SI20117A - Oligoaptameri bogati z G-jem in metode modulacije imunskega odziva - Google Patents

Oligoaptameri bogati z G-jem in metode modulacije imunskega odziva Download PDF

Info

Publication number
SI20117A
SI20117A SI9720081A SI9720081A SI20117A SI 20117 A SI20117 A SI 20117A SI 9720081 A SI9720081 A SI 9720081A SI 9720081 A SI9720081 A SI 9720081A SI 20117 A SI20117 A SI 20117A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
aptamer
ggg
nucleic acid
icn
regions
Prior art date
Application number
SI9720081A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Tam
Original Assignee
Icn Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icn Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Icn Pharmaceuticals, Inc.
Publication of SI20117A publication Critical patent/SI20117A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Predmet pričujočega izuma so aptameri oligonukleotidov, specifično vezani na DNK vezišča proteinov, kot so Spl in Spl-sorodni proteini, ki regulirajo gene z zapisom za kostimulatorne molekule, kot je CD28 in citokine, kot sta IL-2 in GMCSF. Oligonukleotidi tekmujejo z DNK vezišči regulacijskih proteinov, ki specifično regulirajo molekule in s tem modulirajo aktivacijo celic T. To služi za moduliranje genskega izraza pri preprečevanju transkripcije gena. Aptameri so uporabni za terapijo pri boleznih, ki so posledica nepravilne aktivacije celic T, kot so luskavica, sladkorna bolezen tipa I (insulinsko odvisna) diabetes melitus, multipla skleroza, avtoimunski uveitis, revmatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, vnetje črevesa (Crohnov in gnojni katar debelega črevesa), in septični šok. Aptameri so uporabni tudi pri reguliranju normalne aktivacije celic T, kot je zavrnitev alotransplantata.ŕ

Description

Nastanek in poslabšanje številnih razširjenih bolezni, ki so povezane s celicami T, so posledica neprimernega imunskega odziva pri nenormalni aktivaciji celic T. Za številne druge bolezni vključno s sladkorno boleznijo tipa I (insulinsko odvisna) diabetes melitusom, boleznijo žleze ščitnice ('thyroiditis'), sarkoidozo, multiplo sklerozo, avtoimunskim uveitisom, revmatoidnim artritisom, sistemskim lupus eritematozusom, vnetjem črevesa (Chronov in gnojni katar debelega črevesa) in aplastično anemijo je veljalo, da nastanejo z nepravilno aktivacijo celic T. Nadalje, številni sindromi vključno s septičnim šokom, hiranje, ki ga povzroča tumor, lahko vključujejo aktivacijo celic T in posledično povečano proizvodnjo toksičnih nivojev limfokinov. Normalna aktivacija celic T prav tako povzroča zavrnitev transplantiranih celic in organov s potrebnimi signali za učinkovito razgradnjo oz. uničenje “tujega” donorskega tkiva.
Aktivacija limfocitov T, ki vodi do proliferativnega odziva celic T in genskega izražanja ter do izločanja specifičnih imunomodulacijskih citokinov, zahteva dva neodvisna signala. Prvi signal vključuje prepoznavanje antigena z glavnim histokompatibilnim kompleksom molekul na površini antigen predstavljajoče celice (APC), s specifičnim T-celičnim receptorjem in CD3 kompleksom. Antigen-nespecifične intercelularne interakcije med celicami T in APC povzročijo drugi signal, ki regulira odziv celice T na antigen. Ti sekundami ali kostimulatorski signali določajo velikost odziva celice T na antigen. Kostimulatome celice (dopolnilne celice) reagirajo pri povečanju nivojev specifičnega citokinskega genskega prepisovanja in pri stabiliziranju selektiranega mRNK. Aktivacija celic T in odsotnost kostimulacije vodi do nerazvitega ali anergičnega odziva celic T. Ključni kostimulatomi signal nastane pri interakciji Tceličnega površinskega receptorja CD28 z molekulami B7 na APC (Linsley in Ledbetter (1993) Annu Rev Immunol 11 : 191-212). CD28 je konstitutivno izražen na 95% CD4+ celic T (ki preskrbi pomožne funkcije za produkcijo protiteles za celice B) in na 50% CD8+ celic T (ki imajo citotoksične funkcije) (Yamada et al (1985) Eur J Immunol 15 : 1164-1168). Zgodijo se naslednje antigenske ali in vitro mitogenske stimulacije in nadalje indukcija površinskih nivojev CD28, kot tudi produkcija določenih imunomodulatornih citokinov. Te vključujejo interlevkin-2 (IL-2), ki je potreben za razvoj celičnega cikla celic T, interferon-gama (IFNy), ki prikazuje široko raznolikost proti-virusnih in proti-tumomih učinkov in interlevkin-8 (IL-8), ki je poznan kot močan kemotaktični faktor za nevtrofilce in limfocite. Ti citokini so regulirani s C28 pri aktivaciji celic T (Fraser et al (1991) Science 251 : 313-316, Seder et al (1994) J Exp Med 179 : 299-304, Wechsler et al (1994) J Immunol 153 : 2515-2523). IL-2, IFNy in IL-8 so bistveni pri pospeševanju širokega območja imunskih odzivov in so bili prikazani kot močno izraženi pri številnih bolezenskih stanjih, ki so posledica posredovanja celic T.
Pri psoriazi (luskavici), aktivirane poškodovane celice T pretežno sprostijo Thl citokinone, kot je IL-2 in IFNy (Schlaak et al (1994) J Invest Derm 102 : 145-149). Ti izločeni citokini sprožijo normalne keratinocite, da izrazijo enak fenotip (HLA DR+/ICAM-1+) kot je najden pri luskavičnih poškodbah (Baadsgaard et al (1990) J Invest Derm 95 : 275-282). Prav tako je IL-8, s pomočjo njegovih in vitro in in vivo vnetnih lastnosti in, ker je izločen v velikih količinah pri obeh, aktiviranih celicah T in keratinocitih iz luskavičnih poškodb, smatran kot glavni akter patoloških sprememb, ki se vidijo na koži v primeru luskavice, kot je keratinocitna hiperproliferacija. Nadalje, ena od B7 družin receptorjev (naravni ligandi za CD28 najdeni na aktiviranih APC) BB1, ki je bila najdena pri luskavici vendar ne neprizadeti kožni keratinociti (Nickoloff et al (1993) Am J Pathology 142 : 1029-1040), poudarja pomembnost aktivacije celic T v patogenezi bolezni.
V primeru drugih kožnih pomanjkljivosti, ki so posledica celic T, kot je alergeni kontaktni dermatitis in lišaj ('lichen planus'), je bila CD28 močno izražena v večini dermalnih in epidermalnih CD3+ celic T, v primeru normalne kože in osnovnega celičnega karcinoma (bolezen, ki ni posledica T-celične pomanjkljivosti), pa je bila CD28 izražena samo v perivaskulamih celicah T. Podobno je bil v primeru obeh, alergičnega kontaktnega dermatitisa in lišaja ('lichen planus'), na dermalnih dendritičnih celicah, dermalnih APC in na keratinocitih najden B7, ni pa bil najden na normalni koži in na osnovnem celičnem karcinomu (Simon et al (1994) J Invest Derm 103 : 539-543). Na osnovi tega je mogoče domnevati, da je vezanje CD28 z B7 zelo pomembno pri kožnih boleznih, ki so posledica T-celičnih pomanjkljivostih.
Abnormalna aktivacija celic T povezana z določenimi avtoimunskimi boleznimi, ki so povzročene z izgubo samotolerance, je pretežno okarakterizirana s prisotnostjo CD28+ celicami T in njihovim ligandom B7 na aktiviranih profesionalnih APC (monocit, makrofag ali dendritične celice). Te vključujejo avtoimunsko Graevesovo bolezen ('Graves thyroiditis') (Garcia-Cozar et al (1993) Immunologia 12 32), sarkoidozo (Vandenberghe et al (1993) Int Immunol 5 : 317-321), revmatoidni artritis (Verwilghen et al (1994) J Immunol 153 : 1378-1385) in sistemski lupus eritematozus (Sfikakis et al (1994) Ciin Exp Immunol 96 : 8-14). Pri normalni aktivaciji celic T, ki povzroča zavrnitev transplantiranih celic in organov, je vezava CD28 z ustreznim B7 ligandom na T-celičnem receptorju kritična za primeren alogenski odziv na tuje antigene, na primer na tkiva donorjev (Ažurna et al (1992) J Exp Med 175 : 353-360, Turka et al (1992) Proč Nat Acad Sci USA 89 : 11102-11105).
Tradicionalne terapije za avtoimunske bolezni ne preprečujejo aktivacije celic T; efektorski korak v avtoreaktivnih imunskih odzivih na antigen. Zdravila, kot so steroidi in ne-steroidna protivnetna zdravila (NSAIDS), se trenutno uporabljajo za izboljšanje simptomov, vendar ne preprečijo napredovanja bolezni. Nadalje, steroidi lahko imajo stranske učinke, kot je npr. nastanek osteoporoze, organska toksičnost in diabetes, ter lahko pospešijo degeneracijske procese hrustanca in povzročajo ti. poinjekcijske širitve za 2 do 8 ur. NSAIDS lahko povzroči želodčne intestinalne stranske učinke in povečano tveganje za agranulocitozo in iatrogenični hepatitis.
Imunosupresijska zdravila so prav tako uporabna kot druga oblika terapije, posebno v naprednih fazah bolezni. Kakorkoli, ta zdravila ‘zadušijo’ celoten imunski sistem, zdravljenje pa ima pogosto resne stranske učinke vključno s hipertenzijo in nefrotoksičnostjo. Tudi uveljavljeni imunosupresijski agensi kot sta ciklosporin in FK506 ne morejo inhibirati od CD28 odvisne aktivacijske poti celice T (June et al (1987) Mol Celi Biol 7 : 4472-4481).
Sedanji agensi, ki vplivajo na aktivacijo celic T, vsebujejo sintetične peptide, monoklonska protitelesa in topne oblike T-celične aktivacije molekul. Do danes še vedno niso bili identificirani ustrezni sintetični peptidi T-celičnim aktivacijskim molekulam, kot so CD28, CD40L in CAM družina adhezivnih molekul. Monoklonska protitelesa (mAb) so bila prikazana kot protitelesa, ki imajo možne terapevtske učinke v primeru bolezni, ki so posledica T-celičnih pomanjkljivosti, kot je luskavica (anti-CD4 (Prinz et al (1994) Lancet 338 : 320-321)) in imunosupresija normalne T-celične aktivacije v primeru alotransplantatov (anti-VCAM-1 in VLA-4 (Isobe et al (1994) J Immunol 153 : 5810-5818)). Kakorkoli, s kroničnim zdravljenjem gostujoče živali razvijejo protitelesa proti monoklonskim protitelesom pri čemer omejijo njihovo uporabo. Razvita so bila “humanizirana” protitelesa, ki navidezno znižajo nevarnost sproženega imunskega odziva na te mAbs. Ta so še vedno predmet razvoja oz. proučevanja in v nadalje ostanejo nove mAbs veliki proteini, pri čemer je težko doseči njihova ciljna mesta oz. vezišča. Razvite so bile topne oblike T-celičnih aktivacijskih molekul, kot je CTLA-4Ig, ki vsebujejo ekstracelulamo področje človeškega CTLA-4 gena (kije naravno nadaljevanje povezano z CD28), vezanega na človeško Ig Cy verigo. Za CTLA-4Ig je bilo prikazano, da specifično blokira normalno aktivacijo celic T pri preprečitvi zavrnitve ksenogenskih (Lenschow et al (1992) Science 257 : 789-792) in alogenskih (Turka et al (1992) Proč Nat Acad Sci USA 89 : 11102-11105) srčnih alotransplantatov v podganah in da ima terapevtski učinek na abnormalno aktivacijo celic T, kot je najden pri podganskem avtoimunskem glomerulonefritisom (Nishikawa et al (1994) Eur J Immunol 24 : 1249-1254). Topen CTLA-4Ig kakorkoli kaže podobne omejitve kot monoklonska protitelesa razen stroškov proizvodnje. Poleg tega pa je dejanska funkcija teh CD28 podobnih molekul neznana in zato je potrebna njihova popolna določitev še predenje mogoče ovrednotiti učinke terapije.
Inhibicija izražanja CD28 na površini celic vodi do podaljšanja neodzivnosti ali uničenja aktiviranih celic T. Neaktivacija prepreči proliferacijo celic T in ustavitev za T celice specifično produkcijo specifičnih imunoregulacijskih citokinov, kot so interlevkin-2, interferon-gama in interlevkin-8.
Regulacija CD28 genskega izraza je lahko dosežena z uporabo nezaznavnih in tripleks formulirajočih oligonukleotidov pri hibridizaciji oligodeoksi-ribonukleotidov ali oligoribonukleotidov na DNK ali RNK sekvencah znotraj CD28 genske ali promotorske regije (patent CD28 Tam). Oligonukleotidi odpravijo številne nevarnosti danes uporabljanih agensov, ki jih uporabljamo za blokiranje učinkov normalne ali abnormalne aktivacije celic T. Kakorkoli, te oligo spojine, ki so oblikovane za strategije nezaznavnosti so občutljive na razgradnjo z intracelularnimi nukleazami ali nukleazami, ki so prisotne v ekstracelulamem miljeju.
Vezanje DNK (ali RNK) na protein je bilo v preteklosti prikazano kot fundamentalni mehanizem pri katerem je bila nadzorovana transkripcija genov. Ti regulacijski proteini ali transkripcijski faktorji prepoznajo DNK sekvence s specifično sekundarno strukturo in sledeča interakcija lahko vodi do pozitivne ali negativne kontrole genskega izraza. Aptameri so kratke oligonukleotidne sekvence, ki lahko specifično vežejo specifične proteine. Prikazano je bilo, da se lahko različne aptameme sekvence vežejo specifično na različne proteine, na primer sekvenca GGNNGG kjer je N = gvanozin (G), citozin (C) adenozin (A), ali timin (T) se veže specifično na trombin (Bock et al (1992) Nature 355 : 564-566 in patent #5582981 (1996) Toole et al).
Aptameme sekvence še niso bile opisane s stališča, katere lahko delujejo kot kompetitivni inhibitorji DNK vezišč na regulacijskih proteinih, ki so znani kot transkripcij ski faktorji. Transkripcijski faktorji so razred proteinov, ki regulirajo gene pri primarnem vezanju na specifične regulacijske sekvence v 5' protitočni promotorski regiji teh genov. Ta interakcija vodi do iniciacije transkripcije. Določeni transkripcijski faktorji, kot so Spl, AP2, AP-1, EGR-1 in NFkB so kritični pri aktivaciji limfocitov T in B (Skerka et al J Biol Chem 270 : 22500-22506, Jung et al (1995) Ann N Y Acad Sci 766 : 245-252). V nekaterih primerih so ti transkripcijski faktorji povzročeni s signali, ki izvirajo iz sledeče kostimulacije (Jung et al (1995) Ann N Y Acad Sci 766 : 245-252). Tako je še vedno potrebno razviti agense in metode za motenje interakcij proteina z DNK vezišči, ki bi povzročali supresijo določenih imunskih mehanizmov vključno s kostimulatorskim mehanizmom.
OPIS NOVE REŠITVE
Predmet pričujočega izuma so aptameri oligonukleotidov, ki so se sposobni vezati na DNK proteinov kot so Spl in Spl-podobni proteini, ki regulirajo gene, ki določajo kostimulatorske molekule kot sta CD28 in citokine kot sta IL-2 in GMCSF.
V prednostni združbi so oligonukleotidi oblikovani tako, da se vežejo na specifične regulacijske proteine kot so Spl in s Spl-sorodni proteini in tekmujejo pri vezavi teh transkripcij skih faktorjev na promotorsko regijo genov, ki so pod njihovo kontrolo. Ta modulira genski izraz s preprečevanjem prepisa gena. Tako so aptamer nukleotidi sposobni zavirati delovanje RNK ali DNK ali njihov prepis na protein, njihovo translokacijo v citoplazmo ali katerokoli drugo aktivnost potrebno za njihovo celovito biološko delovanje. Napake v delovanju RNK ali DNK na področju vseh ali samo nekaterih funkcij vodijo do delnih napak v izražanju aktivacije celic T, ki jo kontrolira genom. Na tak način je spremenjen omenjen metabolizem.
Prednostno je potrebno doseči, da aptamerska nukleinska kislina tekmuje z mesti vezanja na DNK regulacijskih proteinov, ki specifično regulirajo molekule, ki lahko modulirajo aktivacijo celic T. Odkrito je bilo, da so CD28 proteini zlasti uporabni za ta namen oz. pristop. Pričakovano je, da je inhibicija CD28 in CD28 sorodnega genskega izraza koristna za zdravljenje luskavice in drugih bolezni kože, sindromov z anormalno aktivacijo celic T, avtoimunske neurejenosti in zavrnitve alotransplantatov.
Metode moduliranja aktivacije celic T sestojijo iz kontaktiranja pacienta in oligonukleotida, ki tekmuje z mestom vezave na DNK regulacijskega proteina, kot je inhibicija izraza reguliranega proteina znanega po tem, da je sposoben moduliranja aktivacije celic T. Preferirani so oligonukleotidi, ki vežejo proteine kot so Spl in Splsorodni proteini, ki regulirajo transkripcijo CD28 in CD28 sorodnih genov.
Drugi vidik pričujočega izuma je uporaba aptamerov pri zdravljenju bolezni, ki so posledica zmotne aktivacije celic T, kot je luskavica, zaradi AIDS-a poslabšanje bolezenskega stanja luskavice in druge kožne bolezni, sladkorna bolezen tipa I (insulinsko odvisna) diabetes melitus, bolezen žleze ščitnice ('thyroiditis'), sarkoidoza, multipla skleroza, avtoimunski uveitis, revmatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, vnetje črevesa (Chronov in gnojni katar debelega črevesa), septični šok, hiranje zaradi tumorja in aplastična anemija ter uporaba aptamerov za reguliranje normalne aktivacije celic T, kot na primer pri zavrnitvi alotransplantata. To je mogoče doseči z motnjo pri sintezi in aktivaciji celic T molekul vključno z CD28 in CD28podobnih molekul.
Naslednji vidik izuma je pridobitev aptamerov, ki so sposobni vezanja specifičnih regulacijskih proteinov, kot so Spl in Spl-podobni proteini in tako inhibiranja transkripcije genov, kot sta CD28 in CD28 podobni proteini, ki
a) so normalno regulirani s temi proteini in
b) ki lahko modulirajo odzive celic T.
Kratek opis slik
Sliki 1A in IB sta grafični predstavitvi in vitro stabilnosti s 32P označenega fosforotioata, ICN 16064 (sekv. #4), v izvenceličnem fluidu in Jurkat celicah. Sliki 1C in ID sta grafični predstavitvi in vitro stabilnosti s P označenega fosforotioata, ICN 16214 (sekv. #21), v izvenceličnen fluidu in Jurkat celicah.
Sliki 1E in 1F sta grafični predstavitvi časovno odvisne razgradnje (0-96 h) vsakega oligonukleotida ICN 16064 (sekv. #4) in ICN 16214 (sekv. #21), (2000 cpm) kot je določena s pomočjo elektroforeze na 20% poliamidnem denaturiranem gelu ter vizualizacijo z uporabo Phosphorlmager-a. Procent popolnoma intaktne dolžine 32PRT03S (o) in 32P-RTCO6S (·), relativno na T = 0, je bil določen v eluatu iz 10000 cpm ekstracelulamo (slika IE) in celično (slika 1F) pri prehodu skozi Nickspinovo kolono (Pharmacia). Sprotno je bila analizirana molekulama teža standardov (Std), 32P-dNTP (N) in prostega 32P-ortofosfata (P).
Slika 2 je grafična predstavitev kloramfenikol acetiltransferaznega (CAT) izraza po transfekciji Jurkat celic s plazmidnimi vektorji, ki vsebujejo 226 bp vložek iz CD28 promotorske regije (preostanki -197 do +28) (28b) ali mutant s substitucijo pri preostanku -51 do -22 s sekv.#3 iz tabele 1, (28h-l) protitočno od CAT reporterskega gena, ki so nadalje obdelane z ali brez fosforotioat oligonukleotidi, ICN 16064 in ICN 16481.
Slika 3 je grafična predstavitev analize s premikom po gelu, ki kaže, da oligonukleotidi, ki vsebujejo 12 mestni sekvenčni motiv bogat z G-jem (liniji 5 in 11) dajejo razločevalni trak A, ki se razlikuje pri elektroforetičnem potovanju od traku B, ki gaje mogoče opaziti z drugimi fosforotioatnimi oligonukleotidi po inkubaciji z HeLa nuklearnimi ekstrakti. Trak C je sam 32P-oligo.
Slika 4 je grafična predstavitev analize s superpremikom po gelu, ki kaže, daje vezanje Spl na 28b, protitočna regija -197 do +28 CD28 gena specifična.
Slika 4 je grafična predstavitev vezanja Spl na 32P-označeno dvojno vijačnico oligo 28b (ki je dobljena od starševske 28b - sekv.#l tabela 1) in kompeticijskega vezanja hladne dvojno vijačne oligo 28b in aptamemih oligov slika 1A in 16481.
Podroben opis nove rešitve
Aptamemi oligonukleotidi, ki se specifično vežejo na DNK veziščih regulacijskih proteinov, kot so Spl in Spl sorodni proteini bodo preprečili vezanje regulacijskih proteinov s specifičnim področjem dvojne vijačnice DNK v promotorskem območju gena, ki nas zanima. Kompetitivno vezanje z aptamerom bi zadrževalo prepisovanje gena in tako inhibiralo pretok genetskih informacij iz DNK na protein. Lastnosti oligonukleotidov, ki jih delajo specifične za njihovo delovanje, jih prav tako delajo prilagodljive. Ker so oligonukleotidi dolge verige štirih monomemih enot, jih je mogoče enostavno sintetizirati za katerokoli nalogo RNK sekvence.
Z oligonukleotidi povzročena inhibicija genskega izražanja je bila predstavljena v številnih modelih in in vitro sistemih in ima terapevtski potencial kot nova strategoja za zdravljenje številnih človeških bolezni (Uhlmann in Peyman (1990) Chem Rev 90 :544584, Zon in Steč (1991) Oligonucleotides and analogues - A Practical Approach'. 87108 , Miller et al (1981) Biochem 20 :1874-1880, Orson et al (1991) Nucleic Acid Res 19 : 99-125, Thierry in Dritschilo (1992) Nucleic Acid Res 20 :5691-5698). Zaradi odkritij v zadnjem času na področju sinteze na nukleaze odpornih oligonukleotidov, vključno z fosforotioati Zon in Steč (1991) Oligonucleotides and analogues - A Practical Approach'. 87-108 in fosforotioat-3’hidroksipropilaminom (Tam et al (1994) Nucleic Acid Res 22 : 977-986), ki kažejo povečano celično navzemanje, je sedaj mogoče smatrati uporabo oligonukleotidov kot novo obliko terapevtikov. Aptamemi oligonukleotidi usmeijeni na vezišča regulacijskih proteinov predstavljajo alternativno vrsto nukleinskih na kislinah temelječih spojin in predstavljajo idealno rešitev problemov, ki so bili značilni za predhodne načine reševanja problemov. Direktno so vključeni v moduliranje specifičnih genskih izrazov in tako izključijo ciljni proteinski izraz in ne kompetitivno inhibicijo topnih receptorjev za ciljni protein, interakcijo, ki zahteva popolno razumevanje mehanizma vezanja in afinitete interakcije med receptorjem in ligandom. Oligonukleotidi so majhne molekule zato ne povzročajo steričnih problemov kot velike molekule inhibitorjev.
Opis cilja
Cilji, ki so zajeti v tem izumu vključujejo molekule, ki so lahko regulirane pri transkripciji faktorjev, ki igrajo bistveno vlogo pri iniciranju ali vzdrževanju imunskega odziva. Te vključujejo kostimulatome molekule, kot je CD28 in citokine, kot so IL-2, GM-CSF in IFNy.
S stališča terapevtike so lahko živali za katere obstaja sum, da imajo bolezen, ki je lahko zdravljena z zmanjšanjem izraza kostimulatomih molekul, kot so CD28 in CD28podobne molekule, zdravljene z uporabo oligonukleotidov glede na pričujoč izum. Oligonukleotidi so lahko formirani v farmacevtski kompoziciji, ki lahko kot dodatek k oligonukleotidu vključuje nosilce, gostila, razredčevalce, pufre, preservative, površinsko aktivne snovi, liposome ali lipidne tvorbe in podobne. Farmacevtske kompozicije lahko prav tako kot dodatek k oligonukleotidu vključujejo eden ali več aktivnih dodatkov, kot so protimikrobni agensi, pritivnetni agensi, anestetiki in podobni.
Farmacevstke kompozicije so lahko uporabne na različne načine odvisno od potrebnega lokalnega ali sistemskega zdravljenja in odvisno od področja, ki gaje potrebno zdraviti. Uporaba je lahko lokalna (vključno z oftalmično, vaginalno, rektalno, intranasalno) oralna, z inhalacijo ali parentalna, npr. z intravenoznimi kapljicami, subkutaničnim, intraperitonalnim ali intramuskulamim vbrizgavanjem.
Oblike lokalne uporabe so lahko mazila, losioni, kreme, geli, kapljice, svečke, spreji, tekočine in pudri. Konvencionalni farmacevtski nosilci, vodne raztopine, pudri ali oljne baze, gostila in podobni so lahko potrebni ali vsaj željeni. Prevlečeni kondomi ali rokavice so lahko prav tako uporabni.
Kompozicije za oralno uporabo vključujejo pudre ali granule, suspenzije ali raztopine v vodnem ali nevodnem mediju, kapsule, vrečke ali tablete. Kot željeni dodatki se lahko uporabijo gostila, dišave, razredčevalci, emulgatorji, dispergatorji ali vezalci.
Oblike za parenteralno uporabo lahko vključujejo sterilne vodne raztopine, ki lahko vsebujejo pufre, liposomske razredčevalce in druge primernedodatke.
Doziranje je odvisno do resnosti in odzivnosti pogojev, ki so podvrženi zdravljenju, normalen pa je eden ali več odmerkov na dan, pri čemer zdravljenje traja od nekaj dni pa do nekaj mesecev ali dokler kura ne pokaže rezultatov ali dokler ni doseženo izboljšanje bolezenskega stanja. Ustrezno usposobljene osebe lahko zlahka določajo optimalne odmerke, metodologijo doziranja in periodiko.
Pri prednostni sistemski uporabi, morajo biti aptameri uporabljeni intravenozno v odmerkih 5mg/kg enkrat na dan. Pri prednostni lokalni uporabi, morajo biti aptameri uporabljeni v 1-5% raztopini enkrat na dan. V prednostni pulmonalni (pljučni) uporabi, morajo biti aptameri uporabljeni v obliki aerosoliranih odmerkov 5 mg enkrat na dan.
Pričujoč izum se nanaša na uporabo aptamernih oligonukleotidov pri inhibiranju oz. zaviranju delovanja RNK in DNK, ki ustrezata proteinom sposobnim moduliranja aktivacije celic T. V kontekstu tega izuma se termin ‘oligonukleotid’ nanaša na oligomer ali polimer ribonukleinske kisline ali deoksiribonukleinske kisline. Ta termin vključuje oligomere, ki so sestavljeni iz naravnih baz, sladkorjev in vezi med sladkorji kot tudi oligomere, ki vsebujejo nenaravne dele, ki pa funkcionirajo podobno. Takšni modificirani ali substituirani oligonukleotidi imajo pogosto prednost pred naravnimi oblikami zaradi lastnosti kot so, npr. povečano celularno navzemanje in povečana stabilnost v prisotnosti nukleaz.
Oligonukleotidi so, glede na pričujoč izum, sestavljeni iz 3 do 50 enot nukleinskih kislina baza. Bolje je, če so takšni oligonukleotidi sestavljeni iz okoli 8 in 30 nukleinskih kislina baza enot in še bolje, če so sestavljeni iz okoli 12 in 22 nukleinskih kislina baza enot. Kot bo ocenjeno, je enota nukleinska kislina baza kombinacija kislina-sladkor, ki je ustrezno vezana na sosednjo enoto nukleinska kislina baza preko fosfodiestra ali drugih vezi.
Oligonukleotidi, ki so uporabljeni v pričujočem izumu, so lahko primerno oz. ustrezno rutinsko narejeni po dobro znani tehniki sinteze v trdnem stanju. Opremo za takšno sintezo je mogoče nabaviti pri številnih prodajalcih, vključno z Applied Biosystems. Uporabljeno je lahko tudi katerokoli drugo sredstvo; kakorkoli dejanska sinteza oligonukleotidov je močno povezana s spretnostjo in talentiranostjo izvajalca. Prav tako je dobro znana uporaba podobnih tehnik za pripravo oligonukleotidov, kot sat fosforotioati in 3’aminfosfotioati.
Glede na pričujoč izum, bodo osebe z običajno strokovno izobrazbo na tem področju razumele, da informacijska RNK, identificirana z ORFs od DNK, s katere so prepisane, vsebujejo ne samo ORFs informacije o DNK ampak tudi ribonukleotide, ki oblikujejo regijo prej omenjenemu osebju poznano kot 5’-neprevedena, 3’-neprevedena regija in posredovalne sekvence ribonukleotidov. Tako so lahko, glede na pričujoč izum, oligonukleotidi popolno ali delno izraženi na te ribonukleotide kot tudi na informacijske ribonukleotide. Prednostno aptamemi oligonukleotid reagira z vezišči na DNK regulacijskega proteina, kot so Spl in Spl-sorodni proteini, in pri svojem delovanju uvajajo motnje v izražanje genskega kodiranja proteina, ki je vključen v aktivacijo celic T. Prednostno so proteini, ki morajo biti regulirani CD28 in vsi homologi CD28 molekule. Oligonukleotidi vključujejo sekvence, ki vsebujejo najmanj dve z G-jem bogati regiji, ki sta definirani kot regiji štirih nukleotidov, ki vsebujeta najmanj tri gvanozinske ostanke (G), kot so GGGG, GNGG, GGNG, kjer imajo kot N prednost
N=A, C, G, U ali T. Dve takšni regiji bogati z G-jem sta ločeni z največ 6 ostanki, glede na pričujoč izum pa so željeni oz. uporabni 4 ali manj. Prednost ima naslednji sekvenčni segment, ki je lahko uporaben v celoti ali deloma:
5’ 3’ SEKV. ID
TTG GAG GGG GTG GTG GGG SLIKA 1A
GGG GAG GAG GGG CTG GAA ICN 16481
GGG GTG GTG GGG ICN 16525
TTG GAG GGG GAG GAG GGG ICN 16475
TTG GAG GGG GAG GTG GGG ICN 16479
GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG ICN 16065
Medtem, ko je verjeti, da so prikazane sekvence točne, je pričujoč izum usmerjen v korektne sekvence in napake morajo biti tako najdene. V sklopu izuma uporabni oligonukleotidi obsegajo eno od teh sekvenc ali njen del. Tako je dana prednost uporabi kateremukoli od teh nukleotidov, ki so zgoraj vnaprej navedeni, ali kateremukoli podobnemu nukleozidu, ki ga lahko pripravi izkušena oseba na podlagi znanja o prednostnih nukleotidnih ciljih za modulacijo sinteze T-celičnih aktivacijskih molekul vključno z CD28 in CD28-sorodnimi molekulami. Pričakuje se, da ima inhibicija ali modulacija proizvodnje CD28 in/ali CD28 homologov pomembne terapevtske učinke oz. koristi pri zdravljenju bolezni. Da bi določili učinkovitost kompozicije, je potrebno izvesti eno ali več analiz.
Primeri
Oligonukleotidi
Olinukleotidi so bili sintetizirani na avtomatskem DNK sintetizatorju (Applied Biosystems model 394) z uporabo standardne fosforamiditne kemije, βcianoetilfosforamiditi, sintezni reagenti in CPG polistirenske' kolone so bile kupljene pri Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA). 3'-amino-modifajer C3 CPG kolone so bile kupljene pri Glen Research (Sterling, VA). Za fosforotiat oligonukleotide, so bile standardne oksidacijske bučke zamenjane s tetraetiltiuram disulfid/acetonitrilom, standardni ABI program pa je bil uporabljen za postopno dodajanje fosforotiatnega veziva. Po cepitvi iz steklene kolone s kontroliranimi luknjami, so bile zaščitne skupine odstranjene z 8 urno obdelavo oligonukleotidov s koncentriranim amonijevim hidroksidom pri 55 °C. Oligonukleotidi so bili nato očiščeni s HPLC z uporabo reverzno fazne semipreparacijske kolone C8 (ABI). Po cepitvi DMT zaščitne skupine, obdelavi z 80 % ocetno kislino in precipitacijo z etanolom, je bila čistost produkta določena s pomočjo HPLC z uporabo analizne kolone 08 (Beckman, Fullerton, CA). Vsi oligonukleotidi s čistostjo >90 % so bili liofilizirani do suhega. Oligonukleotidi so bili nato rekonstituirani v sterilni deionizirani vodi (ICN, Costa Mesa), naravnani na 400 μΜ ter OD260nm ovrednoteni, razdeljeni na več vzorcev in shranjeni pri -20°C pred eksperimentom. V vseh primerih so bile uporabljene vsaj tri serije oligonukleotidov, ki so navedeni v tabeli 1.
Študije stabilnosti oligonukleotidov in vitro
Časovne oligonukleotidne stabilnostne analize so bile izvedene kot je bilo predhodno že opisano (Tam et al (1994) Nucleic Acid Res 22 : 977-986). Profili oligonukleotidne razgradnje so bili ocenjeni s pomočjo elektroforeze in kvantitativno ovrednoteni z uporabo Nickspinovih kolon.
Očiščevanje celičnih linij in celic T
Periferalne krvne mononukleame celice (PBMC) so bile izolirane iz 'buffy coat'. Sledilo je Ficoll-Hypaque gostotno gradientno centrifugiranje 60 ml krvi iz zdravega donorja. Celice T so bile nato čiščene iz PBMC z uporabo Lymphokwik limfocitnega izolacijskega reagenta specifičnega za celice T (LK-25T, One Lambda, Canoga Park CA). Povprečni izkoristek 40-60 χ 106 celic T je bilo nato inkubiranih čez noč pri temperaturi 37 °C v 20-30 ml RPMI-AP5 (RPMI-1640 medij (ICN, Costa Mesa, CA), ki vsebuje 20 mM HEPES pufer, pH 7.4, 5% avtologne plazme, 1% L-glutamina, 1% penicilin/streptomicina in 0.05 % 2-merkaptoetanola) za odstranitev kakršnihkoli kontaminiranih adherentnih celic. V vseh eksperimentih so bile celice T izprane z RPMI-AP5 in nato nanesene na 96-luknjiČaste mikrotitrske ploščice, pri čemer je bila koncentracija celic 2-3 χ 106 celic/ml.
Celične črte limfomov celic T, Jerkat E6-1 (CD28+/CD4+) celice (152-TIB) so bile vzdrževane v RPMI-10 (RPMI-1640 medij vsebuje 20 mM HEPES pufra, pH 7.4, 10% seruma zarodka teleta (FCS) (Hyclone, Logan, UT), 1% L-glutamina in 1 % penicilin/streptomicina).
Aktivacija T celic z mitogeni in obdelava oligonukleotidov
Pred dodatkom človeških periferalnih celic T ali T celičnih limfomnih celičnih črt (0.20.3 χ 106), sta bili paralelni 96-luknjičasti mikrotitrski ploščici prevlečeni s prečiščenimi proti-CD3 monoklonskimi protitelesi (mAb) (6.25-2000 ng/luknjico (klon HIT 3a, Pharmingen, San Diego, CA) in dvakrat sprani s hladno s fosfatom pufrano solno raztopino, pH 7.4 (PBS). S proti-CD3 mAb obdelane celice T so bile nadalje aktivirane z dodatkom 2 ng forbol 12-miristat 13-acetata (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA) in inkubirane za 48 ur pri 37 °C. S proti-CD3/PMA aktivirane celice T so bile obdelane z 1-20 μΜ specifičnim CD28 in kontrolni oligonukleotidi so takoj sledili aktivaciji in ponovni obdelavi 24 ur kasneje. T celice iz ene ploščice so bile uporabljene za imunofluorescenčno analizo, 1A za citokinsko študijo, druga ploščica pa je bila uporabljena za proliferacijske analize celic T.
Imunofluorecenčne študije
Po aktivaciji je bilo 150 μΐ celičnega supematanta prenesenega iz prve mikroploščice na drugo ploščico na kateri je potekala analiza citokinske produkcije. Preostale celice so bile dvakrat sprane z izotonično solno raztopino pH 7.4 (Becton Dickinson, Mansfield, MA) in ponovno suspendirane v 50 μΐ izotonične solne raztopine ter ločene na dva vzorca. Del vzorca je bil pripravljen s PE-CD28/FITC-CD4 mAb in določena je bila nespecifična fluorescenca na drugem delu vzorca s PE/FITC zaznamovanimi monoklonskim protitelesom. Vsa fluorescenčno zaznamovana protitelesa so bila dobljena od Becton Dickinson (San Jose, CA). Inkubacije so bile izvedene v temi pri 4° C za 45 minut z uporabo nasičenih koncentracij mAb. Nezdružljive oznake so bile odstranjene s spiranjem v PBS pred analizo v FACScan pretočnem citometru (Becton Dickinson). Protigenska gostota je bila direktno določena v ločenih živih celicah in izražena kot srednji kanal fluorescence (MCF). Površinski izraz CD4+ celic z CD28 mAb je bil določen z odštevanjem MCF CD28+ CD4+od MCF CD28' CD4 celic. Vidnost kontrolnih neobdelanih in z oligonukleotidi obdelanih celic je bila določena v vsaki šarži oligonukleotidov pri večkratnih donorjih s premazovanjem s potrebnim barvilom, propidium jodidom (5pg/ml končne koncentracije). Procent živih celic, ki so izločile propidium jodid je bil določen s pretočnim citometrom in je bil >90% (območje 90 - 99%) po obdelavi vseh šarž oligonukleotidov pri dozi v območju 1-20 μΜ.
Citokinske analize
Koncentracije človeških citokinov so bile določene v celičnem supernatantu iz prve mikroploščice. Spremembe, ki jih povzročajo mitogeni v interlevkinu-2 (IL-2) so bile določene z uporabo komercialno dosegljivega kita ELISA (R & D systems Quantikine kit, Minneapolis, MN). Vsi ELISA rezultati so bili izraženi v pG/ml.
Analiza z elektrojorezo (EMSA)
Testni oligonukleotidi so bili označeni pri 5' koncu z [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (ICN, Costa Mesa, CA) z uporabo T4 polinukleotida kinaze po protokolu proizvajalca (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). 10pg HeLa celičnega nuklearnega ekstrakta (Promega) je bil inkubiran s približno 80,000cpm zaznamovanega oligonukleotida za 20 minut pri sobni temperaturi. Mešanica, v kateri poteka reakcija vezanja, je vsebovala 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.5mM DTT, 0.5mM EDTA, lmM MgCl2, 4% glicerola in 0.5 pg poli (dl.dC). Kompleksi DNK-protein so bili izločeni z elektroforezo skozi 4% poliakrilamidni gel, ki vsebuje 0.5x TBE pufer (50mM Tris, 45 mM borove kisline, 0.5mM EDTA) za približno 3 ure pri 100V. Gel je bil nato posušen in avtoradiografiran z uporabo Phosphorlmager (Biorad, Richmond, CA).
Priprava cDNK za DNK stopenjsko analizo in gelpremično ” analizo cDNK (približno 300 baznih parov) uporabljene pri vezanju protein-DNK pri DNK stopenjski analizi in “gel premični” analizi so bile izolirane iz plazmidov pCAT3e 28b, pCAT3e 28h ali pCAT3e 28h-l. 60pg vsakega plazmida je bilo raztopljenih z Bglll. Nekateri so bili najprej naneseni na agarni gel, da bi bila preizkušena njihova linearnost, ostali pa so bili ekstrahirani v fenol/'sevag', nato pa izločeni v etanolu in nato ponovno suspendirani v vodi in raztopljeni z Sacl. Nato so bili majhni deleži ponovno položeni na gel, da bi ugotovili rezultat (pojaviti se morata dva trakova; 4 kb trak in 300 b.p. trak). Ostal je ekstrahiran fenol/'sevag' ter izločen etanol. Za sledečo fosforilacijo, so bili deli DNK ponovno suspendirani v majhnem volumnu vode (62 μΐ), Ιμΐ 20 U/μΙ alkalne fosfataze (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), dodanih pa je bilo 7μ1 10Χ reakcijskega pufra. Po inkubaciji reakcijske mešanice pri 37 °C za 1 uro, je bilo dodanih 7μ1 pH8.0, 0.2 M EGTA in celotna epruvetka je bila greta pri 65 °C za 10 minut. Vseh 77 μΐ defosforilirane DNK je bilo položene na 1% agamega gela, da bi bil očiščen 300 b.p. trak z uporabo Qiaquick gelske ekstrakcije kita iz Qiagen (Santa Clarita, CA).
Končni volumen očiščenega 300 b.p. traku je bil 70 pl, njegova koncentracija pa je bila izračunana na naslednji način: 60 pg x (300 b.s./4300b.p.) = 4.2 pg, pri čemer je predpostavljeno 50% pokritje po vseh teh manipulacijah: 2.1 pg/70 pl = 30ng/pl. Za vsak s P zaznamovan konec reakcije je bilo uporabljenih 5 pl do 7 pl očiščene 300 b.p. DNK.
Priprava poliakrilnega gela za analizo s premikom po gelu
4% ne-denaturirane poliakrilamidne gelske raztopine v 0.5Χ TBE je bilo pripravljene glede na tehnična navodila Promega Gel Shift Assay Systems (4% akrilamida, 0.05% bisakrilamida, 2.5% glicerola, 0.5Χ TBE). 250 ml osnovne raztopine zgoraj omenjene raztopine gela je bilo pripravljene, filtrirane in vzdrževane pri 4°C. Pri vsaki uporabi je bilo dodanih 12.5 pl TEMED in 187.5 pl 10% amonijevega persulfata k 25 ml osnovne 4% raztopine gela. Mešanica je bila napolnjena v 16.5 cm X 16.5 cm X 0.75 mm steklene petrijevke. Geli so bili nato puščeni čez noč, da bi polimerizirali do optimalnega rezultata. Pred uporabo oz. nanosom vzorca je bil gel predhodno izpostavljen 0.5Χ TBE pufru za 30 min.
Formacija in očiščevanje dvojno zavitih oligonukleotidov
Tukaj uporabljena metoda je metoda, ki jo je predstavil Jacob Joseph s sodelavci v prispevku 'Antiparallel polypurine phosphorothioate oligonucleotides form stable triplexes with the rat a(I) collagen gene promoter and inhibit transcription in cultivated rat fibroblasts' objavljenem v Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 11, 21822188. Enaka količina komplementarnih posamičnih premazov je bila greta pri 80°C za 5 minut v 0.25M NaCl, sledilo je počasno ohlajanje na sobno temperaturo. Strjeni dvojno vijačno oligonukleotidi so bili nato očiščeni z elektroforezo na 6% ne-denaturiranem (29:1) poliakrilamidnem gelu, nato izrezani 'crushed and soaked' in izločeni v etanolu po metodi opisani v prispevku z naslovom 'Molecular cloning, a laboratory manual' Sambrook, Fritsch & Maniatis. Približno 20 ng d.s. oligo je bilo uporabljenih v vsaki zaznamovani reakciji.
Označevanje DNK z izotopom32P
150 do 200 ng 300 b.p. cDNK ali 20 ng d.s. oligo je bilo inkubiranih z 37x104Bq [γ-32Ρ] ATP (16.65xlOl3Bq/mmol, ICN, Irvine, CA) in 10 U kinaze in IX kinaznega pufra (oboje od Promega) v 10 μΐ volumnu pri 37°C za 1 uro in očiščenih na Centri Spin- 10 koloni (Princeton Separation, Adelphia, NJ). Približno 80,000 - 100,000 cpm kinazirane DNK je bilo uporabljene pri vsaki reakciji s premikom po gelu.
Analiza s premikom po gelu (gel premična analiza)
Proteini (nuklearni ekstrakt ali očiščen transkripcij ski faktor) so bili inkubirani z IX pufrom za premik po gelu (Promega, Madison, WI) pri sobni temperaturi za 5-10 minut predenje bila kinazirana DNK dodana in inkubirana za naslednjih 20-30 minut pri sobni temperaturi. Vzorci so bili nato naneseni na 4% ne-denatoriran gel. Po približno treh do štirih urah pri 100 V v 0.5Χ TBE, je bil gel posušen na 2 kosih Whatmanovega papirja in izpostavljen forfoijevemu imagerju čez noč.
Analiza protiteles s premikom po gelu
Spl protitelesa (klon 1C6, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) so bila predhodno inkubirana z očiščenim Spl (Promega) za 1 uro preden je bil dodan z 32P označen cDNA ali oligo.
Kompetitivna analiza s premikom po gelu (gel premična kompetitivna analiza)
Približno 70-100 molamega preostanka nezaznamovanih oligonukleotidov (v oblike enojne ali dvojne vijačnice) je bilo predinkubiranih s proteinom pri sobni temperaturi za približno 30 minut predenje bila dodana z izotopom 32P označena DNK.
StrukturapCAT3e 28b, pCAT3e, 28h, pCAT3e 28h-l
CD28 protitočna cDNK (-197 do +28) je bila proizvedena pri RT PCR z uporabo Jurkat celotne RNK kot šablone. Ta del cDNK je bil najprej kloniran v TA klonski vektor PCR 2.1 (Invitrogen, Crlsbad, CA). Enak cDNK je bil kasneje subkloniran v pCAT3e (Promega) z vstavljanjem v Xhol-Sacl. pCAT3e 28h in pCAT3e 28-1 sta mutanta pCAT3e 28b v katerih so sekvence od -51 do -22 izbrisane in substituirane z 15 drugimi nukleotidi.
Transfekcija (kratkotrajno izražanje)
Dan pred transfekcijo so bile Jurkat celice pripravljene v 2 ali 3 T150s pri razredčenju 1:4 ali 1:5 iz 80-90% zraščenih celic. Tik pred transfekcijo so bile vse celice vložene v eno epruvetko in preštete (koncentracija mora biti približno 40 X 104 na ml). 11 X 4 X 10 celic za 10 transfekcijskih reakcij je bilo prenešenih v 50 ml konične cevke. Celice so bile nato izprane s polovico originalnega volumna PBS, nato ponovno suspendirane v 44 ml predgretem svežem Jurkat mediju (90% RPMI 1640, 10 % FBS, 1% L-glutamat, l%penicilin/streptomicin), tako daje bila končna koncentracija 1 x 106/ml. 4 ml celic je bilo nato odpipetiranih v vsako od luknjic v 6 luknjasti ploščici. 2.5 μΐ 2 mg/ml plaznida (pCAT3e serije) je bilo odpipetiranih v 1.5 ml cevke, dodano je bilo 147.5 μΐ RPMI 1640 medija (brez seruma, brez antibiotikov). Nato je bilo v raztopino plazmid/medij dodanega 20 μΐ reagenta Superfact iz Qiagen, ob mešanju s premikanjem pipete gor in dol 5X. Sledilo je puščanje pri sobni temperaturi za 5-10 minut. Tranfekcijski kompleks je bil po kapljicah dodan celicam v vsako luknjo in ob nežnem vrtenju plošče, da bi bilo doseženo mešanje. Celice so bile nato inkubirane pri 37°C v inkubatorju s 5% CO2 in nato pobrane za CAT analizo po 24 urah. Oligosi so bili dodani po transfekciji, 50μ1 osnovnega 400μΜ oliga pa je bilo celicam dodanega po označenem času (1 uro po transfekciji). Celice so bile nato vrnjene v inkubator.
CAT analiza
Po 24 urah inkubacije, so bile celice pobrane s pipetiranjem celic iz vsake luknje v 15 ml konične cevke ob prepričanju, da so bile luknje dobro oprane, da ne bi kakšne celice ostale. Le te so bile nato vrtene (vijačene) ob hitrosti mešala 2,000 rpm za 3 minute pri sobni temperaturi. Medij je bil odpipetiran. Vsak celični del je bil izpran 32Χ z 2ml PBS (PBS je bil dodan, zvrtinčen, zvijačen, medij je bil odpipetiran). Kolikor je bilo le mogoče, je bil PBS po pranju odstranjen s pipeto. 400μ1 IX Reporter Lysis Buffer (Promega CAT Emzyme Assay System) je bil dodan k vsaki celični pipeti in prenešen v 1.5 ml cevko. Celični del je bil nato inkubiran v razkrojnem pufru pri sobni temperaturi za 30 minut in priložnostno zvrtinčen. Te cevi so bile nato grete pri 60°C za 10 minut na koncu 30 minutne inkubacije, nato zvijačene (stresane) pri sobni temperaturi s hitrostjo 12,000 rpm, 2 minuti, supernatant (lizat) je bil odpipetiran v svežo 1.5 ml cevko. Za vsako CAT analizno reakcijo je bilo uporabljenega 100 μΐ lizata, preostanek je bil zmrznjen pri -80°C. Vsaka CAT analiza je bila sestavljena kot sledi: 18.5μ. vode je bilo vezanih z 100μ1 lizata, 5 μΐ 5mg/ml n-butiril CoA (Promega) in 1.5μ1 37xlO2Bq/pl kloramfenikola- 14C (ICN) v 1.5 ml cevi (celotni volumen 125μ1) in inkubiranih pri 37°C za eno uro. Po eni uri, je bilo 300μ1 ksilena (ICN) dodanega k vsaki cevki, močno zvijačeno za 5 sekund, zvrtinčeno pri največji hitrosti za 3 minute na sobni temperaturi, 280μ1 zgoraj omenjene ksilenske faze je bilo odpipetiranih v svežo cevko. 100μ1 0.25 Tris, pH je 8.0 je bilo dodanih k 280μ1 ksilenske faze, zvrtinčeno in zvijačeno kot zgoraj. 200μ1 zgornje faze je bilo odpipetirane v scintilacijsko epruvetko, dodanega je bilo 5 ml scintilacijskega fluida, zmešanega z inverzijo, vzorci pa so bili prešteti v scintilacijskem števcu.
Stabilnost oligonukleotidov in vitro poveča biološko aktivnost fosforotioatnih oligonukleotidov
Modifikacije oligos-ov s fosforotiatnimi internukleotidnimi vezmi lahko prenesejo nukleazno odpornost in tako razširijo bioaktivnost in vitro od l-2h do 24 ur (Stein, (1993) Science 261: 1004-1012). Tukaj prikazujemo, daje imel G-bogat oligo (slika 1A (sekv. #4) večjo stabilnost in vitro kot ne-G-bogat fosforotiat), slika IB (sekc. #21). Na sliki 1A prikazani elektroferogrami jasno kažejo, za obe tako ekstracelularno 1 A(S) in celico 1B(L) občutno bolj intaktno označeno z izotopom 32P sliko 1A (sekc. #4) kot sliko IB (sekv #21), ki je ostala naslednjih 96 ur inkubirana z Jurkat celicami. Skladne z opazovanjem so kolone Nickspin podatkov (slika IB). Tukaj je bil procent intaktno oligoprekritih iz slike 1A (sekc #4) po 96 urah 54% (S) in 59% (L) in iz slike ID (sekv. #21) 10%(S) in 34% (L). Ti podatki nakazujejo, da je večja nuklearna odpornost značilna za prisotnost z G-bogatih regij na sliki 1A (sekv. #4) in, da je le ta verjetno povezana s sposobnostjo določenega oliga, da prekrije sekundarne strukture.
Inhibicija funkcionanega izraza CD28 in CD28 specifične IL-2 produkcije v aktiviranih človeških T celicah z aptamernimi oligonukleotidi je odvisna od specifičnega Gbogatega motiva
Relativna inhibicija izraza CD28 in CD28-specifične IL-produkcije z fosforotiatnimi oligonukleotidnimi sekvencami #4 do 21 (5μΜ) iz tabele 1 je prikazana v tabeli 2. Tukaj so bile obravnavane natančne sekvenčne zahteve za bioaktivnost teh aptamemih oligonukleotidov. Tabela 2 prikazuje, daje inhibitoma aktivnost sekvenčno odvisna, še posebej glede na prisotnost motiva, ki vsebuje dve G četverici s štirimi bazami (sevk. #5-8). Ti podatki namigujejo, da so interakcije oliga, kot ga prikazuje slika 1A (sekv. #4) in njegovega domnevnega cilja odvisne od natančnih konformatorskih zahtev kot so videne pri oligo-proteinskih interakcijah bolj kot nukleinska kislina: zahteva po hibridizaciji nukleinke kisline hibridizacija.
Oligonukleotidi, ki vsebujejo specifične 12mestne sekvenčne motive tvorijo specifični proteinski oligo kompleks
Slika 3 prikazuje elektroforezno analizo z mobilnim premikanjem z izotopom 32P označenih oligonukleotidov, ki so bili predhodno inkubirani z HeLa celičnim ekstraktom. Razvrstitev oligov v tabeli 3 vključuje dve [slika la (sekv. #4) in ICN 16481 (sekv. #5)], ki vsebujeta 12 motivov z dvema setoma G-tetrad ločenih z 4 nukleotidi. Ti motivi nosijo olige (liniji 5 in 11) kjer samo testni oligo daje takšen oligoproteinski ‘širit’ (trakA) ločen od drugih fosforotioatnih oligov. Ti podatki kažejo, da se specifične protein-oligo interakcije zgodijo z oligi, ki vsebujejo 12 motivov.
Inhibicija funkcionalnega CD28 izraza v aktiviranih človeških celicah T z aptamernimi nukleotidi povezana s prisotnostjo specifičnih oligo-proteinskih kompleksov Tabela 4 primerja inhibitorski učinek na obeh z mitogeni induciranega CD28 izraza in produkcije IL-2 z določenimi fosforotioatnimi oligonukleotidi pri 5 μΜ, z njihovo aptamemo sposobnostjo formiranja specifičnih oligoproteinskih kompleksov, ko so inkubirani z HeLa nuklearnim ekstraktom, obogatenim izvorom transkipcijskega faktorja. Podatki jasno nakazujejo zvezo med inhibitorsko aktivnostjo motiva, ki nosi olige na CD28 izrazu in izločanjem IL-2 ter formiranje specifičnih trakov premikov po gelu. Substitucija znotraj 2G tetrad vodi v izgubo funkcije in posledično v izginotje oligo-proteinskega kompleksa.
CD28protitočnapromotorska regija od -197 do +28 (28b) veže Spl
Z izotopom 32P označena CD28 promotorska regija od -197 do +28, drugače znana kot 28b, je bila inkubirana z Spl proteinom in serijo trikratnih razredčenj Spl protiteles z 0.5 pg na začetku. Analiza s potovanjem po gelu je bila izvedena in DNK-proteinprotitelesa kompleksi so bili ponovno ločeni z nadaljno elektroforezo. Podatki so zbrani na sliki 3. Podatki kažejo, da se Sp 1 veže na regijo 28b CD28 promotorja. Ta interakcija je specifična kot nadaljna serija razredčitev specifičnega Spl protitelesa na 0.00617 pg Spl/32P-28b/Spl protitelesni trak (trak B), ki izgine pri čemer ostane 28b/Spl trak (trak A). To kaže, daje 28b specifično vezan na Spl. Prost z izotopom 32P označen 28b je trak C.
Oligo -51 do -22 je dobljen iz CD28 protitočne promotorske regije od —197 do +28 (28b), ki vsebuje 12mestnih G-bogatih motivov, lahko prav tako veže Spl V naporih, da bi omejili ročnost Spl vezalne regije v 28b na G-bogat motiv v CD28 promotorski regiji -197 do +28, smo sintetizirali dvojno vijačnico (ds) 30 oligo označeno kot 28b oligo (sekv. #1, tabela 1), ki vsebuje 12 GGGGAGGAGGGG znotraj vsake sekvence. Postavili smo hipotezo, daje to bilo Spl vezišče v CD28 promotorski regiji. Nadalje z izotopom 32P označen 28b oligo je bil inkubiran z Spl ekstraktom in dejansko so bile nato vezane ena na drugo (slika 4, trakA, liniji 2 in 3). Kompeticija s hladno 28b oligo je povzročila izginjajoči trak tako, daje bilo vezanje specifično na Spl (linija 4). Presenetljivo, enojno zaviti fosforotioatni G-bogati oligi, slika 1A (linija 5) in 16481 (linija 6) (obe vsebujeta G-bogat motiv) ampak ne kontralni oligo ICN 16476 (linija 7), ki je tekmoval za vezanje na Spl. Ti podatki kažejo, da lahko fosforotioatni G-bogato oligi, slika 1A in ICN 16481 delujejo kot aptameri pri vezanju na DNK vezišča Spl. Posledice te interakcije je preprečitev Spl vezanja na Spl mesto pri -51 do
-22 v promotorski regiji in tako inhibicija s Spl povzročenega prepisa CD28 gena ter zmanjšanje izraza zrelega 28 proteina.
Tako so bili predstavljeni aptameri ter metode moduliranja imunskega odziva z uporabo takšni aptamerov. Medtem ko so bile tako predstavljene specifične vsebine, je področje tega izuma neomejeno, razen znotraj interpretacije patentnih zahtevkov.
IZPIS SEKVENC (1) SPLOŠNE INFORMACIJE:
(i) PRIJAVITELJ: Robert Tam (ii) NASLOV IZUMA: G-BOGATI OLIGO APTAMERI IN METODE MODULIRANJA IMUNSKEGA ODZIVA (iii) ŠTEVILO SEKVENC:_ (iv) NASLOV ZA DOPISOVANJE:
(A) NASLOVLJENEC: Crockett & Fish (B) ULICA: 1440 N. Harbor Blvd., Suite 706 (C) MESTO: Fullerton (D) ZVEZNA DRŽAVA: Kalifornija (E) DRŽAVA: Združene države Amerike (F) POŠTNA ŠTEVILKA: 92835 (v) ZAPIS V RAČUNALNIŠKI OBLIKI (A) VRSTA MEDIJA: Gibki disk (disketa) .
(B) RAČUNALNIK: IBM PC kompatibilen (C) OPERACIJSKI SISTEM: PC-DOC/MS-DOS (D) PROGRAMSKA OPREMA: WordPerfect 6.1 (vi) PODATKI O TEKOČI PRIJAVI:
(A) ŠTEVILKA PRIJAVE: še ni dodeljena (B) DATUM PRIJAVE: 21. november 1995 (C) KLASIFIKACIJA: še ni dodeljena (viii) INFORMACIJE O PATENTNEM ZASTOPNIKU:
(A) IME: Fish, Robert D.
(B) REGISTRACIJSKA ŠTEVILKA: 33,880 (C) REFERENČNA/OOCKET’ ŠTEVILKA: 213/015 (ix) TELEKOMUNIKACIJSKE INFORMACIJE:
(A) TELEFON: 714-525-3433 (B) TELEFAKS: 714-525-3303 (C) TELEKS:
(2) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :1:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 30 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :1: GGGTTCCTCG GGGAGGAGGG GCTGGAACCC (3) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :2:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 15 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :2: GGAGCACAGG GTGCT (4) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :3:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 15 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :3: TCATCACAGG GTGCT (5) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :4:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :4: TTGGAGGGGG TGGTGGGG (6) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :5:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :5: GGGGAGGAGG GGCTGGAA (7) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :6:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 21 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :6: GGGTTGGAGG GGGTGGTGGG G (8) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :7:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :7: TTGGAGGGGG AGGAGGGG (9) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :8:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :8: TTGGAGGGGG AGGTGGGG (10) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :9:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :9: TTGGAGGCGG TGGTGGCG (11) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :10:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :10: TTGGAGCCGG TGGTGGCC (12) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT.: 11 :
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT.: 11: TTGGAGGGGC TCCTCGGG (13) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :12:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 16 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :12:
TTGGAGCCGG TGGTGG (14) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :13:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 12 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :13: GGGGTGGTGG GG (15) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :14:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 10 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :14: GGGGTTGGGG (16) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :15:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 5 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :15
TGGGG (17) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :16:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 4 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :16:
GGGG (18) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :17:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 20 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :17: CACTGCGGGG AGGGCTGGGG (19) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :18:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 20 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :18: ATGGGGTGCA CAAACTGGGG (20) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :19:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 15 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :19: AACGTTGAGG GGCAT (21) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :20:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :20: TTCCAGCCCC TCCTCCCC (22) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :21:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :21 AACCTCCCCC ACCACCCC (23) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :22:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 22 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :22: ATTCGATCGG GGCGGGGCGA GC (24) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :23:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 21 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :23: CGCTTGATGA GTCAGCCGGA A (25) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :24:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 27 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :24: GATCGAACTG ACCGCCCGCG GCCCCT (26) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :25:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 22 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :25: AGTTGAGGGG ACTTTCCCAG GC (27) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :26:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 22 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :26: TGTCGAATGC AAATCACTAG AA (28) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :27:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 27 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :27: AGAGATTGCC TGACGTCAGA GAGCTAG (29) INFORMACIJE O SEKV. Z ID. ŠT. :28:
(i) SEKVENČNE KARAKTERISTIKE:
(A) DOLŽINA: 25 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VIJAČNICA: dvojna (D) TOPOLOGIJA: neznana (ii) VRSTA MOLEKULE: DNK (genomna) (iii) OPIS SEKVENCE: SEKV. Z ID. ŠT. :28:
GCAGAGCATA TAAGGTGAGG TAGGA
Oligo ID
28b
28h
28h-l
ICN 16064 ICN 16481 ICN 16065 ICN 16475 ICN16479 ICN 16480 ICN 16538 ICN 16539 ICN 16523 ICN 16525 ICN 16526 ICN 16483 ICN 16482 ICN 16527 ICN 16528 ICN 16487 ICN 16476 ICN 16214
SPI
AP1 (c-jun)
AP2
NF-K.B
OCT1
CREB
TF1D
Sekvenca
5' GGG TTC CTC GGG GAG GAG GGG CTG GAA CCC 3’ CCC AAG GAG CCC CTC CTC CCC GAC CTT GGG
5' GGA GCA CAG GGT GCT
3' CCT CGT GTC CCA CGA
5' TCA TCA CAG GGT GCT
3' AGT AGT GTC CCA CGA
5' TTG GAG GGG GTG GTG GGG
5' GGG GAG GAG GGG CTG GAA
5' GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG
5' TTG GAG GGG GAG GAG GGG
5' TTG GAG GGG GAG GTG GGG
5’ TTG GAG GCG GTG GTG GCG
5' TTG GAG CCG GTG GTG GCC
5' TTG GAG GGG CTC CTC GGG
5' TTG GAG CCG GTG GTG G
5’ GGG GTG GTG GGG
5' G GGG TTG GGG
5' TG GGG
5' G GGG
5' CAC TGC GGG GAG GGC TGG GG
5' ATG GGG TGC ACA AAC TGG GG
5' AAC GTT GAG GGGCAT
5' TTC CAG CCC CTC CTC CCC
5' AAC CTC CCC CAC CAC CCC
5' ATT CGA TCG GGG CGG GGC GAG C
3' TAA GCT AGC CCC GCC CCG CTC G
5' CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA
3' GCG AAC TAC TCA GTC GGC CTT
5' GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGGCCC CT 3’ CTA GCT TGA CTG GCG GGC GCC GGG GA
5’ AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C
3' TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G
5' TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A
3' ACA GCT TAC GTT TAG TGA TCT T
5' AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAG AGC TAG 3' TCT CTA ACG GAC TGC AGT CTC TCG ATC
5' GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A 3' CGT CTC GTA TAT TCC ACT CCA TCC T
Tabela 2: Identifikacija oligonukleotidnih sekvenc odgovornih za inhibicijo CD28 izraza in od CD28 odvisne proizvodnje IL-2 *
Relativna inhibicija izraza IL-2
Izraz Oligo ID sekvenca CD28
ICN 16064 TTG GAG GGG GTG GTG GGG 100 100
ICN 16481 GGG GAG GAG GGG CTG GAA 100 100
ICN 16065 GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG 100 100
ICN 16475 TTG GAG GGG GAG GAG GGG 100 100
ICN 16479 TTG GAG GGG GAG GTG GGG 100 100
ICN 16480 TTG GAG GCG GTG GTG GCG 31 38
ICN 16538 TTG GAG CCG GTG GTG GCC 40 57
ICN 16539 TTG GAG GGG CTC CTC GGG 44 25
ICN 16523 TTG GAG CCG GTG GTG G 38 57
ICN 16525 GGG GTG GTG GGG 100 120
ICN 61526 G GGG TTG GGG 30 39
ICN 16483 TGGGG 2 2
ICN 16482 G GGG 2 2
ICN 16527 CAC TGC GGG GAG GGC TGG GG 58 76
ICN 16528 ATG GGG TGC ACA AAC TGG GG 51 63
ICN 16487 AAC GTT GAG GGG CAT 26 52
ICN 16476 TTC CAG CCC CTC CTC CCC 29 22
ICN 16214 AAC CTC CCC CAC CAC CCC 4 2
mestna sekvenca vsebuje dvakrat po štiri G, ki sta medseboj ločeni s štirimi bazami, ki dajejo oligo aktivnost. Minimalna sekvenca potrebna za aktivnost ICN 16064 in vitro je bila določena s sposobnostjo sekvenčnih sprememb za inhibicijo izraza CD28, ki jih povzroči ICN 16064, v proti CD3/PMA-aktiviranih človeških celicah T in njihovim učinkom na aktivirano produkcijo IL-2 v Jurkat T celicah.
‘Rezultati so izraženi relativno glede na aktivnost 5μΜ ICN 16064 (100%) katerega območje inhibicije v primeru sedmih eksperimentov je bilo 52-79% za CD28 izraz in 76-89% za produkcijo IL-2.
Tabela 3: Nuklearni ekstrakt na protein vezanih profilov fosforotioatnih oligov (glej sliko 2)
Oligo Sekvenca Št. linije
ICN 16064 TTG GAG GGG GTG GTG GGG 11,12
ICN 16481 GGG GAG GAG GGG CTG GAA 5,6
ICN 16480 TTG GAG GCG GTG GTG GCG 7,8
ICN 16538 TTG GAG CCG GTG GTG GCC 1,2
ICN 16485 GTT GGA GAC CGG GGT TGG 3,4
ICN 16476 TTC CAG CCC CTC CTC CCC 9,10
Tabela 4: Inhibicija funkcionalnega izraza CD28 v zvezi s prisotnostjo specifičnih oligo-protein kompleksov
Oligo Sekvenca Relativna inhibicija izraza (%) CD28 IL-2 Oligo/protein kompleks
ICN 16064 TTG GAG GGG GTG GTG GGG 100 100 DA
ICN 16481 GGG GAG GAG GGG GAA CTG 100 100 DA
ICN 16480 TTG GAG GCG GTG GTG GCG 31 38 NE
ICN 16538 TTG GAG CCG GTG GTG GCC 40 57 NE
ICN 16485 GTT GGA GAC CGG GGT TGG 11 15 NE
ICN 16476 TTC CAG CCC CTC CTC CCC 29 22 NE
ICN 16214 AAC CTC CCC CAC CAC CCC 4 2 NE
Za ICN, PHARMACEUTICALS, INC. (ZDA)

Claims (25)

1. Aptamer s sekvenco, ki vsebuje najmanj dve G-bogati regiji, ki sta izbrani iz skupine GGnG, GGGG, GnGG, nGGG in GGGn, kjer je G gvanosin, n pa katerikoli nukleotid.
2. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da sta najmanj dve od najmanj dveh regij ločeni z manj kot dvema do sedmimi vključenimi nukleotidi.
i
3. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da sta najmanj dve od najmanj dveh regij ločeni s tremi do šestimi vključenimi nukleotidi.
4. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da sta najmanj dve od najmanj dveh regij ločeni s štirimi vključenimi nukleotidi.
5. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da konkurira za vezišče na nukleinski kislini imunskega regulacijskega proteina.
6. Aptamer po patentnem zahtevku 2, značilen po tem, da je imunski regulacijski protein izbran iz skupin SPI, NFKB, EGR1 in AP2.
7. Aptamer po patentnem zahtevku 1, ki konkurira za vezišče na nukleinski kislini imunskega regulacijskega proteina, značilen po tem, da najmanj ena od najmanj dveh G-bogatih regij vsebuje GGnG in da sta najmanj dve od najmanj dveh regij ločeni z dvema do sedmimi nukleotidi.
8. Aptamer po patentnem zahtevku 1, ki konkurira za vezišče na nukleinski kislini imunskega regulacijskega proteina, značilen po tem, da najmanj ena od najmanj dveh G-bogatih regij vsebuje GGGG in da sta najmanj dve od najmanj dveh regij ločeni z dvema do sedmimi nukleotidi.
9. Aptamer po patentnem zahtevku 1, ki konkurira za vezišče na nukleinski kislini imunskega regulacijskega proteina, značilen po tem, da najmanj ena od najmanj dveh G-bogatih regij vsebuje GnGG in da sta najmanj dve od najmanj dveh regij ločeni z dvema do sedmimi nukleotidi.
10. Aptamer po patentnem zahtevku 1, ki konkurira za vezišče na nukleinski kislini imunskega regulacijskega proteina, značilen po tem, da najmanj ena od najmanj dveh G-bogatih regij vsebuje nGGG ali GGGn in da sta najmanj dve od najmanj dveh regij ločeni z dvema do sedmimi nukleotidi.
11. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje naslednje sekvence 5' TTG GAG GGG GTG GTG GGG 3’ (sekv. id. št. 4).
12. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje naslednje sekvence 5' GGG GAG GAG GGG CTG GAA 3' (sekv. id. št. 5).
13. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje naslednje sekvence 5' GGG GTG GTG GGG 3' (sekv. id. št. 13).
14. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje naslednje sekvence 5' TTG GAG GGG GAG GAG GGG 3' (sekv. id. št. 7).
15. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje naslednje sekvence 5' TTG GAG GGG GAG GTG GGG 3' (sekv. id. št. 8).
16. Aptamer po patentnem zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje naslednje sekvence 5' GGG TTG GAG GGG GTG GTG GGG 3' (sekv. id. št. 6).
17. Aptamer po kateremkoli patentnem zahtevku 1-16 za moduliranje odziva imunskega sistema pacienta.
18. Aptamer po kateremkoli patentnem zahtevku 1-16 za zdravljenja pacienta z neprimernim odzivom imunskega sistema.
19. Aptamer po zahtevku 18, pri čemer gre za stanje odziva gostitelja na transplantacijo.
20. Aptamer po zahtevku 18, pri čemer gre za stanje avtoimunske bolezni.
21. Aptamer po zahtevku 18, pri čemer gre za stanje revmatoidnega artritisa.
22. Aptamer po zahtevku 18, pri čemer gre za stanje multiple skleroze.
23. Aptamer po zahtevku 18, pri čemer gre za stanje lupus eritematozus.
24. Aptamer po zahtevku 18, pri čemer gre za stanje insulinsko odvisnega diabetes melitusa.
25. Aptamer po zahtevku 18, pri čemer gre za stanje luskavice.
SI9720081A 1996-12-27 1997-12-19 Oligoaptameri bogati z G-jem in metode modulacije imunskega odziva SI20117A (sl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3450996P 1996-12-27 1996-12-27
PCT/US1997/023927 WO1998029430A1 (en) 1996-12-27 1997-12-19 G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI20117A true SI20117A (sl) 2000-06-30

Family

ID=21876859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9720081A SI20117A (sl) 1996-12-27 1997-12-19 Oligoaptameri bogati z G-jem in metode modulacije imunskega odziva

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6994959B1 (sl)
EP (1) EP0968226A4 (sl)
JP (1) JP2002512599A (sl)
KR (1) KR20000069658A (sl)
AU (1) AU5720098A (sl)
BR (1) BR9714438A (sl)
CA (1) CA2278031A1 (sl)
CZ (1) CZ227199A3 (sl)
HU (1) HU0000769A (sl)
IL (1) IL130192A0 (sl)
NO (1) NO993170L (sl)
PL (1) PL334197A1 (sl)
SI (1) SI20117A (sl)
SK (1) SK84599A3 (sl)
WO (1) WO1998029430A1 (sl)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
AU777225B2 (en) * 1998-09-03 2004-10-07 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
JP2005500806A (ja) 2000-09-15 2005-01-13 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧに基づく免疫アゴニスト／免疫アンタゴニストの高スループットスクリーニングのためのプロセス
WO2002062949A2 (en) 2000-10-20 2002-08-15 Canji, Inc Aptamer-mediated regulation of gene expression
FR2822156A1 (fr) * 2001-03-16 2002-09-20 Centre Nat Rech Scient Oligonucleotides pour la regulation du gene codant pour le tnf alpha et/ou de genes sous son controle et leurs applications
DK1446162T3 (da) 2001-08-17 2008-12-08 Coley Pharm Gmbh Kombinationsmotiv-immunstimulatoriske oligonukleotider med forbedret aktivitet
EP1625850B1 (en) * 2003-05-15 2012-02-29 Japan Science and Technology Agency Immunostimulating agents
US20050187176A1 (en) * 2003-10-10 2005-08-25 Bates Paula J. Method for inhibiting NF-kappa B signaling and use to treat or prevent human diseases
US20050182252A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Reddy K. R. Novel 2'-C-methyl nucleoside derivatives
US7482158B2 (en) 2004-07-01 2009-01-27 Mathison Brian H Composite polynucleic acid therapeutics
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
RU2015104762A (ru) 2012-07-13 2018-08-31 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Хиральный контроль
AU2015217221A1 (en) 2014-02-13 2016-08-11 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Prodrug compounds and their uses
EP3164136A4 (en) 2014-07-02 2018-04-04 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Prodrug compounds and uses therof
US10046064B2 (en) 2014-09-07 2018-08-14 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating exon skipping anti-viral transfer vector immune responses
BR112020007157A2 (pt) 2017-10-13 2020-09-24 Selecta Biosciences, Inc. métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral
KR20190065139A (ko) 2017-12-01 2019-06-11 압타바이오 주식회사 혈액암 치료제
AU2019207625A1 (en) 2018-01-09 2020-07-30 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Acetal compounds and therapeutic uses thereof
EP3939987A4 (en) * 2019-03-13 2023-02-08 Cartiprime Co., Ltd. OLIGONUCLEOTIDE WITH ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY
JP2022534741A (ja) 2019-05-28 2022-08-03 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 減弱化された抗ウイルス導入ベクター免疫応答のための方法および組成物
US20230141563A1 (en) 2021-10-12 2023-05-11 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
US20230357437A1 (en) 2022-03-09 2023-11-09 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992014842A1 (en) * 1991-02-21 1992-09-03 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for thrombin and methods of use
US5567604A (en) * 1993-04-23 1996-10-22 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
DE19502912A1 (de) * 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5932556A (en) * 1995-09-17 1999-08-03 Tam; Robert C Methods and compositions for regulation of CD28 expression
EP0810882A4 (en) * 1995-02-09 1999-05-19 Icn Pharmaceuticals METHOD AND COMPOSITION FOR REGULATING THE CD28 EXPRESSION
EP0871643A4 (en) * 1995-07-19 2000-12-06 Aronex Pharmaceuticals Inc ANTIVIRAL GUANOSINE-RICH OLIGONUCLEOTIDES

Also Published As

Publication number Publication date
US6994959B1 (en) 2006-02-07
JP2002512599A (ja) 2002-04-23
PL334197A1 (en) 2000-02-14
NO993170L (no) 1999-08-25
EP0968226A4 (en) 2001-02-14
HU0000769A (en) 2000-07-28
IL130192A0 (en) 2000-06-01
SK84599A3 (en) 2000-07-11
CA2278031A1 (en) 1998-07-09
EP0968226A1 (en) 2000-01-05
KR20000069658A (ko) 2000-11-25
CZ227199A3 (cs) 1999-12-15
NO993170D0 (no) 1999-06-25
AU5720098A (en) 1998-07-31
WO1998029430A1 (en) 1998-07-09
BR9714438A (pt) 2000-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI20117A (sl) Oligoaptameri bogati z G-jem in metode modulacije imunskega odziva
US6005095A (en) Antisense transcript associated to tumor cells having a T(14;18) translocation and oligodeoxynucleotides useful in the diagnosis and treatment of said tumor cells
US5892023A (en) Anti sense oligonucleotides for blocking IgE receptor synthesis
Rappaport et al. Transport of phosphorothioate oligonucleotides in kidney: implications for molecular therapy
US5932556A (en) Methods and compositions for regulation of CD28 expression
JP2005518452A (ja) 肝搬送のため、修飾オリゴヌクレオチドを用いる方法
JPH09507836A (ja) 非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマー
JP2004024264A (ja) トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ‐β）の免疫抑制効果の治療用アンチセンス−オリゴヌクレオチド類
US11549112B1 (en) RNAi agents for inhibiting expression of xanthine dehydrogenase (XDH), pharmaceutical compositions thereof, and methods of use
KR20220158011A (ko) PNPLA3의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 이의 약제학적 조성물, 및 사용 방법
CA2649114A1 (en) Compositions and methods for modulating gene expression
JP2003505517A (ja) 接合体ならびにそれらの製造方法および生体膜を横切り分子を輸送するためのそれらの使用
KR100199247B1 (ko) Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
JPH0851985A (ja) イソプレニルタンパク質トランスフェラーゼの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、それを含有する治療剤組成物及び該組成物の使用方法
EP0810882A1 (en) Methods and compositions for regulation of cd28 expression
US6399376B1 (en) Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
WO1996024380A9 (en) Methods and compositions for regulation of cd28 expression
CA2223109A1 (en) Use of antisense oligonucleotides to il-6 receptor mrna to inhibit cellular proliferation
AU703139B2 (en) Methods and compositions for regulation of CD28 expression
MXPA99005880A (en) G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response
Zheng et al. Inhibition of gene expression by anti-sense oligodeoxynucleotides.
Tam et al. Inhibition of CD28 expression by oligonucleotide decoys to the regulatory element in exon 1 of the CD28 gene
THIERRY et al. Progress in antisense research and development
Wu Cellular uptake of a c-myc antisense oligonucleotide into Rauscher Red 5-1.5 cells
MXPA97005963A (en) Methods and compositions for the regulation of the expression of c