JPH07503612A - 普遍性ドナー細胞の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２＋、前記ＤＲＡプロモーター配列がＸボックス又はＸ２ボツクスを含む請求の 範囲第２０項記載の移植抗原除去細胞。

２２、前記オリゴヌクレオチドが、下記配列、５　’　ＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧ ＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＴ　３　’又は、下記配列 ５’　ＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧ　３’若しくは 結合能を維持するこれらのフラグメントを含む請求の範囲第２１又は１４項記載 の移植抗原除去細胞。

２３、前記標的細胞が、角膜内皮細胞、甲状腺細胞、甲状腺傍細胞、脳細胞、副 腎細胞、骨髄細胞、膵臓高細胞及び肝細胞から成る群より選択される請求の範囲 第１４項記載の移植抗原除去細胞。

２４、前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＩＣＡＭ遺伝子配列である請求の範囲 第１４項記載の移植抗原除去細胞。

２５　ワトランークリック結合又はトリプレックス結合を経て、移植抗原ヌクレ オチド配列に結合することができるオリゴヌクレオチド。

２６、前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＭＨＣクラス１１遺伝子配列である請 求の範囲第２５項記載のオリゴヌクレオチド。

２７　前記ＭＨＣクラスＩ＋遺伝子配列が、ＤＲＡＳＤＰ又はＤＱ座に位置する 請求の範囲第２６項記載のオリゴヌクレオチド。

２８、前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列がＤＲＡ構造遺伝子配列又はＤＲＡプロ モーター配列である請求の範囲第２７項記載のオリゴヌクレオチド。

２９、前記ＤＲＡプロモーター配列がＸボックス又はＬボックスを含む請求の範 囲第２８項記載のオリゴヌクレオチド。

３０、前記オリゴヌクレオチドが、下記配列、５’　ＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴ ＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＴ　３’又は、下記配列 ５’　ＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧ　３’若しくは 結合能を維持するこれらのフラグメントを含む請求の範囲第２９又は２８項記載 のオリゴヌクレオチド。

３１、標的細胞を移植抗原除去のものにする治療のための組成物の製造に用いら れるオリゴヌクレオチドてあって、該オリゴヌクレオチドが移植抗原ヌクレオチ ド配列の一部に結合することができる当該オリゴヌクレオチド。

３２、　（ａ）　患者から標的器官を得ること；及び（ｂ）　該標的器官を、移 植抗原ヌクレオチド配列に結合することができるオリゴヌクレオチドに暴露し、 ここで、該オリゴヌクレオチドは、該標的器官を普遍性トナー器官にするために 十分な量で存在すること、を含む方法によって製造された普遍性ドナー器官。

３３、移植抗原の機能不全発現により特徴付けられる自己免疫疾患を有する患者 の治療方法であって、該患者に移植抗原ヌクレオチド配列の一部に結合すること ができるオリゴヌクレオチドを、該移植抗原の発現を十分に阻害する量で、投与 することを含む当該方法。

明細書 普遍性ドナー細胞の作製方法 技術分野 本発明は、治療、移植及び免疫学に関する。特に、オリゴヌクレオチドを用いて レシピエンド宿主へより容易に移植される細胞の作製方法に関し、このオリゴヌ クレオチドは、移植細胞の細胞表面に発現される移植抗原に関する遺伝子及び遺 伝子産物と相互作用するものである。

背景 抗遺伝子コード分子は、正常ｍＲＮＡの一部に対する°アンチセンス″　（即ち 、ワトランークリック対様式でＤＮＡ若しくはＲＮＡ鎖と相補的）である短ＲＮ Ａ若しくはＤＮＡ転写物であり、これは翻訳されない。抗遺伝子コードＲＮＡに よる遺伝子の発現の調節は、遺伝子調節の正常モードの１つであり、原核生物に おいて最初に確認された。グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、　Ｐ、Ｍ、　ら、Ａｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８６）５５：５６９゜天然抗遺伝子コー ド物及び人工抗遺伝子コード物は、原核生物において用いられて原核生物タンパ ク質をダウンレギュレートする。サイセンス（Ｓｉｍｍｏｎｓ）。

Ｒ，Ｗ、ら、Ｃｅ１１．　（＋９８３）　３４：６８３　；ミズノ９Ｔ９ら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　（１X８４） ８１：１９６６　、才力モト、に、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　、　（１９８６）　８３：５０００　；ペスト■ （Ｐｅｓｔｋａ）、Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 、　（＋９８４）　８１　ニア５２５　；　コルマン（Ｃｏ撃■高≠氏j。

Ｊ、ら、Ｃｅ１１．　（１９８４）　３７：４２９　：ファルハム（Ｆａｒｎｈ ａｍ）、　Ｐ、　Ｊら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　、　（１９８５）　８２：３９７８　；キンディ（Ｋｉｎｄｙ）、　 Ｍ、　Ｓ、ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、（１９８７）@７：２ ８５７゜ 人工抗遺伝子コード物も、また合成され、真核生物遺伝子発現を調節するように 用いられる。チミジンキナーゼ（ＴＫ）抗遺伝子コード物のマイクロインジェク ション又はトランスフェクションは、ＴＫタンパク質の発現を阻害することが示 されている。アイザント（Ｉｚａｎｔ）、　Ｊ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　（１９８ ４）　３６：１００７　；キム（Ｋｉｍ）、Ｓ、に、ら、Ｃｅ１ｌ　（１９８５ ）　４２：１２９゜更に、チミジンキナーゼ遺伝子の５′非翻訳領域に対する短 い抗遺伝子コード物は、タンパク質発現を、うま（ダウンレギュレートする。ア イザントＪ、Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２９：３４５゜抗遺伝 子コード物による真核生物遺伝子発現の調節の他の例には、ｐｐ６６　ｃ−ｓｒ ｃ遺伝子（トランスフェクトされた完全抗遺伝子コード物による）及びｃ−ｆｏ ｓ遺伝子（第１エクソンの５′非翻訳領域の抗遺伝子コードスバニングによる） がある。

アミ−＝（Ａｍｉｎｉ）、　Ｓ、ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　（１９８ ６）　６：２３０５；ホルト（ＨＯｌｔ）、　Ｊ、　Ｔ。

ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８６）　８３：４７９４ ゜これらの抗遺伝子コード物は、本質的又は異ｐ１誘導プロモータ下に導入され る。

合成オリゴマーは、また、前骨髄細胞系白血病細胞及びＴリンパ球中のｃ　−ｍ ｙｃの発現をダウンレギュレートするために用いられている。ウィックストロン （Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ）、　Ｅ、　Ｌ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、（１９８８）　８５：１０２８　；ヘイキイラ（Ｈｅ@１ ｋｋｉｌａ）、Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２８：４４５゜ｃ−ｍ ｙｃ抗遺伝子コードオリゴヌクレオチドは、正常造血細胞において増殖を阻害す ることが示された。ゲウィルツ（Ｇｅｗｉｒｔｚ）、　Ａ、　Ｍ、ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　（１９８８）　２４２：１３０３゜ＣＤ８フラグメントに対する抗遺伝 子コート物は、ヒト細胞傷害性子細胞の表面上のＣＤ８分子の発現をダウンレギ ュレートした。バンパー（Ｈａｍｂｏｒ）、　Ｊ、　Ｅ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９８Ｂ）８５：４０１０゜ロチアラ（Ｌｏｔｔｅａ ｕ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、（１９８９）　１６９：３５１は、エビソームベ クターを用いてＢリンパ芽球様細胞株にＤＲＡコード配列を導入し、ＤＲＡ−Ｄ Ｑ　Ｂ混合アイソタイプへテロダイマーの発現をダウンレギュレートしたが、ア イソタイプ適合ＤＲＡ−ＤＱ　Ｂへテロダイマーのレベルにおいて如何なる変化 も認められなかった。

抗遺伝子コードオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを阻害す ることによって、ｍＲＮＡに結合してリポソーム翻訳を妨げることによって、Ｒ ＮアーゼＨによるｍＲＮＡ分解を促進することによりｍＲＮＡの安定性を減少さ せることによって、又は成熟ｍＲＮＡへのプロセシングを妨げる若しくは阻害す ることによって、転写を妨げるように作用し得る。マウアー（ｉＪａｈｅｒ）ル 、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（＋９８９）　２４５ニア２５　；モザーＱｌｏｓ ｅｒ）、　Ｈ，Ｅ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）　２３８：６４T　； メルトンＱｌｅｌｔｏｎ）、　Ｄ、　Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、　（１９８５）　８２：１４４；ゲルウィック、Ａ、Ｍ、ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　（１９８９）　２４５：１８０　；ウエルダー（Ｗａｌｄｅｒ）、　Ｒ ，Ｙ、ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８Ｂ）　８５：５０１１　、標的とアン チセンスとの配列間での絶対的な相同性（ホモロジー）は、この阻害において、 あればより良いが、必要ではない。

ホルト、Ｊ、Ｔ、　、前出。

抗遺伝子コードオリゴヌクレオチドは、また無傷のデュプレックス遺伝子とトリ プレックスＤＮＡ構造を形成する。モファット（Ｍｏｆｆａｔ）、　Ａ、　Ｓ、 、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）２５２：　１３７４−１３７５゜抗遺伝子コー ドオリゴヌクレオチドのこの作製技術は、所定の結合法則に従ったトリプレック ス構造の形成に関連する。このトリプレックス構造が遺伝子のプロモーター領域 内に形成される場合、該遺伝子の転写が妨げられることが示されている。オルラ ン（Ｏｒｓｏｎ）、　Ｆ、Ｍ、ら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９９１ ）＋９：３４３５−３４４１゜ 抗遺伝子コード物による調節に潜在的に付されている１対の遺伝子には、ヒト白 血球抗原（ＨＬＡ）複合体があり、これは、６番目染色体の短腕に局在する。

ＨＬＡ抗原はその構造によって２つのクラスに分けられる。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及 び−〇と表される遺伝子座は、ＨＬＡクラスＩ抗原をコードし、ＨＬＡ−ＤＰ、 −ＤＱ及び−ＤＲは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原をコードする。

ＨＬＡクラス１１分子は、２つの非共有結合糖タンパク質、α鎖及びがなり多形 のβ鎖から構成される。各鎖は、１つの細胞外ドメイン、膜貫通セグメント及び 細胞質尾部を含む。α及びβ鎖の構造及びその遺伝子は、明らかにされている。

全ての既知のクラスＩＩ遺伝子は、構造において類似であり、エクソンｌ−４に よってコードされ、非翻訳領域をコードするエフロン５を伴う。ＤＰ、ＤＱ及び ＤＲ座は、全て同義（マルチプル）遺伝子がら成る。全部で１２のクラス１１遺 伝子が同定されている。いくつかのハブロタイブでは、あるクラスＩＩ遺伝子は 、機能的ペプチドをコードせず、偽遺伝子として分類されている。ＨＬＡクラス ＩＩ抗原遺伝子の構造領域に対して抗遺伝子オリゴヌクレオチドが結合すること による該遺伝子発現の調節は、文献において報告されていない。

ＨＬＡクラス１１抗原発現の調節は、一連のプロモーター領域例えばＪＳＷＳＸ （Ｘ、及びＸ、を含む）及びＹボックス、並びにγ−インターフェロン応答成分 を通して、一部分、起こる。Ｘ　（Ｘ、及びＸ、を含む）及びＹボックスは、全 てのクラスＩＩプロモーターの転写調節において必要であると知られている。オ ノ。

Ｓ、Ｊ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９９１）　８８：４ ３０４−４３０８゜ＨＬＡ抗原は、宿主生物における細胞移植片又は移植組織の 生き残りに関係している。殆ど全てのタイプの移植片において最初の年に生き残 る許容移植片があっても、移植後５及び１０年の間は、全移植片の４０〜５０％ のみが、まだ機能しているにすぎない。この低い率は、該移植片における免疫系 の容赦ない攻撃のためである。更に、１〜５％の死亡率は、最良の移植センター でさえも記録されている。薬物が免疫応答を制御し、移植片拒絶を妨げるために 一般的に用いられ、死亡は、しばしば、この薬物投与の間接的な結果となる。

免疫応答を制御するために用いられる薬物は、通常、免疫系の非特異的抑制を起 こす。免疫系を抑制された患者は、かなり感染しやすくなり、生命危機をもたら す感染及び種々の新形成（ネオブラジア）を起こす。長期成功の低い率並びに感 染及び癌の深刻なリスクは、組織及び器官移植の全領域に将に直面する２つの主 な挑戦である。

移植片拒絶が、移植細胞の表面上に発現されたＨＬＡ抗原のレベルの減少によっ て、妨げられ又は減少することが示唆されている。ファウストマン（Ｆａｕｓｔ ｍａｎ）。

Ｄ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５２：１７００−１７０２は、異種 移植片の生き残りが、ＨＬＡクラスＩ抗原又は組織特異性エピトープに対するＦ （ａｂ’）ｔ　抗体フラグメントでＨＬＡクラス■表面抗原を覆うことによって 増加することを観察した。

本発明は、１以上のＨＬＡ抗原において減少している“普遍性ドナー細胞２の開 発を意図するものである。所定のＨＬＡ抗原を、ドナー細胞、これらの細胞を含 む組織若しくは器官の表面上に欠くことは、それらを外来物として認識されない こと、及び拒絶反応を引き出さないことをもたらす。抗遺伝子コード物を細胞へ 選択的に導入することによって、標的ＨＬＡ遺伝子の発現を遮断することが可能 であり、それによって移植片を免疫系に対して“見えなく”する。従って、拒絶 の問題は、免疫系の非特異的な抑制を伴うことな（除去され、免疫系は活性を維 持して感染及びネオブラジアに対して防御する。

発明の概要 抗原除去／減少細胞を移植するための優れた方法がここに示されている。本発明 に従って、細胞の抗原性を減少させるオリゴヌクレオチドが、移植抗原に関連し たヌクレオチド配列に、ある様式で結合して該抗原の発現を妨げることができる ように設計される。これらのオリゴヌクレオチドで処理された細胞は、標的抗原 の発現をかなり減らし、移植された場合には、レシピエンド宿主によってより容 易に寛容になるであろう。これらのオリゴヌクレオチドは移植抗原ヌクレオチド 配列に対して結合できるように設計されるが、それの作用の基本的なモードは異 なり得ることが意図される。

本発明は、移植可能な細胞の改良された供給源を医者に提供する。これらの移植 抗原除去細胞は、レシピエンドにおける改良された移植片の生き残り率を上げ、 又はレシピエンドにおける免疫抑制剤投与の要求を低いレベルにする。これらの 細胞は、また、自己免疫疾患を伴う患者の治療においても有効となり得る。

ある態様では、本発明は、移植抗原除去細胞を標的細胞から作製する方法を提供 し、これは、標的細胞を得ること、及びその後に標的細胞を移植抗原ヌクレオチ ド配列に結合することができるオリゴヌクレオチドに暴露することを含み、ここ で、該オリゴヌクレオチドは、標的細胞を移植抗原除去細胞にするために十分な 量で局所的に与えられ又は生成される。該オリゴヌクレオチドは、ワトランーク リック又はトリプレックス結合法則（フーグスティーン様結合を含む）に従って 、該ヌクレオチド配列に結合することができる。好ましい具体例では、この移植 抗原はＭＨＣクラスＩ又は］Ｉ抗原である。

本発明の他の態様では、移植抗原除去細胞が提供され、これは、標的細胞を得て 、該標的細胞を移植抗原ヌクレオチド配列に結合することができるオリゴヌクレ オチドに暴露することによって製造され、ここで、該オリゴヌクレオチドは、該 標的細胞を移植抗原除去細胞にするために十分な量で局所的に与えられ又は生成 される。

本発明の更に他の態様では、二重鎖移植抗原ヌクレオチド配列に結合することが できるオリゴヌクレオチドが提供される。

本発明の更に他の態様では、普遍性ドナー器官が提供され、これは、標的器官を 患者から得ること、及び移植抗原ヌクレオチド配列に結合することができるオリ ゴヌクレオチドに該標的器官を暴露することによって製造され、ここで、該オリ ゴヌクレオチドは、該標的器官を普遍性ドナー器官にするために十分な量で局所 的に与えられ又は生成される。

本発明の更に他の態様では、移植抗原の機能不全な発現によって特徴付けられる 自己免疫疾患を伴う患者を治療する方法が提供され、これは、該患者に対して、 移植抗原ヌクレオチド配列の一部に結合することができるオリゴヌクレオチドを 、該移植抗原の発現を阻害するために十分な量で投与することを含む。

図面の簡単な説明 図１は、ＤＲＡプロモーターのＸ及びＸ、ボックスのＤＮＡ配列及び、トリプレ ックス形成オリゴヌクレオチドＴ１及びＴ、の構造及び結合パターンを示す。

図２は、γ−インターフェロン及び種々の量のＴ、と共にインキュベートされ、 それから抗ＤＲモノクローナル抗体で標識化されたＨｅＬａ細胞の蛍光分布を示 す。

図３は、γ−インターフェロン及び種々の量のＴ、と共にインキュベートされ、 それから抗ＤＰモノクローナル抗体で標識化されたＨｅＬａ細胞の蛍光分布を示 す。

図４は、センスＤＲＡのｍＲＮＡに特異的に結合するアンチセンスＲＮＡプロー ブを用いたノザンプロット解析である。細胞は、表示された処理による３日及び ７日でプロットされた（Ｃ，Ｏ，は対照オリゴヌクレオチドを表す）。

図５は、種々の移植抗原におけるＸ及びＸ、プロモーター領域のヌクレオチド配 列を含む。

図６（ａ）は、対照物抗体（マウスＩｇＧ＊）及び抗ＤＲモノクローナル抗体と 共にインキュベートされたγ−インターフェロン誘導Ｃｏ１ｏ３８細胞の蛍光分 布を示す。

図６（ｂ）は、（ａ）未処理、（ｂ）５０ＢＭのオリゴＡ、又は（ｃ）１００μ ＭのオリゴＡで処理され、その後、抗ＤＲモノクローナル抗体と共にインキュベ ート・されたγ−インターフェロン誘導Ｃｏ１ｏ３８細胞の蛍光分布を示す。

図６（ｃ）は、（ａ）未処理、又は（ｂ）５０ＢＭの対照物オリゴＡｌで処理さ れ、その後、抗ＤＲモノクローナル抗体と共にインキュベートされたγ−インタ ーフェロン誘導Ｃｏ１ｏ３８細胞の蛍光分布を示す。

図７は、γ−インターフェロン及び種々の量のＴＳＩと共にインキュベートされ 、その後、抗ＤＲモノクローナル抗体フルオレセインで標識化されたＨｅＬａ細 胞のフローサイトメトリーによる蛍光分布を示す。

図８は、ＨｅＬａ細胞に影響する場合のＴＳＩの濃度の関数としての、細胞表面 ＤＲ抗原の投与量応答パーセント抑制を示す。

図９は、ＨｅＬａ細胞におけるＴＳＩ効果の持続を示す。

図１０ａは、本質的ＤＲＣｏ１ｏ３８細胞におけるＴＳＩの効果を示す。図１０ ｂは、図１０ａに示されたデータの蛍光軸に沿った累積積分である。

図１１は、ＩＦＮ−γによるＭＨＣクラスＩ抗原発現の誘導における、アンチセ ンスオリゴヌクレオチドＡＮＴＩ−Ｂ、ＡＢ、ＡＣＡＴ、ＡＴＣＴ及びＴ２の効 果を示す捧グラフである。

図１２は、ＩＦＮ−γ仲介促進トリプトファン分解におけるＴ２及びＡ、の効果 を示すグラフである。

図１３は、キヌレニン生成におけるオリゴヌクレオチドＴ、及びＡ！の効果を示 すグラフである。

図１４は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γによるＨＬＡクラスＩ誘導に おけるＴ、の効果を示す捧グラフである。

［Ｎ＋５１；！、ＷＥＨＩ−３ｍ胎胞中７）ＴＦＮ−７誘導ＭＨＣ−Ｉｌｌ：、 おけるＴ２（７）効果を示す棒グラフである。

図１６八及び１６Ｂは、各々、ＩＦＮ−７及びＴＮＦ−ａ誘導ＩＣＡＭ−１細胞 表面発現におけるＴ２の効果を示すグラフである。

図１７は、ヒト単球の抗原誘導増殖におけるＴ２の効果を示すグラフである。

図１８は、ＩＬ−２産土アツセイを用いたＴ細胞活性化におけるＴ、の効果を示 すグラフである。

発明の詳細な説明 本発明の実施は、化学、分子生物学、生化学、タンパク質化学及び組み換えＤＮ Ａ技術の慣用技術に関係し、これらは、当業の技術範囲内である。このような技 術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅ　５ｙｔｈｅｓｉｓ　（Ｍ、　Ｊ、ガイド（Ｇａｉｔ）ら編、＋９８４） 　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（Ｂ、　Ｄ、 バーメス（Ｈａｍｅｓ）とＳ、　Ｊ、ヒギンス（）ｌｉｇｇｉｎｓ）編、１９８ ４）　；サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッシュ（Ｐｒｉｔｓｃｈ）と マニアティスＱｌａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）　；　ＰＣＲ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＹ　（Ｈ，Ａ、アーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）編、ストックト ンプレス）；Ｒ，に、スコープ（Ｓｃｏｐｅ）　、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｒｉｃｅ　（スブリン ガーバーリック）：及び、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＩＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシ リーズ（Ｓ、クロウイック（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ）とＮ、カブラン（Ｋａｐｌａｎ ）編、アカデミツクブレス社）を参照のこと。

本文中で言及される全ての特許、特許出願及び公報は、前述のものでも後述のも のでも、その開示の全てを援用して本文の記載の一部とする。

定義： 本文中で用いられる場合、“移植抗原”とは、移植の時及び移植後のある時点の いずれかにおいて、移植される細胞の細胞表面上に発現されている抗原性分子を 意味するために用いられる。一般に、これらの抗原性分子はタンパク質及び糖タ ンパク質である。−次移植抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＢＣ）の産物であ り、ヒトにおいて第６染色体上に位置する。ヒトＭＨＣ複合体は、また、ヒト白 血球抗原（ＨＬＡ）複合体とも呼ばれる。ＭＨＣ抗原は、ＭＨＣクラスＩ抗原（ ヒトの場合、このクラスにはＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及び−〇抗原が含まれる）とＭＨ Ｃクラス］ｌ抗原（ヒトの場合、このクラスにはＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ及び−Ｄ Ｒ抗原が含まれる）とに分けられる。移植抗原はまた、ＭＨＣクラス！及びＩＩ 抗原以外の細胞表面分子も包含する。これらの抗原には、下記のものが含まれる ：（１）血液細胞認識に関係するＡＢＯ抗原；　（２）細胞接着分子例えばＩＣ ＡＭであり、これは白血球細胞−細胞認識に関連する；及び（３）β２−ミクロ グロブリン、これはＨＬＡ−１抗原を含む４４ｋｄ重鎮ポリペプチドに会合する ポリペプチドであるが、ＭＨＣ複合体によってコードされていない。

本文中で用いられる場合、“移植抗原ヌクレオチド配列”とは、移植抗原をコー ドする遺伝子に関連したヌクレオチド配列を意味する。遺伝子の関連したヌクレ オチド配列には、イントロンとエクソン領域を含む構造産物をコードする遺伝子 の領域と、転写、転写開始、翻訳開始、オペレーター及びプロモーター領域、リ ポソーム結合領域に関連した構造遺伝子の上流領域と、停止部位を含む該構造遺 伝子の下流領域とが含まれる。遺伝子に関連したヌクレオチド配列はまた、該遺 伝子から誘導されるメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の全ての形態テ見出さ れ、これには、プレｍＲＮＡ、スプライスされたｍＲＮＡ及びポリアデニル化ｍ ＲＮＡが含まれる。

本文中において用いられる場合、“移植抗原除去細胞″とは、ある方法で少なく とも１つの移植抗原の発現が除去されている細胞を意味する。この除去は、全て の時点で細胞表面上に存在する抗原の量を下げることによって作製され得る。

好ましくは、少な（とも９０％の抗原が細胞表面から除去される。最も好ましく は、この除去が細胞表面における基本的に全ての抗原の欠落をもたらす。

所定の移植抗原は、常に細胞表面上に本質的に発現している訳ではない。これら の抗原は、移植後短時間で、その発現を増加する。これらの場合、この除去は、 正常に増加される発現の移植後の時点において、細胞表面で抗原の量の減少又は 完全な欠落によって明らかにされる。

移植抗原除去細胞は、下記２つの特性の内の少なくとも１つを有する＝　（１） 該細胞は、正常細胞よりもかなり長い期間、移植レシピエンド中で生き残る；又 は（２）該細胞は、正常又は未処理細胞と同じ期間、移植レシピエンド中で生き 残るが、移植レシピエンドに対するより低い量の免疫抑制剤を要する。

本文中で用いられる場合、　“オリゴマー”又は“オリゴヌクレオチド”には、 単−鎖及びデュプレックス（二重）形態のいずれかの１以上のヌクレオチドのＲ ＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列が含まれる。”核酸“とは、 本文中で用いられる場合、単−鎖又はデュプレックス形態での如何なる長さのＲ ＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列をも意味する。

本文中で用いられる場合、”結合”とは、オリゴヌクレオチドと標的移植抗原ヌ クレオチド配列との間での、水素結合又は他の分子間力によって仲介される相互 作用又は複合化を意味する。本文中で用いられる場合、“結合”とは、塩基−塩 基水素結合により仲介される２つの型のヌクレオチド間結合を、より特別に意味 する。結合の第１の型は、“ワトランークリック型′結合相互作用であり、ここ では、アデニン−チミン（又はアデニン−ウラシル）並びにグアニン−シトシン 塩基対が該塩基間の水素結合を通して形成される。この型の結合の例には、ＤＮ Ａ二重らせんに関連した伝統的な結合がある。

結合の第２の型は、　“トリプレックス（三重）結合”であり、これは、既に発 生した結合法則の対に続（。一般に、トリプレックス結合は、既にワトランーク リック様式で対になっているデュプレックスＤＮＡ　（又はＤＮＡ−ＲＮＡハイ ブリッド）と第３のオリゴヌクレオチド鎖との全ての型の塩基−塩基水素結合を 意味する。トリプレックス結合は、ＰＣＴ出願第Ｗ０　９０／１５８８４号（１ ９９０年１２月２７日公開）中でより十分に開示されている。ある１組のトリプ レックス結合法則において、第３の鎖は、１つのデュプレックス鎖中のＡ又はＴ 各々とＴと、並びにＣ又はＧ各々とＣとが適合するように設計され、第３の鎖が 適合鎖に対して逆平行に走る。トリプレックス法則の他の組では、第３の鎖が１ つのデュプレックス鎖中のＡ又はＴ各々とＴと、並びにＣ又はＧ各々とＧとが適 合するように設計され、また、適合した鎖に対して逆平行に走る。トリプレック ス結合法則の他の型は、ＰＣＴ出願第Ｗ０　９０／１５８８４号に開示されてい る。

トリプレックス結合の１以上の型が、所定のオリゴヌクレオチドにおいて起こり 得る。

本文中で用いられる場合、フーグスティーン様結合は塩基間の水素結合を意味す る。

オリゴヌクレオチド 本発明によれば、オリゴヌクレオチドは移植抗原ヌクレオチド配列に対して結合 てきるように合成される。結合は、オリゴヌクレオチドと単一鎖配列との間でワ トランークリック型結合によって、又はオリゴヌクレオチドとデュプレックス配 列との間でトリプレックス結合によって生じ得る。いずれの場合にも、結合能は 、移植後のある時点において少なくとも１つの移植抗原の発現を減じている移植 抗原除去細胞中にもたらされる。

種々の移植抗原の構造及び調節領域間の交互反応性及びホモロジーがあり得るこ とが期待されるので、処理された細胞中で結局除去される移植抗原が、元々標的 にされたヌクレオチド配列を有する抗原と異なり得ることも期待される。

ある特定の標的配列は、よく特徴付けされているＤＲＡプロモーター領域である 。ＤＲＡプロモーター領域には、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合部位 として知られている幾つかのサブ領域、Ｊ、　Ｗ、　Ｘ　（Ｘ＋及びＸ！を含む ）及びＹボックスと呼ばれているものと、γ−インターフェロン応答成分とが含 まれる。特に重要なのは、本文中で記載されるように、Ｘ及びＸ２ボツクスであ る。

他の特定標的配列は、構造遺伝子の内部にある。

一般に、最少で約５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドが、 構造遺伝子のイントロン領域内部の特定標的配列に対する必要な結合を生じるた めに必要である。構造遺伝子領域を標的とすることによって、細胞当たり２つの 標的ＤＮＡ配列のみが、このオリゴヌクレオチドによって結合されるために要求 される。更に、オリゴヌクレオチドの短い鎖（約２６ヌクレオチド以下）が細胞 によって容易に取り込まれる。本発明の標的／オリゴヌクレオチド複合体の必要 な結合の長さにおける明らかな制限だけが、十分な結合長さのオリゴヌクレオチ ドを標的移植抗原配列に対する結合できるようにし、他の望ましくない非標的配 列に対して結合せず、他の細胞性機構を遮断しないことに関係する。１５ヌクレ オチドより短いオリゴヌクレオチド配列は、明らかな相互作用が得られることが できるならば、実行可能となり得る。

以下に更に説明すれば、オリゴヌクレオチドは、配列授与の特異性（ｓｅｑｕｅ ｎｃｅ−ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を含むことが必要で あるが、フランキング領域によって延長され、その他、誘導若しくは改変され得 る。オリゴヌクレオチドは、全ての既知の方法によって製造され得、これには、 合成、組み換え及び精製方法が含まれ、単独で、又は同−若しくは異なる標的移 植抗原に対して特異的な他のオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いられ得る。

オリゴヌクレオチドは、また“内部フランキング配列”も含み得、これは、標的 に対してワトランークリック又はトリプレックス結合法則によって結合すること かできない結合配列内部の配列である。従って、オリゴヌクレオチドは、非結合 内部フランキング配列によって分離している２以上の結合領域を含み得る。結合 配列は、結合法則に従わない１以上のミスマツチを含み得ることが期待される。

これらの置換は、オリゴヌクレオチドが本文中で記述される結合能を維持する限 りは、本発明の一部として意図される。

オリゴヌクレオチドは、またＰＣＲによって増幅され得る。ＰＣＲ方法は、この 分野てはよく知られており、例えば米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４ ．６８３，２０２号並びにサイキ、　Ｒ，Ｋ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８ ）２３９＋４８７−４９１．並びに、欧州特許出願第８６３０２２９８．４号、 同第８６３０２２９９．２号及び同第８７３００２０３．４号と、λ１ｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＹ　（１９８７）　１５５：３３５−３５０に 記載されている。その後、増幅されたＤＮＡは、慣用の技術を用いて本来の単鎖 又はデュプレックス形態で、ＤＮＡ又はＲＮＡとして回収され得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、通常、天然由来塩基、糖及びホスホジエステル 結合から構成される。しかし、糖に元々存在する全ての水酸基がホスホネート基 、ホスフェート基によって置換され、標準的な保護基によって保護され、又は活 性化して追加ヌクレオチドに対する追加結合を製造し得、又は固体支持体に結合 され得る。５′及び３′末端のＯＨ基は、通常、フリー（無置換）であるが、ホ スホリル化又はアミン若しくは炭素原子１〜２０の有機キャッピング基部分と置 換し得る。他の水酸基は、また誘導されて標準的な保護基にされ得る。

１以上のホスホジエステル結合は他の結合基によって置換され得る。これらの他 の結合基には、ホスフェートが、Ｐ　（０）　Ｓ　（“チオエート”）、Ｐ（Ｓ ）Ｓ（”ジチオエート”　）、Ｐ　（０）ＮＲ２（“アミデービ）、Ｐ（０）Ｒ ＳＰ（０）ＯＲ’　、Ｃｏ又はＣＨ２、（“フォルムアセターノヒ）、ここで式 中、各Ｒ又はＲ′は、独立してＨ又は、任意的にはエーテル（−０−）結合、ア リール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル若しくはアラルキル　 を含む置換若しくは無置換のアルキル（１〜２０Ｃ）であるものによって置換さ れる具体例が含まれるが、これに制限されない。オリゴマー中の全結合が同一で ある必要はない。

本発明には、合成手順も含まれ、ここで得られたオリゴヌクレオチドは、プリン 及びピリミジンのアナログ（類似）形態に組み込まれる。プリン及びピリジミン の“アナログ形態は、この分野では一般に知られているもので、その多くが化学 治療剤として用いられる。例示であり、完全なものでないリストには、アジリジ ニルシトシン、４−アセチルントシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラ シル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキン メチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イツペンテニルアデニン、ｌ− メチルアデニン、ｌ−メチルシュウドウラシル、■−メチルグアニン、ｌ−メチ ルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグア ニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７− メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル −２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅ ｏｓｉｎｅ）、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イツペンテニル アデニン、ウラツルー５−オキシ酢酸メチルエステル、シコウドゥラシル、フェ オシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル 、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−ペ ンチニルウラシル及び２，６−ジアミツブリンが含まれる。デオキシリボ核酸中 のチミンに対する置換塩基としてのウラシル（以下、“ｄＵ”と表す）の使用は 、本発明において、ピリミジンの“アナログ形態となるように考慮される。

オリゴヌクレオチドは、リボース又はデオキシリボース糖類のアナログ形態を含 み得、これはこの分野において一般に知られている。例示であり、完全でないリ ストには、２′置換糖類例えば２′−〇−メチルー１２′−〇−アリル、２′− フルオロ−又は２′−アジドリポース、環状炭素糖アナログ（ｃａｒｂｏｃｙｃ ｌｉｃ　ｓｕｇａｒａ口ａｌｏｇｓ）　、α−アノマー糖、エピマー糖例えばア ラビノース、キシロース又はライクソース、ピラノース糖、フラノース糖、セド ヘプツロース、非環式アナログ及び非塩基性ヌクレオシドアナログ例えばメチル リボサイドが含まれる。

慣用の糖及び塩基が本発明の方法の適用において用いられるが、糖類、プリン及 びピリミジンのアナログ形態物の置換は、ポリアミド骨格のような他の骨格構造 が有効となることができるように、最終産物の設計に有利となることができる。

本発明の方法を通して認識される設計された結合配列を含むオリゴヌクレオチド は、また、種々のやり方で誘導されることができる。まず、オリゴヌクレオチド は、核への標的送達を改良するための核局在シグナルを、それに付着することに よって誘導され得る。あるよく特徴付けされた核局在シグナルは、７ペプチドＰ ＫＫＫＲＫＶ　（ｐｒｏ−１ｙｓ−１ｙｓ−１ｙｓ−ａｒｇ−１７ｓ−ｖａ　１ ）である。また、オリゴヌクレオチドが標的基質の分離に用いられるためのもの である場合、通常、オリゴヌクレオチドは固体支持体へ誘導されてクロマトグラ フィー分離を可能にする。オリゴヌクレオチドが標的物を標識化するために又は その他、検出可能な部分を標的に付着するために用いられるものである場合、オ リゴヌクレオチドは放射性核種、蛍光分子、発色団等を含むように誘導される。

オリゴヌクレオチドが特異的結合アッセイに用いられるものである場合、固体支 持体又は検出可能標識へのカップリングも、また望ましい。治療薬的に用いられ るものである場合、オリゴヌクレオチドは、特定細胞部位へターゲティングをも たらす又は細胞性バリアの通過をより容易にするリガンド、治療効果を目的とし た毒性部分、又は標的部位で所望の機能を発揮する酵素活性物を含むように誘導 され得る。

標的部位でオリゴヌクレオチドによって実施され得る所望の機能の１つは、標的 ＤＮＡの変更である。オリゴヌクレオチドは、標的配列に付着するように、標的 配列と架橋（例えばブソラレン架橋を経て）するように、又は標的配列の全部若 しくは一部を変更、改変若しくは欠落するように誘導され得る。この方法では、 オリゴヌクレオチドは、細胞及びその娘細胞上で移植抗原の永久的な欠如を起こ し得る。

オリゴヌクレオチド配列は、また、所望のオリゴヌクレオチドのｉｎ　５ｉｔｕ 生成をもたらす適当な発現系内に含まれ得る。

互告二 本発明によれば、上述のオリゴヌクレオチドは、移植抗原除去細胞を正常標的細 胞から作製する処理方法において用いられる。該細胞は、１以上の上述のオリゴ ヌクレオチドと共に、核酸を採取する標準的な条件下での細胞のインキュベーシ ョンにより創生され、これにはエレクトロポレーション又はリボフエクションが 含まれる。

或いは、オリゴヌクレオチドは、核への標的送達（デリバリ−）のために、改変 又は共同投与されることができる。細胞核は、本発明のトリプレックス形成すリ ボヌクレオチドの作用のための適当に好ましい部位であり、それはこの位置で細 胞性転写及び複製機構が起こるためである。また、改良されたオリゴヌクレオチ ド安定性が核内に期待され、これは以下のためである：　（１）低レベルのＤＮ アーゼ及びＲＮアーゼ；　（２）全体積が低いための高いオリゴヌクレオチド濃 度；（３）これらのオリゴヌクレオチドの作用の機構に関係があるキー酵素例え ばＲＮＮアーゼの高い濃度。しかし細胞質は、本発明の伝統的なアンチセンスオ リゴヌクレオチドの作用のために適当に好ましい部位である。

核輸送の第１の経路は、核小孔である。従って、標的送達は、核局在化シグナル を付着することによりオリゴヌクレオチドを誘導して達成されることができる。

よく特徴付けされた核局在化シグナルの１つは、７ペプチドＰＫＫＫＲＫＶ　（ ｐｒｏ−１ｙｓ−１ｙｓ−Ｉｙｓ−ａｒｇ−１７ｓ−ｖａｌ）である。

全ての移植可能な細胞型は、本発明の潜在的標的細胞となる。好ましくは、標的 細胞は、角膜内皮細胞、甲状腺細胞、甲状腺傍細胞、脳細胞、副腎細胞、骨髄細 胞、膵臓高細胞、肝細胞、リンパ系細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、軟骨細胞、内 分ｉＱ細胞、腎細胞、心筋細胞、及び毛包細胞から選択される。より好ましくは 、標的細胞は、角膜内皮細胞、甲状腺細胞、甲状腺傍細胞、脳細胞、副腎細胞、 骨髄細胞、膵臓高細胞及び肝細胞から選択される。

本発明の他の態様では、上述のオリゴヌクレオチドは、発現ベクターへこの分野 でよく知られている方法によって組み込まれ、その後、標準技術例えばエレクト ロポレーシヨン、リポフェクション又はリン酸カルシウム又はカルシウム塩仲介 を通して標的細胞へ挿入され得る。この方法では、所望のオリゴヌクレオチドは 、発現ベクターによってｉｎ　５ｉｔｕで生成され、標的細胞は、少なくとも後 続の移植期間、該オリゴヌクレオチドを発現し続ける。

更に、本発明は、固体器官移植の分野に適用可能である。器官は、通常、移植の 前にｅｘ　ｖｉｖｏで潅流される。特定量の上述のオリゴヌクレオチドを潅流媒 質へ添加することによって、移植抗原除去細胞は、器官中で潅流許容細胞がら創 生されて、固体器官移植に有用な移植抗原除去器官を創生ずることができる。

最後に、抗遺伝子オリゴヌクレオチドを移植後第１８目の間に移植器官へ、直接 、局部投与することは、本発明の範囲内である。また、これらの薬剤の持続放出 も、また意図されている。

治療及び投与方法 本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の移植抗原除去細胞を創生することにお いて有用である。その後、これらの細胞は、直接的に患者へ移植される。この技 術は、免疫系を有する患者に対して用いられることができ、これにはヒトが含ま れる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、また、移植抗原の機能不全即ち異常な発現によ って特徴付けられる自己免疫疾患を治療することにおいて有用である。このよう な場合では、本文中で記載されたオリゴヌクレオチドは、移植抗原の発現を阻害 するために十分な量で投与され得る。

本発明のオリゴヌクレオチドが１以上の移植抗原の生成を干渉する又は阻害する ことによる機構は、通常確立されていないと、コメントし得るが、これは本発明 の一部ではない。本発明のオリゴヌクレオチドは、その結合の機構又はその効果 の機構に拘らず、特定標的ヌクレオチドに対する結合能によって特徴付けられる 。

本発明の実施例を下記に記述し、これは、説明のために提供されるもので、本発 明の範囲を制限するためではない。この開示内容を考慮すれば、クレームの範囲 内の多くの具体例が、通常の当業者には明らかとなるであろう。

ＨｅＬａ　Ｓ３細胞（ヒト子宮頚癌細胞株　ＡＴＣＣＣＣＬ２．２）、Ｋ５６２ 細胞株（ＵＣＳＦ　細胞培養施設）及びＢＪＡＢ細胞代細胞シトリンパ芽球系細 胞株３Ｆ細胞培養施設）並びにＣｏ１ｏ３８　（ヒト子宮頚癌細胞株）を、６５ °Ｃ３０分間加熱不活化済ｌｏ％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ　１６４ ０培地（ギブコ）中で成育させる。繊維芽細胞１４３Ｂ細胞（ヒト骨肉腫細胞株 、ＡＴＣＣ／ｃ　ｒ　Ｉ　８３０３）を、６５℃３０分間加熱不活化済１０％ウ シ胎仔血清添加ＭＥＭイーグルＢＳＳ培地（ＵＣ３Ｆ細胞培養施設）中で成育さ せる。

オリゴヌクレオチド設計 １９ヌクレオチドから成るホスホジエステルオリゴヌクレオチドＡを、翻訳開始 コドン（ＡＵＧ）の上流（５′）側の１３ヌクレオチドで始まり、ＤＲＡ構造遺 伝子のｍＲＮ塩基配列に対するワトランークリック方式の塩基対となるように設 計し、 八：　５’　ＧＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＧ　３’これは、ＵＣＦＳ 生体分子貯蓄施設から取り寄せた。２つの調節ホスホジエステルオリゴヌクレオ チド（八１及びＡ２）は、上述と同一塩基組成のランダム配列からなるが、ＤＲ Ａ　ｍＲＮ八と結合しないもので、これもまた、貯蓄施設から取り寄せた： ＡＩ　＋　５’　ＴＴＧＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＧＴＣＣＣＡ　３’Ａ２：　５１ 　ＴＡＴＣＧＧＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴ　３’トリプレツクス形成オリゴヌ クレオチド（ＴＦＯｓ）を、ＨＬＡ　ＤＲＡのＸ及びＸ２ボツクスプロモーター に適合するように設計した。Ｔ、、Ｔ、、Ｔ。

Ｃ及びＴ、をアメリカン・シンセシス社から取り寄せた。Ｔ、　、　’ｒ＊及び Ｔ、Ｃは、図１に示される式に従って設計された。Ｔ１は、デュプレックス中の 各ＧＣ塩基対と適合するＣと、各ＡＴ対と適合するＴとを有するように設計され た。Ｔ２は、デュプレックス中の各ＧＣ塩基対と適合するＧと、各ＡＴ対と適合 するＴとを存するように設計された。Ｔ１及びＴ、は、３′アミノ基で改変され て、安定性を上げた。Ｔ２Ｃは、ＴｔＣか未改変である以外はＴ２と同一である 。Ｔ７は、Ｔ２及びＴ、Ｃと同じ全ヌクレオチド組成を有するが、Ｘ及びＸ２ボ ツクスと僅かにトリプレックス型対を有するように改変された配列を有する調節 オリゴヌクレオチドとして設計された− ７７　、　５’　ＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣ３’ ＡＩ及びＡ２は未改変オリゴヌクレオチド配列であり、このプロモーターとトリ プレックス構造を形成しない。

ＴＳＩは２６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、ホスホジエステル骨格 とアミン改変３′末端とから成る。ＴＳＩを、ＴＳＩと標的配列との間で形成さ れることができる最大数のフースグティーン結合を有するコード鎖に対して逆平 行となるように設計した。生理学条件下では、トリブレットとなるＧＧＣ及びＴ ＡＴの形成が好まれ、シャンベック（Ｓｃｈａｍｂｏｅｃｋ）、　Ａ、ら、Ｎｕ ｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、（１９８３）　１１：８６６３−８６７５に記載さ れた数として５’−８５１〜３’８７６の位置にある残基でＤＲＡ遺伝子の１つ のＤＮＡ鎖とトリプレックスらせんをもたらす。ＴＳｌは、デュプレックスＤＮ Ａのパリンドローム特性のために、平行及び逆平行のいずれにおいても結合する ことができる点で独特である。ＤＲＡ遺伝子が、患者間で単−形であるために選 択されて、それによって多形遺伝子において通常起こる遺伝子配列の変異性を最 少にする。ＴＳＩ配列を構築するための方法は、ＤＮＡ標的配列中のＣ又はＧ毎 にＣを、及びＡ又はＴ毎にＴを選択することであった。Ｔｅａｓ及びＧＴｅ、、 は、調節オリゴヌクレオチドであり、これも長さ２６ヌクレオチドであって、ア ミン改変３′末端を有する。該配列を、下記の構造遺伝子のＤＲＡイントロンの セグメントと比較する；ＤＲＡ・　５　’　−ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＴ 　ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＧＧ−３’Ｔ　Ｓ　ｌ　：　３　’　−Ｇ ＧＧ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＧＧ−５’ Ｔｃ、、　：　３　’　−ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＴＧＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　 ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴ−５’ＣＡＴｃ、、　：　３’　−ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＴＧ Ｔ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＴＧ−５’該オリゴヌクレオチ ドを、キーストーン・ラボラトリーズ（にｅｙｓｔｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）から得た。

オリゴヌクレオチドＡ、は、調節オリゴヌレオチドであって、ＨｅＬａ　Ｓ３細 胞におけるＩＦＮ−γ促進ＭＨＣ−１発現の比較的低い阻害能を示す。該オリゴ ヌクレオチドの末端でＸは、Ｔ２オリゴヌクレオチドについて解説した３′アミ ノリンカ−改変を示す。Ａ、の配列は、下記のとおりである。

Ａ、：　５’　ＴＴＧＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＧＴＣＣＣＡＸ　３’用いられる他 のオリゴヌクレオチドは、下記の通りである。オリゴヌクレオチドＣＬ　ｔはＨ ＬＡ−Ａ２のｍＲＮＡ中のへＴＧ部位に対するアンチセンスとなるように設計さ れた。オリゴヌクレオチドＡＮＴＩ−Ｂは、ＭＨＣ−１）ＩＬＡ−Ａ２プロモー ターのエンハンサ−Ａ領域中のＫＢＦ結合部位における１つの鎖と同一となるよ うに設計された。オリゴヌクレオチドＡＢは、ＭＭＣ−Ｉ　Ａ２遺伝子の５′領 域中のエンハンサ−Ｂｌ：指向する。八ＣＡＴは、ＭＨＣ−Ｉ　Ａ２遺伝子のＣ ＡＡＴボックスに指向する１８マーである。ＡＴＣＴは、ＴＡＴＡボックスのＭ ＨＣ−Ｉ　Ａ２等個物に指向する。これらのオリゴヌクレオチド及びＡ、オリゴ ヌクレオチドは、キーストーン・ラボラトリーズ、メンロパーク、カリフォルニ ア州、から購入した。これらのヌクレオチドの配列は下記のとおりである： ＣＬ　、：　５　’　ＡＧＧ　ＧＴＴ　ＣＧＧ　ＧＧＣＧＣＣＡＴＧ　ＡＣＧ　 ＧＣＸ　３　’ＡＮＴＩ−Ｂ：　５’ＣＣＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣ ＣＡＡＣＴＣＣＸ　３’Ａ　Ｂ　：　５　’　ＣＣＧ　ＡＣＡ　ＣＣＣＡＡＴ　 ＧＧＧ　ＡＧＴ　Ｘ　３　’ＡＣＡＴ：　５’ＣＧＡＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴ ＴＣＴ　３’ＡＴＣＴ：　５’ＴＧＣＧＴＧＣＧＧＡＣＴＴＴＡＧＡＡＸ　３’ 抗体 マウス抗ヒトＨＬへ−Ａ、Ｂ、Ｃ１抗β２ミクログロブリン及び対照１　ｇ　Ｇ 　２ｂ抗体を、フルオレセインイソチオシアネート結合物として、オリンパス（ Ｏ１ｙ＋ｎｐＵＳ）、レイクサクセス（Ｌａｋｅ　５ｕｃｃｅｓｓ）、ニューヨ ーク州、から購入した。マウス抗ＩＣＡＭ−１及びＩｇＧ＋抗体を、ＡＭＡＣ， ウェストブロック、メイン州から、フルオレセインイソチオシアネート結合物と して購入した。

オリゴヌクレオチド採取及びγ−インターフェロン添加オリゴヌクレオチドを、 オルランら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９９１）　＋９：３４３５− ３４４１に記述されているように細胞培地へ添加した。細胞を、まず２〜６×ｌ Ｏ“細胞／ｍｌの濃度にして、撞々の濃度（５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）のオ リゴヌクレオチドと共に、３０分毎に軽く振盪しながら２時間インキュベートし た。その後、細胞を、最適な細胞成育のために０．　２ｘｌＯ’　／ｍｌに希釈 した。１日目及び／又は２日目で、細胞を再び２〜６ＸＩＯ’約６ＸＩＯ’細胞 ／し、該オリゴヌクレオチドと共にインキュベートし、上述のように希釈した。

適切な場合には、γ−インターフェロン（ＩＦＮγ、フラボレイティブ・リサー チ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）社）を２００ユニット／ ｍｌで、０．２．４及び６日目に添加して、ＨＬＡ−ＤＲ発現を誘導した。

細胞表面ＨＬＡ検出 ３日目及び７日目に細胞を単離し、フルオレセインイソチオシアネート結合（Ｆ ＩＴＣ）抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体を用いて染色した。ＨＬＡ−ＤＰを 、マウス抗ＤＰモノクローナル抗体とその後のＦＩＴＣヤギ抗マウス（ベクトン ・ディッキンラン）とを用いた間接染色によって検出した。約０．　ｌＸｌ０’ の細胞をアッセイ当たり用いた。１０μｍのマウスＩｇＧｔ　−ＦＩＴＣをバッ クグラウンド対照物として用い、ｌＯμＩのモノクローナル抗ＤＲ−ＦＩＴＣ１ ｇＧ２を添加して細胞表面ＨＬＡ　ＤＲ発現を検出した。モノクローナル抗体は 、３０分間、氷上で細胞と共にインキュベートされた。その後、該混合物を、０ ゜１％アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、上演を遠心後に 除去し、ペレットを１５０ｍ１のＰＢＳと５０μｍの０．０５％ヨウ化プロピジ ウム中に再懸濁した。フローサイトメトリー解析（ＦＡＣ３ｃａｎ、ベクトン・ ディッキンラン）を用いて細胞表面抗原の発現を検出した。抗ＨＬＡ−ＤＰ特異 的モノクローナル抗体を用いた同様の手順を用いて表面ＨＬＡ−ＤＰ発現を測定 した。

ノザンハイブリダイゼーシコン及びＲＮＡ単離オリゴヌクレオチドで処理した約 ２ＸＩＯ’の細胞を、３日目及び７日目に単離した。該細胞を、冷ＰＢＳで洗浄 し、２００ｍ１の冷溶解緩衝液（０，５％のＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０，１５０ ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのトリスｐＨ８，０，２ｍＭのＭｇＣ１）中に再懸濁 した。細胞核を１５００Ｏｒｐｍ５分間の回転によって除去した。等量のタンパ ク質変性緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡ、４５０ｍＭのＮａＣ１，７Ｍの尿素、ｌ 　Ｏ’ｍＭのトリスｐＨ７，４，１％の５ＤＳ）を上清に添加した。得られた溶 液を等量のフェノール／クロロホルムで抽出し、水相はＯ，Ｉ容量の３Ｍの酢酸 ナトリウム（ｐＨ５’、２）及び２容量の１００％エタノールに移動した。該溶 液を一２０°Ｃに一晩維持した。上清を遠心後に除去し、ＲＮＡペレットを１ｍ ｌの７０％エタノールで洗浄した。その後、ＲＮＡを５０μｌのＴＥ緩衝液（１ ０ｍＭのトリスｐＨ７，４，１ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶解した。ＲＮＡ１１１度 を２６０ｎｍ　（ＯＤｔｕ＋　）での光学密度によって確認した。

ＤＲＡ遺伝子含有プラスミド（ＤＲＡ　ＰＢＳ　Ｍ２Ｓ）を、スクリップス・リ サーチ研究所のラース・カールソン（Ｌａｒｓ　Ｋａｒｌｓｓｏｎ）氏から得、 ＥｃｏＲＩと共にインキュベートすることによって直線化した。Ｔ３　ＲＮＡポ リメラーゼをＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びジゴキシゲン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ） 結合ＵＴＰと共に添加してＤＲＡ　ＲＮＡプローブに合成した。得られたアンチ センスＤＲＡ　ＲＮＡプローブを用いてセンスＤＲＡ　ｍＲＮＡを検出した。同 様の方法を用いて対照アンチセンスβアクチンＲＮＡプローブを作製した。

７〜１０μｇの調製ＲＮＡ抽出物を、１，２％アガロースホルムアルデヒドゲル で、ＲＮＡサイズマーカーと共に、１２５ボルトで５〜６時間かけて分離した。

ゲル中に分離されたＲＮＡをナイロン紙へ一晩プロットし、２時間８０″Ｃでペ イキングした。その後、数紙をプレハイブリダイズ溶液（ジ−ナスプロトコール ）中へ６〜８時間置き、アンチセンスＤＲＡ　ＲＮＡプローブ（ｌμｇ／＋＋＋ １）　及びアンチセンスβアクチンプローブと共に約４８時間、ハイブリダイズ した。抗ジゴキシゲンアルカリホスファターゼ結合モノクローナル抗体を、該プ ロットした紙に添加し、その後、Ｌｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０　（ベーリンガー マンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）にかけた。Ｌｕｍ１−Ｐ ｈｏｓ発光を、オートラジオグラフィによって検出した。

ＲＮアーゼプロテクションアッセイ ２２ｐリボプローブをマキシスクリプト（ＭａｘｉＳｃｒｉｐｔ）　ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ転写キット（アンピオン、オースチン、テキサス州）とα”Ｐ−ＵＴＰ　 （ＮＥＮ　デュポン、ボストン、マサチューセッツ州）を用いて作製した。ＲＮ Ａの解析をＲＮアーゼプロチクシコンアッセイキット（アンピオン、オースチン 、テキサス州）を用いて実施した。０，１６〜１．７７ｋｂのＲＮＡラダー（ギ ブコ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を、ウシ腸内アルカリホスファタ ーゼ（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、インディアナ州）を用い て脱リン酸化し、γコ！Ｐ−ＡＴＰ　（ＮＥＮデュポン、ボストン、マサチュー セッツ州）を用いてｌ１ｐｔ！ｌｉ識化して、ＲＮアーゼプロテクションアッセ イにおける分子量マーカーとして用いた。ＨｅＬａ　Ｓ３から単離したＲＮＡを 、ＨＬＡ−ＤＲＡ　ｍＲＮＡに対するハイブリダイズの後にＲＮアーゼ消化から プロテクト（保護）された１、２ｋｂフラグメントのＨＬＡ　ＤＲＡ遺伝子（ノ ザン解析で用いたものと同一フラグメント）プローブの対するアンチセンスであ り且っＴ３ポリメラーゼによって生成された”Ｐ−ＲＮＡプローブに、ハイブリ ダイズし、これを回収して、変性７％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した 。ＨｅＬａ　Ｓ３からの各ＲＮＡ試料を、Ｔ３ポリメラーゼによって生成され且 つグリセロアルデヒド−３−リン酸デバイドロゲナーゼ（ＧＰＤ）転写物（０， １４ｋｂ）に対するアンチセンスである３！Ｐリボプローブに、同時にハイブリ ダイズした。ＧＰＤプローブによるハイブリダイゼーションを用いて、ＲＮアー ゼプロテクションによって解析された試料中の開始縁ＲＮＡ量を比較した。

ＩＣＡＭ−１の検出 細胞上のＩＣＡＭ−１部位の存在を下記のようにして検出した。０．１ｍｌの細 胞及び反応剤を含有する試料を、各チューブから種々の時点で取り出し、抗ＩＣ ＡＭ−１抗体を用いてフローサイトメトリーのために染色した。細胞懸濁物を、 ０、　１％のアジ化ナトリウム及び２％ウシ胎仔血清を含むリン酸緩衝液（ＰＢ Ｓ）０．７５ｍ１で洗浄した。抗体結合物（１０μｇ）を添加して、該混合物を 攪拌した。細胞を３０分間、暗所中の氷上においてインキュベートして、０．　 １％アジ化ナトリウム含有ＰＢ３０．７５ｍ１で２回洗浄して、非結合抗体を除 去し、アジ化ナトリウム（０，１％）含有ＰＢＳＯ，１ｍｌに再懸濁した。ヨウ 化プロピジウムを添加して解析物から死細胞を排除した。ＩＣＡＭ−１部位の平 均数を、固定数のヤギ抗マウス部位を含むシンブリーセルラービーズ（フローサ イトメトリー・スタンダード社、リサーチトライアングル、Ｎ、Ｃ）上のＩＣＡ Ｍ−１抗体及びその同種Ｉ　ｇ　Ｇ　＋における蛍光対抗体（Ｆ／Ｐ）比をまず 検出することによって概算した。フローサイトメータを、ＱｉｃｋＣａｌビーズ （フローサイトメトリー・スタンダード社、リサーチトライアングル、ＮＣ）で 検量した。検量曲線を該Ｆ／Ｐ比と組み合わせて用いて、製造者の勧めに従って 、平均チャネル蛍光からＩＣＡＭ−１部位の平均数を計算した。

インドールアミン２．３ジオキシゲナーゼアツセイ細胞のインドールアミン２． ３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を、分光光度計アッセイを用いて計算した。ＩＤ Ｏは、トリプトファンをキヌレニンに変換する。

トリプトファンを、キヌレニンが実質的に吸収されない２８０ｎｍの最大吸光度 で測定した。キヌレニンは、トリプトファンが実質的に吸収されない３６０ｎｍ で測定した。

実施例１ ２つの２６塩基対（ｂｐ）のトリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯｓ ）を設計した。オリゴヌクレオチドＴ１を、各Ａ−Ｔｂｐに適合するためのＴ及 びＧ−Ｃｂｐに適合するためのＣを用いることによって設計した。オリゴヌクレ オチドＴ、を、各Ａ−Ｔｂｐに適合するためのＴ及びｃ−ｃｂｐに適合するため のＧを用いることによって設計した。各オリゴヌクレオチドを３′アミノ基で改 変して半減期を延ばした。各実験用ＨｅＬａ細胞又は繊維芽細胞１４３Ｂ細胞を 、２００ユニツトのりコンビナンドアーインターフェロンへ暴露する前に、Ｔｒ 　、Ｔｔ又はＴ、と共に２時間、前インキュベートして、リコンビナントγ−イ ンターフェロンを培養の０日目及び２日目に添加した。Ｔ１及びＴ、も、また１ 日目及び２日目に添加した。その後、ＤＲ発現の誘導を、該細胞表面上のＨＬＡ クラスＩｆ抗原と結合する抗ＤＲモノジローナル抗体を用いてフローサイトメト リーにより３日目に測定した。対照物ＴＦＯＴ７と共に培養した細胞がＨＬＡ− ＤＲ及びＤＰ抗原の正常な誘導を示したが、Ｔｒは、ＤＲ及びＤＰの発現を５０ ％まで阻害し、一方、Ｔ、は、２０μＭｌ１１度でＤＲ及びＤＰの両方で約１０ ０％の阻害を示した（図２〜３、Ｔ、のデータのみ）。低濃度のオリゴヌクレオ チド（５及び１０μＭ）では、Ｔ１及びＴ、は共に、濃度応答様式で阻害効果を 示した。

この阻害効果の機構を更に研究した。ＤＲＡ遺伝子の転写を、センスｍＲＮＡに 特異的に結合するアンチセンスＲＮＡプローブを用いて、ノザンプロット解析に より測定した（図４）。２０μＭの濃度で、Ｔ、は、３日目で測定されたＤＲＡ のｍＲＮＡ発現を完全に抑制した。この抑制は、７日目で示されたように該培養 物へγ−インターフェロンを続けて更に添加することによって可逆化した。

Ｔ、及びＴ２がγ−インターフェロン誘導ＨＬＡ　ＤＲ及びＤＰ発現を遮断する ことができる一方で、これらは本質的なりＲ発現に何の効果もなかった。これは 、共に本質的にＤＲを発現しているＢＪＡＢ　（Ｂリンパ芽球系）細胞及びＣ。

１ｏ３８　（悪性メラノーマ）細胞を５〜２０μＭのＴ、及び／又はＴ、を７日 まで継続して処理することによってもたらされる。細胞表面ＤＲの本質的な発現 における減少は、認められなかった。

Ｔ２の効果は、ＨＬＡ−ＤＲＡとホモロジーを共存するプロモーター配列に、や や特異的であるようだ（図５）。ＩＣＡＭ−１は、ＨｅＬａ細胞上に本質的に発 現されている接着分子であり、γ−インターフェロン処理によって増加されるこ とができる。Ｔ２は、ＩＣＡＭ発現の増加を遮断するが、本質的な発現を完全な 状態のままであり、ＨＬＡクラスＩ遺伝子の本質的及び誘導発現のいずれに対し ても効果がない。

上記の手順を、下記の点で違えて続け、アンチセンスヌクレオチドＡ並びに対照 ＡＩ及びＡ２を試験した。Ｃｏ１ｏ３８細胞を０．　１〜０．　３Ｘ１０＠細胞 ／ｍｌで前培養し、１〜１００μＭの濃度の種々のオリゴヌクレオチド（１日当 たり２回、約午前９時及び午後５時）と共に培養し、添加前の完全な排除を推定 した。

γ−インターフェロン（コラボラティブ・リサーチ社）を２００ユニット／ｍｌ で０日目及び２日目で添加して、ＤＲＡ発現を誘導し、該細胞を３日目でフロー サイトメトリーのために採取した。

結果を図６に示す。図６（ａ）は、γ−インターフェロン誘導細胞がＤＲ特異性 抗体によって特異的に結合されることを示す。図６（ｂ）は、添加されたオリゴ Ａの増加されたレベルが、特異的結合抗体の量を減少させることを示し、これは ＤＲＡ抗原の発現が減少したことを意味する。図６（ｃ）は、対照オリゴＡ１又 はＡ２の添加が、ＤＲＡ抗原発現を減少しないことを示す。

実施例３ オリゴヌクレオチドＴ、及びＴ１に対して用いられた上記手順を、下記の差異を 採用した以外は続けて、アンチセンスすりゴヌクレオチドＴＳＩ及び対照Ｔ１． 。

及びＧＴｃ、、を試験した。オリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ細胞の場合には３ 日目、他の細胞型の場合には５日目に培地に添加した。γ−インターフェロンを ０．２．４及び６日目にＨｅＬａ及びケラチノサイト細胞に添加した。Ｃ０１０ 細胞には、γ−インターフェロンを添加しなかった。ＴＳＩを、投与量応答実験 以外は毎日２０μＭで全細胞に添加し、投与ｉ応答実験では、ＴＳ１１！１度を ０．　１〜４０μＭまで変えた。

蛍光抗ＤＲＡモノクローナル抗体の結合によって示されるＴＳＩ投与量応答性が 図７に示されている。図８は、ＴＳＩに対するＨｅＬａ細胞の投与量応答と、対 照オリゴヌクレオチドＧＴｅ、、に対するものとを比較している。図７及び図８ の両方で示されるように、５μＭ及び１０ＰＭのレベルのＴＳＩは、ＤＲＡ抗原 の発現において、各々５０及び９０％より大きい阻害をもたらす。

ＨｅＬａ細胞中のＤＲへ発現のＴＳＩ阻害の持続期間を図９に示す。ＨｅＬａ細 胞を、０．２．４及び６日目において２００ユニット／ｍｌのγ−インターフェ ロンで処理した。２０ＰＭのＴＳＩ又はＧＴｅ、、を０．　１及び２日目で添加 した。３及び７日目において、細胞を抗ＤＲモノクローナル抗体−フルオレセイ ンで処理し、フローサイトメトリーで解析した。図９には、ＴＳＩが３日後及び ７日後にＤＲの表面発現を完全に抑制することが示されている。ＴＳＩの効果は 、培地から除去した後、少なくとも４日間維持される。オリゴヌクレオチドの除 去後に細胞がＤＲを再合成し始めるＴ、と異なり、ＴＳＩは、延長された継続効 果ををする。

Ｃｏ１ｏ３８細胞におけるＤＲ発現の本質的な発現におけるＴＳＩの効果も、実 験した。ＴＳＩ処理及びＴｃｏｎ処理細胞に対する抗ＤＲモノクローナル抗体− フルオレセインの結合の結果を図ＩＯに示す。図１０は、細胞をＴｃｏｎ　（ピ ークＢ）及びＴＳＩ（ピークＡ）て処理した場合のフローサイトメトリーのデー タを表している。ピークＢは、曲線への右ピーク高とピーク高が完全に一致する ように、数学的に変形している。ピークＣは、変形したピークＢをピーク八から 引いた数学的な結果物である。図１０ｂ（パーセント対蛍光）は、ピークＣの蛍 光軸に沿った累ｆｆ１分である。この図は、ＴＳＩが、影付けした部分によって 示される細胞の一部の細胞表面ＤＲ抗原の発現が減少していることを示す。影付 は部分は、下部の図中の積分曲線に基づいて約２０％の細胞を示す。ＴＳＩは、 本質的に発現しているＤＲ抗原に部分的に効果を有するが、この処理は、未だ最 適化されていない。

ＴＳｌの作用機構を更に調べるために、ＤＲＡ　ＲＮＡレベルを、未処理、ＴＳ Ｉ処理、及びＴｃｏｎ処理のＣｏ１ｏ細胞において測定した。ＲＮＡを、抽出し 、３２Ｐ−ＤＲＡプローブと共に、インキュベートした。該プローブを、スクリ ップス・リサーチ研究所のラース・カールソン氏から供与されたＤＲＡ遺伝子を 含有するプラスミド（ＤＲＡ　ＰＢＳ　Ｍ２Ｓ）から調製し、巳ｃｏＲＩとイン キュベートして直線化した。ＲＮアーゼプロテクションアッセイは２１頁で既に 記載した。

表１ 本質的なりＲＡ　ＲＮＡに対するＴＳＩ効果ＲＮアーゼプロテクションアッセイ ＣＰＵ　対照に対する％ Ｇ３ＰＤＨ（グリセロールアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）プローブを、 対照として用いて、各ゲルのレーンに流されたＲＮＡのレベルを測定した。ＲＮ Ａを、各レーンに不均等に流した場合、各プローブの標識化バンドを切り出して カウントすることができる。０３ＰＤＨ放射性活性の標準化は、ＤＲＡ　ＲＮＡ の大まかな比較を可能にする。表１は、ＤＲＡ結果物が０３ＰＤＨに対して標準 化された場合に、２０ＰＭのＴＳＩが、未処理又はＴｃｏｎ処理細胞と比較した とき、約５０％たけＤＲＡ　ＲＮＡレベルを減少させたことが示されている。

他のγ−インターフェロン遺伝子（ＩＦＮ−γ）に対するＴＳＩの相互反応性を 、ＨｅＬａ細胞において測定した。

嚢至 ＴＳＩ特異性−ＨＥＬΔ細胞 平均チャネルシフト（実施例一対照例）２０ＰＭＴＳ１　０　０　６３　１２５ ２０μＮ４　対照物　１９　７　１１９　１３（ＧＲｅ、。又はＴｅ、、　） 表２は、他のγ−インターフェロン遺伝子の対するＴＳＩの相互反応性を示して いる。ＴＳＩは、γ−インターフェロン誘導ＤＲ及びＤＰ発現を完全に抑制する 。ＴＳＩは、γ−インターフェロンＩＣＡＭ抑制を本質的発現のレベルにまで抑 制する。ＴＳＩが、本質的及びグーインターフェロン誘導の両方のＩＣＡＭ抗原 を減少するか否かは知られていない。ＴＳＩは、本質的及びグーインターフェロ ン誘導の両方のＨＬＡクラスＩ発現に対して殆と効果を持たない。

不死化細胞株ではなく　”正常な″初期細胞型であるケラチノサイトに対するＴ Ｓｌの効果も、評価した。

ケラチノサイトに対するＴＳＩ効果 ２０μＭ　Ｔｃ、、。　１１ 表３は、ＴＳＩがケラチノサイトにおいてγ−インクフエロン誘導ＤＲ抗原発現 を完全に抑制することを示している。Ｔｅ＠＠も同様の抑制を示す。

まとめると、これらの結果は、オリゴヌクレオチドＴ、を用いた初期研究と比較 して、ＴＳＩによる処理は、本質的に合成されるＨＬＡ　ＤＲＡ抗原の転写及び 発現を阻害することを示している。更にＴＳＩ効果は、Ｔｔのものよりもより長 い持続期間を有するようである。

実施例４ 上記の手順を続けて、ＭＨＣクラス■抗原のＩＦＮ−γによる誘導に対するアン チセンスヌクレオチドの効果を試験した。Ｋ５６２細胞を５００　Ｕ／ｍｌのＩ ＦＮ−γの添加前に２時間、下記オリゴヌクレオチド２５μＭで処理した：即ち 、ＡＮＴＩ−Ｂ、八Ｂ、八ＣＡＴ、ＡＴＣＴ及びＴ２である。■ＦＮ−γの添加 後２４．４８．７２及び９２時間で、新たなオリゴヌクレオチドを添加して、細 胞をＭＨＣ−１抗原の存在下１００時間で、抗体染色及びフローサイトメトリー によって解析した。図１１に示された結果は、試験されたアンチセンスヌクレオ チド全てが、ＩＦＮ−γによって、ＭＨＣクラス■抗原のアップレギュレーショ ンを阻害することができることを示している。

実施例５ ＩＦＮ−γの抗増殖及び抗腫瘍効果は、トリプロファン代謝経路中の酵素、イン ドールアミン２．３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の誘導によって、まず仲介され ると考えられる。（ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）とフェン（Ｐｅｎｇ）　、ＦＡＳ ＥＢ　Ｊ、、　５：２５１６　（１９９１））。ＩＦＮ−γ及びＩＤＯ誘導は、 拒絶を起こす腫瘍同種移植片において観察され、これは、代謝経路の活性化が移 植片拒絶に関連する１つの因子であり得ることを示唆する。（タキカワら、Ｊ、 　１ｍｍｕｎｏ１．１４５：１２４６　（１９９０）。

上述した手順を用いて、ＴＦＮ−γによるＩＤＯの誘導におけるオリゴヌクレオ チドＴ２の効果を調べた。０．２４及び４８時間で、ＲＰＭＩ　１６４０中のＨ ｅＬａ　Ｓ３細胞を、２時間３７°Ｃで２５μＭのオリゴヌクレオチドＴ２又は Ａ、（対照物）と共にインキュベートして、その後５００　Ｕ／ｍｌのＩＦＮ− γで刺激した。各々５Ｘ１０’細胞を含む２つの少量物を取り出した；】つは、 ハンクス調製塩類溶液（ＨＢＳＳ）に移し、他方は、５０μＭのし一トリプトフ ァン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を含有するＨＢＳＳに移した。Ａ １．。及びＡ。、測定を両方の試料からの上清に対して、途中で行った。

図１２は、トリプトファン分解のＩＦＮ−γ仲介促進におけるＴ２及びＡ、の効 果を示すグラフである。結果かられかるように、Ａ、ではなくＴ、は、ＴＦＮ− γにより誘導されるトリプトファン分解の割合の増加を阻害した。

ＩＤＯは、トリプトファンをキヌレニンに転換する。図１３に示された結果は、 トリプトファンにおける減少が、キヌレニンが吸収する波長である３６０ｎｍで 吸収される物質中の対応する増加によって達成されることを確認する。図１３は 、キヌレニン生成におけるオリゴヌクレオチドＴ、及びＡ、の効果を示すグラフ である。グラフかられかるように、Ａ、ではなくＴ、は、ＩＦＮ−γにより誘導 されるキヌレニン生成の割合の増加を阻害する。

実施例６ 上述の手順を用いて、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＦＮ−γによるＨＬＡクラ スＩ誘導におけるＴ、の効果を調べた。細胞を図１４に示されたインタフェロン 類と、並びに２５μＭのＴ２と共に又はオリゴヌクレオチドなしで（対照物）イ ンキュベートした。ＭＨＣクラス１抗原の量を、２つの抗体、重鎮に対するもの とβ２−ミクログロブリンに対するものとを用いた染色後にセルソーティングに よって測定した。結果かられかるように、図１４の棒グラフで、Ｔ、がＩＦＮ− γによる誘導を阻害することか示された。しかし、ＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βに よる誘導は阻害されない。図１４では、ＭＣ３は、平均チャネルシフトであり、 インターフェロンによって処理されていない細胞からの変化は、Ｙ軸にプロット されている。

実施例７ Ｔ２かγインターフェロンによるマウスＭＨＣクラス１］の誘導を妨げることを 以下に説明する。

マウスＭＨＣのプロモーター領域が、ヒトにおける同様物と大きな度合いのホモ ロジーを示すことが示されている。マウスＭＨＣクラス１１分子の発現における Ｔ２の効果を調べるために、我々は、骨髄単球細胞株ＷＥＨｉ３を用いた。ＢＡ ＬＢ／ｃマウス由来（Ｈ−２つであるこの細胞株は、ＭＨＣクラス１１分子（Ａ １、Ｅ’）をかなり低いレベル（４％）で発現している。しかし、Ａ４及びＥ４ 分子は共に、γ−インターフェロンによる７２時間処理後でこれらの細胞上に誘 導することができる。最終的に、ＷＥＨＩ−３上のγ−インターフェロン仲介Ｍ ＨＣクラス］］発現は、抗原特異様式でクラスＩＩ拘束Ｔ細胞増殖に対するこれ らの細胞の刺激能を回復する。ＷＥＨＩ−３を、オリゴヌクレオチドＴ２（最終 濃度、２５．５０．１００ｍＭ）と共に２時間、前インキュベーションし、その 後、γ−インターフェロン（＋　０００／ｍｌ）の存在下で４８時間、培養した 。その後、ＭＨＣクラスＩＩＡ’及びＥｌの細胞表面発現を、ＦＩＴＣ標識化抗 ＭＨＣクラス１１モノクローナル抗体（１−Ｅ’）による直接染色を用いてサイ トフルオロメトリー解析（ＦＡＣＳ）により測定した。図１５は、ＷＥＨＩ−３ 細胞における■ＦＮ−γ誘導ＭＨＣ−ＩｔにおけるＴ２の効果を示した棒グラフ である。この結果を、抗１−Ｅ’　ｍＡｂに対するチャネル数一対照１ｇＧ２ｍ Ａｂに対するチャネル数に相当する平均チャネルシフトとして示した。図１５で の結果かられかるように、Ｔ２は、ＷＥＨ１３細胞株上のマウスＭＨＣクラスＩ Ｉのγ−インターフェロンによる誘導を完全に排除した（９５％減少）。

ヒト主要組織適合性複合体（ＨＬＡ）座のプロモーター領域と共にトリプレック スらせんを形成するように設計されたオリゴヌクレオチド（Ｔ２）が、異なる細 胞（ＨｅＬａ、繊維芽細胞、ケラチノサイト）上のＨＬＡクラスＩＩ　（ＤＲ） 細胞表面分子のγ−インターフェロンによる誘導を阻害すると示されている（上 記参照）。他のγ−インターフェロン誘導免疫すセブターの表面発現におけるＴ ２の効果を調へた。

ＨｅＬａ細胞をオリゴヌクレオチドＴ２（２０μＭ）又は対照物オリゴヌクレオ チド（ＡＩ）と共に若しくは培地のみで２時間、前インキュベートした。その後 、細胞をγ−インターフェロン（５０Ｕ／ｍｌ）　（図１６Ａ）又は腫瘍壊死因 子（ＴＮＦ）　ａ　（１５０Ｕ／ｍｌ）　（図１６Ｂ）の存在下で異なる期間で 培養した。

この過程の後に、細胞をＦＩＴＣｆｆ識化抗ＩＣＡＭ−１を用いて染色し、サイ トフルオロメトリー（ＦＡＣＳ）によって解析した。結果は、抗１−Ｅ’　ｍＡ ｂに対するチャネル数一対照１ｇＧ２ｍＡｂに対するチャネル数に相当する平均 チャネルシフトとして示した。

図１６Ａでの結果かられかるように、接着分子ＩＣＡＭ−１のγ−インターフェ ロン誘導発現の完全な抑制か認められた。しかし、図１６Ｂかられかるように、 Ｔ２は、これらのヒト細胞におけるＴＮＦ−α仲介ＩＣＡＭ−１細胞表面発現に 効果がなかった。他の研究では、ＩＬ−１及びＩＬ−４仲介ＩＣＡＭ−１細胞表 面発現は共に効果がなかった。従って、我々は、オリゴヌクレオチドＴ２がγ− インターフェロン仲介機能に特異的であると結論付けた。

実施例９ 本実施例は、Ｔ２がＴ細胞増殖及びＩＬ−２生成をアクセサリ−細胞による抗原 提示を妨げるることによって阻害することを説明する。

他のγ−インターフェロン誘導免疫すセブターがＴ２によって抑制されるか、及 びこれがヒトＴ細胞応答に影響を与えるか、を調べた。より詳しくは、ｌ）ヒト 単球上のＦｃリセブターのγ−インターフェロン誘導発現におけるＴ２の影響、 及び、２）アクセサリ−機能例えば抗ＣＤ３仲介ヒトＴ細胞増殖を支持すること に対するＴ２処理単球の達成能、を調べた。

ヒトＴ細胞が、ＣＤ３複合体に向けられたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＯＫ Ｔ３）と共にインキュベートした場合に、刺激されて増殖することができること はよく確立されている。この効果を仲介するために、抗ＣＤ３ｍＡｂが、これら の細胞によるＩＬ−１産土を刺激するために、単球上のＦｃグリセタ−（ＦｃＲ ）に対するそのＦｃ部位を経てまず結合し、Ｔリンパ球上のＴＣＲ／ＣＤ３複合 体を凝集することが必要である。両方のシグナル（ＩＬ−１及びＣＤ３／ＴＣＲ 凝集）は、Ｔ細胞増殖及びＩＬ−２生成を引き起こすために必要である。γ−イ ンターフェロンは、ヒト単球上のＦｃＲの発現を調節する。単球上のＦｃＲのγ −インターフェロン仲介誘導は、応答体がない患者中のＩｇＧ１抗ＣＤ３（Ｌｅ ｕ−４、ＵＣＨＴ−１）仲介Ｔ細胞増殖を回復すると共にＩｇＧ２抗ＣＤ３（Ｏ ＫＴ３）仲介Ｔ細胞有基細胞分裂を促進する（Ｇ、ベニシュウ（Ｂｅｎ　１ｃｈ ｏｕ）ら、Ｅｕｒ、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、　１９８７．１７：１１７５−１１８ １）。

本研究では、この結果は図１７に示されており、ヒト単球は、ヒト末梢血単核細 胞（ＰＢＭＣ）による接着によって精製される。これらを、５μＭ〜５０μＭの 範囲の異なる最終濃度でのオリゴヌクレオチドＴ２の存在下で、又はオリゴヌク レオチドの非存在下（破線）で、前インキュベートした。その後、細胞を洗浄し 、４８時間で異なる濃度のγ−インターフェロンを用いて処理した。この過程の 後、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）の存在下で９６ウエル培養デイツ シユ中で４日間、単核細胞を異系末梢Ｔ細胞と共に培養した。抗原誘導増殖を、 ｌｍＣ１の〔３Ｈ〕−チミジンを培養の最後１８時間の間取り込ませることによ って評価した。結果を抗ＣＤ３ｍＡｂを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激した細胞 により得られたカウント毎分（ｃｐｍ）で表した。

本研究の結果は、１）Ｔ２が単球の表面でＦｃＲのγインターフェロンによる誘 導を完全に排除（１００％阻害）した；及び、２）ＦｃＲの欠如は、ヒトＴリン パ球の０ＫＴ３仲介ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔ細胞増殖をヒト単球が支持できないこ とをもたらすことを示した（図１７）。

ｂ）　Ｔ２はマウスＴ細胞ハイブリドーマによる抗原仲介ＩＬ−２放出を阻害す Ｔ細胞活性化に対する抗原提示におけるマウス細胞上のγ−インターフェロン誘 導ＭＨＣクラスＩＩの阻害効果を調べた。Ｔリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣ ）の表面で自己ＭＨＣ分子と会合して提示されるペプチドの形態で抗原を認識す る。

免疫化した後、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、ＭＨＣクラス］１及びペプチド抗原 によって形成された生体分子複合体と、抗原リセブター（ＴＣＲ）とを経て相互 作用することによって、免疫応答を開始する。Ｔ細胞による抗原認識は、その増 殖及びインターロイキン−２の産生を引き起こす。ここで、我々は、オリゴヌク レオチドＴ２がクローン化ＡＰＣ，ＷＥＨＩ　３による抗原提示に影響するかに ついて試験した。ＷＥＨＩ３は、骨髄単球細胞株であり、そのＭＨＣ発現レベル はがなり低い（４％）が、γ−インターフェロンへの暴露後に９０％まで増加し 得る。

我々は、γ−インターフェロンによるＷＥＨＩａ上のＭＨＣクラスＩＩ　（Ａ’ 、Ｅつの誘導がマウス細胞株を７２（２０ｍＭ最終濃最終色共に前インキュベー トすることによって遮断されることができることを示した。Ｔ活性化における効 果を測定するために、我々は、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｅｌと会合して提 示されたラムダリプレッサーペプチド＋２−２４に特異的なＴ細胞ハイブリドー マ、ＩＥｌを用いた。γ−インターフェロンと共に前インキュベートした後、Ｗ ＥＨＩ　３は高いレベルの表面Ｅ６分子を示し、Ｔ細胞ハイブリドーマ、ＩＥＩ に対して該ペプチドを効果的に提示した。オリゴヌクレオチドＴ２は、ＷＥＨＴ −３の抗原提示機能を抑制し、その特異抗原、ラムダリプレッサーペプチド１２ −２４に対する、ＣＤＪ＋、クラスｌ］拘束Ｔ細胞ハイブリドーマ（ＩＥＩ）の ｉｎ　ｖｉｔｒｏインターロイキン２　（ＩＬ−２）生成を阻害していた（図１ ８）。

図１８において本研究は、Ｉ−Ｅ’と会合したラムダリプレッサーペプチド、１ ２−２４に対して特異的なＩＢＩＴハイブリドーマ細胞［１０’を用いた。これ らは、ＡＰＣ対照物としテ＋１７）Ａ２０　（Ａ’　、Ｅ”）　Ｂ細胞リンハ腫 （１０’細胞）と共に、又はγ−インターフェロン（１００Ｕ／ｍｌ）で処理し たＷＥＨＩ−３骨髄単核細胞株と共に、オリゴヌクレオチドＴ２の存在下で若し くは培地のみで、２４時間、共培養した。その後、関連ペプチドを異なる濃度で 細胞培養物に添加した。その後、該９６ウエルマイクロプレートを遠心し、培養 上清（１００ｍｌ）を吸引して新しいマイクロタイタープレートに移し、これを 凍結してＩＬ−２生成のアッセイの前に解凍した。ＩＬ−２を、ＩＬ−２依存性 細胞株、ＨＴ２の（’Ｈ）−チミジン取込みによってアッセイした。簡単に言え ば、０．０４ｍ１の培養上清を、総量０．２ｍｌのＨｌ、−１培地中で２４時間 、１０’のＨＴ−２と共に更にインキュベートした。ｌｍＣ１の〔２Ｈ〕−チミ ジンの取込みを、培養の最後４時間でアッセイした。

本研究から得た結果は、オリゴヌクレオチドＴ２は、ヒト及びマウス系で共に、 γ−インターフェロンによる異なる細胞表面リセブター誘導を遮断することがで きるが、他のリンホカインではできないことを示した。これは、マウス細胞株の 抗原の提示能及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原特異性Ｔ細胞増殖の刺激能を排除するこ とをもたらす。

にに４ Ｉ■ ＦＩＧ、　４ 蛍光 ＩＱ６Ａ 蛍光 ＦＩＧ、６Ｂ 蛍光 Ａ：　対照物 Ｂ：５０μＭ対照物オリゴ（１９ｎｔ）ＦＩＧ、６Ｃ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、１０Ａ 蛍光 なし　ＩＦＮ　ＡＮＴＩ−Ｂ　ＡＢ　ＡＣＡＴ　ＡＴＣＴ　Ｔ２オリゴ ＦＩＧ、１１ ０　１０　、　２０　３０ 時間（時間） ■　２７８ｎｍでのＴ２処理物　０２７８ｎｍでの対照物ム　２７．８ｎｍでの Ａ３処理物　口２７８ｎｍでのＩＦＮ処理物ＦＩＧ、１２ 時間（時間） ■３，６０ｎｍでのＴ２処理物　・　３６０ｎｍでの対照物ム３６０ｎｍでのＡ ３処理物　０３６０ｎｍでのＩＦＮ処理物ＦＩＧ、１３ 八 ＭＣＳにおける変化 ＦＩＧ、１６Ｂ −−−ｗ１０Ｔ２ ＦＩＧ、１７ ペプチド（ｕＭ） ＦＩＧ、１８ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｈ２１１０４Ｚ 　８６１５−４ＣＣ１２Ｎ　５／１０ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｍ Ｇ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ 、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＡ、　ＵＳ（７２）発明者　ギヤロポイ、マービン　ア ール。

アメリカ合衆国　９４９６０　カリフォルニア州　サンアンセルモ　ダッチ　バ レーレーン９ （７２）発明者　ハント、アンソニー アメリカ合衆国　９４１２７　カリフォルニア州　サンフランシスコ　ランズデ イルアベニュ　２１０ （７２）発明者　フェイ、ビン アメリカ合衆国　９４１２２　カリフォルニア州　サンフランシスコ　フォーテ ィーファースト　アベニュ　１６３０ （７２）発明者　タム、シュマン アメリカ合衆国　９４１１８　カリフォルニア州　サンフランシスコ　ナインス 　アベニュ６６０

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．標的細胞から移植抗原除去細胞を作製する方法であって：（ａ）該標的細胞 を得ること；及び （ｂ）該標的細胞を、移植抗原ヌクレオチド配列に結合することができるオリゴ ヌクレオチドに暴露し、ここで、該オリゴヌクレオチドは、該標的細胞を移植抗 原除去細胞にするために十分な量で存在すること、を含む当該作製方法。
2. ２．上記オリゴヌクレオチドが、ワトソン−クリック結合を経て、又はトリプレ ックス結合を経て移植抗原ヌクレオチド配列に結合することができる請求の範囲 第１項記載の方法。
3. ３．前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＩＣＡＭ遺伝子配列又はＭＨＣクラス１ 遺伝子配列若しくはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列である請求の範囲第２項記載の 方法。
4. ４．前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列が、ＤＲＡ、ＤＰ又はＤＱ座に位置する請 求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列がＤＲＡ座に位置する請求の範囲第４項記 載の方法。
6. ６．前記オリゴヌクレオチドが、下記配列、【配列があります】 又は結合能を維持するそのフラグメントを含む請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記移植抗原ヌクレオチド配列がプロモーター配列又は構造遺伝子配列であ る請求の範囲第２項記載の方法。
8. ８．前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＤＲＡ構造遺伝子配列又はＤＲＡプロモ ーター配列である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記ＤＲＡプロモーター配列がＸボックス又はＸ２ボックスを含む請求の範 囲第８項記載の方法。
10. １０．前記オリゴヌクレオチドが、下記配列、【配列があります】 又は結合能を維持するそのフラグメントを含む請求の範囲第９又は１項記載の方 法。
11. １１．前記オリゴヌクレオチドが、下記配列、【配列があります】 又は結合能を維持するそのフラグメントを含む請求の範囲第７項記載の方法。
12. １２．前記標的細胞が、角膜内皮細胞、甲状腺細胞、甲状腺傍細胞、脳細胞、副 腎細胞、骨髄細胞、膵臓島細胞及び肝細胞から成る群より選択される請求の範囲 第１項記載の方法。
13. １３．前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＩＣＡＭ遺伝子配列である請求の範囲 第１項記載の方法。
14. １４．（ａ）標的細胞を得ること；及び（ｂ）該標的細胞を、移植抗原ヌクレオ チド配列に結合することができるオリゴヌクレオチドに暴露し、ここで、該オリ ゴヌクレオチドは、該標的細胞を移植抗原除去細胞にするために十分な量で存在 すること、を含む方法によって製造された移植抗原除去細胞。
15. １５．前記オリゴヌクレオチドが、ワトソン−クリック結合又はトリプレックス 結合を経て、移植抗原ヌクレオチド配列に結合することができる請求の範囲第１ ４項記載の移植抗原除去細胞。
16. １６．前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＩＣＡＭ遺伝子配列又はＭＨＣクラス １遺伝子配列若しくはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列である請求の範囲第１５項記 載の移植抗原除去細胞。
17. １７．前記ＭＨＣクラス１遺伝子配列が、ＤＲＡ、ＤＱ又はＤＰ座に位置する請 求の範囲第１６項記載の移植抗原除去細胞。
18. １８．前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列がＤＲＡ座に位置する請求の範囲第１７ 項記載の移植抗原除去細胞。
19. １９．前記移植抗原ヌクレオチド配列がプロモーター配列又は構造遺伝子配列で ある請求の範囲第１５項記載の移植抗原除去細胞。
20. ２０．前記構造遺伝子配列がＤＲＡ構造遺伝子配列であり、又は前記プロモータ ー配列がＤＲＡプロモーター配列である請求の範囲第１９項記載の移植抗原除去 細胞。
21. ２１．前記ＤＲＡプロモーター配列がＸボックス又はＸ２ボックスを含む請求の 範囲第２０項記載の移植抗原除去細胞。
22. ２２．前記オリゴヌクレオチドが、下記配列、【配列があります】 又は、下記配列 【配列があります】 若しくは結合能を維持するこれらのフラグメントを含む請求の範囲第２１又は１ ４項記載の移植抗原除去細胞。
23. ２３．前記標的細胞が、角膜内皮細胞、甲状腺細胞、甲状腺傍細胞、脳細胞、副 腎細胞、骨髄細胞、膵臓島細胞及び肝細胞から成る群より選択される請求の範囲 第１４項記載の移植抗原除去細胞。
24. ２４．前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＩＣＡＭ遺伝子配列である請求の範囲 第１４項記載の移植抗原除去細胞。
25. ２５．ワトソン−クリック結合又はトリプレックス結合を経て、移植抗原ヌクレ オチド配列に結合することができるオリゴヌクレオチド。
26. ２６．前記移植抗原ヌクレオチド配列が、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列である請 求の範囲第２５項記載のオリゴヌクレオチド。
27. ２７．前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列が、ＤＲＡ、ＤＰ又はＤＱ座に位置する 請求の範囲第２６項記載のオリゴヌクレオチド。
28. ２８．前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子配列がＤＲＡ構造遺伝子配列又はＤＲＡプロ モーター配列である請求の範囲第２７項記載のオリゴヌクレオチド。
29. ２９．前記ＤＲＡプロモーター配列がＸボックス又はＸ２ボックスを含む請求の 範囲第２８項記載のオリゴヌクレオチド。
30. ３０．前記オリゴヌクレオチドが、下記配列、【配列があります】 又は、下記配列 【配列があります】 若しくは結合能を維持するこれらのフラグメントを含む請求の範囲第２９又は２ ８項記載のオリゴヌクレオチド。
31. ３１．標的細胞を移植抗原除去のものにする治療のための組成物の製造に用いら れるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが移植抗原ヌクレオチ ド配列の一部に結合することができる当該オリゴヌクレオチド。
32. ３２．（ａ）患者から標的器官を得ること；及び（ｂ）該標的器官を、移植抗原 ヌクレオチド配列に結合することができるオリゴヌクレオチドに暴露し、ここで 、該オリゴヌクレオチドは、該標的器官を普遍性ドナー器官にするために十分な 量で存在すること、を含む方法によって製造された普遍性ドナー器官。
33. ３３．移植抗原の機能不全発現により特徴付けられる自己免疫疾患を有する患者 の治療方法であって、該患者に移植抗原ヌクレオチド配列の一部に結合すること ができるオリゴヌクレオチドを、該移植抗原の発現を十分に阻害する量で、投与 することを含む当該方法。