CZ178394A3 - Process for producing universal donor cells - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká terapie, transplantací a imunologie. Zejména se týká způsobu přípravy buněk snadněji transplantovatelných do přijímajícího hostitele pomocí oligonukleotidů reagujících s geny a genových produktů týkajících se transplantačnich antigenů vyjádřených na buněčném povrchu transplantovaných buněk.

Dosavadní stav techniky

Molekuly antigenového kódu jsou krátké RNA nebo DNA tránskripty, které jsou protismyslové (to je komplementární k řetězcům RNA nebo DNA ve Watsonově-Crickově pérovacím mechanismu) k části normální mRNA a nejsou překládány. Regulace vyjádření genů antigenovým kódem RNA, jeden z přirozených způsobů regulace genů, byla nejprve objevena u prokaryotů. Green P. M aj., Ann. Rev. Biochem. (1986) 55, 569. Přirozené antigenové kódy a umělé antigenové kódy se použily u prokaryotů k snížení prokaryotických proteinů. Simmons R. W. aj. Cell (1983) 34, 683, Mizuno T. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1984) 81, 1966, Okamoto K. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1986) 83, 5000, Pestka S. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1984) 81, 7525, Coleman J. aj. Cell (1984) 37, 429, Farnham P. J. aj. . Proč. Nati. Acad. Sci. (1985) 82, 3978, Kindy M. S. aj. Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2857.

,- 2 '·*

Rovněž se syntetizovaly umělé antigenové kódy a použily se k regulaci exprese eukaryotických genů. Bylo ukázáno, že mikroinjekce nebo transfekce antigenových kódů thymidin kinázy (TK) inhibuje expresi TK proteinu. Izant J. G„ aj. Cell (1984) 36, 1007, Kim S.K. aj. Cell (1985) 42, 129. Mimo to krátké antigenové kódy k 5' nepřeložené oblasti genu thymidin kinázy úspěšně snižuje vyjádření proteinu. Izant J. G. aj. Science (1985) 229, 345. Jiné příklady regulace vyjádření eukaryotických genů antigenovými kódy jsou gen pp66 c-src (transfekcí úplné délky antigenových kódů) a gen c-fos (napnutím antigenového kódu 5' nepřeložené oblasti prvého exonu). Amini S. aj. Mol. Cell. Biol. (1986) 6, 2305, Holt J. T. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1986) 83, 4794. Tyto antigenové kódy byly zavedeny pomocí zaváděcích konstitučních nebo heterogenních promotorů.

Také se použily syntetické oligomery k snížení c-myc v promyelotických leukemických buňkách a T-lymfocytech. Wickstrom E. L. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1988) 85, 1028, Heikkila R aj. Nátuře (1987) 328, 445. Ukázalo se, že c-myc antigenové oligonukleotidy inhibují proliferaci v normálních hematopoietických buněk. Gerwitz A. M. aj. Science (1988) 242, 1303. Antigenový kód k CD8 fragmentu snižoval vyjádření CD8 molekul na povrchu lidských cytotoxických T-buněk. Hambor J. E. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1988) 85, 4010. Lotteau a j. J. Exp. Med. (1989) 169, 351 použili episomální nosiče k zavedení DR A kódujících sekvencí do B-lymfoblasto ídních buněčných linií a snížili vyjádření heterodimerů smíšených isotypů DR A-DQ B, avšak nepozorovali žádné změny heterodimerů párovaných isotypů DR A-DQ B.

Antigenové kódové oligonukleotidy mohou zabránit transkripci inhibici RNA nebo DNA polymerázy, navázáním na mRNA a zabráněním ribosomálnímu překladu, snížením stability mRNA zvýšením degradace mRNA pomocí RNázy H, nebo zabráněním či inhibici zralé mRNA. Maher L. J. aj. Science (1989) 245, 725, Moser Η. E. aj. Science (1987) 238, 645, Melton D. A. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1985) 82, 144, Gerwirtz A. M. aj. Science (1989) 245, 180, Walder R.Y. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (1988) 85, 5011. Absolutní souhlas mezi cílovou a protismyslnou sekvencí je pro inhibici výhodný, nikoliv však nutný, viz Holt J. T., shora.

Antigenové kódové oligonukleotidy mohou také tvořit triplexní DNA struktury s nedotčeným duplexním genem. Moffat A.S. Science (1991) 252, 1374-1375. Tato technika přípravy antigenových kódových oligonukleotidů vyžaduje vytvoření triplexní struktury podle určitých vazebných pravidel. Když se vytvoří tato triplexní struktura v promotorové oblasti genu, přeruší se, jak se ukázalo, transkripce tohoto genu. Orson F. M. aj. Nuc. Acids Res. (1991) 19, 3435-3441.

Jedna skupina genu, která je potencionálně schopná regulace antigenovými kódy je lidský antigenový leukocytní komplex (HLA), umístěný na krátkém rameni chromozomu 6. HLA antigeny se dělí do dvou tříd podle své struktury. Genetická místa označená HLA-A -B a -C kód pro antigeny HLA třídy

I a HLA-DP -DQ a -DR kód pro antigeny HLA třídy II.

Molekuly HLA třídy II se skládají z dvou nekovalentně spojených glykoproteinů, alfa řetězce a vysoce polymorfního beta řetězce. Každý řetězec obsahuje jednu mimobuněčnou doménu, transmembránový segment a cytoplasmický konec. Struktura alfa a beta řetězců a jejich genů byla objasněna. Všechny známé geny třídy II mají podobnou strukturu a jsou zakódovány exony 1-4 s exonem 5 kódujícím nepřeloženou oblast. Všechna DP DQ a DR místa se skládají ze složitých genů. Celkem bylo identifikováno dvanáct genů třídy II. V některých haplotypech některé geny třídy II nekódují funkční peptid a jsou klasifikovány jako pseudogeny. Regulace exprese antigenů HLA třídy II vázáním antigenových oligonukleotidů na strukturní oblast genu nebyla v literatuře popsána.

Regulace exprese antigenů HLA třídy II probíhá částečně přes sérii promotérových oblastí, jako jsou promotérové bloky J, W, X (včetně Χ_χ a X₂) a Y a prvek odpovídající gamma interferonu. Je známo/ že bloky X (včetně Χ_χ a X₂) a Y jsou nutné v jsou potřeba v transkripční regulaci všech promotorů třídy II. ONO S. J. aj. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) (1991) 88, 4304-4308.

Antigeny HLA jsou zapojeny do přežívání buněčných štěpů nebo transplantátů v hostitelských organismech. Ačkoliv v prvém roce existuje přijatelné přežívání štěpů pro téměř všechny typy transplantátů, po pěti a deseti létech po transplantování pouze 40-50 % všech štěpů ještě funguje. Tento nízký poměr je důsledkem neúnavných útoků imunitní soustavy na štěpy. Navíc je zaznamenána úmrtnost 1-5 % i v nejlepších transplantačních střediscích. Pro kontrolu imunitní odpovědi a prevenci odmítnutí štěpu se zpravidla používají léčiva a smrt je zpravidla nepřímým výsledkem tohoto podávání léčiv. Léčiva používaná ke kontrole imunitní soustavy působí nespecifické potlačení imunitní soustavy. Pacient s potlačenou imunitní soustavou je mnohem náchylnější k napadení život ohrožujícími infekcemi a rozmanitými novotvary. Nízký poměr dlouhodobého úspěchu a vážné riziko infekcí a rakoviny jsou nyní dvě hlavní výzvy pro celé odvětví tkáňových a orgánových transplantací.

Bylo navrženo, že odmítnutí štěpu lze zabránit nebo je snížit snížením úrovní antigenů HLA na povrchu transplantovaných buněk. Faustman D. aj. Science (1991) 252, 1700-1702 pozorovali, že přežívání xenoštěpů se zvýšilo maskováním povrchu antigenů HLA třídy I antičásticovými fragmenty ke HLA třídě I nebo specifickými tkáňovými epitopy.

Tento vynález zamýšlí vývoj univerzální donorové buňky zbavené jednoho či více HLA antigenů. Neexistence jistých HLA antigenů na povrchu donorových buněk, tkání nebo orgánů obsahujících tyto buňky způsobí, že nebudou rozpoznány jako cizí a nevyvolají odmítavou odpověď. Selektivním zavedením antigenových kódů do buňky je možné blokovat expresi cílových genů HLA, čímž se stane štěp neviditelný pro imu6 nitní soustavu. Tím se odstraní problém odvržení bez nespecifického potlačení imunitní soustavy a imunitní soustava zůstane aktivní k obraně proti infekcím a novotvarům.

Podstata vynálezu

Nyní byl nalezen lepší způsob získání transplantačních buněk zbavených zcela či z části antigenů. Podle tohoto vynálezu oligonukleotidy redukující antigenicitu buněk se považují za schopné se nějak vázat k nukleotidové sekvenci ve vztahu k transplantačnímu antigenů a zabránit vyjádření tohoto antigenů. Buňky ošetřené těmito oligonukleotidy budou ukazovat významně méně cílového antigenů a při transplantaci budou snadněji tolerovány přijímajícím hostitelem. Ačkoliv tyto oligonukleotidy jsou navrženy tak, aby byly schopné se vázat k nukleotidové sekvenci transplantačního antigenů, předvídá se, že jejich konečný způsob působení může být různý.

Tento vynález dává lékařům vylepšený zdroj transplantovatelných buněk.......Tyto buňky zbavené transplantačních antigenů vedou ke zlepšenému přežívání štěpů v příjemci či vyžadují nižší hladiny podávání léčiv potlačujících imunitu příjemce. Tyto buňky rovněž mohou být užitečné pro léčení pacientů s autoimunitními nemocemi.

V jednom aspektu vynález poskytuje způsob přípravy buněk zbavených transplantačních antigenů z cílových buněk, při kterém se získají cílové buňky a pak se cílové buňky vystaví oligonukleotidu schopnému se vázat na nukleotidovou

Ί sekvenci transplantačního antigenu, přičemž oligonukleotid se dodává nebo produkuje místně v množství dostatečném, aby se cílové buňky přeměnily na buňky zbavené transplantačních antigenů. Oligonukleotid je schopný se vázat na nukleotidovou sekvenci podle vazných pravidel Watsona-Cricka nebo triplexových (které zahrnují vazby podobné Hoogsteenovým). Ve výhodném provedení je transplantačním antigenem antigen MHC třídy I nebo II.

Podle jiného aspektu tohoto vynálezu se poskytují buňky zbavené transplantačních antigenů připravené získáním cílové buňky a vystavením cílové buňky oligonukleotidu schopnému se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenu, přičemž oligonukleotid se dodává nebo produkuje místně v množství dostatečném, aby se cílové buňky přeměnily na buňky zbavené transplantačních antigenů.

V ještě dalším aspektu tohoto vynálezu se poskytuje oligonukleotid schopný se vázat na dvojitě vázanou nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenu.

A v ještě jiném aspektu tohoto vynálezu se poskytuje univerzální dárcovský orgán, připravený získáním cílového orgánu z jednotlivce, vystavením cílového orgánu oligonukleotidu schopnému se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenu, přičemž oligonukleotid se dodává nebo produkuje místně v množství dostatečném, aby se cílový orgán přeměnil na univerzální dárcovský orgán.

V dalším aspektu tohoto vynálezu se poskytuje způsob léčení jednotlivce s autoimunitní nemocí charakterizovanou dysfunkčním vyjádřením transplantačního antigenu, zahrnující podávání jednotlivci oligonukleotid schopný se vázat na část nukleotidové sekvence transplantačního antigenu v množství dostatečném pro inhibici vyjádření transplantačního antigenu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje DNA sekvenci X a X₂ bloků DR a promotoru a strukturu a vzor vazeb oligonukleotidů T₁ a T₂ tvořících triplex.

Obrázek 2 ukazuje fluorescentní profil HeLa buněk inkubovaných s gama interferonem a různými množstvími T₂ a pak označenými anti-DR monoklonálními antičásticemi.

Obrázek 3 ukazuje fluorescentní profil HeLa buněk inkubovaných s gama interferonem a různými množstvími T₂ a pak označenými anti-DP monoklonálními antičásticemi.

Obrázek 4 je Nothernova skvrnová analýza pomocí protismyslového RNA vzorku, který se specificky váže k smyslové DR A mRNA. Buňky byly označeny při 3 a 7 dnech ukázanými postupy (C.O. znamená kontrolní oligonukleotid).

Obrázek 5 obsahuje nukleotidové sekvence X a X₂ a promotorových oblastí různých transplantačních antigenů.

Obrázek 6(a) ukazuje fluorescentní profil gama interferonem ovlivněných Colo 38 buněk inkubovaných s kontrolní antičásticí (myší IgG_a) a anti-DR monoklonální antičásticí.

Obrázek 6(b) ukazuje fluorescentní profil gama interfe9

-¾ ronem ovlivněných Colo 38 buněk ošetřených (a) ničím, (b) μΜ oligo A nebo (c) 100 μΜ oligo A s následující inkubací s anti-DR monoklonální antičásticí.

Obrázek 6(c) ukazuje fluorescentní profil gama interferonem ovlivněných Colo 38 buněk ošetřených (a) ničím, (b) 50 μΜ kontrolní oligo AI s následující inkubací s anti-DR monoklonální antičásticí.

Obrázek 7 ukazuje fluorescentní profil průtokové cytometrie HeLa buněk inkubovaných s gama interferonem a různými množstvími TS1 a pak označenými anti-DR mónoklonálními antičásticemi.

Obrázek 8 ukazuje procento potlačení DR antigenu na povrchu HeLa buněk ve vztahu ke koncentraci TS1.

Obrázek 9 ukazuje trvání účinku TS1 na HeLa buňky.

Obrázek 10 ukazuje účinek TS1 na konstituční Colo buňky. Obrázek 10b je postupná integrace podél fluorescentní osy dat ukázaných na obrázku 10a.

Obrázek 11 je sloupcový graf, který ukazuje účinek protismyslových oligonukleotidů ANTI-B, AB, ACAT, ATCT a T na indukci vyjádření MHC antigenů třídy I pomocí IFN-gama.

Obrázek 12 je graf ukazující účinek T^a A₃ na zvýšenou degradaci tryptofanu vyvolanou IFN-gama.

Obrázek 13 je graf ukazující účinek oligonukleotidů a A₃ na produkci kynureninu.

Obrázek 14 je sloupcový graf, který ukazuje účinek T_. na HLA třídy I indukované IFN-alfa, IFN-beta a IFN-gama.

Obrázek 15 je sloupcový graf, který ukazuje účinek T₂ na IFN-gama indukované MHC-II ve WEHI-3 buňkách.

Obrázky 16A a 16 B jsou grafy ukazující účinek T₂ na IFN-gama a IFN-alfa indukované vyjádření povrchu v ICAM-1 buňkách.

Obrázek 17 je graf, který ukazuje účinek T₂ na antigeny vyvolaný rozvoj lidských monocytů.

Obrázek 18 je graf, který ukazuje účinek T₂ na aktivaci T buněk pomocí IL-2 produkčního pokusu.

Praxe tohoto vynálezu zahrnuje konvenční techniky chemie, molekulární biologie, biochemie, proteinové chemie a rekombinantní DNA technologie, které jsou v oboru známé. Tyto techniky jsou zcela vysvětleny v literatuře. Viz například Oliqonukleotide Svnthesis (M. J. Gait, Ed.), Nucleic Acid Hybridization ((B. D. Hanes, S. J. Higgins, Eds, 1984), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch a Maniatis, 1989), PCR Technology (H. A. Erlich, Ed., Stocton Press), Protein Purification Principles and Practice (R. K. Scope, Springer Verlag), a série Methods in Enzymology (S. Colowick a N. Kaplan Eds., Academie Press, lne).

Všechny patenty, patentové přihlášky a publikace zde zmíněné, ať shora nebo níže jsou uvedením cele zahrnuty do popisu.

Definice

Tak jak se zde používá, termín transplantační antigen se vztahuje k antigenním molekulám, které jsou vyjádřeny na buněčném povrchu transplantovaných buněk, buď během transplantace nebo v některém čase po transplantaci. Obecně tyto antigenní molekuly jsou proteiny a glykoproteiny. Primární transplantační antigeny jsou produkty hlavního histokompatibilního komplexu (MHC), lokalizovaného u lidí na chromosomu 6. Lidský MHC komplex se také nazývá lidský antigenový leukocytní komplex (HLA). MHC antigeny se dělí na antigeny MHC třídy I (u lidí tato třída zahrnuje HLA-A -B a -C antigeny) a na antigeny MHC třídy II (u lidí tato třída zahrnuje HLA-DP -DQ a -DR antigeny). Transplantační antigeny také zahrnují molekuly buněčného povrchu odlišné od antigenů MHC třídy I a II. Tyto antigeny zahrnují následující: (1) ABO antigeny účinkující při rozpoznávání krevních buněk, (2) molekuly buněčné adheze jako jsou ICAM, které účinkující při vzájemném rozpoznávání leukocytních buněk a (3) beta-2-mikro globulin, polypeptid spojený s 44 kd polypeptidem těžkého řetězce, který zahrnuje HLA-I antigeny, avšak není zakódován MHC komplexem.

Tak jak se zde používá, termín nukleotidová sekvence transplantačního antigenů se vztahuje na nukleotidovou sekvenci spojenou s geny kódujícími transplantační antigeny. Nukleotidové sekvence spojené s geny zahrnují oblast genu kódující strukturní produkt, včetně intronových a exonových oblastí a oblasti proti proudu strukturního genu spojené se zahájením transkripce, zahájením překladu, s operátorovou a promotérovou oblastí, s oblastmi vázání ribosomu, jakož i s oblastmi po proudu strukturního genu včetně ukončujících míst. Nukleotidové sekvence spojené s geny také zahrnují sekvence nalezené v kterékoliv formě nosné RNA (mRNA) odvozené od genu, včetně pre-mRNA, štěpené mRNA a polyadenylované mRNA.

Tak jak se zde používá, termín buňka zbavená transplantačního antigenu se vztahuje na buňky, které jsou nějakou cestou zbaveny vyjádření alespoň jednoho transplantačního antigenu. Toto zbavení se může projevit sníženým množstvím antigenu přítomného na buněčném povrchu v kterékoliv době. S výhodou je z buněčného povrchu odstraněno alespoň 90 % antigenu. Nejlépe toto odstranění vede k podstatně úplné absenci antigenu na buněčném povrchu.

Jisté transplantačního antigeny nejsou vždy konstitučně vyjádřeny na buněčném povrchu. Tyto antigeny mají své vyjádření zvýšené v některé době krátce po transplantaci. V těchto případech se odstranění projeví sníženým množstvím antigenu nebo úplnou absencí antigenu na buněčném povrchu v potransplantačním období normálně zvýšeného vyjádření.

Buňka zbavená transplantačního antigenu bude mít alespoň dvě vlastnosti: (1) buňka bude přežívat u příjemce transplantátu po časové období významně delší než normální buňky, nebo (2) buňka bude přežívat u příjemce transplantátu po časové období srovnatelné s normálními neupravenými buňkami, ale bude vyžadovat nižší dávky léčiv potlačujících imunitu příjemce transplantátu.

Tak jak se zde používají, termíny oligomery” nebo oligonukleotidy” zahrnují RNA, DNA či RNA/DNA hybridní sekvence více než jednoho nukleotidu buď v jediném řetězci nebo v duplexní formě. Nukleové kyseliny” zde užívané se vztahují na RNA, DNA či RNA/DNA hybridní sekvence jakékoliv délky ve formě jednoduchého řetězce nebo duplexní.

Tak jak se zde používá, termín ”vazba se vztahuje na interakci nebo komplexaci mezi oligonukleotidem a cílovou nukleotidovou sekvencí transplantačního antigenu zprostředkovanou vodíkovou vazbou nebo jinými molekulárními silami. Tak jak se zde používá, termín vazba” se vztahuje podrobněji na dva typy vazeb mezi oligonukleotidy zprostředkované vodíkovou vazbou báze-báze. Prvým typem vazby jsou Watsonovy-Crickovy vazné interakce, při kterých se tvoří bazické páry adenin- thymin (nebo adenin-uracil) a guanin- cytosin vodíkovými vazbami mezi bázemi. Jako příklad tohoto typu vazeb jsou vazby tradičně spojené s dvojitou šroubovnicí DNA.

Druhým typem vazby je triplexová vazba”, která sleduje množinu ještě ne zcela formulovaných vazebných pravidel. Obecně triplexová vazba se vztahuje na dva typy vodíkových vazeb báze-báze spojujících třetí oligonukleotidový řetězec s duplexní DNA (nebo RNA/DNA hybridem), která je již spárovaná podle Watsona-Cricka. Triplexová vazba je podrobněji popsána v PCT přihlášce číslo WO 90/15884 (publikované 27.

prosince 1990). V jedné množině triplexových vazebných pravidel je třetí řetězec určen ke shodě každého A nebo T v jednom z duplexových řetězců s T a každého c nebo G s C a třetí řetězec běží antiparalelně ke shodnému řetězci. V jiné množině triplexových pravidel je třetí řetězec určen ke shodě každého A nebo T v jednom z duplexových řetězců s T a každý C nebo G s G, přičemž také běží antiparalelně ke shodnému řetězci. Jiné typy triplexových vazeb jsou popsány v PCT přihlášce číslo WO 90/15884. U daného oligonukleotidu může docházet k jednomu či více typům triplexových vazeb.

Tak jak se zde používá, vazby podobné Hoogsteenově se vztahuje na vodíkové vazby mezi bázemi.

Oligonukleotid:

Podle tohoto vynálezu se syntetizují oligonukleotidy, které jsou schopné se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenu. K vazbě může dojít mezi oligonukleotidem a jednoduchým řetězcem typem vazby Watsonovy-Crickovy, nebo mezi oligonukleotidem a dvojitým řetězcem triplexovým typem vazby. V každém případě vazebná schopnost vede k buňce zbavené transplantačního antigenu, která má snížené vyjádření alespoň jednoho transplantačního antigenu v některém období po transplantaci.

Protože se zamýšlí možnost křížení mezi reaktivitou a jednotností mezi strukturními a kontrolními oblastmi různých transplantačních antigenů, také se zamýšlí, aby se transplantační antigeny, které jsou nakonec odstraněny z ošetřené buňky, mohly lišit od nukleotidové sekvence, která byla původně cílena.

Jeden specifický cílový řetězec je dobře charakterizovaná DR A promotérové oblast. DR A promotérové oblast obsahuje řadu podoblastí, které jsou známy jako vazebná místa pro proteiny vázající DNA, zvané bloky J, W, X (včetně Χ_χ a X_a) a Y a prvek odpovídající gamma interferonu. Zvlášť významné jsou bloky X a X₂, jak je zde popsáno. Jiné specifické cílové řetězce jsou uvnitř strukturního genu.

Obecně je nutné minimálně asi 5 nukleotidů, s výhodou alespoň 10 nukleotidů, aby se dosáhla nutná vazba k specifickému cílovému řetězci uvnitř intronové oblasti strukturního genu. Zacílením oblasti strukturního genu se potřebuje, aby se vázaly pouze dvě cílové DNA sekvence na buňku na tento oligonukleotid. Dále buňky snadno přijímají krátké řetězce oligonukleotidu (přibližně 26 nukleotidů nebo méně). Jediné zřejmé omezení požadované vazebné délky komplexu cíl/oligonukleotid podle tohoto vynálezu se týkají výroby oligonukleotidu s dostatečnou vazebnou délkou, aby byly schopné se vázat na cílovou sekvenci transplantačního antigenu a nevázaly se na jiné nežádoucí necílové sekvence a nerušily jiné buněčné mechanismy. Oligonukleotidy s řetězci kratšími než 15 nukleotidy mohou být vhodné, pokud lze dosáhnout vhodnou interakci.

Jak je dále objasněno níže, oligonukleotidy musí obsa16 hovat sekvenční specifitu, ale mohou být rozšířeny pobočnými oblastmi nebo jinak změněny či upraveny. Oligonukleotidy lze připravit každou známou metodou, včetně syntetických, rekombinantních a čisticích metod a lze je použít samotné nebo v kombinaci s jinými oligonukleotidy specifickými pro téže nebo jiné cílové transplantační antigeny.

Oligonukleotidy mohou také obsahovat vnitřní pobočné oblasti, což jsou sekvence uvnitř vazebných sekvencí, které nejsou schopné se vázat na cíl podle Watsonových-Crickových či triplexovým vazebných pravidel. Tedy oligonukleotidy mohou obsahovat dvě či více vazebných oblastí oddělených vnitřními pobočnými oblastmi. Také se předpokládá, že vazebné sekvence mohou obsahovat jeden či více nesouladů, které nevyhovují vazebným pravidlům. Tyto substituce mají být částí vynálezu tak dlouho, pokud si oligonukleotid zachová zde popsanou vazebnou schopnost.

Oligonukleotidy se mohou také zesílit PCR. PCR metoda je dobře známá a popsaná například v US patentech číslo 4,683,195 a 4,683,202 a v Saiki R. K. aj. Science (1988) 239, 487-491 a Evropských patentových přihláškách

86302299.2, 86302298.4 a 86300203.4 jakož i Methods in Enzymolocrv (1987) 155, 335-350. Zesílenou DNA lze pak získat jako DNA nebo RNA v původní jednoduché nebo dvojité formě pomocí konvenčních technik.

Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu obyčejně obsahují přirozeně se vyskytující báze, cukry a fosfordiesterové vaz17 by. Avšak jakékoliv hydroxylové skupiny přítomné v cukrech se mohou nahradit fosfonátovými skupinami, chráněnými standardními ochrannými skupinami nebo aktivovanými k přípravě dalších vazeb k dalším nukleotidům, nebo mohou být konjugovány k pevným nosičům. 5' a 3' terminály OH skupin jsou obvykle volné, ale mohou být fosforylované nebo substituované aminy či organickými koncovými substituenty s 1 až 20 uhlíkovými atomy. Jiné hydroxyly mohou rovněž být substituovány standardními ochrannými skupinami.

Jedna či více fosfordiesterových vazeb mohou být nahrazeny alternativními spojovacími skupinami. Tyto alternativní spojovací skupiny zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, provedení, kdy fosfát je nahrazen P(O)S (thiolát), P(S)S (dithiolát), P(O)NR₂ (amidát), P(O)R, P(O)OR', CO nebo CH_a (formacetal), kde každé R a R' je nezávisle H či substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl (1-20 C), případně obsahující ethérovou vazbu (-0-), aryl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkenyl nebo aralkyl. Ne všechny vazby v oligomeru musí být identické.

Do rozsahu tohoto vynálezu také patří syntetické procedury, při nichž vznikající oligonukleotidy získávají analogické formy purinů a pyrimidinů. Analogické” formy purinů a pyrimidinů jsou takové, které jsou obecně známé. Mnohé se používají jako chemoterapeutická činidla. Příkladný, nikoliv však vyčerpávající seznam zahrnuje aziridinylcytosin, 4-acetylcytosin, 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5- karboxyme18 thyl aminomethyl-2-thiouracil, 5-karboxymethyl aminomethyluracil, inosin, N6- isopentenyladenin, 1- methyladenin, 1methylpseudouracil, 1- methylguanin, 1- methylinosin, 2,2dimethylguanin, 2- methyladenin, 2- methylguanin, 3- methylcytosin, 5- methylcytosin, N6- methyladenin, 7- methylguanin, 5- methylaminomethyluracil, 5- methoxy aminomethyl-2thiouracil, beta-D-'^- mannosylqueosin, 5- methoxyuracil, 2-methyl-N6- isopentenyladenin, methylester uracil-5- oxyoctové kyseliny, pseudouracil, queosin, 2- thiocytosin, 5methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4- thiouracil, 5- methyl2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyoctová kyselina, 5-pentynyluracil a 2,6 diaminopurin. Použití uracilu jako náhradní báze za thymin v deoxyribonukleové kyselině (dále uváděné jako dU se považuje v tomto vynálezu za analogickou formu pyrimidinu.

Oligonukleotidy mohou obsahovat dobře známé analogické formy ribozy nebo deoxyribozových cukrů. Příkladný, nikoliv však vyčerpávající seznam zahrnuje 2' substituované cukry jako je 2'-O-methyl-, 2'-0-allyl, 2'-fluor nebo 2'- azidoribozy, analogy karboxylových cukrů, alfa-anomerní cukry, epimerní cukry jako arabinoza, xylozy nebo lyxozy, pyranozové cukry, furanozové cukry, sedoheptulozy, acyklické analogy a abazické nukleozidové analogy jako methylribozid.

Ačkoliv konvenční cukry a baze se použijí při aplikaci způsobu podle tohoto vynálezu, substituce analogických forem cukrů, purinů a pyrimidinu může být výhodná při návrhu ko19 nečného produktu, jakou může být alternativní základní strukturu jako je polyamidová páteř.

Oligonukleotidy obsahující navržené vazebné sekvence odpovídající metodě tohoto vynálezu mohou být upraveny různými cestami. Primárně oligonukleotidy budou upraveny připojením lokalizačního jaderného signálu, aby se zlepšilo cílené zaměření jádra. Jedním dobře charakterizovaným lokalizačním jaderným signálem je heptapeptid PKKKRKV (pro-lyslys-lys-arg-lys-val). Pokud se má oligonukleotid použít k separaci cílové substance, oligonukleotid bude upraven připojením k pevnému nosiči, aby se umožnila chromatografická separace. Pokud se má oligonukleotid použít k označení cíle, nebo jinak připojit detekovatelnou skupinu k cíli, oligonukleotid bude upraven tak, aby obsahoval radionuklid, fluoreskující molekulu, chromofor a podobně. Pokud se má oligonukleotid použít k specifickým vazebným pokusům, může též být žádoucí připojení k pevnému nosiči nebo k detekovatelnému označení. Pokud se má oligonukleotid použít terapeuticky, může být upraven zahrnutím ligandů, které zajistí zacílení na specifická buněčná místa nebo dovolí snadnější přechod buněčných bariér, toxických skupin, které napomohou terapeutickému účinku, nebo enzymatických aktivit, které provedou na cíleném místě žádané funkce.

Jednou žádanou funkcí, kterou lze dosáhnout oligonukleotidem na cíleném místě je změna cílené DNA. Oligonukleotid lze upravit, aby se připojil na cílenou sekvenci, aby síto20 val cílenou sekvenci (například psoralenovými můstky) nebo změnil, modifikoval či zničil cílenou sekvenci celou či z části. Tímto způsobem oligonukleotid může způsobit trvalé odstranění transplantačního antigenů na buňce a jejích dceři nných buňkách.

Oligonukleotidová sekvence může být rovněž zahrnuta ve vhodné vyjadřovací soustavě, která by zajistila generaci žádaného oligonukleotidu in šitu.

Metody:

Podle tohoto vynálezu oligonukleotidy popsané shora se používají při způsobu léčení, aby se získaly buňky zbavené transplantačních antigenů z normálních cílových buněk. Buňky vznikají inkubací buněk s jedním či více oligonukleotidy popsanými shora za standardních podmínek pro přijímání nukleových kyselin, včetně začlenění elektricky a lipofekce.

Oligonukleotidy mohou být případně upraveny nebo společně podávány pro cílené dodáni k jádru. Buněčné jádro je jasně preferovaným místem pro působení oligonukleotidů tvořících triplex podle tohoto vynálezu, protože tam je umístěn mechanismus buněčné transkripce a replikace. Také se očekává zlepšená stabilita oligonukleotidu v jádře v důsledku: (1) nižších úrovní DNáz a RNáz, (2) vyšších koncentrací oligonukleotidu v důsledku menšího celkového objemu, (3) vyšších koncentrací klíčových enzymů, jako je DNáza H, zapojených do mechanismu účinku těchto oligonukleotidů. Avšak pravděpodobným místem působení tradičních protismyslových oligonukleotidů podle tohoto vynálezu je cytoplasma.

Primární cestou přenosu jádra je jaderný pór. Cílenou dodávku lze tedy dosáhnout upravením oligonukleotidů připojením jaderného lokalizačního signálu. Jedním dobře charakterizovaným lokalizačním jaderným signálem je heptapeptid PKKKRKV (pro-lys-lys-lys-arg-lys-val).

Všechny transplantovatelné typy buněk jsou potenciálními cílovými buňkami podle tohoto vynálezu. Cilové buňky jsou vybrány přednostně z výstelkových buněk rohovky, buněk štítné žlázy, parathyróidních buněk, mozkových buněk, buněk nadlevinek, buněk morku kostí, buněk pankreatických ostrůvků, jaterních buněk, lymfatických buněk, fibroblastů, výstelkových buněk, chondrocytů, endokrinálních buněk, ledvinových buněk, buněk srdečního svalu a buněk vlasových váčků. Nejvýhodněji jsou cílové buňky vybrány z výstelkových buněk rohovky, buněk štítné žlázy, parathyróidních buněk, mozkových buněk, buněk nadlevinek, buněk morku kostí, buněk pankreatických ostrůvků a jaterních buněk.

V dalším aspektu tohoto vynálezu se oligonukleotidy popsané shora mohou začlenit do výrazového vektoru dobře známými metodami a pak zavést do cílových buněk standardními technikami, jako jsou elektrozačlenění, lipofekce nebo mediace fosforečnanem vápenatým či vápenatou solí. Tímto způsobem se žádané oligonukleotidy produkují in šitu výrazovým vektorem a cílové buňky budou pokračovat ve vyjadřování oligonukleotidů alespoň nějakou dobu po transplantaci.

Dále je vynález použitelný v oblasti transplantací pevných orgánů. Orgány se normálně proplachují ex vivo před transplantací. Přidáním nějakého množství oligonukleotidů popsaných shora k perfušnímu mediu lze vytvořit buňky zbavené transplantačních antigenů z buněk dostupných perfusi v orgánu, aby vznikl orgán zbavený transplantačních antigenů užitečný pro transplantaci pevných orgánů.

Nakonec je i lokální podání antigenových oligonukleotidů přímo do transplantovaného orgánu během prvého dne po transplantaci v rozsahu tohoto vynálezu. Také lze zamýšlí trvalé podávání těchto léků.

Způsoby léčby a podáváni

Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu jsou užitečné pro vytváření buněk zbavených transplantačních antigenů podle tohoto vynálezu. Tyto buňky se pak přímo transplantují jednotlivci. Tuto techniku lze použít pro každého jednotlivce s imunitním systémem, včetně lidí.

Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu jsou užitečné pro léčení autoimunitních nemocí, charakterizovanou dysfunkčním nebo odchylným vyjádřením transplantačního antigenu. V takovém případě lze podávat zde popsané oligonukleotidy v množství dostatečném pro inhibici vyjádření transplantačního antigenu.

Lze namítat, že mechanismus, kterým oligonukleotidy podle tohoto vynálezu ruší nebo inhibují vytváření jednoho či více transplantačních antigenů není vždy objasněn, ale to není součástí vynálezu. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu jsou charakterizovány svou schopností se vázat na specifické nukleotidové sekvence bez ohledu na mechanismus, jakým se vážou, nebo na mechanismus jejich účinku.

Níže jsou popsané příklady tohoto vynálezu, které slouží jeho osvětlení a neomezují rozsah tohoto vynálezu. Ve světle popisu budou odborníkům zřejmé četné provedení v rozsahu nároků.

Příklady

Materiály a metody

Buněčné linie a kultivační media

Buňky HeLa S3 (buňky lidského šíjového karcinomu, linie ATCC CCL 2.2), buněčné linie K562 (UCSF Cell Culture Facility), buňky BJAB (buňky lidského lymfoblastoidu, UCSF Cell Culture Facility) a Colo 38 (buňky lidského šíjového karcinomu) se pěstují v mediu RPMI 1640 (Gibco) s přidanými 10 % fetálního ovčího séra inaktivovaného teplem při 65 °C po 30 minut. Buňky fibroblastu 143B (buňky lidského osteosarkomu, linie ATCC 8303), sé pěstují v mediu MEM Eagle's BBS (UCSF Cell Culture Facility), s přidanými 10 % fetálního ovčího séra inaktivovaného teplem při 65 °C po 30 minut.

Složeni oligonukleotidů

Fosfordiesterový oligonukleotid A složený z 19 nukleotidů byl navržen tak, aby se pároval s bázemi řetězce mRNA podle Watsonově-Crickově pérovacím mechanismu DR A strukturního genu počínajícího 13 nukleotidy proti proudu (5')od překládajícího iniciačního kodonu (AUG)

A: 5' GCC ATT TTC TTC TTG GGC G 3' a byl objednán od UCSF Biomolecular Resource Facility. Dva kontrolní fosfordiesterové oligonukleotidy (AI a A2) složené z náhodné sekvence se stejným složením baží jako shora, která by se však nevázala k DR mRNA se také objednaly od Resource Facility.

AI: 5' TTG CCA GAC TAT TGT CCC A 3'

A2: 5' TAT CGG CTT TGT TGC CCG T 3'

Oligonukleotidy tvořící triplex (TFO) byly navrženy tak, aby se shodovaly s HLA DR A X- a X₂-blokem promotéru. T , T₂C a T_? byly objednány od American Synthesis, lne. Τ_χ, T^C a T_? byly navrženy podle vzorce ukázaného na Obrázku 1. T byl navržen tak, aby C se shodoval s každým párem GC baží v duplexu a T se shodoval s každým párem AT. Τ_χ a T₂ byly modifikovány 3' aminoskupinou, aby se zvýšila stabilita. T^C je stejný jako T₂, avšak není modifikován. T_? byl navržen jako kontrolní oligonukleotid se stejným celkovým složením nukleotidů jako T₂ a T₂C, avšak jeho sekvence byla změněna, aby měla méně triplexových shod v X- a X₂~blocích:

T7: 5' TGT TGG TGT GGG TTG TGG TTG GTT GC 3'

AI a A2 jsou nemodifikované oligonukleotidové sekvence, které by netvořily triplexové struktury s promotéry.

TS1 je oligonukleotid s 26 nukleotidy sestávající z diosfordiesterové páteře a 3' koncem modifikovaným aminem. TS1 byl navržen jako antiparalelní ke ke kódujícímu svazku s maximálním počtem Hoogsteenových vazeb, které se mohou vytvořit mezi TS1 a cílovou sekvencí. Za fyziologických podmínek je zvýhodněna tvorba čistých triplexů GGC a TAT, což vede k triplexové šroubovnici s jedním svazkem DNA DR A genu na zbytkových polohách 5'-851 až 3'-876, jak jsou číslovány v Schamboeck A. aj. Nuc. Acíds Res. (1983) 11, 8663-8675.

TSl je jedinečný v tom, že se bude vázat buď paralelně nebo antiparalelně v důsledku palindromního charakteru duplexní DNA. DR A gen byl vybrán vzhledem k tomu, že je monomorfní mezi jednotlivci, což minimalizuje variabilitu genové sekvence, která normálně existuje v polymorfních genech. Metoda navržení TSl sekvence vyžadovala, aby se vybral C pro každé C nebo G cílové sekvence a T pro každé A nebo T. T a GT_cojni jsou kontrolní oligonukleotidy, které mají rovněž délku 26 nukleotidů a 3' konec modifikovaný aminem. Sekvence jsou níže porovnány se segmentem DR A intronu strukturního genu:

DR A:	5'	-GGG	GGT	GGG	GGT	GGG	GGT	GGG	GGA	GG	-3'
TSl:	3'	-GGG	GGT	GGG	GGT	GGG	GGT	GGG	GGA	GG	-5'
T : con	3'	-TTT	GTG	TTT	TGT	TTT	TTT	GTT	TTT	GG	-5'
GT :	3'	-GGT	GTG	TGT	GTG	TGT	GTG	TGG	GTG	TG	-5'

con

Oligonukleotidy byly objednány od Keystone Laboratories. Oligonukleotid A₃ je kontrolní oligonukleotid, který vykázal relativně menší schopnost inhibovat IFN-gama, zvýrazněný vyjádřením MHC-I v HeLa S3 buňkách. X na konci oligonukleotidu představuje 3' koncovou modifikaci aminem, dis26 kutovanou u T₂ oligonukleotidu. Sekvence A_g je následující:

A : 5'-TTG CCA GAC TAT TGT CCC A X 3'

Další použité oligonukleotidy jsou následující. Oligonukleotid CL_x byl navržen tak, aby byl protismyslový k ATG místu HLA-A2 mRNA. Oligonukleotid ANTI-B je navržen tak,aby byl identický s jedním svazkem KBF vazného místa ve zvýrazňující A oblasti MHC-I HLA-A2 promotoru. Oligonukleotid AB je zaměřen proti zvýrazňující B oblasti MHC-I A2 genu. ACAT je 18mer zaměřený proti CAAT bloku MHC-I A2 genu. ATCT je zaměřen proti MHC-I A2 ekvivalentu TATA bloku. Sekvence těchto oligonukleotidů byly objednány od Keystone Laboratories, Menlo Park, CA. Sekvence těchto oligonukleotidů jsou následující:

CL : X	5'	-AGG	GTT	CGG	GGC	GCC	ATG	ACG	GC X 3'
Anti-B:	5'	-CCG	AGC	CTT	GGG	GAT	TCC	CCA	ACT CC X
AB:	5'	-CCG	ACA	ccc	AAT	GGG	AGT	X 3
ACAT:	5'	-GGA	CAC	TGA	TTG	GCT	TCT	3'
ATCT:	5'	-TGC	GTG	CGG	ACT	TTA	GAA	X 3	-

Antičástice

Myší protilidský HLA-A, B, C, anti-beta2 mikroglogulin a kontrolní IgG₂b antičástice byly získány jako konjugáty s fluoresceinisothiokyanátem od Olympus, Lake Success, N. Y.. Myší anti-ICAM-1 a IgG_x antičástice byly získány jako konjugáty s fluoresceinisothiokyanátem od AMAC, Westbrook,

ME.

Přijímáni oligonukleotidu a přidáni gama interferonu

Oligonukleotidy se přidávaly do buněčného media jak je popsáno Orsonem aj. Nuc. Acids Res. (1991) 19, 3435-3441. Buňky se nejprve koncentrovaly na 2-6*10® buněk/ml a inkubovaly s různými oligonukleotidy o různých koncentracích (5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ) s mírným třepáním každých 30 minut po 2 hodiny. Buňky se pak zředily na 0.2*10® /ml, aby se optimalizoval jejich růst. V dni 1 anebo 2 se buňky opět koncentrovaly na 2-6*10® buněk/ml a inkubovaly s oligonukleotidem a zředily jako shora. Kde to bylo vhodné, přidával se gama interferon (IFN-gama, Collaborative Research, lne.) v dávce 200 jednotek /ml ve dnech 0, 2, 4 a 6, aby se dosáhlo vyjádření HLA-DR.

Detekce HLA na buněčném povrchu

Ve dnech 3 a 7 se buňky isolovaly a označily monoklonálními anti-HLA-DR antičásticemi konjugovanými s fluoresceinisothiokyanátem (FITC). HLA-DP se zjišťovala nepřímým značkováním s myšími monoklonálními anti-DP antičástice s následujícím ovčím protimyším FITC (Becton-Dickinson). Při zkoušce se použilo asi 0.l*10⁶ buněk. 10μ1 myší lgG₂~FITC sloužilo jako kontrola pozadí a 10μ1 monoklonální anti-DRFITC IgG^ se přidávalo, aby se zjistilo vyjádření HLA-DR na buněčném povrchu. Monoklonálními antičástice se inkubovaly s buňkami na ledu po 30 minut. Směs se pak promyla fyziologickým roztokem s fosfátovým ústojem a 0.1 % azidu sodného (PBS), matečný louh se po odstředění odstranil, koláč se znovu suspendoval v 150 ml PBS a 50 μΐ 0.05 % propidium jo28 didu. K stanovení vyjádření antigenu na buněčném povrchu se použila průtoková cytometrická analýza (FACScan-Becton- Dickinson). Podobný postup pomocí specifických monoklonálních anti-HLA-DP antičástic se použil k měření na vyjádření HLADP buněčném povrchu.

Nothernova hybridizace a isolace RNA

Asi 2*10⁶ buněk ošetřených oligonukleotidem se isolovalo ve dnech 3 a 7. Buňky se promyly studeným PBS a znovu se suspendovaly v 200 ml studeného lyzátového ústoje (0.5 % Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl). Jádra buněk se odstranila odstřeďováním při 15,000 ot./min. po 5 minut. Ke suspenzi se přidal stejný objem protein denaturujícího ústoje (10 mM EDTA, 450 mM NaCl, 7 M močovina, 10 mM Tris pH 7.4, 1 % SDS). Vzniklý roztok se extrahoval stejnými objemy fenol/chloroforrau a vodní fáze se přenesla do 0.1 objemu 3 M acetátu sodného (pH 5.2 a 2 objemů 100 % alkoholu. Roztok se přes noc přechovával při -20 °C. Matečný louh se po odstředění odstranil a koláč se promyl 1 ml 70 % ethanolu. RNA rozpustila v 50 μΐ TE ústoje 10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA). Koncentrace RNA byla ověřena optickou hustotou při 260 nm (OD 260).

Plasmid obsahující DR A gen (DR A PBS M13) byl získán od Larse Karlssona z Scripps Research Institute a linearizován inkubací s EcoRI. Polymeráza T3 RNA se přidala spolu s ATP, CTP, GTP a digoxinem spojeným UTP, aby se syntetizovaly vzorky DR A RNA. Vzniklé vzorky protismyslové DR A RNA

se použily k detekci smyslové DR A mRNA. Podobný postup se použil k přípravě kontrolního vzorku protismyslového beta aktin RNA.

až 10 μΐ připraveného RNA extraktu se dělilo na 1.2 % formaldehyd agarózovém gelu spolu se značkovači rozměrů RNA (Pharmacia nebo Gibco BRL) při 125 voltech po 5-6hodin. Separovaná RNA v gelu se přes noc vyvolávala na nylonovém papíru a pekla při 80 °C po 2 hodiny. Papír se pak vložil do předhybridizačního roztoku (Genius protocol) a hybridizoval se vzorkem protismyslové DR A RNA (1 μΐ/ ml) a vzorkem protismyslového beta aktin RNA (0.5 μΐ/ ml) asi po 48 hodin. 0.05 % propidium jodidu. K stanovení vyjádření antigenu na buněčném povrchu se použila průtoková cytometrická analýza (FACScan-Becton- Dickinson). Podobný postup pomocí specifických monoklonálních anti-HLA-DP antičástic se použil k měření na vyjádření HLA- DP buněčném povrchu. Monoklonální antičástice spojené anti-digoxinem s alkalickou fosfatázou se přidaly na vyvolaný papír s následujícím Lumi-Phos 530 (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). Lumi-Phos světelná emise byla detekována autoradiografií.

Pokusná ochrana RNázy ³²P-ribovzorky se vytvořily pomocí soupravy MaxiScript pro transkripci in vitro (Ambion, Austin TX) a alfa ³²P-UTP (NEN Dupont, Boston MA). Analýzy RNA se prováděly pomocí soupravy pro ochranu RNázy (Ambion, Austin TX). 0.16-1.77 kb

RNA kmen (Gibco, Grand Island, NY) se defosforyloval pomocí ovčí střevní alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). ³²P-značený s gama ³²P-ATP (NEN Dupont, Boston MA) a použily jako značkovače molekulární váhy v pokusech s ochranou RNázy. RNA izolovaná z HeLa S3 se hybridizovala k T3 polymeráze vytvořené ³²P-vzorkem protismyslové RNA k 1.2 kb vzorku fragmentu HLA DR A genu (stejný fragment se použil v Nothernovš analýze) chráněného od rozkladu RNázou hybridizací k HLA DR A mRNA. Po oddělení se elektroforézoval na denaturujícím 7 % polyarylamidovém gelu. Každý vzorek RNA z HeLa S3 se současně hybridizoval k T3 polymeráze vytvořené ³²P-ribovzorkem protismyslovým ke glyceraldehyd-3- fosfát dehydrogenázovému (GPD) transkriptu (0.14 kb). Hybridizace se vzorkem GPD se užívala ke srovnání množství počáteční celkové RNA ve vzorcích analýzovaných ochrannou RNázou.

Detekce ICAM-1

Přítomnost míst ICAM-1 v buňkách se zjišťovala následovně. Z každé zkumavky se odebraly v různých dobách vzorky obsahující 0.1 ml buněk a reagentů a označily pro průtokovou cytometrii pomocí anti-ICAM-1 antičástic. Suspenze buněk se jednou promyla 0.75 ml fyziologického roztoku s fosfátovým ústojem obsahujícím 2 % fetálního ovčího séra a 0.1 % azidu sodného (PBS). Konjugát antičástic (10 ^g) se přidal a směs se míchala. Buňky se inkubovaly 30 minut na ledu v temnu, dvakrát promyly 0.75 ml PBS óbsahujícím 0.1 % azidu sodného, aby se odstranily nenavázané antičástice a a znovu se suspendovaly v 0.1 ml PBS obsahujícím 0.1 % azidu sodného. Při31 dal se propidium jodid, aby se z analýzy vyloučily mrtvé buňky. Průměrný počet míst ICAM-1 se určoval nejprve stanovením poměru fluorescence k antičásticím (F/P) pro antičástice ICAM-1 a jejich protějšků IgG^ na jednoduchých buněčných perlách (Flow Cytometry Standards Corporation, Research Triangle, N. C.) obsahujících stanovený počet ovčích protímyších míst. Průtokový cytometr se kalibroval QuickCal perlami (Flow Cytometry Standards Corporation, Research Triangle, N. C.). Kalibrační křivka se použila spolu s poměrem F/P pro zjišťování průměrného počtu míst ICAM-1 podle průměrné fluorescence kanálů podle návodu výrobce.

Pokus s 2,3-dioxyqenázou

Indolamin 2,3-dioxygenáza (IDO) v buňkách se zjišťovala pomocí spektrofotometrie. IDO konvertuje tryptofan na kinurenin. Tryptofan se měřil při svém absorpčním maximu 280 nm, vlnové délce při které kinurenin významně neabsorbuje. Kinurenin se měřil při 360 nm, vlnové délce při které tryptofan významně neabsorbuje.

Přiklad 1

Byly navrženy dva oligonukleotidy (TFO) s 26 bázovými páry (bp) tvořícími triplex. Oligonukleotid Τ_χ byl navržen tak, aby C se shodoval s každým párem G-C baží a T se shodoval s každým párem A-T. Oligonukleotid T₂ byl navržen tak, aby C se shodoval s každým párem G-C baží a T se shodoval s každým párem A-T. Každý oligonukleotid byl modifikován 3' aminoskupinou, aby sé zvýšil poločas. V každém pokusu se s τ , T_a nebo Τ₇ preinkubovaly buňky HeLa nebo fibroblastu 143B po 2 hodiny před vystavením 200 jednotkám rekombinantního gama interferonu, které se přidaly ke kultuře v den 0 a v den 2. T a T_a se také přidávaly v den 1 a v den 2. Dosažení vyjádření DR se měřilo 3. den průtokovou cytometrií pomocí monoklonálních anti-DR antičástic, které se vážou na HLA antigeny třídy II na buněčném povrchu. Ačkoliv buňky kultivované s kontrolním TFO T_? vykazovaly normální indukci HLA-DR a DP antigenů, T inhibovala vyjádření DR a DP na 50 %, zatím co T₂ vykazoval 100 % inhibici jak DR tak DP při koncentraci 20 μΜ (Obr. 2-3, pouze data T₂). Při nižších dávkách T i T₂ vykazovaly inhibiční účinky odpovídající dávce.

Mechanismus těchto inhibičních účinků byl dále studován. Měřila se transkripce DR A genu Nothernovou skvrnovou analýzou (Obrázek 4), pomočí protismyslového RNA vzorku, který se specificky váže k smyslové mRNA. Při koncentraci 20 μΜ T₂ úplně potlačil vyjádření DR A mRNA měřenou 3. den. Toto potlačení bylo reversibilní s pokračujícím přidáváním gama interferonu ke kultuře, jak je ukázáno v 7. den.

Zatím co Τ_χ a T₂ byly schopné inhibovat vyjádření HLA DR a DP vyvolané gama interferonem, neměly žádný účinek na vyjádření konstituční DR. To se prokázalo stálým ošetřováním buněk BJAB (B lymfoblastoid) a Colo 38 (zhoubný melanom), které obě vyjadřují DP konstitučně, s 5-20 μΜ T anebo T₂ až do 7. dne. Nepozorovalo se žádné snížení vyjádření konsti33 tuční DR na buněčném povrchu.

Účinky T₂ se zdají být poněkud specifické pro promotorové sekvence, které jsou homologické s HLA-DR A (Obrázek 5). ICAM-1, adhezní molekuly, které jsou vyjádřeny konstitučně na HeLa buňkách, mohou být zvýšeny gama interferonem. T a T₂ inhibují toto zvýšení ICAM, ale nechává nedotčené vyjádření konstituční a nemá žádný účinek jak na konstituční tak neindukovatelné vyjádření HLA genů třídy I.

Přiklad 2

Shora uvedený postup se použil k testování protismyslového nukleotidu A a kontrolních AI a A2 s následujícími rozdíly. Colo 38 buňky se kultivovaly při O.laž 0.3* 10⁶ buněk/ ml a inkubovaly s různými oligonukleotidy při koncentracích 1-100 μΜ (přidávaných dvakrát denně, asi v 9 a 17 hodin), s předpokládaným úplným odstraněním před přidáním. Gama interferon (Collaborative Research, lne.) se přidával v dávce 200 jednotek /ml ve dnech 0, 2, aby se dosáhlo vyjádření DR A a buňky se sklízely průtokovou cytometrickou analýzu 3. den.

Výsledky jsou na obrázku 6. Obrázek 6(a) ukazuje, že gama interferonem ovlivněné buňky jsou specificky vázány na specifické DR antičástice. Obrázek 6(b) naznačuje, že zvýšené hladiny přidaného oligo A snižuji množství specificky vázané specifické antičástice, zvýznamněním snížení vyjádření DR A antigenů. Obrázek 6(c) ukazuje, že přidání kontrolních oligo AI nebo A2 nesnižuje vyjádření DR A antigenů.

Přiklad 3

Shora uvedený postup použitý pro oligonukleotidy Τ_χ a T₂ se sledoval k testování protismyslového nukleotidu TS1 a kontrolních T a GT s výjimkou následujících rozdílů.

corx con

Oligonukleotidy se přidávaly do media 3 dny v případě HeLa buněk a 5 dnů v případě jiných typů buněk. Gama interferon se přidával k HeLa a keratinocytním buňkám ve dnech 0, 2, 4 a 6. Ke Colo buňkám se nepřidával žádný gama interferon. TS1 se přidával denně v 20 μΜ typům buněk s výjimkou experimentu o vlivu dávky. V experimentu o vlivu dávky koncentrace TS1 se měnila od 0.1 do 40 μΜ.

Vliv dávky TS1 na HeLa buňky, jak je naznačen vázáním fluorescentní anti-DR monoklonální antičástice, je ukázán na obrázku 7. Obrázek 8 srovnává vliv dávky TS1 na HeLa buňky s kontrolním oligonukleotidem GT . Jak je ukázáno na obou obrázcích 7 i 8, TS1 při úrovních 5 μΜ a 10 μΜ inhibuje vyjádření DR antigenu víc než o padesát či devadesát procent.

Trvání účinku TS1 na inhibici vyjádření DR v HeLa buňkách ukazuje obrázek 9. HeLa buňky se vystavily 200 jednotkám gama interferonu ve dnech 0, 2, 4 a 6. 20 μΜ TS1 nebo ^GT<=o_n ^se přidávaly ve dnech 0, 1 a 2. Ve dnech 3 a 7 se buňky nechaly reagovat s raonoklonálními anti-DR antičásticemi s fluoresceinem a analyzovaly se průtokovou cytometrií. Obrázek 9 ukazuje, že TS1 úplně potlačuje povrchové vyjádření DR po 3 a 7 dnech. Účinky TS1 přetrvávají alespoň 4 dny po jeho odstranění z prostředí. Na rozdíl od T , kde buňky za35

Čínají resyntetizovat DR po odstranění oligonukleotidů, TS1 má déle trvající účinek.

Rovněž se zkoumal účinek TS1 na konstituční vyjádření DR na Colo buňkách. Výsledky vázání monoklonálních anti-DR antičástic s fluoresceinem na buňky vystavené TS1 nebo T_eon jsou ukázaný na obrázku 10. Obrázek 10 ukazuje data průtokové cytometrie, když buňky se ošetřily (vrchol B) a TS1 (vrchol A). Vrchol B se matematicky redukoval, aby jeho výška souhlasila s výškou pravého píku křivky A. Vrchol C je matematický výsledek odečtení redukovaného vrcholu B od vrcholu A. Obrázek 10b (procenta proti fluorescenci) je postupná integrace podél fluorescentní osy vrcholu C. Tento obrázek ukazuje, že TS1 snížil vyjádření DR antigenu na povrchu buněk u části buněk, která je představena stínovanou plochou. Tato stínovaná plocha představuje asi 20 % buněk, založeno na integrační křivce nižšího obrázku. TS1 má částečný účinek na konstituční vyjádření DR antigenu, avšak ošetření ještě nebylo optimalizováno.

Tiby se dále objasnil mechanismus účinku TS1, stanovila se úroveň DR A RNA v Colo buňkách neošetřených, ošetřených TS1 a ošetřených T . RNA se extrahovala a inkubovala se «3ΟΠ vzorkem 32P-DR. Vzorek se připravil z plasmidu obsahujícího DR A gen (DR A PBS M13), získaného od Larse Karlssona z Scripps Research Institute, a byl linearizován inkubací s EcoRI. Pokusná ochrana RNázy se popisovala dříve na straně

29.

Tabulka 1

Účinky TS1 na konstituční DR A RNA Pokusná ochrana RNázv

	CPM	% Kontrola
Neošetřeno	DR A	423	45
	G3PDH	930
20 μΜ TS1	DR A	158	22
	G3PDH	730
20 μΜ T oon	DR A	158	52
	G3PDH	303

Vzorek G3PDH (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza) se použil jako kontrola úrovní RNA nanesené na každý pás gelu. Když je RNA nanesená na každý pás nerovnoměrně, označené pásy pro každý vzorek lze vyjmout a spočítat. Normalizace na radioaktivitu G3PDH dovoluje hrubé porovnání DR A RNA. Tabulka 1 ukazuje, že když výsledky byly normalizované na G3PDH, 20 μΜ TS1 snížilo úroveň DR A RNA asi o 50 % ve srovnání s buňkami neošetřenými či ošetřenými Τ_οθ_η·

Křížová reaktivita TS1 s jinými geny gama interferonu (IFN-gama) se zjišťovala na HeLa buňkách.

Tabulka 2

Specifita TS1 - HeLa buňky

Střední posun kanálu (Experiment/Kontrola

DR_DP_ICAM_TŘÍDA I

Neošetřeno 00 54 111

IFN-gama

119

141

20 μΜ TS1	0 0	63	125
20 μΜ Kontrola	19 7	119	13
GT nebo T
cori con
Tabulka 2	ukazuje křížovou	reaktivitu TS1 s jinými
ny gama interferonu. TS1 úplně potlačuje	vyjádření DR i
indukované gama	interferonem. TS1	snižuje	potlačení ICAM

dukované gama interferonem na úroveň konstitučního vyjádřeni. Není známo, zda TS1 snižuje konstituční vyjádření stejně jako ICAM gen indukovaný gama interferonem. TS1 má velmi malý účinek TS1 na vyjádření HLA třídy I, jak konstituční tak indukované gama interferonem.

Rovněž se zjišťoval účinek TS1 na keratinocyty, typ normální” primární buňky, nikoliv nesmrtelné buněčné linie.

Tabulka 2

Účinek TS1 na keratinocyty
Střední posun kanálu	(Experiment/Kontrol
Neošetřeno	6
IFN-gama	31
20 μΜ TS1	0
20 μΜ T ‘ cori	11

Tabulka 2 ukazuje, že TS1 úplně potlačuje vyjádření DR antigenu indukované gama interferonem u keratinocytů. Τ^θ^ také ukazuje jakési potlačení.

Tyto výsledky v celku ukazují, že na rozdíl od starších studií s oligonukleotidem T_? ošetření TS1 inhibuje transkrici a vyjádření konstitučně syntetizovaných HLA-DR A antigenů. Navíc se zdá, že účinky TS1 trvají déle než u T .

Přiklad 4

Shora uvedený postup se sledoval k testování účinků protismyslových nukleotidů na indukci antigenů MHC třídy I gama interferonem. Buňky K562 se ošetřily 20 μΜ následujících oligonukleotidů po 2 hodiny před vystavením 200 jednotkám/ ml gama interferonu: ANTI-B, AB, ACAT, ATCT a T . Nové oligonukleotidy se přidaly po 24, 48, 72 a 92 hodinách po přidání gama interferonu a buňky se analyzovaly reakcí s antičásticemi a průtokovou cytometrií po 100 hodinách na přítomnost antigenů MHC třídy I. Výsledky, ukazuje obrázek 11. Všechny zkoušené protismyslové oligonukleotidy jsou schopné zabránit vzestupu MHC antigenů třídy I vyvolanému IFN-gama.

Přiklad 5

Předpokládá se, že blokační a protirakovinné účinky IFNgama jsou primárně zprostředkovány zavedením enzymu do katabolické cesty tryptofanu, indolamin 2,3 dioxygenázy (IDO). (Taylor a Feng, FASEB J., 5, 2516 (1991). Indukce IFN-gama a IDO se pozorovala u odvržených rakovinných alloštěpů, což svědčí o tom, že aktivace katabolické cesty může být jedním z faktorů ovlivňujících ódvrhování štěpů. (Takikava aj., J.

Immun. 145., 1246 (1990).

Shora uvedený postup se použil pro zkoumání účinku oligonukleotidů T indukci IDO vyvolanou IFN-gama. Při 0, 24, a 48 hodinách HeLa buňky inkubovaly po 2 hodiny při 37 °C s 25 μΜ jednoho z oligonukleotidů T₂ nebo A₃ (kontrola) a stimulovaly 500 jednotkami/ ml gama interferonu. Odebraly se dva stejné podíly, obsahující 5*10⁴ buněk. Jeden se přenesl do Hankova vyváženého roztoku soli (HBSS), druhý do HBSS obsahujícího 50 μΜ tryptofanu (Sigma, St. Louis, MO). Měření A_2ao a A_3eo se prováděla z kapalin obou vzorků.

Obrázek 12 je graf ukazující účinek T₂ a A₃ na zvýšenou degradaci tryptofanu vyvolanou IFN-gama. Jak lze vidět z výsledků, T , nikoliv však A₃, inhiboval zvýšenou rychlost degradace tryptofanu, indukovanou gama interferonem.

IDO konvertuje tryptofan na kinurenin. Výsledky na obrázku 13 potvrzují snížení tryptofanu doprovázené zvýšením materiálu, který absorbuje při 360 nm, vlnové délce při které absorbuje kinurenin. Obrázek 13 je graf ukazující účinek oligonukleotidů T_a a A₃ na produkci kynureninu. Jak lze vidět z výsledků, T , nikoliv však A₃, inhiboval zvýšenou rych lost produkce kinureninu, indukovanou gama interferonem.

Přiklad 6

Shora uvedený postup se použil pro zkoumání účinku T₂ na HLA třídy I indukované IFN-alfa, IFN-beta a IFN-gama.

Buňky se inkubovaly s interferony označenými na obrázku 14 s 25 μΜ T₂ nebo bez oligonukleotidů (kontrola). Množství an40 tigenů HLA třídy I se zjišťovalo tříděním buněk po reakci s dvěma antičásticemi, jednou zaměřenou na těžký řetězec, druhou zaměřenou na beta-2 mikroglogulin. Jak lze vidět z výsledků ukázaných na obrázku 14 ve sloupcovém grafu, T₂ inhiboval indukci vyvolanou IFN-gama, neinhiboval však indukci vyvolanou IFN-alfa či IFN-beta. Na obrázku 14 MSC je střední posun kanálu a rozdíl od buněk, které se neinkubovaly s interferonem je vynesen na ose y.

Přiklad 7

Následující pokus ukazuje, že T₂ zabraňuje indukci myších MHC třídy II vyvolanou IFN-gama.

Bylo ukázáno, že promotérové oblast myší MHC vykazuje vysoký stupeň shody se svým lidským protějškem. Aby se prozkoumal účinek T₂ na vyjádření molekuly myší MHC třídy II, použili jsme myelomonocytické buněčné linie WEHI-3. Tato linie, vzniklá od BALB/c myš (H-2') vyjadřuje molekuly MHC třídy II (A^ů, E^) při velmi nízkých úrovních (4 %). Avšak obě Ad i Ed molekuly mohou být vyjádřeny na těchto buňkách po 72 hodinovém ošetření s gama interferonem. V důsledku toho gama interferonem zprostředkované vyjádření MHC třídy II na WEHI-3 obnovuje kapacitu těchto buněk stimulovat množení T buněk omezené třídou II antigenně specifickým způsobem. WEHI-3 nejprve inkubovaly s oligonukleotidem T (konečné koncentrace 25, 50 100 μΜ) po 2 hodiny, pak se kultivovaly v přítomnosti gama interferonu (100 jednotek/ ml) po 48 hodin. MHC třídy II Ad a Ed vyjádřená na buněčném povrchu se zjišťovaly průtokovou cytometrickou analýzou (FACS) pomocí přímého značení s anti-MHC třídy II monoklonálními antičásticemi (I-Ed). Obrázek 15 je sloupcový graf, který ukazuje účinek T_a na IFN-gama indukované MHC-II ve WEHI-3 buňkách. Výsledky jsou ukázány jako střední posun kanálu odpovídající: počet kanálů pro anti-I-Ed mAB, počet kanálů pro kontrolní IgG2 mAB. Jak lze vidět z výsledků na obrázku 15, T_, úplně rušil myší MHC třídy II indukovanou gama interferonem na buněčné linii WEHI-3 (95 % redukce).

Přiklad 8

Shora bylo shora ukázáno, že oligonukleotid (T2) navržený, aby tvořil triplex s promotérovou oblastí lidského histokompatibilního komplexu (HLA), zabraňuje indukci HLA třídy II (DR) na buněčném povrchu působenou gama interferonem na buněčném povrchu různých buněk (HeLa, fibroblastů, keratinocytů). Byl studován účinek T2 na povrchové vyjádření jiných imunitních receptorů vyvolané gama interferonem.

HeLa buňky inkubovaly po 2 hodiny s 20 μΜ oligonukleotidu T₂ nebo s kontrolním oligonukleotidem AI či se samotným mediem. Pak se buňky kultivovaly po různou dobu v přítomnosti gama interferonu (50 jednotek/ ml, obrázek 16A) nebo faktoru tumorové nekrózy (TNF) (150 jednotek/ ml, obrázek 16B). Po tomto kroku se buňky označily FITC značkovaným anti-ICAM-1 a analyzovaly cytometrií (FACS). Výsledky jsou ukázány jako střední posun kanálu odpovídající: počet kanálů pro anti-I-Ed mAB, počet kanálů pro kontrolní IgG2 mAB.

Jak lze vidět z výsledků na obrázku 15, došlo k úplnému potlačení vyjádření adhezní molekuly ICAM-1 indukované gama interferonem. Avšak, jak lze vidět na obrázku 15, T_. neměl žádný účinek na vyjádření ICAM-1 na buněčném povrchu těchto lidských buněk indukované alfa interferonem. V jiných studiích se nezjistil žádný účinek na vyjádření ICAM-1 na buněčném povrchu buněk indukované IL-1 a IL-4. Tedy uzavíráme, že oligonukleotid je specifický pro funkce zprostředkované gama interferonem.

Přiklad 9

Tento příklad ilustruje, že T₂ inhibuje proliferaci T buněk a produkci IL-2 zabráněním projevení se antigenů pomocí pomocných buněk.

a) T2 blokuje proliferaci T buněk zprostředkovanou anti

CD-3 zabráněním projeveni se Fc receptorů na monocytech

Bylo studováno, zda budou T2 potlačeny jiné imunitních receptorů vyvolané gama interferonem nebo zda ten bude mít vliv na odpověď lidských T buněk. Zejména se studoval 1) vliv T2 na projevení se Fc receptorů na lidských monocytech vyvolané gama interferonem a 2) schopnost monocytů ošetřených T2 plnit své pomocné funkce, jako je podpora proliferace lidských T buněk zprostředkované anti CD-3.

Je dobře známo, že proliferaci lidských T buněk lze stimulovat inkubací s monoklonálními antičásticemi (mAB) zaměřenými na CD3 komplex (OTK3). Aby se zprostředkoval tento účinek, anti-CD3 mAB se musí nejprve vázat svou Fc částí na Fc receptory (FcR) monocytů, aby stimulovaly vylučování IL-1 těmito buňkami a aby se TCR/CD3 komplexy připojily na T lymfocyty. Oba signály (IL-1 a agregace TCR/CD3) jsou nezbytné pro spuštění proliferaci T buněk a produkci IL-2. Gama interferon reguluje vyjádření FcR na lidských monocytech. Indukce FcR na monocytech zprostředkovaná gama interferonem obnovuje proliferaci T buněk zprostředkovanou IgGl anti-CD3 (Leu-4, UCHT-1) u nevnímávých jednotlivců a rovněž zesiluje mitogenezi T buněk zprostředkovanou IgG2 anti-CD3 (OKT3) (G. Benicou aj., Eur. J. Immunol., (1987) 17,1175-1181.

Ve studii, jejíž výsledky jsou ukázané na obrázku 17, lidské monocyty se čistily adherencí z lidských periferálních mononukleárních krevních buněk (PBMC). Ty se nejprve inkubovaly v přítomnosti oligonukleotidu T₂ při různých konečných koncentracích od 5 do 50 μΜ, nebo bez oligonukleotidu (čerchovaná čára). Pak se buňky promyly a 48 hodin se kultivovaly v přítomnosti různých koncentrací gama interfeΛ ronu. Po tomto kroku se mononukleárni buňky kultivovaly spolu s syngeneickými periferálními T lymfocyty v přítomnosti anti-CD3 monoklonálních antičástic (OTK3) v kultivačních mísách s 96 jamkami po 4 dny. Proliferace stimulované antigeny se zjišťovala zavedením 1 mCi (³H)-thymidinu během posledních 18 hodin kultury. Výsledky jsou vyjádřeny jako impulsy za minutu (CPM), získané s buňkami stimulovanými in vitro anti-CD3 mAB.

Výsledky studie ukazují, že 1) T2 úplně potlačil (100 % inhibice) projevení se Fc receptorů na povrchu monocytů vyvolané gama interferonem a 2) nepřítomnost lidských monocytů s FcR neschopných podporovat proliferaci lidských T lymfocytů zprostředkovanou anti OKT-3 (obrázek 17). a) T2 inhibuje produkci IL-2 vyvolanou antigenem hybridomú myších T buněk

Studovala se inhibice MHC třídy II vyvolaného gama interferonem na myších buňkách podle projevení se antigenů při aktivaci T buněk. T lymfocyty rozeznávají antigen ve formě peptidu projeveného ve spojení s vlastními MHC molekulami na na povrchu buněk vyjadřujících antigen (APC). Po imunizaci, CD4+ pomocné buňky iniciují imunitní odpověď tak, že jejich receptor antigenů (TRC) reaguje s biomolekulárním komplexem tvořeným MHC třídy II a peptidovým antigenem. Rozeznání antigenu T buňkami spouští jejich proliferaci a sekreci interleukinu-2. Zde jsme zkoušeli, zda oligonukleotid T2 by ovlivnil projevení se antigenu klonovaným APC, WEHI3. WEHI3 je myelomonocytická 'buněčná linie, která vyjadřuje MHC II při velmi nízkých úrovních (4 %), avšak vyjádření lze zvýšit až na 90 % po ošetření s gama interferonem. Ukázali jsme, že vyjádření MHC třídy II (A^d, Ε^Λ) na WEHI-3 gama interferonem lze blokovat pomocí T2 (konečná koncentrace 20 μΜ). Aby se měřil účinek na T aktivaci, použili jsme hybridomú T buněk, 1E1 specifického pro lambda represorový peptid 12-24 projevující se ve spojení s molekulou myší MHC třídy II, E^d. Po preinkubaci s gama interferonem WEHI3 vyjadřuje vysoké úrovně povrchových Ed molekul a presentuje účinně peptid na hybridomu T buněk 1E1. Oligonukleotid T2 potlačil projevení se antigenních funkcí na WEHI3 tím, že zabránil in vitro produkci interleukinu-2 (IL-2) z CD4+ restriktovaného hybridomu T buněk třídy II (1E1) na svůj specifický antigen, lambda represorovy peptid 12-24 (obrázek 18).

Ve studii pro obrázek 18 se použilo l*10^s (1E1) hybridomních buněk specifických pro lambda represorový peptid 12-24. Kultivovaly se spolu s buňkami lymfomu A20 (A^a, E^) (10^s buněk) jako APC kontrolou nebo s WEHI-3 myelomonocytickou buněčnou linií ošetřenou gama interferonem (100 μΜ/ ml) v přítomnosti oligonukleotidů T2 nebo v čistém mediu. Relevantní peptid se přidával k kultuře v různých koncentracích. Kultivační mísy s 96 jamkami se odstředily a matečný louh kultury (100 ml) se odsál a přenesl se na nový mikrotitrační podnos, který se zmrazil a roztál před pokusem s produkcí interleukinu-2 (IL-2). IL-2 se určoval zavedením (³H)- thymidinu do buněčné linie závislé na IL-2, HT2. V krátkosti, 0.04 matečný louh kultury se dále inkuboval s 10⁴ HT-2 po 24 hodin v celkovém objemu 0.2 ml HL-1 media. Zavedení 1 mCi (³H)-thymidinu se zkoušelo během posledních 4 hodin kultury.

Výsledky studie ukazují, že oligonukleotid T2 může potlačit jak v lidských tak myších systémech projevení se různých receptorů na povrchu monocytů vyvolané gama interferonem, nikoliv však jinými lymfokiny. Tyto výsledky to uka46 zují na odstranění schopnosti myší buněčná linie projevovat antigen a podporovat in vitro proliferaci antigenně specifických T buněk.

Claims (33)

1. Způsob přípravy buněk zbavených transplantačních antigenů z cílových buněk vyznačený tím, že se získají cílové buňky a pak se cílové buňky vystaví oligonukleotidu schopnému se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenů, přičemž řečený oligonukleotid je přítomný v množství dostatečném, aby se cílové buňky přeměnily na buňky zbavené transplantačních antigenů.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že oligonukleotid je schopný se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenů Watsonovou-Crickovou vazbou nebo triplexovou vazbou.

3. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že nukleotidová sekvence transplantačního antigenů je genová sekvence ICAM nebo MHC genová sekvence třídy I nebo MHC genová sekvence třídy

II.

4. Způsob podle nároku 3 vyznačený tím, že MHC genová sekvence třídy II je lokalizována na místě DR A, DP nebo DQ.

5. Způsob podle nároku 4 vyznačený tím, že MHC genová sekvence třídy II je lokalizována na místě DR A.

6. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že oligonukleotid obsahuje sekvenci

5' GCC ATT TTC TTC TTG GGC G 3' nebo její fragmenty, které si zachovávají vazebnou schopnost.

7. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že nukleotidová sekvence transplantačního antigenu je promotérové sekvence nebo sekvence strukturního genu.

8. Způsob podle nároku 7 vyznačený tím, že nukleotidová sekvence transplantačního antigenu je DR A promotérové sekvence nebo DR A sekvence strukturního genu.

9. Způsob podle nároku 8 vyznačený tím, že DR A promotérova sekvence obsahuje X-blok nebo X₂-blok.

10. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že oligonukleotid obsahuje sekvenci

5' GCG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GT 3' nebo její fragmenty, které si zachovávají vazebnou schopnost .

11. Způsob podle nároku 7 vyznačený tím, že oligonukleotid. obsahuje sekvenci

5' GGT GGG GGT GGG GGT GGG GGT GGG GG 3' nebo její fragmenty, které si zachovávají vazebnou schopnost .

12. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že cílové buňky jsou vybrány ze skupiny sestávající z výstelkových buněk rohovky, buněk štítné žlázy, parathyroidních buněk, mozkových buněk, buněk nadlevinek, buněk morku kostí, buněk pankreatických ostrůvků a jaterních buněk.

13. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že nukleotidová sekvence transplantačního antigenu je genová sekvence ICAM.

14. Buňky zbavené transplantačních antigenů vyrobené způsobem zahrnujícím (a) získání cílových buněk a (b) vystavení cílových buněk oligonukleotidu schopnému se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenů, přičemž řečený oligonukleotid je přítomný v množství dostatečném, aby se cílové buňky přeměnily na buňky zbavené transplantační ch antigenů.

15. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 14 vyznačené tím, že v nich oligonukleotid je schopný se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenů Watsonovou- Crickovou vazbou nebo triplexovou vazbou.

16. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 15 vyznačené tím, že jejich nukleotidová sekvence transplantačního antigenů je genová sekvence ICAM nebo MHC genová sekvence třídy I nebo MHC genová sekvence třídy II.

17. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 16 vyznačené tím, že jejich MHC genová sekvence třídy II je lokalizována na místě DR A, DP nebo DQ.

18. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 17 vyznačené tím, že jejich MHC genová sekvence třídy II je lokalizována na místě DR A.

19. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 15 vyznačené tím, že jejich nukleotidová sekvence transplantačního antigenů je promotérové sekvence nebo sekvence strukturního genu.

20. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 19 vyznačené tím, že jejich sekvence strukturního genu DR A sekvence strukturního genu nebo promotérova sekvence je DR

A promotérové sekvence.

21. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 20 vyznačené tím, že jejich DR A sekvence strukturního genu obsahuje X-blok nebo X₂-blok.

22. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 21 nebo nároku 14 vyznačené tím, že oligonukleotid obsahuje sekvenci

5' GCG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GT 3' nebo sekvenci

5' GGT GGG GGT GGG GGT GGG GGT GGG GG 3' nebo jejich fragmenty, které si zachovávají vazebnou schopnost.

23. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 14 vyznačené tím, že jejich cílové buňky jsou vybrány ze skupi-. ny sestávající z výstelkových buněk rohovky, buněk štítné žlázy, parathyroidních buněk, mozkových buněk, buněk nadlevinek, buněk morku kostí, buněk pankreatických ostrůvků a jaterních buněk.

24. Buňky zbavené transplantačních antigenů podle nároku 14 vyznačené tím, že jejich nukleotidová sekvence transplantačního antigenů je genová sekvence ICAM.

25. Oligonukleotid schopný se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenů Watsonovou-Crickovou vazbou nebo triplexovou vazbou.

26. Oligonukleotid podle nároku 25 vyznačený tím, že jeho nukleotidová sekvence transplantačního antigenů je MHC genová sekvence třídy II.

27. Oligonukleotid podle nároku 26 vyznačený tím, že jeho MHC genová sekvence třídy II je lokalizována na místě DR A, DP nebo DQ.

28. Oligonukleotid podle nároku 27 vyznačený tím, že jeho MHC genová sekvence třídy II je je DR A promotérové sekvence nebo DR A sekvence strukturního genu.

29. Oligonukleotid podle nároku 28 vyznačený tím, že jeho DR A promotérové sekvence obsahuje X-blok nebo X^-blok.

30. Oligonukleotid podle nároku 29 vyznačený tím, že jeho oligonukleotid obsahuje sekvenci

5' GCG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GT 3' nebo sekvenci

5' GGT GGG GGT GGG GGT GGG GGT GGG GG 3' nebo jejich fragmenty, které si zachovávají vazebnou schopnost.

31. Oligonukleotid použitelný k přípravě směsi pro ošetřeni cílových buněk, aby se zbavily transplantačních antigenů vyznačený tím, že tento oligonukleotid je schopný se vázat na část nukleotidové sekvence transplantačního antigenu.

32. Univerzální dárcovský orgán vyrobený způsobem zahrnujícím (a) získání cílových buněk a (b) vystavení cílových buněk oligonukleotidu schopnému se vázat na nukleotidovou sekvenci transplantačního antigenu, přičemž řečený oligonukleotid je přítomný v množství dostatečném, aby se cílové buňky přeměnily na buňky zbavené transplantačních antigenů.

33. Oligonukleotid pro použití při přípravě směsi pro léčení člověka trpícího chorobou autoimunity, projevující se disfunkční expresí transplantačního antigenu, vyznačený tím, že oligonukleotid je schopen se vázat na část nukleotidové sekvence transplantačního antigenu.