DE60133049T2

DE60133049T2 - Screeningverfahren für die oligonukleotidtransfektion

Info

Publication number: DE60133049T2
Application number: DE60133049T
Authority: DE
Inventors: Ronald N. El Cerrito ZUCKERMANN; Christoph J. Alameda REINHARD; Ann B. Oakland JEFFERSON; Eric San Francisco BEAUSOLEIL
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-12-23
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2009-02-19
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: WO2002052046A2; US20020151062A1; EP1404867A2; JP2008086318A; CA2431219A1; PT1404867E; US7422861B2; WO2002052046A3; EP1404867B1; CA2431219C; ES2300379T3; JP2005502309A; DE60133049D1; JP4611357B2; ATE387507T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für das Screening von Peptoiden unterschiedlicher Sequenz, einschließlich Lipid- und Sterol-konjugierter Peptoide, insbesondere kombinatorische Bibliotheken solcher Verbindungen, auf Effektivität im Transfizieren von Zellen mit Oligonucleotiden.
Hintergrund der Erfindung
Bei der kürzlichen Explosion bei der Identifizierung von Genen ist es entscheidend geworden, effiziente Werkzeuge für die funktionale Genomik zu entwickeln. Eines der wertvollsten ist die Verwendung der Antisense-Oligonucleotidtechnologie zur Bestätigung der Genfunktion bei Test auf zellulärer Basis. Die Fähigkeit von Antisense-Oligonucleotiden zur Verminderung der Niveaus der zellulären Botschaft ist inzwischen gut etabliert. Ihre Effizienz hängt jedoch zum Teil von der erreichten zellulären Konzentration und der Stelle der Oligonucleotide innerhalb der Zelle ab (Garcia-Chaumont, 2000; Marcusson, 1998). Für die Verabreichung von DNA wurden viele Agenzien entwickelt, und bei mehreren von ihnen wurde gezeigt, dass sie in vitro Nucleinsäuren in Zellen einbringen. Diese Agenzien umfassen kationische Polymere wie Polylysin und kationische Lipide. Zum Beispiel wird die liposomale Zusammensetzung Lipofectin^® (Felgner et al., 1987), die das kationische Lipid DOTMA (N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) und das neutrale Phospholipid DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin enthält, breit verwendet. Vgl. auch Benimetskaya, 1998; Bennett, 1992; Cao, 2000; DeLong, 1999; Kang, 1999; Morris, 1997; Lewis, 1996; und Yoo, 2000.
Es wurde jedoch wenig Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von Trägern gerichtet, die für Oligonucleotide optimiert sind. Dieser Punkt ist deshalb besonders wichtig, weil Antisense-Oligonucleotide ein integraler Teil der funktionalen Genomik und der Zielbestätigung bei der Wirkstofffindung geworden sind. Idealerweise sollten die Transfektionsmittel leicht zu verwenden sein und eine reproduzierbare, effiziente Transfektion von Oligonucleotiden in Zellen mit minimaler Interferenz mit biologischen Systemen ergeben. Unglücklicherweise leiden viele bekannte Transfektionsmittel unter solchen Problemen wie einer schlechten funktionalen Verabreichung, Zelltoxizität oder Inkompatibilität mit Serum im Transfektionsmedium.
Die Toxizität und/oder die ineffiziente Verabreichung durch solche Vehikel bei einer wachsenden Zahl von Zelllinien erfordert, dass neue Kandidaten für Verabreichungsvehikel hergestellt und auf ihre Aktivität getestet werden, sowohl bei der generellen als auch der zellspezifischen Verabreichung. Polykationische Träger wie die im Stand der Technik bekannten müssen jedoch üblicherweise synthetisiert, gereinigt und individuell getestet werden, und viele kationische Lipide bedürfen der Formulierung mit DOPE für die optimale Aktivität. Dementsprechend sind sie der strukturellen Variation durch kombinatorische Synthese oder dem Hochdurchsatzscreening nicht zugänglich. Bis heute wurde das Screening solcher Verbindungen mit einer limitierten Anzahl an bekannten, vorselektierten Zusammensetzungen durchgeführt. Vgl. zum Beispiel Byk et al., 1998; van der Wetering et al., 1999. Dementsprechend gibt es einen Bedarf für eine effizientere Hochdurchsatzsynthese und -durchmusterung für Kandidaten für Transfektionsagenzien.
Von Lipid-kationischen Peptoid-Konjugaten, als "Lipitoide" und "Cholesteroide" bezeichnet, wurde gezeigt, dass sie effektive Reagenzien für die Verabreichung von Plamid-DNA an Zellen in vitro sind. Diese Mittel sind in der Lage, Plasmid-DNA in kleine Partikel zu kondensieren, sie vor dem Nuclease-Abbau zu schützen und effizient die Transfektion von mehreren Zelllinien zu vermitteln (Murphy, 1998). Vgl. zum Beispiel die im gleichen Eigentum befindlichen PCT-Offenlegungsschriften WO 98/06437 und WO 99/08711 (Zuckermann et al), entsprechend den im gleichen Eigentum befindlichen US-Anmeldungen 08/910,647 und 09/132,808. Die Komplexbildung von Lipid-Peptoid-Konjugaten mit Plasmid-DNA ist bei Huang et al., 1998 beschrieben. Von solchen Verbindungen wurde auch gezeigt, dass sie Oligonucleotide (d. h. DNA kürzerer Länge oder DNA-Analoga) effizient in eine Vielzahl von primären und Tumorzelllinien transferieren, wie in der im gleichen Eigentum befindlichen und ebenfalls anhängigen US-Anmeldung 09/648,254 beschrieben. Dies ist im Gegensatz zu vielen kommerziell verfügbaren Transfektionsagenzien, die bei der Verabreichung von Oligonucleotiden weniger effizient sind als bei der Verabreichung von Plasmid-DNA. Die Lipid-Peptoid-Konjugate können mittels automatischer Synthese auf einer festen Phase synthetisiert werden und müssen vor der Verwendung nicht mit anderen Lipiden formuliert werden. Dementsprechend sind solche Verbindungen gut geeignet für die kombinatorische Synthese und das Hochdurchsatzscreening, wie hier nachstehend beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Bei einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für das Screening eines Peptoids bereit, d. h. eines Lipitoids oder Cholesteroids, für die effiziente Transfektion einer Zelle mit einem Oligonucleotid. Das Verfahren umfasst die Schritte von: Bereitstellen einer Vielzahl von Peptoiden unterschiedlicher Sequenz in getrennten Kompartimenten; Bilden einer Peptoid-Oligonucleotid-Mischung in mindestens einem der Kompartimente; Inkontaktbringen der Mischung mit einer Zelle; und Bestimmen des Grads der Transfektion der Zelle durch das Oligonucleotid. Der Grad der Transfektion kann zum Beispiel durch Verwendung eines Oligonucleotids, welches ein Antisense-Oligonucleotid ist, das gegen eine exprimierte Sequenz in der Zelle gerichtet ist, und den Nachweis einer Veränderung beim Spiegel der Sequenz in der Zelle bestimmt werden. Das Peptoid kann dann identifiziert werden, insbesondere wenn es ein transfizierendes Peptoid ist. Auch nicht transfizierende Peptoide können identifiziert werden.
Bei einer Ausführungsform werden die Peptoide von einem festen Partikel getragen; vorzugsweise enthält jedes Kompartiment einen einzigen Partikel und jeder Partikel enthält ein einziges Peptoid, das heißt, die daran gebundenen Peptoide haben dieselbe Sequenz. Das Verfahren umfasst den weiteren Schritt der Freisetzung des Peptoids von dem Partikel vor der Bildung von mindestens einem Peptoid-Oligonucleotid-Gemisch.
In ausgewählten Ausführungsformen haben die Peptoide unterschiedlicher Sequenz die allgemeine Formel I:
wobei
R^a ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einer oder mehreren Gruppen X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -COOH, Sulfonyl und einem Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann,
jedes R^b unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; und Wasserstoff,
wobei mindestens ein Rest R^b nicht Wasserstoff ist;
R^c ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -NH₂, -NHR, -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist; Sulfonyl, Hydrazin und einem Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann;
R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, niedrigem Alkyl und niedrigem Alkoxy;
X ausgewählt ist aus Hydroxy, Alkoxy, Amino, Guanidino, Amidino, Alkylamino, Alkylthio, Halogen, Nitro, Cyano, Keto, Aldehyd, Carboxylsäure, Carboxylester, Carboxylamid, Sulfonsäure und Sulfonester; und
m eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 2 bis ungefähr 50.
Bei weiteren selektierten Ausführungsformen umfasst R^a einen Lipidteil und R^c ist ausgewählt aus -NH₂, -NHR und -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist. Bei einer Ausführungsform ist der Lipidteil Sterol. Die Formel I umfasst poly(N-substituierte)-Glycine, d. h. jeder von R¹ und R² ist Wasserstoff.
Bei bevorzugten Ausführungsformen umfasst mindestens ein R^b eine Gruppe, die bei einem physiologisch relevanten pH-Wert kationisch ist, und wobei mindestens ein R^b bei einem physiologisch relevanten pH-Wert ungeladen ist. Die kationische Gruppe kann ausgewählt sein aus zum Beispiel Aminoalkyl, Ammonium wie quarternäres Alkylammonium, Guanidino, Amidino, Imidazolium, Pyridinium und kationischen Seitenketten, die man in natürlich vorkommenden Aminosäuren findet. Die ungeladene Gruppe kann ausgewählt sein aus zum Beispiel Aralkyl wie Benzyl oder Phenethyl, welches Methoxy-sibstituiert sein kann, und neutralen Seitenketten, die man in natürlich vorkommenden Aminosäuren findet.
Bei einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch ein effizientes Verfahren zum Durchmustern einer Bibliothek von Peptoiden unterschiedlicher Sequenz auf Effektivität im Transfizieren einer Zelle mit einem Oligonucleotid bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte von:

i) Inkontaktbringen jedes Mitglieds einer solchen Bibliothek mit einem Oligonucleotid, um eine Vielzahl von Peptoid-Oligonucleotid-Mischungen zu bilden,
ii) Inkontaktbringen jeder Mixtur mit einer Zelle;
iii) Durchmustern jeder Zelle auf Transfektion des Oligonucleotids; und
iv) Identifizieren transfizierender Peptoide in Mischungen, die mit transfizierten Zellen in Kontakt gebracht wurden.

Die Bibliothek von Peptoiden wird am einfachsten in einem Array physikalisch voneinander getrennter Kompartimente bereitgestellt. Typischerweise werden die Peptoide von festen Partikeln getragen. In diesem Fall werden die Peptoide von den Partikeln vor dem Schritt des Inkontaktbringens (i) freigesetzt. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält jedes Kompartiment einen einzigen Partikel und jeder Partikel enthält ein einziges Peptoid.
Das Screening kann den Nachweis einer Markierung auf dem Oligonucleotid in den transfizierten Zellen oder, wenn das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid ist, das gegen eine exprimierte Sequenz in der Zelle gerichtet ist, und den Nachweis einer Veränderung beim Spiegel dieser Sequenz in der Zelle umfassen.
Ein doppelter Array der Vielzahl an Peptoiden kann vor dem Inkontaktbringen mit dem Oligonucleotid erzeugt werden, was für die Zwecke der späteren Identifizierung von Nutzen ist. Typischerweise folgt dieser Schritt der Freisetzung der Peptoide von den festen Trägern. Nach dem Screening werden die Peptoide in dem doppelten Array, die an den Positionen lokalisiert sind, die transfizierenden Peptoiden entsprechen, die durch das Screening identifiziert wurden, unter Verwendung geeigneter Verfahren charakterisiert, z. B. durch Massenspektrometrie, zum Beispiel durch Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS).
Bei anderen Ausführungsformen dieser Verfahren umfassen die Zellen verschiedene Zelltypen und das Identifizieren ist effektiv, um Peptoide zu identifizieren, die fähig sind, selektiv Oligonucleotide in einen ausgewählten Zelltyp (z. B. eine Tumorzelle oder eine Endothelzelle) relativ zu einem nicht-ausgewählten Zelltyp (eine nicht-Tumorzelle bzw. eine Epithelzelle) einzuführen.
Man wird einsehen, dass die Verfahren der Erfindung nach dem Screening die Identifizierung von effektiven Peptoiden zulassen, und es nicht notwendig ist, dass die Sequenzen der Peptoide, d. h. der Peptoide in einer kombinatorischen Bibliothek, zuvor bekannt sind. Die hier beschriebenen Peptoide, die Lipitoide und Cholesteroide umfassen, zeigen die Vorteile, dass sie gute Kandidaten für den effizienten Transport von Oligonucleotiden sind und der kombinatorischen Synthese und dem Hochdurchsatz-Screening zugänglich sind.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines zu analysiernden Peptoids mittels Tandem-Massenspektrometrie, wobei die N-Substituenten auf dem Peptoid ausgewählt sind aus einer bekannten Population von Substituenten. Das Verfahren umfasst (a) die Bestimmung der vorhergesagten Molekulargewichte von Fragmenten, die durch die Spaltung der Amidbindungen bei mindestens einem theoretischen Peptoid produziert würden, das eine Sequenz hat, die auf einer Kombination der zuvor zitierten bekannten Population von N- Substituenten basiert; (b) Durchführung einer MS-MS-Fragmentierung bei dem zu analysierenden Peptoid, um eine Population von zu analysierenden Fragmentionen von verschiedenen Molekulargewichten zu produzieren; und (c) Bestimmung, ob die Molekulargewichte der zu analysierenden Fragmente den vorhergesagten Molekulargewichten entsprechen und ob somit das zu analysierende Peptoid die Sequenz des theoretischen Peptoids von (b) hat. Vorzugsweise werden die vorhergesagten Molekulargewichte von Fragmenten für eine Vielzahl von theoretischen Peptoiden bestimmt, die Sequenzen haben, die auf verschiedenen Kombinationen der vorstehend zitierten, bekannten Populationen von N-Substituenten basieren. Gegebenfalls werden die N-Substituenten an einer oder mehreren selektierten Positionen in dem zu analysiernden Peptoid zuvor bestimmt.
Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der Erfindung werden völlig offensichtlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die 1A–B vergleichen die Transfektionseffizienz (1A) und die Toxizität (1B) von Peptoid-Transfektionsagenzien (Lipitoid 1 und Cholesteroid 1; die Strukturen sind in den 1C bzw. D gezeigt) mit denen der kommerziell erhältlichen Transfektionsagenzien Lipofectamin^®, Cytofectin^TM GSV und FuGene^TM 6 bei der Transfektion von SKOV3-Zellen mit Akt1-Antisense(AS)- und/oder reversen Kontroll (RC)-Oligonucleotiden;
2 ist ein Flussdiagramm, das die Schritte beim Screening einer Bibliothek von Transfektionsagenzien für die Verabreichung von Oligonucleotiden auf Peptoid-Basis zeigt;
3 zeigt ein einfaches Beispiel einer Peptoid (Cholesteroid)-Kombinationsbibliothek;
4A–B zeigen die Korrelation zwischen der Aufnahme von FITC-Oligonucleotid und dem Verlust der Akt1-Botschaft bei MDA-MB-231-Zellen, die mit einem Gemisch von FITC-Oligonucleotid und Akt1-AS(Antisense)-Oligonucleotid unter Verwendung einer Bibliothek von kombinatorischen Peptoiden als Verabreichungsvehikel transfiziert wurden;
5A–B zeigen die Identifizierung von Verbindungen auf Peptoid-Basis, die mittels eines Misch- und Trenn-Protokolls unter Verwendung von Nanospray-MS/MS synthetisiert wurden;
6 zeigt das Ausschalten der Botschaft durch Akt-1-Antisense, das unter Verwendung von Peptoiden, die nach der Identifizierung mittels MS/MS resynthetisiert wurden, in MDA-231-Zellen transfiziert wurde;
7A–D zeigen die Transfektion von vier verschiedenen Zelllinien (A: HCT116-Colorektalcarcinomzellen; B: MDA-MB-231-Brustadenocarcinomzellen; C: MCF7-Brustadenocarcinomzellen; und D: menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen) unter Verwendung einer Bibliothek von kombinatorisch synthetisierten Peptoid-Verabreichungsvehikeln; und
8A–D zeigen die Transfektion von vier verschiedenen Zelllinien (A. 184B5-Brustepithelzellen. B. MDA-MB-231-Brustadenocarcinomzellen. C. 847-Fibroblastenzellen. D. HT1080-Fibrosarcomzellen) unter Verwendung einer Bibliothek von kombinatorisch synthetisierten Peptoid-Verabreichungsvehikeln.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die nachstehenden Ausdrücke haben die folgende Bedeutung, außer es ist anders angegeben.
Eine "kombinatorische Bibliothek" ist im Allgemeinen eine Sammlung von Verbindungen auf der Basis einer Kernstruktur, die unabhängig variable Substituenten, funktionale Gruppen oder andere Strukturelemente hat. Für den Bereich der chemischen Gruppen, die für jedes der unabhängig variablen Elemente selektiert wurden, können Verbindungen in der Bibliothek vorhanden sein, die alle möglichen Permutationen dieser Elemente enthalten. Das Verfahren für die Herstellung einer kombinatorischen Bibliothek ist vorzugsweise so, dass alle oder jede Kombinationen von verschiedenen Mitgliedern der Bibliothek simultan synthetisiert werden können.
Die hier diskutierten Peptoid-Bibliotheken enthalten typischerweise 2 bis etwa 1000, vorzugsweise etwa 10 bis 500 und am meisten bevorzugt etwa 10 bis 100 Peptoide mit unterschiedlicher Sequenz.
Eine "Vielzahl" von Mitgliedern einer Bibliothek oder eines Arrays umfasst alle oder alle zwei oder mehr Mitglieder der Bibliothek oder des Arrays und umfasst typischerweise mindestens die Hälfte des Arrays.
Die Ausdrücke "Festphase", "Harz", "Kügelchen" und "Partikel" betreffen jeden festen Träger oder jedes feste Subtrat, auf dem die Reaktionsschritte der chemischen Synthese unter Einschluss einer Sequenz von Reaktionsschritten durchgeführt werden können. Somit umfasst der Ausdruck partikuläre Substrate wie Polystyrolharze, die traditionell bei der üblichen chemischen Fmoc-Synthese verwendet wurden, wie das "Rink-Amid"-Harz von Nova Biochem.
Ein "Peptoid" ist ein Poly(N-substituiertes Amid), vorzugsweise ein Poly(N-substituiertes Glycin), wie zum Beispiel beschrieben in den PCT-Offenlegungsschriften WO 94/06451 , WO 98/06437 , WO 99/08711 und dem US-Patent Nr. 5,877,278 (Zuckermann et al.). Für die Herstellung von Peptoiden vgl. diese Referenzen ebenso wie: Bartlett, Santi et al. 1991; Horwell, Pritchard et al. 1992; Haenel 1994; Zuckermann und Kerr 1994; Hadas und Hornik 1995; Desai, Nuss et al. 1996; Kobylecki und Gardener 1996; Ng, Warne et al. 1996; Zuckermann, Siegmund et al. 1998; Zuckermann, Troung et al. 1998; Zuckermann, Chinn et al. 1998; Zuckermann, Goff et al. 1999; Und DE-Gebrauchsmuster Offenlegungsnummer 20005738 , alle vorstehend zitiert.
Eine Klasse von Peptoiden hat die allgemeine Formel I:
wobei
R^a ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einer oder mehreren Gruppen X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -COOH, Sulfonyl und einem Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann,
jedes R^b unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; und Wasserstoff, wobei mindestens ein Rest R^b nicht Wasserstoff ist;
R^c ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -NH₂, -NHR, -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist; Sulfonyl, Hydrazin und einem Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann;
R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, niedrigem Alkyl und niedrigem Alkoxy;
X ausgewählt ist aus Hydroxy, Alkoxy, Amino, Guanidino, Amidino, Alkylamino, Alkylthio, Halogen, Nitro, Cyano, Keto, Aldehyd, Carboxylsäure, Carboxylester, Carboxylamid, Sulfonsäure und Sulfonester; und
m eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 2 bis ungefähr 50.
Bei selektierten Ausführungsformen wird R^c ausgewählt aus -NH₂, -NHR und -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist. Wenn R¹ und R² Wasserstoff ist, ist das Molekül poly(N-substituiertes Glycine). Hinsichtlich der N-Seitenketten des Peptoids umfasst bei selektierten Ausführungsformen mindestens ein R^b eine Gruppe, die bei einem physiologisch relevanten pH-Wert kationisch ist (z. B. Aminoalkyl, quaternäres Ammonium, Guanidino, Amidino, Imidazolium, Pyridinium), und wobei mindestens ein R^b bei einem physiologisch relevanten pH-Wert ungeladen ist. Beispiele umfassen Alkyl und Aralkyl; spezifische Beispiele sind Isopropyl und (p-Methoxyphenyl)ethyl. Kationische oder neutrale Seitenketten von natürlich vorkommenden Aminosäuren können auch verwendet werden. Vorzugsweise umfasst jede Gruppe R^b eine kationische oder ungeladene Gruppe. Eine besonders bevorzugte Struktur umfasst eine sich wiederholende Sequenz von einer kationischen und zwei ungeladenen Gruppen bei R^b.
Eine "Lipidgruppe" ist eine hydrophobe Gruppe, die einen substantiellen Kohlenwasserstoffanteil hat, vorzugsweise umfassend eine Gruppe, die ausgewählt ist aus verzweigtem oder unverzweigtem C₁₀-C₅₀-Alkyl, -Alkenyl oder Alkinyl, C₁₄-C₅₀-Aryl, -Aralkyl, -Aralkenyl oder Aralkynyl oder einem Steroidnucleus. Beispiele für Lipidgruppen umfassen Dialkyl- oder Dialkenyl-Phospholipide wie Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine und Phosphatidylinosite, Glycolipide wie Cerebroside und Ganglioside, Fettdiacylglyceride, Glycosylglyceride, Sphingolipide und Steroide einschließlich Sterole.
Ein "Lipitoid" ist ein Lipid-substituiertes Peptoid, d. h. eine Verbindung der vorstehenden Formel I, wobei Ra einen Lipidrest umfasst. Ein "Cholesteroid" ist ein Cholesterin-substituiertes Peptoid, d. h eine Verbindung der vorstehenden Formel I, wobei R^a einen Cholesterinrest umfasst. Während Cholesterine bevorzugt sind, wird eine weitere Offenbarung von Steroiden, die zum Einbau in Steroid-Peptoid-Konjugate geeignet sind, in der PCT-Offenlegungsschrift WO 97/46223 (Fasbender et al.) und dem entsprechenden US-Patent Nr. 5,935,936 gefunden. Wie hier verwendet, umfasst der Ausdruck "Peptoid" Lipitoide und Cholesteroide.
Eine im Allgemeinen bevorzugte Klasse von Lipitoiden umfasst Verbindungen der Formel: L-Linker-[N(CH₂CH₂NH₂)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)-N(CH₂CH₂R)CH₂(C=O)]₃-NH₂, wobei die Lipidgruppe L eine von Fettsäuren abgeleitete Gruppe wie eine Phospholipidgruppe (d. h. ROOCCH₂CH(COOR)CH₂OP(O)₂O-), die zwischen etwa 8 und 24 Kohlenstoffatome lange Fett-Alkylketten oder -Alkenylketten hat, oder eine Steroid-abgeleitete Gruppe wie eine Cholesterylgruppe ist, und der Teil des Moleküls rechts von dem Linker ist das Peptoid-Segment. Der Linker kann eine direkte Bindung sein oder er kann eine im Wesentlichen lineare verknüpfende Gruppe sein, wie ein Oligopeptid oder eine Alkylkette jeder effektiven Länge. Der Linker kann auch eine Alkylkette, die eine oder mehrere Verknüpfungen hat, die Heteroatome enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Ester, Amid, Carbonat, Carbamat, Disulfid, Peptid und Ether, an jedem Ende der Kette oder zwischen Alkylbindungen liegend sein. Bei ausgewählten Ausführungsformen ist der Linker von 2 bis etwa 30 Atomen oder von 3 bis etwa 15 Atomen Länge. In dem Peptoid-Segment ist R ausgewählt aus Alkyl (verzweigt oder unverzweigt), Aminoalkyl und Aralkyl. Aralkylgruppen wie Benzyl oder p-Methoxyphenylethyl sind bevorzugt. Ein einzelnes Lipitoid kann verschiedene Gruppen R umfassen oder sie können innerhalb des Moleküls dieselben sein.
Die Strukturen von nützlichen Peptoiden sind natürlich nicht auf die vorstehende Klasse beschränkt und sie können durch Festphasensynthese leicht variiert werden, um Bibliotheken von Substanzen zu produzieren, die mit den hier beschriebenen Verfahren leicht durchmustert werden können.
"Alkyl" betrifft einen voll gesättigten azyklischen einwertigen Rest, der Kohlenstoff und Wasserstoff enthält und der verzweigt oder eine gerade Kette sein kann. Beispiele für Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, n-Butyl, t-Butyl, n-Heptyl und Isopropyl. "Alkenyl" betrifft einen azyklischen einwertigen Rest, der Kohlenstoff und Wasserstoff enthält und der verzweigt oder eine gerade Kette sein kann und der mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Die Alkenylgruppe kann einfach ungesättigt oder mehrfach ungesättigt sein. In ähnlicher Weise betrifft "Alkynyl" einen solchen Rest, der mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält. "Niedrigeres" Alkyl (Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy usw.) betrifft eine Gruppe, die 1 bis 6 Kohlenstoffe hat, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffe.
"Aryl" betrifft einen substituierten oder unsubstituierten einwertigen aromatischen Rest, der einen einzigen Ring (d. h. Benzol) oder zwei oder drei kondensierte Ringe (z. B. Naphthyl; Phenanthryl) hat. Es werden im Allgemeinen Gruppen bevorzugt, die einen einzigen (monozyklisch) oder zwei kondensierte Ringe (bizyklisch) haben, wobei monozyklische Gruppen besonders bevorzugt sind. Der Ausdruck umfasst Heteroarylgruppen, was aromatische Ringgruppen sind, die ein oder mehrere Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome im Ring haben, wie Furan, Pyroll, Pyridin, Imidazol und Indol. Mit "substituiert" ist gemeint, dass ein oder mehrere Wasserstoffe in der Arylgruppe durch eine nicht-Wasserstoff-Gruppe ersetzt sind, vorzugsweise ausgewählt aus Halogen, niedrigem Alkyl, niedrigem Alkoxy, Nitro, Amid, tertiärem Amino, Hydroxy und Halo(niedrigem Alkyl).
"Aralkyl" betrifft einen Alkyl-, vorzugsweise niedrigen Alkyl-Substituenten, der weiterhin mit einer Arylgruppe substituiert ist; ein Beispiel ist eine Benzolgruppe. In ähnlicher Weise betreffen "Aralkenyl" und "Aralkinyl" Aralkenyl- oder Aralkinyl-Substituenten, die weiterhin mit einer Arylgruppe substituiert sind.
Ein bei den Screeningverfahren der Erfindung verwendetes "Oligonucleotid" ist vorzugsweise zwischen etwa 10 und 50 und mehr bevorzugt zwischen etwa 15 und 30 Nucleotide lang.
Das Inkontaktbringen eines Peptid-Oligonucleotid-Gemisches "mit einer Zelle" umfasst das Inkontaktbringen des Gemisches mit einem Gewebe, das solche Zellen enthält.
Ein "transfizierendes Peptoid" ist eines, welches bei einem vorgegebenen Screeningtest, der gemäß der Erfindung durchgeführt wird, die Testzellen oder das Gewebe mit dem Testoligonucleotid transfiziert.
Der "physiologisch relevante pH-Wert" ist typischerweise zwischen etwa 5,5 und etwa 8,5; mehr typisch zwischen etwa 6,0 und etwa 8,0; und am typischsten zwischen etwa 6,5 und etwa 7,5.
II. Oligonucleotidtransfektion unter Verwendung von Agenzien auf Peptoid-Basis
Obwohl viele Transfektionsagenzien für die Verabreichung von Plasmid-DNA an Zellen existieren, wurde der Verabreichung von Oligonucleotid weniger Aufmerksamkeit gewidmet. Die hier genannten Autoren fanden, dass eine Serie von Transfektionsagenzien auf Peptoid-Basis, die zuvor für die Transfektion von Plasmid-DNA charakterisiert worden waren, auch zur Bildung von Komplexen mit Oligonucleotiden in der Lage waren und die Aufnahme von mit FITC markierten Oligonucleotiden in viele Zelltypen ohne signifikante Zelltoxizität ermöglichten. Ähnlich den Resultaten bei der Transfektion von DNA war die Transfektion von Oligonucleotiden in Zellen optimal bei einem Verhältnis der Ladung +/– von etwa 1,5–2/1 und die Anwesenheit von Serum hatte keinen negativen Einfluss bei den getesteten Verhältnissen.
Lipid-kationische Peptoid-Konjugate (Lipitoide und Cholesteroide, wie vorstehend beschrieben) sind besonders effektive Reagenzien für die Verabreichung von Plasmid-DNA ebenso wie von Oligonucleotiden an Zellen. Zum Beispiel zeigen die 1A–B die Transfektionseffizienz und die Toxizität von Peptoid-Transfektionsagenzien (Lipitoid 1 und Cholesteroid 1; die Strukturen sind in den 1C–D gezeigt) im Vergleich mit kommerziell verfügbaren Transfektionsagenzien (Lipofectamin^®, Cytofectin^TM GSV und FuFene^TM 6) bei der Transfektion von SKOV3 (Eierstockkarzinom)-Zellen mit 300 nM Oligonucleotid. Das Oligonucleotid bestand entweder aus 50 nM Akt1-Antisense- und 250 nM Kontrolloligonucleotid (AS) oder 300 nM Kontrolloligonucleotid (RC = reverse Kontrolle). Es wurden die Protokolle des Herstellers für kommerzielle Transfektionsagenzien befolgt. Nach der Transfektion über Nacht wurden die Zellen Tests für die Produktion von RNA und die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse der Spiegel der Akt1-Botschaft unterworfen.
Die Transfektionsergebnisse (1A) zeigen, dass die Peptoid-Verabreichungsvehikel in der Lage waren, Oligonucleotid effizient in die Zellen einzubringen. Die Spiegel der Akt1-Botschaft nahmen mit Lipitoid 1 um > 95% und mit Cholesteroid 1 um > 85% ab im Vergleich mit Zellen, die mit der passenden reversen Kontrolle transfiziert worden waren. Dieser Spiegel an Knockout legt nahe, dass die meisten Zellen effizient mit dem Antisense-Oligonucleotid transfiziert worden waren. Dieser Schluss wird durch die FACS-Analyse von SKOV3-Zellen gestützt, die mit FITC-markiertem Oligonucleotid transfiziert worden waren und zu > 97% hinsichtlich der FITC-Fluoreszenz positiv waren (Ergebnisse nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu waren alle getesteten kommerziellen Agenzien entweder ineffektiv bei der Verabreichung der Oligonucleotide (FuFene^TM 6) oder töteten die Zellen (Lipofectamin^®, Cytofectin^TM GSV), wie in 1B gezeigt.
Als Maß für die Zelltoxizität der Transfektionsagenzien wurden Zellen derselben Transfektionen mit Annexin V und PI gefärbt, gefolgt von der FACS-Analyse (1B). Die Fraktion an Zellen, die positiv waren für Annexin V oder für Annexin V und PI, sind diejenigen im frühen oder späten Stadium der Apopotose. Nicht transfizierte Kontrollzellen und Zellen, die unter Verwendung von Lipitoid 1, Cholesteroid 1 oder FuFene^TM 6 transfiziert worden waren, zeigten eine vernachlässigbare Färbung mit Annexin V oder PI. Im Gegensatz dazu waren Zellen, die mit Lipofectamin^® oder Cytofectin^TM GSV transfiziert worden waren, intensiv mit Annexin V und PI gefärbt, was anzeigt, dass ein hoher Prozentsatz der Zellen den programmierten Zelltod erlitten.
III. Screeningverfahren
Bei einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für das Screening eines Peptoids (welches Lipitoide und Cholesteroide umfasst) auf Effektivität bei der Transfektion einer Zelle mit einem Oligonucleotid bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte von: Bereitstellen einer Vielzahl von Peptoiden unterschiedlicher Sequenz in getrennten Kompartimenten; Bilden einer Peptoid-Oligonucleotid-Mischung in mindestens einem der Kompartimente; Inkontaktbringen der Mischung mit einer Zelle; Bestimmen des Grads der Transfektion der Zelle durch das Oligonucleotid. Die Identität des Peptoids kann dann bestimmt werden. Während im Allgemeinen ein höherer Antrieb zur Identifizierung eines transfizierenden Peptoids vorliegt, kann auch die Identifizierung eines nicht transfizierenden Peptoids von Nutzen sein.
Die 2A zeigt ein Flussdiagramm, das die Schritte beim Screening einer Bibliothek von Transfektionagenzien auf Peptoid-Basis für die Verabreichung von Oligonucleotiden illustriert. Die Schritte, die nachstehend detaillierter beschrieben werden, sind wie folgt: a) Bei einer Ausführungsform wird eine Bibliothek solcher Verbindungen mit einem Misch-und-Trenn-Protokoll synthetisiert; b) ein einzelnes Kügelchen, das eine einzelne Verbindung repräsentiert, wird in jeder Mulde einer Platte mit vielen Mulden platziert, abgespalten und in Wasser gelöst; c) jede Verbindung wird für die Bildung Komplexes mit zugesetztem Oligonucleotid verwendet; d) jeder Peptoid/Oligonucleotid-Komplex wird in einem ähnlichen Format mit vielen Mulden zu Zellen zugegeben und auf seine Fähigkeit zur Transfektion des Oligonucleotids in Zellen getestet, beurteilt durch vielfache Ablesemöglichkeiten, wie der FITC-Aufnahme (e) oder den Verlust einer Antisense-Zielbotschaft (f); die Verbindung wird dann aus dem Array von gespaltenen Peptoiden identifiziert, bei einer Ausführungsform unter Verwendung der Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS) (g).
A. Peptoid-Synthese
Wie vorstehend definierte Peptoide werden beschrieben in den im gleichen Eigentum befindlichen PCT-Offenlegungsschriften WO 94/06451 ; WO 98/06437 und WO 99/08711 (Zuckermann et al.), basierend auf den US-Seriennummern 60/023,867, 60/054,743, 07/950,853 und 09/132,808. Die Herstellung von Peptoiden durch schrittweise Zugabe von Untereinheiten ist in den vorstehend zitierten PCT-Offenlegungsschriften beschrieben; vgl. auch Murphy et al., 1998 und Huang et al., 1998, und Zitate dort. Kurz gesagt wird ein mit Amin derivatisierter Festphasenträger, vorzugsweise ein "Rink-Amid"-Harz (4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-Harz; Nova Biochem) mit Bromacetyl zur Reaktion gebracht (nach der Entfernung der Fmoc-Gruppe) und es wird ein primäres Amin zugegeben, das die erste gewünschte Seitenkette hat, die das Brom ersetzt. Zur Konstruktion des Peptoids werden weiterhin wechselweise Bromessigsäure (für ein poly-NSG-Peptoid) und ausgewählte primäre Amine zugegeben.
Die Herstellung des Peptoids wird auch diskutiert bei Bartlett, Santi et al. 1991; Horwell, Pritchard et al. 1992; Haenel 1994; Zuckermann und Kerr 1994; Hadas und Hornik 1995; Desai, Nuss et al. 1996; Kobylecki und Gardener 1996; Ng, Warne et al. 1996; Zuckermann, Siegmund et al. 1998; Zuckermann, Troung et al. 1998; Zuckermann, Chinn et al. 1998; Zuckermann, Goff et al. 1999 2000; und DE-Gebrauchsmuster Offenlegungsnummer 20005738 , alle vorstehend zitiert.
Für die Herstellung von Lipitoiden und Cholesteroiden wird der N-Terminus eines harzgebundenen Peptoids vorzugsweise zunächst mit einem Spacer wie Fmoc-Aminohexansäure oder Fmoc-β-Alanin acyliert. Nach der Entfernung der Fmoc-Gruppe wird die primäre Aminogruppe zur Reaktion gebracht mit z. B. Cholesterinchlorformiat, um eine Carbamat-Bindung zu bilden. Eine von Fettsäuren abgeleitete Lipidgruppe wie ein Phospholipid kann anstelle der Steroidgruppe verwendet werden. Die Steroid- oder andere Lipidgruppe kann auch durch andere Verknüpfungen von effektiver Länge mit der Peptoidgruppe verknüpft sein, die leicht für den Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet verfügbar sind. Die Steroid- oder Lipidgruppe und das Peptoidsegment können auch mittels einer direkten Bindung verbunden sein.
Die Vielzahl von Peptoiden mit unterschiedlicher Sequenz ist vorzugsweise eine kombinatorische Bibliothek von Peptoiden. Solche Bibliotheken können durch Anwendung bekannter kombinatorischer Synthesestrategien für die Synthese von Peptoiden hergestellt werden, wie sie nachstehend beschrieben werden. Vgl. zum Beispiel Thompson et al., 1996; Terrett et al., 1995 und Bunin, 1998. Insbesondere können unter Verwendung der Verfahren, wie sie in der WO 99/58476 und dem entsprechenden US-Patent Seriennr. 60/084,843 beschrieben sind, partikelgetragene kombinatorische Bibliotheken hergestellt werden, die eine große Anzahl von Polymeren enthalten.
Die bei der Synthese von Peptoiden variierten Parameter umfassen die N-Seitenketten (Einbau durch die Zugabe von primären Aminen) und die endständige Lipidgruppe. Bei einer Ausführungsform haben die Peptoide eine endständige Cholesterylgruppe und eine unterschiedliche Verteilung von neutralen und kationischen N-Seitenketten. Ein einfaches Beispiel für eine solche Bibliothek ist in 3 gezeigt.
Der kationische Charakter des Peptoids trägt zu seiner Wechselwirkung mit dem negativ geladenen Oligonucleotiden und schließlich mit den zellulären Phospholipiden bei. Weil der Ladungszustand durch den pKa seiner basischen Funktionen und den lokalen zellulären pH-Wert moduliert werden kann, wurde ein Satz an basischen Seitenketten des Peptoids (pKa 4,5, 9 und 12 für ein Anilin, ein primäres Amin bzw. eine Guanidingruppe) mit unterschiedlichen Längen (Ethyl, Butyl, Benzyl) als Seitenkettensubstituenten bei der Peptoidbibliothek gewählt. Um den Einfluss einer Kombination dieser Seitenketten zusammen zu erforschen, wurde eine basische funktionelle Gruppe an jedem dritten Rest in einem 9-mer-Peptoid eingebaut, um 64 Kombinationen zu erforschen. Die anderen Positionen wurden von einer Methoxyphenylethyl-Seitenkette besetzt, von der gezeigt wurde, dass sie eine geeignete Balance an Hydrophobie ergibt (Huang, 1998; Murphy, 1998).
Die Peptoide unterschiedlicher Sequenz werden am einfachsten für das Screening an Festphasenträgern bereitgestellt, in Übereinstimmung mit Festphasensynthesen, die im Allgemeinen für ihre Herstellung verwendet werden. Eine Peptoidbibliothek, die ein Peptoid pro Kügelchen hat, kann unter Verwendung eines "Misch und Trenn"-Protokolls, wie vorstehend beschrieben, auf polymeren Kügelchen erzeugt werden. Es ist bevorzugt, dass die Kügelchen-Träger Kügelchen mit hoher Beladung sind (d. h. Bereitstellung von > 1 nMol an Verbindung pro Kügelchen). Es ist auch bevorzugt, dass der Kügelchen-Träger einen im Wesentlichen einheitlichen Durchmesser hat, so dass die letztlichen Reaktionsvolumina von Verbindungen, die von den Kügelchen-Trägern abgespalten werden, im Wesentlichen einheitliche Konzentration an Verbindungen haben werden.
Zum Beispiel wurde die vorstehend beschriebene und in 3 gezeigte Bibliothek unter Verwendung des Misch und Trenn-Syntheseprotokolls auf polymeren Kügelchen hergestellt (Furka, 1991; Lam, 1991; Zuckermann und Banville, 1992). Eine mittlere Beladung mit 40 nMol pro Kügelchen (Standardabweichung ± 10%) wurde bei 95% Reinheit für eine Modellverbindung beobachtet.
Bei einem typischen Prozess wird ein solcher Pool an Kügelchen mit einem Lösungsmittel wie Dichlorethan gequollen und, falls gewünscht, über ein rostfreies Stahlnetz gesiebt. Die Kügelchen, von denen jedes ein einzelnes Peptoid enthält, werden mit einem Kügelchen pro Mulde in einem Array von physikalisch getrennten Kompartimenten verteilt, z. B. einer Platte mit 96 Mulden, wie in 2 gezeigt. Diese Verteilung kann unter Verwendung einer Kügelchen-Verteilersonde durchgeführt werden, wie offenbart in der WO 99/58476 . Kurz gesagt verwendet die Kügelchen-Verteilersonde Vakuum, um einzelne Kügelchen aus der Mischung an Kügelchen zu selektieren, und verwendet dann eine Gasentladung, um die selektierten Kügelchen an einem ausgewählten Ort abzulegen, zum Beispiel in einem Array von Mulden.
Die Peptoide werden von den sie tragenden Kügelchen durch Spaltung eines spaltbaren Linkers zwischen dem Peptoid und den Kügelchen freigesetzt. Es sind viele chemisch spaltbare Verknüpfungen im Stand der Technik bekannt; Beispiele umfassen Disulfide (spaltbar durch Reduktion, typischerweise unter Verwendung von Dithiothreit), Azo-Gruppen (spaltbar mit Dithionat), Sulfone (spaltbar mit basischem Phosphat, mit oder ohne Dithiothreit), Glycole, spaltbar mit Periodat, und Ester, spaltbar durch Hydrolyse. Im Falle eines Rink-Amid-Harzes, wie vorstehend beschrieben, oder eines Rink-Säure-Harzes wird die Spaltung von dem Harz unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) erreicht, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Nach der Spaltung wird das Spaltgemisch durch Verdampfen entfernt, und jedes Peptoid in Wasser oder wässrigem Puffer gelöst, um eine Bibliothek von Lösungen von Peptoid-Oligomeren mit unterschiedlicher Sequenz zu erhalten, von denen jede typischerweise eine Konzentration von etwa 0,5 mM hat.
Bei einer Ausführungsform wird, wie nachstehend diskutiert, ein doppelter Array von Peptoid-Lösungen durch Entnahme von Teilvolumina der entsprechenden Peptoid-Lösungen hergestellt. Dieser doppelte Array wird dann für die spätere Identifizierung verwendet.
B. Transfektion und Screening
Ein Oligonucleotid, dessen Transfektion durchmustert werden soll, wird zu mindestens einem Kompartiment des Arrays von Peptoiden mit unterschiedlicher Sequenz zugegeben. Wie vorstehend festgehalten, ist das Nucleotid vorzugsweise etwa zwischen 10 und 50, und mehr bevorzugt etwa zwischen 15 und 30 Nucleotide lang. Bei einem typischen Experiment besteht eine Oligonucleotidprobe aus zwei Teilen eines inaktiven (Kontrolle, d. h. reverse Kontrolle), an FITC gekoppelten Oligonucleotids und einem Teil eines aktiven Antisense-Oligonucleotids, z. B. eines anti-Akt1-Oligonucieotids. Die Bedingungen der Zugabe sind so, dass ein transfizierendes Peptoid mit den Oligonucleotiden einen Komplex bildet. Geeignete Endkonzentrationen der Komponenten sind etwa 200 nM Oligonucleotid und 3 μM Peptoid (vgl. Beispiele).
Jedes Peptoid-Oligonucleotid-Gemisch wird dann mit einer Zelle in Kontakt gebracht, wie in einer Zellkultur oder einer Gewebeprobe. Die Zellkulturen werden typischerweise am Tag vor der Transfektion durch Ausplattieren von 10.000 bis 30.000 pro Mulde und Wechseln des Inhalts jeder Mulde am Tag der Transfektion in 70 μl frisches Gewebekulturmedium, das Serum enthält, hergestellt. Nach Inkubation über Nacht werden die Zellen zweimal mit frischem Kulturmedium gewaschen, das Serum enthält.
Die Zellen werden dann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren auf Transfektion des Oligonucleotids durchmustert. Ein solches Verfahren umfasst den Nachweis einer Markierung wie FITC an dem Oligonucleotid. Zellen, die den Oligonucleotid/Peptoid-Komplex aufgenommen haben, können nach dem Waschen unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegeräts durch Rastern auf FITC-Fluoreszenz identifiziert werden.
Alternativ umfasst das Screening, wenn das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid ist, das eine Sequenz hat, die gegen einen Teil einer DNA-, prä-mRNA- oder mRNA-Sequenz gerichtet ist, die in die Expression eines Genprodukts in der Zelle involviert ist, den Nachweis einer Veränderung der Expressionshöhe des Zielgens in der Zelle. Zum Beispiel wird nach der Transfektion die mRNA von Zellen isoliert, es wird eine Erststrang-cDNA hergestellt und die Spiegel der Botschaft für das Testgen werden gemessen, z. B. durch quantitative Echtzeit-PCR.
Diese beiden Verfahren können unter Verwendung eines Gemisches von mit FITC markiertem Kontrolloligonucleotid und Akt1-Antisense-Oligonucleotid kombiniert werden, wie vorstehend beschrieben. Die transfizierten Zellen werden zunächst auf FITC-Fluoreszenz getestet und dann für die Isolierung von RNA lysiert.
Bei einem Beispiel werden MDA-MB-231-Zellen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Bibliothek von Peptoiden als Verabreichungsvehikel mit einem Gemisch aus FITC-Oligonucleotid und Akt1-AS(Antisense)-Oligonucleotid transfiziert. Die 4A–B zeigen die Korrelation zwischen der Aufnahme an FITC-Oligonucleotid und dem Verlust an Akt1-Botschaft in den Zellen. Es gibt eine gute Korrelation zwischen den Proben, die eine gute Aufnahme an FITC-Oligonucleotid zeigen, und denen, die einen Verlust an Akt1-Botschaft zeigen (quantifiziert mittels quantitativer Echtzeit-PCR eines ersten Strangs der cDNA, der aus RNA von den Zellen gewonnen wurde), was anzeigt, dass sowohl die FITC-Aufnahme als auch der Verlust an Zielbotschaft für die Identifizierung von aktiven Transfektionagenzien verwendet werden könnten.
Es wurde beobachtet, dass eine kleine Anzahl an Peptoiden (z. B. in Mulde H4), die offensichtlich Akt1-AS transfizieren, einen Verlust der Akt1-Botschaft verursachen, ohne eine begleitende Aufnahme von FITC-Oligonucleotid. Somit kann die Durchmusterung durch FITC-Aufnahme einen niedrigen Prozentsatz an Peptoiden nicht finden, die in der Lage sind, Oligonucleotide in Zellen zu transfizieren. Bei Antisense-Oligonucleotiden basiert die Verbindungsauswahl am besten auf den Daten, die bei der Verabreichung des Oligonucleotids und dem anschließenden Knockout der Botschaft erhalten werden.
C. Verbindungsidentifizierung
Jedes transfizierende Peptoid in jedem Gemisch, das mit Zellen kontaktiert wurde und von dem gezeigt wurde, dass es transfiziert wird, kann dann identifiziert werden. Wie vorstehend festgehalten, können, falls erwünscht, auch nicht transfizierende Peptoide identifiziert werden. Vorzugsweise verwendet diese Identifikation ein Doppel der Stammplatte, die, wie vorstehend beschrieben, durch Übertragung eines kleinen Anteils der wässrigen Lösung jeder Mulde der Stammplatte hergestellt wird. Beim Durchmustern von mehreren Verbindungen werden die Lagen der Mulden mit den effizientesten Verbindungen identifiziert und unter Verwendung der reservierten Lösung von der Stammplatte wird die Identität des Peptoids bestimmt, das für die Transfektion verantwortlich ist.
Bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann jedes Verfahren verwendet werden, das für die Bestimmung der Sequenzen von Peptoiden geeignet ist. Bei einigen Ausführungsformen werden massenspektrographische Verfahren verwendet. Bei einer speziellen Ausführungsform wurde gefunden, dass die Tandem-Massenspektrometrie effektiv zur Charakterisierung der hier beschriebenen Peptoidverbindungen ist.
Die Sequenzen von Peptoiden, die bei dem vorstehend zitierten Akt1-Knockout-Test interessante Verabreichungsprofile zeigen, wurden unter Verwendung der Nanospray-Tandem-Massenspektrometrie (Smith, 1990; Carr, 1991) identifiziert (5). Die 5A zeigt die generische Struktur eines Cholesteryl-Peptoid-Konjugats, das N-terminale Fragmente ("b-Ionen") und C-terminale Fragmente ("y-Ionen") zeigt, deren Bildung durch die Ionisierung in dem Massenspektrometer erwartet wird. Die 5B zeigt das Spektrum eines repräsentativen Cholesteryl-Peptoid-Konjugats. Die vorhergesagten Fragmente b2, b3, b4, b5, b6, b8, y2, y3, y5, y7 und y8 reichten zur eindeutigen Identifizierung der Sequenz dieses Cholesteryl-Peptoid-Konjugats aus.
Auch andere Verfahren auf MS-Basis sind zur Identifizierung von Nutzen. Zum Beispiel können der Edman-Abbau oder das partielle Versehen mit einer Kappenstruktur während der Synthese verwendet werden, um eine Sequenz-Leiter zu erstellen, gefolgt von MS zur Bestimmung der Oligomersequenz.
Die Verbindungen, die in den Mulden A2, A3, B5, C4, D3 und E3 von 4 positiv getestet wurden, wurden für die Bestätigung der Verabreichung von Antisense-Oligonucleotid resynthetisiert (vgl. 6). Bei dem Bestätigungstest wurden MDA-MB-231-Zellen, die auf Platten mit 96 Mulden ausplattiert waren, mit einem Gemisch aus 200 nM FITC-Oligo und Akt1-AS(Antisense)- oder Akt1-RC(reverse Kontrolle)-Oligo unter Verwendung einer Vielzahl von cholesteroiden oder Cholesterin-Verabreichungsvehikeln transfiziert. Fünf von ihnen waren neue Cholesteroide und wurden gemäß dem Verfahren der Erfindung als aktive Transfektionagenzien ausgewählt und nach der Identifikation mittels MS/MS resynthetisiert. Eines dieser Cholesteroide, als "Inact Cholest" bezeichnet, ist ein neues Cholesteroid, das bei der ursprünglichen Durchmusterung auf Oligonucleotid-Verabreichung negativ war. Cholesteroid 1 (vgl. 1) wurde als ein positives Kontroll-Verabreichungsvehikel verwendet, und DC-Cholesterin als eine negative Kontrolle. Nach Transfektion über Nacht wurde von den Zellen RNA isoliert und die quantitative Echtzeit-PCR wurde verwendet, um die Akt1- und Actin-Botschaftsspiegel zu bestimmen. Jeder Balken in 6 stellt den Prozentsatz Knockout bei der Akt1-Botschaft im Verhältnis zur Actin-Botschaft dar, im Vergleich mit nicht transfizierten Zellen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung innerhalb der vier Mulden dar, die unter Verwendung jedes Verabreichungsvehikels transfiziert worden waren.
Wie in 6 gezeigt, ergaben die resynthetisierten Cholesteroide einen effizienten Knockout der Akt1-Botschaft in MDA-231-Zellen. Somit wurde gezeigt, dass das Protokoll für die Synthese und die Identifikation von neuen Transfektionagenzien Verbindungen isoliert, die bei der Resynthese ihre vorteilhaften Charakteristika beibehalten.
D. Screening auf selektive Transfektion
Bei einer Ausführungsform des Verfahrens umfassen die für die Transfektion verwendeten Zellen oder Gewebe (in getrennten Kompartimenten oder getrennten Arrays) unterschiedliche Zelltypen. Das Screeningverfahren wird somit zur Identifizierung von Peptoiden verwendet, die zur selektiven Verabreichung von Oligonucleotiden an einen ausgewählten Zelltyp gegenüber einem nicht ausgewählten Zelltyp in der Lage sind. Zum Beispiel kann der ausgewählte Zelltyp eine Tumorzelle sein, während der nicht ausgewählte Zelltyp keine Tumorzelle ist. Bei einem anderen Beispiel ist der ausgewählte Zelltyp eine Endothelzelle und der nicht ausgewählte Zelltyp ist eine Epithelzelle. Bei solchen Anwendungen könnte mehr als ein doppelter Array an Peptoiden hergestellt werden, mit einem, der für Identifizierungszwecke vorgesehen ist, und jeder der anderen für das Screening auf Transfektion einer vorgegebenen Zelle oder eines vorgegebenen Gewebetyps. Dieses Verfahren kann für das Screening auf Verabreichungsvehikel verwendet werden, die selektiv ein vorgegebenes Gewebe transfizieren, z. B. als Hilfe bei der Gentherapie bei Tieren.
Ein Beispiel eines differentiellen Zellscreenings ist in den 7A–D gezeigt. Vier unterschiedliche Zelllinien, einschließlich dreier Tumorzelllinien (A: HCT116-Colorectalkarzinomzellen; B: MDA-MB-231-Brustadenokarzinomzellen; C: MCF7-Brustadenokarzinomzellen) und einer nicht-Tumor-Zelllinie (D: menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen), wurden unter Verwendung einer Bibliothek von kombinatorisch synthetisierten Peptoid-Verabreichungsvehikeln transfiziert. Die Zellen wurden mit 200 nM Akt1-AS-Oligonucleotid und Kontroll-FITC-Oligonucleotid und Verabreichungsvehikel transfiziert, wie in den Beispielen beschrieben, und die Aufnahme an Oligonucleotid wurde nach Transfektion über Nacht mittels Zellfluoreszenz quantifiziert. Bei den Figuren zeigen gepunktete Balken Verbindungen an, die bei allen Zelltypen effektiv waren, während schraffierte Balken Verbindungen anzeigen, die nur bei den Zelltypen effektiv waren, die metastatisches Potential haben. Wie in den Figuren gezeigt, fallen drei der Verbindungen in die letztere Kategorie.
Ein weiteres Beispiel ist in den 8A–D gezeigt. Es wurden unter Verwendung eines einzigen Panels von Verbindungen auf Peptoid-Basis zur Verabreichung eines Gemisches von FITC-Kontrolloligonucleotid/Akt1-Antisense-Oligonucleotid vier Zelltypen transfiziert. Die Brustepithelzellen 18485 und die 847-Fibroblasten sind keine tumorbildenden Zellen, während die MDA-MB-231-Brustadenokarzinomzellen und die HT1080-Fibrosarkomzellen tumorbildende und metastatische Zelltypen sind. Einige der getesteten Verbindungen waren in der Lage, eine erhöhte Transfektion bei allen vier Zelltypen zu bewirken, wie angezeigt vom Knockout der Akt1-Botschaft (d. h. die Verbindungen von den Mulden B2 und F4). Andere Verbindungen förderten den Akt1-Knockout bei einigen, aber nicht allen vier Zelltypen (d. h. die Verbindungen von den Mulden C1, F5, G6, D10 und D11).
Ein solches Screening ist bei der Identifizierung von Verbindungen von Nutzen, die selektiv Oligonucieotide in Zellen transfizieren, die wegen irgendeiner speziellen Charakteristik ausgewählt werden. Eine solche Selektivität bei der Transfektion wäre insbesondere bei der Verabreichung von Antisense-Oligonucleotiden in vivo von Nutzen.
Die hier beschriebenen Agenzien auf Peptoid-Basis sind effektive Oligonucleotid-Transfektionsagenzien, die eine hohe Transfektioneffizienz, den effektiven Verlust von Testbotschaft als Reaktion auf Antisense-Oligonucleotide, eine niedrige Toxizität und Kompabilität mit Serum bereitstellen. Bei Verwendung der kombinarorischen Synthese auf Kügelchen, vorzugsweise in Kombination mit einem automatisierten Kügelchen-Aufnahmeverfahren, kann eine große Anzahl an neuen Peptoid-Konjugaten in einer für die direkte Verwendung beim Hochdurchsatz-Screening, z. B. beim mRNA-Knockout, in einer Vielzahl von Zellen geeigneten Menge und Reinheit hergestellt werden.
Eines der Charakteristika dieser Transfektionsagenzien auf Peptoid-Basis, das sie für das Screening auf Transfektion in einem solchen Format geeignet macht, ist, dass sie keiner Formulierung mit anderen Lipiden bedürfen, Wenn jedoch ein Peptoid als effektiv bei der Transfektion von Oligonucleotid in einen speziellen Zelltyp identifiziert ist, kann es möglich sein, diese Charakteristika durch Formulierung mit anderen Lipiden zu modifizieren oder zu erhöhen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung, sollen sie aber nicht einschränken.
Peptoidsynthese. Lösungsmittel, Amine und andere Reagenzien wurden von kommerziellen Quellen bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Die Peptoid-Oligomeren wurden an 50 μMol Rink Amidharz (Nova Biochem) durch eine Modifikation der früheren Verfahren (Zuckermann, Kerr et al., 1992; Figliozzi, 1996) synthetisiert. Nach der Entfernung der ersten Fmoc-Gruppe wurde der folgende Zyklus der Monomer-Zugabe mit einem Roboter-Synthesegeräts durchgeführt und wiederholt, bis die gewünschte Länge erreicht war.
Das Aminoharz wurde durch Zugabe von 830 μl 1,2 M Bromessigsäure in N,N-Dimethylformamid (DMF) und 200 μl N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) bromacetyliert. Diese Lösung wurde 40 min bei 35°C bewegt, abgegossen und mit DMF (3 × 2 ml) gewaschen. Als nächstes wurden 0,85 ml einer 1 M Lösung eines primären Amins in DMSO zugegeben, um die Seitenkette einzuführen. Diese Lösung wurde 40 min bei 35°C bewegt, abgegossen und mit DMF (4 × 2 ml) gewaschen. Bei einem alternativen Verfahren wurden die Amine in N-Methylpyrrolidon statt in Dimethysulfoxid gelöst.
Die Peptoide wurden unter Verwendung von 50%-iger (Vol./Vol.) TFA in Dichlorethan mit 1% Triethylsilan von den Kügelchen freigesetzt. Jedes Makrokügelchen wurde unter Verwendung eines automatischen Kügelchenaufnehmers (PCT-Offenlegungsschrift Nr. WO 9958476 ) aufgenommen und auf Polypropylenplatten mit 96 Mulden (Y-Form, Greiner) übertragen, um gespalten und aufbewahrt zu werden.
Konjugation mit Cholesterin. Ein Peptoid-Cholesterin-Konjugat (Cholesteroid) wurde wie folgt hergestellt. Das Aminoende eines Harz-gebundenen Peptoids wurde 20 min bei 85°C mit FMOC-β-Ala-OH (0,24 Äq.) und DIC (0,26 Äq.) in DMF behandelt. Der Träger wurde mit 3 × 2 ml DMF gewaschen. Es wurde Piperidin (20% Vol./Vol. in DMF, 3 ml) zugegeben, gefolgt von 20 Äq. Cholesterylchlorformiat und 20 Äq. DIAE (unverdünnt, 173 μl). Nach Abschluss der Reaktion wurde das Konjugat durch Behandlung mit 50% (Vol./Vol.) TFA in CH₂Cl₂ von dem Träger abgespalten.
(Misch-Trenn)-Protokoll der kombinatorischen Synthese. Das folgende illustrative Misch-Trenn-Protokoll wurde für eine kombinatorische Synthese von 64 Peptoiden unterschiedlicher Sequenz unter Verwendung von vier unterschiedlichen primären Aminen verwendet. Jeder "Submonomer-Zyklus" umfasste Bromacetylierung gefolgt von Zugabe von primärem Amin.
Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe vom Harz

Waschen mit DMF
Submonomer Zyklus 1
Submonomer Zyklus 2
Verteilung des Harzes auf 4 Gefäße
Dränieren der Reaktionsgefäße
Submonomer Zyklus 3
Vereinigung des Harzes in einem einzigen Gefäß,
Dränieren der Reaktionsgefäße
Submonomer Zyklus 4
Submonomer Zyklus 5
Verteilung des Harzes auf 4 Gefäße
Dränieren der Reaktionsgefäße
Submonomer Zyklus 6
Vereinigung des Harzes in einem einzigen Gefäß,
Dränieren der Reaktionsgefäße
Submonomer Zyklus 7
Submonomer Zyklus 8
Verteilung des Harzes auf 4 Gefäße
Dränieren der Reaktionsgefäße
Submonomer Zyklus 9
Fmoc-(-Ala-Kopplung
Chlorformiat-Kopplung (Bildung von Lipid- oder Cholesteryl-Konjugat)

Spaltung von Bibliotheks-Verbindungen von den Kügelchen-Trägern. Ein Spalt-Cocktail (TFA/DCE, 50:50, 75 μl) wurde zu jeder Kügelchen enthaltenden Mulde in einer Platte mit vielen Mulden zugegeben. Nach einer Stunde wurde die Platte in ein Speed-vac-Verdampfungsgerät (Verdampfungsgerät Savant AES200, ausgerüstet mit einem Trägerrotor für eine Platte mit 96 Mulden), transferiert, um die meisten flüchtigen Stoffe von jeder Platte zu entfernen. Jede Mulde wurde mit einer Acetonitril/Wasser-Lösung (CH₃CN 50% [Vol./Vol.] in H₂O, 75 μl) und unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Schüttelgeräts 10 Min. geschüttelt. Die Platte wurde in ein Speed-vac-Verdampfungsgerät transferiert und die flüchtigen Stoffe für einen Zeitraum von 30 Minuten entfernt. Der Inhalt jeder Mulde (typischerweise eine einzelne Peptoid-Verbindung) wurde in Wasser oder Puffer gelöst (80 μl), zu einer Polypropylenplatte mit 96 Mulden (200 μl, v-förmiger Boden) transferiert und, falls erforderlich, bei –20°C aufbewahrt.
Transfektion. Für die Transfektion in Gefäßen mit 6 Mulden wurden die Zellen einen Tag vor der Transfektion mit 250.000 Zellen pro Mulde ausplattiert, um bei der Transfektion eine Dichte von 60–80% zu ergeben. Antisense- oder reverses Kontroll-Oligonucleotid wurde für die Transfektion in Opti-MEM (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Ka.) auf 2 μM verdünnt. Die Peptoid-Transfektionsagenzien wurden auf ein Verhältnis von 1,5 nMol Vehikel pro μg Oligonucleotid in demselben Volumen Opti-MEM verdünnt. Das verdünnte Oligonucleotid und das verdünnte Peptoidvehikel wurden dann gemischt und unmittelbar zu den Zellen in einem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 200–300 nM Oligonucleotid zugegeben, wie bei jedem Experiment angegeben. Nach Inkubation über Nacht wurde das Transfektionsgemisch durch frisches Kulturmedium ersetzt.
Die Transfektionen waren ähnlich beim Screening mit 96 Mulden und dem erneuten Testen der Vehikel, außer dass die Zellen mit 20.000 pro Mulde ausgesät wurden und dass alle Misch- und Verdünnungsschritte unter Verwendung eines Sagian Multipipette 96-Kanal-Pipettiergeräts durchgeführt wurden. Die zu durchmusternden Zellen wurden am Tag vor der Transfektion mit 10.000 bis 30.000 pro Mulde in Gewebekulturgefäßen mit 96 Mulden ausplattiert. Am Tag der Transfektion wurden die Zellen in 70 μl frisches Medium gewechselt, das Serum enthielt. Das Oligonucleotid, das aus 2 Teilen an inaktivem FITC-gekoppeltem Oligonucleotid und einem Teil Antisense-Oligonucleotid bestand, wurde in Opti-MEM auf 1,3 μM verdünnt. Die auf die Verabreichung von Oligonucleotiden zu testenden Peptoid-Verbindungen wurden in dem 96-Mulden-Format mit einer Konzentration von 0,5 mM in Wasser angeordnet. Zwei Mikroliter von jedem wurden in Opti-MEM auf eine Konzentration von 20 μM verdünnt. Die verdünnten Oligonucleotide wurden zu den verdünnten Peptoiden gemischt und die gebildeten Peptoid-Oligonucleotide wurden weiter auf die Zellen in Medium verdünnt. Die Doppelplatten mit Zellen wurden mit einer Endkonzentration von 200 nM Oligonucleotid und 3 μM Peptoid transfiziert. Nach Transfektion über Nacht wurden die Zellen zweimal mit Medium gewaschen, das Serum enthielt.
Zum Vergleich von kommerziellem Transfektionsagenzien mit Peptoid-Transfektionsagenzien wurden Lipofectamin (Invitrogen Life Technologies), Cytofectin GSV (Glen Research, Sterling VA) und Fugene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) gemäß den Anweisungen in der Packung verwendet und die Zellen wurden über Nacht in Opti-MEM (Lipofectamin und Cytofectin GSV) oder Medium mit Serum (Fugene 6) transfiziert.
Die antisense-Oligonucleotide wurden bei der Chiron Corporation gemäß Standardverfahren synthetisiert und hatten die folgenden Sequenzen:
RNA-Isolierung und PCR. Die RNA von Zellen, die in dem 6-Mulden-Format transfiziert worden waren, wurde unter Verwendung des High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) isoliert. Für die Zellen, die in dem 96-Mulden-Format transfiziert worden waren, wurde der RNeasy 96 Kit (Qiagen, MMLV-Valencia, Ka.) verwendet. Die RNA wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase und RNasin (Ambion) und Oligo-d(T)18, das von der Chiron Corporation synthetisiert worden war, revers transkribiert. Ein Teilvolumen von 2 μl von jeder RT-Reaktion mit 20 μl wurde unter Verwendung eines Gene Amp 5700 und Sybr Green PCR Master Mix von Applied Biosystems (Foster City, Ka.) quantitativ auf die Spiegel der Akt1- oder Actin-Botschaft untersucht. Die resultierenden Mengen der Spiegel der Akt1-Botschaft wurden hinsichtlich der Spiegel der Actin-Botschaft von derselben Probe normalisiert, um hinsichtlich von Variationen bei der RNA-Ausbeute oder der reversen Transkription zu normalisieren.
Die Primer, die für die quantitative PCR verwendet wurden, wurden bei der Chiron Corporation gemäß Standardverfahren synthetisiert und hatten die folgenden Sequenzen. Die Primer wurden mit einer Endkonzentration von 180 nM verwendet.
Tandem-Massenspektrometrie: Für die Entwindung wurde jede Platte mit Peptoid-Lösung 60 Minuten in einem Speed-vac-Verdampfungsgerät Savant AWS200 getrocknet und es wurde eine Lösung von CH₃CN in H₂O (100 μl) zu jeder Mulde zugegeben. Die resultierende Lösung wurde für die MS-MS-Analyse verwendet. In einigen Fällen wurde ein C4 ZipTip-Reinigungsschritt gemäß den Angaben des Herstellers durchgführt.
Apoptose-Test. Nach der Transfektion mit Antisense-Oligonucleotiden und verschiedenen Transfektionsagenzien wurde die Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin und 2 mM EDTA vorsichtig von den Platten gelöst, in Puffer gewaschen, der 10 mM Hepes pH 7,2, 140 mM NaCl und 5 mM CaCl₂ enthielt, und mit Propidiumiodid mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Annexin-V-FLUOS (Roche Molecular Biochemicals) gefärbt. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines Becton Dickinson-FACScan auf Färbung mit jedem Marker analysiert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Durchmustern eines Peptoids auf Effektivität im Transfizieren einer Zelle mit einem Oligonucleotid, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer Vielzahl von Peptoiden unterschiedlicher Sequenz in getrennten Kompartimenten; Bilden einer Peptoid-Oligonucleotid-Mischung in mindestens einem der Kompartimente; Inkontaktbringen der Mischung mit einer Zelle; Bestimmen des Grads der Transfektion der Zelle durch das Oligonucleotid.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend Identifizieren eines transfizierenden Peptoids, das mit einer transfizierten Zelle in Kontakt gebracht wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptoide auf festen Partikeln gelagert sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei jedes Kompartiment einen einzelnen Partikel enthält und wobei an jeden dieser Partikel Peptoide derselben Sequenz gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend den Schritt des Freisetzens der Peptoide von dem Partikel in dem mindestens einen Kompartiment vor Bilden der Peptoid-Oligonucleotid-Mischung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid ist, das gegen ein Genprodukt in der Zelle gerichtet ist, und wobei das Bestimmen den Nachweis einer Änderung in der Expressionshöhe des Gens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptoide unterschiedlicher Sequenz die allgemeine Formel 1 haben:
wobei R^a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einer oder mehreren Gruppen X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -COOH, Sulfonyl und ein Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann, jedes R^b unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; und Wasserstoff, wobei mindestens ein Rest R^b nicht Wasserstoff ist; R^c ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -NH₂, -NHR, -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist; Sulfonyl, Hydrazin und ein Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann; X ausgewählt ist aus Hydroxy, Alkoxy, Amino, Guanidino, Amidino, Alkylamino, Alkylthio, Halogen, Nitro, Cyano, Keto, Aldehyd, Carboxylsäure, Carboxylester, Carboxylamid, Sulfonsäure und Sulfonester; R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, niedrigem Alkyl und niedrigem Alkoxy; und m eine ganze Zahl ist ausgewählt von 2 bis ungefähr 50.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei in Formel I R^a einen Lipidteil umfasst und R^c ausgewählt ist aus -NH₂, -NHR und -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Lipidteil ein Sterol ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei in Formel I jeder von R¹ und R² Wasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei in Formel I mindestens ein R^b eine Gruppe einschließt, die bei einem physiologisch relevanten pH kationisch ist, und wobei mindestens ein R^b bei einem physiologisch relevanten pH ungeladen ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die kationische Gruppe ausgewählt ist aus Aminoalkyl, Ammonium, Guanidino, Amidino, Imidazolium, Pyridinium und kationischen Seitenketten, die man in natürlich vorkommenden Aminosäuren findet.
Verfahren zum Durchmustern einer Bibliothek von Peptoiden unterschiedlicher Sequenz auf Effektivität im Transfizieren einer Zelle mit einem Oligonucleotid, wobei das Verfahren umfasst: v) Inkontaktbringen jedes Mitglieds der Bibliothek mit einem Oligonucleotid, um eine Vielzahl von Peptoid-Oligonucleotid-Mischungen zu bilden, vi) Inkontaktbringen jeder Mixtur mit einer Zelle; vii) Durchmustern jeder Zelle auf Transfektion des Oligonucleotids; und viii) Identifizieren transfizierender Peptoide in Mischungen, die mit transfizierten Zellen in Kontakt gebracht wurden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Bibliothek von Peptoiden in einem Array physikalisch voneinander getrennter Kompartimente bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Peptoide auf festen Partikeln gelagert sind.
Verfahren nach Anspruch 15, weiterhin umfassend den Schritt des Freisetzens der Peptoide von den Partikeln in den Kompartimenten vor dem Schritt des Inkontaktbringens (i).
Verfahren nach Anspruch 15, wobei jedes Kompartiment einen einzelnen Partikel beinhaltet und jeder Partikel ein einzelnes Peptoid beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei vor dem Schritt des Inkontaktbringens (i) eine Kopie des Arrays von Peptoiden hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Schritt des Identifizierens (iv) das Identifizieren von Peptoiden in der Kopie des Arrays an Positionen entsprechend den transfizierenden Peptoiden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Identifizieren durch Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen verschiedene Zelltypen umfassen und wobei das Identifizieren effektiv ist, um Peptoide zu identifizieren, die fähig sind, selektiv Oligonucleotide in einen ausgewählten Zelltyp relativ zu einem nicht-ausgewählten Zelltyp einzuführen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der ausgewählte Zelltyp eine Tumorzelle und wobei der nicht-ausgewählte Zelltyp eine Nicht-Tumorzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der ausgewählte Zelltyp eine Endothelzelle und wobei der nicht-ausgewählte Zelltyp eine Epithelzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Peptoide unterschiedlicher Sequenzen die allgemeine Formel I haben:
wobei R^a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einer oder mehreren Gruppen X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -COOH, Sulfonyl und ein Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann, jedes R^b unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; und Wasserstoff, wobei mindestens ein Rest R^b nicht Wasserstoff ist; R^c ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl und Aralkinyl, wobei jedes davon mit einem oder mehreren Resten X substituiert werden kann; Wasserstoff, -OH, -SH, -NH₂, -NHR, -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist; Sulfonyl, Hydrazin und ein Lipidteil, wobei der Lipidteil an einen Verknüpfungsteil konjugiert sein kann; X ausgewählt ist aus Hydroxy, Alkoxy, Amino, Guanidino, Amidino, Alkylamino, Alkylthio, Halogen, Nitro, Cyano, Keto, Aldehyd, Carboxylsäure, Carboxylester, Carboxylamid, Sulfonsäure und Sulfonester; R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, niedrigem Alkyl und niedrigem Alkoxy; und m eine ganze Zahl ist ausgewählt von 2 bis ungefähr 50.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei in Formel I R^a einen Lipidteil umfasst und R^c ausgewählt ist aus -NH₂, -NHR und -NH(C=O)R, wobei R ein niedriges Alkyl ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Lipidteil ein Sterol ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei in Formel I jeder von R¹ und R² Wasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei in Formel I mindestens ein R^b eine Gruppe einschließt, die bei einem physiologisch relevanten pH kationisch ist, und wobei mindestens ein R^b bei einem physiologisch relevanten pH ungeladen ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die kationische Gruppe ausgewählt ist aus Aminoalkyl, Ammonium, Guanidino, Amidino, Imidazol, Pyridinium und kationischen Seitenketten, die man in natürlich vorkommenden Aminosäuren findet.