KR100833542B1

KR100833542B1 - Ｐａｃｓｉｎ-3의 유전자 억제를 위한 안티센스올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 ｎｋｔ 림프구 활성억제용 조성물

Info

Publication number: KR100833542B1
Application number: KR1020060121746A
Authority: KR
Inventors: 전태훈; 이재연
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-04
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2008-05-29

Abstract

본 발명은 PACSIN-3의 유전자 억제 (gene silencing)를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 NKT 림프구 활성 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, CD1d가 세포 안에서 항원을 인지하여 세포표면으로 도달할 때 PACSIN-3와 상호결합을 하며, 이러한 PACSIN-3의 발현양을 조절하면 CD1d의 세포표면 발현양을 조절할 수 있음을 밝혔다. 따라서, CD1d에 의한 항원의 NKT 림프구에 대한 제공을 조절함으로써, PACSIN-3에 의한 CD1d의 세포표면 발현 조절 및 이를 이용한 NKT 림프구의 활성 조절을 기대할 수 있다.

CD1d, MKT 림프구, PACSIN-3, gene silencing, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 렌티 바이러스벡터, 자가면역질환, coiled-coil domain, siRNA, RNAi

Description

ＰＡＣＳＩＮ-3의 유전자 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 ＮＫＴ 림프구 활성 억제용 조성물 {Anti-sense oligonucleotide for gene silencing of PACSIN-3 and composition for suppressing NKT lymphocyte activity comprising it}

도 1은 인간 PACSIN-3와 인간 CD1d 유전자의 제한효소 부위를 나타낸다.

도 2는 CD1d 유전자와 PACSIN-3 유전자를 클로닝한 벡터를 나타낸다.

도 3은 이스트 투 하이브리드 시스템 (yeast two hybrid system)을 이용하여 인간 PACSIN-3와 인간 CD1d의 결합을 확인한 것이다.

도 4는 인간 PASIN-3와 인간 CD1d 간의 상호 작용하는 도메인을 확인한 것이다.

도 5는 형광현미경으로 세포 발현 확인한 것이다.

도 6은 PACSIN-3의 coiled-coil domain의 특정염기서열 (siRNA의 유전자)를 나타낸다.

도 7는 RNAi에 의한 유전자 발현 억제를 확인한 것이다.

도 8은 RT-PCR에 의한 유전자 발현 억제를 확인한 것이다.

도 9는 유세포 분석 방법에 의한 유전자 발현 억제를 확인한 것이다.

본 발명은 PACSIN-3의 유전자 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 PACSIN-3의 유전자 억제 (gene silencing)를 위한 서열번호 1의 coiled-coil domain에 해당하는 435내지 455번째 염기서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 NKT 림프구 활성 억제용 조성물에 관한 것이다.

인간 CD1은 주요조직 적합성 항원 (MHC: major histocompatibility complex) class Ⅰ과 비슷한 분자로서, 43-49kDa의 heavy chain과 12kDa의 β2-microglobulin (β2-m) light chain으로 구성되며 항원인식물질로 알려져 있다 (Martin et al.,1986). CD1 유전자는 인간 염색체 1q22-23에 위치하고, 5개 유전자 (CD1A, CD1B, CD1C, CD1D, CD1E)가 존재한다 (Moseley et al., 1989). CD1 단백질은 두 그룹으로 분리되는데, 그룹 1은 CD1a, CD1b, CD1c로 구성되고 전문적인 항원 제시 세포 (professional antigen presenting cells)에서 발현 된다. 또한 그룹 2는 CD1d, CD1e로 구성되고, 주로 수지상 세포 (dendritic cells), 위장의 상피세포 (gastrointestinal epithelial cells)에서 발현한다 (Canchis et al.,1993). CD1d는 매우 hydrophobic한 항원인식부위를 가지고 있어서 기존의 펩타이드 항원을 인식하는 것이 아니라 당지질 (glycolipid)을 인식한다. 또한 이런 당지질 항원을 기 존의 T 림프구에 전달해주는 것이 아니라 자연 살해 T 림프구 (NKT cells)에 제시하는 분자로 알려졌다 (Spada et al.,1998).

자연 살해 T 림프구 (NKT cells)는 NK receptor와 T cell receptor를 공동으로 발현하는 특별한 T 림프구이다 (Bendelac et al., 1995). 자연 살해 T 림프구는 인간과 생쥐에서 발견되었으며 그 기능이 동일하다고 알려졌다 (Eberl et al., 1999). 자연 살해 T 림프구는 주로 흉선과 간에 존재하며, 주요 subset은 CD1d에 의해 제공되는 당지질 (alpha-galactosylceramide)의 자극 시에 활성화되며, 활성화된 NKT 림프구는 IL-4와 IFN-γ와 같은 cytokine을 매우 다량 분비하여 여러 질병에서 빠른 반응을 일으킨다 (Carnaud et al., 1999; Kitamura et al., 2000).

NKT 림프구는 박테리아나 기생충의 감염 (Chackerian et al., 2002; Gonzalez-Aseguinolaza et al., 2000), 암의 발생 (Kawano et al., 1998), 자가면역 질환의 숙주 보호 (Hong et al., 2001)의 경우에서 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, CD1d에 의한 당지질의 NKT 림프구에 대한 제공은 NKT 림프구의 활성을 조절하는데 매우 중요하며, 의학적으로 매우 중요한 의미가 있다.

CD1d는 항원을 NKT 림프구에 항원을 전달하기 때문에 의학적으로 매우 중요한 의미를 가진다. 하지만 CD1d가 당지질을 세포 안에서 어떻게 인식하고 그 것을 세포표면에서 NKT 림프구에 어떻게 전달하는 가는 지금까지 잘 알려진바 없으며 특히 어떤 물질이 이러한 과정에 중요한 역할을 하는지에 대해서는 더 더욱이 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, PACSIN-3의 유전자 억제 (gene silencing)를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 NKT 림프구의 활성을 억제함으로써, 자가면역 질환의 치료 및 예방에 응용할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 NKT 림프구의 활성을 억제할 수 있는 PACSIN-3의 유전자 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 NKT 림프구 활성 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 PACSIN-3의 유전자 억제 (gene silencing)를 위한 서열번호 1의 코일드-코일 도메인 (coiled-coil domain)에 해당하는 435 내지 455번째 서열의 mRNA에 상보적인 염기서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드을 제공한다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 상기 염기서열은 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열인 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 5의 염기서열은 당업계에서 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 제조방법에 따라 표적 염기서열이 루프영역 (5 ~ 15 bp)에 의해 회문 (palindrom)적으로 연결되어 헤어핀 형태의 dsRNA를 형성하도록 하였다. 상기 dsRNA는 세포안으로 들어가게 되면 dicer라는 효소가 RNA를 인지하게 되어 PACSIN-3의 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA를 생성한다.

본 발명에 있어서, 상기 염기서열은 PACSIN-3의 coiled-coil domain과의 상보적인 결합에서 높은 효율을 위하여 GC contents 50% 이상, 말단에 poly A 또는 poly T가 없을 것 등의 조건하에서 실험을 통하여 당업계에서 통상적인 방법인 뉴클레오티드 합성법을 사용하여 얻은 여러 개의 염기서열 조합 중에서 선택되었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유전자를 포함하는 도 6의 개열지도를 갖는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스벡터는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유전자를 삽입하여 숙주세포에 트랜스펙션시켜 유전자를 증폭시킬 수 있는 어떤 바이러스벡터, 예컨대 shlenti 1.1, shlenti 2.4R 및 shlenti 2.4Z (vectorcorea)도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 shlenti2.4G lentiviral vector (vectorcorea)에 삽입하여 도 6의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 NKT 림프구 활성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 일반적으로 CD1d는 당지질을 항원으로 인지하여 NKT 림프구를 활성화 한다고 알려져 있다. 본 발명의 상기 특정염기서열, 즉 서열번호 5의 염기서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 CD1d의 α1, α2 domain과 상호결합 하는 PACSIN-3의 coiled-coil domain의 한 부위로써, 본 발명의 실시예에서는 이러 한 domain들에서 CD1d와 PACSIN-3가 서로 상호결합을 하는 것을 증명하였으며, PACSIN-3의 coiled-coil domain의 특정염기서열을 포함하는 shRNA 바이러스 (lentiviral virus)를 CD1d가 발현된 세포 (CD1d.C1R 세포)에 감염시킴으로써 CD1d의 발현양이 감소하고, 이로 인하여 NKT 림프구의 활성이 억제됨을 확인하였다.

본 발명에서는, NKT 림프구에 항원을 전달하는 CD1d의 세포표면 발현을 조절함으로써 생체 내 면역계에 중요한 작용을 하는 NKT 림프구 활성제어를 할 수 있으며, 이를 이용할 경우 NKT 림프구 활성 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 NKT 림프구 활성 억제용 조성물은 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유전자가 삽입된 바이러스 벡터를 숙주세포에 형질전환 시켜서 생산된 바이러스 입자도 포함된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 NKT 림프구 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물에서, NKT 림프구는 보통의 T 림프구와는 인식하는 항원의 종류와 기능 등에서 차이가 나며 면역조절세포로서의 기능을 수행한다. NKT 림프구는 Th1 type의 사이토카인 IFN-γ와 Th2 type의 사이토카인 IL-4를 분비하는데, 여러 가지 면역반응이 Th1 또는 Th2 사이토카인들에 의해 조절되는 상황에 비추어보면 특정 면역과정의 조절에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 전신성 홍반성 루프스 (Systemic Lupus Erythematosus, SLE)와 같은 자가면역질환에서 CD1d-autoreactive한 NKT 세포는 IFN-γ를 분비하는 세포들이 병세를 악화시킨다는 것이 알려져 있다 (Zeng D, et al., 1998). 또한 NKT 세포들이 정상적인 종양 면역감시 (tumor immunosurveillance)과정을 억제하여 암의 발생을 촉진한다는 보고가 있다 (Cui J, et al., 1997; Kodama T, et al., 1999; Terabe M, et al., 2005).

따라서, PACSIN-3 유전자를 감소조절 (down-regulation)하면 항원제시세포 (antigen presenting cell, APC)에서 발현하는 CD1d 발현양도 감소되고 NKT 세포가 불활성화 될 것이다. 그러면, 자가면역질환 및 감염성 질환의 증세를 완화시킬 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 함유하는 것을 포함하며, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적절한 벡터, 예컨대 동물세포 발현용 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 등에 삽입된 형태로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 PACSIN-3 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 자가면역질환 치료용 조성물은 임상투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우 당업계에서 약제학적으로 잘 알려진 방법을 사용하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효용량은 0.1 ∼ 5 mg/kg 이고, 바람직하게는 1 ∼ 2 mg/kg 이며, 하루 1 ~ 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 조성물은 본 발명의 유효성분인 상기 안테센스 올리고뉴클레오티드의 유전자를 포함하는 바이러스 클론 또는 그 발현 단백질 외에 생물제제에 통상 사용되는 안정화제 및 담체, 보조 활성성분 등을 더 포함할 수 있으며, 면역활성 억제를 위해 주사제 형태로 인체에 투여될 수 있다. 이 때 환자에게 투여될 바이러스 클론 입자의 적정 수는 환자의 중한 상태에 따라 다르나 바람직하게는 체중 kg당 100 ~ 2000 MOI 정도이고, 발현 단백질의 경우는 성인 기준 일당 100 μg ~ 1000 mg 정도이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 CD1d와 상호작용 하는 PACSIN-3 유전자를 감소조절 (down-regulation) 하는 것을 포함하는 NKT 림프구 활성 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 NKT 림프구 활성 억제 방법에서, 바람직하게는 상기 PACSIN-3 유전자의 감소조절은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 유전자 억제 (gene silencing) 되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 NKT 림프구 활성 억제 방법은 상기 올리고뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 벡터를 사용하여 클로닝 한 후, CD1d를 세포표면에 발현하는 세포 예컨대, 면역세포 예컨대 수지상 세포, 위장의 상피세포, 또는 B 세포 등에서 트랜스펙션시켜 CD1d의 세포표면 발현을 억제함으로써 CD1d에 의한 NKT 림프구에 대한 항원제공을 억제하여 NKT 림프구의 활성을 억제시키는 방법을 포함한다.

이하, 본 발명을 단계별로 설명한다.

1. 인간 PACSIN-3와 인간 CD1d 유전자와 아미노산의 서열

2. 이스트 투 하이브리드 시스템 (yeast two hybrid system)을 이용하여 인간 PACSIN-3와 인간 CD1의 결합 확인

3. 단백질-단백질간의 상호작용하는 도메인 확인

4. 형광현미경으로 세포 발현 확인

5. RNAi에 의한 유전자 발현 억제 확인

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 실시예 1> 인간 PACSIN -3와 인간 CD1d 유전자

인간 PACSIN-3와 인간 CD1d 유전자, 단백질 서열과 제한효소 자리를 확인하였다. PACSIN-3 유전자 및 단백질은 서열번호 1과 2에 기재하였으며, CD1d 유전자는 서열번호 3과 4에 기재하였다. 또한, PACSIN-3와 CD1d의 제한효소 자리는 각각 도 1a ~ 1e와 도 1f ~ 1i에 나타내었다.

< 실시예 2> 이스트 투 하이브리드 시스템 ( yeast two hybrid system )를 위한 유전자의 클로닝

C1R cell을 트리졸(Trizol, Invitrogen) 1㎖당 200㎕의 chloroform (Sigma)을 넣고 전체 RNA를 분리 하였다. 추출한 2㎍의 mRNA를 주형으로 역전사 효소인 SuperscriptⅢ (Invitrogen)를 사용하여 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA를 복제 하였다.

정방향 프라이머 (인간 CD1d, SalI site 포함)

5'-ACG CGT CGA CAT GGG GTG CCT GCT G-3' (1aa~)

5'-ACG CGT CGA CGT GAA GCC CAA GGC C-3' (203aa~)

역방항 프라이머 (인간 CD1d, SalI site 포함)

5'-ACG CGT CGA CTT GCT TCT TCA GTT C-3' (~202aa)

5'-ACG CGT CGA CGG AGG TAA AGC CCA C-3' (~323aa)

정방향 프라이머 (인간 PACSIN-3, EcoRI site 포함)

5'-CGA ATT CAT GGC TCC AGA AGA GGA C-3' (1aa~)

5'-CGA ATT CCA GAA GCC CTG GCT GAA G-3' (141aa~)

5'-CGA ATT CGA GGA GTG GTC CTT GGA C-3' (301aa~)

역방향 프라이머 (인간 PACSIN-3, XhoI site 포함)

5'-CCT CGA GCT GGG CCT TGC GGA AGC C-3' (~140aa)

5'-CCT CGA GCT GGA ACT GTG GCC AGT T-3' (~300aa)

5'-CCT CGA GGG CGC CCA CAC ACT CCA C-3' (~424aa)

인간 CD1d를 두 부분으로 나누어 각각 5’와 3’ 말단에 각각 제한효소 SalI의 절단 부위 서열을 포함한 프라이머를 합성하여, 중합효소 Taq polymerase (Gene craft)를 사용하여 cDNA를 주형으로 연쇄중합반응으로 유전자를 만들었다. 또한, 인간 PACSIN-3를 세 부분으로 나누어 각각 5’말단에 제한효소 EcoRI과 3’말단에 제한효소 XhoI의 절단 부위 서열을 포함한 프라이머를 합성하여 연쇄중합반응으로 유전자를 만들었다. 각각의 제한효소로 절단한 뒤 elution (Quagen)하여 ligase (promega)를 사용하여 각각 ligation하였다. DNA binding domain을 가진 pGilda vector (CLONTECH)에 인간 CD1d 유전자를 클로닝 하였고 (도 2a), B42 단백질을 activation domain으로 도입한 pJG4-5 vector (CLONTECH)에 인간 PACSIN-3를 클로닝 하였다 (도 2b).

< 실시예 3> 이스트 투 하이브리드 시스템 ( yeast two hybrid system )을 활용한 단백질 상호작용

상호 작용이 가능한 두 단백질인 인간 CD1d와 인간 PACSIN-3를 각각의 DNA binding domain의 유전자와 activation domain의 유전자에 결합시킨 형질전환을 위한 DNA, LiAc/TE buffer를 효모 (EGY48)에 넣고 vortex를 이용하여 잘 섞은 후 30℃ 진탕 배양기에서 30분간 배양한다. 배양한 반응물에 DMSO를 넣고 42 ℃ 진탕 배양기에서 30분간 heat shock한다. 형질전환체를 uracil, histidine, tryptophan, leucine이 없는 선택배지 (SD/-Ura/-His/-Trp/-leu)에 도말 후 30℃ 배양기에서 3~4일간 배양하였다. 분리되었던 두 단백질의 상호작용에 의해 전사와 관련된 기능을 하게 됨으로써 효모 내에서 lacZ와 LEU2 두 개의 reporter 유전자가 발현되었다. 세포에 Z-buffer (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 50 mM β-mercaptoethanol, pH 7.0)를 넣은 후 잘 섞은 후 액체질소에 30초간 넣었다가 37℃로 옮겨서 세포를 깬다. 여기에 4 mg/㎖ o-nitrophenyl β-D -galactopyranoside (ONPG)와 X-gal을 섞은 후 30℃ 배양기에 배양하면서 색깔 변화를 확인한다. β-galactosidase activity assay를 통해 푸른색으로 변한 결과로 lacZ 유전자가 발현 된 것을 확인할 수 있었고, leucine 유전자 발현 확인은 leucine이 없는 배지에서 형질 전환된 콜로니를 형성하는 것으로 알 수 있었다 (도 3a와 3b).

< 실시예 4> 상호작용 하는 도메인 ( domain ) 확인

인간 PACSIN-3은 인간 CD1d의 α1+α2 (1aa ~ 202aa) domain과 결합하고 (도 3a와 도 4a 참조), 인간 CD1d는 인간 PACSIN-3의 coiled-coil domain과 결합 (도 3b와 도 4b 참조)함으로써, 단백질-단백질간의 상호결합 하는 domain을 확인하였다.

< 실시예 5> 세포 발현 확인

인간 PACSIN-3를 발현시킨 세포 (C1R이라는 B cell line, ATCC CRL-1933을 사용하였다.)에 녹색 형광을 나타내는 antibody, 인간 CD1d를 발현시킨 세포 (C1R이라는 B cell line, ATCC CRL-1933을 사용하였다.)에 빨간 형광을 나타내는 antibody로 각각 표지하여 형광현미경으로 관찰하였다. DAPI 염색은 세포의 핵 부분을 나타내고, 인간 PACSIN-3와 인간 CD1d 유전자는 핵 밖의 세포질에서 발현된 다. 두 가지 형광을 표지한 유전자를 합쳐보면 intracellular vesicle에서 co-localization 한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

< 실시예 6> lentiviral vector 에 RNAi 유전자 클로닝

생체 내에서 유전정보로부터 단백질 합성에 관여하는 RNA를 선택적으로 분해시켜 단백질 합성을 방해하는 현상을 RNA간섭 (RNA interference)이라고 하는데, 이러한 RNA간섭 현상을 효율적으로 일으키게 할 수 있는 이중나선구조의 합성RNA를 siRNA (small interfering RNA)라고 한다 (Hutvagner et al.,2004). siRNA는 각종 난치병의 원인이 되는 단백질 생성을 억제하는 유전자 수준의 근본적인 치료방법으로 주목받고 있는 신약 개발 기술이다. siRNA는 3'overhang(TT) 형태의 21mer정도의 짧은 RNA double strand로서, target specific gene silencing을 위해 최근 각광받고 있는 강력한 수단으로 유전자 기능의 확인, 각종 질병의 gene therapy 등에 사용되고 있다. siRNA는 기존 anti-sense technology에 비교하여 다음과 같은 장점을 가지고 있다. 적은 수의 screening에 의해 높은 효율의 siRNA를 찾을 수 있어 시간 과 경비를 절감 할 수 있고, 낮은 농도에서 효율적인 gene silencing이 가능하다. 마지막으로 natural biological mechanism으로 기작이 매우 target specific하다.

PACSIN은 N-terminal FHC, coiled-coil, C-terminal SH3 domain을 포함한 vesicle 형성과 운반에 중요한 역할을 하는 cytoplasmic phosphoprotein이다. 3가지 PACSIN isoform이 존재하는데, PACSIN-1은 neuro specific하고 PACSIN-2, 3는 주로 lung, muscle 조직에서 발견된다. 인간 PACSIN-3는 48.4 KDa의 424 아미노산으로 구성되고, 생쥐 PACSIN-3 유전자와 핵산 87%, 단백질 94% 일치한다. 모든 isoform은 oligomerization 할 수 있고, Src homology 3 domain을 통해 synaptojanin, dynamin, N-WASP와 결합한다. shlenti2.4G lentiviral vector (shRNA-expression lentiviral vector, 짧은 헤어핀 RNA-발현 렌티바이러스 벡터)에 EcoRI and XbaI 제한효소 자리를 이용하여 coiled-coil domain의 특정 염기서열 5'-CGGAATTC GAGGCTGAAGGAGGTTGAGGC ttcaagaga GCCTCAACCTCCTTCAGCCTC TTTTTGATATCTAGACA-3'을 클로닝 하였다. (볼드체로 표시된 두 부위은 5‘에서부터 각각 sense와 anti-sense siRNA의 유전자임). 대조군으로 같은 방법으로 scramble shRNA (short hair-pin RNA) 염기서열 5'-AATGCGATAGCGTATGCCGTT-3'을 클로닝 하였다 (도 6). 상기 scramble shRNA는 negative control virus를 의미한다.

< 실시예 7> 바이러스 감염

6 well 조직 배양 플레이트에 1.5× 10⁵/well의 hCD1d.C1R 세포를 10% 송아지 혈청을 함유한 RPMI 배지에서 배양하였다. 18시간 후 세포가 well 표면의 30-40% 덮을 정도로 자라면, shlenti virus (벡터코어 에이)의 상청액을 polybrene을 사용하여 CD1d.C1R 세포 (C1R 세포에 CD1d 유전자를 발현시킨 것)에 감염시켰다. 감염시킨 세포를 8시간 배양 후 10% 송아지 혈청을 함유한 RPMI 배지로 바꾼 후 48 시간 배양하였다. EGFP 발현을 형광현미경으로 확인하였다 (도 7).

< 실시예 8> RT - PCR 에 의한 유전자 발현 억제 확인

shlenti virus (coiled-coil domain)를 감염시킨 hCD1d.C1R 세포와 대조군 세포를 트리졸 (Trizol, Invitrogen) 1 ㎖당 200 ㎕의 chloroform (Sigma)을 넣고 전체 RNA를 분리 하였다. 추출한 2 ㎍의 mRNA를 주형으로 역전사 효소인 SuperscriptⅢ (Invitrogen)를 사용하여 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA를 복 제하였다. 정방향 프라이머 5'-CTG GCT GAA GAG GCT GAA GGA GGT-3' 역방향 프라이머 5'-CTG GTG CAA GTC ACG GTG GAG TT-3', 중합효소 Taq polymerase (Gene craft)를 사용하여 cDNA를 주형으로 연쇄중합 반응을 통해 384bp의 인간 PACSIN-3 유전자를 획득 하였다. 그 결과 대조군에 비해 인간 PACSIN-3 양이 크게 감소함을 확인하였다 (도 8).

< 실시예 9 > 유세포 분석 방법에 의한 유전자 발현 억제 확인

shlenti virus (coiled-coil domain에 해당하는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 바이러스)를 감염시킨 hCD1d.C1R 세포와 대조군 세포를 수거하여, anti-human CD1d를 첨가하여, 4℃에서 30분 동안 표지한다. 반응한 세포는 유세 포 분석기 (FACSCaliburTMSYSTEM)의 CellQuestTM 소프트웨어 (BD Parmingen)을 사용하여 분석하였다. 그 결과 대조군에 비해 인간 CD1d의 세포발현 양이 크게 감소함을 확인하였다 (도 9).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 CD1d가 세포 안에서 항원을 인지하고 세포표면으로 도달할 때 PACSIN-3와 상호결합을 하며, PASIN-3의 발현양을 조절함에 따라 CD1d의 세포표면 발현양이 조절된다는 것을 밝혔다. 따라서 본 발명은 NKT 림프구에 항원을 전달하는 CD1d의 세포표면 발현양을 조절함으로써 생체 내 면역계에 중요한 작용을 하는 NKT 림프구 활성제어에 응용될 수 있다.

[참고문헌]

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 5의 염기서열과 그 상보적인 염기서열로 이루어진 팍신-3(PACSIN-3)의 유전자 억제 (gene silencing)를 위한 이중가닥 siRNA.
제 1항에 있어서, 상기 염기서열과 그 상보적인 염기서열은 5 내지 15 bp의 루프영역에 의해 회문(palindrom)적으로 연결되어 헤어핀 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 이중가닥 siRNA.
제 1항 또는 제 2항의 이중가닥 siRNA의 유전자를 포함하는 도 6의 개열지도를 갖는 재조합 바이러스 벡터.
제 1 또는 제 2항의 이중가닥 siRNA를 유효성분으로 함유하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물.
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CD1d와 상호작용 하는 팍신-3(PACSIN-3) 유전자를 감소조절 (down-regulation) 하는 것을 포함하는 시험관내(in vitro) 자연 살해 T 림프구(NKT cells) 활성 억제 방법.
제 6항에 있어서, 상기 팍신-3(PACSIN-3) 유전자의 감소조절은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 이중가닥 siRNA에 의해 유전자 억제 (gene silencing) 되는 것을 특징으로 하는 시험관내(in vitro) 자연 살해 T 림프구(NKT cells) 활성 억제 방법.