DE60038220T2

DE60038220T2 - Chimerische antisense-oligonukleotide und zelltransfektions-zusammensetzungen davon

Info

Publication number: DE60038220T2
Application number: DE60038220T
Authority: DE
Inventors: Michael A. Moraga INNIS; Christoph J. Alameda REINHARD; Ronald N. Berkeley ZUCKERMANN
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2020-08-26
Also published as: WO2001016306A2; DE60038220D1; ATE388226T1; EP1144609B1; JP2003508459A; AU7070800A; WO2001016306A3; ES2302699T3; JP4652648B2; PT1144609E; EP1144609A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antisense-Oligonucleotide und insbesondere auf chimäre Antisense-Oligonucleotide, die eine hohe Beständigkeit gegenüber Endo- und Exonucleasen aufweisen, eine hohe Sequenzspezifität und die Fähigkeit, RNAse H zu aktivieren aufweisen, wie es durch wirksames und lang anhaltendes Knockout von Target-mRNA bewiesen wird. Bereitgestellt werden auch Formulierungen der Oligonucleotide mit Trägermolekülen, welche eine effiziente Transfektion in Zellen bereitstellen.
Hintergrund der Erfindung
Die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden, um die Funktion von targetierten Genen spezifisch zu inhibieren, war aufgrund einer vielversprechenden Erwartung bezüglich einer selektiven antiviralen und Antikrebstherapie Gegenstand umfangreicher Forschungen. Viele Studien waren auf die Entwicklung von Oligonucleotidanaloga gerichtet, die eine optimale Kombination von Eigenschaften, einschließlich Stabilität (das heißt Beständigkeit gegenüber zellulären Nucleasen), zellulärer Aufnahme, DNA/RNA-Bindungsaffinität und -spezifität und Inhibierungseffizienz, haben. Da die Phosophodiester-Verknüpfungen von nativen Nucleinsäuren durch Endo- und Exonucleasen abgebaut werden, waren viele frühe Studien darauf gerichtet, Nuclease-resistente Analoga zu konzipieren. Phosphorothioate sind eine derartige Klasse von Verbindungen, die in vivo relativ stabil sind und die Fähigkeit, RNAse H zu aktivieren, der primäre Mechanismus, durch welchen Antisense-Oligonucleotide Ziel-RNA desaktivieren, beibehalten. Allerdings weist die Verwendung von Phosphorothioaten mehrere Nachteile auf, welche einen hohen Level an nichtspezifischer Bindung an andere zelluläre Komponenten beinhalten, was oft zu unerwünschten Nebenwirkungen führt und die Bindungsaffinität für RNA verringert.
Oligomere Ribonucleotide, die am 2'-Sauerstoff substituiert sind, zeigen hohe RNA-Bindungsaffinitäten und im Vergleich zu den unsubstituierten Ribonucleotiden eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber endogenen Nucleasen. Obgleich 2'-O-Methyl-substituierte Ribonucleotide eine größere Bindungsaffinität als solche mit größeren Substituenten (z. B. Ethyl, Propyl, Pentyl, Allyl) bereitstellen, wird beschrieben, dass die größeren Substituenten eine größere Exonuclease-Beständigkeit bereitstellen (siehe zum Beispiel Monia et al., J. Biol. Chem. 271(24): 14533, 1996). Arrow et al. ( US-Patent Nr. 5,849,902 ) stellt fest, dass „2'-O-Methylbasen mit Phosphodiester-Verknüpfungen durch Exonucleasen abgebaut werden und so zur Verwendung in Zell- oder therapeutischen Anwendungen von Antisense nicht geeignet sind". Phosphorothioat- und Phosphotriesterverknüpfungen werden durch die letztgenannte Gruppe als mit größter Stabilität empfohlen, auch wenn sie die Nachteile einer reduzierten Bindungsaffinität, einer schwierigeren Synthese (Phosphotriester) und/oder höheren Toxizität (Phosphorothioat) aufweisen.
Daher besteht noch ein Bedarf für Antisense-Oligonucleotid-Zusammensetzungen mit optimalen Kombinationen der Antisense-Aktivität, Zielbindungsaffinität, Biokompatibilität und Stabilität.
Zusammensetzung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst in einem Aspekt ein chimäres Oligonucleotid der Formel 5'-W-X¹-Y-X²-Z-3' mit der Fähigkeit, RNAse H zu aktivieren, wobei W ein 5'-O-Alklynucleotid, zum Beispiel 5'-O-Alkylthymidin, darstellt; jedes von X¹ und X² einen Block von sieben bis zwölf Phosphodiester-verknüpften 2'-O-Alkylribonucleotiden darstellt; Y einen Block von fünf bis zwölf Phosphorothioat-verknüpften Desoxyribonucleotiden darstellt; und Z eine Blockierungsgruppe, wirksam zur Blockierung der Nucleaseaktivität, am 3'-Ende des Oligonucleotids darstellt. In einer Ausführungsform ist Z ein 3-zu-3'-verknüpftes Nucleotid. In weiteren Ausführungsformen sind die Alkylgruppen des 5'-O-Alkylnucleotids und/oder der 2'-O-Alkylribonucleotide Methylgruppen. In weiteren Ausführungsformen sind Gruppen W und/oder Z mit X¹ bzw. X² über Phosphodiester-Verknüpfungen, Phosphotriester-Verknüpfungen, Phosphorothioat-Verknüpfungen oder Phosphoramidat-Verknüpfungen verknüpft. Vorzugsweise ist W über eine Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Verknüpfung verknüpft und ist Z über eine relativ Nuclease-resistente Verknüpfung, das heißt eine Phosphotriester-, Phosphorothioat- oder Phosphoramidat-Verknüpfung, verknüpft.
In spezifischen Ausführungsformen hat das Segment X¹-Y-X² des chimären Oligonucleotids eine Sequenz, die durch eine von SEQ ID NOs: 1–24, die hierin offenbart sind, dargestellt wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung bereit, welche ein Oligonucleotid, wie es oben beschrieben wurde, in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Vehikel ein Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugat oder „Lipitoid". Eine Klasse von Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugaten umfasst Verbindungen der Formel: L-Linker-[N(CH₂CH₂NH₂)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂)C=O]₃-NH₂, wobei die Lipidgruppe L eine von Fettsäure abgeleitete Gruppe ist, zum Beispiel eine Phospholipidgruppe (d. h. ROOCCH₂CH(COOR)CH₂OP(O)₂O-), die Fettalkyl- oder -alkenylketten mit einer Länge zwischen etwa 8 und 24 Kohlenstoffen hat, oder eine von Steroid abgeleitet Gruppe ist, zum Beispiel eine Cholesterylgruppe, und wobei der Teil des Moleküls rechts vom Linker das Peptoidsegment ist. In dem Peptoidsegment ist R ausgewählt aus Alkyl (verzweigtes oder unverzweigtes), Aminoalkyl und Aralkyl. Der Ausdruck „Aralkyl", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Alkylsubstituenten, vorzugsweise Niederalkyl, der außerdem mit einer Arylgruppe substituiert ist; ein Beispiel ist eine Benzylgruppe. Der Ausdruck „Aryl" bezieht sich auf einen substituierten oder unsubstituierten einwertigen aromatischen Rest, der einen einzelnen Ring (z. B. Benzol) oder zwei kondensierte Ringe (z. B. Naphthyl) hat. Dieser Ausdruck umfasst Heteroarylgruppen, welche aromatische Ringgruppen mit einem oder mehreren Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom(en) im Ring sind, zum Beispiel Furyl, Pyrrol, Pyridyl und Indol. Mit „substituiert" ist gemeint, dass ein oder mehrere Ringwasserstoffe in der Arylgruppe durch einen Substituenten, vorzugsweise ausgewählt aus einem Halogenid, einer Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppe, Halogenmethyl und Halogenethyl, ersetzt ist/sind.
In spezifischen Ausführungsformen ist R Isopropyl oder 4-Methoxyphenyl. Ein einzelnes Lipitoid kann verschiedene R-Gruppen umfassen oder sie können innerhalb des Moleküls dieselben sein.
Der Linker kann eine direkte Bindung sein oder er kann eine im Wesentlichen lineare Verknüpfungsgruppe, zum Beispiel ein Oligopeptid oder eine Alkylkette, mit wirksamer Länge sein. Der Linker kann auch eine Alkylkette sein, die eine oder mehrere Heteroatom-enthaltende Verknüpfung(en) hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ester, Amid, Carbonat, Carbamat, Disulfid, Peptid und Ether, und zwar entweder am Ende der Kette oder intervenierend zwischen Alkylbindungen. In ausgewählten Ausführungsformen hat der Linker eine Länge von 2 bis etwa 30 Atomen oder von 3 bis etwa 15 Atomen.
Nach einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Verwendung eines chimären Oligonucleotids der Erfindung, welches zum spezifischen Hybridisieren an die gesamte oder einen Teil einer ausgewählten Ziel-Nucleinsäuresequenz, die von dem Gen abgeleitet ist, wirksam ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Inhibieren der Expression des Zielgens in einem Subjekt bereit. In einer Ausführungsform ist die Ziel-Nucleinsäuresequenz eine mRNA, die von dem Zielgen abgeleitet ist. In spezifischen Ausführungsformen hat das Segment X¹-Y-X² des chimären Oligonucleotids eine Sequenz, dargestellt durch eine der SEQ ID NOs: 1–24, die hierin offenbart werden. In weiteren Ausführungsformen umfasst das Medikament ein Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugat, zum Beispiel das oben beschriebene.
Wie hierin gezeigt wird, stellten die chimären Oligonucleotide der Erfindung überraschenderweise hohe Stabilität und ein effizientes und lang anhaltendes Knockout von Ziel-mRNA bereit. Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden beim Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen vollständig verständlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung eines chimären Oligonucleotids nach einer Ausführungsform der Erfindung;
2 zeigt eine Auswahl von Phospholipid-Peptoid-Konjugaten („Lipitoide") und Cholesterin-Peptoid-Konjugaten („Cholesteroide"), die als Oligonucleotidträger in Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung einsetzbar sind;
3 zeigt die Wirkung auf den AKT1-mRNA-Level von Antisense-Oligos zu AKT1, abgegeben an HT1080-Zellen durch Effectene^TM, Lipoid 1 und Peptoid 1, und Kontrolloligos (AKT2-AS, AKT2-RC und AKT1-RC), abgegeben über Effectene^TM;
4 zeigt die Wirkung auf den AKT1-m-RNA-Level von Antisense-Oligos zu AKT1, abgegeben an Kolonkrebszellen (Lovo) in Verbindung mit: Lipitoid 1, zwei verschiedenen Beladungsverhältnissen von Lipitoid 2 (DMPE(NaeNiaNia)₃), zwei verschiedenen Beladungsverhältnissen von Cholesteroid 1 (Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)₃) und dem im Handel verfügbaren Transfektionsmittel Cytofectin^TM;
5–7 zeigen die Wirkungen einer Transfektion von Lovo-, Km12L4- und Colo320DM-Kolonkrebszellen mit chimären Oligonucleotiden der Erfindung in Verbindung mit verschiedenen Lipitoid- und Cholesteroid-Trägern auf die Zellproliferation; und
8 zeigt die Resultate von mehreren Zellviabilitätsassays an Km12L4- und HCT-166-Zellen, die mit Oligonucleotiden in Konjugation mit Lipitoiden 1 und 2, Cholesteroiden 1 und 3 und den im Handel verfügbaren Transfektionsmitteln Lipofectin^® und Cytofectin^TM transfiziert waren, wobei die weißen Bereiche die Level an gesunden Zellen anzeigen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Chimäre Antisense-Oligonucleotide
A. Struktur
Die chimären Oligonucleotide der Erfindung haben die unten gezeigte allgemeine Struktur: 5'-W-X¹-Y-X²-Z-3'
In dieser Struktur ist der zentrale Teil des Moleküls, der durch Y dargestellt wird, ein Block aus zwischen fünf und zwölf Phosphorothioat-verknüpften Desoxyribonucleotiden (Phosphorothioat-DNA oder PS-DNA). In einer Ausführungsform ist der Block Y wirksam, um RNAse H zu aktivieren, wenn er an einen ausreichend komplementären RNA-Strang hybridisiert, wodurch eine Spaltung der RNA begünstigt wird. Block Y ist von zwei Bindungsblöcken, dargestellt durch X¹ und X², flankiert, von denen jeder zwischen sieben und zwölf Phosphodiester-verknüpfte 2'-O-Alkylribonucleotid-Untereinheiten (Phosphodiester-2'-O-Alkyl-RNA oder PO-2'-O-Alkyl-RNA) hat. Der Ausdruck „Alkyl", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen vollständig gesättigten acyclischen monovalenten Rest, der Kohlenstoff und Wasserstoff enthält, der verzweigtkettig oder geradkettig sein kann; Beispiele für Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, n-Butyl, t-Butyl, n-Heptyl und Isopropyl. Der Ausdruck „Niederalkyl" bezieht sich auf einen Rest aus ein bis sechs Kohlenstoffatomen und vorzugsweise ein bis vier Kohlenstoffatomen.
Die Alkylgruppen der 2'-O-Alkylribonucleotid-Untereinheiten sind vorzugsweise Niederalkylgruppen. In einer Ausführungsform sind die Alkylgruppen Methylgruppen, die im Allgemeinen eine überlegene Bindung und zelluläre Aufnahme im Vergleich zu längeren Alkylgruppen bereitstellen. Die Bindungsblöcke stellen, obgleich sie nicht notwendigerweise wirksam sind, um an einer Aktivierung von RNAse H teilzunehmen, Bindungsaffinität für ausreichend komplementäre RNA-Stränge bereit und können auch im Vergleich zu Phosphorothioat-verknüpften Untereinheiten eine verringerte zelluläre Toxizität bereitstellen.
Blockierungsgruppen Z und W werden an den 3'- bzw. 5'-Termini bereitgestellt. In einer Ausführungsform sind die Gruppen W und Z durch Phosphodiester-Verknüpfungen an die entsprechenden X-Blöcke gebunden; in einer anderen Ausführungsform sind sie über Phosphorothioat-Verknüpfungen gebunden. Die 3'-Blockierungsgruppe Z ist vorzugsweise ein 3'-zu-3'-verknüpftes Nucleotid, obgleich dieses Ende auch durch andere Verfahren, z. B. durch Bindung des terminalen Nucleotids über eine relativ Nuclease-stabile Verknüpfung (z. B. Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphotriester) oder Anhängen einer Nicht-Nucleotid-Gruppierung blockiert werden kann.
Das 5'-Ende ist mit einer 5'-O-Alkylnucleotid-Untereinheit (W), worin Alkyl vorzugsweise Niederalkyl ist, blockiert. In einer Ausführungsform ist W ein 5'-O-Methylthymidin. Es wurde festgestellt, dass diese Blockierungsgruppe Stabilität gegenüber chimären Nucleotiden in Zellkultur und in Serum verleiht. Beispielsweise liegt die Dauer eines mRNA-Knockouts in Zellkulturen (wird weiter unten diskutiert) typischerweise im Bereich von 3–5 Tagen nach Transfektion. Es wurde festgestellt, dass diese Blockierungsgruppe und die 3'-zu-3'-Nucleotidblockierungsgruppe, außer dass sie Stabilität verleihen, die Aufnahme oder Verteilung der Oligonucleotide nicht stören.
Die chimären Oligonucleotide der Erfindung können unter Verwendung einer Lösungsphasen- oder vorzugsweise Testphasensynthese nach gut eingeführten Verfahren hergestellt werden. Die Synthese eines Beispiels für ein chimäres Oligonucleotid, zum Beispiel das in 1 gezeigte, wird in Beispiel 1 beschrieben.
B. Antisense-Aktivität
Chimäre Antisense-Oligonucleotide, die auf der obigen Formel basieren, die Sequenzen haben, die gegen AKT1 (SEQ ID NO: 1) oder AKT2 (SEQ ID NO: 2) gerichtet sind, wurden hergestellt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Oligonucleotide enthielten auch ein 5'-terminales 5'-O-Methylthymidin, wie es in der Formel oben angegeben ist. In diesen Oligonucleotiden waren X¹ und X² Sieben-Basen-Blöcke von 2'-O-Methyl-PO-RNA, Y war PS-DNA, Z war ein 3'-zu-3'-verknüpftes Nucleotid und W war ein 5'-O-Methylthymidin. Beide, Z und W, waren über Phosphodiesterverknüpfungen an die entsprechenden X-Blöcke gebunden. Wenn chimäre Antisense-Oligonucleotide der Erfindung, die verschiedene Sequenzen haben, (siehe Tabelle 1) in Fällen transfiziert wurden, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, zeigten sie in überraschender Weise einen wirksamen Abbau von endogener mRNA, was in einem Verlust der Aktivität der entsprechenden Gene resultierte. 5 und 6 zeigen Level an endogener AKT1-mRNA in Kolonkrebszellen bzw. in HT1080-Zellen, die mit anti-AKT1-chimären Oligonucleotiden (SEQ ID NO: 1) transfiziert waren. In ähnlicher Weise zeigte ein chimäres Antisense-Oligonucleotid, das gegen hCHK1 gerichtet war, (SEQ ID NO: 3), einen Abbau von endogener mRNA, den Verlust an chk1-Kinaseaktivität und den Verlust an chk1-Funktion (das heißt G2-Zellzyklus-Checkpoint-Kontrolle).
Weitere chimäre Oligonucleotide, die die in Tabelle 1 angegebenen Sequenzen haben, wurden hergestellt und an Zellen verabreicht, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. (Jedes Oligonucleotid enthielt ein 5'-O-Methylthymidin, wie es oben beschrieben ist, welches in den aufgelisteten Sequenzen nicht gezeigt ist). In diesen Oligonucleotiden sind, bezogen auf die obige Formel, X¹ und X² Sieben-Basen-Blöcke von 2'-O-Methyl-PO-RNA, Y ist ein Block von PS-DNA mit neun bis elf Basen, Z ist ein 3'-zu-3'-verknüpftes Nucleotid und W ist ein 5'-O-Methylthymidin. Beide, Z und W, sind über Phosphodiesterverknüpfungen verknüpft.
Mit Ausnahme des mTyr-Oligo (SEQ ID NO: 17–18), das in B16-Melanom-Zellen transfiziert wurde, wurden alle in Tabelle 1 gezeigten Oligos in HT1080-Zellen unter Verwendung von „Lipitoid 1" (siehe unten) zur Transfektion transfiziert und für 24 Stunden inkubiert. Die Tabelle gibt den ungefähren Level des mRNA-Knockouts an, der in jedem Fall beobachtet wurde. Eine Verringerung der mRNA-Level um 90% oder mehr wurde häufig beobachtet, wie es in der Tabelle gezeigt ist.
Tabelle 1
II. Transfektionsmittel
Es existieren eine Vielzahl von Strategien zur Abgabe von Nucleinsäurezusammensetzungen an Zellen. Virale Vektoren liefern eine relativ wirksame Abgabe, zeigen aber in einigen Fällen Sicherheitsprobleme infolge des Risikos immunologischer Komplikationen oder einer unerwünschten Vermehrung in dem Subjekt. Adenovirale Vektoren haben einige Vorteile dahingehend gezeigt, dass sie sich nicht in das Genom der Zelle einbauen und in ruhende Zellen transduziert werden können. Allerdings müssen alle diese Vektoren durch zeitaufwendige DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden. Oligonucleotide können auch über chemische Transfektionsmittel, die Gegenstand jüngerer umfangreicher Arbeiten waren, abgegeben werden. Diese Mittel umfassen polykationische Moleküle, zum Beispiel Polylysin und kationische Lipide. Die Liposomenzusammensetzung Lipofetin^® (Felgner et al., PNAS 84: 7413, 1987), die das kationische Lipid DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) und das neutrale Phospholipid DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) enthält, wird in großem Umfang verwendet. Es können ein beliebiges dieser Verfahren wie auch andere Verfahren, zum Beispiel Calciumphosphatvermittelte Transfektion, verwendet werden, um die Oligonucleotide der Erfindung nach beschriebenen Verfahren abzugeben.
Ein Abgabeverfahren involviert die Verwendung von Transfektionsmitteln, die als „Lipitoide" und „Cholesteroide" bekannt sind, die zum Beispiel in den PCT-Publikationen WO 98/06437 und WO 99/08711 der gleichen Anmelderin (Zuckermann et al.) beschrieben sind, die auf den US-Seriennummern 60/023,867, 60/054,743 und 09/132,808 basieren, welche hier durch Referenz aufgenommen werden. Diese Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugate werden in diesen Referenzen als wirksame Reagenzien für die Abgabe von Plasmid-DNA an Zellen in vitro beschrieben. Es wird hier gezeigt, dass solche Verbindungen effizient Oligonucleotide in einer Vielzahl von primären und Tumorzelllinien abgeben. Die Effizienz der Abgabe wurde durch Fluoreszenzanalyse von FITC-markierten Oligonucleotiden oder durch Überwachung der mRNA-Level nach Transfektion von chimären Antisense-Oligonucleotiden bestimmt, wie es weiter unten beschrieben wird.
Ein beliebiger der Träger, die in den oben genannten Anmeldungen beschrieben sind, ist für eine Verwendung bei der Transfektion der hierin beschriebenen Oligonucleotide geeignet. Ferner wird eine Offenbarung von Steroiden, die zum Einbau in Steroid-kationisches-Peptoid-Konjugate verwendbar sind, in der PCT-Publikation WO 97/46223 (Fasbender et al.) und dem korrespondierenden US-Patent Nr. 5,935,936 gefunden, welche hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Diese Verbindungen können durch herkömmliche Lösungs- oder Festphasensynthese hergestellt werden. In einem solchen Verfahren, wie es in Zuckermann et al. beschrieben wird, das oben zitiert wurde, wird der N-Terminus eines harzgebundenen Peptoids mit einem Spacer, zum Beispiel Fmoc-Aminohexansäure oder Fmoc-β-Alanin, acyliert. Nach Entfernung der Fmoc-Gruppe wird die primäre Aminogruppe mit Cholesterinchlorformiat unter Bildung einer Carbamatverknüpfung, zum Beispiel wie in den Cholesteroiden 2, 3 und 4 von 2 gezeigt, umgesetzt. Das Produkt wird dann mit Trichloressigsäure von dem Harz abgespalten und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Eine von Fettsäure abgeleitete Lipidgruppierung, zum Beispiel ein Phospholipid, kann anstelle der Steroidgruppierung verwendet werden, wie es auch in 2 gezeigt ist.
Die Steroid- oder andere Lipidgruppierung kann auch durch andere Verknüpfungen mit wirksamer Länge, die dem Fachmann leicht zur Verfügung stehen, an die Peptoidgruppierung gebunden sein. Der Linker ist eine Kette mit bis zu etwa 30 Bindungen in der Länge und bevorzugt bis zu etwa 15 Bindungen in der Länge, obgleich jede wirksame Länge verwendet werden kann. Die Kette ist typischerweise linear oder im Wesentlichen linear, obgleich verzweigte Ketten (einschließlich Oligopeptide) und Linker, die intervenierende cyclische Gruppen enthalten, auch verwendet werden können. Der Linker umfasst im Allgemeinen Alkyl-(C-C)-Bindungen und eine funktionelle Gruppe oder mehrere funktionelle Gruppen, zum Beispiel Ester-, Amid-, Carbonat-, Carbamat-, Disulfid-, Peptid- oder Etherbindungen. Der Linker kann mehrfach funktionelle Gruppen, zum Beispiel in einem Succinatester oder Polyether, umfassen oder er kann ein Oligopeptid, vorzugsweise ein 2-bis-10-mer und bevorzugter ein 2-bis-5-mer sein. Die Steroid- oder Lipidgruppierung und das Peptoidsegment können auch durch eine direkte Bindung verknüpft sein.
In bestimmten Ausführungsformen baut der Linker eine Bindung oder mehrere Bindungen ein, die unter geeigneten Bedingungen in vivo gegenüber einer Spaltung empfindlich sind; zum Beispiel hydrolysierbare Ester-, Carbonat-, Carbamat- oder Peptidbindungen; Disulfidbindungen, die in zellulären Kompartimenten mit ausreichend reduzierender Umgebung spaltbar sind; und Peptidbindungen, die durch endogene Peptidasen spaltbar sind. Was die letztgenannten angeht, so können auch Polypeptidlinker, die zehn oder weniger, oder in anderen Ausführungsformen fünf oder weniger Peptidbindungen haben, in Betracht gezogen werden, obgleich auch längere Linker verwendet werden können.

In bestimmten Ausführungsformen gehört das Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugat zu einer Klasse von Verbindungen mit der Formel: L-(CH₂)_n-(C=O)-[N(CH₂CH₂NH₂)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)]₃-NH₂, wobei L ausgewählt ist aus (i) einer Phosphatidylethanolamingruppe (d. h. ROOCCH₂CH(COOR)CH₂OP(O)₂O-CH₂CH₂NH₂-), die Fettalkyl- oder -alkenylketten mit einer Länge von zwischen 8 und 24 Kohlenstoffatomen hat, und (ii) einer Cholesterylgruppe, verknüpft mit dem angrenzenden -(CH₂)n-Segment durch eine Ester-, Amid- oder Carbamatbindung; n 1 bis 5 ist und R ausgewählt ist aus Isopropyl und 4-Methoxyphenyl. Repräsentative Strukturen dieser Klasse, die in 2 gezeigt sind, werden hierin durch die folgenden Bezeichnungen angegeben:

Lipitoid 1 oder L1	DMPE(NaeNmpeNmpe)₃
Lipitoid 2 oder L2	DMPE (NaeNiaNia)₃
Cholesteroid 1 oder Chol 1	Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)₃
Cholesteroid 2 oder Chol 2	Chol-Ahx-(NaeNmpeNmpe)₃
Cholesteroid 3 oder Chol 3	Chol-β-ala-(NaeNiaNia)₃
Cholesteroid 4 oder Chol 4	Chol-Ahx-(NaeNiaNia)₃

Der Ausdruck "Lipitoid", wie er hierin verwendet wird, kann allgemein verwendet werden, um sowohl Lipitoide als auch Cholesteroide anzugeben, außer er bezieht sich auf ein bestimmtes Lipitoid, zum Beispiel L1 oder L2 oben.
Um transfizierende Zusammensetzungen herzustellen, wird eine wässrige Lösung eines Peptoids, Lipitoids oder Cholesteroids mit dem Oligonucleotid formuliert, wie es in Beispiel 2A beschrieben ist. Die Komponenten werden vorzugsweise in solchen relativen Mengen verwendet, dass es mindestens zwei und vorzugsweise zwei bis vier positive Lipitoidladungen für jede negative DNA-Ladung gibt. Das exakte Verhältnis von Antisense-Oligonucleotid zu Lipitoid wird für jeden Zelltyp vorzugsweise empirisch bestimmt, liegt aber im Allgemeinen im Bereich von 1,5–2 nmol Lipitoid/μg Antisense-Oligonucleotid. Zellen können wie oben und in Beispiel 2B beschrieben transfiziert werden.
Das Ausmaß der Abgabe von FITC-markierten chimären Oligonucleotiden in humane Fibrosarkom (HT1080)-Zellen wurde durch Fluoreszenzanaylse beurteilt. (Alle in den anschließenden Studien verwendeten Oligonucleotide waren chimäre Oligonucleotide, wie es für die in Tabelle 1 angegeben Studien beschrieben wurde). Die Sequenz der Oligonucleotide war die reverse Kontrolle von PDK1 (SEQ ID NO: 25, die reverse Sequenz von SEQ ID NO: 23), so dass die Wirkung der Oligonucleotide auf die Zellen minimal würde. Die Oligonucleotide wurden durch Komplexierung mit (a) einem im Handel verfügbaren Transfektionsmittel, Effectene^TM, (b) dem Peptoid (NaeNmpeNmpe)₃ (Peptoid 1), (c) Lipitoid 1, in einem Beladungsverhältnis von Oligo zu Lipitoid von 1:4, und (d) Lipitoid 1, in einem Beladungsverhältnis 1:3, transfiziert. Im Vergleich zu Effectene^TM ergab Lipitoid 1 eine deutlich höhere Transfektionseffizienz und einen höheren Grad der nukleären Abgabe des Oligonucleotids, wie es durch eine Fluoreszenzanalyse der transfizierten Zellen bewiesen wurde. Das höhere Lipitoid/Oligo-Beladungsverhältnis (1:4; c) schien auch wirksamer zu sein als das Verhältnis 1:3.
3 zeigt die Verringerung von endogener AKT1-mRNA in HT1080-Zellen, die aus einer Transfektion eines chimären Antisense-Oligonucleotids zu AKT1, wie es oben beschrieben wurde (AKT1-AS), im Vergleich zu Kontrolloligonucleotiden AKT1-RC (RC = reverse Kontrolle; SEQ ID NO: 26; reverse Sequenz von SEQ ID NO: 1), AKT2-AS und AKT2-RC (SEQ ID NO: 27; reverse Sequenz von SEQ ID NO: 2) resultiert. Dieselben Oligos wurden auch durch kommerzielle Lipide (Effectene^TM) und Peptoide ((NaeNmpeNmpe)₃) abgegeben. Die in 3 gezeigten Resultate zeigen, dass L1-transfizierte AKT1-chimäre Antisense-Oligonucleotide die ausgeprägteste Verringerung beim Ziel-mRNA-Level ergaben.
Die Effizienz der Oligonucleotidabgabe durch Cholesteroide erwies sich als ähnlich der von (Nicht-Steroid-)Lipitoiden oder dieser überlegen. Wie in 4 gezeigt ist, erreichte zum Beispiel die Abgabe des chimären Anti-AKT1-Oligos, das oben beschrieben wurde, durch Cholesteroid 1 ein besseres AKT1-mRNA-Knockout als eine Abgabe durch Lipitoid 1 oder Lipitoid 2 in einer Kolonkrebszelllinie (Lovo).
Die Cholesteroide stellen den zusätzlichen Vorteil einer wesentlich reduzierten Toxizität für Zellen in vitro bereit. 5 zeigt einen 4-Tages-Proliferations-Assay, der wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt wurde, für Lovo-Kolonkrebszellen nach Transfektion von 50–300 nM Oligonucleotiden. (Wiederum wurden reverse Kontroll-PDK1-chimäre Oligonucleotide verwendet, von denen erwartet wird, dass sie nicht aktiv sind). Diese Diagramme beweisen die deutliche Zunahme bei der Proliferation und Lebensfähigkeit bzw. Viabilität der Lovo-Zellen nach einer Oligonucleotidtransfektion mit Cholesteroiden 2 und 3 (5B, D) im Vergleich mit einer Transfektion mit Lipitoiden 1 und 2 (5A, C). Dieser Effekt ist nicht auf diesen Zelltyp begrenzt und wurde auch in Proliferationsassays von Km12L4-Kolonkrebszellen (6) und Colo320DM-Kolonkrebszellen (7) beobachtet.
Um die verringerte Toxizität der Cholesteroide weiter zu untersuchen, wurde eine FACS-Analyse von Zellen nach der Transfektion (siehe Beispiel 4) durchgeführt, um die Anzahl an nekrotischen (PI+), früh apoptotischen (Annexin+), spät apoptotischen (Annexin+/PI+) und gesunden Zellen (Annexin-/PI-) zu bestimmen. Die weißen Spalten in 8 geben die Anzahl von gesunden Zellen wider, während gefärbte Teile der Balken (aus Gründen der Klarheit mit gestrichelten Segmenten abgetrennt) tote oder sterbende Zellen darstellen. Die Analyse wurde an Km12L4- (8A–B) und HCT116-Zellen (8C–D) durchgeführt. Der prozentuale Anteil an sterbenden Zellen wurde 4 Stunden (8A, C) oder 24 Stunden (8B, C) nach Transfektion bestimmt. Während verschiedene Zelltypen verschiedene Sensitivität gegenüber der Transfektion zeigen, enthielten Zellen, die mit Cholesteroiden transfiziert waren, konsistent die meisten gesunden Zellen und zeigten den niedrigsten Grad an Zelltod. Die niedrigere Toxizität wurde auch im Vergleich von Cholesteroiden mit den im Handel verfügbaren Lipiden Lipofectamine^® und Cytofetin^TM erkannt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sollen sie aber in keiner Weise beschränken.
Beispiel 1. Synthese von chimären poRNA-psDNA-poRNA-Oligucleotiden
Die chimären Oligonucleotiden wurden unter Verwendung einer Festphasensynthese nach etablierten Verfahren hergestellt. PerSpective Biosystems (Framingham, MA) 8909-Synthesizer und ein ABI 394-Synthesizer (ABI/Perkin-Elmer, Foster City, CA) wurden für die RNA-Additionen und die Phosphorothioat-verknüpften DNA-Additionen verwendet. Es ist auch möglich, die Synthese unter Verwendung nur eines Geräts mit acht Amiditreagensflaschen durchzuführen. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Reagensherstellung und die Synthese unter Anwendung der Standardprotokolle des Herstellers durchgeführt.
Die 5'-CPG-Trägersäule, 5'-O-Methyl-RNA-Phosphoramidite, 5'-O-Methyl-dT-CE-phosphoramidit und Schwefelungsreagens, 3H-1,2-Benzoedithiol-3-on-2,2-dioxid, wurden alle von Glen Research (Sterling, VA) erhalten.
Um eine repräsentative Synthese durchzuführen, wurden die letzten sieben Basen der gewünschten Sequenz in den 8909-Synthesizer eingegeben, ergänzt mit 2'-O-Methyl-RNA-phosphoramiditen, die geeignete 5'-CPG-Säule wurde angeschlossen und es wurde eine RNA-Synthese im 1 μmol-Maßstab mit endständigem DMT durchgeführt.
Dann wurde die Säule aus dem 8909 entfernt und an den ABI 394 angeschlossen. Das Schwefelungsagens wurde in Position 15 installiert (um das Oxidationsmittel zu ersetzen) und es wurde eine Synthese für den Phosphorothioat-Mittelabschnitt des Oligos durchgeführt, wobei das 1 μmol-Schwefelprogramm mit dem endständigen DMT verwendet wurde.
Die Säule wurde entfernt und wieder in den 8909 eingesetzt. Die letzten sieben 2'-O-Methyl-RNA-Basen wurden addiert, wobei ein μmol-RNA-Programm mit DMT verwendet wurde. Schließlich wurde der Kettenterminator 5'-O-Methyl-dT-CE (Cyanoethyl)-phosphoramidat zugegeben, wobei ein 1 μmol-DNA-Protokoll, modifiziert, um die Kopplungszeit auf 300 Sekunden auszudehnen, verwendet wurde. Das Oligonucleotid wurde vom Träger abgespalten, entschützt und unter Verwendung von Standardverfahren gelgereinigt.
Beispiel 2. Antisense-Inhibierung von Ziel-RNA
A. Herstellung eines Transkriptionsgemisches
Für jedes Transfektionsgemisch wurde ein Trägermolekül, vorzugsweise ein Lipitoid oder Cholesteroid, zu einer Arbeitskonzentration von 0,5 mM in Wasser präpariert, mit Ultraschall behandelt, um eine einheitliche Lösung zu erhalten, und durch eine 0,45 μm-PVDF-Membran filtriert. Das Antisense-Oligonucleotid wurde in sterilem Millipore-Wasser zu einer Arbeitskonzentration von 100 μM präpariert.
Das Oligonucleotid wurde in OptiMEM^TM (Gibco/BRL) in einem Mirkozentrifugenröhrchen auf 2 μM oder etwa 20 μg Oligo/ml OptiMEM^TM verdünnt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen wurde Lipitoid oder Cholesteroid, typischerweise in einer Menge von 1,5–2 nmol Lipitoid/μg Antisense-Oligonucleotid in demselben Volumen OptiMEM^TM, das zum Verdünnen des Oligonucleotids verwendet wurde, verdünnt. Das verdünnte Antisense-Oligonucleotid wurde unverzüglich zu dem verdünnten Lipitoid gegeben und es wurde durch Einpipettieren und Auspipettieren vermischt.
B. Transfektion
Zellen wurden auf Gewebekulturplatten einen Tag vor der Transfektion in Wachstumsmedium mit Serum plattiert, um eine Dichte bei Transfektion von 60–90% zu erhalten. Das Oligonucleotid/Lipitoid-Gemisch wurde unmittelbar nach dem Mischen zu einer Endkonzentration von 100–300 nM Antisense-Oligonucleotid zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden mit dem Transfektionsgemisch bei 37°C, 5% CO₂ für 4–24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Transfektionsgemisch entfernt und durch normales Wachstumsmedium mit Serum ersetzt.
Die gesamte RNA wurde unter Verwendung eines RNeasy^TM-Kits (Quiagen Corporation, Chatsworth, CA) nach Protokollen des Herstellers extrahiert.
C. Reverse Transkription
Die Konzentration an Ziel-mRNA wurde unter Verwendung der Roche LightCycler^TM-Echtzeit-PCR-Apparatur quantitativ bestimmt. Die Werte für die Ziel-mRNA wurden gegenüber einer inneren Kontrolle (zum Beispiel Beta-Actin) normalisiert.
Für jede 20 μl-Reaktion wurde extrahierte RNA (im Allgemeinen insgesamt 0,2–1 μg) in ein steriles 0,5- oder 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und es wurde Wasser zu einem Gesamtvolumen von 12,5 μl zugesetzt. Zu jedem Röhrchen wurden 7,5 μl eines Puffer/Enyzm-Gemisches gegeben, welches durch Mischen (in der angegebenen Reihenfolge) von 2,5 μl H₂O, 2,0 μl 10X-Reaktionspuffer, 10 μl Oligo-dT (20 pmol), 1,0 μl dNTP-Mischung (jeweils 10 mM), 0,5 μl RNAsin^® (20 U) (Ambion, Inc., Hialeah, FL) und 0,5 μl MMLV reverse Transkriptase (50 U) (Ambion Inc.) hergestellt worden war. Die Inhalte wurden durch Aufpipettieren und Abpipettieren vermischt und das Reaktionsgemisch wurde für 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Die Inhalte jedes Röhrchens wurden vor der Amplifikation zentrifugiert.
D. LightCycler^TM-Amplifikation von RT-Reaktionen
Ein Amplifikationsgemisch wurde hergestellt, indem in der folgenden Reihenfolge vermischt wurden: 1X PCR-Puffer II, 3 mM MgCl₂, je 140 μM dNTP, je 0,175 pmol Oligo, 1:50.000-Verdünnung von SYBR^® Green, 0,25 mg/ml BSA, 1 Einheit Taq-Polymerase und H₂O zu 20 μl. (PCR-Puffer II ist in 10X-Konzentration von Perkin-Elmer (Norwalk, CT) erhältlich. In 1X-Konzentration enthält er 10 mM Tris, pH 8,3, und 50 mM KCl. SYBR^® Green (Molecular Probes, Eugene, OR) ist ein Farbstoff, der fluoresziert, wenn er an doppelsträngige DNA gebunden ist. Da doppelsträngiges PCR-Produkt während einer Amplifikation produziert wird, nimmt die Fluoreszenz von SYBR^® Green zu).
Zu je 20 μl Aliquot des Amplifikationsgemisches wurden 2 μl Matrizen-RT gegeben und es wurde eine Amplifikation nach Standardprotokollen durchgeführt.
Beispiel 3. Zellproliferationsassay
Zellen wurden in 96 Well-Platten in einer Dichte von 5.000 Zellen pro Well ausgesät. Für einen 4-Tage-Proliferationsassay wurden 5 unabhängige 96 Well-Platten präpariert, eine für jeden Tag. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens transfiziert. An jedem Tag des Proliferationsassays wurde das gesamte Medium von einer Platte entfernt und bei –70°C gefroren. Am Tag 4 wurden alle Platten mit dem Quantos^TM-Assay-Kit (Stratagene, La Jolla, CA), der die Menge an DNA und somit die Zellenzahl in jedem Well bestimmt, entwickelt.
Beispiel 4. Cytotoxizitätsassay
Zellen wurden in 35 mm-Schalen mit 35.000 Zellen/Well ausgesät und über Nacht anheften gelassen. Zellen wurden dann mit Oligonucleotid/Lipid-Formulierungen mit 50–300 nM transfiziert und für 4 oder 24 Stunden inkubiert. Zellen wurden 12 Stunden später geerntet, einschließlich des Mediums, das schwimmende Zellen enthielt. Lebende Zellen wurden dann mit Propidiumiodid (PI) gefärbt, um nekrotische und apoptotische Zellen zu detektieren, und mit FITC-gekoppeltem Annexin V (welches frühe und späte apoptotische Zellen detektiert) gegengefärbt, und zwar nach Instruktionen des R&D Systems (Minneapolis, MN) Apoptosis Detektionskits. Die Zellen wurden dann durch FACS-Analyse analysiert, um die relative Anzahl von PI+-, Annexin V+-, PI+/Annexin V+- und PI-/Annexin V-Zellen zu bestimmen. Die Resultate sind als Prozentwerte angegeben (8).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chimäres Oligonucleotid der Formel 5'-W-X¹-Y-X²-Z-3' mit der Fähigkeit, RNAse H zu aktivieren, wobei W ein 5'-O-Alkylnucleotid darstellt; jedes von X¹ und X² einen Block von 7 bis 12 Phosphodiester-verknüpften 2'-O-Alkylribonucleotiden darstellt; Y einen Block von fünf bis zwölf Phosphorothioat-verknüpften Desoxyribonucleotiden darstellt; und Z eine Blockierungsgruppe, wirksam zur Blockierung der Nucleaseaktivität, am 3'-Ende des Oligonucleotids darstellt.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei die Alkylgruppen des 5'-O-Alkylnucleotids und der 2'-O-Alkylribonucleotide Niederalkylgruppen sind.
Oligonucleotid nach Anspruch 2, wobei die Alkylgruppen der 2'-O-Alkylribonucleotide Methylgruppen sind.
Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das 5'-O-Alkylnucleotid ein 5'-O-Alkylthymidin ist.
Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das 5'-O-Alkylnucleotid mit X¹ über eine Phosphodiester-Verknüpfung oder eine Phosphorothioat-Verknüpfung verknüpft ist.
Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gruppe Z über eine Verknüpfung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Phosphotriester-Verknüpfung, einer Phosphorothioat-Verknüpfung und einer Phosphoramidat-Verknüpfung, mit X² verknüpft ist.
Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Z ein 3-zu-3'-verknüpftes Nucleotid ist.
Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X¹-Y-X² eine Nucleotidsequenz hat, entsprechend einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 1–24.
Zusammensetzung, die zum Inhibieren der Expression eines Zielgens bei einem Subjekt zweckmäßig ist, umfassend ein chimäres Oligonucleotid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Vehikel ein Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugat der Formel: L-Linker-[N(CH₂CH₂NH₂)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)]₃-NH₂ einschließt, wobei L ausgewählt ist aus einer Lipidgruppierung, umfassend mindestens eine Fettalkyl- oder -alkenylkette mit einer Länge von zwischen etwa 8 und 24 Kohlenstoffatomen, und einem Steroid; jede Gruppe R unabhängig ausgewählt ist aus Alkyl, Aminoalkyl und Aralkyl und der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer direkten Bindung, einem Oligopeptid, einer im Wesentlichen linearen Alkylkette mit einer Länge von 2 bis etwa 30 Bindungen und einer im Wesentlichen linearen Kette mit einer Länge von 2 bis etwa 30 Bindungen, bestehend aus Alkylbindungen und einer oder mehreren Verknüpfung(en), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ester, Amid, Carbonat, Carbamat, Disulfid, Peptid und Ether.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei der Linker eine Länge von 3 bis etwa 15 Bindungen aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Fettalkyl- oder -alkenylkette eine Länge zwischen etwa 14 und 24 Kohlenstoffatomen aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei L eine Phospholipidgruppe mit zwei Fettalkyl- oder -alkenylketten mit einer Länge zwischen etwa 8 und 24 Kohlenstoffatomen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei L eine Cholesterylgruppe ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei R Isopropyl oder 4-Methoxyphenyl ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugat die Formel: L-(CH₂)_n-(C=O)-[N(CH₂CH₂NH₂)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)]₃-NH₂ hat, wobei L ausgewählt ist aus (i) einer Phosphatidylethanolaminogruppe mit Fettalkyl- oder -alkenylketten mit einer Länge zwischen etwa 8 und 24 Kohlenstoffatomen und (ii) einer Cholesterylgruppe, die mit dem benachbarten -(CH₂)_n-Segment durch eine Ester-, Amid- oder Carbamatverknüpfung verknüpft ist; n 1–5 ist; und R ausgewählt ist aus Isopropyl und 4-Methoxyphenyl.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den hierin wie folgt dargestellten Verbindungen: (a) Lipitoid 1 oder DMPE(NaeNmpeNmpe)₃; (b) Lipitoid 2, DMPE(NaeNiaNia)₃; (c) Cholesteroid 1 oder Chol-β-ala(NaeNmpeNmpe)₃; (d) Cholesteroid 2 oder Chol-Ahx-(NaeNmpeNmpe)₃; (e) Cholesteroid 3 oder Chol-β-ala(NaeNiaNia)₃; und (f) Cholesteroid 4 oder Chol-Ahx-(NaeNiaNia)₃.
Verwendung eines chimären Oligonucleotids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 zitiert, welches zum spezifischen Hybridisieren an die gesamte oder einen Teil einer ausgewählten Ziel-Nucleinsäuresequenz, die von dem Gen abgeleitet ist, wirksam ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Inhibieren der Expression des Zielgens in einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Ziel-Nucleinsäuresequenz eine mRNA, die von dem Zielgen abgeleitet ist, ist.
Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei das Segment X¹-Y-X² des chimären Oligonucleotids eine Nucleotidsequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 1–24.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Medikament ein Lipid-kationisches-Peptoid-Konjugat, wie in einem der Ansprüche 10 bis 17 zitiert, einschließt.