KR20000069658A - Ｇ 풍부 올리고 앱태머 및 면역 반응을 변조시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD28과 같은 공동자극 분자 및 IL-2와 GMCSF와 같은 시토카인을 코드화하는 유전자를 조절하는 Sp1 및 Sp1 관련 단백질과 같은 단백질의 DNA 결합 부위에 특이적으로 결합하는 앱태머 올리고누클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 올리고누클레오티드는 T 세포 활성화를 변조시키는 분자를 특이적으로 조절하는 조절 단백질의 DNA 결합 부위과 경합한다. 이는 유전자의 전사를 억제함으로써 유전자 발현을 조절하는 기능을 한다. 앱태머는 건선, 타입 I(인슐린 의존성) 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 포도막염, 류마티스성 관절염, 전신성 피부홍반성 루푸스, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염), 및 패혈성 쇽과 같은 비정상적 T 세포 활성화를 포함하는 질병에 대한 치료를 제공하고, 동종이식편 거부에서와 같은 정상적인 T 세포 활성화를 조절하기 위해 투여된다.

Description

Ｇ 풍부 올리고 앱태머 및 면역 반응을 변조시키는 방법 {G-RICH OLIGO APTAMERS AND METHODS OF MODULATING AN IMMUNE RESPONSE}
다수의 유행하는 T 세포 매개성 질병의 병인 및 악화는 비정상적 T 세포 활성화에 의해 유도되는 부적당한 면역 반응의 결과로써 발생한다. 비정상적 T 세포 활성화에 의해 유도되는 것으로 생각되는 다수의 기타 질병으로는 타입 I(인슐린-의존성) 진성 당뇨병, 갑상선염, 사르코이도시스, 다발성 경화증, 자가면역 포도막염, 류마티스성 관절염, 전신성 피부홍반성 루푸스, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염) 및 재생불량성 빈혈이 있다. 또한, 패혈성 쇽 및 종양 유도된 악액질을 포함하는 다양한 증후군은 T 세포 활성화 및 잠재적으로 독성 수준의 림포카인의 생성 증가를 포함할 수 있다. 또한, 정상적인 T 세포 활성은 "외래" 공여체 조직의 효과적인 파괴를 위해 필요한 신호를 제공함으로써 이식된 세포 및 장기의 거부 반응을 매개한다.
T 세포 증식 및 유전자 발현 및 특이적 면역변조성 시토카인의 분비를 유도시키는 T 림프구의 활성화에는 2개의 독립적 신호가 필요하다. 첫 번째 신호는 특이적 T 세포 수용체/CD3 복합체에 의한, 항원 제공 세포(APC)의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 분자에 의해 제공되는 항원의 인식을 포함한다. T 세포와 APC 간의 항원 비특이적 세포간 상호작용은 항원에 대한 T 세포 반응을 조절하는 기능을 하는 두 번째 신호를 제공한다. 이들 두 번째 또는 공동자극 신호에 의해 항원에 대한 T 세포 반응의 세기가 결정된다. 공동자극된 세포는 특이적 시토카인 유전자 전사의 수준을 증가시키고, 선택된 mRNA를 안정화시킴으로써 반응한다. 공동자극의 부재하의 T 세포 활성화는 억제성 또는 무력성 T 세포 반응을 초래한다. 한 가지 중요한 공동자극성 신호는 T 세포 표면 수용체 CD 28과 APC 상의 B7 관련된 분자의 상호작용에 의해 제공된다 [참조: Linsley 및 Ledbetter(1993) Annu Rev Immunol 11: 191-212]. CD28은 CD4+T 세포(B 세포 항체 생성을 위해 헬퍼 기능을 제공함)의 95% 및 CD8+T 세포(세포독성 기능을 가짐)의 50%에서 구조적으로 발현된다 [참조: Yamada et al (1985) Eur J Immunol 15 : 1164-1168]. 항원성 또는 시험관내 마이토젠성 자극 후, 추가로, CD 28의 표면 수준의 유도 뿐만 아니라 특정 면역변조성 시토카인의 생성이 일어난다. 이들 물질로는 T 세포의 세포 주기 진행에 필요한 인터루킨-2(IL-2), 광범위한 항바이러스 및 항종양 효과를 나타내는 인터페론-감마(IFNγ), 및 호중구 및 림프구에 대한 효능있는 화학주성 인자로서 공지된 인터루킨-8(IL-8)이 있다. 이들 시토카인은 T 세포 활성화의 CD28 경로에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다 [참조: Fraser et al (1991) Science 251 : 313-316, Seder et al (1994) J Exp Med 179 : 299-304, Wechsler et al (1994) J Immunol 153 : 2515-2523]. IL-2, IFNγ 및 IL-8은 광범위한 면역 반응을 촉진시키는 데 필수적이며, 다수의 T 세포 매개성 질병 상태에서 과발현되는 것으로 밝혀져 왔다.
건선의 경우, 활성화된 병변성 T 세포는 IL-2 및 IFNγ와 같은 Th1 시토카인을 주로 방출시킨다 [참조: Schlaak et al (1994) J Invest Derm 95 : 275-282]. 이들 분비된 시토카인은 정상적인 케라티노사이트가 동일한 표현형(HLA DR+/ICAM-1+)을 발현시키도록 유도시킨다. 또한, IL-8은, 이것의 시험관내 및 생체내 프로인플러머토리(proinflammatory) 특성 및 이것이 활성화된 T 세포 및 케라티노사이트 둘 모두에 의해 건선 병변으로부터 대량 분비되기 때문에, 케라티노사이트 과증식과 같은 건선성 피부에서 나타나는 병리학적 변화에 대한 주요 기여물질로서 간주된다. 또한, 수용체의 B7 패밀리(활성화된 APC 상에서 발견되는 CD28에 대한 천연 리간드) 중의 하나인 BB1은 건선성이지만 영향을 받지 않은 피부 케라티노사이트에서 발현되는 것으로 밝혀져 왔으며[참조: Nickoloff et al(1993) Am J Pathology 142 : 1029-1040], 이는 질병의 병인에서의 T 세포 활성화의 중요성을 분명히 나타낸다.
알레르기성 접촉 피부염 및 편평 태선와 같은 기타 T 세포 매개성 피부 질환의 경우, CD28은 대다수의 피부 및 상피 CD3+T 세포에서 고수준으로 발현되었지만, 정상적인 피부 및 기저 세포 암종(비 T 세포 매개성 피부 질환)의 경우, CD28은 혈관주위에 있는 T 세포에서만 발현되었다. 유사하게는, 알레르기성 접촉 피부염 및 편형 태선 둘 모두에 있어서, B7 발현은 피부 수상돌기 세포, 피부 APC 및 케라티노사이트에서 발현되었지만, 정상적인 피부 및 기저 세포 암종의 경우에는 그렇지 않았다 [참조: Simon et al (1994) J Invest Derm 103 : 539-543]. 따라서, 이것은 CD28/B7 경로가 T 세포 매개성 피부 질환의 중요한 매개자임을 제시한다.
자기 내성의 손실에 의해 유발된 특정 자가면역 질환과 관련된 비정상적 T 세포 활성은 주로 CD28 T 세포의 존재 및 이것의 리간드인 B7의 활성화된 전문적 APC(단세포, 대식구 또는 수상돌기 세포)에서의 발현을 특징으로 한다. 이들로는 자가면역성 그레이브스 갑상선염(참조: Garcia-Cozar et al (1993) Immunologia 12 32), 사르코이도시스(참조: Vandenberghe et al (1993) Int Immunol 5 : 317-321), 류마티스성 관절염(참조: Verwilghen et al (1994) J Immunol 153 : 1378-1385) 및 전신성 피부홍반성 루푸스(참조: Sfikakis et al (1994) Clin Exp Immunol 96 : 8-14)가 있다. 이식된 세포 및 장기의 거부반응을 매개하는 정상적인 T 세포 활성화에 있어서, T 세포 수용체 결합 도중의 적당한 B7 리간드에 의한 CD28의 결합은 외래 항원, 예를 들어 공여체 조직에 대한 적당한 이인자형 반응에 중요하다 [참조: Azuma et al (1992) J Exp Med 175 : 353-360, Turka et al (1992) Proc Nat Acad Sci USA 89 : 11102-11105].
자가면역 질병에 대한 종래의 치료법은 자기 항원에 대한 자기반응적 면역 반응에서의 이펙터 단계인 T 세포 활성화를 억제하지 않는다. 스테로이드 및 비스테로이드 소염제(NSAIDS)와 같은 약제가 증상을 완화시키기 위해 현재 사용되고 있지만, 이들은 질병의 진행을 억제시키지 못한다. 또한, 스테로이드는 골다공증, 기관 독성 및 당뇨병을 유도하는 것과 같은 부작용을 갖고, 연골 퇴화 작용을 촉진시킬 수 있으며, 소위 주사후 발적확장을 2시간 이하 내지 8시간 동안 야기시킨다. NSAIDS는 위장 부작용을 가질 수 있으며, 무과립구증 및 의원성 간염의 위험을 증가시킨다.
면역억제성 약제는 특히 진전된 질병 상태에서 치료의 또 다른 형태로서 또한 사용된다. 그러나, 이들 약제는 전체 면역계를 억제하며, 종종 치료는 고혈압 및 신독성을 포함하는 심각한 부작용을 갖는다. 또한, 사이클로스포린 및 FK506과 같은 확정된 면역억제제는 CD28 의존성 T 세포 활성화 경로를 억제시킬 수 없다 [참조: June et al (1987) Mol Cell Biol 7 : 4472-4481].
T 세포 활성화에 영향을 미치는 현재의 제제로는 합성 펩티드, 단클론성 항체 및 가용성 형태의 T 세포 활성화 분자가 있다. 현재까지, CD28, CD40L 및 부착 분자의 CAM 패밀리와 같은 T 세포 활성화 분자에 대한 경합성 합성 펩티드는 확인되지 않아 오고 있다. 단클론성 항체(mAb)는 건선(항-CD4 (Prinz et al (1994) Lancet 338 : 320-321))과 같은 T 세포 매개성 질병에서 가능한 치료 효과을 가지며, 동종이식(항-VCAM-1 및 VLA-4 (Isobe et al (1994) J Immunol 153 : 5810-5818))에서의 정상적인 T 세포 활성화의 면역억제를 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 만성 치료의 경우, 숙주 동물은 단클론성 항체에 대한 항체를 발달시킴으로써, 이들의 유용성을 제한시킨다. 이들 mAb에 대한 유도된 면역 반응의 위험을 감소시키는 '인간화된' 단클론성 항체가 개발되었다. 그러나, 이들은 여전히 개발중이며, 또한, 이들 새로운 mAb는 거대 단백질이기 때문에, 이들의 표적 부위에 근접하는 것이 곤란할 수 있다. 사람 Ig Cγ 사슬에 융하된 사람 CTLA-4 유전자(CD28과 서열 관련성이 있는)의 세포외 도메인을 함유하는 CTLA-4Ig와 같은 T 세포 활성화 분자의 가용성 형태가 개발되었다. CTLA-4Ig는 래트에서 이종발생성(참조: Lenschow et al (1992) Science 257 : 789-792) 및 이인자형(참조: Turka et al (1992) Proc Nat Acad Sci USA 89 : 11102-11105) 심장 동종이식편의 거부반응을 억제시킴으로써 정상적인 T 세포 활성화를 특이적으로 블록킹시키고, 래트의 자가면역 사구체신염에서 발견된 바와 같이 비정상적 T 세포 활성화에 대해 치료적 효과를 갖는 것으로(참조: Nishikawa et al (1994) Eur J Immunol 24 : 1249-1254) 밝혀졌다. 그러나, 가용성 CTLA-4Ig는 이들의 제조 비용 뿐만 아니라 단클론성 항체와 유사한 제한을 받는다. 또한, 이러한 CD28류 분자의 실제 기능은 알려져 있지 않기 때문에, 이것은 임의의 치료적 잇점이 평가될 수 있기 전에 충분히 결정될 필요가 있다.
CD28의 세포 표면 발현이 억제되면 무반응성이 연장되거나 활성화된 T 세포가 결실된다. 불활성화되면 T 세포 증식이 억제되고, 인터루킨-2, 인터페론-감마 및 인터루킨-8과 같은 특이적 면역조절성 시토카인의 T 세포 특이적 생성이 억제된다.
CD28 유전자 발현의 조절은 안티센스 및 트리플렉스 형성 올리고누클레오티드를 사용하여 올리고데옥시-리보누클레오티드 또는 올리고리보누클레오티드를 CD28 유전자 또는 프로모터 영역(patent CD28 Tam)내의 DNA 또는 RNA 서열에 혼성화시킴으로써 달성될 수 있다. 올리고누클레오티드는 정상적 및 비정상적 T 세포 활성화의 효과를 블록킹시키기 위해 사용되는 기존 제제가 안고 있는 다수의 위험을 방지한다. 그러나, 안티센스 기법용으로 고안된 이들 올리고는 세포내 누클레아제 또는 세포외 환경에 존재하는 누클레아제에 의해 분해되기 쉽다.
단백질에 대한 DNA(또는 RNA)의 결합은 유전자의 전사를 조절하는 기본 경로인 것으로 종래에 밝혀졌다. 이들 조절 단백질 또는 전사 인자는 특이적 2차 구조를 갖는 DNA 서열을 인식하고, 후속 상호작용은 유전자 발현의 포지티브 또는 네거티브 조절을 유도시킬 수 있다. 앱태머는 특이적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 짧은 올리고누클레오티드 서열이다. 상이한 앱태머 서열이 상이한 단백질, 예를 들어 서열 GGNNGG(여기에서, N=구아노신(G), 시토신(C), 아데노신(A) 또는 티민(T)은 트롬빈에 특이적으로 결합함)에 특이적으로 결합할 수 있음이 입증되었다 [참조: Bock et al(1992) Nature 355:564-566 및 특허 #5582981 (1996) Toole et al].
그러나, 전사 인자로서 공지된 조절 단백질 상의 DNA 결합 부위의 경합 억제물질로서 기능할 수 있는 앱태머 서열은 기술되지 않아 왔다. 전사 인자는 유전자의 5' 업스트림 프로모터 영역 내의 특이적 조절 서열에 주로 결합함으로써 유전자를 조절하는 단백질의 종류이다. 이러한 상호작용은 전사의 개시를 유도시킨다. Sp1, AP2, AP-1, EGR-1 및 NFκB와 같은 특정 전사 인자는 T 및 B 림프구의 활성화에 중요하다 [참조: Skerka et al J Biol Chem 270: 22500-22506, Jung et al (1995) Ann N Y Acad Sci 766: 245-252]. 따라서, 공동자극 경로를 포함하는 특정 면역 경로의 억제를 유도시키는, 단백질과 특이적 DNA 결합 부위의 상호작용을 간섭하는 제제 및 방법을 개발할 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, CD28과 같은 공동자극 분자 및 IL-2와 GMCSF와 같은 시토카인을 코드화하는 유전자를 조절하는 Sp1 및 Sp1 관련 단백질과 같은 단백질의 DNA 결합 부위에 특이적으로 결합하도록 고안된 앱태머 올리고누클레오티드가 제공된다.
바람직한 구체예에 있어서, 올리고누클레오티드는 Sp1 및 Sp1 관련 단백질과 같은 특이적 조절 단백질에 결합하고, 이들의 조절을 받는 유전자의 프로모터 영역에 대한 이들 전사 인자의 결합과 경합하도록 작용하도록 고안된다. 이것은 유전자의 전사를 억제시킴으로써 유전자 발현을 변조시키는 기능을 한다. 따라서, 앱태머 올리고누클레오티드는 RNA 또는 DNA의 기능, 즉, 단백질로의 이것의 번역, 세포질로의 이것의 전좌 또는 이것의 전체 생물학적 기능에 필요하는 임의의 기타 활성을 억제시킬 수 있다. RNA 또는 DNA가 이것의 기능의 일부 또는 전부를 수행하지 못하면, T 세포 활성화를 조절하는 게놈의 일부가 적절하게 발현되지 못하게 됨으로써, 상기 대사가 변조된다.
T 세포 활성화를 변조시킬 수 있는 분자를 특이적으로 조절하는 조절 단백질의 DNA 결합 부위와 경합하는 앱태머 핵산 유인물질을 표적화시키는 것이 바람직하다. CD28 단백질이 이러한 방법에 특히 유용하다는 것이 밝견되었다. CD28 및 CD28 관련 유전자 발현이 억제되면 건선 및 기타 피부 질환, 비정상적 T 세포 활성화에 따른 증후군, 자가면역 질환 및 동종이식편 거부반응의 치료에 유용한 것으로 예측된다.
환자를, 조절 단백질의 DNA 결합 부위와 경합하는, 예를 들어 T 세포 활성화를 변조시킬 수 있는 것으로 공지된 조절된 단백질의 발현을 억제시키는 올리고누클레오티드에 접촉시키는 것으로 포함하여, T 세포 활성화를 변조시키는 방법이 제공된다. CD28 및 CD28 관련 유전자의 전사를 조절하는 Sp1 및 Sp1 관련 단백질과 같은 단백질에 결합하는 올리고누클레오티드가 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일면에 있어서, 건선, AIDS 악화된 건선 및 기타 피부 질환, 예를 들어 타입 I(인슐린 의존성) 진성 당뇨병, 갑상선증, 사르코이도시스, 다발성 경화증, 자가면역 포도막염, 류마티스성 관절염, 전신성 피부홍반성 루푸스, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염), 패혈성 쇽, 종양 유도된 악액질 및 재생불량성 빈혈과 같이 비정상적 T 세포 활성화를 포함하는 질병에 대한 치료를 제공하고, 동종이식편 거부반응에서와 같이 정상적인 T 세포 활성화를 조절하는 앱태머가 제공된다. 이것은 CD28 및 CD28 관련 분자를 포함하는 T 세포 활성화 분자의 합성 및 발현에서의 교란에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면에 있어서, Sp1 및 Sp1 관련 단백질과 같은 특이적 조절 단백질과 결합하여, a) 이들 단백질에 의해 일반적으로 조절되고, b) T 세포 반응을 조절할 수 있는 CD28 및 CD28 관련 단백질과 같은 유전자 전사를 억제시킬 수 있는 앱태머가 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B는32P 표지된 포스포로티오에이트인 ICN 16064 (서열 번호 4)의 세포외 유체 및 쥬르카트 세포에서의 각각의 시험관내 안정성을 그래프로 나타낸 도면이다. 도 1C 및 1D는32P 표지된 포스포로티오에이트인 ICN 16214 (서열 번호 21)의 세포외 유체 및 쥬르카트 세포에서의 각각의 시험관내 안정성을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 1E 및 1F는 20% 폴리아크릴아미드 변성 겔 상에서의 전기영동 후 포스포르이매져(PhosphorImager)를 사용하여 가시화시킴으로써 평가된 (2000 cpm), 각각의 올리고누클레오티드 ICN 16064 (서열 번호 4) 및 ICN 16214 (서열 번호 21)의 시간 의존성 분해 (0 내지 96 시간)를 그래프로 나타낸 도면이다. t가 0인 경우, 각각의 시간 점에 남아있는 온길이의32P-RT03S(○) 및32P-RTCO6S(●)의 퍼센트는 닉스핀(Nickspin) 칼럼(Pharmacia)을 통해 적용된 세포외(도 1E) 및 세포(도 1F)의 1000 cpm으로부터의 용리액에서 결정되었다. 분자량 표준(Std),32P-dNTP(N) 및 유리32P-오르토포스페이트(P)는 동시에 분석되었다.
도 2는 G 풍부 12량체 서열 모티프(레인 5 및 11)이 올리고누클레오티드 HeLa 핵 추출물과의 인큐베이션 후 기타 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 의해 관찰된 밴드 B에 대해 전기영동 시프트가 상이한 독특한 밴드 A를 제공한다는 것을 입증하는 겔 시프트 분석을 그래프로 나타낸 도면이다. 밴드 C는 32P-올리고 뿐이다.
도 3은 쥬르카트 세포를 CD28 프로모터 영역으로부터의 226bp 인서트(insert)(잔기 -197 내지 +28)(28b) 또는 CAT 리포터 유전자의 업스트림에서 표 1로부터의 서열 번호 3(28h-1)에 의해 잔기 -51 내지 -22에서 치환된 돌연변이체를 함유하는 플라스미드 벡터로 트랜스펙팅시키고, 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드인 ICN16064 및 ICN 16481의 존재 및 부재하의 처리한 후, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 발현을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 4는 CD28 유전자의 업스트림 영역 -197 내지 +28인 28b에 대한 Sp1의 결합이 특이적이라는 것을 나타내는 겔 수퍼시프트(supershift) 검정을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 5는32P 표지된 이중 가닥 올리고 28b(모체 28b(표 1의 서열 번호 1)로부터 유도됨)에 대한 Sp1의 결합 및 저온 이중 가닥 올리고 28b과 앱태머 올리고인 도면 1A 및 16481의 경합 결합을 그래프로 나타낸 도면이다.
본 발명의 분야는 면역학이다.
Sp1 및 Sp1 관련 단백질과 같은 조절 단백질의 DNA 결합 부위에 특이적으로 결합하는 앱태머 올리고누클레오티드는 조절 단백질이 프로모터 영역에 있는 DNA의 특이적 이중 가닥 영역, 즉, 관심 유전자와 결합하는 것을 억제할 것이다. 앱태머에 의한 경합 결합은 유전자의 전사를 억제함으로써, DNA로부터 단백질로의 유전 정보의 흐름을 억제할 것이다. 또한, 표적에 특이적으로 되는 올리고누클레오티드의 특성에 의해 이들은 다용도로 된다. 올리고누클레오티드가 4개의 단량체 단위의 긴 사슬이기 때문에, 이들은 임의의 표적 RNA 서열에 대해 용이하게 합성될 수 있다.
유전자 발현의 올리고누클레오티드 매개성 억제는 다수의 모형 및 시험관내 시스템에서 입증되어 왔으며, 다수의 사람 질병을 치료하기 위한 신규한 방법으로서 치료적 잠재력을 갖는다 [참조: Uhlmann 및 Peyman (1990) Chem Rev 90 : 544-584, Zon 및 Stec (1991) Oligonucleotides and analogues - A Practical Approach: 87-108, Miller et al (1981) Biochem 20 : 1874-1880, Orson et al (1991) Nucleic Acid Res 19 : 3435-3441, Helene 및 Toulme (1990) Biochem Biophys Acta 1049 : 99-125, Thierry 및 Dritschilo (1992) Nucleic Acid Res 20 : 5691-5698]. 증강된 세포 흡수를 나타내는 포스포로티오에이트[참조: Zon 및 Stec (1991) Oligonucleotides and analogues - A Practical Approach: 87-108 및 포스포로티오에이트-3'히드록시프로필아민[참조: Tam et al (1994) Nucleic Acid Res 22 : 977-986]를 포함하는 누클레아제 저항성 올리고누클레오티드의 합성에서의 최근 진보로 인하여, 올리고누클레오티드를 치료학의 신규한 형태로서 사용하는 것을 현재 고려할 수 있다. 조절 단백질 결합 부위를 표적화시키는 앱태머 올리고누클레오티드는 핵산 기초 화합물의 또 다른 종류를 나타내고, 이들은 종래의 방법에서 직면했던 문제점에 대한 이상적인 해결법을 제공한다. 이들은 특정 유전자 발현의 변조에 직접 관여함으로써, 수용체-리간드 상호작용의 결합 메카니즘과 친화성의 완전한 이해를 필요로 하는 상호작용인 표적 단백질에 대한 가용성 수용체의 경합 결합이 아닌, 표적 단백질 발현을 억제시킨다. 올리고누클레오티드는 작은 분자이기 때문에, 거대 분자 억제물질과 같은 입체 문제는 없다.
표적의 설명
본원에서 고려되는 표적은 면역 반응을 개시 또는 유지시키는 데 필수적인 역할을 하는 전사 인자에 의해 조절될 수 있는 분자를 포함한다. 이들로는 CD28과 같은 공동자극 분자 및 IL-2, GM-CSF 및 IFNγ와 같은 시토카인이 있다.
치료학을 위해, CD28 또는 CD28 관련 분자와 같은 공동자극 분자의 발현을 감소시킴으로써 치료될 수 있는 질병에 걸린 것으로 의심되는 동물은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드를 투여함으로써 치료될 수있다. 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드 이외에 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 방부제, 표면 활성제, 리포솜 또는 지질 제형 등을 포함할 수 있는 약제 조성물로 제형화될 수 있다. 약제 조성물은 올리고누클레오티드 이외에 항균제, 소염제, 마취제 등과 같은 1종 이상의 활성 성분을 또한 포함할 수 있다.
약제 조성물은 국소적 또는 전신적 치료가 바람직한 경우 및 치료될 부위에 따라 다수의 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적으로(안구, 질, 직장, 비내), 경구적으로, 흡입에 의해, 또는 비경구적으로, 예를 들어 점적 정주, 피하, 복강내 또는 근내 주사에 의해 이루어질 수 있다.
국소 투여용 제형으로는 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 있을 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수분, 분말 또는 오일성 염기, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 피복된 콘돔 또는 글러브(glove)가 또한 유용할 수 있다.
경구 투여용 조성물로는 분말 또는 과립, 현탁액 또는 수중 용액 또는 비수성 매질, 캡슐, 새쉐이(sachet) 또는 정제가 있다. 증점제, 풍미제, 희석제, 에멀션화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
비경구적 투여용 제형으로는 완충제, 리포솜 희석제 및 기타 적당한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액이 있을 수 있다.
투여 용량은 치료하려는 질환의 심각성 및 반응성에 좌우되지만, 수 일 내지 수 개월 지속되는 치료 도중에 또는 완치되거나 질병 상태의 감소가 달성될 때까지, 매일 1회 이상 투여되는 것이 일반적일 것이다. 당업자는 최적 용량, 투여 방법 및 반복율을 용이하게 결정할 수 있다.
바람직한 전신적 적용에 있어서, 앱태머는 1일 1회 5mg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 바람직한 국소적 적용에 있어서, 앱태머는 1일 1회 1 내지 5% 요액으로 투여된다. 바람직한 폐 적용에 있어서, 앱태머는 1일 1회 5mg의 에어로솔화된 용량으로 투여된다.
본 발명은 T 세포 활성화를 조절할 수 있는 단백질에 상응하는 RNA 및 DNA의 기능의 억제에 사용되는 앱태머 올리고누클레오티드를 사용한다. 본 발명에서, '올리고누클레오티드"란 용어는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 이 용어는 천연 염기, 당 및 인터슈거(intersugar)(주쇄) 결합체로 구성된 올리고머 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 인공 부분을 갖는 올리고머를 포함한다. 이러한 변형되거나 치환된 올리고누클레오티드는 누클레아제의 존재하의 증강된 세포 흡수 및 증가된 안정성과 같은 특성 때문에 천연 형태 보다 종종 바람직하다.
본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 약 3개 내지 약 50개의 핵산 염기 단위를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 올리고누클레오티드가 약 8개 내지 30개 핵산 염기 단위를 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 약 12개 내지 22개 핵산 염기 단위를 갖는 것이 더욱더 바람직하다. 인식되는 바와 같이, 핵산 염기 단위는 인산이에스테르 또는 기타 결합을 통해 인접 핵산 염기 단위에 적당하게 결합된 염기-당 결합물이다.
본 발명에 따라 사용되는 올리고누클레오티드는 널리 공지된 기법인 고체상 합성을 통해 편리하고, 일상적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)를 포함하는 몇몇 회사에 의해 판매되고 있다. 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 또한 사용될 수 있지만, 올리고누클레오티드의 실제 합성은 기술자의 재능에 달려있다. 또한, 포스포로티오에이트 및 3'아민-포스포로티오에이트와 같은 기타 올리고누클레오티드를 제조하는 유사하는 기법을 사용하는 것이 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 당업자는 전사되는 DNA의 오픈 리딩 프레임(ORF)에 의해 확인된 메신저 RNA가 DNA의 ORF로부터의 정보 뿐만 아니라 당업자에게 알려진 5' 번역된 영역, 3' 번역된 영역 및 개재 서열 리보누클레오티드와 같은 영역을 형성하는 관련 리보누클레오티드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 올리고누클레오티드는 본 발명에 따라, 이들 관련 리보누클레오티드 뿐만 아니라 정보함유 리보누클레오티드에 대해 전체적으로 또는 부분적으로 표적화된 상태로 제형화될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 앱태머 올리고누클레오티드는 Sp1 및 Sp1 관련 단백질과 같은 조절 단백질의 DNA 결합 부위와 상호작용하며, 이렇게 상호작용함으로써, T 세포 활성화에 관여하는 단백질을 코드화하는 유전자의 발현을 간섭한다. 바람직한 구체예에 있어서, 조절하려는 상기 단백질은 CD28 및 CD28 분자의 모든 상동체이다. GGGG, GNGG, GGNG(여기에서, N은 A, C, G, U 또는 T임)와 같은 3개 이상의 구아노신(G) 잔기를 함유하는 4개의 누클레오티드의 영역으로서 규정된 2개 이상의 G 풍부 영역을 함유한느 서열을 포함하는 올리고누클레오티드가 바람직하다. 6개 이하의 잔기 및 바람직하게는 4개 이하의 잔기 만큼 떨어져 있는 2개의 이러한 G 풍부 영역이 본 발명에서 유용하다. 전체적으로 또는 부분적으로 유용할 수 있는 바람직한 서열은 하기와 같다:
도시된 서열이 정확한 것으로 믿어지지만, 본 발명은 오류가 발견된 경우, 정확한 서열에 관한 것이다. 본 발명에서 유용한 올리고누클레오티드는 이들 서열 중의 하나 또는 이것의 일부를 포함한다. 따라서, 상기 나열된 올리고누클레오티드 중의 어느 하나 또는 당업자가 CD28 및 CD28 관련 분자를 포함하는 T 세포 활성화 분자의 합성의 변조를 위한 바람직한 올리고누클레오티드 표적의 지식으로부터 제조할 수 있는 유사한 올리고누클레오티드 중의 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하다. CD28 및/또는 CD28 상동체의 생성의 억제 또는 변조는 질병의 치료에서 중요한 치료적 잇점을 갖는 것으로 예측된다. 조성물의 효과를 평가하기 위해, 1회 검정 또는 일련의 검정이 필요하다.
올리고누클레오티드
올리고데옥시누클레오티드를 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 자동 DNA 합성기(Applied Biosystems model 394)에서 합성하였다. β-시아노에틸포스포르아미다이트, 합성 시제 및 CPG 폴리스티렌 칼럼을 어플라이드 바이오시스템스(ABI, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드를 위해, 표준 산화 병을 테트라에틸티우람 디설파이드/아세토니트릴로 대체하고, 표준 ABI 포스포로티오에이트 프로그램을 사용하여 포스포로티오에이트 결합제를 단계적으로 첨가시켰다. 조절된 포어 유리 칼럼으로부터의 분해 후, 보호 기를, 올리고누클레오티드를 55℃에서 8시간 동안 진한 수산화 암모늄으로 처리함으로써 제거하였다. 올리고누클레오티드를 역상 세미프렙(semiprep) C8 칼럼(ABI)를 사용하여 HPLC에 의해 정제시켰다. DMT 보호 기의 분해, 80% 아세트산에 의한 처리 및 에탄올 침전 후, 생성물의 순도를 분석용 C18 칼럼(Beckman, Fullerton, CA)을 사용하여 HPLC에 의해 평가하였다. 순도가 90%를 넘는 모든 올리고누클레오티드를 동결건조시켰다. 올리고누클레오티드를 멸균 탈이온수(ICN, Costa Mesa) 중에서 재구성시키고, OD260nm의 평가 후 400μM으로 조정하고, 분액화시키고, 실험 전에 -20℃에서 보관하였다. 모든 경우, 표 1에 열거된 각각의 올리고누클레오티드의 3개 이상의 배치(batch)를 사용하였다.
시험관내 올리고누클레오티드 안정성 실험
일시적 올리고누클레오티드 안정성 분석을 이미 공지된 바와 같이 수행하였다 [참조: Tam et al (1994) Nucleic Acid Res 22 : 977-986]. 올리고누클레오티드 분해 프로파일을 전기영동에 의해 평가하고, 닉스핀(Nickspin) 칼럼을 사용하여 정량하였다.
세포계열 및 T 세포 정제
말초혈 단핵 세포(PBMC)를 건강한 공여체로부터의 혈액 60㎖를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리를 수행한 후 담황갈색 층(buffy coat)으로부터 단리시켰다. 그 후, T 세포를 T 세포에 대해 특이적인 림포크위크(Lymphokwik) 림프구 단리 시제(LK-25T, One Lambda, Canoga Park CA)를 사용하여 PBMC로부터 정제시켰다. 그 후, T 세포 40 내지 60 x 106개의 평균 수율을 20 내지 30㎖의 RPMI-AP5(HEPES 완충액 20mM(pH 7.4), 5% 자가 혈장, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.05% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 배지(ICN, Costa Mesa, CA)) 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이팅하여, 임의의 오염성 부착 세포를 제거시켰다. 모든 실험의 경우, T 세포를 RPMI-AP5로 세척한 후, 96 웰 미세역가 플레이트 상에 2 내지 3 x 106개 세포/㎖의 세포 농도로 플레이팅하였다.
T 세포 림프종 세포계통인 쥬르카트 E6-1(CD28+/CD4+) 세포(152-TIB)를 RPMI-10(HEPES 완충액 20mM(pH 7.4), 10% 우태아 혈청(FCS)(Hyclone, Logan, UT), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지) 중에 유지시켰다.
마이토젠 유도된 T 세포 활성화 및 올리고누클레오티드 처리
사람 말초 T 세포 또는 T 세포 림프종 세포계통(0.2 내지 0.3 x 106)을 첨가하기 전에, 2벌의 96-웰 미세역가 플레이트를 정제된 항-CD3 단클론성 항체(mAb)(6.25 내지 200ng/웰)(clone HIT 3a, Pharmingen, San Diego, CA)로 예비피복시키고, 저온 포스페이트 완충된 식염(pH 7.4)(PBS)으로 2회 세척하였다. 항-CD3 mAb 처리된 T 세포를 포스볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Calbiochem, La Jolla, CA)을 첨가항 추가로 활성화시키고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이팅시켰다. 항-CD3/PMA 활성화된 T 세포를 활성화 후 즉시 1 내지 20 μM의 CD28 특이적 및 대조 올리고누클레오티드로 처리하고, 24시간 후 재처리하였다. 1개의 2벌 플레이트로부터의 T 세포를 면역형광 분석에 사용하였고, 1A를 시토카인 실험에 사용하였으며, 두 번째 플레이트를 T 세포 증식 분석에 사용하였다.
면역형광 실험
활성화 후, 첫 번째 2벌 미세플레이트로부터의 세포 150㎕를 세포 유도된 시토카인 생성의 분석을 위해 또 다른 미세플레이트로 옮겼다. 잔존 세포를 등장성 식염 용액(pH 7.4)(Becton Dickinson, Mansfield, MA)로 2회 세척하고, 등장성 식염 용액 50㎕ 중에 재현탁시키고, 2개의 샘플로 분할하였다. 하나의 샘플 분액을 PE-CD28/FITC-CD4 mAb 중의 어느 하나로 공염색시키고, 비특이적 형광은 나머지 분액을 PE/FITC 표지된 이소타입 매치되는 대조 단클론성 항체로 염색시킴으로써 평가하였다. 모든 형광 표지된 단클론성 항체를 벡턴 딕킨슨(Becton Dickinson, San Jose, CA)로부터 구입하였다. 인큐베이션을 어두운 조건에서 4℃에서 45분간 포화 mAb 농도를 사용하여 수행하였다. 혼입되지 않은 표지는 FACScan 플로우 세포계수기(Becton Dickinson)으로 분석하기 전에 PBS 중에서 세척함으로써 제거하였다. 항원 밀도는 게이팅된(gated) 생존 세포에서 간접적으로 결정하고, 형광의 평균 채널(MCF)로서 표현하였다. CD28 mAb로 염색된 세포의 CD4+-서브셋의 표면 발현은 CD28_CD4_세포의 MCF로부터 CD28+CD4+의 MCF를 뺌으로써 결정하였다. 처리되지 않은 대조군 및 올리고누클레오티드 처리된 세포의 생존성을, 필수 염료인 요오드화 프로피듐(최종 농도 5㎍/㎖)으로 염색시킴으로써, 다수의 공여체에서의 모든 누클레오티드의 각각의 배치에서 결정하였다. 요오드화 프로피듐을 배제시키는 생존 세포의 퍼센트를 플로우 세포계수기에 의해 결정하였고, 1 내지 20μM의 용량 범위에서 모든 올리고누클레오티드의 모든 배치에 의한 처리 후 90%를 넘었다 (90 내지 99%).
시토카인 분석
세포 유도된 사람 시토카인 농도를 첫 번째 2벌 미세플레이트로부터의 세포 상층액에서 결정하였다. 인터루킨-2(IL-2) 수준의 마이토젠 유도된 변화를 시판되는 ELISA 키트(R ＆ D systems, Quantikine kit, Minneapolis, MN)를 사용하여 결정하였다. 모든 ELISA 결과를 pg/㎖로서 표현하였다.
전기영동 이동도 시프트 분석(EMSA)
시험 올리고누클레오티드를 제조업자 프로토콜(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에 따라 T4 폴리누클레오티드 키나아제를 사용하여 [γ-32P]-ATP(ICN, Costa Mesa, CA)로 5' 말단에서 표지화시켰다. HeLA 세포 추출물(Promega) 10㎍을 표지된 올리고누클레오티드 약 80,000 cpm과 실온에서 20분간 인큐베이팅시켰다. 결합 반응 혼합물은 Tris-HCl(pH 7.5) 10mM, NaCl 50mM, DTT 0.5mM, EDTA 0.5mM, MgCl21mM, 4% 글리세롤 및 폴리(dI.dC) 0.5㎍을 함유하였다. DNA-단백질 복합체를 100V에서 약 3시간 동안 0.5x TBE 완충액(Tris 50mM, 붕산 45mM, EDTA 0.5mM)을 함유하는 4% 폴리아크릴아미드 겔을 통한 전기영동에 의해 분해시켰다. 겔을 건조시키고, 포스포르이매저(Biorad, Richmond, CA)를 사용하여 자동방사능사진을 촬영하였다.
DNase 풋프린트(footprint) 검정 및 겔 시프트 검정을 위한 cDNA 제조
DNase 풋프린트 검정 및 겔 시프트 검정에서 단백질-DNA 결합에 사용되는 cDNA(약 300개의 염기쌍)을 플라스미드 pCAT3e 28b, pCAT3e 28h 또는 pCAT3e 28h-1로부터 단리시켰다. 각각의 플라스미드 60㎍을 Bg1II으로 분해시키는데, 일부를 선형성 검사를 위해 아가로오스 겔에 놓은 후, 나머지를 페놀/세바그(sevag) 추출시키고, 에탄올 침전시킨 후, 물에 재현탁시키고, SacI로 분해시켰다. 다시, 작은 분획을 겔에 놓고 절단 유무를 검사하였다. (2개의 밴드가 나타나야 함: 4kb 밴드 및 300b.p. 밴드) 나머지 분획을 페놀/세바그 추출하고, 에탄올 침전시켰다. 하기 탈인산화를 위해, DNA 펠레트를 물(62㎕)의 작은 부피 중의 재현탁시키고, 20U/㎕ 알칼리 포스파타아제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 1㎕ 및 10X 반응 완충액 7㎕을 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시킨 후, pH 8.0의 0.2M EGTA 7㎕를 첨가하고, 전체 튜브를 65℃에서 10분간 가열시켰다. 탈인산화된 DNA의 전체 77㎕를 1% 아가로오스 겔에 놓고, 퀴아젠(Santa Clarita, CA)으로부터의 퀴아퀵(Qiaquick) 겔 추출 키트를 사용하여 300 b.p. 밴드를 정제시켰다. 정제된 300 b.p. 밴드의 최종 부피는 70㎕이었고, 이것의 농도는 하기와 같이 계산되었다: 60㎍ x (300 b.p./4300 b.p.) = 4.2㎍, 이들 모든 조작 후 50% 회복을 가정한 경우: 2.1㎍/70㎕ = 30ng/㎕. 각각의32P 말단-표지화 반응(키네이싱(kinasing))을 위해, 정제된 300 b.p. DNA 5㎕ 내지 7㎕를 사용하였다.
겔 시프트 검정을 위한 폴리아크릴아미드 겔 제조
0.5X TBE 중의 4% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 용액을 프로메가 겔 시프트 검정 시스템스(Promega Gel Shift Assay Systems) 공업 회보에 따라 제조하였다 (4% 아크릴아미드, 0.05% 비스아크릴아미드, 2.5% 글리세롤, 0.5X TBE). 상기 겔 용액 250㎖ 원액을 제조하고, 여과시키고, 4℃에서 보관하였다. 각각의 사용을 위해, TEMED 12.5㎕ 및 10% 과황화 암모늄 187.5㎕를 원액 4% 겔 용액의 각각의 25㎖에 첨가시키고, 16.5cm X 16.5cm X 0.75mm 유리 플레이트에 부었다. 겔을 최적 결과를 위해 밤새 항상 중합되도록 하였다. 겔을, 샘플을 로딩시키기 전에 100V에서 30분간 0.5X TBE 완충액중에서 예비조작하였다.
이중 가닥 올리고누클레오티드 형성 및 정제
여기에 사용된 방법은 제이콥 조셉(Jacob Joseph) 등의 문헌[Antiparallel polypurine phosphorothioate oligonucleotides from stable triplexes with the rat α1(I) collagen gene promoter and inhibit transcription in cultured rat fibroblasts, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 11, 2182-2188]으로부터 유래하였다. 동량의 상보적 단일 가닥을 0.25M NaCl 중에서 80℃에서 5분간 가열시킨 후, 실온까지 저속 냉각시켰다. 어닐링된 이중 가닥 올리고누클레오티드를 6% 비변성 (29:1) 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 정제한 후, "분쇄(crushed) 및 침지(soked)" 절단시키고, 샘브룩(Sambrook), 프리츠히(Fritsch) 및 마니아티스(Maniatis)의 문헌[Molecular cloning, a laboratory manual"에 기재된 방법을 사용하여 에탄올 침전시켰다. 이중 가닥 올리고 약 20ng을 각각의 표지화 반응에서 사용하였다.
DNA의 말단32P 표지화
300 b.p. cDNA 150 내지 200ng 또는 이중 가닥 올리고 20ng을 37℃에서 1시간 동안 10㎕ 부피에서 [γ-32P]ATP(4500Ci/mmole, ICN, Irvine, CA) 10μCi 및 키나아제 10U 및 1X 키나아제 완충제(둘 모두 프로메가로부터 구입)와 인큐베이팅시키고, 센트리 스핀(Centri Spin)-10 칼럼(Princeton Separation, Adelphia, NJ) 상에서 정제시켰다. 키네이싱된 DNA 약 80,000 내지 100,000 cpm을 각각의 겔 시프트 반응에서 사용하였다.
겔 시프트 검정
단백질(핵 추출물 또는 정제된 전사 인자)을, 키네이싱된 DNA를 첨가하고, 실온에서 추가의 20 내지 30분 인큐베이팅시키기 전에, 실온에서 5 내지 10분간 1X 겔 시프트 완충제(Promega, Madison, WI)과 인큐베이팅시켰다. 0.5X TBE 중에서 100V에서 약 3 내지 4시간 조작한 후, 겔을 2매의 와트만 종이에서 건조시키고, 포스포르-이매저에서 밤새 노출시켰다.
항체 겔 수퍼시프트 검정
Sp1에 대한 항체(clone 1C6, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA)를,32P 표지된 cDNA 또는 올리고를 첨가시키기 전에 1시간 동안 정제된 Sp1(Promega)와 예비인큐베이팅시켰다.
경합 겔 시프트 검정
비표지된 올리고누클레오티드(단일 가닥 또는 이중 가닥)의 약 70 내지 100몰 과량을,32P 표지된 DNA를 첨가시키기 전에, 실온에서 약 30분간 단백질과 예비 인큐베이션시켰다.
pCAT3e 28b, pCAT3e 28h, pCAT3e 28h-1의 구성
CD28 업스트림 cDNA(-197 내지 +28)을 쥬르카트 전체 RNA를 주형으로서 사용하여 RT PCR에 의해 제조하였다. 먼저 이 cDNA 조각을 TA 클로닝 벡터 PCR 2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)내로 클로닝시켰다. 그 후, 동일한 cDNA를 XhoI-SacI 부위에 삽입시킴으로써 pCAT3e(Promega) 내로 서브클로닝시켰다. pCAT3e 28h 및 pCAT3e 28h-1은 -51 내지 -22 서열이 결실되고, 15개의 다른 누클레오티드에 의해 치환된 pCAT3e 28b의 돌연변이체이다.
트랜스펙션(일시적 발현)
트랜스펙션시키기 하루 전에, 쥬르카트 세포를 1:4 또는 1:5 희석율로 80 내지 90% 컨플루언트 세포로부터 2 또는 3 T150s 중에서 제조하였다. 트랜스펙션시키기 바로 전에, 모든 세포를 하나의 플라스크로 풀링시키고, 계수하였다 (농도는 1㎖ 당 약 40 X 104이어야 함). 10 트랜스펙션 반응을 위해 11 X 4 X 106개의 세포를 50㎖ 원뿔형 튜브에서 스피닝시켰다. 세포를 PBS의 본래 부피의 절반으로 1회 세척한 후, 예비가온된 신선한 쥬르카트 배지(90% RPM1 1640, 10% FBS, 1% L-글루타메이트, 1% 페니실린/스트렙토마이신) 44㎖ 중에 재현탁시키면, 최종 농도가 1 x 106/㎖가 되었다. 세포 4㎖를 6-웰 플레이트 중의 각각의 웰에 피펫팅하였다. 2㎎/㎖ 플라스미드(pCAT3e 시리즈) 2.5㎕fmf 1.5㎖ 튜브에 피펫팅하고, RPMI 1640 배지(혈청 비함유, 항생제 비함유) 147.5㎕를 첨가한 후, 퀴아젠으로부터의 수퍼팩트(Superfact) 시제 20㎕를 5회 조절 피펫팅된 혼합물인 플라스미드/배지 용액에 첨가하고, 실온에서 5 내지 10분간 방치시켰다. 트랜스펙션 복합체를 각각의 웰에 한 방울씩 첨가하면서, 플레이트를 부드럽게 교반시켜 혼합시켰다. 세포를 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 인큐베이션시키고, 24시간 후 CAT 검정을 위해 수거하였다. 올리고가 트랜스펙션 후 첨가되는 경우, 원액 400 μM 올리고의 50㎕를 지정된 시간에 세포에 첨가시키고(트랜스펙션시킨지 1시간 후), 세포를 인큐베이터에 다시 넣는다.
CAT 검정
인큐베이션시킨 지 24시간 후, 세포를 각각의 웰로부터 15㎖ 원뿔형 튜브로 피펫팅시키고, 웰을 세포 배지로 잘 세정시켜, 세포가 남아있지 않도록 함으로써 세포를 수거하였다. 이들을 실온에서 2,000 rpm에서 5분간 스피닝시켰다. 배지를 피펫팅하였다. 각가의 세포 펠레트를 2㎖ PBS로 3회 세척하였다 (PBS를 첨가하고, 볼텍싱시키고, 스피닝시키고, 배지를 피펫팅시킴). 가능한 많은 최종 PBS 세척액을 피펫팅 팁으로 제거하였다. 1X 리포터 라이시스 버퍼(Reporter Lysis Buffer, Promega CAT Enzyme Assay System) 400㎕를 각각의 세포 피펫에 첨가하고, 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 세포 펠레트를 실온에서 30분간 용해 완충액에서 인큐베이팅시키고, 가끔씩 볼텍싱시켰다. 이들 튜브를 30분 인큐베이팅의 말기에 60℃에서 10분간 가열시킨 후, 실온, 12,000 rpm에서 2분간 스피닝시키고, 상층액(용해물)을 새로운 1.5㎖ 튜브에 피펫팅하였다. 각각의 CAT 검정 반응을 위해, 용해물 100㎕를 사용하고, 나머지를 -80℃에서 동결시켰다. 각각의 CAT 검정을 다음과 같이 셋업하였다: 물 18.5μ.를 1.5㎖ 튜브(전체 부피 125㎕) 중에 용해물 100㎕, 5㎎/㎖ n-부티릴 CoA(Promega) 및 0.1 μCi/㎕ 클로람페니콜-14C(ICN)과 결합시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 1시간이 될 때쯤, 크실렌(ICN) 300㎕를 각각의 튜브에 첨가하고, 5초간 격렬하게 볼텍싱시키고, 실온에서 3분간 최고 속도로 스피닝시키고, 상부(크실렌) 상 280㎕를 새로운 튜브에 피펫팅시켰다. 0.25M Tris(pH 8.0) 100㎕를 크실렌 상 280㎕에 첨가하고, 볼텍싱시키고, 상기와 같이 스피닝시켰다. 상부 상 200㎕를 섬광 바이알에 피펫팅시키고, 섬광 유체 5㎖를 첨가하고, 전도에 의해 혼합시키고, 샘플을 섬광 계수기에서 계수하였다.
포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 생물학적 활성을 연장시키는 시험관내 올리고누클레오티드 안정성.
포스포로티오에이트 누클레오티드간 결합에 의해 올리고가 변형되면 누클레아제 저항성이 부여됨으로써, 시험관내 생활성이 1 내지 2시간으로부터 24시간까지 연장될 수 있다 [참조: Stein, (1993) Science 261: 1004-1012]. 여기서, 본 발명자들은 G 풍부 올리고인 도 1A(서열 번호 4)가 G 풍부하지 않은 포스포로티오에이트인 도 1B(서열 번호 21) 보다 높은 시험관내 안정성을 가졌다. 도 1A에 있어서, 전기영동도는, 세포외 1A(S)와 세포 1B(L) 둘 모두에 대해, 쥬르카트 세포와의 96시간 인큐베이팅 후 남아있는 도 1B(서열 번호 21) 보다32P 표지된 도 1A(서열 번호 4)가 훨씬 더 온전함을 나타낸다. 닉스핀 칼럼 데이터(도 1B)는 이러한 결과와 일치한다. 여기에서, 96시간 후 도 1A(서열 번호 4)로부터 회복된 온전한 올리고의 퍼센트는 54%(S) 및 59%(L)이며, 도 1B(서열 번호 21)로부터는 10%(S) 및 34%(L)이었다. 이들 데이터는 보다 큰 누클레아제 저항성이 도 1A(서열 번호 4)에 G 풍부 영역이 존재함으로써 완전히 부여되며, 이것은 폴딩된 2차 구조를 형성하는 이 특정한 올리고의 능력과 관련된 것으로 가정된다.
특정 G 풍부 모티프에 좌우되는, 앱태머 올리고누클레오티드에 의한 활성화된 사람 T 세포에서의 기능적 CD28 발현 및 CD28 특이적 IL-2 생성의 억제
표 1로부터의 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 서열 번호 4 내지 21(5μM)에 의한 CD28의 발현 및 CD28 특이적 IL-2 생성의 상대적 억제를 표 2에 도시하였다. 여기에서, 본 발명자들은 이들 앱태머 올리고누클레오티드의 생활성에 대한 정확한 서열적 요건을 조사하였다. 표 2는 억제 활성이 서열 의존성이며, 특히 4개의 염기 만큼 떨어져 있는 2개의 G 쿼텟(quartet)을 함유하는 모티프(서열 번호 5 내지 8)에 의존한다는 것을 도시한다. 이러한 데이터는 도 1A(서열 번호 4)와 같은 올리고의 상호작용 및 이것의 추정 표적이 핵산:핵산 혼성화 요건이라기 보다는 올리고-단백질 상호작용에서 발견되는 요건과 같은 정확한 구조적 요건에 의존한다는 것을 제시한다 (안티센스 및 안티유전자 모델에 의해 밝혀진 바와 같이).
특정 단백질 올리고 복합체를 형성하는 특정 12량체 서열 모티프를 함유하는 올리고누클레오티드
도 2는 HeLa 세포 추출물과 예비인큐베이팅된32P 표지된 올리고누클레오티드의 전기영동 이동도 시프트 분석을 도시한다. 표 3에 있는 올리고의 목록은 4개의 누클레오티드 만큼 떨어져 있는 G-테트라드(tetrad)의 2개 셋을 함유하는 12량체 모티프를 함유하는 2개 [도 1A(서열 번호 4) 및 ICN 15481(서열 번호 5)]을 포함한다. 모티프 함유 올리고(레인 5 및 11)는 기타 포스포로티오에이트 올리고와 구별되는 올리고-단백질 시프트(밴드 A)를 제공하는 유일한 시험 올리고였다. 이들 데이터는 특이적 단백질-올리고 상호작용이 12량체 모티프를 함유하는 올리고에 의해 발생함을 제시한다.
특이적 올리고-단백질 복합체와 상호관련이 있는 앱태머 올리고누클레오티드에 의한 활성화된 사람 T 세포에서의 기능적 CD28 발현의 억제
표 4에서는 5μM에서의 특정한 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 마이토젠 유도된 CD28 발현 및 IL-2 생성 둘 모두에 대한 억제 효과를 전사 인자의 풍부한 공급원인 HeLa 핵 추출물과 인큐베이팅되는 경우에 특이적 올리고-단백질 복합체를 형성하는 이들의 앱태머 능력을 비교하였다. 이들 데이터는 CD28 발현 및 IL-2 분비에 대한 모티프 함유 올리고의 억제 활성과 특이적 겔 시프트 밴드의 형성 간의 상호관계를 명확하게 나타내준다. 2 G-테트라드 내에서의 치환은 기능의 손실을 초래하며, 올리고-단백질 복합체의 소실을 초래한다.
Sp1과 결합하는 CD28 업스트림 프로모터 영역 -197 내지 +28(28b)
P 표지된 CD28 프로모터 영역 -197 내지 +28(28b로도 알려져 있음)을 Sp1 단백질 및 0.5㎍에서 출발하여 Sp1 항체의 연속 3배 희석물과 인큐베이팅시켰다. 겔 수퍼시프트 검정을 수행하고, DNA-단백질-항체 복합체를 전기영동 후 분해시키고, 데이터를 도 4에 나타내었다. 데이터는 Sp1이 CD28 프로모터의 28b 영역에 결합함을 나타낸다. 이러한 상호작용은, 특이적 Sp1 항체를 0.00617ug까지 연속 희석시킨 후, Sp1/32P-28b/Sp1 항체 밴드(밴드 B)가 28b/Sp1 밴드(밴드 A)를 남기면서 소실되기 때문에, 특이적이다. 이는 28b가 Sp1에 특이적으로 결합한다는 것으로 나타낸다. 유리32P 표지된 28b는 밴드 C이다.
Sp1과 또한 결합할 수 있는, CD28 업스트림 프로모터 영역 -197 내지 +28(28b)로부터 유도되고, 12량체 G 풍부 모티프를 함유하는 올리고 -51 내지 -22
28b 내의 정확한 Sp1 결합 영역을 CD28 프로모터 영역 -197 내지 +28에 있는 G 풍부 모티프로 제한시키기 위해, 본 발명자들은 이것의 서열 내에 12량체 GGGGAGGAGGGG를 함유하는 이중 가닥(ds) 30량체 올리고(28b 올리고(서열 번호 1, 표 1)라 명명됨)를 합성하였다.32P 표지화 후, 28b 올리고를 Sp1 추출물과 인큐베이팅시켰으며, 실제로, 이들은 서로에 대해 결합하였다 (도 5, 밴드 A, 레인 2 및 3). 저온 ds 28b 올리고와의 경합에 의해 밴드가 소실되었으며, 이는 결합이 Sp1(레인 4)에 대해 특이적임을 나타낸다. 놀랍게도, 단일 가닥 포스포로티오에이트 G 풍부 올리고인 도 1A(레인 5) 및 16481(레인 6)(둘 모두 G 풍부 모티프를 함유함)는 Sp1에 대한 결합을 위해 경합하였지만, 대조 올리고 ICN 16476(레인 7)은 경합하지 않았다. 도 1A 및 ICN 16481은 Sp1의 DNA 결합 부위에 대한 결합에서 앱태머로서 작용할 수 있다. 이러한 상호작용의 결과는 프로모터 영역에서의 -51 내지 -22에서 Sp1 부위에 대한 Sp1 결합을 억제시킴으로써, CD28 유전자의 Sp1 매개성 전사를 억제시키고, 성숙 CD28 단백질의 발현을 감소시킨다.
이와 같이, 앱태머 및 이러한 앱태머를 이용하여 면역 반응을 변조시키는 방법을 기술하였다. 특정 구체예가 본원에 기재되었지만, 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
서열표
(1) 일반적 사항
(i) 출원인: 로버트 탐
(ii) 발명의 명칭: G 풍부 올리고 앱태머 및 면역 반응을 변조시키는 방법
(iii) 서열의 수:
(iv) 연락처:
(A) 수신인: 크로켓 ＆ 피쉬
(B) 스트리트: 1440 N. 하버 블러바드, 슈트 706
(C) 도시: 풀러톤
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편 번호: 92835
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: WordPerfect 6.1
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원 번호: 미지정
(B) 출원일: 1995년 11월 21일
(viii) 변리사/대리인 상황
(A) 성명: 피쉬, 로버트 디.
(B) 등록 번호: 33,880
(C) 참고/서류 번호: 213/015
(ix) 통신처
(A) 전화: 714-525-3433
(B) 팩스: 714-525-3303
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 1:
GGGTTCCTCG GGGAGGAGGG GCTGGAACCC
(3) 서열 번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 15
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 2:
GGAGCACAGG GTGCT
(4) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 15
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 3:
TCATCACAGG GTGCT
(5) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 4:
TTGGAGGGGG TGGTGGGG
(6) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 5:
GGGGAGGAGG GGCTGGAA
(7) 서열 번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 6:
GGGTTGGAGG GGGTGGTGGG G
(8) 서열 번호 7에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 7:
TTGGAGGGGG AGGAGGGG
(9) 서열 번호 8에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 8:
TTGGAGGGGG AGGTGGGG
(10) 서열 번호 9에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 9:
TTGGAGGCGG TGGTGGCG
(11) 서열 번호 10에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 10:
TTGGAGCCGG TGGTGGCC
(12) 서열 번호 11에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 11:
TTGGAGGGGC TCCTCGGG
(13) 서열 번호 12에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 16
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 12:
TTGGAGCCGG TGGTGG
(14) 서열 번호 13에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 13:
GGGGTGGTGG GG
(15) 서열 번호 14에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 10
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 14:
GGGGTTGGGG
(16) 서열 번호 15에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 5
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 15:
TGGGG
(17) 서열 번호 16에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 4
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 16:
GGGG
(18) 서열 번호 17에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 17:
CACTGCGGGG AGGGCTGGGG
(19) 서열 번호 18에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 18:
ATGGGGTGCA CAAACTGGGG
(20) 서열 번호 19에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 15
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 19:
AACGTTGAGG GGCAT
(21) 서열 번호 20에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 20:
TTCCAGCCCC TCCTCCCC
(22) 서열 번호 21에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 21:
AACCTCCCCC ACCACCCC
(23) 서열 번호 22에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 22
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 22:
ATTCGATCGG GGCGGGGCGA GC
(24) 서열 번호 23에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 23:
CGCTTGATGA GTCAGCCGGA A
(25) 서열 번호 24에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 24:
GATCGAACTG ACCGCCCGCG GCCCCT
(26) 서열 번호 25에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 22
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 25:
AGTTGAGGGG ACTTTCCCAG GC
(27) 서열 번호 26에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 22
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 26:
TGTCGAATGC AAATCACTAG AA
(28) 서열 번호 27에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 27:
AGAGATTGCC TGACGTCAGA GAGCTAG
(29) 서열 번호 28에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 25
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 불명
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 28:
GCAGAGCATA TAAGGTGAGG TAGGA
표 1
표 2
CD28 발현 및 CD28 의존성 IL-2 생성의 억제를 초래하는 올리고누클레오티드 서열의 확인
4개의 염기 만큼 떨어져 있는 2개의 G 퀘텟을 함유하는 12량체 서열은 올리고 활성을 부여한다. ICN 16064의 시험관내 활성에 필요한 최소 서열을 항-CD3/PMA 활성화된 사람 T 세포에서의 CD28 발현의 ICN 16064 매개성 억제에 영향을 미치는 서열 변화(진한 문자)의 기능 및 쥬르카트 T 세포에서의 활성화된 IL-2 생성에 대한 이들의 효과에 의해 결정하였다.
*결과는 7회 실험에서의 억제 범위가 CD28 발현의 52 내지 79%이고, IL-2 생성의 76 내지 89%였던 ICN 16064(100%) 5μM의 활성에 대해 표현된다.
표 3
포스포로티오에이트 올리고의 핵 추출물 단백질-결합 프로파일 (도 2 참조)
표 4
특정 올리고-단백질 복합체의 존재와 상호관련된 기능적 CD28 발현의 억제

Claims (25)

  1. GGnG, GGGG, GnGG 및 GGG로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 G 풍부 영역을 포함하는 서열을 갖는 앱태머로서, G가 구아니딘이고, n이 임의의 누클레오티드인 앱태머.
  2. 제 1항에 있어서, 2개 이상의 영역 중의 2개 이상이 7개 미만의 누클레오티드 만큼 떨어져 있음을 특징으로 하는 앱태머.
  3. 제 1항에 있어서, 2개 이상의 영역 중의 2개 이상이 3개 내지 6개의 누클레오티드 만큼 떨어져 있음을 특징으로 하는 앱태머.
  4. 제 1항에 있어서, 2개 이상의 영역 중의 2개 이상이 4개의 누클레오티드 만큼 떨어져 있음을 특징으로 하는 앱태머.
  5. 제 1항에 있어서, 면역 조절 단백질의 핵산 결합 부위에 대해 경합함을 특징으로 하는 앱태머.
  6. 제 2항에 있어서, 면역 조절 단백질이 SP1, NFKB, EGR1 및 AP2로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 앱태머.
  7. 제 1항에 있어서, 면역 조절 단백질의 핵산 결합 부위에 대해 경합하는 앱태머로서, 2개 이상의 G 풍부 영역 중의 1개 이상이 GGnG를 포함하고, 2개 이상의 영역 중의 2개 이상이 7개 미만의 누클레오티드 만큼 떨어져 있음을 특징으로 하는 앱태머.
  8. 제 1항에 있어서, 면역 조절 단백질의 핵산 결합 부위에 대해 경합하는 앱태머로서, 2개 이상의 G 풍부 영역 중의 1개 이상이 GGGG를 포함하고, 2개 이상의 영역 중의 2개 이상이 7개 미만의 누클레오티드 만큼 떨어져 있음을 특징으로 하는 앱태머.
  9. 제 1항에 있어서, 면역 조절 단백질의 핵산 결합 부위에 대해 경합하는 앱태머로서, 2개 이상의 G 풍부 영역 중의 1개 이상이 GnGG를 포함하고, 2개 이상의 영역 중의 2개 이상이 7개 미만의 누클레오티드 만큼 떨어져 있음을 특징으로 하는 앱태머.
  10. 제 1항에 있어서, 면역 조절 단백질의 핵산 결합 부위에 대해 경합하는 앱태머로서, 2개 이상의 G 풍부 영역 중의 1개 이상이 GGG를 포함하고, 2개 이상의 영역 중의 2개 이상이 7개 미만의 누클레오티드 만큼 떨어져 있음을 특징으로 하는 앱태머.
  11. 제 1항에 있어서, 서열 5'TTG GAG GGG GTG GTG GGG3'(서열 번호 4)을 포함함을 특징으로 하는 앱태머.
  12. 제 1항에 있어서, 서열 5'GGG GAG GAG GGG CTG GAA3'(서열 번호 5)를 포함함을 특징으로 하는 앱태머.
  13. 제 1항에 있어서, 서열 5'GGG GTG GTG GGG3'(서열 번호 13)을 포함함을 특징으로 하는 앱태머.
  14. 제 1항에 있어서, 서열 5'TTG GAG GGG GAG GAG GGG3'(서열 번호 7)을 포함함을 특징으로 하는 앱태머.
  15. 제 1항에 있어서, 서열 5'TTG GAG GGG GAG GTG GGG3'(서열 번호 8)을 포함함을 특징으로 하는 앱태머.
  16. 제 1항에 있어서, 서열 5'GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG3'(서열 번호 6)을 포함함을 특징으로 하는 앱태머.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 앱태머를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자 체내의 면역계 반응을 변조시키는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 앱태머를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 부적당한 면역계 반응을 특징으로 하는 질환에 걸린 환자를 치료하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 질환이 이식편 대 숙주 반응을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 질환이 자가면역 질병을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 질환이 류마티스성 관절염을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 질환이 다발성 경화증을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 질환이 피부홍반성 루푸스를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 20항에 있어서, 질환이 인슐린 의존성 진성 당뇨병을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 20항에 있어서, 질환이 건선을 포함함을 특징으로 하는 방법.
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