JP2008086318A - オリゴヌクレオチドトランスフェクションスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本出願は、オリゴヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトする際の有効性についてペプトイドをスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、別個の区画において複数の異なる配列のペプトイドを提供する工程;この区画のうちの少なくとも1つにおいてペプトイド−オリゴヌクレオチド混合物を形成する工程;この混合物を細胞と接触させる工程;このオリゴヌクレオチドによるこの細胞のトランスフェクションの程度を決定する工程;を包含する。
【選択図】なし
Description
本発明は、オリゴヌクレオチドでの細胞のトランスフェクションにおける有効性について、異なる配列のペプトイド(脂質結合体化ペプトイドおよびステロール結合体化ペプトイドを含む)(特に、このような化合物のコンビナトリアルライブラリー)をスクリーニングするための方法に関する。
遺伝子同定における最近の急増に伴い、機能的ゲノミックスのための効率的なツールを開発することが重要となっている。最も価値あるものの1つは、細胞ベースのアッセイにおいて遺伝子機能を確認するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド技術の使用である。細胞性メッセージを減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力は、現在、十分に証明されている。しかし、これらの効力は、達成される細胞濃度および細胞内のオリゴヌクレオチドの位置に、一部依存する(Garcia−Chaumont、2000;Marcusson、1998)。多くの薬剤が、DNAの送達のために開発されており、そしてこれらのいくつかは、インビトロで核酸を細胞に送達することが示されている。これらの薬剤としては、カチオン性ポリマー(例えば、ポリリジン)およびカチオン性脂質が挙げられる。例えば、リポソーム組成物Lipofectin(登録商標)(Felgnerら、1987)(これは、カチオン性脂質DOTMA(N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド)および中性リン脂質DOPE(ジオレイルホスファチジルエタノールアミン)を含む)が、広範に使用されている。Benimetskaya、1998;Bennett、1992;Cao、2000;DeLong、1999;Kang、1999;Morris、1997;Lewis、1996;およびYoo、2000もまた参照のこと。
1つの局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドでの細胞のトランスフェクションにおける有効性について、ペプトイド(例えば、リピトイドまたはコレステロイド)をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する:別々の区画に複数の異なる配列のペプトイドを提供する工程;これらの区画のうちの少なくとも1つにおいてペプトイド−オリゴヌクレオチド混合物を形成する工程;この混合物を細胞と接触させる工程;およびこのオリゴヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションの程度を決定する工程。トランスフェクションの程度は、例えば、オリゴヌクレオチド(これは、その細胞において発現される配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである)を使用して、そしてその細胞中のその配列のレベルにおける変化を検出することによって決定され得る。次いで、ペプトイドが、特に、それが、トランスフェクトペプトイドである場合に、同定される。非トランスフェクトペプトイドもまた、同定され得る。
Raは、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニルおよびアラルキニル(これらのいずれかは、1以上の基Xで置換され得る);水素、−OH、−SH、−COOH、スルホニルおよび脂質部分からなる群より選択され、ここで、この脂質部分は、リンカー部分に結合体化され得;
各Rbは、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニルおよびアラルキニル(これらのいずれかは、1以上の基Xで置換され得る);および水素からなる群より独立して選択され;
ここで、少なくとも1つの基Rbは、水素ではなく;
Rcは、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニルおよびアラルキニル(これらのいずれかは、1以上の基Xで置換され得る);水素、−OH、−SH、−NH2、−NHR、−NH(C=O)R(ここで、Rは、低級アルキルである);スルホニル、ヒドラジンおよび脂質部分からなる群より選択され、ここで、この脂質部分は、リンカー部分に結合体化され得;
R1およびR2は、水素、低級アルキルおよび低級アルコキシから独立して選択され;
Xは、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、グアニジノ、アミジノ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ケト、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホン酸およびスルホン酸エステルから選択され;そして
mは、2〜約50から選択される整数である。
(i)このようなライブラリーの各メンバーをオリゴヌクレオチドと接触させて、複数のペプトイド−オリゴヌクレオチド混合物を形成する工程;
(ii)各混合物を細胞と接触させる工程;
(iii)このオリゴヌクレオチドのトランスフェクションについて各細胞をスクリーニングする工程;および
(iv)トランスフェクトされた細胞を接触された混合物において、トランスフェクトペプトイドを同定する工程。
したがって、本発明は以下を提供する。
(1)オリゴヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトする際の有効性についてペプトイドをスクリーニングするための方法であって、上記方法は、
別個の区画において複数の異なる配列のペプトイドを提供する工程;
上記区画のうちの少なくとも1つにおいてペプトイド−オリゴヌクレオチド混合物を形成する工程;
上記混合物を細胞と接触させる工程;
上記オリゴヌクレオチドによる上記細胞のトランスフェクションの程度を決定する工程;
を包含する、方法。
(2)トランスフェクトされた細胞と接触しているトランスフェクションペプトイドを同定する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(3)上記ペプトイドが固体粒子上に支持される、項目1に記載の方法。
(4)上記区画の各々が、単一の粒子を含み、そしてこのような粒子各々が、上記粒子に結合している同じ配列のペプトイドを有する、項目3に記載の方法。
(5)項目4に記載の方法であって、上記ペプトイド−オリゴヌクレオチド混合物を形成する工程の前に、上記少なくとも1つの区画にある上記粒子から上記ペプトイドを遊離させる工程をさらに包含する、方法。
(6)項目1に記載の方法であって、上記オリゴヌクレオチドが、上記細胞における遺伝子産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、そして上記決定する工程が、上記遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程を包含する、方法。
(7)項目1に記載の方法であって、上記異なる配列のペプトイドが、一般式I:
を有し、ここで、
R a は、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル、水素、−OH,−SH、−COOH,スルホニル、および脂質部分からなる群より選択され、上記アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニルのいずれも、1つ以上の基Xで置換され得、上記脂質部分は、リンカー部分に結合体化され得;
各R b は、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル、および水素からなる群より独立して選択され、上記アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニルのいずれも、1つ以上の基Xで置換され得、少なくとも1つの基R b は水素ではなく;
R c は、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル、水素、−OH,−SH、−NH 2 、−NHR、−NH(C=O)R、スルホニル、ヒドラジン、および脂質部分からなる群より選択され、上記アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニルのいずれも、1つ以上の基Xで置換され得、Rは、低級アルキルであり、上記脂質部分は、リンカー部分に結合体化され得;
Xは、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、グアニジノ、アミジノ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ケト、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホン酸、およびスルホン酸エステルから選択され:
R 1 およびR 2 は、水素、低級アルキル、および低級アルコキシから独立して選択され;そして
mは、2〜約50から選択される整数である、
方法。
(8)項目7に記載の方法であって、式Iにおいて、R a は、脂質部分を含み、そしてR c は、−NH 2 、−NHR、および−NH(C=O)Rから選択され、Rは、低級アルキルである、方法。
(9)項目8に記載の方法であって、上記脂質部分がステロールである、方法。
(10)項目7に記載の方法であって、式Iにおいて、R 1 およびR 2 の各々が水素である、方法。
(11)項目7に記載の方法であって、式Iにおいて、少なくとも1つのR b が、生理学的に適切なpHでカチオン性である基を含み、そして少なくとも1つのR b が、生理学的に適切なpHで非荷電である、方法。
(12)項目11に記載の方法であって、上記カチオン性基は、アミノアルキル、アンモニウム、グアニジノ、アミジノ、イミダゾリウム、ピリジニウム、および天然に存在するアミノ酸上に見出されるカチオン性側鎖から選択される、方法。
(13)オリゴヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトする際の有効性について、異なる配列のペプトイドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、上記方法は、
(i)複数のペプトイド−オリゴヌクレオチド混合物を形成するために、オリゴヌクレオチドと上記ライブラリーの各メンバーとを接触させる工程;
(ii)上記混合物各々を細胞と接触させる工程;
(iii)上記オリゴヌクレオチドのトランスフェクションについて各細胞をスクリーニングする工程;および
(iv)トランスフェクトされた細胞と接触している、混合物中のトランスフェクトペプトイドを同定する工程;
を包含する、方法。
(14)上記ペプトイドのライブラリーが、物理的に別個の区画のアレイ中に提供される、項目13に記載の方法。
(15)上記ペプトイドが、固体粒子上に支持される、項目13に記載の方法。
(16)項目15に記載の方法であって、上記接触させる工程(i)の前に、上記区画中の上記粒子から上記ペプトイドを放出させる工程をさらに包含する、方法。
(17)各区画が単一の粒子を含み、そして各粒子が単一のペプトイドを含む、項目15に記載の方法。
(18)項目16に記載の方法であって、上記接触させる工程(i)の前に、上記ペプトイドのライブラリーの複製アレイが作製される、方法。
(19)項目18に記載の方法であって、上記同定する工程(iv)が、トランスフェクトペプトイドに対応する位置にある上記複製アレイ中のペプトイドを同定する工程を包含する、方法。
(20)項目19に記載の方法であって、上記同定する工程が、タンデム質量分析計(MS−MS)により行われる、方法。
(21)項目13に記載の方法であって、上記細胞が、個別の細胞型を含み、そして上記同定する工程が、選択していない細胞型と比較して選択した細胞型にオリゴヌクレオチドを選択的に送達することができるペプトイドを同定するために有効である、方法。
(22)項目21に記載の方法であって、上記選択された細胞型が腫瘍細胞であり、そして上記選択されていない細胞型が非腫瘍細胞である、方法。
(23)項目21に記載の方法であって、上記選択された細胞型が内皮細胞であり、そして上記選択されていない細胞型が上皮細胞である、方法。
(24)項目13に記載の方法であって、上記異なる配列のペプトイドが、一般式I
を有し、ここで、
R a は、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル、水素、−OH,−SH、−COOH,スルホニル、および脂質部分からなる群より選択され、上記アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニルのいずれも、1つ以上の基Xで置換され得、上記脂質部分は、リンカー部分に結合体化され得;
各R b は、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル、および水素からなる群より独立して選択され、上記アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニルのいずれも、1つ以上の基Xで置換され得、少なくとも1つの基R b は水素ではなく;
R c は、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル、水素、−OH,−SH、−NH 2 、−NHR、−NH(C=O)R、スルホニル、ヒドラジン、および脂質部分からなる群より選択され、上記アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニルのいずれも、1つ以上の基Xで置換され得、Rは、低級アルキルであり、上記脂質部分は、リンカー部分に結合体化され得;
Xは、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、グアニジノ、アミジノ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ケト、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホン酸、およびスルホン酸エステルから選択され:
R 1 およびR 2 は、水素、低級アルキル、および低級アルコキシから独立して選択され;そして
mは、2〜約50から選択される整数である、
方法。
(25)項目24に記載の方法であって、式Iにおいて、R a は、脂質部分を含み、そしてR c は、−NH 2 、−NHR、および−NH(C=O)Rから選択され、Rは、低級アルキルである、方法。
(26)項目25に記載の方法であって、上記脂質部分がステロールである、方法。
(27)項目24に記載の方法であって、式Iにおいて、R 1 およびR 2 の各々が水素である、方法。
(28)項目24に記載の方法であって、式Iにおいて、少なくとも1つのR b が、生理学的に適切なpHでカチオン性である基を含み、そして少なくとも1つのR b が、生理学的に適切なpHで非荷電である、方法。
(29)項目28に記載の方法であって、上記カチオン性基は、アミノアルキル、アンモニウム、グアニジノ、アミジノ、イミダゾール、ピリジニウム、および天然に存在するアミノ酸上に見出されるカチオン性側鎖から選択される、方法。
(30)タンデム質量分析法により分析物であるペプトイドの配列を決定する方法であって、上記ペプトイド上のN−置換基は、既知の置換基集団から選択され、上記方法は、
少なくとも1つの理論的ペプトイド中のアミド結合を切断することにより生成されるフラグメントの推定分子量を決定する工程であって、上記理論的ペプトイドは、上記既知のN−置換基集団の1つの組み合わせに基づく配列を有する、工程;
種々の分子量の分析物フラグメントイオン集団を作製するために、上記分析物のペプトイドをMS−MS断片化に供する工程;および
上記分析物のフラグメントの分子量が上記推定分子量に対応するか否かを決定する工程;
を包含する、方法。
(31)項目30に記載の方法であって、上記フラグメントの推定分子量が、複数の理論的ペプトイドに関して決定され、上記複数の理論的ペプトイドは、上記既知のN−置換基集団の異なる組み合わせに基づく配列を有する、方法。
(32)項目31に記載の方法であって、上記分析物であるペプトイド中の1つ以上の選択された位置にあるN−置換基が、予め決定されている、方法。
(I.定義)
以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有する。
Raは、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル(これらのいずれかは、1つ以上の基X;水素、−OH、−SH、−COOH、スルホニルおよび脂質部分(ここで、この脂質部分は、リンカー部分と結合され得る)と置換され得る)からなる群より選択され;
各Rbは、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル(これらのいずれかは、1つ以上の基X;および水素と置換され得る)からなる群より独立して選択され、少なくとも1つの基Rbは水素ではなく;
Rcは、アルキル、アリール、アラルキル、アラルケニル、およびアラルキニル(これらのいずれかは、1つ以上の基X;水素、−OH、−SH、−NH2、−NHR、−NH(C=O)R(ここで、Rは低級アルキルである);スルホニル、ヒドラジン、および脂質部分(ここで、この脂質部分は、リンカー部分と結合され得る)と置換され得る)からなる群より選択され;
R1およびR2は、水素、低級アルキル、および低級アルコキシから独立して選択され;
Xは、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、グアニジノ、アミジノ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ケト、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホン酸およびスルホン酸エステルから選択され;そして
mは、2〜約50から選択される整数である。
プラスミドDNAを培養物中の細胞に送達するための多くのトランスフェクション薬剤が存在するが、オリゴヌクレオチドの送達に対する考慮はほとんどない。本発明者らは、以前は、プラスミドDNAのトランスフェクションについて特徴付けられた一連のペプトイドベースのトランスフェクション薬剤がまた、オリゴヌクレオチドと複合体を形成し得、そして有意な細胞毒性無しに、FITCタグ化オリゴヌクレオチドの多くの細胞型への取り込みを促進するということを見出した。DNAのトランスフェクションでの結果と類似して、細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、+/−電荷比が約1.5〜2/1で最適とされ、そして血清の存在は、試験された比率においてネガティブな影響を有さなかった。
1つの局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトする際の有効性について、ペプトイド(これは、リピトイドおよびコレステロイドを含む)をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する:別々の区分に複数の異なる配列のペプトイドを提供する工程;これらの区分のうちの少なくとも1つに、ペプトイド−オリゴヌクレオチド混合物を形成する工程;この混合物を細胞と接触させる工程;ならびにそのオリゴヌクレオチドによる細胞のトランスフェクトの程度を決定する工程。次いで、ペプトイドの同一性が決定され得る。一般的に、トランスフェクトペプトイドの同定に対して一般的により大きな力が注がれるが、非トランスフェクトペプトイドの同定もまた、有用であり得る。
上記に規定されるようなペプトイドは、US出願番号60/023,867、60/054,743、07/950,853、および09/132,808に基づく、共有に係るPCT公開WO 94/06451、WO 98/06437、およびWO 99/08711(Zuckermannら)(これらは、本明細書によって参考として援用される)に記載される。段階的サブユニット添加によるペプトイドの調製は、上記に参照されるPCT刊行物に記載され;Murphyら,1998およびHuangら、1998、ならびにこれらの中の参考文献もまた参照のこと。簡単に言うと、アミン誘導体化固相支持体(好ましくは、「Rinkアミド」樹脂((4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)−フェノキシ樹脂;Nova Biochem))は、ブロモアセチル化され(Fmoc基の除去後)、そして第1の所望の側鎖を有する一級アミンが添加され、臭素を置換する。ペプトイドを構築するために、ブロモ酢酸(ポリ−NSGペプトイドに対して)および選択された一級アミンのさらなる添加が交互にされる。
トランスフェクションがスクリーニングされるオリゴヌクレオチドを、異なる配列のペプトイドのアレイの少なくとも1つの区画に添加する。上記のように、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約10〜50、そしてより好ましくは、約15〜30のヌクレオチド長である。代表的な実験において、オリゴヌクレオチドサンプルは、2部の不活性な(コントロール、例えば、逆方向コントロール)FITC結合体化オリゴヌクレオチドおよび1部の活性なアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、抗Aktlオリゴヌクレオチド)からなる。添加の条件は、トランスフェクトペプトイドが、オリゴヌクレオチドと複合体を形成するような条件である。これらの成分の適切な最終濃度は、約200nMのオリゴヌクレオチドおよび3μMのペプトイド(実施例を参照のこと)である。
次いで、トランスフェクトされることが示された細胞を接触させた各混合物における、各トランスフェクトペプトイドを同定し得る。上記のように、非トランスフェクトペプトイドもまた、所望の場合に同定され得る。好ましくは、この同定は、母プレートのレプリカを使用し、これは、上記のように、各ウェルの少ない割合の母プレート水溶液を移すことによって調製される。複数の化合物のスクリーニングにおいて、最も効率的な化合物のウェル位置を同定し、そしてその母プレートから保存した溶液を使用して、トランスフェクションを担うペプトイドの正体を決定する。
この方法の1つの実施形態において、トランスフェクションに使用される細胞または組織は、(別々の区画または別々のアレイにおいて)異なる細胞型を含む。従って、このスクリーニング方法を使用して、選択されていない細胞型と比較して選択された細胞型に対してオリゴヌクレオチドを選択的に送達し得る、ペプトイドを同定する。例えば、選択された細胞型が、腫瘍細胞であり得、一方、選択されない細胞型が、非腫瘍細胞である。別の例において、選択された細胞型が、内皮細胞であり、そして選択されない細胞型が、上皮細胞である。このような適用において、ペプトイドの1より多い2連のアレイを作製し、1つを、同定目的のために保存し得、そして他の各々を、所定の細胞型または組織型のトランスフェクションのスクリーニングのために使用し得る。この手順を使用して、所定の組織を選択的にトランスフェクトする送達ビヒクル(例えば、動物における遺伝子治療の補助としての)についてスクリーニングし得る。
以下の実施例は、本発明を例示し、本発明を限定することを意図されない。
樹脂Fmoc脱保護
DMF洗浄
サブモノマーサイクル1
サブモノマーサイクル2
4つの容器へ樹脂を分配する、
反応容器をドレインする
サブモノマーサイクル3
単一容器へ樹脂を再度合わせる、
反応容器をドレインする
サブモノマーサイクル4
サブモノマーサイクル5
4つの容器へ樹脂を分配する、
反応容器をドレインする
サブモノマーサイクル6
単一容器へ樹脂を再度合わせる、
反応容器をドレインする
サブモノマーサイクル7
サブモノマーサイクル8
4つの容器へ樹脂を分配する、
反応容器をドレインする
サブモノマーサイクル9
Fmoc−(−Alaカップリング
クロロホルメートカップリング(脂質結合体またはコレステリル結合体の形成)。
SEQUENCE LISTING
<110> Chiron Corporation
<120> Oligonucleotide Transfection Screening Method
<130> F107811BXE
<150> JP 2002-553525
<151> 2001-12-18
<150> US 60/257,975
<151> 2000-12-23
<150> US 60/329,185
<151> 2001-10-11
<160> 6
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 1
ccatagtgag gttgcatctg gtgcc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 2
ccgtggtcta cgttggagtg atacc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
cgggaaatcg tgcgtgacat taag 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
tgatctcctt ctgcatcctg tcgg 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
gaagtggggc ctgcgctcgc tgt 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
atcgtgtggc agcacgtgta cg 22
Claims (1)
- 本明細書に記載のオリゴヌクレオチドトランスフェクションスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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