SK84599A3 - G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response - Google Patents

G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response Download PDF

Info

Publication number
SK84599A3
SK84599A3 SK845-99A SK84599A SK84599A3 SK 84599 A3 SK84599 A3 SK 84599A3 SK 84599 A SK84599 A SK 84599A SK 84599 A3 SK84599 A3 SK 84599A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
aptamer
ggg
oligonucleotides
regions
seq
Prior art date
Application number
SK845-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Tam
Original Assignee
Icn Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icn Pharmaceuticals filed Critical Icn Pharmaceuticals
Publication of SK84599A3 publication Critical patent/SK84599A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka odboru imunológie.
Doterajší stav techniky
Patogenéza a aktivácia mnohých bežných ochorení sprostredkovaných T-bunkami vzniká na základe nesprávnej imunitnej odpovede spôsobenej abnormálnou aktiváciou T-buniek. Uvažuje sa, že mnoho ďalších ochorení spôsobených abnormálnou aktiváciou T-buniek zahŕňa cukrovku typu I (závislá na inzulíne), zápal štítnej žlazy, sarkoidózu, roztrúsenú sklerózu, zápal uveálneho traktu, reumatický zápal kĺbov, lupus erythematodes, zápalové ochorenie čriev (Crohnova choroba a vredovitý zápal hrubého čreva) a aplastickú anémiu. Okrem toho vela syndrómov, ako septický šok a nádorom indukovaná kachexia, môže zahŕňať aktiváciu T-buniek a zvýšenú produkciu potencionálneho toxického množstva lymfokínov. Normálna aktivácia T-buniek tiež spôsobuje odmietnutie transplantovaných buniek a orgánov tým, že T-bunky produkujú potrebné signály pre účinné zničenie cudzorodého tkaniva darcu.
Aktivácia T-lymfocytov, ktorá spôsobuje proliferáciu Tbuniek a expresiu génu a vylučovanie imunomodulačných cytokinov, si vyžaduje dva nezávislé signály. Prvý signál predstavuje rozoznanie antigénu, ktorý tvoria molekuly hlavného histokompatibilného komplexu na povrchu buniek ako antigén (APC), pomocou komplexu receptor špecifický pre T-bunky/CD3. Druhý signál, ktorý pôsobí pri regulácii odpovede T-bunky na antigén, tvorí intracelulárne interakcie medzi T- bunkami a APC, ktoré nie sú antigénne špecifické. Tieto sekundárne, alebo ko-stimulačné signály, určujú intenzitu odpovede T-buniek na antigén. Ko-stimulované bunky reagujú zosilnením transkripcie génu pre špecifický cytokín a stabilizáciou vybranej mRNA. Aktivácia T-buniek v prípade, že sa neuskutočni ko-stimulácia, spôsobí zastavenie odpovede T-buniek. Jeden klúčový ko-stimulačný signál vzniká interakciou povrchového receptora T-bunky CD28 s molekulami príbuznými s B7 na APC (Linsley a Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212). CD28 sa konštitutívne exprimuje u 95 % T-buniek CD4+ (ktoré pôsobia ako pomocník pri produkcii protilátok v B-bunkách) a 50 % T-buniek CD8+ (ktoré majú cytotoxické funkcie) (Yamada a spol. (1985) Eur. J. Immunol 15: 1164-1168). Nasleduje antigénna alebo in vitro mitogénna stimulácia, potom dochádza k indukcii povrchového CD28, rovnako ako k produkcii určitých imunomodulačných cytokínov. Tieto cytokíny zahŕňajú interleukín-2 (IL-2), ktorý je potrebný pri bunkovom cykle T-buniek, interferon-gama (IFNy), ktorý vykazuje rôzne antivírusové a protinádorové účinky a interleukín-8 (IL-8), ktorý je známy ako chemotaktický faktor v prípade neutrofilov a lymfocytov. Ukázalo sa, že tieto cytokíny sú regulované dráhou CD28 aktivácie T-buniek (Fraser a spol. (1991) Science 251: 313-316, Seder a spol.(1994) J. Exp. Med. 179: 299-304, Wechsler a spol. (1994) J. Immunol. 153: 2515-2523). IL-2, IFNy a IL-8 majú podstatný význam pri podpore širokého rozsahu imunitnej odpovede a ukázalo sa, že sa nadmerne exprimujú v štádiách mnohých ochorení, ktoré sprostredkujú Tbunky.
V prípade ochorenia lupienky léziou aktivované T-bunky prevážne uvolňujú cytokíny Thl, ako sú IL-2 a IFNy (Schlaak a spol. (1994) J. Invest. Derm. 102: 145-149). Tieto vylučované cytokíny indukujú, že normálne keratinocyty exprimujú rovnaký fenotyp (HLA DR*/ICAM-1+), ako sa nachádza v léziách lupienky (Baadsgaard a spol. (1990) J. Invest. Derm. 95: 275-282). IL8 tiež pôsobí in vivo a in vitro zápalovou odpoveďou, a keďže je vylučovaný vo velkom množstve aktivovanými T-bunkami a keratinocytmi, ktoré pochádzajú z lézií lupienky, považujú sa za hlavný faktor patogénnych zmien, ktoré možno spozorovať na koži postihnutej lupienkou, ako je napríklad hyperproliferácia keratinocytov. Ukázalo sa, že jeden z rodiny receptorov B7 (prirodzené Ugandy CD28 nájdené na APC) BB1, sa exprimuje v keratinocytoch pochádzajúcich z lézie lupienky, ale nie je exprimovaný neinfikovanými kožnými keratinocytmi (Nickoloff a spol. (1993) Am. J. Pathology 142: 1029-1040). Táto skutočnosť poukazuje na dôležitú úlohu aktivácie T-buniek v patogenéze chorôb.
V prípade iných porúch kože sprostredkovaných T-bunkami, ako je alergická kontaktná dermatitída a plošná lišaj, väčšina dermálnych a epidermálnych T-buniek CD3+ exprimuje vo velkom množstve CD28, ale u normálnej kože a karcinóme bazálnych buniek (je to kožné ochorenie, ktoré nie je sprostredkované T-bunkami) sa CD28 exprimuje len v perivaskulárnych Tbunkách. Podobne v prípade alergickej kontaktnej dermatitídy a plochej lišaje sa zistila expresia B7 u dermálnych dendritických buniek, dermálnych APC a u keratinocytov, ale nie v prípade normálnej kože a karcinómu bazálnych buniek (Somon a spol. (1994) J. Invest. Derm. 103: 539-543). To znamená, že dráha CD28/B7 je dôležitým mediátorom kožných ochorení, ktorých sprostredkovateľom sú T-bunky.
Chybné aktivácie T-buniek spojené s určitým autoimunitných ochorením, ktoré sú spôsobené stratou vlastnej tolerancie, sa väčšinou charakterizujú prítomnosťou T-buniek CD28* a expresiou ich ligandu B7 na aktivovaných APC (monocyty, makrofágy alebo dendritické bunky). Tieto ochorenia sú autoimunitný Gravevov zápal štítnej žlazy (Garcia-Cozar a spol. (1993) Immunologia 12, 32), sarkoidoza (Vandenberghe a spol. (1993) Ont. Iramunol. 5: 317-321), reumatická artritída (Verwilghen a spol. (1994) J. Immunol. 153: 1378-1385) a lupus erythrematodes (Sfikakis a spol. (1994) Clin. Exp. Immunol. 96: 8-14). Pri normálnej aktivácii T-buniek, ktoré spôsobujú odmietnutie transplantovaných buniek a orgánov, je pri spustení receptora T-buniek kritické naviazanie . CD28 na svoj vhodný ligand B7 počas, za účelom dosiahnutia alogénnej odpovede na cudzie antigény, napríklad darované tkanivo (Azuma a spol. (1992) J. Exp. Med. 175: 353-360, Turka a spol. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105).
Tradičné liečenie autoimunitných ochorení nepredbieha aktiváciu T-buniek, čo je účinný krok pri autoreaktívnych imunitných odpovediach na vlastný antigén. Lieky, ako sú steroidy a nesteroidné protizápalové lieky (NSAIDS) sa v súčasnosti používajú na zmiernenie symptómov, ale nezabránia postupu ochorenia. Okrem toho steroidy môžu mať vedľajšie účinky, ako sú osteoporóza, cukrovka a sú toxické pre orgány, môžu tiež urýchliť degeneračný proces chrupaviek a spôsobujú tak zvané post-infekčné sčervenanie do 2 až 8 hodín. NSAIDS môžu spôsobovať vedlajšie účinky v gastrointestinálnom trakte a zvyšujú nebezpečenstvo agranulocytózy a jatrogénnej hepatitídy.
Ako jedna forma liečenia sa tiež používajú imunosupresivne lieky, predovšetkým v pokročilých štádiách chorôb. Tieto lieky tlmia celý imunitný systém a liečba má ťažké vedľajšie účinky, ako vysoký krvný tlak a nefrotoxicita. Ani imunosupresívne činidlá, ako je cyklosporín a FK506 nemôžu inhibovať dráhu aktivácie T-buniek závislú na CD28 (Juné a spol. (1987) Mol. Celí Biol. 7: 4472-4481).
V súčasnosti sa ako antigény, ktoré spôsobujú aktiváciu T-buniek používajú syntetické peptidy, monoklonálne protilátky a rozpustné formy molekúl aktivácie T-buniek. Dosial sa neidentifikovali pre molekuly aktivácie T-buniek, ako je
CD28, CD40L a rodina CAM adhéznych molekúl, konkurenčné syntetické peptidy. Ukázalo sa, že monoklonálne protilátky (mAb) majú pravdepodobne terapeutický účinok pri ochoreniach sprostredkovaných T-bunkami, ako je lupienka (anti-CD4 (Prinz a spol. (1994) Lancet 338: 320-321)) a pri imunosupresii normálnej aktivácie T-buniek u aloimplantátov (anti-VCAM-1 a VLA-4 (Isobe a spol. (1994) J. Immunol. 153: 5810-5818)). V prípade chronického liečenia si hostitelské zviera vyvinie protilátky proti monoklonálnym protilátkam, čo obmedzuje ich použitie. Vyvinuli sa „humanizované monoklonálne protilátky, ktoré výrazne znižujú nebezpečenstvo indukovanej imunitnej odpovede na tieto monoklonálne protilátky. Tieto humanizované monoklonálne protilátky sú stále v štádiu vývoja a okrem toho sú tvorené veľkými proteínmi a preto môže byť obtiažné, aby dosiahli cieľové miesto. Vyvinuli sa rozpustné formy molekúl aktivácie T-buniek, ako je CTLA-4Ig, ktoré obsahujú extracelulárnu oblasť ľudského génu CTLA-4 (ktorá je v podstate príbuzná CD28) vo fúzii s reťazcom ľudského IgCy. Ukázalo sa, že CTLA-4Ig špecificky blokuje aktiváciu normálnych T-buniek a tak sa predchádza odmietnutiu xenogénnych (Lenschow a spol. (1992) Science 257: 789-792) a alogénnych (Turka a spol. (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105) srdcových aloimplantátov u potkanov a ďalej má terapeutický účinok pri chybnej aktivácii T-buniek, ako sa zistilo napríklad v prípade autoimunitnej glomerulonefritídy (Nishikawa a spol. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 1249-1254). Rozpustný CTLA-4Ig má však podobné obmedzenia ako monoklonálne protilátky a okrem toho ich príprava je nákladná. Skutočná funkcia molekuly podobnej CD28 nie je známa, preto skôr ako sa budú hodnotiť akékoľvek výhody liečby, je nutné určiť tieto funkcie.
Pri inhibicii expresie CD28 na bunkovom povrchu nedochádza počas dlhšej doby k odpovedi, alebo nastane delécia aktivovaných T-buniek. Deaktivácia predchádza proliferácii Tbuniek a zastavuje T-bunkovú špecifickú produkciu špecifických imunoregulačných cytokínov, ako je interleukin-2, interferón-gama a interleukín-8.
Regulácia expresie génu CD28 môže byť dosiahnutá za použitia antimediátorových oligonukleotidov, ktoré tvoria triplexy, pomocou hybridizácie oligodeoxyribonukleotidov alebo oligoribonukleotidov so sekvenciami DNA alebo RNA v géne CD28 alebo v oblasti promótora (popisuje sa v publikácii PCT/US96/01507, podaná 30. augusta 1996). Použitím oligonukleotidov sa vyhne mnohým ťažkostiam spojených s činidlami, ktoré sa používajú pri blokovaní účinkov normálnej a abnormálnej aktivácie T-buniek. Tieto oligonukleotidy, ktoré sa pripravili pre účely antimediátorovej stratégie, sú náchylné k degradácii vnútrobunkovými nukleázami alebo nukleázami, ktoré sa nachádzajú vo vonkajšom prostredí bunky.
Zistilo sa, že naviazanie DNA (alebo RNA) na proteín je základná cesta, ktorou je riadená transkripcia génu. Tieto regulačné proteíny alebo transkripčné faktory rozoznávajú sekvepie DNA, ktoré majú špecifickú sekundárnu štruktúru a nasledujúce interakcie môžu viesť k pozitívnej a negatívnej kontrole expresie génu. Aptaméry sú krátke oligonukleotidové sekvencie, ktoré sa môžu špecificky viazať na špecifické proteíny. Ukázalo sa, že rôzne aptamérové sekvencie môžu špecificky viazať rôzne proteíny. Napríklad sekvencia GGNNGG, kde symbol N je guanozín (G), cytozín (C), adenozín (A) alebo tymidín (T) a špecificky sa viaže na trómbín (popísané v publikácii Bock a spol. (1992) Náture 355: 564-566 a v patente č. 5582981 (1996) (Toole a spol.).
Aptamérové sekvencie sa nepopisujú, ale môžu byť účinné ako konkurenčné inhibitory miest viažucich DNA na regulačných proteínoch, ktoré sú známe ako transkripčné faktory. Trans kripčné faktory sú triedou proteinov, ktoré regulujú gény primárnym naviazaním na špecifické regulačné sekvencie nachádzajúce sa v smere 5' zakončenia promótorovej oblasti týchto génov. Táto interakcia vedie k iniciácii transkripcie. Niektoré transkripčné faktory ako je Spi, AP2, AP-1, EGR-1 a NFkB, sú kritické pri aktivácii T a B lymfocytov (Skerka a spol. J. Biol. Chem. 270: 225000-22506, Jung a spol. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 766: 245-252). Niekedy sa tieto transkripčné faktory vyvolávajú signálmi iniciovanými následnou ko-stimuláciou (Jung a spol. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 766: 245-252). Stále existuje potreba vyvinúť činidlá a spôsoby, ktoré by zabránili interakcii proteínu so špecifickým DNA väzobným miestom, ktoré by spôsobili supresiu určitej imunitnej dráhy zahŕňajúcu ko-stimulačnú dráhu.
Podstata vynálezu.
Vynález popisuje aptaméry, ktorých dĺžka sa pohybuje medzi 12 až 22 jednotkami nukleovej kyseliny vrátane. Sekvencie, ktoré zahrňujú aspoň dve oblasti bohaté na G, sa vybrali zo skupiny obsahujúcej GGnG, GGGG, GnGG, nGGG a GGGn, kde symbol G je guanidin a symbol n je Iubovolný nukleotid.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa navrhujú oligonukleotidy tak, aby viazali špecifické regulačné proteíny, ako je Spi a proteíny príbuzné Spi, a pôsobili tak, že konkurujú väzbe týchto transkripčných faktorov na promótorovú oblasť génov, ktoré kontrolujú. Táto skutočnosť slúži pre moduláciu génovej expresie tým, že sa predchádza transkripcii génu. Potom aptamérové oligonukleotidy sú schopné inhibovať funkciu RNA alebo DNA, buď ich transláciu na proteín, ich translokáciu do cytoplazmy alebo ich Iubovolú aktivitu potrebnú pre ich biologické funkcie. Keď RNA alebo DNA nie je schopná uskutočniť všetky alebo časť svojich funkcií, spôsobuje to poruchu časti genómu, ktorý riadi aktiváciu T-buniek. Genóm nie je správne exprimovaný, a tak nemôže modulovať uvedený metabolizmus.
Je výhodné, aby cieľová aptamérová nukleová kyselina sa uchádzala o miesta regulačných proteinov viažucich DNA, ktoré špecificky regulujú molekuly, ktoré môžu tlmiť aktiváciu Tbuniek. Zistilo sa, že pre tieto účely je obzvlášť vhodné použiť protein CD28. Očakáva sa, že inhibiciu CD28 a expresiu génu príbuzného CD28 je možné použiť pri liečení lupienky a iných ochorení kože, syndrómov spojených s abnormálnou aktiváciou T- buniek, porúch autoimunity a odmietnutie aloimpmlantátov.
Spôsoby podľa vynálezu zahŕňajú utlmenie aktivácie T-buniek tak, že pacient sa dostane do kontaktu s oligonukleotidom, ktorý konkuruje miestu viažucemu DNA regulačného proteínu, čím sa inhibuje expresia regulovaného proteinu, ktorý je známy, že je schopný tlmiť aktiváciu T-buniek. Výhodné sú oligonukleotidy, ktoré sa viažu na proteíny, ako je Spi a proteíny príbuzné Spi, ktoré regulujú transkripciu CD28 a génov príbuzných CD28.
Vynález ďalej popisuje aplikáciu aptamérov za účelom liečenia ochorení, ktoré sú spôsobené abnormálnou aktiváciou T-buniek, ako je lupienka, lupienka aktivovaná AIDS alebo iné kožné ochorenia, cukrovka typu I (závislá na inzulíne), zápal štítnej žľazy, sarkoidóza, roztrúsená skleróza, autoimunitný zápal uveálneho traktu, reumatický zápal kĺbov, lupus erythrematodes, zápalové ochorenia čriev (Crohnova choroba a vrer * I dovitý zápal hrubého čreva), septický šok, nádorom inďukoväná kachexia a aplastická anémia. Ďalej sa aptaméry môžu použiť pri regulácii normálnej aktivácie T-buniek, čo je potrebné v prípade odmietnutia aloimplantátov. Je to možné dosiahnuť pertubáciami pri syntéze a expresii molekúl aktivácie T-buniek, ktoré zahŕňajú CD28 a molekuly príbuzné CD28.
Vynález ďalej popisuje aptaméry, ktoré sú schopné viazať špecifické regulačné proteiny, ako je Spi a proteiny príbuzné Spi. Týmto spôsobom inhibujú transkripciu génov proteínu CD28 alebo proteínov príbuzných CD28, ktoré a) sú v normálnom prípade regulované uvedenými proteínmi a b) môžu modulovať odpovede T-buniek.
Aptamérové oligonukleotidy, ktoré sa špecificky viažu na väzobné miesta pre DNA regulačných proteínov, ako je Spi a proteiny príbuzné Spi, tak zabránia naviazaniu regulačného proteínu na špecifickú dvojreťazcovú oblasť DNA v promótorovej oblasti génu. Konkurenčné naviazanie aptaméru bude brániť transkripcii génu, a tak bude inhibovať tok genetických informácií z DNA na proteín. Vlastnosti oligonukleotidov, ktoré ich robí špecifickými voči ich cielu, ich tiež robí univerzálnymi. Vzhľadom k tomu, že oligonukleotidy sú dlhé reťazce tvorené štyrmi monomérnymi jednotkami, môžu sa ľahko syntetizovať pre ľubovoľnú cieľovú sekvenciu RNA.
Inhibícia expresie génu sprostredkovaná oligonukleotidom sa dokázala v mnohých modeloch a v in vitro modeloch a vykazuje liečebný potenciál, ako nová stratégia pre liečenie mnohých ľudských ochorení (Uhlmann a Peyman (1990) Chem. Rev. 90: 544-584, Zon a Steč (1991) Oligonucleotides and analogues- A Practical Approach: 87-108, Miller a spol. (1981) Biochem 20: 1874-1880, Orson a spol. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 3435-3441, Helene a Toulme (1990) Biochem. Biophys. Acta 1049: 99-125, Thierry a Dritschilo (1992) Nucleis, Acid Res. 20: 5691-5698). Vzhľadom na určité výhody 1 I syntézy oligonúkleotidov rezistentných voči nukleázair., pričom oligonukleotidy zahŕňajú fosforotioaty (popísané v publikácii Zon a Steč (1991) Oligonucleotides and analogues- A Practical Approach: 87-108) a fosforotioat-3’hydroxypropylamín (uvedené v publikácii Tam a spol. (1994) Nucleic Acid Res. 22: 977
968) a ich lepšie pohlcovanie bunkami, je teraz možné považovať použitie oligonukleotidov za novú formu terapeutických činidiel.
Aptamérové nukleotidy cielené do väzobných miest regulačných proteínov predstavujú alternatívnu triedu zlúčenín založených na nukleovej kyseline a poskytujú riešenie problémov, s ktorými sa potýka súčasný stav techniky. Aptamérové oligonukleotidy sa priamo podieľajú na modulácii špecifickej expresie génov, a tak zastavujú expresiu cieľového proteínu. Aptamérové oligonukleotidy nevykazujú konkurenčnú inhibíciu rozpustných receptorov cieľového proteínu. Jedná sa o interakcie, kde je potrebné úplne rozumieť väzobným mechanizmom a afinitnej interakcii receptor-ligand. Oligonukleotidy sú malé molekuly, a preto sa nevyskytujú rovnaké stérické problémy, ako u veľkých molekúl inhibítorov.
Popis cieľov
Termín „ciele tu znamená molekuly, ktoré sa môžu reguI lovať transkripčnými faktormi, ktoré majú dôležitú úlohu pri iniciácii a udržovaní imunitnej odpovede. Tieto molekuly zahŕňajú ko-stimulačné molekuly, ako je CD28 a cytokíny, ako je IL-2, GM-CSF a IFNy.
Pre účely liečenia sa zvieratám, o ktorých sa predpokladá že sú choré, ktoré je možné liečiť zoslabením expresie ko-stimulačných molekúl, ako je CD28 alebo molekúl príbuzných CD28, sa môžu aplikovať oligonukleotidy podľa tohoto vynálezu. Oligonukleotidy sa môžu začleniť do farmaceutickej formy, ktorá môže obsahovať nosiče, zahusťovadlá, rozpúšťadlá, pufre, konzervačné činidlá, povrchovo aktívne činidlá, lipozómy a lipidové látky a podobne. Farmaceutické kompozície môžu tiež obsahovať jednu alebo viac aktívnych zložiek, ako sú antimikrobiálne činidlá, protizápalové činidlá, anestetiká a podobne.
Farmaceutická kompozícia sa aplikuje rôznymi spôsobmi podlá toho, či je potrebná lokálna alebo systémová liečba a v závislosti od oblasti liečby. Aplikácia môže byť povrchová (oko, vagína, rektum, nos), orálna, inhaláciou alebo parenterálne napríklad intravenózne, podkožné, intraperitoneálne alebo intramuskulárnou injekciou.
Kompozícia vhodná pre povrchovú aplikáciu môže zahŕňať masti, mlieka, krémy, gély, kvapky, čipky, spreje, roztoky a púder. Bežné farmaceutické nosiče, vodné, práškové alebo olejové základy, zahusťovadlá a podobne, podlá toho, čo je potrebné alebo požadované. Tiež sa môžu používať potiahnuté kondómy alebo rukavice.
Kompozície vhodné pre orálnu aplikáciu zahŕňajú prášky alebo granule, suspenzie alebo roztoky vo vodnom alebo nevodnom médiu, kapsule alebo tablety. Môžu byť tiež potrebné zahusťovadlá, aromatizačné prísady, riedidlá, emulgátory, disperzné činidlá alebo pojivá.
Prostriedky vhodné pre parenterálne podávanie môžu zahŕňať vodné roztoky, ktoré obsahujú pufre, lipozómy, riedidlá a iné vhodné prísady.
Dávkovanie závidí na závažnosti stavu, ktorý sa lieči a na odpovedi na liečenie. V normálnom prípade sa podáva jedna alebo viac dávok denne, pričom priebeh liečby trvá niekoľko dní až mesiacov, alebo do chvíle, keď je liečba účinná, alebo sa zmierni stav ochorenia. Odborníci môžu ľahko stanoviť optimálne dávky, spôsob dávkovania a interval opakovania.
Pri systémovej aplikácii aptamérov1' je výhodná intra1 1 I venózna aplikácia, pričom dávka je 5 mg/kg a podáva sa jedenkrát denne. Pri povrchovej aplikácii sa aptaméry výhodne podávajú v podobe 1 až 5 % roztoku jedenkrát denne. Pri pulmonálnej aplikácii sa výhodne aptaméry podávajú v podobe aerosólu v dávke 5 mg jedenkrát denne.
Vynález popisuje aptamérové oligonukleotidy vhodné pre použitie pri inhibícii funkcie RNA a DNA, ktorá zodpovedá proteínu schopnému modulovať aktiváciu T-buniek. Podľa vynálezu výraz „oligonukleotid znamená oligomér alebo polymér ribonukleovej kyseliny alebo deoxyribonukleovej kyseliny. Tento výraz zahŕňa oligoméry obsahujúce prirodzene sa vyskytujúce bázy, sacharidy a vnútorné kostry sacharidov, rovnako ako oligoméry, ktoré obsahujú časti s podobnou funkciou, a ktoré sa prirodzene nevyskytujú. Takéto upravené alebo substituované oligonukleotidy sú často výhodnejšie ako prirodzené formy vzhľadom k ich vlastnostiam, ako napríklad zvýšené pohlcovanie bunkami a väčšia stabilita v prítomnosti nukleáz.
Oligonukleotidy podľa vynálezu výhodne obsahujú približne 3 až 50 jednotiek báz nukleových kyselín. Takéto oligonukleotidy výhodne obsahujú približne 8 až 30 jednotiek báz nukleových kyselín a najvýhodnejšie je, aby oligonukleotidy obsahovali približne 12 až 22 jednotiek báz nukleových kyselín. Je výhodné, aby bázová jednotka nukleovej kyseliny bola kombináciou báza-sacharid, ktorá je vhodne naviazaná na vedľajšiu jednotku báza nukleová kyselina prostredníctvom fosfodiesterovej alebo inej väzby.
Oligonukleotidy, ktoré sa používajú v súlade s predkladaným vynálezom sa môžu bežne pripravovať dobre známymi metódami syntézy na pevnej fáze. Mnohí odborníci, medzi nimi aj firma Applied Biosystems, predáva zariadenia vhodné pre takúto syntézu. Môžu sa použiť ľubovoľné iné -spôsoby syntézy.
1 . ( I
Dobre známe je tiež použitie podobných metód prípravy iných oligonukleotidov, ako je fosforotioat a 3'amín-fosforotioat.
V súlade s vynálezom je odborníkom zrejmé, že mediátorová RNA identifikovaná otvoreným čítacím rámcom (ORF) DNA, z ktorého sa prepisuje, neobsahuje len informácie ORF DNA, ale tiež pripojené oligonukleotidy, ktoré tvoria oblasti, ktoré sú pre odborníka známe ako 5'- neprekladaná alebo 3'neprekladaná oblasť, intervenujúca sekvenciu ribonukleotidov. Tak môžu vznikať oligonukleotidy podlá vynálezu, ktoré sú úplne, alebo čiastočne cielené na tieto pripojené ribonukleotidy, rovnako ako na informačné ribonukleotidy. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu aptamérové oligonukleotidy interagujú s DNA väzobným miestom regulačného proteínu, ako je Spi a proteíny príbuzné Spi, a spôsobujú prerušenie expresie génu kódujúceho proteín zahrnutý do aktivácie T-buniek. Vo výhodných uskutočneniach podlá vynálezu uvedené regulované proteíny sú CD28 a všetky homológy molekuly CD28. Oligonukleotidy majú sekvencie s obsahom aspoň dvoch oblastí bohatých na G, ktoré sa definujú ako oblasti štyroch nukleotidov obsahujúcich aspoň tri guanozinové zvyšky (G), ako je GGGG, GNGG, GGNG, kde symbol N je výhodne A, C, G, U alebo T. Podlá vynálezu sa môžu použiť dve takéto oblasti bohaté na G oddelené maximálne šiestimi zvyškami a výhodne štyrmi zvyšr kami, alebo menším počtom zvyškov. Výhodné sekvenčné segmenty, ktoré sa môžu použiť v celku alebo ich časti sú:
5' 3' SEQ ID
TTG GAG GGG GTG GTG GGG obrázok č. 1A
GGG GAG GAG GGG GTG GAA ICN 16481
GGG GTG GTG GGG ICN 16525
TTG GAG GGG GAG GAG GGG ICN 16475
TTG GAG GGG GAG GTG GGG ICN 16479
GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG • ICN 16065
Verí sa, že uvedené sekvencie sú presné, vynález sa zaoberá možnosťou opraviť sekvencie v prípade, že sa zistia chyby. Oligonukleotidy podlá vynálezu obsahujú jednu z týchto sekvencií alebo ich časť. Výhodné je použitie ktoréhokoľvek z týchto nukleotidov, uvedených vyššie, alebo ktorýchkolvek podobných oligonukleotidov, ktoré môže odborník pripraviť vzhľadom k vedomostiam o výhodných oligonukleotidových cieľoch, ktoré slúžia na utlmenie syntézy molekúl aktivácie Tbuniek, zahŕňa CD28 a molekuly príbuzné s 'CD28. Očakáva sa, že inhibícia alebo modulácia produkcie CD28 a/alebo homológov CD28 má podstatný terapeutický účinok pri liečení chorôb. Za účelom stanovenia účinnosti kompozícií je potrebné uskutočniť viac skúšok alebo sériu skúšok.
Prehľad obrázkov na výkrese
Na obrázku č. 1A a 1B je uvedené grafické znázornenie stability in vitro fosforotioatu označeného 32P, ICN 16064 (Seq#4), v extracelulárnej kvapaline a Jukartových bunkách.
Obrázky č. 1C a 1D znázorňujú in vitro stabilitu fosforotioatu označeného 32P, ICN 16214 (Seq#21), v extracelulárnej kvapaline a Jukartových bunkách.
Na obrázku č. 1E a 1F je grafické znázornenie časovej závislosti degradácie (0 až 96 hodín) každého oligonukleotidu ICN 16064 (Seq#4) a ICN 16214 (Seq#21), (2 000 cpm), čo sa stanovilo elektroforetickým delením na 20 % polyakrylamidovom denaturačnom géli, po ktorom nasledovalo zviditeľnenie pomocou Phospholmager. Symbol O znamená percentá neporušeného 32P-RT03S v celej dĺžke a symbol · označuje zvyšný 32P-RTCO6S v každom časovom úseku, relatívne k t=0. Tieto hodnoty sa > ' · · · . ’ stanovili v extracelulárnych (obrázok' č.' 1E) a bunkových (obrázok č. 1F) eluátoch s hodnotou 1 000 cpm, ktoré prešli cez kolóny Nickspin (Pharmacia). Súčasne sa analyzovali molekulové hmotnosti štandardných vzoriek (Std), 32P-dNTP (N) a volného ortofosforečnanu (P).
Obrázok č. 2 graficky znázorňuje analýzu posunu na géli, ktorý ukazuje, že oligonukleotidy obsahujúce motív 12-merovej sekvencie bohatej na G (dráha 5 a 11) vykazujú vzdialený pruh, ktorý sa líši elektroforetickým posunom od pruhu B, ktorý sa pozoroval u iných fosforotioatových oligonukleotidov po inkubácii s extraktom jadier buniek HeLa. Pruh C je samotný 32P-oligonukleotid.
Na obrázku č. 3 je grafické znázornenie expresie chloramfenikolovej acetyltransferázy (CAT), ktorá nasleduje po transfekcii Jurkatových buniek plazmidovým vektorom, ktorý obsahuje inzert z promótorovej oblasti CD28 s veľkosťou 226 bp (zvyšky -197 až +28) (28bp), alebo mutant, ktorý obsahuje substitúciu zvyškov -51 až -22 sekvencie Seq#3 z Tabuľky č.l (28-1) v smere 5' zakončenia reportného génu CAT, a nasledujúcej liečby s použitím a bez použitia foforotioatových oligonukleotidov, ICN 16064 a ICN 16481.
Na obrázku č. 4 je grafické znázornenie testu superposunu na géli, ktorý ukazuje, že naviazanie Spi na oblasť -197 až +28 génu CD28 smerom k 5' zakončeniu o veľkosti 28 bp je špecifické.
Na obrázku č. 5 je grafické znázornenie naviazania Spi na dvojreťazcový oligonukleotid o veľkosti 28 bp označeného 32P (ktorý sa odvodil z rodičovskej sekvencie 28-Seq#l, Tabuľka č.l) a konkurenčné naviazanie dvojreťazcového oligonukleotidu veľkosti 28 bp a aptamérových oligonukleotidov (FIGURE1A a 16481).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Oligonukleotidy
Oligodeoxynukleotidy sa syntetizujú v automatizovanom syntetizátore DNA (Applied Biosystems model 394) za použitia štandardnej fosforamiditovej chémie, β-kyanoetylfosforamidity, reakčné činidlá a polystyrénové kolóny CPG sa získali od firmy Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA) . Kolóny 3'-Amino-Modifier C3 CPG sa získali od firmy Glen Research (Šterling, VA). V prípade fosforotioatových oligonukleotidov sa štandardné oxidačné flašky nahradili tetraetyltiuramdisulfidom/acetomitrilom, a za účelom postupnej adície fosforotioatových väzieb sa použil štandardný ABI program. Po odštiepení z riadenej poréznej sklenenej kolóny sa odstránila ochranná skupina tak, že oligonukleotidy boli ošetrené koncentrovaným hydroxidom amónnym pri teplote 55 °C počas 8 hodín. Oligonukleotidy sa prečistili HPLC za použitia semipreparačnej kolóny C8 s reverznou fázou (ABI). Nasleduje odštiepenie DMT ochrannej skupiny, ošetrenie 80 % kyselinou octovou a vyzrážanie etanolom, čistota produktu sa stanovila pomocou HPLC za použitia analytickej kolóny C18 (Beckman, Fullerton, CA) . Všetky oligonukleotidy, ktoré mali vyššiu čistotu ako 90 % boli lyofilizované. Oligonukleotidy sa rekonštituovali v sterilnej deionizovanej vode (ICN, Costa Mesa), objem sa doplnil do 400 μΜ a stanovila sa hodnota OD2eo nm, výsledný objem sa rozdelil na menšie podiely, ktoré sa skladovali pri teplote -20 °C až do doby ďalšieho použitia. Vo všetkých prípadoch sa použili aspoň tri séria oligonukleotidov uvedených v Tabulke č.l.
Príklad 2: Štúdium stability oligonukleotidov in vitro
Analýza stability oligonukleotidov sa uskutočnila spôsobom, ktorý je popísaný v publikácii Tam a spol. (1994) Nucleic Acid Res. 22: 977-986). Profily degradácie oligonukleotidov boli hodnotené pomocou elektroforézy a kvantifikovali sa za použitia kolón Nickspin.
Príklad 3: Bunkové línie a čistenie T-buniek
Periférne krvné mononukleárne bunky (PBMC) boli izolované zo zrazeniny leukocytov tak, že 60 ml krve zdravého darcu bolo centrifugovaných cez hustotný gradient Ficoll17
Hypaque. Potom boli izolované T-bunky z PMBC pomocou činidla pre izoláciu lymfocytov Lmphokwik, ktoré je špecifické pre Tbunky (LK-25T, One Lambda, Canoga Park, CA) . Priemerný výťažok je 40 až 60 x 106 T-buniek. T-bunky sa potom inkubovali cez noc pri teplote 37 °C v 20 až 30 ml kultivačného média RPMI-AP5 (kultivačné médium RPMI-1640; ICN, Costa Mesa, CA) s obsahom 20 mM HEPES pufra, pH=7,45, 5 % plazmy, 1 % L-glutamínu, 1 % penicilin/streptomycin a 0,05 % 2-merkaptoetanolu, za účelom odstránenia akýchkoľvek adherentných buniek, ktoré tu vystupujú ako kontaminácia. Vo všetkých pokusoch sa T-bunky premyli RPMI-AP5, a potom sa preniesli na mikrotitračné platničky s 96 jamkami. Koncentrácia buniek je 2 až 3 x 106 buniek/ml.
Bunky z línie lymfomu T-buniek Jurkat E6-1 (CD28+/CD4+) (152-TIB) boli udržiavané v kultivačnom médiu RPMI-10 (kultivačné médium RPMI-1640 s obsahom 20 mM HEPES pufra pH=7,4, 10 % fetálneho hovädzieho séra (FCS) (Hyclon, Logan, UT), 1 % Lglutamínu a 1 % penicilin/streptomycin.
Príklad 4: Mitogénom indukovaná aktivácia T-buniek a liečenie oligonukleotidmi
Pred pridaním Iudských periférnych T-buniek alebo bunkovej línie lymfomu T-buniek (v množstve 0,3 x 106) sa duplikát mikrotitračných platničiek s 96 jamkami pokryl monoklonálnymi protilátkami proti CD3 (mAb) (6,25-200 ng/jamka) (klón HIT 3a, Pharmingen, San Diego, CA) a dvakrát sa premyl studeným fyziologickým roztokom puftovaným fosforečnanom, pH = 7,4 (PBS). T-bunky ošetrené anti-CD3 monoklonálnymi protilátkami sa potom aktivovali pridaním 2 ng forbol-12myristát-13-acetátu (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA) a boli inkubované 48 hodín pri teplote 37 °C. Hneď po aktivácii sa T-bunky aktivované anti-CD3/PMA ošetrili 1 až 20 pM CD28 špe cifickými a kontrolnými oligonukleotidmi a pridanie sa opakovalo ešte jeden krát po 24 hodinách. T-bunky z jedného duplikátu mikrotitračných platničiek sa použili pre imunofluorescenčnú analýzu a druhá mikrotitračná platnička sa použila pre analýzu proliferácie T-buniek.
Príklad 5: Imunofluorescenčné štúdie
Po aktivácii sa 150 μΐ inkubačného média nad bunkami z prvého duplikátu mikrotitračnej platničky prenieslo na inú mikrotitračnú platničku za účelom analýzy tvorby cytokínov bunkami. Zvyšné bunky sa premyli dvakrát izotonickým fyziologickým roztokom pH = 7,4 (Becton Dickinson, Mansfield, MA) a resuspendovali sa v 50 μΐ izotonického fyziologického roztoku a rozdelili sa na dve vzorky. Jedna vzorka sa zafarbila PE-CD28/FITC-CD4 monoklonálnymi protilátkami a druhá vzorka sa zafarbila porovnatelnými kontrolnými protilátkami označenými PE/FITC. Všetky protilátky označené fluorescenčné sa získali od firmy Becton Dickinson (San Jose, CA) . Inkubácia sa uskutočnila v tme pri teplote 4 °C počas 45 minút pri použití nasýtenej koncentrácie monoklonáIných protilátok. Nenaviazaná značená látka sa pred analýzou v prietokovom cytometri FACScan (Becton Dickinson) odstránila premytím pomocou PBS. Hustota antigénu sa nepriamo stanovila v privádzaných živých bunkách a vyjadrila sa ako priemerné pásmo fluorescencie (MFC). Povrchová expresia CD4+ buniek zafarbených CD28 monoklonálnymi protilátkami sa stanovila odpočítaním MCF buniek CD28+CD4+ od MCF buniek CD28CD4. Životaschopnosť kontrolných neošetrených buniek a buniek ošetrených oligonukleotidmi sa stanovila v každej sérii u všetkých oligonukleotidov a viacerých donorov farbením propidiumjodidom (výsledná koncentrácia je 5 μς/πιΐ) . Percento živých buniek po ošetrení všetkými sériami oligonukleotidov v rozsahu dávky 1 až 20 μΜ, ktoré sa stanovilo po zafarbení propidiumjodidom sa stanovilo cytometricky a bolo vyššie ako 90 % (rozsah 90 až 99 %) .
Príklad 6: Analýza cytokínov
Koncentrácia ludských cytokínov získaných z buniek sa stanovila vo všetkých supernatantoch buniek z prvého duplikátu mikrotitračných platničiek. Mitogénom indukované zmeny v množstve interleukínu-2 (IL-2) sa stanovili použitím bežne dostupného kitu ELISA (R and D systems Quantikine kit, Minneapolis, MN) . Všetky výsledky testu ELISA sa vyjadrujú v jednotkách pg/ml.
Príklad 7: Analýza zmeny elektroforetickej mobility (EMSA)
5' zakončenie testovaných oligonukleotidov za označil [γ—32P]—ATP (ICN, Costa Mesa, CA) za použitia T4 polynukleotidovej kinázy podlá protokolu výrobcu (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . 10 pg nukleárneho extraktu buniek HeLa (Promega) sa inkubovalo približne s 80 000 cpm značeného oligonukleotidu 20 minút pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes pre väzbu obsahovala 10 mM Tris-HCl (pH =7,5), 50 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 1 mM MgC12, 4 % glycerol a 0,5 pg poly(dl.dC). Komplexy DNA-proteín sa rozdelili elektroforeticky na 4 % polyakrylamidovom géli, ktorý obsahoval 0,5 x TBE pufer (50 mM Tris, 45 mM kyselina ortoboritá, 0,5 mM EDTA) počas 3 hodín pri napätí 100 V. Gél sa vysušil a autoradidgraf sa analyzoval v Phosphorlmager (Biorad, Richmond, CA).
Príklad 8: Príprava cDNA pre účely mapovania oligonukleotidov za použitia nukleáz štiepiacich DNA a test posunu na géli cDNA (o veľkosti 300 párov báz), ktorá sa používa pri naviazaní proteínu a DNA v testoch mapovania oligonukleotidov a posunu na géli, sa izolovala z plazmidov pCAT3e28b, pCATe28h alebo pCAT3e28h-l. 60 pg každého plazmidu sa štiepilo reštrikčným enzýmom BglIII. Niektorá štiepená DNA sa naniesla na agarózový gél, aby sa overila linearita DNA. Zvyšok sa extrahoval zmesou fenol/sevag, vyzrážal sa etanolom a opäť bol resuspendovaný vo vode a bol štiepený reštrikčným enzýmom Sací. Malá časť sa opäť naniesla na gél, aby sa overilo, či sa uskutočnilo štiepenie (mali by sa objaviť dva pruhy veľkosti 4 kb a 300 bp). Zvyšok sa extrahoval zmesou fenol/sevag a vyzrážal sa etanolom. Pre účely nasledujúcej defosforylácie sa pelet DNA resuspendoval v malom objeme vody (62 μΐ) a pridal sa 1 pl 20 U/μΙ alkalickej fosfatázy (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 7 μΐ 10 x koncentrovaného reakčného pufru. Po inkubácii reakčnej zmesi pri teplote 37 °C počas 1 hodiny sa pridalo 7 μΐ 0,2 M EGTA pH=8,0 a všetko sa zahrievalo pri teplote 65 °C 10 minút. Celkový objem 77 μΐ defosforylovanej DNA sa naniesol za účelom prečistenia pruhu veľkosti 300 pb na 1 % agarózový gél. K extrakcii DNA z gélu sa použil extrakčný kit Qiaquick od firmy Qiagen (Šanta Clarita, CA). Výsledný objem čisteného pruhu DNA o veľkosti 300 pb bol 70 μΐ a koncentrácia sa vypočítala nasledovným spôsobom: 60 pg x (300 bp/4 300 bp) = 4,2 pg. Predpokladá sa, že výťažok DNA z pruhu je 50 % a potom koncentrácia bude
2,1 pg v 70 pl. To znamená 30 ng/pl. Koniec DNA za označil
P (pomocou kinázy). V reakcii pri rádioaktívnom značení sa použilo 5 až 7 pl izolovanej DNA o veľkosti 300 bp.
Príprava polyakrylamidového gélu pre účely testu posunu na géli
Pripravil sa roztok 4 % polyakrylamidového gélu, ktorý nemá denaturačné vlastnosti, v 0,5 x TBE podlá technického návodu Promega Gel Shift Assay Systems (4 % akrylamid, 0,05 % bisakrylamid, 2,5 % glycerol, 0,5 % TBE). Pripravil sa zásobný roztok vyššie uvedeného gélu v množstve 250 ml, prefiltroval sa a uskladnil pri teplote 4 °C. Pri každom použití sa pridalo na každých 25 ml zásobného roztoku 4 % gélu 12,2 μΐ TEMED a 287, 5 μΐ 10 % persufátu amónneho a roztok gélu sa vylial na platničku rozmerov 16,5 cm x 16,5 cm x 0,75 mm. Aby sa dosiahli optimálne výsledky, gél sa nechal vždy polymerizovať cez noc. Elektroforéza sa uskutočnila len v pufri 0,5 x TBE bez vzoriek počas 30 minút pri napätí 100 V a potom sa naniesli vzorky.
Príklad 9: Príprava a čistenie dvojreťazcových oligonukleotidov
Použitý spôsob je založený na publikácii „Antiparallel polypurine phosphorothioate oligonucleotides form stable triplexes with the rat αΐ (I) collagen gene promotor and inhibit transcription in cultured rat fibroblasts Jacob Joseph a spol., Nucleic Acids Research, 1997, zv. 25, č. 11, 21822188. Rovnaké množstvo komplementárneho reťazca sa zahrievalo pri teplote 80 °C 5 minút v 0,25 M NaCl. Potom nasleduje pomalé ochladenie na laboratórnu teplotu. Dvojreťazcové oligonukleotidy spojené tepelnou hybridizáciou sa izolovali elektroforézou na 6 % polyalrylovom géli (29 : 1), ktorý nemá denaturačné vlastnosti, potom sa vyrezali a eluovali z gélu a vyzrážali sa etanolom. Použili sa , spôsoby popísané v publikácii „Molecular cloning, a laboratory manual, Sambrook, Fritsch a Maniatis. Do značkovacej reakcie sa pridalo približne 20 ng dvojreťazcových oligonukleotidov.
Príklad 10: Značenie konca DNA pomocou 32P
150 až 200 ng cDNA o velkosti 300 bp alebo 20 ng dvoj reťazcových oligonukleotidov sa inkubovalo s 10 pCi [γ-32Ρ]ΆΤΡ (4 500 Ci/mmol, ICN, Irvin, CA) a s 10 jednotkami kinázy a 1 x koncentrovaným kinázovým pufrom (firma Promega) v objeme 10 μΐ pri teplote 37 °C počas 1 hodiny a prečistili sa na kolóne Centri Spin 10 (Princeton Separation, Adelphia, NJ) . Pri reakcii v každom teste posunu sa používala DNA vykazujúca približne 80 000 až 100 000 cpm, ktorá je upravená kinázou.
Príklad 11: Test posunu na géli
Proteíny (nukleárny extrakt alebo prečistený transkripčný faktor) sa inkubovali s 1 x koncentrovaným pufrom pre test posunu na géli (Promega, Madison, WI) pri laboratórnej teplote počas 5 až 10 minút, potom sa pridala DNA upravená kinázou a nasledovala inkubácia 20 až 30 minút pri laboratórnej teplote. Vzorky sa potom naniesli na upravený 4 % gél, ktorý nemá denaturačné vlastnosti. Elektroforéza sa uskutočnila počas 3 až 4 hodín pri napätí 100 V v pufri, ktorý je 0,5 x koncentrovaný TBE. Gél sa sušil na dvoch hárkoch Whatman papiera a exponoval sa vo vývojke luminiscencie fosforu cez noc.
Príklad 12: Test protilátkového super-posunu na géli
Protilátky Spi (klón 1C6, Šanta Cruz Biotechologies, Šanta Cruz, CA) sa predinkubovali s prečisteným Spi (Promega) 1 hodinu a potom sa pridala cDNA označená 32P alebo oligonukleotidmi.
I * I
Príklad 13: Konkurenčný test posunu na géli
Neznačené oligonukleotidy v približne 70 až 100 molárnom nadbytku (buď jednoreťazcové alebo dvojreťazcové) sa predinkubovali s proteínom pri laboratórnej teplote približne 30 minút a potom sa pridala cDNA označená 32P.
Príklad 14: Konštrukcia pCAT3e28b, pCAT3e, pCAT3e28h-l
RT PCR umožnila vytvoriť cDNA smerom ku 5' zakončeniu CD28 (-197 až +28), pričom ako templát sa použila celková RNA buniek Jurkat. Tento segment cDNA sa najskôr klonoval do TA klónovacieho vektora PCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Rovnaká cDNA sa neskôr subklónovala do vektora pCAT3e (Promega) a začlenila sa do miesta Xhol-Sacl. PCAT3e28h a pCAT3e28h-l sú mutanty pCAT3e28b, v ktorých boli deletované sekvencie -51 až -22 a boli substituované inými 15 nukleotidmi.
Príklad 15: Transfekcia (dočasná expresia)
Jeden deň pred transfekciou sa bunky Jurkat pripravili do 2 alebo 3 T150 v riedení 1:4 alebo 1:5 z 80 až 90 % konfluentných buniek. Tesne pred transfekciou sa všetky bunky zliali do jednej kultivačnej nádoby a spočítali sa (koncentrácia buniek by sa mala pohybovať okolo 40 x 104 buniek/ ml) . 11 x 4 x 106 buniek pre použitie v 10 transfekčných reakciách sa centrifugovalo v skúmavkách s kónickým dnom s objemom 50 ml. Bunky sa jedenkrát premyli PBS. Objem PBS je polovica pôvodného objemu. Bunky sa resuspendovali v 44 ml vopred zahriateho, čerstvého Jurkatovho kultivačného média (90 % RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % L-glutamát, 1 % penicilín/streptomycín) tak, že výsledná koncentrácia bola 1 x 106 buniek/ml. 4 ml roztoku buniek sa rozpipetovali do jamôk mikrotitračnej platničky so 6 jamkami. Do skúmavky objemu 1,5 ml sa napipetovalo 2,5 μΐ plazmidu v koncentrácii 2 mg/ml (séria pCAT3e), pridalo sa 147,5 μΐ kultivačného média RPMI 1640 (bez séra a antibiotík) . Potom do roztoku plazmidu a kultivačného média bolo pridaných 20 μΐ činidla Superfact od firmy Qiagen. Zmes sa premiešala pipetou tak, že sa roztok 5 x do pipety napipetoval a vypustil a potom sa nechal stáť pri laboratórnej teplote 5 až 10 minút. Do každej jamky s bunkami sa po kvapkách pridal transfekčný komplex a všetko sa mierne premiešalo. Bunky sa inkubovali pri teplote 37 ’C v inkubátore s atmosférou C02 a po 24 hodinách sa bunky odobrali pre účely testu CAT. V prípade, že sa po transfekcii majú pridať oligonukleotidy, k bunkám sa v určený čas (1 hodina po trans-
fekcii) pridalo 50 pl zásobného roztoku 400 pM nukleotidov a bunky boli uložené do inkubátora. oligo-
Príklad 16: Test CAT *
PO 24 hodinách inkubácie sa bunky odobrali pipetou
z každej jamy do skúmaviek objemu 15 ml s kónickým dnom. Jamky sa premyli bunkovým kultivačným médiom, aby tam nezostali žiadne bunky. Bunky boli potom centrifugované pri 2 000 otáčkach za minútu pri laboratórnej teplote 5 minút. Kultivačné médium sa odsalo pipetu. Každý bunkový pelet sa premyl 2x2 ml PBS (pridal sa PBS, zmes sa premiešala na Vortexe, centrifugovala a kultivačné médium sa odsalo pipetu). Pipetou sa odsalo maximálne množstvo PBS. Potom sa do skúmavky s peletom buniek pridalo 400 pl 1 x koncentrovaného reportného lyžujúceho pufra. Lýza buniek sa uskutočnila inkubáciou pri laboratórnej teplote počas 30 minút za občasného premiešania skúmaviek na Vortexe. Na konci 30 minútovej inkubácie sa skúmavky zahriali na teplotu 60 ’C počas 10 minút, potom sa centrifugovali pri laboratórnej teplote pri 12 000 ot./min. 2 minúty a supernatant (lyzát) sa preniesol pipetou do novej skúmavky objemu 1,5 ml. Pri každej reakcii testu CAT sa použilo 100 pl lyzátu. Zvyšok sa zamrazil pri teplote -80 °C. Každý test CAT obsahoval: 18,5 pl vody sa zmiešalo so 100 pl lyzátu, pridalo sa 5 pl n-butyryl-CoA v koncentrácii 5 mg/ml (Promega) a 1,5 pl 0,1 pCi/pl chloramfenikol-^C (ICN) v skúmavke 1,5 ml (celkový objem zmesi je 125 pl) a zmes sa inkubovala pri teplote 37 ’C 1 hodinu. Na konci prvej hodiny sa do každej skúmavky pridalo 300 μΐ xylénu (ICN). Objem sa premiešal na Vortexe 5 sekúnd, potom nasledovala centrifugácia pri maximálnej rýchlosti 3 minúty pri laboratórnej teplote. 280 μΐ vrchnej fázy (xylén) sa prenieslo pipetou do novej skúmavky. K týmto 280 μΐ xylénovej fázy sa pridalo 100 μΐ 0,25 M Tris, pH=8,0. Zmes sa premiešala na Vortexe a centrifugovala sa ako je popísané vyššie. 200 μΐ vrchnej fázy sa prenieslo pipetou do scintilačnej flaštičky a pridalo sa 5 ml scintilačného roztoku. Celý objem sa dobre premiešal a vzorky sa hodnotili meraním rádioaktivity v scintilačnom počítači.
Príklad 17: Stabilita oligonukleotidov in vitro predlžuje biologickú aktivitu fosforotioátových oligonukleotidov
Modifikácia oligonukleotidov internukleotidovými fosforotioatovými väzbami môže udeliť rezistenciu voči nukleázam, a tak predĺžiť bioaktivitu in vitro z 1 až 2 hodín na 24 hodín (Stein, (1993) Science 261: 1004-1012). Ukázalo sa, že oligonukleotidy bohaté na G napríklad FIGURE1A (Seq#4) vykazujú väčšiu stabilitu in vitro pri porovnaní s fosforotioatom, ktorý nie je obohatený G FIGURE1B (Seg#21). Na obrázku 1A uvedené elektroforeogramy kasne ukazujú, že v prípade extracelulárneho 1A (S) a bunkového 1B (L) podstatne viac neporušený počas 96 hodinovej inkubácie s bunkami Jurkat zostáva oligonukleotid FIGURE1A (Seq#4) označený 32P pri porovnaní s oligonukleotidom FIGURE1B (Seq#21). V súhlase s týmto pozorovaním sa javia údaje z kolóny Nickspin (obrázok č. 1B). Percento neporušených oligonukleotidov FIGURE1A (Seq#4) po 96 hodinách je 54 % (S) a 59 % (L) a z FIGURE1B (Seq #21) je 10 % (S) a 34 % (L) . Tieto výsledky naznačujú, že vyššia rezistencia voči nukleáze sa dosiahne iba prítomnosťou oblastí obohatených G v FIGURE1A (Seq#4) a to je práv depodobne spojené so schopnosťou tohoto určitého nukleotidu tvoriť zbalené sekundárne štruktúry.
Príklad 18: Inhibícia expresie funkčného CD28 a CD28špecifická produkcia IL-2 v aktivovaných ľudských T-bunkách aptamérovými oligonukleotidmi je závislá na špecifickom motíve bohatom na G
Realatívna inhibícia expresie CD28 a CD28-špecifickej produkcie IL-2 pomocou fosforotioátovej oligonukleotidovej sekvencie #4 až #21 (5 pM) uvedené v tabuľke č. 1 je zaznamenaná v tabuľke č. 2. Tabuľka č. 2 ukazuje, že inhibičná aktivita čiastočne závisí od sekvencie a opiera sa o prítomnosť motívu, ktorý obsahuje dve štvorice G oddelených štyrmi bázami (Seq#5 až #8). Tieto hodnoty naznačujú, že interakcia oligonukleotidu, ako je FIGURE1A (Seq#4) a jeho putatívneho cieľa, závisí na presnej požiadavke konformácie, čo je podobné ako u interakcie oligonukleotid-proteín, skôr ako na požiadavke hybridizácie nukleová kyselina/nukleová kyselina (ako je možné nájsť u antigénnych a nezmyselných modelov).
Príklad 19: Oligonukleotidy obsahujúce špecifický 12-mérový motív tvoria špecifický proteínový oligonukleotidový komplex
Obrázok č. 2 zobrazuje analýzu posunu elektroforetickej pohyblivosti oligonukleotidov označených 32P, ktoré sa predinkubovali s extraktom buniek HeLa. Zoznam oligonukleotidov uvedený v tabuľke č. 3 obsahuje dva oligonukleotidy FIGURE1A (Seq#4) a ICN 16481 (Seq#5), ktoré obsahujú 12-mérový motív nesúci dve sady štvoríc G oddelených 4 nukleotidmi. Testovali sa len oligonukleotidy s uvedeným motívom (dráha 5 a 11), aby vznikol posun komplexu oligonukleotid-proteín (pruh A), ktorý sa líši od iných fosforotioátových oligonukleotidov. Tieto hodnoty naznačujú, že špecifické interakcie protein-oligonukleotid sa objavujú u oligonukleotidov obsahujúcich 12mérový motív.
Príklad 20: Inhibícia expresie funkčného CD28 v aktivovaných ludských T-bunkách pomocou aptamérových oligonukleotidov je vo vzťahu k prítomnosti špecifického komplexu oligonukleotid-proteín
Tabuľka č. 4 porovnáva účinok inhibicie mitogénom vyvolanej expresie CD28 a produkcie IL-2 pomocou niektorých fosforotioatových oligonukleotidov pri koncentrácii 5 pM s ich aptamérovou schopnosťou tvoriť špecifický komplex oligonukleotid-proteín, v prípade že sa inkubujú s nukleárnym extraktom buniek HeLa, ktorý je bohatým zdrojom transkripčných faktorov. Tieto údaje jasne ukazujú na vzťah medzi inhibičnou aktivitou oligonukleotidov s motívom pre expresiu CD28 a vylučovanie IL-2 a tvorbu špecifického pruhu posunu na géli. Substitúcia smerovaná do dvoch štvoríc G vedie k strate funkcie a komplex oligonukleotid-proteín mizne.
Príklad 21: Promótorová oblasť na 5' zakončení CD28 -197 až +28 (28b) viaže Spi
Promótorová oblasť CD28 -197 až +28 označená 32P, ktorá je známa ako 28b, sa inkubovala s proteínom Spi a so sériou trojnásobného riedenia protilátok proti Spi začínajúcou množstvom 0,5 pg. Uskutočnil sa test super-posunu na géli a komplexy DNAproteín-protilátka sa rozdelili elektroforézou. Výsledky sú uvedené na obrázku č.4. Údaje znamenajú, že Spi sa viaže na oblasť 28b promótora CD28. Táto interakcia je špecifická, čoho dôkazom je vymiznutie pruhu Spl/32P-28b/Spl (prh B) pri nariedení protilátok špecifických pre Spi na hodnotu 0,00617 pg, pričom zostal len pruh 28b/Spl (pruh A) . Znamená to, že 28b špecificky viaže Spi. Pruh C predstavuje volný 28b značený 32P.
Príklad 22: Oligonukleotid -51 až -22 odvodený od promótorovej
I oblasti na 5' zakončení CD28 -197 až +28 (28b) obsahujúci 12-mérový motív bohatý na G môže viazať Spi
Za účelom vymedzenia presnej Spi viažucej oblasti v 28b na motív bohatý na G v promótorovej oblasti CD28 -197 až +28 sa syntetizoval dvojreťazcový (ds) 30-mérový oligonukleotid, ktorý bol pomenovaný 28b oligo (Seq#l, tabulka č. 1), ktorý obsahuje vo svojej sekvencii 12-mér GGGGAGGAGGGG. Bola vyslovená hypotéza, že sa jedná o väzobné miesto pre Spi v promótorovej oblasti CD28. Po označení 32P sa 28b oligo inkuboval s extraktom Spi a došlo k vzájomnému naviazaniu (obrázok č. 5, pruh A, dráha 2 a 3) . Konkurencia s dvojreťazcovým 28b oligo spôsobila, že pruh zmizol, čo znamená, že väzba je špecifická pre Spi (dráha 4) . Prekvapivo jednoreťazcové fosforotioátové oligonukleotidy bohaté na G FIGURE1A (dráha 5) a 16481 (dráha 6) (obidva obsahujú motív bohatý na G) na rozdiel od kontrolného oligonukleotidu ICN 16476 (dráha 7) sa uchádzajú o väzbu s Spi. Tieto údaje znamenajú, že fosforotioátové oligonukleotidy bohaté na G FIGURE1A a ICN 16481 môžu pôsobiť ako aptaméry pri väzbe na DNA väzobné miesto Spi. Dôsledkom tejto interakcie je prevencia naviazania Spi na Spi miesto -51 až -22 v promótorovej oblasti a tak dochádza k inhibícii transkripcie génu CD28 sprostredkovanej SPI a k zoslabeniu expresie proteínu CD28.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Aptamér so sekvenciou, ktorá obsahuje aspoň dve oblasti bohaté na G vybrané zo skupiny GGnG, GGGG, GnGG, nGGG a GGGn, kde G je guanozin a n je ľubovoľný nukleotid.
  2. 2. Aptamér podľa nároku 1, kde aspoň dve z aspoň dvoch oblasti sú oddelené menej ako siedmimi nukleotidmi vrátane.
  3. 3. Aptamér podľa nároku 1, kde aspoň dve z aspoň dvoch oblastí sú oddelené tromi až šiestimi nukleotidmi vrátane.
  4. 4. Aptamér podľa nároku 1, kde aspoň dve z aspoň dvoch oblastí sú oddelené štyrmi nukleotidmi.
  5. 5. Aptamér podľa nároku 1, ktorý sa uchádza o väzobné miestQ imunitného regulačného proteínu pre nukleovú kyselinu.
  6. 6. Aptamér podľa nároku 2, kde imunitný regulačný proteín sa vybral zo skupiny obsahujúcej SPI, NFKB, EGR1 a AP2.
  7. 7. Aptamér podľa nároku 1, ktorý sa uchádza o väzobné miesto imunitného regulačného proteínu pre nukleovú kyselinu, kde aspoň jedna z aspoň dvoch oblastí bohatých na G obsahuje GGnG a aspoň dve z aspoň ( dvoch oblasti sú oddelené dvomi .až .siedmimi nukleotidmi.
  8. 8. Aptamér podľa nároku 1, ktorý sa uchádza o väzobné miesto imunitného regulačného proteínu pre nukleovú kyselinu, kde aspoň jedna z aspoň dvoch oblastí bohatých na G obsahuje GGGG a aspoň dve z aspoň dvoch oblastí sú oddelené dvomi až siedmimi nukleotidmi vrátane.
    ZMENENÝ LIST
  9. 9. Aptamér podlá nároku 1, ktorý sa uchádza o väzobné miesto imunitného regulačného proteínu pre nukleovú kyselinu, kde aspoň jedna z aspoň dvoch oblastí bohatých na G obsahuje GnGG a aspoň dve z aspoň dvoch oblastí sú oddelené menej ako siedmimi nukleotidmi.
  10. 10. Aptamér podlá nároku 1, ktorý sa uchádza o väzobné miesto imunitného regulačného proteínu pre nukleovú kyselinu, kde aspoň jedna z aspoň dvoch oblastí bohatých na G obsahuje GGG a aspoň dve z aspoň dvoch oblastí sú oddelené menej ako siedmimi nukleotidmi.
    11. Aptamér podlá nároku 1 obsahujúci sekvenciu 5'TTG GAG GGG GTG GTG i GGG 3' (Seq. ID. No.4) . 12. Aptamér podlá nároku 1 obsahujúci sekvenciu 5'GGG GAG GAG GGG CTG i GAA 3' (Seq. ID. No.5). 13. Aptamér podlá nároku 1 obsahujúci sekvenciu 5'GGG GTG
    GTG GGG 3' (Seq. ID. No.13).
    14. Aptamér podlá nároku 1 obsahujúci sekvenciu 5'TTG GAG GGG GAG GAG GGG 3' (Seq. ID. No.7). 15. Aptamér pódia 1 nároku 1 obsahujúci sekvenciu 5'TTG GAG GGG GAG GTG GGG 3' (Seq. ID. No.8). 16. Aptamér podlá nároku 1 obsahujúci sekvenciu 5'GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG 3' (Seq. ID. No.6).
    ZMENENÝ LIST
    17. Spôsob tlmenia odpovede vyznačujúci sa aptaméru podlá ktoréhokoľvek z imunitného tým, nárokov 1 systému u pacienta že zahŕňa aplikáciu až 16 pacientovi.
    18. Spôsob liečenia pacienta, terizovaný neprimeranou odpoveďou značujúci sa tým, že podlá ktorýchkolvek z nárokov 1 až ktorý vykazuje stav charakimunitného systému, v y zahŕňa aplikáciu aptaméru 16 pacientovi.
    19.
    Spôsob podlá nároku 18, v m, že stav zahŕňa štep verzus y odpoveď č u j ú c hostitela.
    20.
    Spôsob podlá nároku 18, v m, že stav zahŕňa autoimunitné ochorenia.
    21.
    Spôsob podlá nároku 20, v m, že stav zahŕňa reumatický y z n a č u zápal kĺbov.
    22.
    Spôsob podlá nároku 20, v m, že stav zahŕňa roztrúsenú sklerózu.
    23.
    Spôsob podlá nároku 20, vyzná m, že stav zahŕňa lupus erythematodes.
SK845-99A 1996-12-27 1997-12-19 G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response SK84599A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3450996P 1996-12-27 1996-12-27
PCT/US1997/023927 WO1998029430A1 (en) 1996-12-27 1997-12-19 G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK84599A3 true SK84599A3 (en) 2000-07-11

Family

ID=21876859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK845-99A SK84599A3 (en) 1996-12-27 1997-12-19 G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6994959B1 (sk)
EP (1) EP0968226A4 (sk)
JP (1) JP2002512599A (sk)
KR (1) KR20000069658A (sk)
AU (1) AU5720098A (sk)
BR (1) BR9714438A (sk)
CA (1) CA2278031A1 (sk)
CZ (1) CZ227199A3 (sk)
HU (1) HU0000769A (sk)
IL (1) IL130192A0 (sk)
NO (1) NO993170L (sk)
PL (1) PL334197A1 (sk)
SI (1) SI20117A (sk)
SK (1) SK84599A3 (sk)
WO (1) WO1998029430A1 (sk)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
CA2341338A1 (en) * 1998-09-03 2000-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
DK1366077T3 (da) 2000-09-15 2011-09-12 Coley Pharm Gmbh Fremgangsmåde til screening i store mængder af CpG-baserede immunoagonister/-antagonister
AU2002253836A1 (en) 2000-10-20 2002-08-19 Canji, Inc Aptamer-mediated regulation of gene expression
FR2822156A1 (fr) * 2001-03-16 2002-09-20 Centre Nat Rech Scient Oligonucleotides pour la regulation du gene codant pour le tnf alpha et/ou de genes sous son controle et leurs applications
JP4383534B2 (ja) 2001-08-17 2009-12-16 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
US7790189B2 (en) * 2003-05-15 2010-09-07 Mitsui Sugar Co., Ltd. Immunostimulating agents
WO2005037323A2 (en) * 2003-10-10 2005-04-28 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Use of gro to treat or prevent inflammation
US20050182252A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Reddy K. R. Novel 2'-C-methyl nucleoside derivatives
US7482158B2 (en) 2004-07-01 2009-01-27 Mathison Brian H Composite polynucleic acid therapeutics
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
EP3623364A1 (en) 2014-02-13 2020-03-18 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Prodrug compounds and their uses
CN106687118A (zh) 2014-07-02 2017-05-17 配体药物公司 前药化合物及其用途
AU2015311708A1 (en) 2014-09-07 2017-02-02 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating exon skipping anti-viral transfer vector immune responses
BR112020007157A2 (pt) 2017-10-13 2020-09-24 Selecta Biosciences, Inc. métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral
KR20190065139A (ko) 2017-12-01 2019-06-11 압타바이오 주식회사 혈액암 치료제
JP2021509907A (ja) 2018-01-09 2021-04-08 リガンド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド アセタール化合物およびその治療的使用
US20230165888A1 (en) * 2019-03-13 2023-06-01 Donghwi Park Oligonucleotide having anti-inflammatory activity
BR112021023594A2 (pt) 2019-05-28 2022-02-08 Selecta Biosciences Inc Métodos e composições para resposta imune de vetor de transferência antiviral atenuada
US20230141563A1 (en) 2021-10-12 2023-05-11 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
US20230357437A1 (en) 2022-03-09 2023-11-09 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL101038A0 (en) * 1991-02-21 1992-11-15 Gilead Sciences Inc Agent specific for trombin and its use
US5567604A (en) * 1993-04-23 1996-10-22 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
DE19502912A1 (de) * 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
HUP9801629A3 (en) * 1995-02-09 2000-10-30 Icn Pharmaceuticals Inc Costa Methods and compositions for regulation of cd28 expression
US5932556A (en) * 1995-09-17 1999-08-03 Tam; Robert C Methods and compositions for regulation of CD28 expression
AU725936B2 (en) * 1995-07-19 2000-10-26 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
AU5720098A (en) 1998-07-31
NO993170L (no) 1999-08-25
IL130192A0 (en) 2000-06-01
KR20000069658A (ko) 2000-11-25
HU0000769A (en) 2000-07-28
US6994959B1 (en) 2006-02-07
EP0968226A4 (en) 2001-02-14
CZ227199A3 (cs) 1999-12-15
BR9714438A (pt) 2000-03-21
CA2278031A1 (en) 1998-07-09
JP2002512599A (ja) 2002-04-23
SI20117A (sl) 2000-06-30
NO993170D0 (no) 1999-06-25
WO1998029430A1 (en) 1998-07-09
PL334197A1 (en) 2000-02-14
EP0968226A1 (en) 2000-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK84599A3 (en) G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response
Holtz-Heppelmann et al. Transcriptional regulation of the human FasL promoter-enhancer region
AU673992B2 (en) Senescent cell derived inhibitors of DNA synthesis
JP2019014733A (ja) Ｔｎｆスーパーファミリー受容体に対するスプライス切替オリゴマーならびに疾病治療における該オリゴマーの使用
US5932556A (en) Methods and compositions for regulation of CD28 expression
JP2732546B2 (ja) 細胞接着のオリゴヌクレオチド調節
US5990090A (en) Methods and compositions for treatment of diseases
US9868776B2 (en) Anti-sense oligonucleotides targeted against exon 9 of IL-23R-alpha gene and method of using same to induce exon skipping and to treat inflammatory bowel diseases
CA2273203A1 (en) Antisense inhibition of human adhesion molecules
US6399376B1 (en) Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
WO1996024380A9 (en) Methods and compositions for regulation of cd28 expression
EP0810882A1 (en) Methods and compositions for regulation of cd28 expression
US20230287427A1 (en) Inhibition of lncExACT1 to Treat Heart Disease
AU703139B2 (en) Methods and compositions for regulation of CD28 expression
MXPA99005880A (en) G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response
US20020052331A1 (en) Compositions and methods for antisense inhibition of protein translation
Tam et al. Inhibition of CD28 expression by oligonucleotide decoys to the regulatory element in exon 1 of the CD28 gene
MXPA97005963A (en) Methods and compositions for the regulation of the expression of c
MXPA99005066A (en) Antisense inhibition of human adhesion molecules