之影響。寡醣基轉移酶(OST)藉由使14-糖聚醣在其經由Sec/轉位子轉位期間轉移至初生多肽上之天冬醯胺殘基來介導蛋白質N-醣基化。所測試的係NGI-1 (一種特異性且有效的OST小分子抑制劑)對醣RNA產生的影響。此類處理引起用Ac 4ManNAz標記之醣RNA之劑量依賴性損失(圖4B)，表明OST涉及醣RNA酶相關聚醣之生物合成。下游N-聚醣處理步驟亦分別用基夫鹼(kifunensine)及苦馬豆素(swainsonine) (該等為N-聚醣修整酶α-甘露糖苷酶I及II之抑制劑)擾動。此等處理亦引起疊氮基糖標記之劑量依賴性損失(圖4C)，伴隨著在較高劑量下醣RNA之表觀MW增加，其等效於使用P-3F AX-Neu5Ac所發現之結果。假設高甘露糖聚醣加工之中斷產生具有較小淨負電荷之低唾液酸化醣RNA，且因此具有降低之移動性。
為了進一步定義醣RNA上之聚醣結構，採用一組內切醣苷酶。首先將來自Ac 4ManNAz標記HeLa細胞之純化RNA暴露於各酶且接著與生物素反應以用於觀測(圖4D)。用PNGase F處理醣RNA，其裂解蛋白質與N-聚醣之間的天冬醯胺側鏈醯胺鍵，強烈消除來自Ac 4ManNAz標記的信號。Endo F2優先裂解雙觸角及高甘露糖結構，而Endo F3優先裂解岩藻糖基化雙觸角及三觸角結構，兩者均在聚醣之殼二糖核心內。用Endo F2或F3處理醣RNA導致Ac 4ManNAz標記部分損失。然而，對高甘露糖結構更具選擇性之Endo Hf不影響Ac 4ManNAz信號(圖4D)。與此等N-聚醣消化酶相比，O-醣苷酶(靶向核心1及核心3 O-聚醣)或黏蛋白酶(StcE)處理對Ac 4ManNAz標記強度無作用(圖4D)。如在先前實驗中，VC-Sia完全移除Ac 4ManNAz依賴性標記(圖4D)。 實例 6- 質譜定義 RNA 上聚醣之不同組成
以上資料表明醣RNA經具有至少一個末端唾液酸殘基之複合型N-聚醣修飾。為了開發與RNA相關之醣型之更精確視圖，將基於PNGaseF介導之自小RNA池中釋放聚醣的工作流程最佳化，隨後藉由多孔石墨化碳基液相層析MS策略分析彼等聚醣(PGC-LC-MS，圖4D)。自來自293T、H9及HeLa細胞之小RNA池釋放聚醣，且並行地，類似地處理肽樣品以比較細胞蛋白質上之聚醣輪廓。對各樣品進行兩個生物複本。發現在六個樣品類型中之至少一者中兩個複本中存在的107個獨特聚醣(圖4E，參見材料及方法)。所鑑別之聚醣及主要組分分析的層級集群顯示，在與自RNA釋放的彼等聚醣相比時，自肽釋放的聚醣有差異地集群。此外，與肽上發現的RNA相比，在RNA上發現的獨特聚醣的集合更小且更受限制(圖4F及4G)。當檢查區分RNA聚醣與肽聚醣之特徵時，注意到與來自此等相同細胞之肽相比，293T及H9細胞兩者在RNA上均具有較高的經岩藻糖修飾之聚醣級份。相比之下，與來自HeLa細胞之肽聚醣相比，來自HeLa細胞之醣RNA聚醣更可能含有唾液酸修飾。總體而言，PNGaseF釋放之聚醣的PGC-LC-MS資料與Ac 4ManNAz標記及DMB探針實驗一致。重要的係，由於基於MS之方法不需要唾液酸進行富集或觀測，因此能夠揭露通常經岩藻糖基化且有時去唾液酸化之擴展組聚醣組合物。 實例 7- 醣 RNA 與細胞膜相關
接著評估醣RNA之次細胞定位。唾液酸化聚醣之生物發生在包括胞溶質(ManNAc處理為Neu5Ac)、細胞核(用CMP充電Neu5Ac)及分泌路徑(其中唾液酸轉移酶將唾液酸添加至聚醣末端)之許多次細胞區室中。據報導，Y RNA之定位主要為在細胞核中具有次要部分之細胞質。諸如tRNA及sn/snoRNA之其他主要類別之醣RNA轉錄本通常分別侷限於可溶性胞溶質及細胞核。為了確定醣RNA分佈於細胞內部的位置，使用兩種生化策略，第一種為將細胞核自膜細胞器及胞溶質中分離出來，以及第二種為將可溶性胞溶質區室與膜性細胞器分離(參見材料及方法)。來自經Ac 4ManNAz標記之HeLa細胞的核RNA產生不可偵測之疊氮化物標記之物種，而膜部分排他性地含有醣RNA(圖5A及5B)。此表明醣RNA與膜細胞器緊密相關。
因為膜細胞器具有精確拓樸組態，所以隨後評估關於分離之膜，醣RNA是否存在明顯拓樸組織。自經Ac 4ManNAz標記之293T細胞中分離出粗細胞膜及膜結合細胞器且進行VC-Sia消化，無論用或不用Triton X-100預處理以滲透膜區室。若醣RNA在拓樸上受限於膜區室之管腔空間，則VC-Sia將僅在添加Triton X-100之後進入此等物種。發現大部分醣RNA信號對無Triton X-100之VC-Sia敏感，而小型但可複製的池僅在滲透之後可接近。因此，當醣RNA之一部分似乎駐存於膜性細胞器之管腔空間內時，絕大部分似乎可接近，或在此分析中位於膜之表面上。 實例 8- 醣 RNA 進入活細胞表面
以上實驗中之VC-Sia的可接近性表明醣RNA不積聚在胞內囊泡或膜細胞器之內腔中，然而其未能精確地限定哪個膜表面上可能存在於醣RNA。鑒於糖聚合物之典型運輸及定位，假設RNA之醣基化可提供其運輸至質膜且存在於活細胞之細胞外表面上之能力。此假設經由兩種正交及互補方法得到解決。
首先利用VC-Sia對裂解唾液酸(包括醣RNA上之彼等唾液酸)之穩固且特異的活性，以及其已建立之選擇性地裂解活細胞表面外唾液酸之能力。分析在活HeLa細胞上將VC-Sia添加至培養基之後Ac 4ManNAz信號的變化，且在少至20分鐘內可看到醣RNA量之降低(圖5C)。在60分鐘時複製此實驗，其中觀測到最強大之差異(圖5D)且在貼壁(HeLa及293T)及懸浮(K562)細胞上進行，表明在所有情況下VC-Sia能夠顯著降低醣RNA之量。此等資料指示在短時間範圍內且在具有完整質膜之環境中，VC-Sia可接近自細胞純化之大部分醣RNA的＞50%。
為驗證醣RNA定位於活細胞表面之觀察結果，所需的為一種獨立於Ac 4ManNAz代謝併入之標記工作流程。為了達成此目的，將過氧化酶催化之鄰近標記技術與生物素-苯胺相對於生物素苯酚對RNA具有顯著增加的反應性的觀察結果組合，此有利於蛋白質標記。採用非遺傳策略，利用凝集素作為細胞表面親和力工具來結合活細胞，活細胞隨後可募集過氧化酶且使生物素-苯胺沈積在結合聚醣附近之RNA上(圖5E)。儘管廣泛使用凝集素作為一般細胞表面結合試劑，但其具有特定醣型結合特徵且因此基於來自圖3及4之資料選擇一種凝集素，其不應結合在醣RNA附近(ConA，對高甘露糖結構具有特異性)，且凝集素應直接結合於醣RNA (MAAII，唾液酸；WGA，N-聚醣+/-唾液酸)。
最初，此分析以活HeLa細胞表面蛋白為基準。如所預期，所有三種凝集素能夠募集鏈黴抗生物素蛋白-HRP，活化生物素-苯胺，且產生細胞表面蛋白質之特異性標記模式，而單獨的鏈黴抗生物素蛋白-HRP不能產生穩固標記。此實驗及所有後續實驗嚴格在4℃下進行以減少或消除囊泡遷移、膜再循環或細胞外組分吸收。接下來分析來自此等細胞之RNA，且發現為用MAAII或WGA染色細胞時所產生之高分子量帶之特異性標記，而並非ConA。該信號為部分RNA酶敏感的(89%損失，圖5F)。在用唾液酸酶處理經純化之RNA物質後，觀測到生物素信號幾乎定量移入至凝膠之孔中而信號量並未強烈減少(圖5F)。此支持生物素-苯胺直接共價修飾RNA且聚醣(特別係唾液酸)有助於醣RNA在瓊脂糖凝膠中顯著異常遷移的觀點。
重複細胞裂解物而非活細胞中之鄰近接合分析顯示，在無可滲透的(針對生物素-苯胺之活化氮烯基團)質膜之情況下，MAAII及WGA仍標記醣RNA。然而，所有三種凝集素均微弱地，但一致地標記rRNA帶(圖5G)。活細胞實驗中不存在此等rRNA帶及其相對於高MW醣RNA帶之強度再次表明大部分細胞醣RNA位於細胞表面上。暴露於生物素-苯胺標記之總RNA未經RNA酶完全消化(圖5F及5G，左側，第5泳道)，可能歸因於藉由苯胺探針或其他物種對RNA進行之共價修飾。此為在此等實驗中未觀測到完全RNA酶敏感性之可能原因。總之，對活細胞表面複合N-聚醣附近的RNA基於鄰近性標記可偵測到醣RNA，與描述本文所報導之RNA聚醣之化學、基因及質譜分析結果一致。 實例 9- Siglec 受體及抗 RNA 抗體識別細胞表面醣 RNA
定位於細胞表面之生物聚合物通常參與與細胞-細胞接合點處之順式或反式結合搭配物的分子相互作用。由於醣RNA存在於細胞表面上，假設其太可能參與此等類型之相互作用。評估是否現有試劑來研究細胞表面之生物學，此類抗體或基於重組蛋白之親和力試劑是否可能與細胞表面醣RNA相互作用(圖6A)。
靶向RNA之抗體與全身性紅斑性狼瘡症(SLE)相關。另外，抗RNA抗體用作研究工具；舉例而言，J2抗雙股RNA (dsRNA)抗體具有針對RNA之ds區域之特異性(與dsDNA無交叉反應性)且通常用於鑑別感染RNA病毒之細胞。據報導J2抗體以約40 bp之最小長度結合dsRNA。預測醣RNA具有雙螺旋體RNA區，然而，其長度一般＜40 bp。然而，測試J2是否可使用電泳遷移率變化分析來結合藉由Ac 4ManNAz定序(圖2A-2E)富集的小RNA，諸如Y5 RNA。J2抗體能夠活體外轉移游離Y5 RNA。此轉移對J2具有特異性且使用同型對照抗體未觀測到。此外，由J2誘導之轉移在競爭性poly-(I:C)之存在下被消除，其模擬長dsRNA。
已證實J2可結合如Y5之醣RNA的RNA組分，建立對探針細胞表面RNA之流式細胞測量術分析。所有實驗均在活細胞上進行，僅在抗體結合且洗掉背景之後固定以獲得實驗工作流靈活性。有必要使用細胞解離酶的重組源。舉例而言，常用的胰蛋白酶粗製劑含有顯著的RNase活性且因此快速破壞RNA (參見材料及方法)。
約20%之經培養HeLa細胞群體顯示J2染色陽性(圖6B)。此結合藉由用RNA酶A預處理細胞穩固地消除且藉由向RNA酶A添加特異性蛋白抑制劑以阻斷活性來恢復(圖6B)。使用293T (貼壁)及K562 (懸浮)細胞觀測到類似結果。為了證實J2染色細胞表面之分佈，進行用J2染色之HeLa細胞之共焦成像，其表明細胞外圍邊緣中之信號對RNA酶A處理敏感。接下來問詢J2是否如先前圖4中所進行的藉由擾動OST偵測細胞表面上之醣RNA。用OST抑制劑NGI-1處理HeLa細胞12小時，且觀測到J2結合至細胞表面之劑量依賴性損失(圖6C)。此與圖4A-4H中報導之全細胞RNA墨點法實驗一致，且表明J2抗體所識別之許多細胞表面RNA依賴於N-醣基化以用於其表面定位。
最後，試圖確定醣RNA是否可與聚醣結合受體相互作用，基於慣例，該等聚醣結合受體之配體已假定為細胞表面醣蛋白及醣脂。如上文所描述，與醣RNA相關之N-聚醣為高度唾液酸化的。因此，問詢唾液酸結合免疫球蛋白凝集素型(Siglec)受體家族之成員是否可識別醣RNA。值得注意地係，Siglec有14個成員分佈在所有類別之免疫細胞上，為人類中最大之唾液酸苷結合蛋白家族。其在免疫調節中之作用沿用已久，且包括宿主病原體相互作用、癌症免疫逃避及與自體免疫疾病之遺傳關聯。已在少數設定中鑑別個別Siglec家族成員之生理學配體，但對於大部分而言，未充分表徵支持Siglec結合免疫突觸處之唾液酸結合的醣結合物。如此進行之所有工作均已假設Siglec配體為醣蛋白或醣脂。
為確定人類Siglec受體是否可結合細胞表面醣RNA，使用可溶性Siglec-Fc試劑且藉由流式細胞測量術探測其與細胞之結合。首先確定，12種商用Siglec-Fc試劑中有九種能夠將上述背景與HeLa細胞結合。在這九種試劑中，兩種Siglec-Fc試劑Siglec-11及Siglec-14的結合對RNA酶A處理敏感(圖6D)。此等資料表明細胞表面醣RNA可為直接Siglec受體配體。 用於實例 1 至實例 9 之材料及方法 代謝化學報導子及抑制劑
在無菌二甲亞碸(DMSO)中使疊氮化物標記之糖N-乙醯基-9-疊氮基-9-去氧-神經胺酸(9Az唾液酸，Carbosynth)及N-疊氮基乙醯基甘露糖胺四醯化(Ac 4ManNAz，Click Chemistry Tools)之儲備液製成500 mM。將未經標記之糖N-乙醯基-D-半乳糖胺(GalNAc，Sigma)及D-(+)-半乳糖(Gal，Sigma)的儲備液在無菌水中分別製成500 mM及50 mM。在細胞實驗中，ManNAz以100 μM之最終濃度使用。ManNAz之活體外實驗在37℃下使用0、2或20 mM ManNAz (高達細胞內濃度的200倍) 2小時。使用9Az唾液酸之細胞內實驗使用1.75 mM最終濃度，持續6與48小時之間。將Gal及GalNAc分別用作10 μM及100 μM之培養基補充劑，且與ManNAz同時添加以用於標記。
聚醣生物合成抑制劑之工作儲備液皆在DMSO中以以下濃度製得，且儲存在-80℃：10 mM NGI-1 (Sigma)、10 mM基夫鹼(Kif，Sigma)、10 mM苦馬豆素(Swain，Sigma)、50 mM P-3F AX-Neu5Ac (Tocris)。所有化合物在細胞上使用24小時且與ManNAz同時添加以用於標記。 小鼠模型中之代謝報導子
所有實驗均根據斯坦福大學實驗動物護理管理小組制定的指導原則來進行。C57Bl/6小鼠內部雜交且繁殖。藉由以下製備ManNAz：將100 mg ManNAz溶解於830 μL含70% DMSO之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，升溫至37℃持續5分鐘，且接著使用0.22 μm Ultrafree MC離心過濾器單元(Fisher Scientific)進行無菌過濾；此溶液儲存於-20℃下。雄性C57Bl/6小鼠(8至12週齡)每日注射，腹膜內注射100 μL ManNAz (給藥至300 mg ManNAz/kg/天)，而對照小鼠僅接受媒劑。在第2天、第4天及第6天，將小鼠安樂死，且收集其肝臟及脾臟。器官經由耐綸細胞過濾器按壓且用PBS再懸浮以產生單細胞懸浮液。如下文所描述收集RNA。 RNA 提取及純化策略
採用特定的一系列步驟以確保在整個此研究中分析之RNA為儘可能純淨的。第一TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)用作裂解及變性細胞或組織之第一步驟。藉由移液在TRIzol均質化之後，在37℃下培育樣品以進一步使非共價相互作用變性。藉由添加0.2倍體積之100%氯仿，渦旋混合且最後在4℃下以12,000x g旋轉15分鐘來啟動相分離。將水相小心地移除，轉移至新試管中且與2倍體積之100%乙醇(EtOH)混合。此溶液經Zymo RNA清潔及濃縮器管柱純化(Zymo Research)：將樣品溶液添加至Zymo管柱中且以10,000x g旋轉20秒且始終丟棄流過物。進行三次獨立洗滌，1×400 μL RNA製備型緩衝液(Zymo Research)及2×400 μL RNA洗滌緩衝液(Zymo Research)且以10,000x g旋轉20秒。為了溶離RNA，使用兩個體積之純水。接下來，藉由添加1 μg蛋白酶K (PK，Thermo Fisher Scientific)至25 μg經純化之RNA使RNA經受蛋白質消化且在37℃下培育45分鐘。在PK消化後，如上文所描述，用Zymo RNA清潔及濃縮器再次純化RNA。此研究中產生之所有RNA樣品至少首先由此兩個步驟純化，其中除前兩次純化之外，後續進行酶或RNA分級分離。發現，Zymo-Spin IC及IIICG管柱分別結合至多約50及350 μg總RNA；各實驗中之管柱係基於需要純化之RNA的量而進行選擇。
對於小RNA與大RNA的差異沈澱，如所描述使用Zymo RNA清潔及濃縮器流程。簡言之，將水溶液中之RNA與1×體積之50% RNA結合緩衝液於100% EtOH中混合。將此混合物施用於Zymo二氧化矽管柱；流過物含有小RNA，而管柱保留大RNA。將流過物與1×體積之100% EtOH混合，結合至新的Zymo管柱且如上文所描述純化。
為富集聚腺苷酸化RNA物種，將最初如上文所純化之RNA用作Poly(A)Purist MAG套組(Thermo Fisher Scientific)之輸入。將寡核苷酸(dT)磁珠等分且在洗滌溶液1中洗滌兩次。將RNA (15 μg總RNA)在1×結合液中達到600 ng/μL，添加至經洗滌之磁珠中，且加熱至70℃持續5分鐘。將樣品冷卻至25℃持續60分鐘，施加至磁體，移除上清液，且用洗滌溶液1洗滌兩次且用洗滌溶液2洗滌一次。藉由添加RNA儲存溶液至磁珠且將樣品加熱至70℃來溶離Poly-A富集之RNA。溶離步驟進行兩次且經由如上文所描述之Zymo RNA清潔及濃縮器清洗所得poly-A RNA。 酶處理 RNA 樣品及細胞
使用各種內及外切核酸酶及醣苷酶消化RNA、DNA或聚醣。所有消化均在20 μL下在37℃下在20 μg總RNA上進行60分鐘。為消化RNA，使用以下各者：1 μLRNA酶混合物(0.5U/μL RNA酶A及20U/μL RNA酶T1，Thermo Fisher Scientific)與20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM KCl及0.1 mM MgCl 2。為了阻斷RNA酶混合物的RNA酶活性，將1 μL RNA酶混合物與8 μL SUPERaseIn (20U/μL，Thermo Fisher Scientific)在25℃下預混合15分鐘，然後加入RNA溶液中。為了消化DNA，2 μL TURBO DNA酶(2U/μL, Thermo Fisher Scientific)與1× TURBO DNA酶緩衝液(製造時未提供的組合物)。為了消化聚醣：2 μL α2-3,6,8神經胺糖酸酶(50U/μL，New England Biolabs，NEB)與GlycoBuffer 1 (NEB)、或2 μL Endo-Hf (1,000U/μL，NEB)與GlycoBuffer 3 (NEB)、或2 μL PNGase F (500U/μL，NEB)與GlycoBuffer 2 (NEB)、或2 μL Endo-F2 (8U/μL，NEB)與GlycoBuffer 3 (NEB)、或2 μL Endo-F3 (8U/μL，NEB)與GlycoBuffer 4 (NEB)、或2 μL O-醣苷酶(40,000U/μL，NEB)與GlycoBuffer 2 (NEB)、或0.5 μg/μL之1 μL StcE含或不含20 mM EDTA。對於活細胞處理，如先前所描述表現且純化VC-Sia，且在完全生長培養基中在37℃下以150 nM最終濃度添加至細胞中持續20至60分鐘。 與 RNA 之無銅點擊結合
在生物素與疊氮基糖(ManNAz及9Az-Sia)之結合期間，所有實驗中使用無銅條件以避免溶液中之銅。所有實驗使用二苯并環辛炔-PEG4-生物素(DBCO-生物素，Sigma)作為環加成的炔烴半部分。為進行SPAAC，將純水中之RNA與1×體積之「無染料」凝膠負載緩衝液II (df-GLBII、95%甲醯胺、18mM EDTA及0.025% SDS)及500 μM DBCO-生物素混合。通常，此等反應物為10 μL df-GLBII、9 μL RNA、1 μL 10 mM DBCO試劑儲備液。樣品在55℃下結合10分鐘以使RNA及任何其他可能的污染物變性。藉由添加80 μL水，隨後2×體積(200 μL) RNA結合緩衝液(Zymo)、渦旋，且最後添加3×體積(300 μL)之100% EtOH且渦旋來中止反應。如上文所描述經由Zymo管柱純化此結合反應且藉由如下文所描述之凝膠電泳分析。 RNA 凝膠電泳、墨點法及成像
ManNAz標記之RNA的墨點法分析在概念上類似於北方墨點法，但具有以下修飾。將純化、富集或酶消化且與如上文所描述之DBCO-生物素試劑結合的RNA凍乾，且隨後再懸浮於15 μL df-GLBII及1×SybrGold (Thermo Fisher Scientific)中。為了變性，RNA在55℃下培育10分鐘且在冰上破碎3分鐘。隨後將樣品裝載至1%瓊脂糖-甲醛變性凝膠(Northern Max Kit，Thermo Fisher Scientific)中且在110 V下電泳45分鐘。接著使用UV凝膠成像器在凝膠中觀測總RNA。RNA轉移根據Northern Max流程在25℃下發生2小時，但使用0.45 μm硝化纖維素膜(NC，GE Life Sciences)。此對於下游成像至關重要，因為大部分帶正電荷之耐綸膜在紅外(IR)光譜中具有強背景。在轉移之後，使用UV-C光(0.18 J/cm 2)使RNA與NC交聯。NC膜隨後在25℃下用Odyssey阻斷緩衝液PBS (Li-Cor Biosciences)阻斷45分鐘。應注意，用TBS或PBS製造之阻斷緩衝液均購自Li-Cor Biosciences，類似地操作此步驟。在阻斷之後，在Odyssey阻斷緩衝液中將鏈黴抗生物素蛋白-IR800 (Li-Cor Biosciences)稀釋至1:10,000且在25℃下將NC膜染色30分鐘。在25℃下在1×PBS中之0.1% Tween-20 (Sigma)中進行連續洗滌三次，每次5分鐘，來將過量鏈黴抗生物素蛋白-IR800自膜洗掉。NC膜在1×PBS中簡單沖洗以移除Tween-20，隨後在Odyssey LiCor CLx掃描儀(Li-Cor Biosciences)上掃描，其中軟體設定為自動偵測700通道及800通道兩者之信號強度。在掃描之後，用LiCor軟體(適當時)在800通道中定量影像且導出。 用於唾液酸偵測之 DMB 分析
除非另外指出，否則所有化學品均由Sigma供應。RNA或DNA上之天然唾液酸用4,5-亞甲基二氧基-1,2-苯二胺二鹽酸鹽(DMB)衍生且根據現有方法經由逆相高效液相層析(HPLC)偵測。簡言之，凍乾RNA樣品，且將各樣品之100 µg (或以特定圖式以其他方式指出)溶解於2 M乙酸中。唾液酸藉由在80℃下培育2小時水解，且隨後在添加DMB緩衝液(7 mM DMB，0.75 M β-巰基乙醇，18 mM Na 2SO 4，1.4 M乙酸)之前冷卻至室溫。在50℃下進行衍生作用2小時。在添加0.2 M NaOH之後，藉由離心經由10 kDa MWCO過濾器(Millipore)過濾樣品且在-20℃下儲存於黑暗中直至使用為止。經由逆相HPLC使用Poroshell 120 EC-C18管柱(Agilent)，以乙腈/水之梯度進行分離：T(0分鐘) 2%；T(2分鐘) 2%；T(5分鐘) 5%；T(25分鐘) 10%；T(30分鐘) 50%；T(31分鐘) 100%；T(40分鐘) 100%；T(41分鐘) 2%；T(45分鐘) 2%。藉由在373 nm下激發且監測448 nm下之發射偵測經DMB衍生之唾液酸。唾液酸標準品包括N-乙醯基神經胺糖酸(Neu5Ac；Jülich Fine Chemicals)、N-羥乙醯基神經胺酸(Neu5Gc；Carbosynth)、3-去氧-D-甘油-半乳糖-2-尤羅索尼克酸(KDN；Carbosynth)及Glyko唾液酸參考小組(Prozyme)。 次細胞分級分離 分離高度純細胞核
細胞核與ER錯綜複雜地交織在一起，對生化地將細胞核從ER中乾淨地分離而不混合提出了挑戰。Gagnon等人描述一種在處理之後乾淨地回收哺乳動物核而無明顯殘餘ER膜附接之流程。此流程在貼壁的經ManNAz標記之HeLa細胞上進行而不修改成公開的分步說明。歸因於細胞核之嚴格分離，細胞核之一些部分本身在過程期間裂解，污染了非核部分。因此，當檢查此流程之分級分離結果時，僅考慮細胞核中留下之信號。上清液中之信號將為部分混合的ER、高基氏體、胞溶質、一些細胞核以及其他細胞區室。根據流程分級分離之後，TRIzol用於提取及處理RNA。 胞溶質及粗膜級份之分離
ProteoExtract®天然膜蛋白提取套組(EMD Millipore)用於貼壁之經ManNAz標記之HeLa細胞。此套組使用連續裂解步驟：首先平緩地釋放可溶性胞溶質蛋白及RNA，且其次使膜性細胞器(諸如質膜、高基氏體及ER)破裂。因為裂解緩衝液為溫和的，殘留ER/高基氏體留在核部分上且因此相比於膜性部分，由此套組產生之樣品的分析受限於有效分離之可溶性胞溶質部分。特定言之，首先自經培養之HeLa細胞中移除生長培養基且接著用冰冷的洗滌緩衝液洗滌細胞兩次。將提取緩衝液I (補充有蛋白酶抑制劑)添加至培養盤且在4℃下在細胞上培育10分鐘，搖盪。在培育之後，收集此緩衝液作為「細胞質」。隨後在4℃下將提取緩衝液II (補充有蛋白酶抑制劑)添加至細胞中持續30分鐘，搖盪。收集此緩衝液作為「ER/膜」。此等級份隨後用TRIzol提取且如上文所描述進行處理。 膜保護分析
使用質膜蛋白提取套組(ab65400，Abcam)分離大規模粗膜：首先自經培養之細胞中移除生長培養基，且接著用冰冷1×PBS洗滌細胞兩次。在第二次PBS洗滌中，將細胞自盤刮下且在4℃下以400x g快速離心4分鐘。使細胞集結粒再懸浮於2 mL均質化緩衝液混合物中，每3×15 cm培養盤具有80%匯合293T細胞。細胞懸浮液在冰上經杜恩斯(Dounce)勻漿55次，且重複此過程直至所有細胞懸浮液體積均被類似地處理為止。隨後在4℃下以700x g使勻漿物旋轉10分鐘。此集結粒係核級份且將上清液轉移至新試管中且在4℃下以10,000x g再次旋轉30分鐘。由此旋轉產生之集結粒為粗膜且上清液為可溶性胞溶質。對於保護分析，典型地將10×15 cm盤用於各生物複本。將粗膜集結粒再懸浮於800 μL KPBS (136 mM KCl、10 mM KH 2PO 4，用KOH調節pH為7.25)、125 mM蔗糖及2 mM MgCl 2中，分成4個反應物，且在37℃下在含或不含0.1% Triton×100或150 nM VC-Sia (根據上文自製的)下培育1小時。RNA用TRIzol提取且如上文關於唾液酸量之DMB分析所描述進行處理。 蛋白質親和力工具：抗體及凝集素
以下為用於在硝化纖維膜上在以下指定濃度下進行墨點法：1:1000 GAPHD (A300-641A，Bethyl)、1:3000 β-微管蛋白(ab15568，Abcam)、1:5000 H3K4me3 (ab8580，Abcam)、1:1000 RPN1 (A305-026A，Bethyl)、1:1000 Sec63 (A305-084A，Bethyl)。適當二級抗體結合於LiCor IR染料(Li-Cor Biosciences)且以0.1 ng/μL之最終濃度使用。所有凝集素均自Vector實驗室購買經生物素標記的：生物素-麥胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)、生物素-伴刀豆球蛋白A (concanavalin A，ConA)及生物素-朝鮮槐凝集素II (Maackia Amurensis Lectin II，MAAII)。Pierce高敏感性鏈黴抗生物素蛋白-HRP (Strep-HRP，Thermo Fisher Scientific)用於苯胺標記實驗。 RNA 之蔗糖梯度分級分離
先前提取用作蔗糖梯度分離之輸入的RNA，進行PK處理且如上文所描述點擊DBCO-生物素。按照McConkey的方法，RNA經由15%至30%蔗糖梯度沈降。通常，將250-500 μg總RNA凍乾，且接著溶解於500 μL含有50 mM NaCl及100 mM乙酸鈉(pH 5.5)之緩衝液中。使用BioComp 107梯度主控器在1×3.5吋聚丙烯試管(Beckman)中製備線性15-30%蔗糖梯度。將溶解RNA在預冷卻梯度之頂部分層，隨後使用SW32 Ti轉子在4℃下以80,000x g (25,000 rpm)在Beckman Coulter Optima L70-K超離心機中離心18小時。使用Brandel梯度分離系統分離梯度，收集0.75 mL級份。隨後如上文所描述使用TRIzol自蔗糖溶液提取經分級分離之RNA，且藉由瓊脂糖凝膠電泳或深度定序分析。 ManNAz 標記之 RNA 之富集、深度定序及分析
在序列分析之前對RNA樣品進行兩輪選擇以鑑別經含ManNAz之聚醣修飾的轉錄本。提取來自經ManNAz標記之H9或HeLa細胞的總RNA，純化且與如上文所描述結合至DBCO-生物素。出於定序實驗之目的，產生在細胞培養水準(不同繼代數目)下的生物複製物。第一富集藉由蔗糖梯度分離實現；離心後收集含有小RNA之級份且提取TRIzol。第二次富集藉由對鏈黴抗生物素蛋白磁珠之選擇性親和力來達成，如先前公開具有以下特定步驟：在生物素洗滌緩衝劑(10 mM Tris HCl pH 7.5，1 mM EDTA，100 mM NaCl，0.05% Tween-20)中，在25℃下用50 ng/μL肝醣(Thermo Fisher Scientific)阻斷每一反應物10 μL之MyOne C1鏈黴抗生物素蛋白磁珠(Thermo Fisher Scientific)持續1小時。將來自H9及HeLa細胞之經生物素標記之小RNA解凍且每個保存150 ng用於輸入庫構築。隨後，在750 μL生物素洗滌緩衝液(最終濃度為約33 ng/μL)中稀釋25 μg經生物素標記之小RNA且在4℃下與阻斷之MyOne C1磁珠混合2小時。洗滌磁珠以移除非結合RNA：用1 mL ChIRP洗滌緩衝液(2×SSC，0.5% SDS)洗滌兩次，用1 mL生物素洗滌緩衝液洗滌兩次，且用NT2緩衝液(50 mM Tris HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM MgCl 2，0.005% NP-40)洗滌兩次，全部均在25℃下各自持續3分鐘。
為了構築深度定序庫，採取兩種方法使用相同酶，其中輸入與富集磁珠之樣品具有不同步驟，鑒於後者已與磁珠載體結合。 輸入庫
將在MyOne C1捕捉之前分離的150 ng小RNA凍乾乾燥，且隨後在37℃下添加T4 PNK混合物(2 μL 5×緩衝液(500 mM Tris HCl pH 6.8，50 mM MgCl 2，50 mM DTT)、1 μL T4 PNK (NEB)、1 μL FastAP (Thermo Fisher Scientific)、0.5 μL SURaseIn及5.5 μL水)持續45分鐘。隨後，藉由添加3'接合混合物(1 μL 3 μM L3-Bio_Linker，1 μL RNA接合酶I (NEB)，1 μL 100 mM DTT，1 μL 10× RNA接合酶緩衝液(NEB)及6 μL 50% PEG8000 (NEB))至T4 PNK反應且在25℃下培育4小時使前腺苷酸化3'連接子接合。藉由添加2 μL RecJ (NEB)、1.5 μL 5'去腺苷酶(NEB)、3 μL 10× NE緩衝液1 (NEB)且在37℃下培育反應物60分鐘來消化未接合之L3-Bio_Linker。用如上文所描述之Zymo管柱純化接合之RNA且凍乾乾燥。cDNA合成、cDNA:RNA雜交體之富集、cDNA溶離、cDNA環化、cDNA清除、第一步PCR、PAGE純化及第二步PCR如先前描述進行。 富含磁珠之庫
如前所描述用以下修飾處理結合至經ManNAz標記小RNA之經洗滌的MyOne C1磁珠。對於珠上接合步驟，使用非經生物素標記之3'連接子寡核苷酸(L3-連接子)，使得磁珠上捕捉之所有RNA將包括於定序庫中。在完成輸入及磁珠富集之樣品的第二步PCR後，在高敏感性DNA生物分析儀晶片(Agilent)上對dsDNA庫進行定量且在NextSeq 500儀器(Illumina)上定序。 資料分析
如先前所描述，大量地用經設計以分析紅外線CLIP資料之管線處理定序資料。用於此操作中之管線的特定版本可在此處在線上找到。特定言之，移除了PCR複製物的原始讀段且修剪了接附子序列。接下來，為解決相對於tRNA基因座定位的讀段，首先使用bowtie2將讀段相對於成熟的tRNA參考定位。成熟tRNA參考獲自GtRNAdb且轉化為以FASTA格式定序之DNA。移除相同序列且將CCA添加至各tRNA序列之3'端。使用所得SAM檔案的NM及XS欄位的值提取唯一定位之讀段(grep -E 「@|NM:」 *.sam|grep -v 「XS:」))。接下來，將讀段相對於人類重複RNA (諸如snRNA及rRNA)之定製序列索引定位且最終相對於人類基因體參考(GCRh38)定位。使用DESeq2工具計算來自兩個生物複本中之每一者之各RNA轉錄本(例如tRNA、snRNA、Y RNA等)的唯一讀段之數目，以計算輸入與富集樣品(ManNAz或EDC捕捉方法)之間的倍數變化。使用R進行統計分析，且使用ggplot生成曲線圖。 Y5 之 CRISPR/Cas9 基因剔除及表徵
使用CHOPCHOP線上網路工具設計CRISPR gRNA序列。選擇側接Y5基因座之嚮導序列。對應寡核苷酸自IDT訂購。如先前使用Gibson裝配反應(NEB)所描述，將寡核苷酸選殖至表現pX458嚮導RNA質體(Addgene)之Cas9中。側接編碼於pX458質體中之人類Y5基因座的兩個sgRNA以6孔格式使用脂染胺3000(Thermo Fisher Scientific)共轉染。經轉染細胞使用BD流入細胞分選儀(斯坦佛FACS設施(Stanford FACS facility))基於GFP表現分選至96孔培養盤。使純系細胞株擴增，且分離出基因體DNA用於靶向對偶基因之基於定序之基因分型。為此，擴增包涵gRNA靶向位點的300至500個鹼基對區且定序PCR產物。選擇具有導致大量缺失之編輯事件的純系用於後續實驗且藉由北方墨點法確認表現之KO損失(下文)。為評估倍增時間，如上文所描述培養293 WT及KO細胞，最初一式三份地每12孔盤接種20,000個細胞。以24小時時間間隔對細胞進行胰蛋白酶化且使用Countess II FL自動化細胞計數器(Thermo Fisher Scientific)計數。 小 RNA 北方墨點法
藉由習知北方墨點法偵測小RNA且經由放射性標記之鎖定核酸(LNA)偵測。對Y5 RNA或5S rRNA互補的LNA (Qiagen)進行排序且標記5'端：將200 pmol LNA添加至3 μL T4 PNK (NEB)、7 μL 10×T4 PNK緩衝液及1 μl ATP，[γ- 32P]- 3000 Ci/mmol 10 mCi/ml (γ-ATP, Perkin Elmer)於70 μL反應物中。LNA在37℃下培育3小時，其後使用Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad)管柱純化掉游離γ-ATP。將管柱置於25℃，預填充緩衝液在1000x g下旋轉2分鐘。將樣品施加至經乾燥之管柱基質上且藉由在1000x g下旋轉4分鐘來純化。倒入12%脲-PAGE凝膠(National Diagnostics)且以10 W預運行15分鐘，其後藉由在15 W下運行凝膠來分離來自各種細胞類型之2 μg總RNA。在電泳之後，在4℃下以18 V之恆定功率使用具有0.5×Tris/硼酸鹽/EDTA (TBE，Thermo Fisher Scientific)緩衝液之半乾轉移設備(Bio-Rad)將RNA轉移至HyBond N+ (GE Life Sciences)持續90分鐘。接著，使RNA與膜交聯，且在65℃下在2 mL PerfectHyb Plus(Sigma)緩衝劑中預雜交60分鐘。隨後將經標記LNA探針添加至PerfectHyb Plus緩衝液(通常25%經標記LNA探針用於任何單一膜雜交)且在65℃下培育3至16小時(較長或較短雜交結果無變化)。膜經2×2.5 mL低嚴格北方緩衝液(0.1% SDS，2×SSC(鹽水-檸檬酸鈉))沖洗，且接著在37℃下在2.5 mL高嚴格北方緩衝液(0.1% SDS，0.5×SSC)中洗滌2×5分鐘。使洗滌膜暴露於儲存磷光體螢幕且最後用GE Typhoon 9410掃描儀成像。 聚醣自 RNA 樣品釋放
如上文所描述分離小RNA。RNA樣品依序用兩種醣苷酶消化。通常對於實驗樣品，將來自H9 ES、HeLa或293FT細胞之25 μg小RNA再懸浮於10 μL 1×GlycoBuffer 2 (NEB)、7.5 μL PNGaseF (NEB)中且用水再懸浮至100 μL最終反應體積。PNGaseF裂解發生在37℃下隔夜。在消化之後，使用PGC SPE管柱(Thermo Fisher Scientific)使所釋放之聚醣去鹽。首先用80%乙腈(ACN)+ 0.1%三氟乙酸(TFA)且隨後用0.1% TFA洗滌SPE管柱5次。用水使樣品達到500 μL且穿過管柱兩次。將SPE用0.1% TFA洗滌一次且最後依序在15% ACN/0.1% TFA，35% ACN/0.1% TFA中溶離。用SpeedVac (Labconco)抽吸出ACN，合併溶離份且藉由凍乾乾燥。在乾燥之後，將樣品再懸浮於5 μL LC-MS級水(Thermo Fisher Scientific)中用於MS分析。 聚醣自肽樣品釋放
肽由來自H9 ES、HeLa或293FT細胞之總細胞裂解物材料產生。特定言之，使用S-trap微型管柱(Protifi)將100 μg蛋白裂解物處理成胰蛋白酶肽。使裂解物溶液達到5% SDS及5 mM DTT最終濃度，加熱至95℃後維持5分鐘，冷卻至25℃後維持5分鐘，且接著添加25 mM碘乙醯胺(Sigma)以在25℃下在暗處烷基化30分鐘。隨後藉由添加磷酸(Sigma)至1.2%最終濃度來酸化樣品，且隨後添加8倍體積之結合緩衝液(含100 mM三乙基碳酸氫銨(TEAB)之90%甲醇)，渦流以混合。蛋白質樣品接下來藉由在4000x g下離心10個部分來結合S-trap管柱，重複旋轉，直至所有樣品體積通過管柱基質為止。用結合緩衝液進行三次洗滌以沖洗管柱。藉由以1 μg胰蛋白酶與20 μg蛋白質裂解物之比率將胰蛋白酶(Promega)溶液施加至50 mM碳酸氫銨(Sigma)之管柱基質來產生肽。消化在47℃下進行90分鐘。藉由依序施加含0.1%甲酸之50 mM碳酸氫銨及含0.1%甲酸之50%乙腈來溶離肽。N-聚醣自如上文關於RNA所描述之肽樣品釋放。在PNGaseF消化之後，藉由使肽混合物在0.2%甲酸中達到500 μL且使其通過10 mg聚合C-18 SPE (Strata-X)管柱來移除去醣基化肽：游離聚醣將流經且被保存。用PGC SPE使游離聚醣平行於RNA樣品去鹽，且最後將樣品再懸浮於5 μL LC-MS級水(Thermo Fisher Scientific)中用於MS分析。 質譜層析
使用以下條件獲得質譜資料。將各乾燥樣品在10 µL 5 mM甲酸銨中復原，且將3 µL樣品注射至裝備有5 μL注射迴路之UltiMate 3000 RSLC奈米UPLC (Thermo Fisher Scientific)系統上。用人工填充有連接至不鏽鋼發射器(30 µM ID，Thermo Fisher Scientific)之5 μm多孔石墨碳(Hypercarb，PGC，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)的市售熔融二氧化矽管柱(IntegraFrit，New Objective，Woburn，MA)產生之毛細管管柱(100 μm ID, 18 cm長度)來執行分離。所使用之移動相為5 mM甲酸銨(A)及2:1異丙醇:乙腈(B)。在100% A下，流動速率為1000 nL/min，持續5.5 min，接著降低至300 nL/min持續0.5 min，接著在15%/min線性梯度下持續1 min。在1.4%/min下持續25 min，6.25%/min持續8 min，接著在100% B下保持2 min，在100% A下以1000 nL/min再平衡5 min(包括注射時間用於後續注射)。在運行5.5 min時間點處切換注射閥門以在梯度期間自流道移除樣品迴路。 質譜儀
所有質譜資料均用Lumos Orbitrap質譜儀(Thermo Fisher Scientific)獲取。正模式電噴霧電離在奈米噴霧條件(300 nL/min)下，使用施加至不鏽鋼發射器(30 µM ID，Thermo Fisher Scientific)的具有2.2 kV之源電壓的Thermo Fisher Scientific Nanoflex離子源進行，且毛細管溫度為300℃。S-透鏡RF水準設定為60%。 游離聚醣非靶向篩選
採用全掃描( m/z500−2500)軌道離子阱偵測進行資料依賴性片段化，解析度設定為120,000，標準化AGC目標為250%，以及最大離子注入時間設定為50 ms。獲取MS 2譜，四極分離寬度為 m/z1.6，HCD片段化為25%，軌道離子阱偵測解析度設定為15000，標準化AGC目標為400%，以及最大離子注入時間為22 ms。資料依賴性參數如下：強度臨限值2.5×10 4、30 s內重複計數3、排除持續時間為20 s，以及排除質量寬度為±5 ppm (排除同位素)。使用由先前公開之內源性RNA加合物及其 13C同位素同源物組成的質量排除清單。循環時間為3 s，資料收集為特徵曲線模式。 分析
聚醣釋放樣品用GlycoNote分析。簡言之，.raw檔案轉化為.mgf檔案且加載至GlyoNote GUI中。該等參數用於所有聚醣釋放檔案。GlycoNote輸出檔案含有人工驗證之聚醣結構及標註光譜。 用生物素苯胺對 RNA 進行之凝集素鄰近標記 活細胞標記
HeLa細胞如上典型地在10 cm盤中培養。細胞在冰冷1×PBS中沖洗兩次，每次洗滌之後丟棄，且在4℃下在凝集素阻斷緩衝液(LBB，20 mM HEPES，150 mM NaCl，1 mM MgCl 2，1 mM MnCl 2，1 mM CaCl 2，2.5% FBS)中阻斷15分鐘。隨後丟棄阻斷緩衝液且用LBB+Lectin+Strep-HRP置換。通常，以5 μg/mL經生物素標記之凝集素及6 μg/mL Strep-HRP之濃度製備4 mL此物質，首先在冰上將此等組分混合在一起持續30分鐘，隨後添加LBB。在4℃下LBB+Lectin+Strep-HRP染色45分鐘，其後細胞在冰冷1×PBS + 1 mM CaCl 2+ 1 mM MgCl 2(PBS++)中沖洗兩次。緊接在此3 mL PBS++之後添加350 μM生物素-苯胺(Iris Biotech GMBH)至各盤且在冰上培育1分鐘。接著將培養盤移動至台面且添加H 2O 2至最終濃度為1 mM。此反應精確地進行2分鐘，其後使培養盤返回至冰上，抽吸PBS++/生物素-苯胺/H 2O 2，且在淬滅緩衝液中將細胞快速但輕輕地沖洗兩次：5 mM Trolox、10 mM抗壞血酸鈉及10 mM疊氮化鈉於PBS++中(如(Fazal等人, 2019)中所描述)。在移除淬滅緩衝液之後，將TRIzol直接添加至培養盤且如上文所描述處理RNA以用於酶消化以及墨點法。 裂解物標記
生長HeLa細胞且如活細胞標記流程般洗滌。藉由每10 cm培養盤添加500 μL冰冷50 mM Tris pH 8與完整蛋白酶抑制劑混合物(Roche)，刮除細胞且上下吸液10次來產生細胞裂解物。來自各10 cm培養盤之裂解物隨後與經生物素標記之凝集素與Strep-HRP之相同預複合比率一起在冰上培育45分鐘。隨後使裂解物升溫至25℃持續2分鐘，在25℃下將350 μM生物素-苯胺添加至各試管中持續1分鐘，且隨後添加1 mM H 2O 2以起始反應。每個反應在直接添加5mM Trolox，10mM抗壞血酸鈉及10mM疊氮化鈉之前進行正好2分鐘。用TRIzol LS (Thermo Fisher Scientific)自標記裂解物樣品提取RNA且與活細胞樣品平行處理。 細胞提昇試劑之最佳化
在建立細胞表面醣RNA之FACS流程過程中(下文)，注意到使用胰蛋白酶之標準細胞提昇策略導致細胞RNA之幾乎完全破壞。為了理解為何會發生此情況且找到RNA安全策略，執行以下品質控制實驗：
首先，分析用於組織培養之胰蛋白酶及TrypLE試劑之總蛋白質。購買來自GE Healthcare、Sigma、Stem Cell Technologies、ATCC及Thermo Fischer Scientific之組織蛋白酶產物，在SDS-PAGE凝膠上分離，用Acquastain蛋白質凝膠染色(Bulldog Bio)染色且在LiCor上掃描以觀察此等試劑之任何蛋白質組分。所有胰蛋白酶產物含有對應於約25 kDa之全長胰蛋白酶蛋白質的帶，然而每種儲備液亦含有一系列具有未知標識之低分子量帶。
第二，來自Thermo Fischer Scientific網站之TrypLE為「無動物來源之重組酶」，因為其「特殊的純度增加特異性且減少可能由一些胰蛋白酶提取物中存在之其他酶而引起的對細胞的損害」。發現TrypLE以與胰蛋白酶極類似之分子量運作，然而其不含此等低分子量帶。
第三，評估此等試劑對細胞RNA造成之相對損害。HeLa細胞生長於如上文所描述之6孔盤中，用1×PBS沖洗，且隨後在37℃下在250 μL 1×PBS、胰蛋白酶(GE Healthcare )或TrypLE (Thermo Fischer Scientific)培育5分鐘。在此培育之後，樣品直接用750 μL TRIzol LS裂解或再懸浮於750 μL 1×PBS中，在300x g下旋轉5分鐘，丟棄上清液，且接著細胞集結粒裂解於TRIzol LS中。此實驗之結果顯示，儘管PBS及TrypLE不引起RNA降解，但若細胞不用PBS預洗滌，則胰蛋白酶溶液完全破壞RNA，且若其存在，則即使當用TRIzol萃取時，亦存在細胞RNA之大量降解。
因此，當進行用於細胞表面醣RNA之分析的實驗時，應使用已經謹慎地測試RNA酶污染之TrypLE或其他試劑。 螢光活化之細胞分選 (FACS) 分析
細胞如上文所描述生長，且若貼壁，則在37℃下用TrypLE (Thermo Fisher Scientific)提昇4分鐘。將細胞再懸浮於FACS緩衝液(0.5%牛血清白蛋白(Thermo Fisher Scientific)於1% PBS中)中，計數，且等分至每100 μL FACS緩衝液200,000個細胞，在冰上培育30分鐘以阻斷。對於RNA酶消化，以指定濃度(通常2 μM)將RNA酶A (Sigma)添加至阻斷緩衝液中。在阻斷之後，使細胞達到25℃持續5分鐘，接著在4℃及350×g下旋轉5分鐘。細胞用150 μL FACS緩衝液洗滌一次且如上旋轉。採集兩種類似方法以染色細胞表面RNA (1)或細胞表面唾液酸(2)。在分析(1)中，細胞在冰上在100 μL FACS緩衝液中再懸浮於10 μg/mL抗J2抗體(Scicons)中30分鐘，如上旋轉且如上洗滌一次。細胞隨後用8 μg/mL山羊、抗小鼠IR680抗體(LiCor Bioscience)於100 μL FACS緩衝液中在冰上及在黑暗中染色30分鐘，如上旋轉且如上洗滌一次。最後，將細胞在黑暗中在25℃下固定在100 μL FluoroFix緩衝液(BioLegend)中30分鐘。細胞最後如上洗滌一次且儲存於4℃下之FACS緩衝液中以用於分析。在(2)的分析中，重組人類Siglec-Fc蛋白(R&D Systems)預先複合至Alexa Fluor-647 AffiniPure驢抗人類IgG，Fcγ片段特異性(Jackson Laboratories)，兩者在FACS緩衝液中均為1.5 μg/mL，在冰上1小時。將細胞再懸浮於100 μL預先複合之Siglec-Fc-二級溶液中且在冰上在黑暗中培育30分鐘，洗滌一次，且直接如上文所描述進行固定。分析FACS資料且用FloJo軟體觀測。 定量及統計分析
RNA序列統計藉由R封裝『DESeq2』測定。 實例 10- 合成醣核酸之通用程序
具有共價結合之天然聚醣的核酸係藉由在疊氮化物-聚醣與炔烴-核酸之間與銅催化劑使用典型銅單擊反應(CuAAC)製得。RNA及DNA反應物使用內部單一修飾之3'5-辛二烯基dU (IDT)合成。將含有炔烴之經修飾之核酸在水中稀釋至100 µM的最終濃度，且在95℃下變性2分鐘，置放於冰上，且在37℃下於200 µM MgCl及PBS pH 7.0中摺疊5分鐘。CuSO4在水中製造且添加至配體2-(4-((雙((1-(三級丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸(BTTAA)，且在室溫下培育5分鐘。隨後，藉由依序添加炔烴核酸(10 µM)、疊氮化物-聚醣(20 µM)與Cu·BTTAA (各自最終濃度為100uM)及含1×PBS之抗壞血酸鈉(1mM)來組裝CuAAC反應。在35℃下培育點擊反應1小時。用20 mM EDTA停止點擊反應。接著使用ZYMO RESEARCH® RNA清潔及濃縮器對反應進行純化且在10 µl中溶離。此溶離在55℃下使用95%甲醯胺、18 mM EDTA及0.025% SDS加樣染料與1×SYBR金變性10分鐘。1%瓊脂糖及1.1%甲醛凝膠用於觀察結合及非結合聚醣核酸之間的強度及遷移差異。疊氮基-聚醣(疊氮化物-聚醣)如下文在 實例 11中所描述製備。
疊氮基聚醣之表徵已藉由TLC及MALDI-MS實現。用UV-Vis及凝膠電泳實現炔烴-DNA及炔烴RNA之表徵。合成-N-聚醣-RNA及合成-N-聚醣-DNA之表徵已藉由唾液酸糖之化學標記、凝膠電泳、RNA/DNA轉移及唾液酸糖於RNA/DNA轉移膜上之成像來實現。在實例10中，使用基於二氧化矽之標準RNA/DNA去鹽管柱將合成-N-聚醣-RNA及合成-N-聚醣-DNA自過量試劑中純化出來。
在某些實施例中，應變之經炔烴修飾之核酸係藉由使用N-羥基丁二醯亞胺(NHS)反應之條件，將在5'端用內部胺基修飾劑(例如用核酸之內部胺基修飾劑，例如可用於整合DNA技術(Integrated DNA Technologies)中)/iUniAmM/修飾之RNA或DNA (SEQ ID NO. 1或2之RNA或DNA)偶合至DIBAC (二苯偶氮雜環辛炔，或「DBCO」，二苯并環辛炔)來製備的。應變之經炔烴(DIBAC/DBCO)修飾之RNA或應變之經炔烴(DIBAC/DBCO)修飾之DNA隨後與疊氮化物-N-聚醣偶合。疊氮基-聚醣(疊氮化物-聚醣)如下文在 實例 11中所描述製備。 實例 11- 自對應例示性胺基 -N- 聚醣製備例示性疊氮基 -N- 聚醣
提供一種便捷且高效的方法，其經由氟硫醯基疊氮化物介導之重氮基轉移將胺基N-聚醣轉化成疊氮基N-聚醣，顯示於下表5中。此方法展現在簡單單醣至寡醣、N-聚醣及複雜醣肽範圍內之受質範疇，其以幾乎定量的產率提供相應疊氮基-N-聚醣。 表 5- 合成疊氮基 -N- 聚醣之實例
Figure 02_image137
實例 12- 合成疊氮基聚醣之通用程序 材料及方法
游離還原末端聚醣獲自Glycobia, Inc., Ithaca, NY，且根據此項技術中已知之文獻程序製備。 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物添加
具有游離還原末端之聚醣與10倍莫耳過量之胺氧基-PEG3-疊氮化物連接子一起培育。在1×PBS (pH 4.0)中在65℃下進行反應30小時。使用PGC SPE管柱(Thermo FisherScientific®)使反應去鹽。用1 mL乙腈，繼之以1 mL H 2O預調節管柱。反應混合物用水稀釋直至500 µL，且通過管柱。在反應混合物載入之後，管柱用800 µL於50/50乙腈及H 2O中之10 mM NH 4HCO 3溶離。在真空下移除乙腈且藉由凍乾乾燥。 表 6A- 例示性胺氧基 -PEG3- 疊氮化物功能化聚醣
參考 編號 經修飾之聚醣
G-12 Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-13 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-14 NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuNAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-15 Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-16 Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-17 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-18 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-19 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
G-20 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- 胺氧基 -PEG3- 疊氮化物
天冬醯胺疊氮化物功能化
向天冬醯胺連接之N-聚醣於蒸餾水中之溶液中添加Na 2CO 3(20當量)及FSO 2N 3(40當量)。混合物在室溫下旋轉1小時，且MALDI質量分析展示完全轉化。將反應混合物置放於真空中30分鐘，接著凍乾。使殘餘物(白色粉末)在微型Q水中復原，隨後將其裝載於經預調節之Carb SPE管上。用蒸餾水(10×1.2 mL)洗滌試管，隨後用50%乙腈及100 mM (NH 4) 2CO 3(4×1.2 mL)溶離。將溶離劑合併且凍乾，得到所需疊氮基聚醣。 表 6B- 例示性天冬醯胺疊氮化物功能化聚醣
參考 編號 經修飾之聚醣 產率 MS
G-28 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物 93 [M+K] += 1495.156
G-29 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物 92 [M+K] += 1819.304
G-30 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物 91 [M+4K-3H] += 2515.293
G-31 GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物 91 [M+K] += 1641.453
G-32 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物 92 [M+K] += 1965.601
G-33 Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Neu5Ac(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc(b1- Asn- 疊氮化物 90 [M+4K-3H] += 2661.363
實例 13- 疊氮基聚醣及經修飾之 siRNA 之點擊化學偶合的通用程序 聚醣 - siRNA
在3'端經DBCO官能化之siRNA係購自WuXi Biologics®或Axolabs®，且藉由此項技術中沿用已久之方法製成。將在3'端與DBCO結合之siRNA與10倍過量的疊氮化物官能化聚醣一起培育。結合反應在37℃下隔夜進行。藉由HPLC純化結合之醣RNA。使用200 mM HFIP+16 mM TEA/甲醇進行醣RNA結合物之HPLC純化。儀器模型：Agilent 1260 HPLC；管柱：Agilent AdvanceBio寡核苷酸，2.1×100 mm, 2.7 µm。藉由凍乾乾燥經結合之醣RNA。接著，將醣RNA再懸浮於水中至100 µM之濃度。接著使醣RNA退火至退火緩衝液(30 mM Tris，pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA)中之互補有義股。對於退火反應，將樣品加熱至95℃且歷經約6小時緩慢冷卻至室溫。經退火之雙螺旋體使用Zeba旋轉去鹽管柱(Thermo FisherScientific®)藉由在1500 g下離心2 min去鹽。
使用上文所描述之通用程序產生表6C中所描述之醣RNA。 表 6C- 例示性醣 RNA
參考 編號 聚醣 siRNA 結合 %
R-1 G-28 I-2 76
R-2 G-29 I-2 74
R-3 G-30 I-2 67
R-4 G-31 I-2 77
R-5 G-32 I-2 75
R-6 G-33 I-2 75
R-7 G-12 I-2 50
R-8 G-13 I-2 48
R-9 G-14 I-2 28
R-10 G-15 I-2 39
R-11 G-16 I-2 47
R-12 G-17 I-2 23
R-13 G-18 I-2 22
R-14 G-19 I-2 29
R-15 G-20 I-2 8
R-16 G-35 I-2   
接著使用上述通用程序使醣RNA退火至I-1。圖12為顯示醣RNA R-1至R-6及未結合之siRNA I-2與siRNA I-1之雙螺旋體的形成的墨點。
類似地，使用上文所描述之通用程序合成比較化合物X-1及X-2，其中使用單醣代替疊氮化物官能化之聚醣。接著使用上述通用程序使結合之單醣退火至I-1。 表 6D- 例示性經單醣修飾之 siRNA
參考 編號 單醣 siRNA
X-1
Figure 02_image139
2-疊氮基乙基α-D-哌喃甘露糖苷 		I-2
X-2
Figure 02_image141
2-疊氮基乙基2-乙醯胺基-3,4,6-參-O-乙醯基-2-去氧-β-D-哌喃半乳糖苷 		I-2
另外，使用固態合成程序合成比較化合物X-3。接著使用上述通用程序使結合之化合物退火至I-4。 表 6E- 例示性經修飾之 siRNA
參考 編號 化合物
X-3
Figure 02_image143
實例 14- 使用醣 RNA 之細胞信號傳導基因敲低
在實驗之前24小時將293T細胞以100,000個細胞/1 mL生長培養基接種於24孔培養盤中。將2µl脂染胺添加至100µl無血清培養基中，且將醣-siRNA雙螺旋體分別添加至無血清培養基中直至最終濃度為50 nM。在室溫下將此兩種混合物(脂染胺及經稀釋之雙螺旋體)一起添加且培育20分鐘。自接種之293 T細胞中抽吸培養基且用100µl新鮮培養基替換。將20µl脂染胺-醣-siRNA混合物添加至各孔中且培育隔夜。RNA使用RNA裂解緩衝液(Zymo)自細胞純化，接著進行RNA製備、洗滌及溶離緩衝液以及各自以10,000 g旋轉2 min。在定量RNA之後，將其稀釋至10 ng/µL，每個qPCR反應具有50 ng。一式兩份地操作樣品且各樣品具有生物複本。qPCR引子連接至β連環蛋白基因及PPIB且使用125 nM引子、1×Taq聚合酶主混合物、MMLV RT酶(每反應0.5單位)及1×SYBR綠進行擴增。樣品首先在50℃下培育30分鐘，接著在95℃下培育10分鐘，接著在95℃下培育40個30秒之循環及在60℃下培育1分鐘。β連環蛋白Ct值藉由PPIB的Ct值標準化，以報導圖14中之相對豐度(β連環蛋白mRNA%)。 實例 15- 醣 RNA 流動分析 -HepG2 細胞
HepG2細胞維持在培養培養基中(DMEM+10% FBS，所有試劑均來源於Gibco/Life Technologies)。在ViCell XR細胞計數器(Beckman)上使用錐蟲藍排除評估細胞計數及活力。2×10 5個活細胞接種於總體積為100 µL之分析緩衝液(無額外血清或蛋白質之細胞培養基，Gibco/Life Technologies)中之96孔v底培養盤中的每個孔中。細胞經由離心在1×PBS (Gibco/Life Technologies)中洗滌且再懸浮於額外PBS中。根據製造商說明書添加100 µL活/死可固定的黃細胞染色(Life Technologies/Thermo Scientific)且在室溫下培育15分鐘。樣品隨後如上經由離心在PBS中洗滌。將細胞再懸浮於阻斷緩衝液(10%人類TruStain FcX，BioLegend，1×PBS+0.5% BSA)中，且在室溫下在黑暗中培育五分鐘(以最小化Cy5信號之損失)。經Cy5標記之雙螺旋醣RNA自10 µM儲備液稀釋至額外分析緩衝液中且以0.1、1、10及100 nM濃度(在生物複本中)接種。細胞接著於暗處在37℃，5% CO 2下在標準細胞培養保溫箱內培育四小時。樣品隨後經由離心在分析緩衝液中洗滌一次。接著緊接著在帶有CYTKICK 96孔高通量附接件(Thermo Scientific)之ATTUNE NxT T流式細胞儀上獲取未固定細胞。使用FlowJo®軟體(BD Bioscience)分析FCS檔案。使用正向散射特性及側向散射特性鑑別所關注之細胞群體，且藉由比較正向散射高度與面積排除雙聯體。基於活/死亡染色排除所鑑別之活細胞。對所有所關注之陽性細胞群體之Cy5表現的直方圖重疊及平均螢光強度(MFI)與用X-3/I-4雙螺旋體醣RNA處理之細胞進行比較。所測試之醣RNA之平均螢光強度(MFI)顯示於圖15A及15B中，與X-3/I-4雙螺旋體進行比較，且在Prism (GraphPad)中用圖表示。 實例 16-HepG2 細胞中之 siRNA 介導之基因敲低
將1×10 5個HepG2細胞/孔接種於96孔平底盤中且在無血清DMEM培養基中與Cy5標記之雙螺旋醣RNA (R-1至R-6)滴定一起培育24小時。在培育之後，經由抽吸移除培養基且在PBS中洗滌一次。在-80℃下冷凍乾燥集結粒直至RNA提取。遵循製造商說明書，使用RNeasy微旋轉管柱(QIAGEN)自細胞分離出總RNA。總RNA在水中溶離(14 µL總容積)且等分試樣在NanoDrop TM(Thermo Scientific)上定量。cDNA使用100 ng RNA/樣品使用SuperScript TMIV cDNA合成系統(Life Technologies/Thermo Scientific)與寡核苷酸(dT)引子遵循製造商說明書使用BioRad熱循環儀來合成。使用針對β-連環蛋白與GAPDH之多工TaqMan探針評估基因表現(β-連環蛋白探針集合之分析ID：Hs00355045_m1，內源性人類GAPDH對照：4326317，兩者均購自Applied Bio/Thermo Scientific)。在生物及技術複本中之96孔光學透明PCR培養盤(Applied Bio/Thermo Scientific)中每孔接種10 ng樣品cDNA，且按照製造商說明書添加20X TaqMan探針和2× TaqMan基因表現主混合物，每孔20 µL總反應物(Applied Bio/Thermo Scientific)。使用以下擴增參數在QuantStudio 6 Pro即時PCR系統上擴增樣品：第1階段：50℃持續2分鐘。第2階段：95℃，持續10分鐘。第3階段：95℃持續15秒，60℃持續1分鐘。重複40次。β-連環蛋白之基因表現係使用ΔΔCT方法相對於GAPDH表現及未處理對照細胞計算，其中值小於1指示siRNA介導之β-連環蛋白的基因敲低。 實例 17- 醣 RNA 流動分析 -PBMC
自StemCell Technologies購買冷凍的來自健康人類供體之周邊血液單核細胞(PBMC)。此等細胞儲存於液氮超低溫冷凍器之氣相中直至使用。使小瓶在37℃水浴中快速解凍且在PBS+10% FBS (Gibco/Life Technologies)中洗滌一次，隨後經由離心(500xg，5分鐘)於PBS (Gibco/Life Technologies)中額外洗滌兩次。在Vi-Cell TMXR細胞計數器(Beckman)上使用錐蟲藍排除評估細胞計數及活力。4×10 5個活細胞接種於總體積為100 µL之分析緩衝液(PBS+0.5%BSA，Gibco/Life Technologies)中之96孔圓底培養盤中的每個孔中。經Cy5標記之雙螺旋醣RNA自10 µM儲備液稀釋至額外分析緩衝液中且以0.1、1、10及100 nM濃度(在生物複本中)接種。細胞接著於暗處在37℃，5% CO 2下在標準細胞培養保溫箱內培育四小時。在培育之後，細胞經由離心(如上文)洗滌一次且再懸浮於添加10% Fc阻斷之分析緩衝液(人類Fc阻斷，Miltenyi Biotech)中，其中總體積為100 µL/孔。在室溫下於暗處培育培養盤30分鐘(以使Cy5信號之損失最小化)。使用Super Bright染色緩衝液(Life Technologies/Thermo Scientific)按照製造商建議之量添加針對所選免疫細胞標誌物之抗體(抗CD3純系OK3 AF 488，抗CD4純系OKT4 Super Bright 600，抗CD8純系OKT8 Super Bright 702，抗CD14純系MEM-15 NovaFluor Yellow 700，及抗CD19純系HIB19 PE-eFluor 610，均購自Life Technologies/Thermo Scientific)。細胞在室溫下於暗處培育一小時，隨後用分析緩衝液(如上)洗滌一次。根據製造商說明書添加活/死可固定的淺綠色細胞染色(Life Technologies/Thermo Scientific)且在室溫下培育兩分鐘。接著緊接著在Attune NxT T流式細胞儀及其CYTKICK 96孔高通量附接件(Thermo Scientific)上獲取未固定細胞。使用FlowJo軟體(BD Bioscience)分析FCS檔案。使用正向散射特性及側向散射特性鑑別淋巴球，且藉由比較正向散射高度與面積排除雙聯體。基於活/死亡染色排除所鑑別之活細胞。藉由CD14陽性染色鑑定單核球，且基於CD19陽性染色鑑定B細胞。首先藉由CD3陽性染色且接著藉由CD4對比CD8染色鑑別T細胞。對所有所關注之陽性細胞群體之Cy5表現的直方圖重疊及平均螢光強度(MFI)與用I-4/X-3雙螺旋體處理之細胞進行比較。表現資料係相對於X-3/I-4雙螺旋體報導且在Prism (GraphPad)中用圖表示，參見圖13A至圖13C。 實例 18-HepG2 成像分析
第1天，使用ACCUTASE® (Sigma)分裂且計數HepG2細胞。將2000個活細胞/50 µL完整培養基(DMEM+10% FBS+1%PEN/STREP，Gibco/Life Technologies)接種至384孔玻璃底成像培養盤(CORNING®)中。細胞在標準組織培養恆溫箱中在37℃，5% CO 2下培育隔夜。在第2天，自各孔移除培養基，且將50 µL的1:1000細胞光罩綠色質膜染色(ThermoFisher)及1:20,000稀釋於OptiMEM中之Hoechst添加至各孔。將細胞在37℃、5% CO 2下培育五分鐘，且隨後用50℃之OptiMEM平緩洗滌三次。移除OptiMEM且將50 µL之100 nM經Cy5標記之雙螺旋醣RNA添加至細胞中且在37℃、5% CO 2下培育16小時。在DAPI、FITC及Cy5通道中用40×水物鏡使培養盤成像在Opera Phenix高含量篩選系統上。圖16A-圖16F為如上文所描述捕獲之Cy5螢光影像，其展示HepG2細胞中及HepG2細胞上醣RNA雙螺旋體之內化及/或定位。R-1/I-1 (圖16A)；R-2/I-1 (圖16B)；R-3/I-1 (圖16C)；R-4/I-1 (圖16D)；R-5/I-1 (圖16E)；及R-6/I-1 (圖16F)。
前述實例說明本發明之原理。應瞭解，本領域中熟習此項技術者將能夠設計各種配置，儘管並未在本文中明確地描述或展示，但該配置體現本發明之原理且包括於其精神及範疇內。此外，本文中所敍述之所有實例及條件語言大體上意欲輔助讀者理解本發明之原理及由本發明人貢獻之概念以促進此項技術，且解釋為不限於所述特定敍述之實例及條件。此外，本文中敍述本發明之原理、態樣及實施例以及其具體實例之所有陳述皆意欲涵蓋其結構等效物及功能等效物兩者。另外，希望該等等效物包括當前已知之等效物及未來研發之等效物，亦即不管結構如何，執行相同功能之所研發之任何元素。因此，本發明之範疇不意欲限於本文所顯示且描述之例示性實施例。
圖 1A- 圖 1D為顯示Ac 4ManNAz (聚醣報導子)併入哺乳動物細胞RNA中的示意圖及墨點影像。 圖 1A為RNA提取方案之示意圖。Ac 4ManNAz=過乙醯化之 N-疊氮基乙醯基甘露糖胺。Prot.K=蛋白酶K。DBCO=二苯并環辛炔。 圖 1B為用100 μM Ac 4ManNAz處理指定時間量之HeLa細胞的RNA的RNA墨點法。在RNA純化之後，Ac 4ManNAz結合至DBCO-生物素，用鏈黴抗生物素蛋白-IR800 (鏈黴素)觀測，且成像於紅外線掃描儀上。在RNA轉移至膜之前，將總RNA染色且用SYBR Gold (Sybr)成像以詢問品質及負載。所有後續墨點以此方式製備，且Ac 4ManNAz始終以100 μM使用。存在醣RNA且指出非特異性標記(*)的區域。 圖 1C為用Turbo DNA酶或RNA酶混合物(A/T1) +/- SUPERaseIn (RNA酶抑制劑)活體外處理之經Ac 4ManNAz標記的HeLa RNA的RNA墨點。 圖 1D為在指定天數以300 mg Ac 4ManNAz/kg/天經由腹膜內注射之活體內Ac 4ManNAz遞送之後的鼠類RNA的RNA墨點。分析來自肝臟及脾臟之RNA。模擬(m)小鼠僅注射有DMSO。對所提取RNA進行RNA酶處理。
圖 2A- 圖 2E為墨點及散佈圖，其顯示小型、非聚腺苷酸化且保守性轉錄本包含細胞醣RNA池。 圖 2A為用Ac 4ManNAz處理之HeLa細胞的總或聚腺苷酸化(poly-A)富集之RNA的墨點。 圖 2B為使用基於二氧化矽之管柱進行差異沈澱分級分離之後，用Ac 4ManNAz處理之HeLa細胞的總RNA的墨點。 圖 2C為在蔗糖密度梯度(15%-30%蔗糖)分級分離後，用Ac 4ManNAz處理之H9人類胚胎幹細胞(H9)之總RNA的墨點法。輸入輪廓顯示於該梯度右側。 圖 2D為來自HeLa及H9細胞之 圖 2C的小RNA級份中純化的Ac 4ManNAz富集之RNA的散佈圖分析。展示相對於snRNA、snoRNAs及Y RNA定位之讀段。將顯著性評分(-log 10(經調整之p值)覆疊作為針對HeLa細胞之各資料點之大小及作為針對H9細胞之各資料點之色彩。 圖 2E為用Ac 4ManNAz處理之野生型(WT)或Y5基因剔除(KO) 293T細胞之總RNA的代表性墨點。 圖 2E中之插圖展示 圖 2E中生物三重複本之對墨點的定量。P值藉由成對雙尾t檢驗計算。
圖 3A- 圖 3E為含有唾液酸之聚醣修飾之RNA的墨點及曲線圖。 圖 3A為來自用1.75 mM 9-疊氮基唾液酸處理指定時間之HeLa細胞的RNA的墨點法。 圖 3B為用霍亂弧菌( Vibrio cholerae，VC)唾液酸酶或熱不活化唾液酸酶(VC-唾液酸酶-HI)處理之經Ac 4ManNAz標記的HeLa細胞RNA的墨點法。 圖 3C為用Ac 4ManNAz及指示濃度之P-3F AX-Neu5Ac處理之HeLa細胞的RNA的墨點法。 圖 3D自H9細胞分離出未經標記之總RNA，使其與指定酶(無酶、RNA酶混合物或唾液酸酶處理)反應，清潔以移除裂解代謝物，且用螢光形成的1,2-二胺基-4,5-亞甲基二氧基苯(DMB)探針處理。HPLC分析對特定唾液酸之存在及含量進行定量。 圖 3D中之插圖影像為各條件之總RNA的Sybr凝膠影像。主要唾液酸峰值為#2及#3。峰1之標識未知，但其對RNA酶敏感。 圖 3E為展示來自四個生物複本之4188、H9及HeLa細胞之圖 3D的DMB結果之定量的圖。
圖 4A- 圖 4H為顯示一組不同的富集有醣RNA之N-聚醣的墨點、圖式及流程。 圖 4A為經Ac 4ManNAz、半乳糖(Gal，10 μM)、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc，100 μM)或全部持續24小時標記之 ldlDCHO細胞的RNA的墨點法。 圖 4B為用Ac 4ManNAz及指示濃度之NGI-1 (OST抑制劑)處理24小時之HeLa細胞的RNA的墨點法。 圖 4C為如同圖4B中之墨點法，但具有指示濃度之幾夫鹼(Kifunensine)。 圖 4D為在用指定酶活體外在生物三重複本中在37℃下各自處理經Ac 4ManNAz標記之HeLa細胞RNA 1小時之後量化Ac4ManNAz信號之圖式。 圖 4E為用於自RNA樣品釋放聚醣且隨後純化游離聚醣以進行質譜分析之方法的示意圖。 圖 4F為經由PNGaseF裂解自293、H9或HeLa細胞之肽及RNA級份(行)釋放之聚醣(列)的無監督聚類分析。聚醣必須在六個樣品中的至少一個的生物複本中發現，才能被包括在內。 圖 4G為肽及RNA PNGaseF釋放型聚醣之主要組分分析圖。 圖 4H為自肽或RNA樣品釋放之含有岩藻糖或唾液酸修飾之聚醣級份的一組條形圖。橫軸上之數字為在來自給定資料集之各修飾下發現的聚醣之絕對數目。
圖 5A- 圖 5G為說明醣RNA在活細胞外表面上之影像及圖式。 圖 5A為經設計以穩固地純化細胞核之次細胞分級分離之後RNA及蛋白質之墨點法。藉由西方墨點法觀測非核蛋白質GAPDH及β-微管蛋白及細胞核組蛋白3離胺酸4三甲基化(H3K4me3)。 圖 5B為經設計以將可溶性胞溶質與膜性細胞器分離之次細胞分級分離之後RNA及蛋白質之墨點。藉由西方墨點法觀測膜蛋白RPN1、Sec63及可溶性β-微管蛋白。 圖 5C為HeLa細胞的RNA墨點法，該Hela細胞用100 μM Ac 4ManNAz標記持續24小時且接著在37℃下暴露於含有具有或不具有150 nM VC-Sia之100 μM Ac 4ManNAz之新鮮培養基持續60分鐘。 圖 5D為量化 圖 5C中所示之在整個生物三重複本中且用相同方式處理之293T或K562細胞的實驗的圖。P值藉由成對雙尾t檢驗計算。 圖 5E為細胞表面上RNA之基於凝集素的鄰近標記的示意圖。將活細胞用生物素化凝集素染色，該生物素化凝集素募集鏈黴抗生物素蛋白HRP，其繼而能夠在添加過氧化氫之後自生物素-苯胺產生氮烯自由基。接著提取來自此等細胞之RNA且分析生物素標記，其揭示RNA是否鄰近凝集素。 圖 5F係如圖5E中所描述產生之總RNA樣品的墨點法。用RNA酶混合物或VC-Sia活體外處理泳道5及6 (在純化RNA之後)，以展現生物素-苯胺信號對此等酶之任何靈敏度。 圖 5G為與 圖 5F中報導之實驗類似的總RNA樣品之墨點法，然而，細胞首先裂解於低張緩衝液中，破壞通常為氮烯自由基不可滲透之細胞膜。rRNA標記在此為明顯的，而在圖5F中則不然。
圖 6A- 圖 6D為顯示細胞表面醣RNA有助於結合所選Siglec蛋白的流程及圖式。 圖 6A為描繪有PNGaseF釋放實驗中鑑別之兩種聚醣之細胞表面上醣RNA的草圖模型。突出顯示抗dsRNA抗體(J2)及Siglec-Fc蛋白之結合的預測位置。 圖 6B為用指示酶或抑制劑預處理且接著用J2抗體染色之單一HeLa細胞的FACS分析。門控區(橙色)指示群體朝向高J2結合偏移。 圖 6C為用OST抑制劑NGI-1以指定濃度預處理12小時之單一HeLa細胞的FACS分析。虛垂直線表示J2高群體，且對於各樣品，此區域內之細胞級份以百分比展示。 圖 6D為用RNA酶預處理且接著用指定Siglec-Fc試劑染色之單一HeLa細胞的FACS分析。
圖 7A- 圖 7C為例示性聚醣部分之結構。在某些實施例中，本發明之醣核酸包含圖7A-圖7C中描繪之聚醣部分。
圖 8A- 圖 8B展示炔烴修飾之核酸與疊氮化物聚醣之間的銅催化之炔烴疊氮化物環加成(CuAAC)反應的示意圖。 圖 8A顯示核酸在經修飾之核苷酸之主鏈組成及長度及位置方面可變化。 圖 8A顯示描繪具有3'末端炔烴修飾之短(20 nt)核酸與含有末端疊氮化物之聚醣(具有簡單寡醣(＜10個糖)之聚醣至用岩藻糖(三角形)及唾液酸(菱形)官能化之更複合的聚醣結構)之間的反應。多個聚醣顯示於 圖 8A中，但在CuAAC反應中，單一修飾之核酸物種與單一聚醣物種反應。 圖 8B展示具有炔烴部分、3'5-辛二炔基dU之經修飾之核苷酸的實例。
圖 9展示可置放聚醣部分之核酸的實例。核酸可在糖組成(RNA或DNA)、長度範圍內，且包括非天然組合物，諸如LNA、硫代磷酸酯或其他修飾。 圖 9中所示之例示性核酸包括各自連接至聚醣之siRNA、ASO、mRNA、適體、環狀RNA及嚮導RNA。 圖 9顯示聚醣修飾可置放於末端5'、3'端或內部，如關於mRNA、適體及環狀RNA描繪所示。
圖 10A- 圖 10E顯示實例10中用於製備核酸-N-聚醣結合物的疊氮基-N-聚醣。 圖 10A顯示實例10中所用疊氮基-N-聚醣之類型及濃度：A2G0-Asn-N3 (G-28) (50 nmol)；2,3SA2-A2G2-Asn-N3 (G-35) (50 nmol)；A2G2-Asn-N3 (G-29) (50 nmol)及2,6SA2-A2G2-Asn-N3 (G-30) (50 nmol)。 圖 10B展示G-28之MALDI-MS波譜。 圖 10C展示G-29之MALDI-MS波譜。 圖 10D展示G-35之MALDI-MS波譜。 圖 10E展示G-30之MALDI-MS波譜。
圖 11展示SybrGold核酸染色，其展示實例10中炔烴-RNA或炔烴-DNA與指定N-聚醣G-28 (50 nmol)、G-35 (50 nmol)、G-29 (50 nmol)及G-30 (50 nmol)反應之後的各別產物。 圖 11展示對應於產生之N-聚醣-RNA或N-聚醣-DNA偶合結合物之新偏移頻帶。
圖 12為顯示例示性醣RNA R-1至R-6與互補有義股I-1之間形成的雙螺旋體之墨點。
圖 13A- 圖 13C描繪相對於醣RNA之X-3/I-4雙螺旋體之表現的圖。 圖 13A顯示相對於醣RNA之X-3/I-4雙螺旋體在與醣RNA一起培育4小時後，人類CD14+單核體中之Cy5信號之相對表現。 圖 13B顯示在與醣RNA一起培育4小時後，人類CD3+ T細胞中Cy5信號之相對表現。 圖 13C顯示與醣RNA一起培育4小時後，人類CD3+ T細胞中Cy5信號之相對表現。
圖 14為顯示使用醣RNA (R-1/I-1雙螺旋體、R-2/I-1雙螺旋體、R-16/I-1雙螺旋體及R-3/I-1雙螺旋體)之細胞信號傳導基因敲低(β連環蛋白%)的圖。
圖 15A 及圖 15B為展示醣RNA相對於HepG2細胞中之X-3/I-4雙螺旋體之Cy5表現的平均螢光強度的圖。圖15A顯示在4小時培育之後在10 nM濃度下相當於X-3/I-4，具有醣RNA雙螺旋體R-1/I-1、R-2/I-1、R-3/I-1、R-4/I-1、R-5/I-1及R-6/I-1之HepG2細胞中Cy5信號之相對表現。圖15B顯示在4小時培育之後在100 nM濃度下相當於X-3/I-4，具有醣RNA雙螺旋體R-1/I-1、R-2/I-1、R-3/I-1、R-4/I-1、R-5/I-1及R-6/I-1之HepG2細胞中Cy5信號之相對表現。
圖 16A- 圖 16F為如實例18中所描述捕獲之Cy5螢光影像，其展示HepG2細胞中及HepG2細胞上醣RNA雙螺旋體之內化及/或定位。圖16A：R-1/I-1；圖16B：R-2/I-1；圖16C：R-3/I-1；圖16D：R-4/I-1；圖16E：R-5/I-1；圖16F：R-6/I-1。 

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                李蘭.史丹佛學院理事會(THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY)
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Claims (71)

  1. 一種醫藥組合物，其包含： a)  醣核酸，該醣核酸包含： i)核酸；及 ii)至少一個結合至該核酸之聚醣部分，該聚醣部分包含至少6個單醣；及 b)  醫藥學上可接受之載劑。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含至少8個單醣。
  3. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含至少10個單醣。
  4. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含 N-連接之聚醣。
  5. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含 O-連接之聚醣。
  6. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含雙觸角聚醣，其中該雙觸角聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基。
  7. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含三觸角聚醣，其中該三觸角聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基。
  8. 如請求項6或7中任一項之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含唾液酸。
  9. 如請求項6或7中任一項之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含岩藻糖。
  10. 如請求項6或7中任一項之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含GlcNAc。
  11. 如請求項6或7中任一項之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含甘露糖。
  12. 如請求項6或7中任一項之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含NeuNAc。
  13. 如請求項6或7中任一項之醫藥組合物，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含半乳糖。
  14. 如請求項1之醫藥組合物，其中該核酸為RNA。
  15. 如請求項14之醫藥組合物，其中該核酸為siRNA。
  16. 如請求項14之醫藥組合物，其中該核酸為mRNA。
  17. 如請求項14之醫藥組合物，其中該核酸為環狀RNA。
  18. 如請求項14之醫藥組合物，其中該核酸為嚮導RNA。
  19. 如請求項14之醫藥組合物，其中該核酸為適體RNA。
  20. 如請求項1之醫藥組合物，其中該核酸為DNA。
  21. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分包含表2A或2B之化合物。
  22. 如請求項1之醫藥組合物，其中該經修飾之核酸包含表1之核酸。
  23. 如請求項1之醫藥組合物，其中該至少一個聚醣部分經由點擊化學反應(click-chemistry reaction)與該經修飾之核酸結合。
  24. 如請求項1之醫藥組合物，其中該核酸經由共價結合至該核酸之末端的連接子基團與該聚醣結合。
  25. 如請求項1之醫藥組合物，其中該核酸經由共價結合至該核酸中間之經化學修飾之核苷酸的連接子與該聚醣結合。
  26. 如請求項1之醫藥組合物，其中該核酸經由共價結合至經化學修飾之核苷酸的連接子與該聚醣結合，該經化學修飾之核苷酸不位於該核酸之3'末端或5'末端。
  27. 如請求項1之醫藥組合物，其中該核酸經由插入該核酸之兩個核苷酸之間的化學手柄與該聚醣結合。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其中該兩個核苷酸不包括在該核酸之3'末端或5'末端處之核苷酸。
  29. 如請求項1之醫藥組合物，其中該醣核酸包含式(I)化合物： A-L-B(I)， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。
  30. 一種式(I)之醣核酸化合物： A-L-B(I)， 或其鹽、共晶體、互變異構物、立體異構物、溶劑合物、水合物、同質異晶物或經同位素富集之衍生物，其中： A為包含第一點擊化學手柄之核酸； B為包含第二點擊化學手柄之天冬醯胺連接之聚醣(N-聚醣)；且 L包含藉由該第一點擊化學手柄與該第二點擊化學手柄之間的雙正交點擊化學反應形成之連接子。
  31. 如請求項30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之RNA。
  32. 如請求項30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之siRNA。
  33. 如請求項30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之mRNA。
  34. 如請求項30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之環狀RNA。
  35. 如請求項30之醣核酸，其中A為包含第一點擊化學手柄之DNA。
  36. 如請求項30之醣核酸，其中A包含選自表4中在「試劑A」下所列出之彼等的第一點擊化學手柄，且其中B包含選自表4中在「試劑B」下所列出之彼等的第二點擊化學手柄。
  37. 如請求項30之醣核酸，其中A包含選自表4中在「試劑B」下所列出之彼等的第一點擊化學手柄，且其中B包含選自表4中在「試劑A」下所列出之彼等的第二點擊化學手柄。
  38. 如請求項30至37中任一項之醣核酸，其中B為包含雙觸角聚醣之天冬醯胺連接之聚醣，其中該雙觸角聚醣包含第一末端殘基及第二末端殘基。
  39. 如請求項30至37中任一項之醣核酸，其中B為包含三觸角聚醣之天冬醯胺連接之聚醣，其中該三觸角聚醣包含第一末端殘基、第二末端殘基及第三末端殘基。
  40. 如請求項38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含唾液酸。
  41. 如請求項38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含岩藻糖。
  42. 如請求項38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含GlcNAc。
  43. 如請求項38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含甘露糖。
  44. 如請求項38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含NeuNAc。
  45. 如請求項38或39之醣核酸，其中該第一末端殘基、該第二末端殘基及該第三末端殘基中之至少一者倘存在時包含半乳糖。
  46. 一種治療疾病或病況之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如請求項1至29中任一項之醫藥組合物或如請求項30至45中任一項之醣核酸；其中該疾病或病況係選自發炎病症、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、凝血疾病、抗凝血疾病、過敏、病毒性疾病及微生物感染。
  47. 如請求項46之方法，其中該疾病或病況為發炎。
  48. 如請求項46之方法，其中該疾病或病況為癌症。
  49. 如請求項46之方法，其中該疾病或病況為自體免疫疾病。
  50. 如請求項46之方法，其中該過敏為IgE介導之過敏。
  51. 如請求項46之方法，其中該自體免疫疾病為全身性紅斑狼瘡。
  52. 如請求項46之方法，其中該疾病或病況為微生物感染。
  53. 如請求項46之方法，其中該疾病或病況為病毒性感染。
  54. 如請求項46之方法，其中該疾病或病況為代謝疾病。
  55. 一種如請求項1至29中任一項之醫藥組合物或如請求項30至45中任一項之醣核酸的用途，其用於製造供治療疾病或病況用之藥劑，其中該疾病或病況係選自發炎病症、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、凝血疾病、抗凝血疾病、過敏、病毒性疾病及微生物感染。
  56. 一種如請求項1至29中任一項之醫藥組合物或如請求項30至45中任一項之醣核酸的用途，其係用於治療有需要之個體之疾病或病況，其中該疾病或病況係選自發炎病症、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、凝血疾病、抗凝血疾病、過敏、病毒性疾病及微生物感染。
  57. 一種用於減少表現聚醣結合蛋白(glycan binding protein；GBP)之細胞與呈現細胞表面醣基化核糖核酸(醣RNA)之細胞之間的相互作用的方法，其包含： 以有效減少該等表現GBP之細胞與該等呈現細胞表面醣RNA之細胞之間的相互作用之量，使該等表現GBP之細胞與結合至該等表現GBP之細胞的表面上表現的GBP的可溶性醣RNA進行接觸。
  58. 如請求項57之方法，其中該等可溶性醣RNA包含來自Y RNA家族之RNA。
  59. 如請求項58之方法，其中該等可溶性醣RNA包含Y5 RNA。
  60. 如請求項57至59中任一項之方法，其中該等可溶性醣RNA包含snoRNA、tRNA、snRNA、rRNA或其任何組合。
  61. 如請求項57至59中任一項之方法，其中該等可溶性醣RNA包含可溶性唾液酸化RNA。
  62. 如請求項61之方法，其中該等可溶性唾液酸化RNA包含Neu5Ac、Neu5Gc或其組合。
  63. 如請求項57至62中任一項之方法，其中該等可溶性醣RNA與一或多種試劑結合。
  64. 如請求項63之方法，其中該一或多種試劑包含治療劑。
  65. 如請求項63或64中任一項之方法，其中該一或多種試劑包含可偵測標記。
  66. 如請求項57至65中任一項之方法，其中該等GBP包含唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin；Siglec)。
  67. 如請求項66之方法，其中該等Siglec包含Siglec-11。
  68. 如請求項66之方法，其中該等Siglec包含Siglec-14。
  69. 如請求項57至65中任一項之方法，其中該等GBP包含C型凝集素。
  70. 如請求項57至65中任一項之方法，其中該等GBP包含半乳糖凝集素。
  71. 如請求項57至65中任一項之方法，其中該等GBP包含選擇素。
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