ES2300379T3 - Procedimiento de deteccion selectiva de transfeccion de oligonucleotidos. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la detección selectiva de un peptoide según la eficacia en transfeccionar una célula con un oligonucleótido, en el que el procedimiento comprende: proporcionar una pluralidad de peptoides de diferente secuencia en compartimentos separados; formar una mezcla peptoide-oligonucleótido en al menos uno de dichos compartimentos; poner en contacto dicha mezcla con una célula; determinar el grado de transfección de dicha célula por dicho oligonucleótido.

Description

Procedimiento de detección selectiva de transfección de oligonucleótidos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para la detección selectiva de peptoides de diferente secuencia, incluidos peptoides conjugados con lípidos y esteroles, en particular bibliotecas combinatorias de tales compuestos, para determinar la eficacia en la transfección de células con oligonucleótidos.
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Antecedentes de la invención
Con la reciente explosión en la identificación de genes, se ha convertido en algo crucial desarrollar herramientas para la genómica funcional. Una de las más valiosas es el uso de tecnología de oligonucleótidos antisentido para validar la función génica en ensayos basados en células. La capacidad de los oligonucleótidos antisentido para disminuir los niveles del mensaje celular está ahora bien establecida. No obstante, su eficacia depende, en parte, de la concentración celular alcanzada y de la localización de los oligonucleótidos dentro de la células (García-Chaumont, 2000; Marcusson, 1998). Se han desarrollado muchos agentes para la liberación de ADN y se ha demostrado que varios de estos liberan ácidos nucleicos en las células in vitro. Estos agentes incluyen polímeros catiónicos, tales como polilisina, y lípidos catiónicos. Por ejemplo, la composición liposómica Lipofectin® (Felgner y col., 1987), que contienen el lípido catiónico DOTMA (cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio) y el fosfolípido neutro
DOPE (dioleilfosfatidiletanolamina) está ampliamente usada. Véase también Benimetskaya, 1998; Bennett, 1992; Cao, 2000; DeLong, 1999; Kang, 1999; Morris, 1997; Lewis, 1996; y Yoo, 2000.
No obstante, se ha prestado poca atención al desarrollo de portadores optimizados para oligonucleótidos. Este punto es especialmente importante porque los oligonucleótidos antisentido se han convertido en parte integral de la genómica funcional y la validación diana en el descubrimiento de fármacos. Idealmente, los agentes de transfección deberán ser fáciles de usar y proporcionar a las células una eficaz y reproducible transfección de oligonucleótidos con mínima interferencia con los sistemas biológicos.
Por desgracia, muchos agentes de transfección conocidos sufren problemas tales como una mala liberación funcional, toxicidad celular o incompatibilidad con suero en el medio de transfección.
La toxicidad y/o liberación ineficaz mediante tales vehículos en un número creciente de líneas celulares requiere la preparación de nuevos candidatos a vehículos de liberación y su análisis para determinar su actividad, tanto en general como para la liberación específica en la célula. No obstante, normalmente los portadores policatiónicos tales como los conocidos en la técnica deben sintetizarse, purificarse y analizarse individualmente y muchos lípidos catiónicos requieren la formulación con DOPE para determinar su actividad óptima. En consecuencia, no son susceptibles a la variación estructural mediante síntesis combinatoria o a detección selectiva de alto rendimiento. Hasta la fecha, la detección selectiva de tales compuestos se ha llevado a cabo en un número limitado de composiciones conocidas preseleccionadas. Véase, por ejemplo, Byk y col., 1998; van de Wetering y col., 1999. En consecuencia, existe una necesidad de síntesis de alto rendimiento más eficaz y de detección selectiva de candidatos a agentes de
transfección.
- Se ha demostrado que conjugados peptoides catiónicos-lípidos, denominados "lipitoides" y "colesteroides" son eficaces reactivos para la liberación de ADN plasmídico a las células in vitro. Estos agentes son capaces de condensar el ADN plasmídico en pequeñas partículas, protegerle de la degradación por nucleasas y mediar con eficacia la transfección de varias líneas celulares (Murphy, 1998). Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT de co-propiedad WO 98/06437 y WO 99/08711 (Zuckermann y col.,) correspondientes a las solicitudes de EE.UU. de co-propiedad 09/910.647 y 09/132.808. En Huang y col., 1998 se describe la formación de complejos de conjugados de lípidos-peptoides con ADN plasmídico. También se ha demostrado que tales compuestos liberan con eficacia oligonucleótidos (es decir, ADN de cadena corta o análogos de ADN) en una diversidad de líneas celulares primarias y tumorales, tal y como se describe en la solicitud de EE.UU. de co-propiedad y pendiente de tramitación 09/648.254. Esto contrasta con muchos agentes de transfección comercialmente disponibles, que son menos eficaces en la liberación de oligonucleótidos que en la liberación de ADN plasmídico. Los conjugados lípidos-peptoides se pueden sintetizar mediante síntesis automática en fase sólida y no necesitan formularse con otros lípidos antes de usar. En consecuencia, tales compuestos son bien adecuados pata la síntesis combinatoria y la detección selectiva de alto rendimiento, como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva.
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Resumen de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la detección selectiva de un peptoide, por ejemplo un lipitoide o un colesteroide, por su eficacia en la transfección de una célula con un oligonucleótido. El procedimiento incluye las etapas de: proporcionar una pluralidad de peptoides de diferente secuencia en distintos compartimentos; formar una mezcla peptoide-oligonucleótido en al menos uno de estos compartimentos; poner en contacto esta mezcla con una célula; y determinar el grado de transfección de la célula por el oligonucleótido. El grado de transfección puede determinarse mediante, por ejemplo, el empleo de un oligonucleótido que es un oligonucleótido antisentido dirigido contra una secuencia expresada en dicha célula, y mediante la detección de una alteración en el nivel de dicha secuencia en dicha célula. El peptoide puede a continuación identificarse, particularmente si es un peptoide de transfección. Los peptoides que no son para transfección también se pueden identificar.
En una forma de realización, los peptoides están soportados en partículas sólidas; preferentemente, cada compartimento contiene una única partícula, y cada partícula contiene un único peptoide; es decir, los peptoides unidos al mismo tienen la misma secuencia. Por tanto, el procedimiento incluye la posterior etapa de liberar el peptoide de la partícula, antes de la formación de al menos una mezcla peptoide-oligonucleótido.
En formas de realización seleccionados, los peptoides de diferente secuencia poseen la fórmula general I:
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1
en la que
R^{a} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, -COOH, sulfonilo y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado con un resto de unión,
cada R^{b} se selecciona de forma independiente del grupo construido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; e hidrógeno,
en el que al menos un grupo R^{b} no es hidrógeno;
R^{c} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, NH_{2}, -NHR, -NH(C=O)R, donde R es alquilo inferior; sulfonilo, hidracina y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado a un resto de unión; R^{1} y R^{2} se seleccionan de forma independiente de hidrógeno, alquilo inferior y alcoxi inferior.
X se selecciona de hidroxi, alcoxi, amino, guanidino, amidino, alquilamino, alquiltio, halógeno, nitro, ciano, ceto, aldehído, ácido carboxílico, éster carboxílico, amida carboxílica, ácido sulfónico y éster sulfónico; y
m es un número entero seleccionado de 2 a aproximadamente 50.
En otras formas de realización seleccionadas, R^{a} comprende un resto lipídico y Rc se selecciona de -NH_{2}, -NHR y -NH(C=)R, donde R es alquilo inferior. En una forma de realización, el resto lipídico es un esterol. La Fórmula I incluye glicinas poli(N-sustituidas), es decir donde cada R^{1} y R^{2} es hidrógeno.
En formas de realización preferidas, al menos un R^{b} incluye un grupo que es catiónico a un pH fisiológicamente relevante, y al menos un R^{b} está sin cargar a un pH fisiológicamente relevante. El grupo catiónico puede seleccionarse de, por ejemplo, aminoalquilo, amonio, tal como alquil amonio cuaternario, guanidino, amidino, imidazolio, pirinidinio y cadenas laterales catiónicas encontradas en aminoácidos naturales. El grupo no cargado puede seleccionarse de, por ejemplo, aralquilo, tal como bencilo o fenetilo, que puede ser metoxi-sustituido, y cadenas laterales neutras encontradas en aminoácidos naturales.
La presente invención también proporciona, en un aspecto relacionado, un procedimiento para la detección selectiva eficaz de una biblioteca de peptoides de secuencia diferente por eficacia en la transfección de una célula con un oligonucleótido. El procedimiento comprende las etapas de:
(i)
poner en contacto cada miembro de tal biblioteca con un oligonucleótido para formar una pluralidad de mezclas de peptoide-oligonucleótido,
(ii)
poner en contacto cada mezcla con una célula;
(iii)
la detección selectiva de cada célula para la transfección del oligonucleótido; e
(iv)
identificar peptoides de transfección en mezclas en contacto con células transfeccionadas.
La biblioteca de peptoides se proporciona de un modo más cómodo en una matriz de compartimentos separados físicamente. Normalmente, los peptoides están soportados en partículas sólidas. En este caso, los peptoides se liberan desde las partículas antes de la etapa de contacto (i). En formas de realización preferidas, cada compartimento contiene una única partícula y cada partícula contiene un único peptoide.
La detección selectiva puede comprender detectar un marcador en el oligonucleótido en células transfeccionadas o, cuando el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido dirigido contra una secuencia expresada en la célula, detectar una alteración en el nivel de dicha secuencia en la célula.
Puede crearse una matriz duplicada de la pluralidad de peptoides, antes del contacto con el oligonucleótido, que es útil para posteriores fines de identificación. Normalmente, esta etapa sigue a la liberación de peptoides desde soportes sólidos. Tras la detección selectiva, los peptoides en la matriz duplicada localizados en las posiciones correspondientes a los peptoides de transfección, identificados por la detección selectiva, se caracterizan usando procedimientos y materiales adecuados, por ejemplo mediante espectrometría de masas, por ejemplo mediante espectrometría de masas en tándem (MS-MS).
En otras formas de realización de estos procedimientos, las células comprenden distintos tipos celulares y la identificación es eficaz para identificar peptoides capaces de liberar de forma selectiva oligonucleótidos en un tipo de célula seleccionada (p. ej., una célula tumoral o una célula endotelial) en relación con un tipo de célula no seleccionada (una célula no tumoral o una célula epitelial, respectivamente).
Se apreciará que los procedimientos de la invención permiten la identificación de peptoides eficaces tras la detección selectiva y no requiere que las secuencias de los peptoides, por ejemplo peptoides en una biblioteca combinatoria, se conozcan con antelación. Los peptoides descritos en la presente memoria descriptiva, que incluyen lipitoides y colesteroides, presentan las ventajas de ser buenos candidatos para el transporte eficaz de oligonucleótidos y ser susceptibles a la síntesis combinatoria y a la detección selectiva de alto rendimiento.
También se proporciona un procedimiento de determinar la secuencia de un peptoide analito mediante espectrometría de masas en tándem, donde los N-sustituyentes del peptoide se seleccionan de una población conocida de sustituyentes. El procedimiento comprende (a) determinar los pesos moleculares predichos de los fragmentos que se producirían a través de la rotura de los enlaces amida en al menos un peptoide teórico, que posee una secuencia basada en una combinación de la población de N-sustituyentes conocida citada anteriormente; (b) someter al peptoide analito a la escisión mediante MS-MS para producir una población de iones de fragmentos de analitos de varios pesos moleculares; y (c) determinar si los pesos moleculares de dichos fragmentos de analitos corresponden a los pesos moleculares predichos y, por tanto, si el peptoide analito tiene la secuencia del peptoide teórico de (b). Preferentemente, los pesos moleculares predichos de los fragmentos se determinan para una pluralidad de peptoides teóricos, que poseen secuencias basadas en diferentes combinaciones de la población de N-sustituyentes conocida citada anteriormente. Opcionalmente, los N-sustituyentes en una o más posiciones seleccionadas en el peptoide analito están predeterminados.
Estos y otros objetos y características de la invención se harán más completamente evidentes cuando la siguiente descripción detallada de la invención se lea junto con las figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A-B comparan la eficacia de la transfección (1A) y la toxicidad (1B) de los agentes de transfección peptoides (Lipitoide 1 y Colesteroide 1; estructuras mostradas en las Fig. 1C-D, respectivamente) con las de los agentes de transfección comercialmente disponibles Lipofectamine®, Cytofectin^{TM} GSV y FuGene^{TM} 6 en la transfección de células SKOV3 con oligonucleótidos Akt1 antisentido (AS) y/o de control inverso (CI);
La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra las etapas en la detección selectiva de una biblioteca de agentes de transfección basados en peptoide para la liberación de oligonucleótidos;
La Figura 3 muestra un ejemplo sencillo de una biblioteca combinatoria de peptoides (colesteroide);
Las Figuras 4A-B muestra la correlación entre la captación de FITC-oligonucleótido y la pérdida del mensaje Akt1 en células MDA-MB-231 transfeccionadas con una mezcla de oligonucleótido-FITC y oligonucleótido AS (antisentido)-Akt1, usando una biblioteca de peptoides combinatorios como vehículos de liberación;
Las Figuras 5A-B ilustran la identificación de compuestos basados en peptoides sintetizados mediante un protocolo de mezcla y rotura usando MS/MS de nanonebulización;
La Figura 6 muestra deficiencia de mensaje por el antisentido Akt-1 transfeccionado en células MDA-231 usando peptoides resintetizados tras la identificación mediante MS/MS;
Las Figuras 7A-D muestran la transfección de cuatro líneas celulares diferentes (A: células de carcinoma colorrectal HCT116; B: células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231; C: células de adenocarcinoma de mama MCF7; y D: células endoteliales microvasculares humanas) usando una biblioteca de vehículos de liberación de peptoides sintetizados combinatoriamente; y
Las Figuras 8A-D muestran la transfección de cuatro líneas celulares diferentes (A. células epiteliales de mama 184B5. B. células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231. C. células fibroblastos 847. D. células de fibrosarcoma HT1080) usando una biblioteca de vehículos de liberación de peptoides sintetizados combinatoriamente.
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
Los términos siguientes tienen los siguientes significados a menos que se indique otra cosa.
Una "biblioteca combinatoria", en general, es una colección de compuestos basada en una estructura central que tiene sustituyentes independientemente variables, grupos funcionales o elementos estructurales. Para la gama de restos químicos seleccionados para cada uno de los elementos independientemente variables, en la biblioteca puede haber compuestos que contengan todas las posibles permutaciones de dichos elementos. El procedimiento para preparar una biblioteca combinatoria es preferentemente tal que todas o cualquier combinación de diversos miembros de la biblioteca se pueden sintetizar de forma simultánea.
Las bibliotecas de peptoides expuestas en la presente memoria descriptiva contienen normalmente de 2 a aproximadamente 1000, preferentemente de aproximadamente 10 a 500, y más preferentemente de aproximadamente 10 a 100 peptoides de secuencias diferentes.
Una "pluralidad" de miembros de una biblioteca o matriz incluye todos o dos o más miembros cualquiera de la biblioteca o matriz, y normalmente incluye al menos la mitad de la matriz.
Los términos "fase sólida", "resina", "esfera" y "partícula" se refieren a cualquier soporte o sustrato sólido sobre el cual se pueden llevar a cabo las etapas de reacción de síntesis química que implica una secuencia de etapas de reacción. Por tanto, el término incluye sustratos particulados tales como resinas de poliestireno que se han empleado tradicionalmente en síntesis químicas de Fmoc estándar, tal como resina "amida Rink" de Nova Biochem.
Un "peptoide" es una poli(amida N-sustituida), preferentemente una poli(glicina-N-sustituida), como se ha descrito, por ejemplo, en las publicaciones de PCT WO 94/06451, WO 98/06437, WO 99/08711 y la patente de EE.UU. n1 5.877.278 (Zuckermann y col.). Para la preparación de peptoides, véanse estas referencias así como: Bartlett, Santi y col., 1991; Horwell, Pritchard y col. 1991; Haenel 1994; Zuckermann y Kerr 1994; Hadas y Homik 1995; Desai, Nuss y col. 1996; Kobylecki y Gardner 1996; Ng, Warne y col. Zuckermann, Siegmund y col. 1998; Zuckermann, Troung y col., 1998; Zuckermann, Chinn y col. 1998; Zuckermann, Goff y col., 1999; 2000; y DE Modelo de utilidad, publicación nº 20005738, todos ellos citados anteriormente.
Una clase de peptoides tiene la fórmula general I:
2
donde
R^{a} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, -COOH, sulfonilo y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado con un resto de unión,
cada R^{b} se selecciona de forma independiente del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; e hidrógeno, donde al menos un grupo R^{b} no es hidrógeno;
R^{c} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, NH_{2}, -NHR, -NH(C=O)R, donde R es alquilo inferior; sulfonilo, hidracina y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado a un resto de unión; R^{1} y R^{2} se seleccionan de forma independiente de hidrógeno, alquilo inferior y alcoxi inferior;
X se selecciona de hidroxi, alcoxi, amino, guanidino, amidino, alquilamino, alquiltio, halógeno, nitro, ciano, ceto, aldehído, ácido carboxílico, éster carboxílico, amida carboxílica, ácido sulfónico y éster sulfónico; y
m es un número entero seleccionado de 2 a aproximadamente 50
En formas de realización seleccionadas, R^{c} se selecciona de -NH_{2}, -NHR y -NH(C=)R, donde R es alquilo inferior. Donde cada R^{1} y R^{2} es hidrógeno, la molécula es una poli(glicina N-sustituida). En relación al las cadenas N-laterales del peptoide, en formas de realización seleccionadas, al menos un R^{b} incluye un grupo que es catiónico a un pH fisiológicamente relevante (p. ej., aminoalquilo, amonio cuaternario, guanidino, amidino, imidazolio, pirinidinio) y al menos un R^{b} está sin cargar a un pH fisiológicamente relevante. cadenas laterales catiónicas encontradas en aminoácidos naturales. Entre los ejemplos se incluyen alquilo y aralquilo; ejemplos específicos son isopropilo y (p-metoxifenil)etilo. También se pueden usar cadenas laterales catiónicas o neutras de ácidos naturales. Preferentemente, cada grupo R^{b} incluye un grupo catiónico o no cargado. Una estructura particularmente preferida incluye una secuencia repetida de un grupo catiónico y dos grupos no cargados en R^{b}.
Un "resto lipídico" es un resto hidrofóbico que tiene un sustancial componente hidrocarburo, preferentemente comprende un grupo seleccionado de alquilo, alquenilo o alquinilo C_{10}-C_{50} ramificado o no ramificado, arilo, aralquilo, aralquenilo o aralquinilo C_{14}-C_{50}, o un núcleo esteroide. Entre los ejemplos de restos lipídicos se incluyen fosfolípidos de dialquilo o dialquelino, tal como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas y fosfatidilinositoles, glucolípidos, tal como cerebrósidos y gangliósidos, diacilglicéridos grasos, glucosilglicéridos, esfingolípidos y esteroides, incluidos los esteroles.
Un "lipitoide" es un peptoide sustituido con lípido, por ejemplo un compuesto de fórmula I anterior, donde R^{a} comprende un resto lipídico. Un "colesteroide" es un peptoide sustituido con colesterol, por ejemplo un compuesto de fórmula I anterior donde R^{a} comprende un resto de colesterilo. Aunque se prefieren los colesteroles, una posterior descripción de los esteroides útiles para incorporar en conjugados de esteroide-peptoide se encuentra en la publicación PCT WO 97/46223 (Fasbender y col.) y la correspondiente patente de EE.UU. Nº 5.935.936. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "peptoide" abarca lipitoides y colesteroides.
Una clase de lipitoides generalmente favorecida incluye compuestos de la fórmula: L-agente de unión-[N(CH_{2}CH_{2}
NH_{2})CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R) CH_{2} (C=O)-N (CH_{2}CH_{2}R) CH_{2} (C=O)]_{3}, donde el grupo lipídico L es un grupo derivado de ácido graso, tal como un grupo fosfolípido (es decir, ROOCCH_{2}CH(COOR)CH_{2}OP(O)_{2}O-), que tiene cadenas de alquenilo o alquilo graso entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud, o un grupo derivado de esteroide, tal como un grupo de colesterilo, y la porción de la molécula a la derecha del agente de unión es el segmento peptoide. El agente de unión puede tener un enlace directo i puede ser un grupo de unión sustancialmente lineal, tal como un oligopéptido o una cadena de alquilo, de cualquier longitud eficaz. El agente de unión también puede ser una cadena alquilo que tenga uno o más enlaces con heteroátomos, seleccionado del grupo constituido por éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido y éter, en cualquier extremo de la cadena o entre los enlaces de alquilo. En formas de realización seleccionadas, el agente de unión tiene una longitud de 2 a aproximadamente 30 átomos, o de 3 a aproximadamente 15 átomos. En el segmento peptoide, R se selecciona de alquilo (ramificado o no ramificado), aminoalquilo y aralquilo. Se prefieren los grupos aralquilo, tal como bencilo o p-metoxifeniletilo. Un único lipitoide puede incluir deferentes grupos R o pueden ser iguales en la molécula.
Estructuras de peptoides útiles no están, por supuesto, limitadas a la clase anterior y pueden variarse con facilidad mediante la síntesis en la fase sólida para producir bibliotecas de compuestos que se pueden seleccionar mediante los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.
"Alquilo" se refiere a un radical monovalente acíclico completamente saturado que contiene carbono e hidrógeno, que puede ser una cadena ramificada o lineal. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo e isopropilo. "Alquenilo" se refiere a un radical monovalente acíclico que contiene carbono e hidrógeno, que puede ser una cadena ramificada o lineal y que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. El grupo alquenilo puede estar monoinsaturado o poliinsaturado. De igual forma, "alquinilo" se refiere a un radical tal que tiene al menos un enlace triple carbono-carbono. Alquilo "inferior" (alquenilo, alquinilo, alcoxi, etc.) se refiere a un grupo que tiene de 1 a 6 carbonos, preferentemente de 1 a 4 carbonos.
"Arilo" se refiere a un radical aromático monovalente sustituido o insustituido que tiene un único anillo (p. ej., benceno) o dos o tres anillos condensados (p. ej., naftilo; fenantrilo). Generalmente se prefieren los grupos que tienen un único anillo (monocíclicos) o dos anillos condensados (bicíclicos), siendo particularmente preferidos los grupos monocíclicos. El término incluye grupos de heteroarilo, que son grupos de anillo aromático que tiene uno o más átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre en el anillo, como furano, pirrol, piridina, imidazol e indol. Por "sustituido" se quiere decir que uno o más hidrógenos del anillo en los grupos arilo está reemplazado por un grupo que no es hidrógeno, preferentemente seleccionado de halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, nitro, amida, amino terciario, hidroxi y halo(alquilo inferior).
"Aralquilo" se refiere a un alquilo, preferentemente alquilo inferior, sustituyente que además está sustituido con un grupo arilo; un ejemplo es un grupo bencilo. De igual forma, "aralquenilo" y "aralquinilo" se refieren a sustituyentes alquenilo o alquinilo sustituidos además con un grupo arilo.
Un "oligonucleótido" empleado en los procedimientos de detección selectiva de la invención tiene una longitud de, preferentemente, entre aproximadamente 10 y 50, y más preferentemente entre aproximadamente 15 y 30 nucleótidos.
El contacto de una mezcla peptoide-oligonucleótido "con una célula" incluye poner en contacto la mezcla con un tejido que contiene dichas células.
Un "peptoide de transfección" es uno que, en un ensayo de detección selectiva dada llevado a cabo de acuerdo con la invención, transfecciona la célula o tejido de prueba con el oligonucleótido de prueba.
"pH fisiológicamente relevante" está normalmente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8,5; más normalmente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0, y más normalmente entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5.
II. Transfección del oligonucleótido usando agentes basados en peptoide
Aunque existen muchos agentes de transfección para la liberación de ADN plasmídico a las células en cultivo, se ha prestado menos atención a la liberación de oligonucleótidos. Los presentes autores han descubierto que una serie de agentes de transfección basados en peptoides, previamente caracterizados pata la transfección de ADN plasmídico, también fueron capaces de formar complejos con oligonucleótidos y han facilitado la captación de oligonucleótidos marcados con FITC en muchos tipos de células, sin una toxicidad celular significativa. De forma similar a los resultados con la transfección de ADN, la transfección de oligonucleótidos en las células fue óptima a una proporción de la carga +/- de aproximadamente 1,5-2/1, y la presencia de suero no tuvo una influencia negativa a las proporciones analizadas.
Conjugador de peptoides catiónicos-lípidos (lipitoides y colesteroides, como se han descrito anteriormente) son reactivos particularmente eficaces para la liberación de ADN plasmídico así como oligonucleótidos en las células. Por ejemplo, Las Figuras 1A-B muestran la eficacia y la toxicidad de la transfección de agentes de transfección peptoides (Lipitoide 1 y Colesteroide 1; estructuras mostradas en las Figs. 1C-D, respectivamente) en comparación con los agentes de transfección comercialmente disponibles (Lipofectamine®, Cytofectin^{TM} GSV y FuGene^{TM} 6) en la transfección de células SKOV3 (carcinoma de ovario) con oligonucleótidos 300 nM. El oligonucleótido consistió en oligonucleótido antisentido Akt1 50 nM y control 250 nM (AS) o bien oligonucleótido control 300 nM (CI= control inverso). Para los agentes de transfección comercial se siguieron los protocolos del fabricante. Tras la transfección durante la noche, las células se sometieron a ensayos para la producción de ARN y análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles del mensaje de Akt1.
Los datos de transfección (Fig. 1A) muestran que los vehículos de liberación peptoides pudieron liberar de forma eficaz oligonucleótidos en las células. Los niveles del mensaje de Akt1 disminuyeron > 95% con lipitoide 1 y > 85% con colesteroide 1 en comparación con las células transfeccionadas con el control inverso correspondiente. Este nivel de deficiencia sugiere que la mayoría de las células fueron transfeccionadas de forma eficaz con oligonucleótido antisentido. Esta conclusión está respaldada por análisis FACS de las células SKOV3 transfeccionadas con oligonucleótidos marcados con FITC, en las que > 97% de las células fueron positivas para fluorescencia con FITC (datos no mostrados). En contraste, todos los agentes comerciales analizados o fueron ineficaces en la liberación de los oligonucleótidos (FuGene^{TM} 6) o mataron a las células (Lipofectamine®, Cytofectin^{TM} GSV), como se muestra en la Fig. 1B.
Como medida de toxicidad celular de los agentes de transfección, las células de las mismas transfecciones se marcaron con anexina V y PI, seguido por el análisis FACS (Fig. 1B). La fracción de células positivas para Anexina V, o para Anexina V y PI, son aquéllos en apoptosis en etapa precoz y tardía, respectivamente. Las células control no transfeccionadas y las células transfeccionadas usando Lipitoide 1, Colesteroide 1 o FuGene^{TM} 6 mostraron una tinción insignificante con anexina V o PI. En contraste con ello, las células transfeccionadas usando células (Lipofectamine®, Cytofectin^{TM} GSV se marcaron fuertemente con anexina V y PI, lo que indica que un alto porcentaje de células estaban sufriendo muerte celular programada.
III. Procedimiento de detección selectiva
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la detección selectiva de un peptoide (que incluye lipitoides y colesteroides) por eficacia en la transfección de una célula con un oligonucleótido. El procedimiento incluye las etapas de: proporcionar una pluralidad de peptoides de diferente secuencia en distintos compartimentos; formar una mezcla peptoide-oligonucleótido en al menos uno de estos compartimentos; poner en contacto esta mezcla con una célula; y determinar el grado de transfección de la célula por el oligonucleótido. La identidad del peptoide se puede determinar. Aunque en general existe un mayor ímpetu hacia la identificación de peptoides de transfección, la identificación de peptoides que no realicen la transfección también puede ser útil.
La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra las etapas en la detección selectiva de una biblioteca de agentes de transfección basados en peptoides para la liberación de oligonucleótidos. Las etapas, que se describen con más detalla a continuación, son las siguientes: a) Una biblioteca de dichos compuestos se sintetiza, en una forma de realización, mediante un protocolo de mezcla y rotura; b) una única esfera, que representa un único compuesto, se coloca en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos, se rompe y se disuelve en agua; c) cada compuesto se usa para formar un complejo con oligonucleótido añadido; d) cada complejo peptoide/oligonucleótido se añade a las células en un formato similar de múltiples pocillos y se analiza para determinar la capacidad de transfeccionar oligonucleótidos en las células, según se juzgue mediante múltiples posibles lecturas, como captación de FITC (e) o pérdida de un mensaje diana antisentido (f); a continuación el compuesto se identifica a partir de la matriz de peptoides escindidos usando, en una forma de realización, espectrometría de masas en tándem (MS-MS) (g).
A. Síntesis de peptoide
Los peptoides, como se han definido antes en las publicaciones PCT de co-propiedad WO 94/06451, WO 98/06437 y WO 99/08711 (Zuckermann y col.), basados en los números de serie de EE.UU. 60/023.867, 60/054.743, 07/950.853 y 09/132.808. La preparación de peptoides mediante adición escalonada de subunidades se describe en las publicaciones PCT referenciadas antes; véase también Murphy y col., 1998 y Huang y col., 1998, y referencias en las mismas. Brevemente, un soporte de fase sólida derivado de amina, preferentemente una resina "amida Rink" resina (4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxi; Nova Biochem) se bromoacetila (tras la eliminación del grupo Fmoc) y se añade una amina primaria que tiene la primera cadena lateral deseada, desplazando al bromo. La posterior adición de ácido bromoacético (para un peptoide poli-NSG) y aminas primarias seleccionadas se alterna para construir el peptoide.
La preparación de peptoides también se trata en Bartlett, Santi y col., 1991; Horwell, Pritchard y col. 1992; Haenel 1994; Zuckermann y Kerr 1994; Hadas y Homik 1995; Desai, Nuss y col. 1996; Kobylecki y Gardner 1996; Ng, Warne y col. 1996; Zuckermann, Siegmund y col. 1998; Zuckermann, Troung y col., 1998; Zuckermann, Chinn y col. 1998; Zuckermann, Goff y col., 1999; 2000; y DE Modelo de utilidad, publicación nº 20005738, todos ellos citados anteriormente.
Para la preparación de lipitoides o colesteroides, preferentemente el extremo N de un peptoide unido a resina se acila primero con un espaciador tal como Fmoc-ácido aminohexanoico o Fmoc-(\beta-alanina). Tras la eliminación del grupo Fmoc, el grupo amino primario reacciona con, por ejemplo cloroformiato de colesterol, para formar un enlace carbamato. Un resto lipídico derivado de ácido graso, tal como un fosfolípido, puede usarse en lugar del resto esteroide. El esteroide u otro resto lipídico también puede unirse al resto peptoide mediante otros enlaces, de cualquier longitud eficaz, fácilmente disponible para el experto. El resto esteroide o lipídico y el segmento peptoide también se pueden unir mediante un enlace directo.
La pluralidad de los peptoides de secuencia diferente es, preferentemente, una biblioteca combinatoria de peptoides. Tales bibliotecas se pueden preparar mediante la aplicación a la síntesis de peptoides de estrategias de síntesis combinatoria conocidas, que se describe con más detalle más adelante. Véase, por ejemplo, Thompson y col., 1996; Terrett y col., 1995 y Bunin, 1998. En particular, se pueden preparar bibliotecas combinatorias soportadas por partículas que contengan un gran número de polímeros usando los procedimientos descritos en el documento WO 99/58476 y la correspondiente solicitud de patente de EE.UU., nº de serie 60/084.843.
Los parámetros que varían en la síntesis de peptoides incluyen las cadenas N-laterales (incorporadas mediante la adición de aminas primarias) y el resto lipídico terminal. En una forma de realización, los peptoides tienen un resto terminal de colesterilo y diferentes distribuciones de cadenas N-laterales neutras y catiónicas. Un sencillo ejemplo de tal biblioteca se muestra en la Fig. 3.
El carácter catiónico del peptoide contribuye a su interacción con los oligonucleótidos cargados negativamente y, en último término, con los fosfolípidos celulares. Dado que el estado de carga se puede modular mediante el pKa de sus funcionalidades básicas y el pH celular local, se escogió un grupo de cadenas laterales básicas peptoides (pKa 4,5, 9 y 12, para una anilina, una amina primaria y un grupo de guanidina, respectivamente) con diferentes longitudes (etilo, butilo, bencilo) como cadenas laterales sustituyentes en la biblioteca de peptoides. Para explorar la influencia de una combinación de estas cadenas laterales juntas se incorporó un grupo funcional básico en cada tercer residuo en un peptoide 9-mer, para evaluar 64 combinaciones, Las otras posiciones se ocuparon con una cadena lateral de metoxifeniletilo, que se ha descubierto que da un equilibrio adecuado de hidrofobicidad (Huang, 1998; Murphy, 1998).
Los peptoides de diferente secuencia se proporcionan de un modo más cómodo para la detección selectiva en soportes de fase sólida, consistente con las síntesis de fase sólida que generalmente se emplean para su preparación. Una biblioteca de peptoides, con u peptoide por esfera, se puede generar en esferas poliméricas usando un protocolo de "mezcla y rotura", tal como se ha descrito antes. Es preferible que los soportes de esfera sean esferas de carga elevada (es decir, que proporcionen > 1 nmol de compuesto por esfera). También es preferible que los soportes de esfera tengan un diámetro sustancialmente uniforme, de modo que los volúmenes de reacción finales de los compuestos escindidos de los soportes de esfera tendrán concentraciones del compuesto sustancialmente uniformes.
Por ejemplo, la biblioteca descrita antes y mostrada en la Fig. 3 se preparó usando un protocolo de síntesis de mezcla y rotura en esferas poliméricas (Furia, 1991; Lam, 1991; Zuckermann y Banville, 1992). Se observó una carga media de 40 nMol por esfera (desv. estándar \pm 10%), con una pureza del 95% para un compuesto modelo.
En un procedimiento típico, tal grupo de esferas se hincha en un disolvente tal como diclorometano y, si se desea, se filtra a través de una malla de acero inoxidable. Las esferas, cada una de las cuales contiene un peptoide único, se distribuyen, una esfera por pocillo, en una matriz de compartimentos separados físicamente, por ejemplo una placa de 96 pocillos, como se muestra en la Fig. 2. Esta distribución se puede conseguir usando una sonda distribuidora de esferas, como se describe en el documento WO 99/58476. Brevemente, la sonda distribuidora de esferas usa el vacío para seleccionar pequeñas esferas de la mezcla de esferas y después usa una descarga de gas para liberar las esferas seleccionadas a una localización seleccionada, por ejemplo, en una matriz de pocillos.
Los peptoides se liberan a partir de las esferas del soporte mediante la escisión de un agente de unión escindible entre los peptoides y las esferas. En la técnica se conocen muchos enlaces químicamente escindibles; entre los ejemplos se incluyen disulfuros (escindibles mediante reducción, normalmente usando ditiotreitol), grupos azo (escindibles con diotionato), sulfonas (escindibles con fosfato básico, con o sin ditiotreitol), glicoles, escindibles mediante peryodato, y ésteres, escindibles mediante hidrólisis. En el caso de una resina amida Rink, como se ha descrito antes, o una resina Rink ácida, la fragmentación de la resina se consigue usando ácido trifluoroacético (TFA), como se describe en los Ejemplos siguientes. Tras la fragmentación, la mezcla de fragmentación se elimina mediante evaporación, y cada peptoide se disuelve en agua o tampón acuoso para obtener una biblioteca de soluciones oligoméricas de peptoides de diferentes secuencias, donde cada una de ellas normalmente tiene una concentración de aproximadamente 0,5 mM.
En una forma de realización, como se trata con más detalle más adelante, se prepara una matriz duplicada de soluciones peptoides mediante extracción de alícuotas de las respectivas soluciones peptoides. Esta matriz duplicada se usa para la posterior identificación.
B. Transfección y detección selectiva
Un oligonucleótido cuya transfección se va a someter a detección selectiva se añade a al menos un compartimento de la matriz de peptoides de diferente secuencia. Como se ha indicado antes, el oligonucleótido tiene una longitud de, preferentemente, entre aproximadamente 10 y 50, y más preferentemente entre aproximadamente 15 y 30 nucleótidos. En un experimento típico, una muestra de oligonucleótido consta de dos partes de un oligonucleótido inactivo (control, por ejemplo un control inverso) acoplado a FITC y una parte de un oligonucleótido antisentido activo, por ejemplo un oligonucleótido anti-Akt1. Las condiciones de la adición son tales que un peptoide de transfección forma un complejo con los oligonucleótidos. Las concentraciones finales adecuadas de los componentes son de de aproximadamente
200 nM para el oligonucleótido y de 3 \muM para el peptoide (véanse los Ejemplos).
A continuación, cada mezcla de peptoide-oligonucleótido se pone en contacto con una célula, como en un cultivo celular o muestra de tejido. Normalmente, los cultivos celulares se preparan sembrando en placas a 10.000-30.000 por pocillo el día anterior a la transfección y cambiando el contenido de cada pocillo a 70 \mul de medio de cultivo tisular fresco que contiene suero el día de la transfección. Tras la incubación durante la noche, las células se lavan dos veces con medio de cultivo fresco que contiene suero.
Después, las células se someten a detección selectiva por la transfección del oligonucleótido, de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Uno de tales procedimientos comprende detectar un marcador, tal como FITC, en el oligonucleótido. Las células que han suspendido el complejo oligonucleótido/peptoide se pueden identificar, tras el lavado, mediante escaneo para detectar fluorescencia FITC usando un lector de placas de fluorescencia.
Como alternativa, cuando el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia dirigida contra una porción de una secuencia ADN, pre-ARNm o ARNm implicada en la expresión de un producto génico en la célula, la detección selectiva comprende detectar una alteración en el nivel de expresión del gen diana en la célula. Por ejemplo, tras la transfección se aísla el ARNm de las células, se prepara una primera hebra de ADNc y se miden los niveles del mensaje para el gen de prueba, por ejemplo mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
Estos dos procedimientos se pueden combinar usando una mezcla de oligonucleótido control marcado con FITC y oligonucleótido antisentido Akt1, como se ha descrito antes. Primero, las células transfeccionadas se analizan para detectar fluorescencia FITC, después se lisan para aislar el ARN.
En un ejemplo, las células MDA-MB-231 se transfeccionaron con una mezcla de oligonucleótido FITC y oligonucleótido Akt1-AS (antisentido) usando la biblioteca de peptoides descrita antes como agentes de liberación. Las Fig. 4A-B muestran la correlación entre la captación de oligonucleótido-FITC y la pérdida de mensaje de Akt1 en estas células. Existe una buena correlación entre las muestras que muestran buena captación de oligonucleótido-FITC y aquéllos que muestran pérdida de mensaje de Akt1 (cuantificado mediante PCR cuantitativa en tiempo real de la primera hebra de ADNc preparada a partir de ARN de las células), lo que indica que se podría usar la captación de FITC o la pérdida de mensaje diana para identificar los agentes de transfección activa.
Se ha observado que un número pequeño de peptoides (p. ej., en el pocillo H4), que aparentemente transfeccionan Akt1-AS y causan pérdida de mensaje de Akt1 sin una captación acompañante en el oligonucleótido-FITC. Por tanto, la detección selectiva mediante captación-FITC puede perder un bajo porcentaje de peptoides que son capaces de transfeccionar oligonucleótido en las células. Para los oligonucleótidos antisentido, la selección del compuesto se basa mejor en los datos obtenidos de la liberación del oligonucleótido y la posterior deficiencia del mensaje.
C. Identificación del compuesto
A continuación se puede identificar cada peptoide de transfección, en cada mezcla en contacto con las células en las que se ha mostrado transfección. Como se ha indicado antes, también se pueden identificar, si se desea, los peptoides que no producen transfección. Preferentemente, esta identificación emplea una réplica de la placa madre, preparada, como se ha descrito antes, mediante las transferencia de una fracción pequeña de cada pocillo de la solución acuosa en la placa madre. En la detección selectiva de múltiples compuestos se identifican las localizaciones en los pocillos de los compuestos más eficaces y se determina la identidad del peptoide responsable de la transfección, usando la solución reservada de la placa madre.
Cualquier procedimiento adecuado para determinar las secuencias de peptoides se puede usar de acuerdo con este aspecto de la presente invención. En algunas formas de realización se usan métodos espectrográficos de masas. En un ejemplo concreto, se ha descubierto que la espectrometría de masas en tándem (MS-MS) es eficaz para caracterizar los compuestos peptoides descritos en la presente memoria descriptiva.
Las secuencias de peptoides que exhibían perfiles de liberación interesantes en el ensayo de deficiencia de Akt1 referenciado anteriormente (Fig. 5) se identificaron usando espectrometría de masas en tándem con nanonebulización (Smith, 1990; Carr, 1991). La Fig. 5A muestra la estructura genérica de un conjugado de colesterilo-peptoide, que muestra fragmentos N-terminales ("iones b") y fragmentos C-terminales ("iones y") que cabe esperar que se generen mediante ionización en el espectrómetro de masas. La Fig. 5B muestra el espectro de un conjugado de colesterilo-peptoide representativo. Los fragmentos predichos b2, b3, b4, b5, b6, b8, y2, y3, y5, y6, y7 e y8 fueron suficientes para identificar de forma no ambigua la secuencia de este conjugado de colesterilo-peptoide.
Otros procedimientos de identificación basados en MS también son útiles. Por ejemplo, la degradación de Edman o "capping" parcial durante la síntesis se puede usar para crear una secuencia en escalera, Seguido por MS para determinar la secuencia oligomérica.
Los compuestos que dieron positivo en los pocillos A2, A3, B5, C4, D3 y E3 de la Fig. 4 se resintetizaron para confirmar la liberación del oligonucleótido antisentido (véase la fig. 6). En el ensayo de confirmación, células MDA-MB-231 se sembraron en placas de 96 pocillos se transfeccionaron con una mezcla de FITC-oligo 200 nM y oligo Akt1-AS (antisentido) o Akt1-CI (control inverso) usando una diversidad de vehículos de liberación de colesteroide o de colesterol. Cinco de estos fueron nuevos colesteroides seleccionados como agentes de transfección activa de acuerdo con el procedimiento de la invención y resintetizados tras la identificación mediante MS/MS. Uno de estos colesteroides, designado "Colest. Inact", es un colesteroide nuevo que dio negativo para la liberación de oligonucleótido en la detección selectiva inicial. El Colesteroide 1 (véase la Fig. 1) se usó como vehículo de liberación control positivo y DC-colesterol como control negativo. Tras la transfección durante la noche, se aisló el ARN de las células y la PCR cuantitativa en tiempo real se usó para determinar los niveles de mensaje de Akt1 y de actina. Cada barra en la Fig. 6 representa el porcentaje de deficiencia en el mensaje de Akt1 en relación con un mensaje de actina cuando se comparó con células no transfeccionadas. Las barras de error representan la desviación estándar entre los cuatro pocillos transfeccionados usando cada vehículo de liberación.
Como se muestra en la fig. 6, los colesteroides resintetizados dieron deficiencia eficaz del mensaje Akt1 en las células MDA-231. Por tanto, se mostró que el protocolo para la síntesis e identificación de nuevos agentes de transfección aislaba compuestos que conservan sus características favorables tras la resíntesis.
D. Detección selectiva de transfección selectiva
En una forma de realización del procedimiento, las células o tejido usado para la transfección comprenden (en distintos compartimentos o en diferentes matrices) distintos tipos celulares. Por tanto, el procedimiento de detección selectiva se usa para identificar peptoides capaces de liberar de forma selectiva oligonucleótidos a un tipo celular seleccionado en relación con un tipo celular no seleccionado. Por ejemplo, el tipo celular seleccionado puede ser una célula tumoral, mientras que el tipo celular no seleccionado es una célula no tumoral. En otro ejemplo, el tipo celular seleccionado es una célula endotelial y el tipo celular no seleccionado es una célula epitelial. En tales solicitudes, se podrían generar más de una matriz duplicada de peptoides, con una reservada para fines de identificación y cada una de las otras usada para la detección selectiva de la transfección de un tipo celular o tisular dado. Este procedimiento se puede usar para detectar vehículos de liberación que transfeccionan de forma selectiva un tejido dado, por ejemplo como una ayuda a la terapia génica en animales.
Un ejemplo de la detección selectiva celular diferencial se muestra en las Figs. 7A-D. Cuatro líneas celulares diferentes, incluidas tres líneas de células tumorales (A: células de carcinoma colorrectal HCT116; B: células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231; C: células de adenocarcinoma de mama MCF7) y una línea de células no tumorales (D: células endoteliales microvasculares humanas) se transfeccionaron usando una biblioteca de vehículos de liberación de peptoides sintetizados combinatoriamente. Las células se transfeccionaron con oligonucleótido Akt1-AS 200 nM y oligonucleótido FITC-control y vehículo de liberación, como se describe en los Ejemplos, y la captación de oligonucleótido se cuantificó mediante fluorescencia celular tras la transfección durante la noche. En las Figuras, las barras punteadas indican compuestos que fueron eficaces en todos los tipos celulares, mientras que las barras con trama representan compuestos eficaces sólo en los tipos de célula que tienen potencial metastásico. Como se muestra en las Figuras, tres de los compuestos entran dentro de la última categoría.
Otro ejemplo se muestra en las fig. 8A-D. Se transfeccionaron cuatro tipos celulares usando un único panel de compuestos basados en peptoides pata liberar una mezcla de oligonucleótido control-FITC/oligonucleótido antisentido Akt1. Las células epiteliales de mama 184B5 y los fibroblastos 847 son células no tumorales, mientras que las células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 y las células de fibrosarcoma HT1080 son tipos celulares formadores de tumores y metastásicos. Algunos de estos compuestos analizados pudieron causar un incremento de la transfección de los cuatro tipos celulares, como indica la deficiencia del mensaje de Akt1 (p. ej., compuestos de los pocillos B2 y F4). Otros compuestos estimularon la deficiencia de Akt1 en algunos, aunque no en todos, de los cuatro tipos celulares (p. ej., los compuestos de los pocillos C1, F5, G6, D10 y D11).
Tal detección selectiva es útil en la identificación de compuestos que transfeccionan de forma selectiva oligonucleótidos en células seleccionadas por algunas características concretas. Tal selectividad en la transfección sería particularmente útil para la liberación de oligonucleótidos antisentido in vivo.
Los agentes basados en peptoide descritos en la presente memoria descriptiva son eficaces agentes de transfección de oligonucleótidos, lo que proporciona una elevada eficacia de la transfección, la pérdida eficaz del mensaje de prueba en respuesta a un oligonucleótido antisentido, toxicidad baja y compatibilidad con suero. Usando síntesis combinatoria en esferas, preferentemente en combinación con un procedimiento de recogida esferas automático, un gran número de nuevos conjugados peptoides se puede generar en cantidad y pureza adecuadas para su uso directamente en una detección selectiva de alto rendimiento, por ejemplo una detección de deficiencia de ARNm, en una diversidad de líneas celulares.
Una de las características de estos agentes de transfección basados en peptoides que convierte en viable su detección selectiva por transfección de un formato tal que no requieren formulación con otros lípidos. No obstante, una vez que se identifica un peptoide como eficaz en la transfección del oligonucleótido en un tipo celular concreto, puede ser posible modificar o potenciar estas características mediante formulación con otros lípidos.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes ilustran pero no están destinados a limitar la invención.
Síntesis de peptoides. Los disolventes, las aminas y otros reactivos se adquirieron de fuentes comerciales y se usaron sin más purificación. Los oligómeros peptoides se sintetizaron en 50 \mumol de resina amida Rink (Nova Biochem) mediante una modificación de los procedimientos previos (Zuckermann, Kerr y col., 1992; Figliozzi, 1996). Tras la eliminación del primer grupo Fmoc, se realizó el siguiente ciclo adición del monómero mediante un sintetizador robótico y se repitió hasta obtener la longitud deseada.
La resina amino se bromoacetiló añadiendo 830 \mul de ácido bromoacético 1,2M en N,N-dimetilformamida (DMF) y 200 \mul de N,N'-diisopropialcarbodiimida (DIC). Esta solución se agitó durante 40 min a 35ºC, se drenó y se lavó con DMF (3 x 2 ml). A continuación, se añadieron 0,85 ml de una solución 1M de una amina primaria en DMSO, para introducir la cadena lateral. Esta solución se agitó durante 40 min a 35ºC, se drenó y se lavó con DMF (4 x 2 ml). En un procedimiento alternativo, las aminas se disolvieron en N-metilpirrolidona en lugar de en dimetilsulfóxido.
Los peptoides se liberaron de las esferas usando TFA al 50% (v/v) en dicloroetano con trietilsilano al 1%. Cada macroesfera se recogió usando un recolector automático de esferas (Publicación PCT Nº WO 9958476) y se transfirieron a placas de polipropileno de 96 pocillos (forma V, Greiner) para su escisión y almacenamiento.
Conjugación con colesterol. Una conjugado de peptoide-colesterol (colesteroide) se preparó del siguiente modo. El extremo amino de un peptoide unido a resina se trató con FMOC-\beta-Ala-OH (0,24 eq.) y DIC (0,26 eq.) en DMF durante 20 min a 85ºC. el soporte se lavó con 3 x 2 de DMF. Se añadió piperidina (20% v/v en DMF, 3 ml), seguido por 20 eq. de cloroformiato de colesterilo y 20 eq. de DIEA (neto, 173 \mul). Tras la finalización de la reacción, el conjugado se escindió del soporte mediante tratamiento con TFA al 50% (V/v) en CH_{2}Cl_{2}.
Protocolo de síntesis Combinatoria (Mezcla-Rotura). El siguiente protocolo ilustrativo de mezcla-rotura se usó para una síntesis combinatoria de sesenta y cuatro peptoides de diferentes secuencias empleando cuatro aminas primarias distintas. Cada "ciclo submonomérico" comprendió bromoacetilación, seguida por la adición de una amina primaria.
Desprotección de resina Fmoc
Lavado con DMF
Ciclo submonomérico 1
Ciclo submonomérico 2
Distribuir la resina en 4 vasos
Drenar los vasos de reacción
Ciclo submonomérico 3
Recombinar la resina en un único vaso,
Drenar los vasos de reacción
Ciclo submonomérico 4
Ciclo submonomérico 5
Distribuir la resina en 4 vasos
Drenar los vasos de reacción
Ciclo submonomérico 6
Recombinar la resina en un único vaso,
Drenar los vasos de reacción
Ciclo submonomérico 7
Ciclo submonomérico 8
Distribuir la resina en 4 vasos
Drenar los vasos de reacción
Ciclo submonomérico 9
Fmoc (acoplamiento-Ala acoplamiento cloroformiato (formación de un conjugado lipídico o de colesterilo).
\vskip1.000000\baselineskip
Escisión de los compuestos de la biblioteca de los soportes de esferas. En una placa de multipocillos, a cada pocillo que contiene esferas se añadió un cóctel de escisión (TFA/DCE, 50:50, 75 \mul). Tras una hora, la placa se transfirió a un evaporador de vacío, Speed-vac, (evaporador Savant AES200 equipado con un rotor portador de placas de 96 pocillos) para eliminar la mayoría de los gases volátiles de la placa. Cada pocillo se trató con solución de acetonitrilo/agua (CH_{3}CN 50% [v/v] en H_{2}O 75 \mul) y se agitó durante 10 minutos usando un agitador de placas de microtitulación. La placa se transfirió a un evaporador de vacío, Speed-vac, y los gases volátiles se eliminaron durante un periodo de 30 minutos. El contenido de cada pocillo (normalmente un compuesto de peptoide único) se disolvió en agua o tampón (80 \mul), se transfirió a una placa de propileno de 96 pocillos (200 \mul, de fondo en v) y se almacenó, en caso necesario, a -20ºC.
Transfección. Para las transfecciones en placas de 6 pocillos, las células se sembraron en placas a 250.000 células por pocillo un día antes de la transfección, para dar una densidad de 60-80% en el momento de la transfección. El oligonucleótido antisentido o de control inverso se diluyó hasta Opti-MEM 2 \muM (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para transfección. Los agentes de transfección de peptoides se diluyeron hasta una proporción de
1,5 nmol de vehículo por \mug de oligonucleótido en el mismo volumen de Opti-MEM. El oligonucleótido diluido y el vehículo peptoide diluido se mezclaron después e inmediatamente se añadieron a las células en el medio de cultivo hasta una concentración final de oligonucleótidos 200-300 nM tal y como se indica para cada experimento. Tras la incubación durante la noche, la mezcla de transfección se reemplazó por medio de cultivo fresco.
Las transfecciones fueron similares para la detección selectiva en 96 pocillos y el reanálisis de los vehículos, a excepción de que las células se sembraron a 20.000 por pocillo y todas las etapas de mezclado y dilución se realizaron usando una multipipeta Sagian Multipippette Pipettor de 96 canales. Las células que se iban a someter a detección selectiva se sembraron en placas a 10.000 a 30.000 por pocillo en dos placas de cultivo tisular de 96 pocillos el día antes de la transfección. El día de la transfección, las células se cambiaron a 70 \mul de medio de cultivo tisular fresco que contenía suero. El oligonucleótido, constituido por 2 partes de un oligonucleótido inactivo acoplado a FITC y una parte de oligonucleótido antisentido, se diluyó en Opti-MEM hasta 1,3 \muM. Los compuestos peptoides a analizar para determinar la liberación de oligonucleótidos se dispusieron en un formato de 96 pocillos a una concentración de 0,5 mM en agua. Dos microlitros de cada uno se diluyeron en Opti-MEM hasta una concentración de 20 \muM. Los oligonucleótidos diluidos se mezclaron en peptoides diluidos y los oligonucleótidos-peptoide formados se diluyeron después en las células en el medio. Placas duplicadas de células se transfeccionaron con una concentración final de oligonucleótido 200 nM y peptoide 3 \muM. Tras la transfección durante la noche, las células se lavaron dos veces con medio con suero.
Para la comparación de los agentes de transfección comerciales con los agentes de transfección peptoides, se usaron Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies), Cytofectin GSV (Glen Research, Sterling, VA) y Fugene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del prospecto, y las células se transfeccionaron durante la noche en Opti-MEM (Lipofectine y Cytofectin GSV) o medio con suero (Fugene 6).
Los oligonucleótidos antisentido se sintetizaron en Chiron Corporation de acuerdo con los procedimientos estándar y tenían las secuencias siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
AKT1-AS: CCATAGTGAGGTTGCATCTGGTGCC (SEC ID Nº 1);
AKT1-CI: CCGTGGTCTACGTTGGAGTGATACC (SEC ID Nº 2). 
\vskip1.000000\baselineskip
Aislamiento de ARN y PCR. El ARN de las células transfeccionadas en el formato de 6 pocillos se aisló usando el kit de aislamiento de ARN de alta pureza (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN). Para las células transfeccionados en el formato de 96 pocillos, se usó el kit RNeasy 96 (Qiagen, Valencia, CA). Se realizó la transcripción inversa del ARN usando transcriptasa inversa MMLV y RNasin (Ambion) y oligo-s(T)18 sintetizado en Chiron Corporation. Se cuantificó una alícuota de 2 \mul de cada reacción TI de 20 \mul para determinar los niveles de mensaje de AKT1 o de actina usando un Gene Amp 5700 y Sybr Green PCR Master Mix de Applied Biosystems (Foster City, CA). Las cantidades resultantes del nivel del mensaje de Akt1 se normalizaron con los niveles del mensaje de actina de la misma muestra para normalizar las variaciones en el rendimiento de ARN o de la transcripción inversa.
\newpage
Los cebadores usados para la PCR cuantitativa se sintetizaron en Chiron Corporation de acuerdo con procedimientos estándar y tenías las secuencias siguientes. Los cebadores se usaron a una concentración final de 180 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
\beta-actina directo: 5'-CGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3' (SEC IDE Nº 3);
\beta-actina INVERSO: 5'-TGATCTCCTTCTGCATCCTGTCGG-3' (SEC IDE Nº 4);
Akt1 directo: 5'-GAAGTGGGGCCTGCGCTCGCGTGT-3' (SEC IDE Nº 5);
Akt1 inverso: 5'-ATCGTGTGGCAGCACGTGTACG-3' (SEC IDE Nº 6). 
\vskip1.000000\baselineskip
Espectrometría de masas en tándem. Para la desconvolución, cada placa con solución peptoide se secó en un evaporador de vacío, Speed-vac, Savant AES200 durante 60 min y a cada pocillo se añadió una solución de CH_{3}CN en H_{2}O (100 \muL). La solución resultante se usó para el análisis MS-MS. En algunos casos se realizó una etapa de purificación C4 ZipTip siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayo de apoptosis. Tras la transfección con oligonucleótidos antisentido y varios agentes de transfección, las células se extrajeron suavemente de las placas usando tripsina al 0,05% y EDTA 2 mM, se lavaron en un tampón con Hepes 10 mM pH 7,2, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 5 mM y se marcaron con yoduro de propidio a una concentración final de 1 \mug/ml y Annexin-V-FLUOS (Roche Molecular Biochemicals). A continuación, las células se analizaron para determinar el marcaje con cada marcador usando un FACScan de Becton Dickinson.
<110> Chiron Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de detección selectiva de transfección de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 52456-8024.W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US01/49175
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2001-12-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/257,975
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-12-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/329,185
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-10-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatagtgag gttgcatctg gtgcc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgtggtcta cgttggagtg atacc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggaaatcg tgcgtgacat taag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgatctcctt ctgcatcctg tcgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagtggggc ctgcgctcgc tgt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgtgtggc agcacgtgta cg 
\hfill
22

Claims (29)

1. Un procedimiento para la detección selectiva de un peptoide según la eficacia en transfeccionar una célula con un oligonucleótido, en el que el procedimiento comprende:
proporcionar una pluralidad de peptoides de diferente secuencia en compartimentos separados;
formar una mezcla peptoide-oligonucleótido en al menos uno de dichos compartimentos;
poner en contacto dicha mezcla con una célula;
determinar el grado de transfección de dicha célula por dicho oligonucleótido.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende identificar un peptoide de transfección en contacto con una célula transfeccionada.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos peptoides están soportados en partículas sólidas.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que cada uno de dichos compartimentos contiene una única partícula, y cada una de dichas partículas lleva unida a ella peptoides de la misma secuencia.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, que además comprende la etapa de liberar los peptoides desde la partícula en dicho al menos un compartimento, antes de formar dicha mezcla peptoide-oligonucleótido.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido dirigido contra un producto génico en dicha célula, y dicha determinación comprende detectar una alteración en el nivel de expresión de dicho gen.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos peptoides de diferente secuencia tienen la fórmula general I:
3
en la que
R^{a} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, -COOH, sulfonilo y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado con un resto de unión,
cada R^{b} se selecciona de forma independiente del grupo construido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; e hidrógeno,
en el que al menos un grupo R^{b} no es hidrógeno;
R^{c} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, NH_{2}, -NHR, -NH(C=O)R, donde R es alquilo inferior; sulfonilo, hidracina y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado a un resto de unión;
X se selecciona de hidroxi, alcoxi, amino, guanidino, amidino, alquilamino, alquiltio, halógeno, nitro, ciano, ceto, aldehído, ácido carboxílico, éster carboxílico, amida carboxílica, ácido sulfónico y éster sulfónico;
R^{1} y R^{2} se seleccionan de forma independiente de hidrógeno, alquilo inferior y alcoxi inferior; y
m es un número entero seleccionado de 2 a aproximadamente 50.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que en la fórmula I, R^{a} comprende un resto lipídico y R^{c} se selecciona de -NH_{2}, -NHR y -NH(C=O)R, donde R es alquilo inferior.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho resto lipídico es un esterol.
10. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la fórmula I, cada R^{1} y R^{2} es hidrógeno.
11. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que en la fórmula I, al menos un R^{b} incluye un grupo que es catiónico a pH fisiológicamente relevante, y al menos un R^{b} no está cargado a pH fisiológicamente relevante.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho grupo catiónico se selecciona de aminoalquilo, amonio, guanidino, amidino, imidazolio, piridinio y cadenas laterales catiónicas que se encuentran en aminoácidos naturales.
13. Un procedimiento de detección selectiva de una biblioteca de peptoides de secuencia diferente por eficacia en la transfección de una célula con un oligonucleótido, en el que el procedimiento comprende:
(i)
poner en contacto cada miembro de la biblioteca con un oligonucleótido para formar una pluralidad de mezclas de peptoide-oligonucleótido,
(ii)
poner en contacto cada mezcla con una célula;
(iii)
la detección selectiva de cada célula para la transfección del oligonucleótido; e
(iv)
identificar peptoides de transfección en mezclas en contacto con células transfeccionadas.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha biblioteca de peptoides se proporciona en una matriz de compartimentos físicamente separados.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dichos peptoides están soportados en partículas sólidas.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, que además comprende la etapa de liberar los peptoides de las partículas en dichos compartimentos, antes de dicha etapa de contacto (i).
17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho compartimento contiene una única partícula y cada partícula contiene un único peptoide.
18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que, antes de la etapa de contacto (i), se crea una matriz duplicada de dicha biblioteca de peptoides.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la etapa de identificación (iv) comprende identificar peptoides en dicha matriz duplicada en las posiciones correspondientes a peptoides de transfección.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicha identificación se realiza mediante espectrometría de masas en tándem (MS-MS).
21. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dichas células comprenden diferentes tipos celulares y dicha identificación es eficaz para identificar peptoides capaces de liberar de forma selectiva oligonucleótidos a un tipo celular seleccionado en relación con un tipo celular no seleccionado.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho tipo celular seleccionado es una célula tumoral y dicho tipo celular no seleccionado es una célula no tumoral.
23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho tipo celular seleccionado es una célula endotelial y dicho tipo celular no seleccionado es una célula epitelial.
24. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dichos peptoides de diferente secuencia tienen la fórmula general I:
4
en la que
R^{a} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, -COOH, sulfonilo y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado con un resto de unión,
cada R^{b} se selecciona de forma independiente del grupo construido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; e hidrógeno,
en el que al menos un grupo R^{b} no es hidrógeno;
R^{c} se selecciona del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más grupos X; hidrógeno, -OH, -SH, NH_{2}, -NHR, -NH(C=O)R, donde R es alquilo inferior; sulfonilo, hidracina y un resto lipídico, donde el resto lipídico puede estar conjugado a un resto de unión;
X se selecciona de hidroxi, alcoxi, amino, guanidino, amidino, alquilamino, alquiltio, halógeno, nitro, ciano, ceto, aldehído, ácido carboxílico, éster carboxílico, amida carboxílica, ácido sulfónico y éster sulfónico;
R^{1} y R^{2} se seleccionan de forma independiente de hidrógeno, alquilo inferior y alcoxi inferior; y
m es un número entero seleccionado de 2 a aproximadamente 50.
25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que en la fórmula I, R^{a} comprende un resto lipídico y R^{c} se selecciona de -NH_{2}, -NHR y -NH(C=O)R, donde R es alquilo inferior.
26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que dicho resto lipídico es un esterol.
27. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que en la fórmula 1, cada uno de R^{1} y R^{2} es hidrógeno.
28. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que en la fórmula I, al menos un R^{b} incluye un grupo que es catiónico a pH fisiológicamente relevante, y al menos un Rb está sin cargar a pH fisiológicamente relevante.
29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicho grupo catiónico se selecciona de aminoalquilo, amonio, guanidino, amidino, imidazol, piridinio y cadenas laterales catiónicos encontrados en aminoácidos naturales.
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