KR0178958B1 - 세포 흡착의 올리고누클레오티드 조절 - Google Patents

세포 흡착의 올리고누클레오티드 조절 Download PDF

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데이비드 제이.엑커
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Abstract

본 발명은 세포간 흡착 분자의 합성이나 대사의 조절을 통하여 치료되는 질병의 진단을 위한 조성물 및 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라 세포간 흡착 분자-1, 맥관 세포 흡착 분자-1 및 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1을 암호화하는 핵산과 특이하게 혼성화할 수 있는 올리고누클레오티드를 제공하기 위한 것이다. 상기 올리고누클레오티드는 동정(identify)하기에 충분하고 상기 특이성 혼성화를 효과적으로 할 수 있을 정도의 수로 구성된다. 다른 바람직한 구체예에서는 올리고누클레오티드가 전사개시 부위, 해독개시 부위, 5'- 비해독역, 3'-비해독역 및 삽입서열에 특이하게 혼성화할 수 있다. 또한 상기 단백질 중의 하나에 해당하는 RNA나 DNA와 특이성 있게 혼성화 할 수 있는 올리고누클레오티드로 세포 흡착 분자를 조절함으로써 치료할 수 있는 질병으로 인하여 고통받는 동물의 치료방법도 제공한다. 세포 흡착 분자 조절에 반응하는 질병의 치료방법도 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
세포 흡착의 올리고누클레오티드 조절
[발명의 분야]
본 발명은 세포 흡착 분자의 합성이나 대사조절에 따른 질병의 진단, 검사시료 및 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 백혈구 세포가 다른 백혈구 세포 및 다른 세포형태에 흡착하는 것을 조절하는 단백질의 합성에 관계된 어떤 메신저 리보핵산(mRNAs) 또는 DNA와의 안티센스 올리고누클레오티드에 관한 것이다. 세포간 흡착 분자-1(ICAN-1), 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1(ELAN-1, E-selectin 으로도 알려짐), 및 맥관세포 흡착분자-1(VCAN-1)을 암호화하는 mRNA와 혼성화되도록 조작된 올리고누클레오티드를 제공하는 것이다. 이들 올리고누클레오티드는 RNA의 활성을 조절하므로 특이세포 흡착 분자의 합성 및 대사의 조절을 하는 것으로 알려졌다. 결국 병의 완화 및 치료효과가 된다.
[발명의 배경]
염증은 상처, 간염이나 조직 파괴에 반응해서 조직에 의해 일어나는 국부적인 보호반응으로서 결국 해로운 전염원의 제거와 상처입은 조직을 제거하는 것이다. 전형적인 염증성 반응은 다음과 같이 진행된다. 외부인자로서 항원인식이나 조직 손상의 인식, 수용성의 염증성 매개인자, 감염이나 손상된 조직부위로 염증성 세포의 보급, 파괴 침입 유기물 또는 손상된 조직의 파괴와 제거 및 침입 유기물이나 손상이 해결된 후 계(system)의 불화성화 염증원을 가지는 많은 인간의 질병에서 염증 반응을 완화시키는 정상적인 향상성 메카니즘이 결여되어 있기 때문에 정상조직의 손상이나 파괴를 초래한다.
세포간 상호작용이 상기에 언급된 각 단계의 면역반응의 활성화에 관여한다. 정상적인 염증반응에서의 가장 먼저 발견되는 현상중 하나는 맥관 내피 세포층에 백혈구가 부착하는 것이며, 그 다음 맥관구조(脈管構造)밖으로 백혈구가 간염이나 상처 부위에 이동하게 된다. 맥관 내피 세포층에 이러한 백혈구 또는 백혈구 세포의 부착단계는 맥관구조 밖으로 이동에서 필수적인 단계이다(Harlan, J. M., Blood 1985, 65, 513-525). 일반적으로 염증부위에 처음 나타나는 염증세포는 뉴트로필(neutrophile; pH 6∼8에서 최적 성장을 갖는 유기체). 그 다음 식세포성 백혈구와 림프구이다. 세포간 상호작용 또한 체액 및 세포의 면역반응을 각각 향상시키는 B-림프구와 T-림프구의 증식에 결정적으로 필요하다.
맥관 내피 세포층 및 다른 세포형태로의 백혈구 세포의 부착은 백혈구 세포와 맥관 내피 세포층의 원형질막에 위치하는 흡착분자로 불리우는 특이성 단백질들 간의 상호작용에 의해 조절된다. 흡착분자간의 상호작용은 전형적인 수용체 리간드 상호작용과 유사한데, 리간드가 용해되어 있지 않고 세포의 표면에 고정되어 있다는 점만 다르다. 백혈구 흡착의 유전적 결함을 갖는 단백질을 동정(identification)할 수 있으면 백혈구 세포의 흡착을 담당하는 단백질족(family)을 알 수 있게 된다. 백혈구 흡착 결함(leukocyte adhesion deficiency; LAD)은 반복되는 세균감염 및 손상된 고름 형성과 상처치료로 특징되는 흔하지 않은 상염색체의 특성이다. 상기 결함은 대체로 백혈구 세포의 세포막의 바깥쪽에서 발현되는 Mac-1, LAF-1, 및 p150,95의 세 개의 이형이합체 당단백질(glycoprotein)의 B-소단위에서 생긴 것으로 보여진다(앤더슨 및 스프링거, Ann. Rev. Med. 1987, 38, 175-194). LAD로 인하여 고통받는 환자는 과립구(granulocyte), 단색구(monocyte) 및 림프구의 흡착-의존성 기능의 광범위한 스펙트럼에서 결함을 나타낸다. LAF-1에 대한 세 개의 리간드가 동정되었는데, 세포내 흡착 분자 1,2 및 3(ICAN-1, ICAN-2 및 ICAN-3)이다. Mac-1과 p150,65는 완전한 단편 C3bi 및 아마도 다른 동정되지 않는 리간드에 결합하는 것으로 보인다. Mac-1 또한 ICAM-1에 결합한다.
다른 흡착 분자도 동정되었는데 맥관 내피 세포층에 백혈구 세포의 부착 및 연속하여 맥관구조 밖으로 이탈에 관여한다. 상기의 것에는 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1(ELAM-1), 맥관세포 흡착 분자(VCAM-1) 및 과립 막단백질-140(GMP-140) 및 그것들 각각의 수용체가 있다. 백혈구 세포가 맥관 내피 세포층에 부착하는 것은 ICAM-1, ICAM-2, ELAM-1, VCAM-1 및 GMP-140의 5개의 세포 흡착 분자 전체에 의해서는 아니더라도 일부에 의해 조절되는 것으로 보인다(더스틴 및 스프링거, J. Cell Biol. 1987, 107, 321-331). ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1 및 GMP-140 흡착 분자의 세포표면에서의 발현은 염증 자극에 의해서 유도된다. 반면에 ICAM-2의 발현은 항상성인 것으로 보이며 시토기닌에 의한 유도에 민감하지 않다. 일반적으로 GMP-140은 히스타민, 루코트리엔 B4, 혈소판 활성인자, 및 트롬빈과 같은 오토코이드(autocoid)에 의해 유도된다. 내피 세포층 세포에서의 최적 발현은 자극후 30분 내지 1시간 사이에 관찰되며 2 내지 3시간내에 기준선으로 되돌아온다. 내피 세포층에서의 ELAM-1과 VCAM-1의 발현은 인터루킨-1β 및 종양 괴사(neucrosis) 인자와 같은 시토키닌에 의해 유도되나, 감마-인터페론에 의해 유도되지는 않는다. 내피 세포층 세포의 표면에서의 ELAM-1의 최적 발현은 자극후 4 내지 6시간에서 나타나며 16시간 후 기준선으로 되돌아온다. ELAM-1의 발현은 새로운 mRNA 및 단백질 합성에 의존한다. 종양 괴사 인자로 처리한 후 2시간이 자나서 VCAM-1 발현이 증가되었으며, 자극후 8시간후 최대이고 적어도 48시간 동안 증가된 상태로 유지된다(라이스 및 베빌라쿠아, Science 1989, 246, 1303-1306). 내피 세포층 세포에서의 ICAM-1의 발현은 인터루킨-1, 종양 괴사 인자 및 감마-인터페론과 같은 시토키닌에 의해 유도된다. ICAM-1의 최적 발현은 자극후 8 내지 10시간 후 일어나는 ELAM-1의 최적 발현 후 생기며 적어도 48시간 동안 증가된 상태로 유지된다.
GMP-140과 ELAM-1은 기본적으로 뉴트로필(neutrophile)이 맥관 내피 세포층 세포에 부착하는 것에 관여한다. VCAM-1은 기본적으로 T 및 B 림프구에 결합한다. 더욱이 VCAM-1은 멜라노마(melanoma) 및 가능한한 다른 암의 전이(metastasis)에 관여한다. ICAM-1은 맥관 내피 세포층에 뉴트로필이 부착하는 것 뿐만 아니라 맥관 내피 세포층 조직성 섬유아세포 및 표피의 케라틴 생성세포에 단색구와 림프구가 부착하는 데에 관여한다. ICAM-1은 또한 항원 제공세포의 T-세포인식, 중성의 킬러(killer) 세포에 의한 표적 세포의 용균, 림프구 활성과 증식, 및 흉선에서 T 세포의 성숙등에 작용을 한다. 최근의 연구기록에 의하면 ICAM-1은 보통 감기의 50% 이상 원인이 되는 리노비루스의 주요 혈청형의 세포내 수용체도 된다고 한다(스타운톤 외, cell 1989, 56, 849-853; 그레브 외, cell 1989, 56, 839-847)
ICAM-1의 발현은 알러지성 접촉 피부병, 고정된 약제 부작용, 편평태선(扁平苔蘚; lichen planus), 및 건선(乾癬)과 같은 다양한 피부염증 질환과 관련된다; 호 외, J, Am, Acad, Dermatol. 1990, 22 64-68; 그리피스, 니콜로프 공저, Am, J, Pathology 1989, 135, 1045-1053; 리즈비 외, Br. J. Dermatol. 1989, 125, 1371-1376). 또한 ICAM-1 발현은 류마티스성 관절염 환자의 활막(滑膜)(헤일 외, Arch. Rheum, 1989, 32, 22-30), 당뇨병에서의 췌장 B-세포 (캠프벨 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 4282-4286), 그레이브스병 환자에서 발견되는 갑상선 난포세포(위트만 외, J. Endocrinol, 1989, 122, 185-191) 및 신장과 간의 타가이식 거부반응(파울, 러스공저, Transplantation 1989, 48, 226-230; 아담스 외, Lancet 1989, 1122-1125)에서도 검출된다.
ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1 발현의 억제자가 다양한 염증성질환 또는 천식, 류마티스성 관절염, 타가이식 거부반응, 내장염증, 다양한 피부병적인 증상, 및 건선과 같은 염증성의 병에 대하여 활성을 갖는 항염증성 약제의 새로운 치료법을 제공할 것으로 기대하고 있다. 또한 ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1은 리노비루스때문에 생기는 감기, AIDS, 카포시의 육종증(肉腫症) 및 몇몇 암의 치료와 그것들의 전이(轉移)에 효과적일 수 있다. 현재가지 세포성 흡착 분자인 ELAM-1, VCAM-1 및 ICAM-1의 발현을 효과적으로 저해하는 치료제는 알려진 바 없다. 천식(웨그너 외, Science 1990, 247, 456-459), 신장의 타가이식(코시미 외. J. Immunol. 1990, 144, 4604-4612), 및 심장의 타가이식(이소베 외, Science 1992, 255, 1125-1127)에 대한 치료 효과가 있다는 사실이 동물 모형에서 ICAM-1에 대한 중화된 단클론 항체의 사용에 의해서 알려진다. ICAM-1 분자를 용해된 형태로 사용하면 배양균에서 세포의 리노비루스 감염을 막는데 효과적이다(마르린 외. Neture 1990, 344, 70-72).
세포간 흡착 분자에 영향을 미치는 널리 알려진 시료에는 합성 단백질, 단클론 항체, 흡착 분자의 가용성 형태가 있다. 현재까지 VCAM-1 또는 ELAM-1과의 상호작용을 막는 합성 단백질은 동정되지 않았다. 단클론(monocolonal) 항체는 ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1의 발현으로 인한 급성 염증성 반응을 치료하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 만성적인 병의 치료에 있어서는 동물 숙주는 단클론 항체에 대한 항체를 만들어 내므로 이것에 의해 그것의 유용성은 제한된다. 또한 단클론 항체는 큰 단백질이므로 염증부위에 접근하기 어렵다. 세포 흡착 분자의 가용성 형태는 그것의 생산 손실과 낮은 결합 친화도 뿐만 아니라 단클론 항체와 같은 많은 제한을 받는다. 이와 같이 효과적으로 세포간 흡착 분자를 억제하는 분자에 대한 필요성이 오랫동안 요청되어 왔다. 안티센스 올리고누클레오티드는 ICAM-1, VCMA-1 및 ELAM-1의 효과를 저지하는데 주로 쓰이는 시료의 많은 제한을 피할 수 있다.
PCT/US90/02357(헤션 외)는 ELAM-1을 포함하는 내피 세포층 흡착 분자(ELAMs) 및 VCAM-1과 VCAM-1b를 암호화하는 DNA 서열을 공개하고 있다. 이 DNA 서열은 많은 용도로 제공되는데, (1) 내피 세포층 세포에 결합하는 백혈구를 억제하는 치료제로서 사용될 수 있는 분자에 대해 반응하는 단클론 항체의 제조 합성; (2) ELAM이 백혈구에서 ELAM 리간드에 결합하고 그 다음 이 리간드가 내피 세포층 세포에서 ELAM에 결합하여 백혈구가 내피 세포층에 결합하는 것을 저해하는 ELAM 단백질의 합성; (3) ELAMs (항-ELAM 항체 또는 리간드나 그것의 단편과 같은 마아커(marker))에 결합하여 염증을 검출하는 분자의 용도; (4) 안티센스 올리고누클레오티드로 mRNA를 차단하거나 리보자임으로 절단함으로써 특이 mRNA의 해독을 방해하는 안티센스 올리고누클레오티드 및 리보자임을 이용하여 해독단계에서 ELAM 또는 ELAM 리간드의 발현에 간섭하는 핵산분자를 생산하기 위한 ELAM 및 ELAM 리간드 DNA 서열의 용도가 있다. 암호구역이 선택표적이라는 것도 공개하고 있다. VCMA-1에 대해서는 AUG가 가장 가능성이 있는 것으로 여겨진다. AUG 부위에 혼성화하는 15단위체가 실시예 17에 구체적으로 공개되어 있다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 염증성 세포 흡착 분자의 합성과 발현을 방해함으로써 면역학적 성분, 타가이식, 암 및 전이로 인한 질병, 결장 염증, 건선과 다른 피부병, 감기 및 AIDS에 대한 치료법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포간 흡착 분자를 암호화하는 핵산의 기능을 방해할 수 있는 안티센스 올리고누클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포간 흡착의 기능장애의 진단법도 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 목적은 예시적인 설명을 살펴봄으로써 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 인간의 세포간 흡착 분자-1(ICAM-1)의 mRNA 서열을 나타낸 것이다.
제2도는 인간의 내피 세포층 흡착 분자-1(ELAM-1)의 mRNA 서열을 나타낸 것이다.
제3도는 맥관세포 흡착 분자-1(VCAM-1)의 mRAN 서열을 나타낸 것이다.
제4도는 인터루킨-1 및 종양 괴사 인자에 의한 다양한 인간세포계의 세포표면에서의 ICAM-1 발현유도를 나타낸 도표이다.
제5도는 인간의 중앙 혈관 내피 세포층에서의 ICAM-1 발현에 대한 선택적 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타낸 도표이다.
제6a와 6b는 종양 괴사 인자와 인터루킨-1로 자극된 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포(human umbilical vein endothelial cells)의 ICAM-1의 발현에 대한 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타낸 도표이다.
제7도는 조절하기 위한 DMSO 분화된 HL-60 세포 및 종양 괴사 인자로 처리된 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포의 ICAM-1로 중재된 흡착에 대한 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타낸 도표이다.
제8도는 인간 허파의 A549 악성종양 세포에서 ICAM-1 발현에 대한 선택적 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타낸 도표이다.
제9도는 인간 기초적 케라틴 생성세포에서 ICAM-1 발현에 대한 선택적 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타낸 도표이다.
제10도는 올리고누클레오티드 사슬의 길이, Tm 및 ICAM-1 발현의 저해에 대한 효과 사이의 상관관계를 나타낸 도표이다.
제11도는 조절하기 위한 DMSO 분화된 HL-60 세포 및 종양 괴사 인자로 처리된 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포의 ICAM-1로 중재된 흡착에 대한 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타낸 도표이다.
제12도는 종양 괴사 인자로 처리된 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포에서의 ELAM-1 발현에 대한 선택적 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타낸 도표이다.
제13도는 안티센스 올리고누클레오티드의 표적부위를 보여주는 인간의 ELAM-1 mRNA를 도식적으로 나타낸 도면이다.
제14도는 안티센스 올리고누클레오티드의 표적부위를 보여주는 인간의 VCAM-1 mRNA를 도식적으로 보여주는 도면이다.
제15도는 ICAM-1에 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드로 처리한 후 인간의 C8161 멜라노마 세포에서의 ICAM-1 발현의 저해를 나타내는 선 그래프이다.
제16도는 덱스트린 황산(DSS)-유도 염증성 결장 질병에 대한 ISIS 3082의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
[발명의 요약]
본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 세포간 흡착 분자-1(ICAM-1), 맥관세포 흡착분자-1(VCMA-1) 및 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1(ELAM-1)을 암호화하는 핵산과 특이성있게 혼성화할 수 있도록 제공된다. 상기 올리고누클레오티드는 직접 mRNA에 결합하거나 삼중가닥 구조를 형성하는 선택된 DNA 부분에 결합하도록 조작되어 유전자로부터 만들어지는 mRNA의 양을 조절한다.
상기의 관계를 보통 안티센스라 부른다. 상기 올리고누클레오티드는 단백질로의 해독, 세포질로의 이동 또는 전체 생물학적 기능에 필수적인 어떤 다른 활성중 어느 하나의 RNA 또는 DNA의 기능을 저해한다. RNA나 DNA의 전부 또는 일부 수행기능의 상실은 올바로 발현되어 상기의 대사를 조절하는 세포 흡착 분자를 조절하는 게놈 일부분의 기능상실이 되는 것이다.
안티센스 공격에 특이성 있는 유전자를 표적하는 것은 바람직하다. ICAM-1, VCMA-1 및 ELAM-1을 암호화하는 유전자가 이러한 접근법에 유용하다는 것은 알려져 있다. ICAM-1, VCMA-1 및 ELAM-1 발현 억제는 염증성 질환, 염증성분으로 인한 질병, 타가이식 거부반응, 건선과 다른 피부질환, 염증성 결장질환, 암과 그것의 전이, 및 비루스의 감염의 치료에 유용할 것으로 기대된다. 세포 흡착을 조절할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산과 혼성화 가능한 올리고누클레오티드로 동물을 접촉시키는 것으로 구성되는 세포 흡착을 조절하는 방법이 제공된다. ICAM-1, VCMA-1 및 ELAM-1을 암호화하는 RNA 또는 DNA와 혼성화 가능한 올리고누클레오티드가 바람직하다. 진단방법 또한 본 발명의 일부가 된다.
[바람직한 구체예에 대한 상세한 설명]
안티센스 올리고누클레오티드는 인간의 많은 질병의 치료제로서 큰 기대가 되고 있다. 올리고누클레오티드는 특이성 있게 mRNA 전구체나 성숙된 mRNA 중 하나의 상보적 서열에 왓슨-크읏 염기쌍에 의해 결합하여 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해한다. 표적 서열에 특이하게 만들어지는 안티센스 올리고누클레오티드의 특성은 또한 이것 자체를 이외로 가변적이 되도록 해준다. 안티센스 올리고누클레오티드는 네 개의 단위체 구조의 긴사슬이미로 어떤 표적 RNA 서열에 대해서도 쉽게 합성이 될 수 있다. 표적 단백질의 연구에 대한 생화학적 수단으로서 안티센스 올리고누클레오티드가 유용하다는 연구가 최근에 많이 발표되고 있다(로텐버그 외. J. Natl. Cencer Inst. 1989, 81, 1539-1544; 존, G. Pharmaceutical Res. 1988, 5, 539-549). 증가된 세포 흡착을 나타내는 뉴클레아제 내성 올리고누클레오티드의 합성기술이 최근에 진보되었기 때문에 안티센스 올리고누클레오티드의 사용은 새로운 치료법의 한 형태로 여겨질 수 있다.
안티센스 올리고누클레오티드는 종전 기술의 문제점에 대한 이상적 해결책을 제공한다. 이 올리고노클레오티드는 동위효소를 선택적으로 방해하도록 조작될 수 있으며, 상기 효소의 생산을 저해하고, 유리 라디칼 제거 또는 다중 수용체에 결합과 같은 비-특이성 메카니즘을 피할 수 있다. 특이성 억제자를 고안하기 위해서 효소 메카니즘이나 수용체-리간드 상호작용에 대한 완전한 이해가 될 필요는 없다.
[표적 서열에 대한 설명]
염증부위로의 뉴트로필의 급성 침투는 내피 세포층 세포 표면에 GMP-140, ELAM-1 및 ICAM-1의 발현이 증가되었기 때문인 것으로 보인다. 염증반응의 후기단계 동안에 림프구 및 단색구가 나타나는 것은 VCAM-1 및 ICAM-1에 의해 조절되는 것으로 여겨진다. ELAM-1 및 GMP-140이 맥관 내피 세포층 세포에 잠시동안 발현되는 반면 VCMA-1 및 ICAM-1은 만성적으로 발현된다.
인간의 ICAM-1은 55,219 달톤의 단백질 합성이 되는 3.3kb mRANdp 의해 암호화된다(제1도). ICAM-1은 N-연결 글라이코실화된 부위에서 글라이코실화된다. 상기 성숙된 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같이 90kDa의 분자량을 갖는다(스타운톤 외, cell 1988, 52, 925-933). ICAM-1은 면역글로블린 초유전자족(famliy)에 속하고 아미노말단에 5 면역글로블린-유사 도메인을 포함하며 이 도메인 뒤에 막통과(transmembrane) 도메인과 세포질 도메인이 있다. LFA-1 및 리노비루스에 대한 1차적인 결합부위는 첫 번째 면역글로블린-유사 도메인에서 발견된다. 그러나 상기 결합부위는 독특한 것으로 보인다(스타운톤 외, cell 1990, 61, 243-354). 최근 전자 현미경에 의한 연구로 인하여 ICAM-1은 18.7㎚의 길이와 2 내지 3㎚의 반경을 가진 굽은 간상체라는 것이 밝혀졌다. ICAM-1은 광범위한 조직과 세포 분포를 나타내며 백혈구 세포, 내피 세포층 세포, 섬유아세포, 케라틴 생성세포 및 다른 내피 세포층 세포에서 발견될 수도 있다. ICAM-1의 발현은 맥관 내피 세포층 세포, 섬유아세포, 케라틴 생성세포, 성상세포(astrocyte) 및 몇몇 세포계에서 세균성 리포다당 및 인터루킨-1, 종양 괴사 인자, 감마-인터페론, 및 림포톡신(lymphotoxin)과 같은 시토키닌으로 처리하여 조절할 수 있다(프로만 외. J. Neuroimmunol. 1989, 23, 117-124). 시토키닌 처리에 따른 ICAM-1 발현증가의 분자 메카니즘은 아직 결정되지 않았다.
ELAM-1은 115KDa의 막 당단백질(glycoprotein)(제2도)이며, 막 당단백질의 셀레틴족(selection famliy)의 일종이다(베빌라쿠아 외. Science 1989, 243, 1160-1165). ELAM-1의 아미노 말단부위는 렉틴-유사 단백질의 일종과 상동성을 지니는 서열을 포함하며, 이 부위 다음에는 표피 성장인장에 유사한 도메인, 완전 수용체에 1과 2에서 발견되는 것과 유사한 6개의 나란히 배열된 60-아미노산 반복단위가 있다. 이러한 특징은 또한 GMP-140 및 MEL-14 항원, 즉 림프구 회귀 항원에서도 나타난다. ELAM-1은 3.9kb mRANdp 의해 암호화된다. ELAM-1, mRNA의 3'-비해독역은 몇 개의 서열 요소인 ATITA를 포함하는데 이는 ELAM-1 발현이 일시적인 특성을 나타내는 것과 일치하는 세포성 mRNA의 빠른 회전(turnover)의 원인이 된다.
ELAM-1은 맥관 내피 세포층 세포에서만 동정된다는 점에서 제한된 세포분포를 나타낸다. ICAM-1과 같이 ELAM-1은 종양 괴사 인자, 인터루킨-1 및 림포특신과 같은 많은 시토키닌 및 세균성 리포다당에 의해서 유도 가능하다. ICAM-1과는 반대로 ELAM-1은 감마-인터페론에 의해 유도되지 않는다(베빌라쿠아 외. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 9238-9242; 월리콤 외. J. Immunol. 1990, 144, 2558-2565). 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포에서의 ELAM-1 mRNA 유도 및 소멸은 세포표면에서의 출현과 소멸보다 선행한다. ICAM-1에서와 같이 ELAM-1에 대한 분자적 메카니즘은 알려지지 않았다.
VCAM-1은 3.2kb mRNA에 의해 암호화되는 막 당단백질이다(제3도). VCAM-1은 선택적인 접속(splicing)을 거쳐 6개 또는 7개의 면역글로블린 도메인을 가지는 산물을 만들어 낼 수 있는 단일사본 유전자에 의해 암호화되는 것으로 보인다(오스본 외, Cell 1989, 59, 1203-1211). CD29에 대한 단클론 항체가 VCAM-1에 라모스(Ramos) 세포의 흡착을 막는 것으로 보아 VCAM-1에 대한 수용체가 CD29인 것으로 제안된다. VCAM-1은 1차적으로 맥관 내피 세포층 세포에서 발현된다. ICAM-1 및 ELAM-1과 같이 맥관 내피 세포층 세포에서 발현된다. ICAM-1 및 ELAM-1과 같이 맥관 내피 세포층에서의 VCAM-1의 발현은 시토키닌 처리에 의해 조절된다(라이스 및 베빌라쿠아, Science 1989, 246, 1303-1306; 라이스 외, J. Exp. Med. 1990, 171, 1369-1374). 발현이 증가하는 것은 mRNA의 유도에 기인하는 것 같다. ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1의 발현을 감소시킴으로써 치료될 수 있는 질병을 가진 것으로 짐작되는 동물이 본 발명에 따른 올리고누클레오티드를 투여함으로써 치료된다. 올리고누클레오티드는 약제학적 조성물의 형태로 될 수 있으며. 이것은 올리고누클레오티드외에 담체, 침전 농축재료, 희석제, 완충제, 보존제, 표면활성제, 리포좀 또는 지질 형성제 등등을 함유할 수 있다. 또한 약제 조성물은 올리고누클레오티드외에 항균제, 항-염증제, 마취제등과 같은 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 포함할 수도 있다.
약제 조성물은 국소적인 치료가 필요한가 또는 전신의 치료가 필요한가에 따라 그리고 치료되어야 할 부위의 면적에 따라 많은 방법으로 투여될 수 있다. 투여방법은 원칙적으로(눈, 협막(莢膜), 직장(直腸), 코 안으로 투여방법을 포함하여), 구강으로, 흡입하여 또는 장관외(腸管外)로, 예를 들어 정맥내로 적하, 피하, 복막 또는 근육내 주사에 의할 수 있다.
원칙적인 투여방법의 형태는 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약(點適藥), 좌약, 분무액, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유질의 주약(主藥), 침전 농축재료 등이 바람직하며 필요한 성분이다. 피복된 콘돔이나 글러브 또한 유용할 수 있다.
장관의 투여조성물은 분말이나 과립, 현탁액이나 수용액 또는 비-수성 용제 용액, 캡술, 향낭 또는 정제를 포함할 수 있다.
장관의 투여형태는 완충액, 리포좀, 희석제 및 다른 적당한 첨가제를 포함할 수도 있는 무균의 수용액을 함유할 수 있다.
복용량은 치료되어야 할 조건의 긴급함이나 민감성에 따라 달라질 수 있으나 몇일에서 몇 달까지 또는 치료효과가 나타날 때까지 또는 질병이 차도가 있을 때까지 하루에 한번 또는 그 이상 지속적으로 하는 것이 바람직할 것이다. 평균적인 사람이라면 쉽게 최적 복용량, 복용방법, 복용회수를 정할 수 있다.
본 발명은 염증세포 흡착을 조절할 수 있는 단백질에 해당하는 RNA 및 DNA의 안티센스 저해로 사용되기 위한 올리고누클레오티드를 이용한다. 본 발명의 명세서에서 올리고누클레오티드라는 말은 리보핵산 또는 디옥시리보핵산의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 상기 단어는 천연 상태에서 존재하는 염기, 당 및 당간(주색) 연결로 구성되는 올리고머 뿐만 아니라 유사하게 작용하는 비천연적인 부분을 가진 올리고머도 포함한다. 그러한 변형 또는 치환 올리고누클레오티드는 증가된 세포 흡착 및 누클레아제 존재하에서 안정성의 증가와 같은 특성 때문에 천연의 형태 보다 종종 더 바람직한 것으로 나타난다.
본 발명에 따른 몇몇 바람직한 올리고누클레오티드의 특별한 예로는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 짧은 사슬알킬이나 시클로알킬 당간 결합 또는 짧은 사슬 헤테로원자나 헤테로고리 당간 결합을 포함할 수 있다. CH2-NH-O-CH, CH2-N(CH3)-O-CH2, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2및 O-N(CH3)-CH2-CH2주쇄(여기에서 인산이에스테르는 O-P-O-CH2이다)를 가진 결합이 가장 바람직하다. 또한 모르폴리노(morpholino) 골격구조를 갖는 올리고누클레오티드도 바람직하다(수머론과 웰러, 미합중국 특허 제 5,034,506호). 단백질-핵산(PNA) 골격과 같은 다른 바람직한 구체예에서는 올리고누클레오티드의 인산이에스테르 결합이 폴리아미드 결합으로 대치되었고, 염기는 폴리아미드 골격의 아자 질소원자에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있다(닐슨, 에그홀름, 버그, 부카르트 공저, Science. 1991, 254, 1497). 다른 바람직한 올리고누클레오티드는 2' 위치에 하기에 열거된 것 중의 하나를 포함하는 알킬 및 할로겐-치환 당성분을 함유할 수 있다; OH, SH, SCH3, F, OCN, O(CH2)nNH2또는 O(CH2)nNH3(여기에서 n은 1에서 약 10까지이다); C1내지 C10저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카킬 또는 아랄킬; C1; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단기(基); 접합체(conjugate); 수용체 그룹; 삽입기; 올리고누클레오티드의 약물역학적 특성을 향상시키는 기(基); 또는 올리고누클레오티드의 약물활성을 증가시키는 기 및 유사한 특성을 갖는 치환체, 올리고누클레오티드는 펜토푸라노실기 대신에 시클로부틸과 같은 당 성분을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 약 3 내지 50의 핵산 염기 단위를 바람직하게 포함할 수 있다. 약 8 내지 25의 핵산 염기 단위로 구성된 올리고누클레오티드가 더 바람직하며 약 12 내지 22 핵산 염기 단위를 가지는 것이 더욱 더 바람직하다. 알려진 바와 같이 핵산 염기 단위는 인산이에스테르 또는 다른 결합을 통하여 인접 핵산염기와 적당히 결합되는 염기-당 조합이다.
본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 종래의 공지된 기술인 고체상(solid phase) 합성법을 통하여 만들어진다. 상기 합성에 대한 장치는 Applied Biosystems와 같은 회사에 의해 판매된다. 그러한 합성에는 어떤 다른 수단도 이용가능하나 올리고누클레오티드의 실질적인 합성은 평균적인 기술을 가진 사람이라면 실시할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 다른 올리고누클레오티드를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것도 잘 알려져 있다.
본 발명이 따른 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 전사되는 DNA의 오픈 해독 프레임(ORFs)에 의해 동정되는 메신저 RNA는 DNA의 ORFs로부터 정보뿐만이 아니라 5'-비해독역, 3'-비해독역 및 삽입(intervening) 서열 리보누클레오티드로 알려진 구역을 형성하는 리보누클레오티드를 포함하는 사실을 알 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 정보 리보누클레오티드 뿐만 아니라 이러한 결합된 리보누클레오티드에 전부 또는 일부가 표적되도록 만들어져야 한다. 바람직한 구체예에서 올리고누클레오티드는 전사 개시부위, 해독 개시부위, 삽입 서열, 3'-비해독역 서열과 특이하게 혼성화할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 다른 백혈구 세포 또는 다른 세포 형태 중 하나에 백혈구 세포가 흡착하는 것에 관여하는 단백질을 암호화하는 핵산 부분과 특이하게 혼성화할 수 있다. 바람직한 구체예에서 상기 단백질은 세포간 흡착 분자-1, 맥관 세포 흡착분자-1 및 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1이다. 상응하는 서열 또는 그의 일부로 구성되는 올리고누클레오티드는 본 발명에 유용하다. 예를 들어 제1도는 인간의 세포간 흡착 분자-1 mRNA 서열을 나타낸 것이다. 전부 또는 일부로서 유용한 바람직한 서열 단편은 하기와 같다.
제2도는 인간의 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1의 mRNA 서열이다. 전부 또는 일부로서 유용한 바람직한 서열 단편은 하기와 같다.
제3도는 인간의 맥관 세포 흡착 분자-1의 mRNA 서열이다. 전부 또는 일부로서 유용한 바람직한 서열 단편은 하기와 같다.
상기 예시된 서열은 정확한 것으로 여겨지지만 본 발명은 오류가 발견되면 교정되어야 한다. 본 발명에 유용한 올리고누클레오티드는 이들 서열 중 하나 또는 그것의 일부로 구성된다. 따라서 상기 설명된 것과 같은 올리고누클레오티드 또는 이 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 염증세포 흡착 분자의 합성 조절을 위한 바람직한 안티센스 표적에 대한 지식으로 제조할 수 있는 유사한 올리고누클레오티드를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 몇몇 바람직한 구체예는 하기의 비제한적인 실시예에 따라 예시된다. 조절을 위한 표적 nRNA의 종류는 세포간 흡착 분자-1, 내피세포층 백혈구 흡착 분자-1 및 맥관 세포 흡착 분자-1에 관련된다. 이 분양의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명이 제한적이지 않고 일반적으로 적용될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. ICAM-1 및/또는 ECAM-1 및/또는 VCAM-1 합성의 억제 또는 조절은 병의 치료에 있어서 중요한 치료 효과를 가진다고 기대할 수 있다. 상기 조성의 효과를 평가하기 위해 어느 한 분석 또는 일련의 분석이 필요하다.
[실시예]
[실시예 1]
세포 표면에서의 ICAM-1, VCMA-1 및 ELAM-1의 발현은 ELISA에서 특이 단클론 항체를 이용하여 정량할 수 있다. 세포를 96 웰 마이크로타이터 평판(well microtiter plate)에 전면배양시킨다. 세포는 ELAM-1을 정량하기 위해서 4 내지 8시간 동안, 그리고 ICAM-1 및 VCAM-1을 정량하기 위해서 8 내지 24시간 동안 인터루이킨-1 또는 종양 괴사 인자중 하나로 자극되었다. 시토키닌으로 정당히 배양한 후에 Dulbecco의 인산 염으로 완충된 염수(D-PBS)과 같이 칼슘과 마그네슘을 함유한 등장의 완충액으로 세포를 세 번 서서히 세척한다. 그 다음 상기 세포는 25℃에서 20분 동안 D-PBS로 희석시킨 1∼2% 파라포름알데히로 마이크로타이터 평판에 직접 고착시킨다. 상기 세포는 D-PBS로 다시 세 번 세척한다. 마이크로타이터 평판에서의 비특이성 결합부위는 37℃에서 1시간동안 D-PBS에서 2% 소의 혈청 알부민으로 차단한다. 37℃에서 1시간동안 차단용액으로 희석된 적당한 단클론 항체로 세포를 배양시킨다. 결합되지 않은 항체는 D-PBS로 세 번 세포를 세척함으로써 제거된다. 세포에 결합된 항체는 37℃에서 1시간동안 차단용액에서 비오틴화된 염소의 항-쥐 IgG(Bethesda 연구소, Gaitherberg, MD)의 1:1000 희석율로 배양함으로써 검출되었다. 세포는 D-PBS로 세 번 세척한 후 37℃에서 1시간동안 β-갈락토시다제에 복합된 스트렙트라비틴(Bethesda 연구소)을 1:1000으로 희석하여 배양하였다. 세포를 각각 5분동안 3번 세척하였다. 특이 단클론 항체에 결합된 β-D-갈락토피란노시드, 50mM 인산나트륨 1.5mM MgCl2(pH=7.2)의 용액에서 2 내지 15분동안 37℃에서 전개시킴으로써 결정할 수 있다. 산물의 농도는 ELISA 마이크로타이터 평판 판독기에서 575㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 결정할 수 있다.
몇몇 인간세포계에서 인터루킨-1β 또는 종양 괴사 인자로 자극한 후 관찰되는 ICAM-1 유도의 예는 제4도에서 보여주고 있다. 15시간 동안 인터루킨-1 또는 종양 괴사 인자의 농도를 증가시켜 세포를 자극한 후 상기 언급된 바와 같이 진행하였다. ICAM-1 발현은 단클론 항체 84H10(Amac Inc. Westbrook, Me)을 1:1000 비율로 희석하여 배양시킴으로써 결정하였다. 상기 사용된 세포계는 인간의 종양 혈관 내피 세포층 세포(HUVEC), 인간의 표피 악성종양 세포계(A431), 인간의 멜라노마가 세포계(SK-MEL-2) 및 인간의 폐 악성종양 세포계(A549)의 4개가 될 수 있다. ICAM-1은 모든 세포계에서 유도되었으나, 종양 괴사 인자가 인터루킨-1보다 세포 표면에서의 ICAM-1 발현 유도에서 더 효과적이었다(제4도).
ICAM-1, VCAM-1 또는 ELAM-1 발현의 저해를 위한 안티센스 올리고누클레오티드의 검출은 시토키닌 처리전에 올리고누클레오티드로 세포를 전처리하는 것 외에는 상기의 언급된 바와 같이 행한다. ICAM-1의 안티센스 올리고누클레오티드 저해의 예는 제5도에 나타나있다. 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포(HUVEC)는 8㎛ 염화 N-[1(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(DOTMA)를 포함하는 Opti MEM(GIBCO, Grand Island, NY)에서 희석된 올리고누클레오티드의 농도를 증가시켜 4시간동안 37℃애서 처리하여 올리고누클레오티드의 포착을 증진시켰다.
상기 배지는 제거되고 4시간동안 필요한 농도의 올리고누클레오티드를 함유하는 내피 세포층 성장배지(EGM-UV; Clonetics, San Diego, CA)로 교체하였다. 인터루킨-1β를 5단위/㎖의 농도로 세포에 첨가하였고 37℃에서 14시간동안 배양하였다. 상기 세포는 상기 언급된 바와 같이 단클론 항체 84H10을 1:1000 비율로 희석시켜 사용하여 ICAM-1 발현을 정량하였다. 사용된 올리고누클레오티드는 하기와 같다;
화합물 1 - (ISIS 1558) 하기 서열을 갖는 AUG 해독 개시를 코돈을 포함하는 mRNA의 64-80위치와 혼성화하도록 조작된 인산이에스테르 올리고누클레오티드
5'-TGGGAGCCATAGCGAGG-3; (서열 ID 번호 : 1)
화합물 2 - (ISIS 1570)
화합물 1과 동일한 서열에 해당하는 포스포로티오에이트 함유 올리고누클레오티드
화합물 3 - 하기 서열로 표시되는 화합물 1과 화합물 2에 상보적인 포스포로티오에이트 함유 올리고누클레오티드
5'-GCCTCGTATAGCGAGG-3; (서열 ID 번호 : 81)
화합물 4 - (ISIS 1572)
하기 서열을 갖는 3' 비해독역에 위치한 mRNA의 2190-2210과 혼성화할 수 있도록 조작된 포스포로티오에이트 함유 올리고누클레오티드
5'-GACACTCAATAAATAGCTGGT-3'; (서열 ID 번호 : 3)
화합물 5 - (ISIS 1821) 하기 서열로 포함하는 대조부로서 사용되는 인간의 5-리폭시게나제 mRANDP 혼성화할 수 있도록 조작된 포스포로티오에이트 함유 올리고누클레오티드
5'-CATGGCGCGGGCCGCGGG-3'; (서열 ID 번호 : 82)
인간의 ICAM-1 mRNA의 AUG 개시 해독역을 표적으로 하는 인산이에스테르 올리고누클레오티드(화합물 1)는 ICAM-1의 발현을 방해하지 않았으나 대응하는 포스포로티오에이트 함유 올리고누클레오티드(화합물 2)는 0.1㎛ 농도에서 70% 그리고 1㎛농도에서 90%(제4도)로 ICAM-1 발현을 저해하였다. 인산이에스테르보다 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 우수한 효능은 안정성의 증가에 기인한다. 화합물 2, 화합물 3에 대한 암호 가닥은 10㎛에서 ICAM-1의 발현을 약간 저해하였다. 화합물 2가 세포에 첨가되기 전에 화합물 3에 미리 혼성화되었다면 ICAM-1 발현에 대한 화합물 2의 효과는 악화되었는데, 이는 화합물 2의 활성이 안티센스 올리고누클레오티드 효과에 기인하고 있으며 M굼에 혼성화되는 것을 필요로한다는 것을 제시해준다. 3' 비해독 서열(화합물 4)에 대하여 유도된 안티센스 올리고누클레오티드는 1㎛농도에서 ICAM-1 발현을 62% 저해하였다(제5도). 인간의 5-리폭시게나제를 표적하는 대조부 올리고누클레오티드(화합물 5)는 ICAM-1 발현을 20%만큼 감소시켰다. 이들 기록은 올리고누클레오티드가 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포에서의 ICAM-1 발현을 저해할 수 있다는 것을 나타내주며, ICAM-1 발현의 저해는 안티센스 활성에 기안한다는 것을 제시한다.
1㎛의 농도에서 화합물 2의 안티센스 올리고누클레오티드는 종양 괴사 인자 및 인터루킨-1의 농도증가로 자극된 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포에서의 ICAM-1 발현을 저해한다(제6도).
이들 기록은 화합물 2의 효과가 세포의 인터루킨-1 자극에 대해 특이하지 않다는 것을 나타내준다.
유사한 분석이 또한 안티센스 올리고누클레오티드에 의한 ELAM-1 및 VCAM-1의 발현 저해를 나타내는 데 사용될 수 있다.
[실시예 2]
ICAM-1, VCAM -1 또는 ELAM-1의 발현에 대한 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 나타내기 위해 사용되는 2차 세포 분석은 세포 흡착 분석이다. 올리고누클레오티드로 처리한 다음 시토키닌으로 처리된 표적세포를 멀티웰(multwell) 평판에서 단일층으로 성장시킨다, 그 다음 흡착 세포가 단일층 세포에 첨가되고 37℃에서 60분간 동안 배양된 후 흡착되지 않은 세포를 제거하기 위해 세척한다. 단일층에 흡착하는 세포는 흡착세포를 직접 계수하든가 또는51Cr과 같은 방사성 동위원소로 세포를 미리 표식(label)하고 기재된 바와 같이 단일층과 결합된 방사능을 정량하든가 하여 결정할 수 있다(더스턴과 스프링커 J. Cell Biol. 1998, 107, 321-331); 상기 분석에서 안티센스 올리고누클레오티드는 ICAM-1, VCAM-1 또는 ELAM-1 중 어느 하나를 표적할 수 있다.
종양 괴사 인자로 처리된 인간의 종앙 혈관 내피 세포층 세포에 DMSO 분화된 HL-60 세포의 흡착에서 ICAM-1 mRNA를 표적하는 안티센스 올리고누클레오티드의 효과는 제7도에 보여지고 있다. 인간의 중앙 내피 세포층 세포는 12 웰 평판에서 80% 전면 배양하였다. 8㎛ DOTMA를 함유하는 Opti-MEM에서 희석된 2㎛ 올리고누클레오티드로 37℃에서 4시간동안 세포를 처리하였다. 배지를 제거하였고 앞서 언급된 올리고누클레오티드 2㎛을 함유하는 새로운 내피 세포층 세포 성장배지로 교체한 후 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 종양 괴사 인자, 1㎎/㎖를 세포에 첨가하였으며 19시간 동안 더 세포 배양하였다. 상기 세포는 EMG-UV로 한번 세척하였으며 1.3% DMSO로 4일간 분화된 1.6×106의 HL-60 세포를 첨가하였다. 세포는 37℃에서 1시간동안 부착하도록 하였으며 37℃로 가온된 Dulbeco의 인산-완충된 염수(D-PBS)로 4번 부드럽게 세척하였다. 흡착된 세포를 5mM EDTA를 함유하는 차가운 (4℃) 인산-완충된 염수 0.25㎖를 첨가하여 단일층으로부터 분리한 후 5분동안 얼음에서 배양시킨다. EDTA로 처리하여 분리된 세포수는 혈구계산기(hemocytomer)로 계수하여 결정하였다. EDTA로 처리하여 단일층에서 분리된 내피 세포층 세포는 형태차이로 인하여 HL-60 세포와 쉽게 구분할 수 있었다.
종양 괴사 인자가 없으면 HL-60 세포의 3%가 내피 세포층 세포에 결합하였다. 내피 세포층 세포 단일층을 1ng/㎖ 종양 괴사 인자로 처리하면 흡착 세포의 수가 첨가된 전체 세포의 59%까지 증가하였다(제7도). 안티센스 올리고누클레오티드 화합물 2나 대조부 올리고누클레오티드 화합물 5로 처리하여도 종양 괴사 인자의 결여시에는 단일층에 흡착되는 세포의 수는 변함이 없었다(제7도). 안티센스 올리고누클레오티드 화합물 2는 첨가된 전체세포 59%에서 첨가된 전체세포 17%까지 흡착세포의 수를 감소시켰다(제7도). 반면에 대조부 올리고누클레오티드 화합물 5는 종양 괴사 인자로 처리된 내피 세포층 단일층에 부착된 세포의 수를 현저히 감소시키지는 않았는데, 즉 화합물 5로 처리된 세포에 대해 첨가된 전체 세포의 53%였고 대조부 세포에 대해서는 59%이었다.
이들 기록은 안티센스 올리고누클레오티드가 내피 세포층 세포에서의 ICAM-1 발현을 저해할 수 있고 ICAM-1 발현 저해는 서열 특이성 방법으로 내피 세포층 단일층에 뉴트로필-유사 세포의 흡착에 있어서의 감소와 상관관계가 있다는 것을 나타내었다. 다른 분자도 ELAM-1 및 VCAM-1과 같이 내피 세포에 백혈구 세포가 흡착하는 것을 조절할 수 있으므로 흡착이 완전히 차단된다고는 기대되지 않는다.
[실시예 3]
올리고누클레오티드의 합성과 특성
요오드에 의한 산화로 표준 포스포르아마다이트(phosphoramidite) 화학작용을 이용하여 자동 DNA 합성기(Applied Biosystems model 380B)에서 변형되지 않은 DNA 올리고누클레오티드를 합성하였다. β-시아노에틸디이소프로필-포스포르아미다이트는 Applied Biosystems(Foster city, CA)에서 구입할 수 있다. 포스포로티오에이트 Applied Biosystems 제조를 위해 표준 산화 용기는 아인산염 연결의 단계적인 황화(thiation)를 위하여 아세토니트릴에서 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드 0.2M 용액으로 대치하였다. 황화 회로의 대기 단계(wait step)는 68초까지 길어지며, 캡핑단계(capping step)가 뒤따른다.
2'-O-메틸 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드는 2'-O-메틸 β-시아노에틸디이소프로필-포스포르아미다이트(Chemgenss, Needham, MA) 및 테트라졸과 염기의 펄스 방출후 대기 단계가 360초까지 길어지는 것을 제외한, 변형되지 않은 올리고누클레오티드에 대한 표준 회로를 이용하여 합성하였다. 합성을 개시하기 위해 사용되는 3'-염기는 2'-디옥시리보누클레오티드이다.
2'-플루오트 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드는 5'-디메톡시트리틸-3'-포스포로아미다이트를 이용하여 합성하였고 미합중국 특허출원 제 463,358호(1990.1.11 출원) 및 제 566,977호(1990.8.13. 출원)에 개시된 바와 같이 제조하였으며, 상기 특허출원은 본 출원과 같은 양수인에게 양도되었고, 본 명세서에 참고로 설명하였다. 2'-플루오로 올리고누클레오티드는 포스포르아미다이트 화학작용 및 표준 DNA 합성법을 약간 변형 이용하여 제조하였다; 실온에서 메탄올릭 암모니아를 이용한 탈보호가 효과적이었다.
제어된 소공 유리 컬럼(Applied Biosystems)으로부터 분리 및 농축된 수산화 암모늄에서 18시간 동안 55℃에서 탈블록킹(deblocking) 후에 올리고누클레오티드는 2.5부피 에탄올로 0.5 M NaCl로부터 2번 침전시켜 정제하였다. 겔 전기영동 분석은 20% 아크릴아미드, 8M 우레아, 45mM 트리스-봉산염 완충액(pH 7.0)에서 행하였다. 올리고디옥시누클레오티드 및 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드는 전기영동으로 판단하건대 충분히 편 재료(full length material)의 80% 이상이었다.
RNA 올리고누클레오티드 합성은 ABI 모델 380B DNA 합성기로 행하였다. 표준 합성회로는 테트라졸의 펄스 방출후 대기 단계를 900초까지 길게하여 변형시켰다. 염기는 하루동안 메탄올릭 암모니아에서 배양시킴으로써 탈보호시켰다. 염기 탈보호에 이어 올리고누클레오티드는 진공상태에서 건조시켰다. t-부틸디메틸실릴 보호된 2' 히드록 실은 하루동안 테트라히드로푸란내에 1M의 테트라부틸 암모늄플루오라이드에서 올리고누클레오티드를 배양시킴으로써 제거하였다. C18Sep-Park 카트리지(Waters, Division of Millipore Corp., Milford MA) 및 침전된 에탄올에서 RNA 누클레오티드를 더 정제하였다.
합성에서 얻어진 포스포로티오에이트 및 인산이에스테르 결합의 상대적인 양은31P NMR 분광기로 주기적으로 기록하였다. 산화중수소 또는 디메틸 설폭사이드-d6를 용매로 사용하여 실온에서 스펙트럼을 얻었다. 포스포로티오에이트 시료는 전형적으로 인산이에스테르의 1% 이하를 함유한다.
50mM 아세토산 트리에틸암모늄(pH 7.0 30분내에 4% 내지 32%, 유속=1.5㎖/min)에서 아세토니트릴 성분을 사용하여 PRP-1 칼럼(Hamilton Co., Reno. Nevada)에서 트리틸-온 HPLC로 정제된 올리고누클레오티드로 2차적인 평가를 행하였다. 상기 용액은 동일용량의 에틸 아세트산으로 추출하였고 수산화암모늄으로 중화시킨 후 동결시키고 얼림 건조시켰다. HPLC-정제된 올리고누클레오티드는 ICAM-1 발현에 대한 ELISA로 판단된 바와 같이 침전된 올리고누클레오티드와 효능면에서 크게 차이가 나지 않았다.
[실시예 4]
세포배양 및 올리고누클레오티드 처리
인간의 폐 악성종양 세포계 A549는 미국형 배양 수집기(Bethesda)에서 얻어졌다. 세포는 1g/t 글리코오스 및 10% 송아지 태아 혈청(Irvine Scientific Irvine CA)을 함유하는 Dulbecco의 변형된 이글즈(Eagle's)(Irvine Scientific)에서 성장시켰다. 인간의 중앙 혈관 내피 세포층 세포(HUVEC)(Clonetics, San Diego CA)는 EGM-UV 배지(Clonetics)에서 배양하였다. HUVEC는 일곱 번째와 여섯 번째 계대배양(passage)사이에서 사용하였다. 인간의 표피 악성종양 A431 세포는 미국형 배양 수집기로 얻어졌으며 4.5g/t 글루코오스를 함유한 DMEM에서 배양하였다. 인간의 1차 케라틴 생성세포가 클로네틱스(Clonetics)에서 얻어졌으며 KGM(케라틴 생성폐포 성장 배지, Clonetics)에서 배양시켰다.
96-웰 평판에서 자란 세포는 37℃로 미리 가온한 Opti-MEM(GiBCO, Grand Island, NY)로 세 번 세척하였다. HUVEC Cell인 경우 10㎍/㎖ 염화 N-[1(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(DOTMA, Bethesada 연구소, Bethsda MD), A549 세포인 경우에는 20㎍/㎖ DOTMA를 함유하는 100㎕의 Opti-MEM을 각 웰에 첨가하였다. 올리고누클레오티드들을 0.2㎛ 센트렉스(Centrex) 아세트산 셀룰로오스 여과기(Schleicher and Schuell, Keene, NH)를 통하여 원심분리하여 살균시켰다. 올리고누클레오티드를 20배의 저장용액(stock solution)으로서 웰에 첨가하였고 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 적정 농도의 올리고누클레오티드를 함유하는 적당한 성장 배지 150μt로 대치하였다. 세폰은 3 내지 4시간동안 37℃에서 더 배양하고 14 내지 16시간동안 적절한 시토키닌으로 자극시켰다. ICAM 발현은 실시예 1에서 설명한 바와 같이 결정하였다. 올리고누클레오티드로 배양한 처음 4시간 동안 DOTMA가 있으면 올리고누클레오티드의 효능이 약 100배 증가하였다. 이러한 효능의 증가는 올리고누클레오티드의 세포포착에서의 증가와 상관관계에 있다.
[실시예 5]
인터루킨-1β-자극 세포에서 ICAM-1 발현에 반하여 활성을 갖는 부가적인 안티센스 올리고누클레오티드 ELISA 검출
안티센스 올리고누클레오티드는 처음부터 인간의 ICAM-1 mRNA에서의 5개의 표적 부위에 혼성화하도록 조작되었다. 올리고누클레오티드는 인산이에스테르(P=O; ISIS 1558, 1559, 1563, 1564 및 1565) 및 포스포로티오에이트 (P=S ISIS 1570,1571,1572, 1753 ALC 1574) 형태로 합성하였다. 상기 올리고누클레오티드는 표 1에 나타낸 바와 같다.
상기 올리고누클레오티드에 의한 인터루킨-1β-자극 세포의 표면에서의 ICAM-1 발현의 저해는 실시예 1에서 언급한 대로 ELISA 분석에 의해 결정하였다. 상기 올리고누클레오티드는 두 개의 다른 세포계에서 검사되었다. 상기 인산이에스테르 올리고누클레오티드의 어느것도 ICAM-1 발현을 저해하지 않았다. 이것은 아마도 세포내에서 인산이에스테르 올리고누클레오티드의 빠른 분해에 기인하는 것 같다. 5개의 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 중에 AUG 해독 저해 코돈에 혼성화하는 ISIS 1570이 가장 활성이 크다. 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드인 ISIS 2794는 HUVEC 및 A549 세포에서 ICAM-1 발현을 저해하는 데 있어서 ISIS 1570보다 약 3배 정도 덜 효과적이다. 2'-플루오르 올리고누클레오티드인 ISIS 2634도 덜 효과적이다.
5개의 원래의 표적으로 얻어진 초기의 기록에 기초하여 ICAM-1 mRNA와 혼성화하는 부가적인 올리고누클레오티드가 고안되었다. 예정된 해독 개시부위 (5' 캡 부위)에 혼성화가능한 상기 안티센스 올리고누클레오티드(ISIS 3067)는 제8도에 나타난 바와 같이 AUG 코돈에 혼성화하는 올리고누클레오티드(ISIS 1570)만큼 인터루킨-1β-자극세포에서 활성이 있었다. ISIS 1931 및 ISIS 1932는 AUG 해독 개시 코돈의 5'과 3'에 각각 혼성화한다. ISIS-1932는 ISIS 1570과 ISIS 1931보다 약간 덜 활성이 있었으나 AUG 구역에 혼성화하는 새 누클레오티드 모두 ICAM-1 발현을 억제하였다, ICAM-1 mRNA의 암호화 구역과 혼성화하는 올리고누클레오티드(ISIS 1933, 1935, 1574 및 1936)는 약한 활성을 보였다. 해독 종결 코돈에 혼성화하는 올리고누클레오티드(ISIS 1937 및 1938)은 중간의 활성을 나타내었다.
놀랍게도 가장 활성이 있는 안티센스 올리고누클레오티드는 ISIS 1939이었는데 ICAM-1 mRNA의 3'-비해독역 서열에 표적하는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드인 2'-O-메틸(ISIS 2973) 및 2'-플루오로(ISIS 2637)이 시험되었는데 이들은 이정도 수준의 활성을 보이지는 않았다. 다른 3' 비해독 서열에 표적되는 올리고누클레오티드(ISIS 1572, 1573 및 1940)도 ISIS 1939만큼 활성이 있지는 않았다. 사실상 폴리아데닐화 상호에 표적되는 ISIS 1940는 ICAM-1 발현을 저해하지 못하였다.
의외로 시험된 16개의 초기 올리고누클레오티드중에서 ISIS 1939가 가장 큰 안티센스 활성을 나타내는 것으로 판명되었으로 ICAM-1 mRNA의 3'-비해독역에 있는 서열에 혼성화되도록 다른 올리고누클레오티드가 고안되었다(표 1에서 보여진 것과 같이 ISIS 2302, 2303, 2304 및 2307). ISIS 1939 표적 서열에서 3' 쪽으로 단지 5개의 염기부위에 혼성화는 ISIS 2307는 상기 언급된 것 중에서 가장 활성이 덜하였다(제8도). ISIS 1939 표적서열에서 3' 쪽으로 143 염기 위치에 혼성화하는 ISIS 2302는 상기 언급된 것 중 가장 활성이 컸으며, ISIS 1939 활성과 비교할 만하였다. 인간의 ICAM-1 mRNA 3'-비해독역의(엠. 주커 Science 1989, 244, 48-52에 따라)예견된 RNA 2차 구조를 연구해보면 ISIS 1939 및 ISIS 2302 모두 안정된 줄기-고리(stem-loop) 구조에 있는 것으로 예견되는 서열과 혼성화 한다는 것을 알 수 있다. RNA 2차 구조의 구역은 안티센스 올리고누클레오티드 고안시에 회피되어야 한다는 것이 현재의 정설이다. 따라서, ISIS 1939 및 ISIS 2302는 ICAM-1 발현을 저해할 것이라고 짐작하지 못하였던 것이다.
대조부 올리고누클레오티드 ISIS 1821는 ISIS 1934에 비견될 정도의 활성으로 HUVEC 세포내에서의 ICAM-1 발현을 저해하지는 않았다. 그러나 A549 세포에서는 ISIS 1821은 ISIS 1934보다 덜 효과적이었다. 음성 대조부 ISIS 1821은 ICAM 발현에 대한 작은 활성량을 가지는 것으로 밝혀졌으며, 이는 부분적으로 AUG 해독 개시 코돈에서 3'쪽으로 15염기 위치에서 ICAM-1 mRNA에 혼성화 (12 내지 13 염기 결합)할 수 있는 능력에 기인하는 것 같다.
이들 연구는 ICMA-1 mRNA에서의 AUG 해독 개시코돈 및 특이 3'-비해독 서열이 ICAM-1 발현의 안티센스 올리고누클레오티드 저해에 가장 가능성이 있다는 것을 나타낸다.
인간의 중앙 혈관 세포 및 폐 악성 종양 세포(A549)에서의 ICAM-1 발현의 저해 뿐만 아니라 ISIS 1570, ISIS 1939 및 ISIS 2302는 인간의 표피 악성종양 A431 세포 및 1차 케라틴생성세포에서도 ICAM-1 발현을 저해하는 것으로 보였다(제9도). 이러한 기록은 안티센스 올리고누클레오티드가 몇몇의 인간 세포계에서 ICAM-1 발현을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 더욱이 상기 올리고누클레오티드의 효능이 실험된 4개의 세포계에서 동일하다. ICAM 발현이 인간의 1차 케라틴 생성세포에서 억제될 수 있다는 사실은 표피 케라틴 생성세포가 안티센스 올리고누클레오티드이 지정된 표적이기 때문에 중요하다.
[실시예 6]
다른 시토키닌으로 자극된 세포에서의 안티센스 올리고누클레오티드의 ICAM-1 발현 저해
두 개의 올리고누클레오티드, ISIS 1570과 ISIS 1939에 대해 TNF-α 및 IFN-γ-유도 ICAM-1 발현을 저해하는 기능을 시험하였다. 1μM 안티센스 올리고누클레오티드로 A549 세포를 처리하면 IL-1β, TNF-α, 및 IFN-γ-유도 ICAM-1 발현을 서열특이적인 방법으로 저해하였다. 상기 안티센스 올리고누클레오티드는 IL-1β 및 TNF-α-유도 ICAM-1 발현을 비슷한 정도로 억제하는 반면 IFN-γ-유도 ICAM-1 발현은 안티센스 저해에 보다 민감하였다. 대조부 올리고누클레오티드, ISIS 1821은 IL-1β-또는 IFN-α-유도 ICAM-1 발현을 현저히 억제하지 않았으며 IFN-γ-유도 ICAM-1 발현은 하기에서 보는 바와 같이 약간 억제시켰다.
[표 2]
[실시예 7]
암호화 가닥(sense strand)의 조절에 의해 안티센스 효과가 소멸된다.
ISIS 1570 및 ISIS 1939, 올리고누클레오티드에 의한 ICAM-1 발현의 안티센스 올리고누클레오티드 저해는 그것들 각각의 암호화 가닥과 올리고누클레오티드를 혼성화시킴으로써 역전될 수 있었다. ISIS 1570에 대한 포스포로티오에이트 암호화 가닥(ISIS 1575)는 단독으로 적용하면 IL-1β-유도 ICAM-1 발현을 약간 향상시켰다.
세포에 첨가하기전에 동일농도로 ISIS 1570과 ISIS 1575를 미리 혼합하면 ISIS 1570의 효과는 차단된다. ISIS 1939(ISIS 2115)에 보충하면 세포에 단독으로 첨가될시보다 46% 만큼 ICAM-1 발현을 향상시켰다. ISIS 1936에 ISIS 2115를 미리 혼성화시키면 ISIS 1939에 의한 ICAM-1 발현 저해를 차단한다.
[실시예 8]
올리고누클레오티드 Tm(표적 서열로부터 올리고누클레오티드가 분리되는 온도)의 측정
안티센스 올리고누클레오티드에 의한 ICAM-1 발현 저해 능력이 그것의 표적부위에 대한 친화도에 기인했는지 결정하기 위해 각 올리고누클레오티드에 대해 열역학적 측정을 행하였다. (포스포로티오에이트로 합성된) 안티센스 올리고누클레오티드는 그것의 (인산이에스테르로 합성된) 상보적 DNA 서열과 혼성화시켰다. 흡광도 대 온도 관계는 100mM Na+, 10mM 인산염, 0.1mM EDTA, pH 7.0에서 4μM의 각 올리고누클레오티드 가닥으로 측정하였다. Tm과 이중나선 형태의 자유에너지는 선형 기울기의 기준선으로 이원상태(two-state)모형에 측정된 기록을 맞추어 봄으로써 얻어졌다(피터쉬임 및 터너, Biochemistry 1983, 22, 256-263). 결과는 적어도 세 번의 실험의 평균치이다.
(인산이에스테르로 합성된)상보적인 DNA 서열에 안티센스 올리고누클레오티드를 혼성화시키면 ISIS 1940을 제외한 모든 안티센스 올리고누클레오티드는 적어도 50℃의 Tm을 나타내었다. 그러므로 모든 올리고누클레오티드는 표적서열이 노출되었다면 표적 ICAM-1 mRNAdp 혼성화될 수 있었다. 놀랍게도 안티센스 올리고누클레오티드의 이러한 효능은 Tm이나 △Go 37°에 직접적으로 상관관계에 있지 않았다. 가장 큰 생물학적 활성을 갖는 올리고누클레오티드, ISIS 1939는 다른 주요 올리고누클레오티드의 Tm보다 낮은 온도의 Tm을 나타내었다. 이와 같이 혼성화 친화도는 생물학적 활성을 확증시키는 데는 불충분하다.
[실시예 9]
ICAM 발현의 안티센스 저해에 대한 올리고누클레오티드 길이의 효과
안티센스 활성화 올리고누클레오티드의 효과는 ISIS 1570의 절단된 부분(ISIS 2165, 2173, 2149, 2163 및 2164) 및 ISIS 1939의 절단된 부분 (ISIS 2540, 2544, 2545, 2546, 2567 및 2548)을 이용하여 시험하였다. 일반적으로 안티센스 활성을 올리고누클레오티드의 길이가 감소함에 따라 감소되었다. 16 염기의 길이를 가진 올리고누클레오티드는 18 염기의 올리고누클레오티드보다 약간 적은 활성을 보였다. 14 염기의 올리고누클레오티드는 현저히 적은 활성을 나타내었고, 12나 10 염기의 올리고누클레오티드는 단지 약간의 활성을 나타내었다. 올리고누클레오티드 길이 및 Tm 과 안티센스 활성간의 관계를 연구하면 14와 16 염기사이에 뚜렷한 전이가 생기는 반면 Tm은 길이에 따라 선형으로 증가한다(제10도).
[실시예 10]
ICMA-1의 안티센스 저해 특이성
안티센스 올리고누클레오티드 ISIS 1570 및 ISIS 1939의 ICAM-1에 대한 특이성은35S-표지된 단백질의 면역침전법에 의해 평가하였다. A549 세포를 25㎤ 조직 배양 플라스크에 전면배양하여 성장시킨 후 실시예 4에 기재된 바와 같이 안티센스 올리고누클레오티드로 처리하였다. 상기 세포는 14시간동안 인터루킨-1β로 자극시켰고 메티오닌-결여된 DMEM 및 10% 투석된 송아지 태아 혈청으로 세척한 후, 10% 투석된 송아지 태아 혈청, 1μM 올리고누클레오티드 및 적정량의 인터루킨-1β를 함유하는 메치오닌이 없는 배지에서 1시간동안 배양시켰다.35S-메치오닌/시스테인 혼합물(Tran35S-label I]CN(Costa Mesa, CA)로부터 구입가능)을 세포에 100μCi/㎖의 활성정도까지 첨가시켰고 부가적으로 2시간동안 배양하였다. 세포성 단백질은 50mM 트리스-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 1.0% NP-40, 0.5% 디옥시콜산염 및 2mM EDTA(웰당 0.5㎖)로 4℃에서 30분동안 배양시킴으로써 추출하였다. 추출액은 20분 동안 18,000×g으로 원심분리하여 분류하였다. 상청액은 4℃에서 2시간동안 200㎕ 단백질 G-세파토스(Sepharose) 입자(Bethesda 연구소)로 미리 흡수시켰고, 동일하게 나누어 5㎍ ICAM-1 단클론 항체(AMAC 회사에서 구입가능) 또는 HLA-A, B 항체(W6/32, 미국형 배양수집기로부터 얻어진 쥐과의 하이브리도마 세포에서 생산됨, Bethesda MD)로 15시간동안 배양하였다. 면역 복합체는 4℃에서 2시간동안 단백질 G-세파토스(V/V)의 50% 현탁액 200㎕로 배양시켜 포착하였고, 용균 완충액으로 5번 세척하였으며, SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분리결정하였다. 단백질은 자동 방사선사진으로 검출하였다. 5단의(units)/㎖의 인터루킨-1β로 A549세포를 처리하면 ICAM-1에 대한 단클로 항체로 면역침전되어 한쌍으로 이동하는 95-100kDa 단백질의 합성이 되는 것으로 보였다. 한쌍으로 나타나는 것은 ICAM-1의 달게 글라이코실화된 형태에 기인하는 것으로 여겨진다. 세포를 1μM농도의 안티센스 올리고누클레오티드 ISIS 1570으로 미리 처리하면 약 50%만큼 ICAM-1 합성이 감소되었고, 1μM ISIS 1939로 처리하면 ICAM-1 합성이 기본적인 합성 수준까지 감소되었다. ICAM-1 ELISA 분석(실시예 1 및 5)에서 불활성인 안티센스 올리고누클레오티드 ISIS 1940은 현저히 ICAM-1 합성을 감소시켰다. ICAM-1 표적서열과 혼성화할 수 있는 안티센스 올리고누클레오티드의 어느것도 ICMA-1에 대한 올리고누클레오티드 특이성을 나타내었지만 HLA-A,B 합성에는 드러날만한 영향을 미치지 않았다. ICMA-1 항체 및 단백질 G-세파로스와 비특이성으로 침전된 단백질은 안티센스 올리고누클레오티드 처리에 의해서 심각한 영향을 받지는 않았다.
[실시예 11]
세포 흡착 분석에 의한 ICAM-1에 반한 활성에 대한 부가적 안티센스 올리고누클레오티드의 검사
인간의 중앙 혈관 내피 세포층(HUVEC) 세포는 실시예 4와 같이 올리고누클레오티드로 처리하여 성장시켰다. 세포를 ISIS 1939, ISIS 1940 또는 대조부 올리고누클레오티드 ISIS 1821로 4시간동안 처리한 다음 20시간 동안 TNF-α로 자극하였다. 기본적인 HUVEC는 HL-60 세포에 최소로 결합하였고 반면에 TNF-자극 HUVEC는 첨가된 전체세포의 19%에 결합하였다. 제11도에 보여진 바와 같이 HUVEC 단일층을 0.3μM ISIS 1939로 미리 처리하면 HL-60 세포의 흡착이 감소되었다. 대조부 올리고누클레오티드 ISIS 1821 및 ISIS 1940은 19%에서 90%로 흡착 세포의 백분율을 감소시켰다. 이들 기록은 ICAM-1을 표적하는 안티센스 올리고누클레오티드가 백혈구-유사 세포계 (HL-60)가 TNF-α-처리 HUVEC에 흡착하는 것을 현저히 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
[실시예 12]
ECAM-1 유전자 발현에 대한 안티센스 올리고누클레오티드 활성의 ELISA 조사
계대배양 2 내지 5에서 인간의 1차 중앙 혈관 내피 세포층(HUVEC)세포를 96-웰 평판에 깔고 전면배양이 되도록 하였다. 세포는 Opti-MEM(GIBCO, Grand Island NY)로 세 번 세척하였다. 세포는 Opti-MEM 함유 10㎍/㎖ DOTMA 용액(Bethesda 연구소)에서 희석된 올리고누클레오티드의 농도를 증가시켜 37℃에서 4시간동안 처리하였다. 배지를 제거한 후 EGM-UV(클로네틱스, San Deigo, CA) 및 올리고누클레오티드로 대치하였다. 종양 괴사 인자a를 배지(2.5ng/㎖)에 첨가하였다. 부가적으로 4시간동안 37℃에서 배양하였다.
ELAM-1 발현은 ELISA에 의해 결정하였다. 세포를 37℃로 미리 가온한 Dulbecco 의 인산염-완충된 염수(D-PBS)로 세 번 세척하였다. 세포는 20분동안 4℃에서 95% 에탄올로 고정시키고 -PBS로 세 번 세척하고 D-PBS에서 2% BSA를 차단시켰다. 2% BSA를 함유하는 D-PBS에서 0.5㎍/㎖까지 희석된 ELAM-1 단클론 항체인 BBA-1(RD 시스템, Minneapolis MN)으로 1시간동안 37℃에서 세포배양하였다. D-PBS로 세 번 세포를 세척한 다음 결합된 ELAM-1 항체를 비오틴화된 염소의 항-쥐 2차 항체로 검출하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 β-갈락토시다제에 복합된 스트럽트라비딘 처리를 하였다.
ELAM-1 cDNA에서의 11개의 다른 구역을 표적하는 안티센스 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 및 (대조부로서) ICAM-1을 표적하는 두 개의 올리고누클레오티드의 활성은 ELAM-1 ELISA를 이용하여 결정하였다. 상기 올리고누클레오티드 및 표적서열은 표 2에 보여진 바와 같다.
ICAM-1에 표적된 안티센스 올리고누클레오티드(실시예 5)에서 관찰된 것과 대조적으로 ELAM-1 활성(ISIS 2679)의 가장 효능이 있는 올리고누클레오티드 조절자는 EKLM-1의 5'-비해독역에 있는 특이 서열과 혼성화가능하였다. ISIS 2679 표적서열의 세 개의 염기 상류에서 종결하는 서열에 혼성화하는 올리고누클레오티드 ISIS 2687은 상당한 활성을 보이지는 않았다(제12도). 그러므로 ELAM-1 mRNA 상의 유일한 부위에 혼성화하고, 이것은 안티센스 올리고누클레오티드로 인한 저해에 유일하게 민감하다. 이 부위의 안티센스 올리고누클레오티드로 인한 저해에 대한 민감성은 RNA 2차 구조 예측이나 조사에서 얻은 정보에 기초하여서는 예측할 수 없었다.
[실시예 13]
ELAM-1 유전자 발현에 대한 부가적 안티센스 올리고누클레오티드 활성의 ELISA 검사
18개 안티센스 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 의한 ELAM-1 발현의 저해는 실시예 12에서의 기재와 같이 ELISA 분석을 이용하여 결정하였다. ELAM-1 mRNA 상의 이러한 올리고누클레오티드의 표적 서열은 제13도에 나타내었다. ELAM-1에 대한 각 올리고누클레오티드의 서열과 활성은 표 3에 나타내었다. 별표(*)에 의해 나타낸 올리고누클레오티드는 약 50mM 또는 그 이하의 IC 50을 가지며 이것은 바람직한 것이다. IC 50은 ILAM-1 발현이 50% 저해가 되는 올리고누클레오티드의 분량을 가리킨다. 3'-비해독역에 표적된 부가적 올리고누클레오티드는 ELAM 발현을 저해하지 않았다.
I/E는 인트론/엑손 접합부위를 나타낸다.
약 50nM 또는 그 이하의 IC50을 갖는 올리고누클레오티드는 별표(*)로 표시한다.
[실시예 14]
VCAM-1 유전자 발현을 저해하는 활성에 대한 안티센스 올리고누클레오티드의 ELISA 검사
15개의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 의한 VCAM-1 발현의 저해는 대략 실시예 12에 기재된 바와 같이 ELISA 분석을 이용하여 결정하였는데, 세포를 16시간동안 TNF-α로 자극하고, VCAM-1 발현을 0.5㎍/㎖로 사용된 VCAM-1 특이 단클론 항체(RD System, Minneapolis. MN)에 의해서 검출하였던 것만 다르다. VCAM-1 mRNA 상의 이들 올리고누클레오티드의 표적서열은 제14도에 나타낸 바와 같다. VCAM-1을 저해하는 각 올리고누클레오티드 활성과 서열은 표 4에 나타난 바와 같다. 별표(*)로 표시된 올리고누클레오티드는 약 50mM 또는 그 이하의 IC50을 가지며 이것은 바람직하다. IC50은 VCAM-1 발현을 50% 저해하는 올리고누클레오티드의 양을 나타낸다.
I/E는 인트론/엑손 접합부위를 나타낸다.
약 50nM 또는 그 이하의 IC50을 갖는 올리고누클레오티드는 별표(*)로 표시한다.
[실시예 15]
인간의 C8161 멜라노마 세포에서의 ICAM-1 발현
인간의 멜라노마 세포계 C8161(단 웰치 박사가 증여, 허쉬 의료센타)는 반복되는 악성 멜라노마를 갖는 환자의 복강 전이로부터 유래하였다. 이 세포는 흉선 결핍 누드 취(athymic nude mice)에 피하, 피부 및 혈관 주사후에 폐, 피하조직, 지라, 간 및 지엽적인 림프절에서 복수 전이를 형성한다. 세포는 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 DMA-F12에서 배양하였으며 2mM EDTA를 사용하여 계대배양하였다.
C8161 세포를 TNF-α에 노출시키면 ICAM-1의 세포표면 발현 및 이 세포에서 ICMA-1 mRNA 수준을 6배 증가시켰다. 세포표면에서의 ICAM-1 발현은 ELISA에 의해 측정하였다. 리포펙틴(Lipofection) 15㎍/㎖ 존재하에 안티센스 올리고누클레오티드의 농도를 증가시켜 세포를 4시간동안 37℃에서 처리하였다. ICAM-1 발현을 16시간동안 5ng/㎖ TNF-α와 함께 배양하여 유도하였다. DPBS에서 세포를 세척한 다음 3% 포름알데히드에서 20분 동안 고착시켰다. 다시 DPBS에서 세포를 체척하고 37℃에서 1시간동안 2% BAS로 차단시키고 ICAM-1 단클론항체 84H10(AMAC 회사, Westbrook, ME)와 함께 배양하였다. 결합된 항체의 검출은 비오틴화된 염소의 항-쥐 IgG와 함께 배양한 다음 β-갈락토시다제-복합된 스트렙타비딘과 함께 배양하여 결정하였고, 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피란노시드 β-D-갈락토피란노시드로 전개시켰고, 575nm에서의 흡광도에 의해 정량하였다. ICAM-1 mRNA 수준은 노던 블롯 분석법(Nothern blot analysis)에 의해 측정하였다.
[실시예 16]
인간의 C8161 멜라노마 세포에서 ICAM 발현의 올리고누클레오티드저해
제15도에 보여지는 바와 같이 ICAM-1에 표적된 올리고누클레오티드 ICAM 1570(염기서열 ID 번호 : 1), ISIS 1939(염기서열 ID 번호 : 15) 및 ISIS 2302(염기서열 ID 번호 : 22)은 ICAM-1의 세포 표면의 발현(실시예 16에서와 같이 ELISA에 의해 검출됨)을 감소시켰다. 5-리폭시게자네에 상보적인 음성 대조 올리고누클레오티드인 ISIS 1822는 ICAM-1 발현에 영향을 미치지 않았다. 하기와 같이 계산된 기록은 대조부 활성의 백분율로서 표현하였다 : (올리고누클레오티드-처리되고, 시토기닌-유도된 세포에 대한 ICAM-1 발현)-(기초적인 ICAM-1 발현)/(ICAM-1 시토키닌-유도된 발현)-기초적인 ICAM-1 발현)×100
ISIS 1939 (염기서열 ID 번호 : 15) 및 ISIS 2302(염기서열 ID 번호 : 22)는 ICAM-1 mRNA 수준(노던블롯 분석법에 의해 검출)을 현저히 감소시켰으나, ISIS-1570(염기서열 ID 번호 : 1)은 ICAM-1 mRNA 수준을 약간 정도만 감소시켰다.
[실시예 17]
실험적인 전이(Metastasis)분석
전이에서 ICAM-1의 역할을 알아보기 위해 1×10 C8161 세포를 흉선결핍 누드 마이스(athymic nude mice)의 측부 꼬리 혈관에 주입시킴으로써 실험적인 전이 분석을 행하였다. C8161 세포를 시토키닌 TNF-α 및 인터페론 γ로 처리하면 세포가 누드 마이스에 주입될 때 폐의 전이 수를 감소시킨다는 것이 종래에 알려져 있다(밀러 및 웰치(1990) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 13: 353).
4주후에 쥐는 희생되었고 유기체는 보우인(Bouin)의 고정체에 고착되었고 폐에서의 전이 손상부위는 해부현미경으로 알아내었다. 4주된 암컷의 흉선이 결핍된 누드 마이스(Harlan Speague Dawley)가 사용되었다. 동물을 NIH의 가이드라인하에서 유지시켰다. 4∼8 쥐의 집단 각각이 실험적인 전이분석에서 시험되었다.
[실시예 18]
안티센스 올리고누클레오티드 ISIS 1570 및 ISIS 2302는 C8161 세포의 전이 능력을 감소시킨다.
C8161 세포를 ICAM-1에 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드 ISIS 1570과 ISIS 2302로 처리하는 것은 양이온성 지질, 리포펙틴(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)의 존재하에서 수행되었다. 안티센스 올리고누클레오티드는 실시예 3에 기재된 바에 따라 합성되었다. 60㎜ 조직배양 접시에 10 세포/㎖로 세포를 접종하였고 3일간 37℃에서 배양한 후 Opti-MEM(Gibco/BRL)로 세 번 세척하였고 Opti-MEM 배지 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 0.5μM 올리고누클레오티드 및 15㎍/㎖ 리포펙틴을 15분간 실온에서 혼합하였다. 올리고누클레오티드-리포펙틴 혼합물 25㎕를 적당한 접시에 첨가시킨후 4시간동안 37℃에서 배양하였다. 올리고누클레오티드-리포펙틴 혼합물을 제거하고 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 DME-F12 배지와 대치시켰다. 4시간 후 500U/㎖ TNF-α를 적당한 웰에 첨가하였고 18시간 동안 배양하였는데 이때 세포를 평판에서 제거하고 계수한 뒤 흉선이 결핍된 누드 마이스에 주입시켰다.
C8161 세포를 ISIS 1570(염기서열 ID 번호 : 1)또는 ISIS 2302(염기서열 ID 번호 : 22)로 처리하면 이들 세포의 전이능력은 감소되었고 TNF-α 처리로 향상된 C8161의 전이능력을 소멸시켰다. 기록은 표 5에 기재되어 있다.
[실시예 19]
ICAM-1에 대한 안티센스 올리고누클레오티드를 시험하기 위한 쥐(Murine)모형
세포간 흡착 분자에 의해 조절된다고 여겨지는 많은 질환이 인간에서의 연구에 그대로 받아들여질 수는 없다. 예를 들면 타가이식 거부반응은 ICMA-1 발현의 간섭으로써 개선되기 쉬운 질병이나, 분명히 이것은 인간의 이식 환자 보다 동물에서 평가되었음에 틀림없다. 다른 예로는 염증성의 내장염이 그러하고 또 다른 것으로는 뉴트로필 이동(침윤(浸潤))이다. 그러나 이러한 조건들은 여기에 사용된 쥐 모형과 같은 동물 모형에서 시험될 수 있다.
ICAM-1 발현을 방해하기 위한 올리고누클레오티드 서열이 쥐 세포에서 동정되었다. 쥐의 ICAM-1은 인간의 ICAM-1 서열과 약 50% 정도 상동성을 가진다; 쥐의 ICAM-1 mRNA 서열을 표적하는 일련의 올리고누클레오티드가 인간의 ICAM-1에 표적된 올리고누클레오티드의 연구로부터 얻은 정보를 이용하여 고안 및 합성되었다. 이들 올리고누클레오티드는 면역침전 분석법을 이용하여 활성이 조사되었다.
쥐과의 DCEK-ICAM 세포(아드리네 브리안 박사가 증여, 샌디고의 캘리포니아 대학교)를 4시간동안 37℃에서 20㎍/㎖ DOTMA/DOPE의 존재하에 1㎛ 안티센스 올리고누클레오티드로 처리하였다. 배지는 10% 투석된 송아지 태아혈청과 1㎛ 안티센스 올리고누클레오티드를 포함하는 메치오닌이 결여된 배지로 교체하였다. 세포는 1시간동안 메치오닌이 결여된 배지에서 배양한 후 100μCi/㎖의 S-표지 메치오닌/시스테인 혼합물을 세포에 첨가하였다. 세포를 2시간 더 배양한 후 PBS로 네 번 세척하고 20mM 트리스(pH 7.2), 20mM kCl, 5mM EDTA, 1% 트리톤×100. 0.1mM 루펩틴(leupeptin), 10㎍/㎖ 어프로티닌(aprotinin), 및 1mM PNSF를 함유하는 완충액으로 추출하였다. 쥐-특이성 ICAM-1 항체(YN1/1.7.4)와 함께 배양하고 단백질 G-세파토스로 처리하여 추출물로부터 ICAM-1을 면역 침전시켰다. 상기 면역 침전물은 SDS-PAGE로 분석하였고 방사선 사진을 찍었다. 쥐의 ICAM-1의 AUG 코돈을 표적하는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 ISIS 3066 및 3069는 각각 ICAM-1 합성을 48% 및 63% 만큼 저해하는 반면 쥐의 ICAM-1 mRNA의 3'-비해독역 서열을 표적하는 ISIS 3065 및 ISIS 3082 올리고누클레오티드는 각각 47% 및 97% ICAM-1 합성을 저해하였다. 쥐의 ICAM-1에 대한 가장 활성이 큰 안티센스 올리고누클레오티드가 3'-비해독역에 표적되었다. ISIS 3082가 이들 결과에 기준하여 더 연구되었다 : 이 20합체 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드는 서열(5'에서 3') TGC ATC CCC CAG GCC ACC AT (염기서열 ID 번호 : 83)으로 구성된다.
[실시예 20]
ICAM-1에 대한 안티센스 올리고누클레오티드는 쥐(murine) 모형계에서 염증성 내장 질환을 감소시켰다.
염증성 내장 질환(IBD)에 대한 쥐 모형이 최근에 개발되었다(오카와수 외 (1990) Gastroenterology 98 : 694-702). 쥐에 덱스트란 황산을 투여하면 인간의 IBD와 인간의 IBD는 연속적으로 조직학적수준에서 세밀히 비교되어 왔고 쥐모형은 재현 가능하고 확실한 모형으로 알려져 있다. 쥐의 ICAM-1의 3'-비해독역에 상보적인 20-염기 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드, ISIS 3082의 효과를 시험하기 위해서도 사용된다.
약 25 내지 30 그램의 무게가 되는 암컷의 스위스 웹스터 마이스(Webster mice; 생후 8주됨)를 표준 조건하에서 유지시켰다. 실험단계의 시작 전에 적어도 5일 동안 쥐가 조건에 적응하도록 한다. 식수에 5% 덱스트란 황산 나트륨을 5일간 주었다(가능하면 리비툼(libitum)을 첨가하여) 부수적으로 약제학적 담체내의 ISIS 3082 올리고누클레오티드, 담체단독(음성적 대조부) 또는 TGF-β(쥐에서 덱스트란 황산염-매개 결장염에 대항하여 보호하는 것으로 공지됨)을 투여한다. TGF-β는 결장을 통하여 쥐 한 마리당 1㎍으로 투여하였다. 1㎎/㎏일 때는 상기 올리고누클레오티드는 덱스트린-황산염-유도 결장염으로부터 보호하는데 있어서 TGF-β만큼 효과적이었다.
쥐는 6일째에 희생되었고 결장은 조직 병리학적 평가에 제공되었다. 희생시킬때까지 질병의 활성정도는 쥐의 무게 변화를 관찰하고 결장염의 증거로서 대변을 관찰함으로써 측정하였다. 매일 쥐의 무게를 측정하였다. 대변은 매일 시종일관하여 변화 및 불가사이하거나 큰 출혈의 존재에 대하여 관찰하였다. 질병의 활성지수를 나타내기 위해 기록체계(scoring system)가 사용되었는데, 그것에 의해 무게손실, 대변의 일관성 및 출혈의 존재가 0 내지 3의 범위 상에 등급을 매겼고(0은 정상이고 3은 가장 심각하게 영향을 받음) 지수를 계산하였다. 질병 활성지수에서의 약물-유도변화를 통계학적으로 분석하였다. 상기 질병활성지수는 일반적으로 IBD와 상당히 상관 관계에 있는 것으로 알려져 왔다. 결과는 제16도에 제시되었다. 1㎎/㎏의 올리고누클레오티드는 40%만큼 질병 지수를 감소시켰다.
[실시예 21]
ICAM-1에 대한 안티센스 올리고누클레오티드는 쥐(murine)의 이소성(異所性; heterotopic) 심장 이식 모형에서의 생존율을 증가시킨다.
타가이식 거부반응을 막는데 있어서 ICAM-1 안티센스 올리고누클레오티드의 치료효과를 결정하기 위해 쥐과의 ICAM-1 특이성 올리고누클레오티드 ISIS 3082를 쥐의 혈관화(Vascularized)된 헤테르토픽 심장 이식 모형에서 시험하였다. Balb/C 쥐의 심장을 이소베등(1991) (Circulation 84 : 1246-1255)) 문헌에 기재된 바와같이 1차 혈관화된 이식과 마찬가지로 C3H 쥐의 복강에 이식하였다. 올리고누클레오티드는 7일간 알젯트(Alzet) pump를 통한 계속적인 혈관 공급으로 투약하였다. 처리되지 않은 쥐에 대한 평균적 생존 기간이 9.2±0.8일 (8,9,9,9,10,10일)이었다. 5㎎/㎏ ISIS 3082로 7일간 쥐를 처리하면 평균 생존기간이 14.3±4.6일(11,12,13,21일)로 증가하였다.
[실시예 22]
ICAM-1에 대한 안티센스 올리고누클레오티드는 백혈구 이동을 감소시킨다.
조직이나 유기체의 백혈구 침투는 염증 진행과정의 주요한 양상이며 염증으로부터 생기는 조직 손상에 기여한다. 백혈구 이동에 대한 ISIS 3082의 효과는 카라기난-침지(Carrageenan-soaked) 스폰지에서 피하내로 주입된 쥐모형을 사용하여 연구되었다. 카라기난은 백혈구 이동 및 부종(浮腫)을 자극시킨다. 염증성 삼출물(渗出物)에서의 백혈구 이동에 대한 올리고누클레오티드의 영향은 주입된 스폰지를 침투한 백혈구를 정량하여 평가된다. 4시간이 지난 후, 40마리의 쥐를 무작위로 각각 5마리 쥐를 포함하는 8개 군으로 나누었다. 각 쥐를 메토판(Metofane)으로 마취시킨 후 20㎎/㎖ 카라기난 용액 1㎖를 함유한 풀리에스테르 스폰지를 피하내로 주입시켰다. 스폰지 주입 4시간 전에 10㎖/㎏의 염수를 제1군에 혈관내로 투여하였고, 이것은 부형약(賦刑藥)대조부로서 제공되었다. 20㎎/㎏의 부피에서 3㎎/㎏의 인도메타신(Indomethacin; 양성 대조부)을 수술 후 즉시 제2군에 구강으로 투여하였다. ISIS 3082 5㎎/㎏을 스폰지 주입 4시간 전에 혈관을 통하여 제3군에 투여하였다. ISIS 3082 5㎎/㎏을 스폰지 주입 바로 직후에 제4군에 혈관을 통하여 투여하였다. ISIS 3082 5㎎/㎏을 스폰지 주입 후 제 5, 6, 7 및 8군에 각각 2, 4, 8 및 18시간 후 혈관을 통하여 투여하였다. 주입 후 24시간 뒤에 스폰지를 제거하고 EDTA 및 염수(5㎖)에 담근 후 압착하여 건조하였다. 스폰지 삼출물 혼합물에서의 백혈구의 총수를 결정하였다.
인도메타신 3㎎/㎏을 구강 주입시키면 부형약 대조군에 비하여 평균 백혈구 수가 79% 감소되었다.
평균 백혈구 수의 42% 감소는 스폰지 주입 4시간 전에 ISIS 3082 5㎎/㎏을 투여한(제3군) 후에 관찰되었다. 평균 백혈구 수의 47% 감소는 스폰지 주입 바로직후 ISIS 3082 5㎎/㎏을 투여한 (제4군)후에 관찰되었다. 연구과정중 내내 모든 동물들은 정상적인 것으로 보였다.
서열목록
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인 : 베네트 및 미라벨리
(ii) 발명의 명칭 : 세포흡착의 올리고누클레오티드 조절
(iii) 염기서열의 수 : 85
(iv) 주소 :
(A) 수신인 : 우드랜드 폴스 코포레이트 파크
(B) 거리명 : 210 레이크 드라이브 이스트, 슈이 201
(C) 도시명 : 체리 힐
(D) 주명 : 뉴저어지
(E) 국명 : 미합중국
(F) 우편변호 : 08002
(v) 컴퓨터 해독 형태 :
(A) 중간형 : 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 용량
(B) 컴퓨터 : IBM PS/2
(C) 작동 시스템 : PC-DOS
(D) 소프트웨어 : 워드퍼펙트 5.0
(vi) 출원자료 :
(A) 출원번호 :n/a
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(vii) 선행 출원자료 :
(A) 출원번호 : 제 939,855호
(B) 출원일 : 1992. 9. 2.
(vii) 선행 출원자료 :
(A) 출원번호 : PCT/US91/05209
(B) 출원일 : 1991. 7. 23.
(vii) 선행 출원자료 :
(A) 출원번호 : 제567,286호
(B) 출원일 : 1990. 8. 14.
(vii) 선행 출원자료 :
(A) 출원번호 : 제007,997호
(B) 출원일 : 1993. 1. 20.
(viii) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 제인 매세이 리카타
(B) 등록번호 : 32,257
(C) 참조/서류번호 : ISPH-0002
(ix) 통신 연락처 :
(A) 전화번호 : (609) 779-2400
(B) TELEFAX : (609) 779-8488
(2) 서열 ID NO : 1에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
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GACACTCAAT AAATGCTGG T
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(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 18
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GAGGCTGAGG TGGGSAGGA
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CGATGGGCAG TGGGAAAG
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CATAGCGAGG CTGAGGTTGC
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CGGGGGCTGC TGGAGCCAT
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AGAGGCCCCGA GCAGGACCAG
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(i) 서열특성 :
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TGCCCATCAG GGCAGTTTGA
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(i) 서열특성 :
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GGTCACACTG ACTGAGGCCT
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(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 12:
CTCGCGGGTC ACCTCCCCTT
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(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 13:
TCAGGGAGGC GTGGCTTGTG
(2) 서열 ID NO : 14에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 14:
CCTGTCCCGG GATAGGTTC A
(2) 서열 ID NO : 15에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 15:
CCCCCACCAC TTCCCCTCTC
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(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 16:
TTGAGAAAGC TTTATTAACT
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(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 14
(B) 유형 : 핵산
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 17:
AGCCATAGCG AGGC
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(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12
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CCATAGCGAG GC
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(i) 서열특성 :
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ATAGCGAGGC
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TGGGAGCCAT AGCGAG
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 21:
GGAGCCATAG CGAGGC
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GCCCAAGCTG GCATCCGTGA
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TCTGTAAGTC TGTGGGCCTC
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AGTCTTGCTC CTTCCTCTTG
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CTCATCAGGC TAGACTTTAA
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TGTCCTCATG GTGGGGCTAT
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(A) 길이 : 22
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TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC GA
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(i) 서열특성 :
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CAATCATGAC TTCAAGAGTT CT
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ACCACACTGG TATTTCACAC CT
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GTATGGAAGA TTATAATATA T
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CACAATCCTT AAGAACTCTT T
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(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 32:
ACCTCTGCTG TTCTGATCCT
(2) 서열 ID NO : 33에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 33:
CTGCTGCCTC TGTCTCAGGT
(2) 서열 ID NO : 34에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 15
(B) 유형 : 핵산
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 34:
GGTATTTGAC ACAGC
(2) 서열 ID NO : 35에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
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(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 35:
AATCATGACT TCAAGAGTTC T
(2) 서열 ID NO : 36에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 36:
TGAAGCAATC ATFACTTCAA G
(2) 서열 ID NO : 37에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
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(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 37:
TATAGGAGTT TTGATGTGAA
(2) 서열 ID NO : 38에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 38:
ACAATGAGGG GGTAATCTAC A
(2) 서열 ID NO : 39에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
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(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 39:
GACAATATAC AAACCTTCCA T
(2) 서열 ID NO : 40에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 40:
CCAGGCATTT TAAGTTGCTG T
(2) 서열 ID NO : 41에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 41:
CCTGAAGCCA GTGAGGCCCG
(2) 서열 ID NO : 42에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 42:
GATGAGAAAA TAGTGGAACC A
(2) 서열 ID NO : 43에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 19
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 43:
CTGACCAAGA TATCTAGAT
(2) 서열 ID NO : 44에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 19
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 44:
CTACACTTTT GATTTCTGT
(2) 서열 ID NO : 45에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
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(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 45:
TTGAACATAT CAAGCATTAG CT
(2) 서열 ID NO : 46에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 46:
TTTACATATG TACAAATTAT GT
(2) 서열 ID NO : 47에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 47:
AATTATCACT TTACTATACA AA
(2) 서열 ID NO : 48에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 48:
AGGGCYGACC AAGACGGTTG T
(2) 서열 ID NO : 49에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 49:
CCATCTTCCC AGGCATTTTA
(2) 서열 ID NO : 50에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 50:
AACCCAGTGC TCCCTTTGCT
(2) 서열 ID NO : 51에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 51:
GGCCACATTG GGAAAGTTGC
(2) 서열 ID NO : 52에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 52:
GAAGTCAGCC AAGAACAGCT
(2) 서열 ID NO : 53에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 53:
ACAGGATCTC TCAGGTGGGT
(2) 서열 ID NO : 54에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 54:
CCAAAGTGAG AGCTGAGAGA
(2) 서열 ID NO : 55에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 55:
CTGATTCAAG GCTTTGGCAG
(2) 서열 ID NO : 56에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 56:
TTCCCCAGAT GCACCTGTTT
(2) 서열 ID NO : 57에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
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(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 57:
GGGCCAGAGA CCCGAGGAGA
(2) 서열 ID NO : 58에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(C) 가닥형태 : 싱글
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 58:
ACGTTTGGCC TCATGGAAGT
(2) 서열 ID NO : 59에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(D) 위상 : 선형
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 59:
GGAATGCAAA GCACATCCAT
(2) 서열 ID NO : 60에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(D) 위상 : 선형
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 60:
CGATGCAGAT ACCGCGGACT
(2) 서열 ID NO : 61에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 61:
GCCTGGGAGG GTATTCAGCT
(2) 서열 ID NO : 62에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
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(D) 위상 : 선형
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 62:
CCTGTGTGTG CCTGGGAGGG
(2) 서열 ID NO : 63에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 63:
GGCATTTTAA GTTGCTGTCG
(2) 서열 ID NO : 64에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
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(C) 가닥형태 : 싱글
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(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 64:
CAGCCTGCCT TACTGTGGGC
(2) 서열 ID NO : 65에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 65:
CTTGAACAAT TAATTCCACC T
(2) 서열 ID NO : 66에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 66:
TTACCATTGA CATAAAGTGT T
(2) 서열 ID NO : 67에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 67:
CTGTGTCTCC TGTCTCCGCT
(2) 서열 ID NO : 68에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 68:
GTCTTTGTTG TTTTCTCTTCC
(2) 서열 ID NO : 69에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 69:
TGAACATATC AAGCATTAGC
(2) 서열 ID NO : 70에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 70:
GCAATCTTGC TATGGCATAA
(2) 서열 ID NO : 71에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 71:
CCCGGCATCT TTACAAAACC
(2) 서열 ID NO : 72에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 72:
AACATCTCCG TACCATGCCA
(2) 서열 ID NO : 73에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 73:
TCACAGCTGC CTCTGTCTCA GG
(2) 서열 ID NO : 74에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 74:
TGATTCTTTT GAACTTAAAA GGA
(2) 서열 ID NO : 75에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 75:
TTAAAGGATG TAAGAAGGCT
(2) 서열 ID NO : 76에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 19
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 76:
CATAAGCACA TTTATTGTC
(2) 서열 ID NO : 77에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 77:
TTTTGGGAAG CAGTTGTTCA
(2) 서열 ID NO : 78에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 78:
AACTGTGAAG CAATCATGAC T
(2) 서열 ID NO : 79에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 79:
CCTTGAGTGG TGCATTCAAC CT
(2) 서열 ID NO : 80에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 80:
AATGCTTGCT CACACAGGCA TT
(2) 서열 ID NO : 81에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 81:
GCCTCGCTAT GGCTCCCA
(2) 서열 ID NO : 82에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 82:
CATGGCGCGG GCCGCGGG
(2) 서열 ID NO : 83에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 83:
TGCATCCCCC AGGCCACCAT
(2) 서열 ID NO : 84에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 84:
TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC 20
(2) 서열 ID NO : 85에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 85:
TATGTCTCCC CCACCACTTC 20

Claims (36)

  1. 서열 ID 번호 : 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,22,23,24,25,26,27 및 84로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드.
  3. 제1항의 안티센스 올리고누클레오티드 및 약제학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  4. 서열 ID 번호 : 28,29,30,31,32,33,34,35,34,37,38,39,52,53,54,55,,56,57,58 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드.
  6. 제4항의 안티센스 올리고누클레오티드 및 약제학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  7. 서열 ID 번호 : 50,51,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71 및 72로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드.
  9. 제7항의 안티센스 올리고누클레오티드 및 약제학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  10. 제1항의 안티센스 올리고누클레오티드와 인간을 제외한 세포 또는 조직을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 상기 세포 또는 조직내에서 세포간 흡착 분자-1의 합성을 조절하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제4항의 안티센스 올리고누클레오티드와 인간을 제외한 세포 또는 조직을 접촉시키는 것으로 구성되는 상기 세포나 조직내의 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1의 합성을 조절하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제7항의 안티센스 올리고누클레오티드와 인간을 제외한 세포 또는 조직을 접촉시키는 것으로 구성되는 상기 세포나 조직에서의 맥관 세포 흡착 분자-1의 합성을 조절하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항의 안티센스 올리고누클레오티드를 치료학적으로 효과적인 양으로 인간을 제외한 동물에 투여하는 것으로 이루어지고, 세포간 흡착 분자-1의 변화에 의해 조절되는 병을 가진 것으로 추측되는 상기 동물의 치료방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 안티센스 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 질병이 타가이식 거부반응, 건선(乾癬), 염증성 질환, 또는 악성 멜라노마인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 염증성 질환이 염증성 내장 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 염증성 질환이 백혈구 침투에 의해 특정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 질병이 전이(metastases)에 의해 특정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 전이가 폐에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제4항의 안티센스 올리고누클레오티드를 치료학적으로 효과적인 양으로 인간을 제외한 동물에 투여하는 것으로 이루어지고, 내피 세포층 백혈구 흡착 분자-1의 변화에 의해 조절되는 질병을 가지는 것으로 추측되는 상기 동물의 치료방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 안티센스 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제7항의 안티센스 올리고누클레오티드를 치료학적으로 효과적인 양으로 인간을 제외한 동물에 투여하는 것으로 이루어지고, 맥관 세포 흡착 분자-1의 변화에 의해 조절되는 질병을 가지는 것으로 추측되는 상기 동물의 치료방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 안티센스 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1항의 안티센스 올리고누클레오티드를 치료학적으로 효과적인 양으로 인간을 제외한 동물에 투여하는 것으로 이루어지고, 전이(metastatic) 조건을 갖고 있다고 추측되는 상기 동물에서 전이를 감소시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 안티센스 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제29항에 있어서, 상기 전이가 폐에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제4항의 안티센스 올리고누클레오티드를 치료학적으로 효과적인 양으로 인간을 제외한 동물에 투여하는 것으로 이루어지고, 전이조건을 갖고 있다고 추측되는 상기 동물에서 전이를 감소시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 안티센스 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 전이가 폐에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제7항의 안티센스 올리고누클레오티드를 치료학적으로 효과적인 양으로 인간을 제외한 동물에 투여하는 것으로 이루어지고, 전이조건을 갖고 있다고 추측되는 상기 동물에서 전이를 감소시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 안티센스 올리고누클레오티드의 누클레오티드 단위간 연결그룹 중 적어도 하나가 황-함유 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 전이가 폐에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 서열 ID 번호 : 22의 안티센스 올리고누클레오티드를 치료학적으로 효과적인 양으로 건선을 갖는다고 추측되는 인간을 제외한 동물에 투여하는 것으로 구성되는 건선의 치료방법.
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