CZ227199A3

CZ227199A3 - Aptamer

Info

Publication number: CZ227199A3
Application number: CZ992271A
Authority: CZ
Inventors: Robert Tam
Original assignee: Icn, Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 1999-12-15
Also published as: NO993170L; US6994959B1; AU5720098A; BR9714438A; CA2278031A1; PL334197A1; NO993170D0; EP0968226A4; IL130192A0; EP0968226A1; HU0000769A; WO1998029430A1; JP2002512599A; SI20117A; SK84599A3; KR20000069658A

Description

Aptamer

Oblast techniky

Vynález se týká oboru imunologie.

Dosavadní stav techniky

Patogeneze a aktivace mnoha běžných onemocnění zprostředkovaných T-buňkami vzniká na základě nesprávné imunitní odezvy dané abnormální aktivací T-buněk. Uvažuje se, že řada dalších onemocnění způsobených abnormální aktivací Tbuněk zahrnuje cukrovku typu I (závislost na inzulínu), zánět štítné žlázy, sarkoidózu, roztroušenou sklerózu, zánět uveálního traktu, revmatický zánět kloubů, lupus erythematodes, zánětlivé onemocnění střev (Crohnova nemoc a vředovitý zánět tlustého střeva) a aplastická anemie. Navíc řada syndromů zahrnující septický šok a nádorem indukovanou kachexii může zahrnovat aktivaci T-buněk a zvýšenou produkci potenciálně toxického množství lymfokinů. Normální aktivace Tbuněk také způsobuje odmítnutí transplantovaných buněk a orgánů tím, že T-buňky produkují nezbytné signály pro účinné zničení cizorodé tkáně dárce.

Aktivace T-lymfocytů, která vede k proliferaci expresi genu a k vylučování imunomodulačních vyžaduje dva nezávislé signály. První signál

T-buněk a cytokinů, zahrnuje rozpoznání antigenu, který je prezentován molekulami hlavního histokompatibilního komplexu na povrchu buněk prezentujících antigen (APC), pomocí komplexu receptoru specifického pro Tbuňky/CD3. Druhý signál, který slouží k regulaci odezvy Tbuňky na antigen, tvoří intercelulární interakce mezi Tbuňkami a APC, které nejsou antigenně specifické. Tyto sekundární nebo ko-stimulační signály určují sílu odezvy Tbuněk na antigen. Ko-stimulované buňky reagují zesílením transkripce genu specifického cytokinů a stabilizací vybrané

4 4 4 4 4 4 · 4 · • · · · · *·· 4 44 •4 444 44 44 444 • 44 4444 4

.....·* mRNA. Aktivace T-buněk v případě, že neproběhne ko-stimulace vede k zastavení odezvy T-buněk. Jeden klíčový ko-stimulační signál vzniká interakcí povrchového receptoru T-buňky CD28 s molekulami příbuznými s B7 na APC (Linsley and Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212). CD28 se konstitutivně exprimuje u 95 % T-buněk CD4⁺ (které působí jako pomocník při produkci protilátek u B-buněk) a 50 % T-buněk CD8⁺ (které mají cytotoxické funkce) (Yamada et al. (1985) Eur. J. Immunol 15: 1164-1168) . Následuje antigenní nebo in vitro mitogenní stimulace, dále dochází k indukci povrchového CD28, stejně jako k produkci jistých imunomodulačních cytokinů. Tyto cytokiny zahrnují interleukin-2 (IL-2), který je nutný, aby proběhl buněčný cyklus T-buněk, interferon-gama (IFNy), který vykazuje různé antivirové a protinádorové účinky a interleukin-8 (IL-8), který je znám jako chemotaktický faktor v případě neutrofilů a lymfocytů. Ukázalo se, že tyto cytokiny jsou regulovány dráhou CD28 aktivace T-buněk (Fraser et al. (1991) Science 251: 313-316, Seder et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 299-304, Wechsler et al. (1994) J. Immunol. 153: 25152523). IL-2, IFNy a IL-8 jsou podstatné při podpoře širokého rozsahu imunitní odezvy a ukázalo se, že se nadměrně exprimují při stádiích mnoha onemocnění, které zprostředkovávají Tbuňky.

V případě onemocnění lupénky aktivované T-buňky lézí převážně uvolňují cytokiny Thl, jako jsou IL-2 a IFNy (Schlaak et al. (1994) J. Invest. Derm. 102: 145-149). Tyto vylučované cytokiny indukují, že normální keratinocyty exprimují stejný fenotyp (HLA DR⁺/ICAM-1⁺) , jako se nachází v lézích lupénky (Baadsgaard et al. (1990) J. Invest. Derm. 95: 275-282). Také IL-8 působí in vivo a in vitro zánětlivou odezvu a protože je vylučován ve velkém množství aktivovanými T-buňkami a keratinocyty, které pocházejí z lézí lupénky, považují se za hlavní faktor patogenních změn, které je možno spatřit na kůži postižené lupénkou, jako je například hyperproliferace • 4 · 4 4 4 · ··»« ••44 4 444 4 44 4 • 99999 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 keratinocytů. Ukázalo se, že jeden z rodiny receptorů B7 (přirozené ligandy CD28 náležené na APC) BB1, se exprimuje v keratinocytech pocházejících z lézí lupénky, ale není exprimován neinfikovanými kožními keratinocyty (Nickoloff et al. (1993) Am. J. Pathology 142: 1029-1040). Tato skutečnost ukazuje na důležitou úlohu aktivace T-buněk v patogenezi onemocnění.

V případě jiných poruch kůže zprostředkovaných T-buňkami, jako je alergická kontaktní dermatitida a plochý lišej, většina dermálních a epidermálních T-buněk CD3⁺ exprimuje ve velkém množství CD28, ale u normální kůže a u karcinomu bazálních buněk (jde o kožní onemocnění, které není zprostředkováno Tbuňkami) se CD28 exprimuje pouze v perivaskulárních T-buňkách. Podobně v případě alergické kontaktní dermatitidy a plochého lišeje se zjistila exprese B7 u dermálních dendritických buňkách, dermálních APC a u keratinocytů, ale nikoli v případě normální kůže a karcinomu bazálních buněk (Somon et al. (1994)

J. Invest. Derm. 103: 539-543). To naznačuje, že dráha CD28/B7 je důležitým mediátorem kožních onemocnění, jejichž zprostředkovatelem jsou T-buňky.

Chybná aktivace T-buněk spojená s jistým auto-imunitním onemocněním, která jsou způsobena ztrátou vlastní tolerance se převážně charakterizují přítomností T-buněk CD28⁺ a expresí jejich ligandu B7 na aktivovaných APC (monocyty, makrofágy nebo dendritické buňky). Tato onemocnění zahrnují autoimunitní Gravevův zánět štítné žlázy (Garcia-Cozar et al. (1993) Immunologia 12, 32), sarkoidozu (Vandenberghe et al. (1993)

Int. Immunol. 5: 317-321), revmatickou artritidu (Verwilghen et al. (1994) J. Immunol. 153: 1378-1385) a lupus erythematodes, (Sfikakis et al. (1994) Clin. Exp. Immunol. 96: 8-14). Při normální aktivaci T-buněk, které způsobují odmítnutí transplantovaných buněk a orgánů, je při zpuštění receptoru T-buněk kritické navázání CD28 na svůj vhodný ligand B7 během, za účelem dosažení alogení odezvy na cizí antigeny, ······ · ··· ·· ·· ·· ·· ·· například darovaná tkáň (Azuma et al. (1992) J. Exp. Med. 175: 353-360, Turka et al (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105).

Tradiční terapie autoimunitních onemocnění nepředchází aktivaci T-buněk, což je účinný krok při autoreaktivních imunitních odezvách na vlastní antigen. Léky, jako jsou steroidy a nesteroidní protizánětlivé léky (NSAIDS) se v současné době používají pro zmírnění symptomů, ale nezabrání progresi onemocnění. Navíc steroidy mohou mít vedlejší účinky, jako je osteoporeza, cukrovka a jsou toxické pro orgány, mohou také zrychlit degenerační proces chrupavek a způsobují tak zvané post-infekční zarudnutí do 2 až 8 hodin. NSAIDS mohou způsobovat vedlejší účinky v gastrointestinálním traktu a zvyšuje nebezpečí agranulocytózy a iatrogenní hepatitidy.

Jako jedna forma terapie se také používají imunosupresivní léky, zvláště v pokročilých stavech onemocnění. Tyto léky tlumí celý imunitní systém a léčba má těžké vedlejší účinky, které zahrnují vysoký krevní tlak a nefrotoxicitu. Ani imunosupresivní činidla, jako je cyklosporin a FK506 nemohou inhibovat dráhu aktivace T-buněk závislou na CD28 (June et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7: 4472-4481).

Současné antigeny, které způsobují aktivaci T-buněk zahrnují syntetické peptidy, monoklonální protilátky a rozpustné formy molekul aktivace T-buněk. V současné době se zatím neidentifikovaly pro molekuly aktivace T-buněk, jako je CD28, CD40L a rodina CAM adhezních molekul, konkurenční syntetické peptidy. Ukázalo se, že monoklonální protilátky (mAb) mají pravděpodobně terapeutický účinek při onemocnění zprostředkované T-buňkami, jako je lupénka (anti-CD4 (Prinz et al- (1994) Lancet 338: 320-321)) a při imunosupresi normální aktivace T-buněk u aloimplantátú (anti-VCAM-1 a VLA-4 (Isobe et al. (1994) J. Immunol 153: 5810-5818)). V případě chronické léčby si hostitelské zvíře vyvine protilátky proti monoklonálním protilátkám, což omezuje jejich použití.

Vyvinuly se „humanizované monoklonální protilátky, které zjevně zmenšují nebezpečí indukované imunitní odezvy na tyto monoklonální protilátky. Tyto humanizované monoklonální protilátky jsou stále ve stádiu vývoje a navíc jsou tvořeny velkými proteiny a proto může být obtížné dosažení jejich cílového místa. Vyvinuly se rozpustné formy molekul aktivace T-buněk, jako je CTLA-4Ig, jenž obsahují extracelulární oblast lidského genu CTLA-4 (která je v podstatě příbuzná CD28) ve fúzi s řetězcem lidského IgCy. Ukázalo se, že CTLA-4Ig specificky blokuje aktivaci normálních T-buněk a tak se předchází odmítnutí xenogeních (Lenschow et al. (1992) Science 257: 789-792) a alogeních (Turka et al. (1992) Proč. Nat. Acad. Sci USA 89: 11102-11105) kardiálních aloimplantátů u krys a dále má terapeutický účinek při chybné aktivaci Tbuněk, jak se zjistilo například v případě atoimunitní glomerulonefritidy (Nishikawa et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 1249-1254). Rozpustný CTLA-4Ig má však podobná omezení jako monoklonální protilátky a navíc je jejich příprava nákladná. Opravdová funkce molekuly podobné CD28 není známa, proto dříve než se budou hodnotit jakékoliv výhody léčby, je nutné určit tyto funkce.

Při inhibici exprese CD28 na buněčném povrchu nedochází po delší dobu k odezvě nebo dojde k deleci aktivovaných T-buněk. Deaktivace předchází proliferaci T-buněk a zastavuje Tbuněčnou specifickou produkci specifických imunoregulačních cytokinů, jako je interleukin-2, interferon-gama a interleukin-8.

Regulace exprese genu CD28 se může dosáhnout za použití antimediátorových oligonukleotidů, které tvoří triplexy, pomocí hybridizace oligodeoxyribonukleotidů nebo oligoribonukleotidů se sekvencemi DNA nebo RNA v genu CD28 nebo v oblasti promotoru (popisuje se

PCT/US96/01507, podáno 30. srpna 1996) v publikaci Použitím oligonukleotidů se předchází mnoha nástrahám spojených se · 4 ·* · · 9 · ·9 • · 4 4 9 9 9 · · · • ··· · · 9· 9 9 9 « · 9 9 9 9 9 • · · 9 4 99 99 99 99 současnými činidly, která se používají při blokování účinků normální a abnormální aktivace T-buněk. Tyto oligonuklotidy, které se připravily pro účely antimediátorové strategie jsou náchylné k degradaci vnitrobuněčnými nukleázami nebo nukleázami, které se nachází ve vnějším prostředí buňky.

Zjistilo se, že navázání DNA (nebo RNA) na protein je základní dráha, kterou se řídí transkripce genu. Tyto regulační proteiny nebo transkripční faktory rozeznávají sekvence DNA, které vykazují specifickou sekundární strukturu a následující interakce mohou vést k pozitivní a negativní kontrole exprese genu. Aptamery jsou krátké oligonukleotidové sekvence, které se mohou specificky vázat na specifické proteiny. Ukázalo se, že různé aptamerové sekvence mohou specificky vázat různé proteiny. Například sekvence GGNNGG, kde symbol N je guanosin (G), cytosin (C), adenosin (A) nebo thymidin (T) a specificky se váže na trombin (popisuje se v publikaci Bock et al. (1992) Nátuře 355: 564-566 a v patentu č. 5582981 (1996) Toole et al.) .

Aptamerové sekvence se nepopisují, ale mohou fungovat jako konkurenční inhibitory míst vázající DNA na regulačních proteinech, které jsou známy jako transkripční faktory. Transkripční faktory jsou třídy proteinů, které regulují geny primárním navázáním na specifické regulační sekvence nacházející se ve směru 5' konce promotorové oblasti těchto genů. Tato interakce vede k iniciaci transkripce. Jisté transkripční faktory, jako je Spi, AP2, AP-1, EGR-1 a NFkB, jsou kritické při aktivaci T a B lymfocytů (Skerka et al. J. Biol. Chem. 270: 22500-22506, Jung et al. (1995) Ann. Ν. Y.

Acad. Sci. 766: 245-252). V některých případech se tyto transkripční faktory vyvolávají signály iniciovanými následnou ko-stimulací (Jung et al (1995)) Ann. N. Y. Acad. Sci. 766: 245-252). Stále je nutné vyvinout činidla a způsoby, které by zabránili interakci proteinu se specifickým DNA vazebným ·· ·» 99 99 99 · · · · ··» •·9 9 999 9 99

9 9 9 9 9 · ·· · · · « 9 99 99 9 9 místem, která povede k supresí jisté imunitní dráhy zahrnující ko-stimulační dráhu.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje aptamery, jejichž délka se pohybuje mezi 12 a 22 jednotkami nukleové kyseliny včetně. Sekvence, které zahrnují alespoň dvě oblasti bohaté na G, se vybraly ze skupiny zahrnující GGnG, GGGG, GnGG, nGGG a GGGn, kde symbol G je guanidin a symbol n je libovolný nukleotid.

V preferovaném provedení vynálezu se oligonukleotidy navrhují tak, aby vázaly specifické regulační proteiny, jako je Spi a proteiny příbuzné Spi, a působí tak, že konkurují navázání těchto transkripčních faktorů na promotorovou oblast genů, které řídí. Tato skutečnost slouží k modulaci genové exprese tím, že se předchází transkripci genu. Pak aptamerové oligonukleotidy jsou schopny inhibovat funkci RNA nebo DNA, buď její translací na protein, její translokaci do cytoplazmy nebo libovolnou její aktivitu nezbytnou pro její biologické funkce. Když RNA nebo DNA není schopna uskutečnit všechny nebo část svých funkcí, vede to k poruše části genomu, který řídí aktivaci T-buněk. Genom není správně exprimován a tak nemůže modulovat uvedený metabolizmus.

Preferuje se, aby cílová aptamerová nukleová kyselina se ucházela o místa regulačních proteinů vázajících DNA, které specificky regulují molekuly, jenž mohou tlumit aktivaci Tbuněk. Zjistilo se, že pro tyto účely je zvláště vhodné použít protein CD28. Očekává se, že inhibici CD28 a exprese genu příbuzného s CD28 lze použít při léčbě lupénky a jiných onemocnění kůže, syndromů spojených s abnormální aktivací Tbuněk, poruch autoimunity a odmítnutí aloimplantátů.

Způsoby podle vynálezu zahrnují tlumení aktivace T-buněk tím, že pacient přijde do kontaktu z oligonukleotidem, který konkuruje místu vázajícímu DNA regulačního proteinu, čímž se inhibuje exprese regulovaného proteinu, který je znám, že je • *· ·♦ ·· ·· ·· ·»♦ · 9 « » 9 9 9 • 999 9 9 99 999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 999 99 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 99 9 9 99 99 schopný tlumit aktivaci T-buněk. Preferují se oligonukleotidy, které se váží na proteiny, jako je Spi a proteiny příbuzné Spi, jenž regulují transkripci CD28 a genů příbuzných s CD28.

Dále vynález popisuje aplikaci aptamerů za účelem léčby onemocnění , která zahrnují abnormální aktivaci T-buněk, jako je lupénka, lupénka aktivovaná AIDS nebo jiné kožní onemocnění, cukrovka typu I (závislost na inzulínu), zánět štítné žlázy, sarkoidóza, roztroušenou sklerózu, autoimunotní zánět uveálního traktu, revmatický zánět kloubů, lupus erythematodes, zánětlivé onemocnění střev (Crohnova nemoc a vředovitý zánět tlustého střeva), septický šok, nádorem indukovaná kachexie a aplastická anemie. Dále se aptamery mohou použít při regulaci normální aktivace T-buněk, což je nutné v případě odmítnutí aloimplantátů. Toho lze dosáhnout perturbacemi při syntéze a expresi molekul aktivace T-buněk, které zahrnují CD28 a molekuly příbuzné CD28.

Dále vynález popisuje aptamery, které jsou schopny vázat specifické regulační proteiny, jako je Spi a proteiny příbuzné Spi. Tímto způsobem inhibují transkripci genů proteinu CD28 nebo proteinů příbuzných CD28, které a) jsou v normálním případě regulovány uvedenými proteiny a b) mohou modulovat odezvy T-buněk.

Aptamerové oligonukleotidy, které se specificky váží na vazebná místa pro DNA regulačních proteinů, jako je Spi a proteiny příbuzné Spi, budou předcházet navázání regulačního proteinu se specifickou dvouřetězcovou oblastí DNA v promotorové oblasti genu. Konkurenční navázání aptameru bude bránit transkripci genu a tak bude inhibovat tok genetických informací z DNA na protein. Vlastnosti oligonukleotidů, které je činí specifickými vůči jejich cíli, je také činí univerzálními. Vzhledem k tomu, že oligonukleotidy jsou dlouhé řetězce tvořené čtyřmi monomerními jednotkami, mohou se snadno syntetizovat pro libovolnou cílovou sekvenci RNA.

• •000 00 ·0 0* 00

Inhibice exprese genu zprostředkovaná oligonukleotidem se demonstrovala u řady modelů a u in vitro systémů a vykazuje léčebný potenciál, jako nová strategie pro léčbu mnoha lidských onemocnění (Uhlmann and Peyman (1990) Chem. Rev. 90: 544-584, Zon and Stec (1991) Oligonucleotides and analogues- A Partical Approach: 87-108, Miller et al. (1981) Biochem 20: 1874-1880, Orson et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 34353441, Helene and Toulme (1990) Biochem. Biophys. Acta 1049: 99-125, Thierry and Dritschilo (1992) Nucleic Acid Res. 20: 5691-5698). Vzhledem k jistým výhodám syntézy oligonukleotidů rezistentních vůči nukleázám, přičemž oligonukleotidy zahrnují fosforothioaty (popisuje se v publikaci Zon a Stec (1991) Oligonucleotides and analogues - A Practical Approach: 87-108 a fosforothioat-3'hydroxypropylamin (popisuje se v publikaci Tam et al. (1994) Nucleic Acid Res. 22: 977-986) a jsou lépe pohlcovány buňkami, je nyní možné považovat použití oligonukleotidů za novou formu terapeutických činidel.

Aptamerové oligonukleotidy cílené do vazebných míst regulačních proteinů představují alternativní třídu sloučenin založených na nukleové kyselině a nabízejí ideální řešení problémů, na které naráží dosavadní stav techniky. Aptamerové oligonukleotidy se přímo podílejí na modulaci specifické exprese genů a tak zastavují expresi cílového proteinu. Aptamerové oligonukleotidy nevykazují konkurenční inhibici rozpustných receptorů cílového proteinu. Jde o interakce, kde je nutné zcela porozumět vazebným mechanizmům a afinitní interakci receptor-ligand. Oligonukleotidy jsou malé molekuly a proto se nenaráží na stejné sterické problémy, jako je to u velkých molekul inhibitorů.

Popis cílů

Termín „cíle zde znamená molekuly, které se mohou regulovat transkripčními faktory, jenž mají důležitou roli při iniciaci a udržování imunitní odezvy. Tyto molekuly zahrnují ko10 • ft • ftft ft * stimulační molekuly, jako je CD28, a cytokiny, jako je IL-2, GM-CSF a IFNy.

Pro účely léčby se zvířatům, o kterých se předpokládá, že vykazují onemocnění , jenž lze léčit zeslabením exprese kostimulačních molekul, jako je CD28 nebo molekul příbuzných

CD28, se s vynálezem.

mohou aplikovat Oligonukleotidy oligonukleotidy v souladu se mohou začlenit do farmaceutické formulace, která dále může zahrnovat nosiče, zahušťovadla, rozpouštědla, pufry, konzervační činidla, povrchově aktivní činidla, lipozomy a lipidové formulace a podobně. Farmaceutické kompozice mohou také zahrnovat jeden nebo více aktivních ingrediencí, jako jsou antimikrobiální činidla, protizánětlivá činidla, anestetika a podobně. Farmaceutická kompozice se aplikuje řadou způsobů podle toho, je-li nutná lokální nebo systémová léčba a v závislosti na oblasti léčby. Aplikace může být povrchová (okem, vagínou, rektem, nosem), orální, inhalací nebo parenterální například intravenózní, podkožní, intraperitonální nebo intramuskulární injekcí.

Formulace vhodná pro povrchovou aplikaci může zahrnovat masti, mléka, krémy, gely, kapky, čípky, spreje, roztoky a pudr. Běžné farmaceutické nosiče , vodné, práškové nebo olejové báze, zahušťovadla a podobně, podle toho, co je nutné nebo žádané. Také se mohou používat potažené kondomy nebo rukavice. Kompozice vhodné pro orální aplikaci zahrnují prášky nebo granule, suspenze nebo roztoky ve vodném nebo nevodném médiu, kapsule, váčky nebo tablety. Mohou se také požadovat zahušťovadla, aromatizační přísady, ředidla, emulgátory, disperzní činidla nebo pojivá.

Formulace vhodné pro parenterální aplikaci mohou zahrnovat vodné roztoky, které obsahují pufry, lipozomy, ředidla a jiné vhodné přísady.

Dávkování závisí na vážnosti a stavu, který se léčí a na odpovědi na léčbu. V normálním případ se podává jedna nebo • ··»» · « » • 99 · 9 99 9 9 9 ··« 9999 9 999 99 99 99 99 99 více dávek denně, přičemž průběh léčby trvá od několika dní do několika měsíců nebo do okamžiku, kdy je léčba účinná nebo se zmírní stav onemocnění. Odborníci mohou snadno stanovit optimální dávky, způsob dávkování a interval opakování.

Při systémové aplikaci aptamerů se preferuje intravenózní aplikace, přičemž dávka je 5 mg/kg a podává se jednou denně. Při preferované povrchové aplikaci se aptamery podávají v podobě 1 až 5 % roztoku jednou denně. Při preferované pulmonární aplikaci se aptamery podávají v podobě aerosolu v dávce 5 mg jednou za den.

Vynález popisuje aptamerové oligonukleotidy vhodné pro použití při inhibici funkce RNA a DNA, která odpovídá proteinu schopnému modulovat aktivaci T-buněk. V souladu s vynálezem termín „oligonukleotid znamená oligomer nebo polymer ribonukleové kyseliny nebo deoxyribonukleové kyseliny. Tento termín zahrnuje oligomery obsahující přirozeně se vyskytující báze, sacharidy a vnitřní kostry sacharidů, stejně jako oligomery, které obsahují části s podobnou funkcí a jenž se přirozeně nevyskytují. Takové upravené nebo substituované oligonukleotidy jsou často preferovány před přirozenými formami vzhledem k jejich vlastnostem, jako je například zvýšené pohlcování buňkami a větší stabilita v přítomnosti nukleáz.

Oligonukleotidy podle vynálezu s výhodou obsahují přibližně 3 až přibližně 50 jednotek báze nukleových kyselin. Takové oligonukleotidy s výhodou obsahují přibližně 8 až 30 jednotek báze nukleových kyselin a nejvýhodnější je, aby oligonukleotidy obsahovaly přibližně 12 až 22 jednotek báze nukleových kyselin. Je vhodné, aby jednotkou bází nukleové kyseliny byla kombinace báze-sacharid, která je vhodně navázaná na vedlejší jednotku báze nukleové kyseliny prostřednictvím fosfodiesterové nebo jiné vazby.

Oligonukleotidy, které se používají v souladu s vynálezem se mohou běžně připravovat dobře známými metodami syntézy na • * · » « ♦ ·

999 99 99 99 9· 99 pevné fázi. Řada obchodníků, mezi nimi i firma Applied Biosystems, prodává zařízení vhodná pro takovou syntézu. Může se použít libovolné jiné způsoby syntézy. Dobře známé je také použití podobných metod přípravy jiných oligonukleotidů, jako je fosforothioat a 3'amin-fosforothioat.

V souladu s vynálezem je odborníkům jasné, že mediátorová RNA identifikovaná otevřeným čtecím rámcem (ORF) DNA, ze kterého se přepisuje, nezahrnuje pouze informace ORF DNA, ale také připojené ribonukleotidy, které tvoří oblasti, které jsou pro odborníka známi jako 5'- nepřekládaná nebo 3'-nepřekládaná oblast, intervenující sekvenci ribonukleotidů. Tak mohou vznikat oligonukleotidy podle vynálezu, které jsou zcela nebo částečně cíleny na tyto připojené ribonukleotidy stejně jako na informační ribonukleotidy. V preferovaném provedení vynálezu aptamerové oligonukleotidy interaktují s DNA vazebným místem regulačního proteinu, jako je Spi a proteiny příbuzné Spi, a způsobují přerušení exprese genu kódujícího protein zahrnutý do aktivace T-buněk. V preferovaných provedeních podle vynálezu uvedené regulované proteiny jsou CD28 a všechny homology molekuly CD28. Oligonukleotidy zahrnující sekvence obsahující alespoň dvě oblasti bohaté na G, které se definují jako oblasti čtyř nukleotidů obsahující alespoň tři guanosinové zbytky (G), jako je GGGG, GNGG, GGNG, kde symbol N je s výhodou A, C, G, U nebo T. Podle vynálezu se mohou použít dvě takové oblasti bohaté na G oddělené maximálně 6-ti zbytky a s výhodou 4 zbytky nebo menším počtem zbytků. Preferovanými sekvenčními segmenty, které se mohou použít v celku nebo jejich části, jsou:

5' 3' SEQ ID

TTG	GAG GGG GTG GTG GGG	Obrázek č. IA
GGG	GAG GAG GGG GTG GAA	ICN 16481
GGG	GTG GTG GGG	ICN 16525

TTG GAG GGG GAG GAG GGG

ICN 16475 * * *· 04 ·· • 440 4 0 4 • · ·· · · ·

4«

040 • 00

4 4 0

4· 44 44 4«

TTG GAG GGG GAG GTG GGG GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG

ICN 16479 ICN 16065

Zatímco se věří, že uvedené sekvence jsou přesné, vynález se směřuje, aby mohl opravit sekvence, najdou-li se chyby. Oligonukleotidy podle vynálezu obsahují jednu z těchto sekvencí nebo jejich část. Preferuje se použití libovolného z těchto nukleotidů, které se popisují shora v textu, nebo libovolných podobných oligonukleotidů, připravit vzhledem ke znalostem oligonukleotidových cílech, které slouží k utlumení syntézi molekul aktivace T-buněk zahrnující CD28 a molekuly příbuzné s CD28. Očekává se, že inhibice nebo modulace produkce CD28 a/nebo homologů CD28 má podstatný terapeutický účinek při léčbě onemocnění. Za účelem stanovení účinnosti kompozic je nutné provést řadu testů nebo série testů.

které může odborník o preferovaných

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. IA a IB je uvedeno grafické znázornění stability in vitro fosforothioatu značeného ³²P, ICN 16064 (Seq#4), v extracelulární tekutině a v Jukartových buňkách.

Obrázky č. IC a ID jsou grafická znázornění řn vitro stability fosforothioatu značeného ³²P, ICN 16214 (Seq#21), v extracelulární tekutině a v Jukartových buňkách.

Na obrázku č. 1E a 1F je grafické znázornění časově závislé degradace (0 až 96 hodin) každého oligonukleotidů ICN 16064 (Seq#4) a ICN 16214 (Seq#21) , (2 000 cpm) , což se stanovilo elektrolýzou na 20 % polyakrylamidovém denaturačním gelu, po níž následuje zviditelnění použitím Phosphorlmager. Symbol O značí procenta neporušeného ³²P-RT03S v plné délce a symbol · značí zbývající ³²P-RTCO6S v každém časovém bodu, relativní k t=0. Tyto hodnoty se stanovily v extracelulárních (obrázek č. 1E) a buněčných (obrázek č. 1F) eluátech s hodnotou 1 000 ** · · *4 44 44 • · · · 4 4 4 4 ··· · · 44 4 4 4 • · · · · 4 · ··· «· 4 4 · · >4 ·« cpm, které prošly kolonami Nickspin (Pharmacia). Současně se analyzovaly molekulové hmotnosti standardů (Std), ³²P-dNTP (N) a volného ortofosforečnanu (P).

Obrázek č. 2 je grafické znázornění analýzy posunu na gelu, který ukazuje, že oligonukleotidy obsahující motiv 12-merové sekvence bohaté na G (dráha 5 a 11) vykazují vzdálený pruh, který se liší elektroforetickým posunem od pruhu B, který se pozoroval u jiných fosforothioatových oligonukleotidů po inkubaci s jaderným extraktem buněk HeLa. Pruh C je samotný ³²P-oligonukleotid.

Na obrázku č. 3 je grafické znázornění exprese chloramfenikolové acetyltranferázy (CAT), která následuje po transfekci Jurkatových buněk plazmidovým vektorem, jenž obsahuje inzert z promotorové oblasti CD28 o velikosti 226 bp (zbytky -197 až +28) (28b) nebo mutant, který zahrnuje substituci zbytků -51 až -22 sekvencí Seq#3 z Tabulky č. 1 (281) ve směru 5'konce reportního genu CAT, a následující léčby s použitím a bez použití fosforothioatových oligonukleotidů, ICN 16064 a ICN 16481.

Na obrázku č. 4 je grafické znázornění testu super-posunu na gelu, který ukazuje, že navázání Spi na oblast -197 až +28 genu CD28 směrem k 5'konci o velikosti 28 bp je specifické.

Na obrázku č. 5 je grafické znázornění navázání Spi na dvouřetězcový oligonukleotid o velikosti 28 b značeného ³²P (který se odvodil z rodičovské sekvence 28-Seq#l, Tabulka č. 1) a konkurenční navázání dvouřetězcového oligonukleotidů o velikosti 28 b a aptamerových oligonukleotidů (FIGURE1A a 16481).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Oligonukleotidy

Oligodeoxynukleotidy se syntetizují na automatizovaném syntetizéru DNA (Applied Biosystems model 394) za použití ♦ 4 ·· 44 44 94 • 4 4 4 4 4 4 4 ·«· 4 4 44 494

4 4 4 4

444 4 4 44 44 44 94 standardní fosforamiditové chemie, β-kyanoethylfosforamidity, reakční činidla a polystyrénové kolony CPG se získaly od firmy Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA). Kolony 3^Z-AminoModifier C3 CPG se získaly od firmy Glen Research (Sterling, VA) . V případě fosforothioatových oligonukleotidů se standardní oxidační lahve nahradily tetraethylthiuramdisulfidem/acetonitrilem a za účelem postupné adice fosforothioatových vazeb se použil standardní ABI program. Po odštěpení z řízené porézní skleněné kolony se odstranila chránící skupina tím, že se oligonukleotidy ošetřily koncentrovaným hydroxidem amonným při teplotě 55 °C po dobu 8 hodin. Oligonukleotidy se čistily HPLC za použití semipreparační kolony C8 s reverzní fází (ABI). Následuje štěpení DMT chránící skupiny, ošetření 80 % kyselinou octovou a srážení etanolem, čistota produktu se stanovila HPLC za použití analytické kolony C18 (Beckman, Fullerton, CA) . Všechny oligonukleotidy vykazující čistotu vyšší než 90 % se lyofilizovaly. Oligonukleotidy se re-konstituovaly ve sterilní deionizované vodě (ICN, Costa Mesa), objem se doplnil na 400 uM a stanovila se hodnota OD₂6o udělaly se alikvoty a skladovaly se při teplotě -20 °C až do doby dalšího použití.

Ve všech případech se použily alespoň tři série oligonukleotidů uvedených v Tabulce č. 1.

Příklad 2: Studie stability oligonukleotidů in vitro

Analýza stability oligonukleotidů se provedla způsobem, který se popisuje v publikaci Tam et al. (1994) Nucleic Acid Res.

22: 977-986). Profily degradace oligonukleotidů se provedly elektroforézou a kvantifikovaly se za použití kolon Nickspin.

Příklad 3: Buněčné linie a čištění T-buněk

Periferní krevní mononukleární buňky (PBMC) se izolovaly ze sraženiny leukocitů tak, že se 60 ml krve zdravého dárce centrifugovalo v hustotním gradientem Ficoll-Hypaque. Pak se

• 9« • 9 • 99 9	9 •	9· 9 9	·« 9 9 99	99 99 • 9 9 9 9 9
• 9 ·	9	9	« 9	9
99 99		• 9	« 9	·· 99

izolovaly T-buňky z PMBC za použití činidla pro izolaci lymfocytů Lmphokwik, které je specifické pro T-buňky (LK-25T, One Lambda, Canoga Park, CA) . Průměrný výtěžek je 40 až 60 x 10⁶ T-buněk. T-buňky se pak inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C ve 20 až 30 ml kultivačního média RPMI-AP5 (kultivační médium RPMI-1640 (ICN, Costa Mesa, CA) obsahujícím 20 mM pufr HEPES, pH7,45, 5% plazmu, 1% L-glutamin, 1% penicilin/streptomycin a 0,05% 2-merkaptoethanol) za účelem odstranění libovolných adherentních buněk, které zde vystupují jako kontaminanty. Ve všech experimentech se T-buňky promyly RPMI-AP5 a pak se nanesly na mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi. Koncentrace buněk je 2 až 3 x 10⁶ buněk/ml.

Buňky buněčné linie lymfomu T-buněk Jurkat E6-1 (CD28⁺/CD4⁺) (152-TIB) se udržovaly v kultivačním médiu RPMI-10 (kultivační médium RPMI-1640 obsahující 20 mM pufr HEPES pH7,4, 10% fetální telecí sérum (FCS) (Hyclon, Logan, UT) , 1% L-glutamin a 1% penicilin/streptomycin).

Příklad 4: Mitogenem indukovaná aktivace T-buněk a léčba oligonukleotidy

Dříve než se přidaly lidské periferní T-buňky nebo buněčná linie lymfomu T-buněk (v množství 0,3 x 10^s) se duplikát mikrotitračních monoklonálními

200ng/prohluběň) destiček s 96 prohlubněmi potáhl protilátkami proti CD3 (mAb) (6,25(klon HIT 3a, Pharmingen, San Diego, CA) a dvakrát se promyl chlazeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem, pH7,4 (PBS). T-buňky ošetřené Anti-CD3 monoklonálními protilátkami se dále aktivovaly přidáním 2ng forbol-12-myristat-13-acetatu (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA) a inkubovaly se po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C. Ihned po aktivaci se T-buňky aktivované anti-CD3/PMA ošetřily 1 až 20 ýiM CD28 specifickými a kontrolními oligonukleotidy a aplikace se opakovala ještě jednou o 24 hodin později. T-buňky z jednoho duplikátu mikrotitračních destiček se použily pro ·· ·* ·* ·· ·· « * · · · « · · « ··* · · · · · · • · » · ·· · · »·· ··· ·*«··· » ·

99 9· 99 99 imunofluorescenční analýzu a druhá mikrotitrační destička se použila pro analýzu proliferace T-buněk.

Příklad 5: Imunofluorescenční studie

Po aktivaci se 150 pl buněčného supernatantu z prvního duplikátu mikrotitrační destičky přeneslo na jinou mikrotitrační destičku za účelem analýzy buněčné produkce cytokinů. Zbývající buňky se dvakrát promyly isotonickým fyziologickým roztokem, pH7,4 (Becton Dickinson, Mansfield, MA) a resuspendovaly se v 50 pl izotonického fyziologického roztoku a rozdělily se na dva vzorky. Jeden alikvot vzorku se obarvil PE-CD28/FITC-CD4 monoklonálními protilátkami a obarvením druhého alikvotu se srovnatelnými kontrolními protilátkami značenými PE/FITC. Všechny protilátky značené fluorescencí se získaly od firmy Becton Dickinson (San Jose, CA) . Inkubace se provedla ve tmě při teplotě 4 °C po dobu 45 minut za použití saturující koncentrace monoklonálních protilátek. Nenavázaná značící látka se před analýzou na průtočném cytometru FACScan (Becton Dickinson) odstranila promytím PBS. Hustota antigenu se nepřímo stanovila v přiváděných živých buňkách a vyjádřila se jako průměrné pásmo fluorescence (MFC). Povrchová exprese CD4⁺ buněk barvených CD28 monoklonálními protilátkami se stanovila buněk CD28⁺CD4⁺ od MCF odečtením MCF Životaschopnost buněk buněk

CD28~CD4~. a buněk kontrolních neošetřených ošetřených oligonukleotidy se stanovila u každé série všech oligonukleotidů u více donorů barvením propidiumjodidem (konečná koncentrace je 5 pg/ml). Procento živých buněk po ošetření všemi sériemi oligonukleotidů v rozmezí dávky 1 až 20 jUM, které se odhalily propidiumjodidem se stanovilo cytometricky a bylo vyšší než 90 % (rozmezí 90 až 99%).

Příklad 5: Analýza cytokinů ·· ·· ·· ·· ·· • «··· ···· ··· · · ·· · · · · • ··· · · ·· ··« »·· ······ · · • ·» »· ·· ·· ··

Koncentrace lidských cytokinů získané z buněk se stanovila ve všech buněčných supernatantech z prvního duplikátu mikrotitračních destiček. Mitogenem indukované změny v množství interleukinu-2 (IL-2) se stanovily použitím běžně dostupného kitu ELISA (R and D systems Quantikine kit, Minneapolis, MN) . Všechny výsledky testu ELISA se vyjadřují v jednotkách pg/ml.

Příklad 6: Analýza změny elektroforetické mobility (EMSA)

5'konec testovaných oligonukleotidů se označil [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (ICN, Costa Mesa, CA) za použití T4 polynukleotidové kinázy podle protokolu výrobce (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . 10 pg nukleárního extraktu buněk HeLa (Promega) se inkubovalo přibližně s 80 000 cpm značeného oligonukleotidu po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Reakční směs pro navázání obsahovala 10 mM Tris-HCl (pH7,5), 50 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 1 mM MgClž, 4 % glycerol a 0,5 jug poly(dl.dC). Komplexy DNA-protein se dělily na elektroforéze na 4% polyakrylamidovém gelu, který obsahuje 0,5 x TBE pufr (50 mM Tris, 45 mM kyselina ortoboritá, 0,5 mM EDTA) po dobu přibližně 3 hodiny při napětí 100 V. Gel se sušil a vytvořil se autoradiograf za použití Phosphorlmager (Biorad, Richmond, CA) .

Příklad 7: Příprava cDNA pro účely mapování oligonukleotidů za použití nukleáz štěpících DNA a test posunu na gelu cDNA (o velikosti 300 párů baží), která se používá při navázání proteinu a DNA v testech mapování oligonukleotidů a posunu na gelu, se izolovala z plazmidů pCAT3e28b, pCAT3e28h nebo pCAT3e28h-l. 60 jig každého plazmidu se štěpilo restrikčním enzymem BglIII. Některá štěpená DNA se nanesla na agarózový gel, aby se ověřila linearita DNA. Zbytek se extrahoval směsí fenol/sevag, srážel se etanolem a znovu byl resuspendován ve vodě a štěpil se restrikčním enzymem Sací.

Malá část se opět nanesla na gel, aby se ověřilo, zda došlo ke štěpení (měly by se objevit dva pruhy o velikosti 4 kb a 300 bp). Zbytek se extrahoval směsí fenol/sevag a srážel se etanolem. Pro účely následující defosforylace se pelet DNA resuspendoval v malém objemu vody (62 jíl) a přidal se 1 jal 20 U/jul alaklické fosfatázy (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 7 jol 10 x koncentrovaného reakčního pufru. Po inkubaci reakční směsi při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny se přidalo 7 ul 0,2 M EGTA pH8,0 a vše se zahřálo při teplotě 65 °C po dobu 10 minut. Celkový objem 77 jol defosforylované DNA se nanesl za účelem čištění pruhu o velikosti 300 pb na 1 % agarozový gel. K extrakci DNA z gelu se použil extrakční kít Qiaquick od firmy Qiagen (Santa Clarita, CA) . Konečný objem čištěného pruhu DNA o velikosti 300 bp byl 70 jUl a její koncentrace se vypočítala následujícícm způsobem: 60 ^ug x (300 bp/4 300 bp) = 4,2 ug. Předpokládá se, že se zisk DNA z pruhu je 50 % a pak koncentrace bude 2,lug v 70 jal. To znamená 30 ng/jul. Konec DNA se značil ³²P (pomocí kinázy). V reakci, kde dochází ke značení se použilo 5 až 7 jal izolované DNA o velikosti 300 bp.

Příprava polyakrylamidového gelu pro účely testu posunu na gelu

Připravil se roztok 4 % polyakrylamidového gelu, který nemá denaturační vlastnosti, v 0,5x TBE podle technického buletinu Promega Gel Shift Assay Systems (4 % akrylamid, 0,05 % bisakrylamid, 2,5 % glycerol, 0,5 x TBE). Připravil se zásobní roztok shora popsaného gelu o objemu 250 ml, přefiltroval se a uchovával se při teplotě 4 °C. Při každém použití se přidalo ke každým 25 ml zásobního roztoku 4 % gelu 12,5 ul TEMED a

287,5 jUl 10 % persulfátu amonného a roztok gelu se vylil na skleněnou desku o rozměrech 16,5 cm x 16, 5 cm x 0,75 mm. Aby se dosáhlo optimálních výsledků, gel se nechal vždy polymerizovat přes noc. Elektroforéza proběhla pouze v pufru

0,5 x TBE bez vzorků po dobu 30 minut při napětí 100 V a pak se nanesly vzorky.

pomalé chladnutí na oligonukleotidy spojené

Příklad 8: Příprava a čištění dvouřetězcových oligonukleotidů Zde použitý způsob pochází z publikace „Antiparallel polypurine phosphorothioate oligonucleotides form stable triplexes with the rat al(I) collagen gene promotor and inhibit transcription in cultured rat fibriblasts Jacob Joseph et al., Nucleic Acids Reseacrh, 1997, Vol.25, No 11, 2182-2188. Stejné množství komplementárního řetězce se zahřálo na teplotu 80 °C po dobu 5 minut v 0,25 M NaCl. Pak následuje teplotu místnosti.

teplotní hybridizací elektroforézou na 6 % polyakrylovém gelu (29:1), který nemá denaturační vlastnosti, později se vyřízly a eluovaly se z gelu a srážely se etanolem. Použily se způsoby popsané v publikaci „Molecular cloning, a laboratory manual, Sambrook, Fritsch and Maniatis. Do značící reakce se přidalo přibližně 20 ng dvouřetězcových oligonukleotidů.

Dvouřetězcové se izolovaly

Příklad 9: Značení konce DNA pomocí ³²P

150 až 200 ng cDNA o velikosti 300 bp nebo 20 ng dvouřetězcových oligonukleotidů se inkubovalo s 10 pCi [γ³²P]ATP (4 500 Ci/mmol, ICN, Irvin, CA) a s 10 jednotkami kinázy a lx koncentrovaného kinázového pufru (firma Promega) v objemu 10 μΐ při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny a čistily se na koloně Centri Spin 10 (Princeton Separation, Adelphia, NJ) . V reakci každého testu posunu na gelu se používala DNA vykazující přibližně 80 000 až 100 000 cpm, která je upravená kinázou.

Příklad 10: Test posunu na gelu

Proteiny (nukleární extrakt nebo čištěný transkripční faktor) se inkuboval s lx koncentrovaným pufrem pro test posunu na ftftft ftftftft ftftftft • ftftft ft ftftft · ftft · gelu (Promega, Madison, WI) při teplotě místnosti po dobu 5 až 10 minut, pak se přidala DNA upravená kinázou a proběhla inkubace po dalších 20 až 30 minut při teplotě místnosti. Vzorky se pak nanesly na upravený 4 % gel, který nemá denaturační vlastnosti. Elektroforéza proběhla po dobu 3 až 4 hodin při napětí 100 V v pufru, kterým je 0,5 x koncentrovaný TBE. Gel se sušil na dvou listech Whatmanova papíru a exponoval se ve vývojce luminiscence fosforu přes noc.

Příklad 11: Test protilátkového super-posunu na gelu

Protilátky Spi (klon 1C6, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) se pre-inkubovaly s čištěným Spi (Promega) po dobu 1 hodiny a pak se přidala cDNA značená ³²P nebo oligonukleotidy.

Příklad 12: Konkurenční test posunu na gelu

Neznačené oligonukleotidy v přibližně 70 až 100 molárnírn nadbytku (buď jednořetězcové nebo dvouřetězcové) se preinkubovaly s proteinem při teplotě místnosti po dobu přibližně 30 minut a pak se přidala DNA značená ³²P.

Příklad 13: Konstrukce pCAT3e28b, pCAT3e, pCAT3e28h-l

RT PCR umožnila vytvořit cDNA směrem k 5 konci CD28 (-197 až +28), přičemž jako templář se použila celková RNA buněk Jurkat. Tento segment cDNA se nejdříve klonoval do TA klónovacího vektoru PCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stejná cDNA se později sub-klónovala do vektoru pCAT3e (Promega) a začlenila se do místa Xhol-Sacl. PCAT3e28h a pCAT3e28h-l jsou mutanty pCAT3e28b, ve kterých se deletovaly sekvence -51 až 22 a substituovaly se 15 jinými nukleotidy.

Příklad 14: Transfekce (dočasná exprese)

Jeden den před transfekcí se buňky Jurkat připravily do 2 nebo 3 T150 v ředění 1:4 nebo 1:5 z 80 až z 90 % konfluentních buněk. Těsně před transfekcí se všechny buňky slily do jedné

0 0 · · · · · · · · • · · · 0 000 0 00 0 • · 000 00 00 000 000 000 0000 0 0

000 00 00 f>0 00 00 kultivační nádoby a spočítaly se (koncentrace buněk by se měla pohybovat kolem 40 x 10⁴ buněk/ml) . 11 x 4 x 10⁶ buněk pro použití v 10 transfekčních reakcích se centrifugovalo ve zkumavkách s konickým dnem s objemem 50 ml. Buňky se jedenkrát promyly PBS. Objem PBS odpovídá polovině původního objemu. Buňky se resuspendovaly ve 44 ml předehřátého, čerstvého Jurkatova kultivačního média (90 % RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % Lglutamat, 1 % penicilin/streptomycin) tak, že konečná koncentrace byla 1 x 10⁶ buněk/ml. Roztok buněk o objemu 4 ml se pipetoval do každé prohlubně mikrotitrační destičky se 6 prohlubněmi. Do zkumavky o objemu 1,5 ml se pipetovalo 2,5/Ul plazmidu v koncentraci 2 mg/ml (série pCAT3e), přidalo se

147,5 41I kultivačního média RPMI 1640 (bez séra a antibiotik).

Pak se do roztoku, který obsahuje plazmid a kultivační médium, přidalo 20 /ul činidla Superfact od firmy Qiagen. Směs se promíchala pipetou tak, že se roztok 5 x do pipety nasál a opět vypustil a nechala se stát při teplotě místnosti po dobu 5 až 10 minut. Do každé prohlubně s buňkami se po kapkách přidal transfekční komplex a vše se zvolna promíchalo. Buňky se inkubovaly při teplotě 37 °C v inkubátoru s atmosférou CO₂a po 24 hodinách se buňky sebraly pro účely testu CAT.

V případě, že se po transfekci mají přidat oligonukleotidy, se k buňkám v určený čas (1 hodina po transfekci) přidalo 50 ^ul zásobního roztoku 400 _íuM oligonukleotidů a buňky se vrátily do inkubátoru.

Příklad 15: Test CAT

Po 24 hodinách inkubace se buňky sebraly přenesením buněk pipetou z každé prohlubně do zkumavek o objemu 15 ml s konickým dnem. Prohlubně se vypláchly buněčným kultivačním médiem, aby tam nezůstaly žádné buňky. Buňky se centrifugovaly při 2 000 ot/min po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Kultivační médium se odtáhlo pipetou. Každý buněčný pelet se promyl 3 x 2 ml PBS (přidal se PBS, směs se promíchala na • · · ···· ti ·· · ·· «· ·· ti· ·· vortexu, centrifugovala se a kultivační médium se odtáhlo pipetou). Pipetou se odtáhlo maximální množství PBS. Do zkumavky o objemu 1,5 ml se přidalo 400 ul lx koncentrovaného reportního lyžujícího pufru. Pelet buněk se inkuboval v lyžujícím pufru při teplotě místnosti po dobu 30 minut a během této doby se několikrát promíchal na vortexu. Na konci 30 minutové inkubace se zkumavky zahřály na teplotu 60 °C po dobu 10 minut, pak se centrifugovaly při teplotě místnosti při 12 000 ot./min po dobu 2 minut a supernatant (lyzát) se přenesl pipetou do nové zkumavky o objemu 1,5 ml. Při každé reakci testu CAT se použilo 100 ul lyzátu. Zbytek se zamrazil při teplotě -80 °C. Každý test CAT proběhl následovně: 18,5 ul vody se smíchalo se 100 ul lyzátu, s 5 £Ul n-butyryl-CoA o koncentraci 5 mg/ml (Promega) a s 1, ⁵ ^1 θ'¹ (UCi/nl chloramfenikol-¹⁴C (ICN) ve zkumavce o objemu 1,5 ml (celkový objem směsi je 125^411) a směs se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Na konci první hodiny se do každé zkumavky přidalo 300,/ul xylenu (ICN). Vše se míchalo na vortexu po dobu 5 vteřin, proběhla centrifugace při plné rychlosti po dobu 3 minut při teplotě místnosti. 280 ^Lil horní fáze (xylen) se přeneslo pipetou do nové zkumavky. K těmto 280 ul xylenové fáze se přidalo 100 £il 0,25 M Tris, PH8,0. Směs se promíchala na vortexu a centrifugovala se shora popsaným způsobem. 200 <ul horní fáze se přeneslo pipetou do scintilační zkumavky a přidalo se 5 ml scintilační kapaliny. Překlápěním zkumavky se vše promíchalo a vzorky se hodnotily na scintilačním počítači.

Příklad 16: Stabilita oligonukleotidů in vitro prodlužuje biologickou aktivitu fosforothioatových oligonukleotidů

Modifikace oligonukletidů s internukleotidovými fosforothioatovýmu vazbami může udělit rezistenci vůči nukleázám a tak prodloužit bioaktivitu in vitro z 1 až 2 hodin na 24 hodin (Stein, (1993) Science 261: 1004-1012).

Ukázalo se, že oligonukleotidy bohaté na G například FIGURE1A (Seq #4) vykazují větší stabilitu in vitro ve srovnání s fosforothioatem, který není bohatý na G FIGURE1B (Seq #21)). Na obrázku IA uvedené elektroferogramy jasně ukazují, že v případě extracelulárního IA (S) ) a buněčného IB (L) ) podstatně více neporušené po dobu 96 hodin inkubace s buňkami Jukart zůstává oligonukleotid FIGURE1A (Seq#4) značený ³²p ve srovnání s oligonukleotidem FIGURE1B (Seq#21) . V souladu s tímto pozorováním se jeví také data z kolony Nickspin (obrázek č. IB) . Procento neporušených oligonukleotidů FIGURE1A (Seq#4) po 96 hodinách je 54 % (S) a 59 % (L) a z FIGURE1B (Seq#21) je 10 % (S) a 34 % (L). Tato data naznačují, že vyšší rezistenci vůči nukleáze se dosáhne pouhou přítomností oblastí bohatých na G v FIGURE1A (Seq#4) a to je pravděpodobně spojeno se schopností tohoto určitého nukleotidu tvořit balené sekundární struktury.

Příklad 17: Inhibice exprese funkčního CD28 a CD28-specifická produkce IL-2 v aktivovaných lidských T-buňkách aptamerovými oligonukleotidy je závislá na specifickém motivu bohatém na G.

Relativní inhibice exprese CD28 a CD28-specifické produkce IL2 pomocí fosforothioatové oligonukleotidové sekvence #4 až #21 (5 uM) uvedené v tabulce č. 1 je zobrazena v tabulce č. 2. Tabulka č. 2 ukazuje, že inhibiční aktivita částečně závisí na sekvenci a opírá se o přítomnost motivu, který obsahuje dvě čtveřice G oddělených čtyřmi bázemi (Seq#5 až #8) . Tato data naznačují, že interakce oligonukleotidu, jako je FIGURE1A (Seq#4) a jeho putativního cíle, závisí na přesném požadavku konformace, což je podobné jako u interakce oligonukleotidprotein, spíše než na požadavku hybridizaci nukleová kyselina/nukleová kyselina (jak je možné najít u antigenních a nesmyslných modelů).

· · ·· · · » «9 · * ·· · ·

Obrázek č. pohyblivosti

Příklad 18: Oligonukleotidy obsahující specifický 12-merový motiv tvoří specifický proteinový oligonukleotidový komplex zobrazuje analýzu posunu elektroforetické oligonukleotidů značených ³²P, které se preinkubovaly s extraktem buněk HeLa. Seznam oligonukleotidů uvedený v tabulce č. 3 zahrnuje dva oligonukleotidy (FIGUŘE IA (Seq#4) a ICN 16481 (Seq#5) ) , které obsahují 12-merový motiv nesoucí dvě sady čtveřic G oddělených 4 nukleotidy. Testovaly se pouze oligonukleotidy nesoucí uvedený motiv (dráha 5 a 11), aby vznikl posun komplexu oligonukleotid-protein (pruh A), který se liší od jiných fosforothioatových oligonukleotidů. Tyto data naznačují, že specifické interakce proteinoligonukleotid se objevují s oligonukleotidy obsahujícími 12merový motiv.

Příklad 19: Inhibice exprese funkčního CD28 v aktivovaných lidských T-buňkách pomocí aptamerových oligonukleotidů je ve vztahu s přítomností specifického komplexu oligonukleotid-protein

Tabulka č. 4 porovnává účinek inhibice mitogenem vyvolané exprese CD28 a produkce IL-2 pomocí jistých fosforothioatových oligonukleotidů při koncentraci 5 /iM s jejich aptamerovou schopností tvořit specifický komplex oligonukleotid-protein, v případě, že se inkubují s nukleárním extraktem buněk HeLa, což je bohatý zdroj transkripčních faktorů. Tato data jasně ukazují vztah mezi inhibiční aktivitou oligonukleotidů nesoucích motiv na expresi CD28 a vylučování IL-2 a tvorbu specifického pruhu posunu na gelu. Substituce mířená do dvou čtveřic G vede ke ztrátě funkce a komplex oligonukleotidprotein zmizí.

• · · · » 9···

999 9 999 9 99 9

99*9·· » ·

9 · « · 9 * 9 9 99 <9

Příklad 20: Promotorové oblast na 5'konci CD28 -197 až +28 (28 b) váže Spi

Promotorové oblast CD28 -197 až +28 značená ³²P, která je jinak známá jako 28b, se inkubovala s proteinem Spi a se sérií třínásobného ředění protilátek proti Spi začínající s množstvím 0,5 ug. Provedl se test super-posunu na gelu a komplexy DNA-protein-protilátka se rozdělily elektroforézou. Data se uvádějí na obrázku č. 4. Data ukazují, že Spi se váže na oblast 28b promotoru CD28. Tato interakce je specifická, čemuž nasvědčuje zmizení pruhu Spl/32P-28b/Spl (pruh B) při naředění protilátek specifických pro Spi na hodnotu 0.00617 ug, přičemž zbyl pouze pruh 28b/Spl (pruh A) . To ukazuje, že 28b specificky váže Spi. Pruh C představuje volný 28b značený ³²P.

Příklad 21: Oligonukleotid -51 až -22 odvozený z promotorové oblasti na 5'konci CD28 -197 až +28 (28b) obsahující 12-merový motiv bohatý na G také může vázat Spi

Za účelem omezení přesné Spi vázající oblasti v 28b na motiv bohatý na G v promotorové oblasti CD28 -197 až +28 se syntetizovala dvouřetězcový (ds) 30-merový oligonukleotid, který se nazval 28b oligo (Seq#l, tabulka č. 1), který obsahuje ve své sekvenci 12-mer GGGGAGGAGGGG. Byla vyslovena hypotéza, že jde o vazebné místo pro Spi v promotorové oblasti CD28. Po značeni P se 28b oligo inkuboval s extraktem Spi a došlo k vzájemnému navázání (obrázek č. 5, pruh A, dráha 2 a 3) . Konkurence s dvouřetězcovým 28b oligo způsobila, že pruh zmizel, což ukazuje, že vazba je specifická pro Spi (dráha 4). Překvapivě jednořetězcové fosforothioatové oligonukleotidy bohaté na G FIGURE1A (dráha 5) a 16481 (dráha 6) (oba obsahují motiv bohatý na G) se na rozdíl od kontrolního oligonukleotidů ICN 16476 (dráha 7) ucházejí o navázání Spi. Tato data ukazují, že fosforothioatové oligonukleotidy bohaté na G tf

FIGURE1A a ICN 16481 mohou působit jako aptamery při navázání na DNA vazebné místo Spi. Důsledkem této interakce je prevence navázání Spi na Spi místo -51 až -22 v promotorové oblasti a tak dochází k inhibici transkripce genu CD28 zprostředkované Spi a k zeslabení exprese proteinu CD28.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Aptamer, jehož délku tvoří přibližně 12 až 22 jednotek nukleových kyselin včetně, a obsahuje sekvenci, která zahrnuje alespoň dvě oblasti bohaté na G vybrané ze skupiny zahrnující GGnG, GGGG, GnGG, nGGG a GGGn, kde G je guanidin a symbol n je libovolný nukleotid.
2. Aptamer podle nároku 1, kde alespoň dvě z alespoň dvou oblastí jsou odděleny méně než dvěma až sedmi nukleotidy včetně.
3. Aptamer podle nároku 1, kde alespoň dvě z alespoň dvou oblastí jsou odděleny třemi až šesti nukleotidy včetně.
4. Aptamer podle nároku 1, kde alespoň dvě z alespoň dvou oblastí jsou odděleny čtyřmi nukleotidy.
5. Aptamer podle nároku 1, který se uchází o vazebné místo imunitního regulačního proteinu pro nukleovou kyselinu.
6. Aptamer podle nároku 2, kde imunitní regulační protein se vybral ze skupiny zahrnující SPI, NFKB, EGR1 a AP2.
7. Aptamer podle nároku 1, který se uchází o vazebné místo imunitního regulačního proteinu pro nukleovou kyselinu, kde alespoň jedna z alespoň dvou oblastí bohatých na G obsahuje GGnG a alespoň dvě z alespoň dvou oblastí jsou odděleny dvěma až sedmi nukleotidy.
8. Aptamer podle nároku 1, který se uchází o vazebné místo imunitního regulačního proteinu pro nukleovou kyselinu, kde alespoň jedna z alespoň dvou oblastí bohatých na G obsahuje • 4 4

4 44

4 4 4 · 4 · · 4 4

4*4 «4 «4 44 4· 44

GGGG a alespoň dvě z alespoň dvou oblastí jsou odděleny dvěma až sedmi nukleotidy včetně.
9. Aptamer podle nároku 1, který se uchází o vazebné místo imunitního regulačního proteinu pro nukleovou kyselinu, kde alespoň jedna z alespoň dvou oblastí bohatých na G obsahuje GnGG a alespoň dvě z alespoň dvou oblastí jsou odděleny dvěma až sedmi nukleotidy včetně.

10. Aptamer podle nároku 1, který se uchází o vazebné místo imunitního regulačního proteinu pro nukleovou kyselinu, kde alespoň jedna z alespoň dvou oblastí bohatých na G obsahuje nGGG nebo GGGn a alespoň dvě z alespoň dvou oblastí jsou odděleny dvěma až sedmi nukleotidy včetně.

11. GTG Aptamer podle nároku 1 GTG GGG 3' (Seq. Id. No. obsahuj ící 4) . sekvenci 5'TTG GAG GGG 12. Aptamer podle nároku 1 obsahuj ící sekvenci 5'GGG GAG GAG GGG CTG GAA 3' (Seq. Id. No. 5) . 13. Aptamer podle nároku 1 obsahuj ící sekvenci 5'GGG GTG GTG GGG 3' (Seq. Id. No. 13). 14. Aptamer podle nároku 1 obsahuj ící sekvenci 5'TTG GAG GGG GAG GAG GGG 3' (Seq. Id. No. 7) . 15. Aptamer podle nároku 1 obsahující sekvenci 5'TTG GAG GGG GAG GTG GGG 3' (Seq. Id. No. 8) . 16. Aptamer podle nároku 1 obsahuj ící sekvenci 5'GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG 3' (Seq. Id. No. 6) .

·* ♦ · · » · 00«

0 ♦·· 4 » 40 0 0 0 • 4 · 4 · 04 40 400

4 4 0' «0·· 4 ··» »♦ 4 * «0 « ·

17. Způsob tlumení odezvy imunitního systému u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci aptameru podle libovolného z nároků 1 až 16 pacientovi.

18. Způsob léčby pacienta, který vykazuje stav charakterizovaný nepřiměřenou odezvou imunitního systému, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci aptameru podle libovolného z nároků 1 až 16 pacientovi.

19. Způsob podle nároku s e tím, ž e stav zahrnuje 20. Způsob podle nároku s e tím, ž e stav zahrnuje 21. Způsob podle nároku s e tím, ž e stav zahrnuje 22. Způsob podle nároku s e tím, ž e stav zahrnuje 23. Způsob podle nároku s e tím, ž e stav zahrnuje 24. Způsob podle nároku s e tím, ž e stav zahrnuj e 25. Způsob podle nároku s e tím, ž e stav zahrnuje

18, vyznačuj ící štěp versus odezva hostitele.

18, vyznačuj ící autoimunitní onemocnění.

20, vyznačuj ící revmatický zánět kloubů.

20, vyznačuj ící roztroušenou sklerózu.

20, vyznačuj ící lupus erythematodes.

20, vyznačuj ící na inzulínu závislou cukrovku.

20, vyznačuj ící lupénku.