JP5368425B2 - 核酸を内部移行している細胞の選択方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般に分子生物学および生化学の分野に関する。より詳細には本発明は、核酸標的指向化、ならびにＲＮＡ含有分子の選択および送達のための方法、組成物およびキットに関する。

現在、薬剤の細胞内への送達は、調整された送達機構を必要とするが、これは有毒、非効率的または極めて非特異的であることが多い。さらに、細胞に送達される多くの薬剤は、有毒であり、生体への望ましくない毒性を抑制するために適切な細胞への特異的かつ迅速な内部移行を必要とする。

生体への毒性および非特異的作用を低減して細胞に薬剤を送達できる化合物の同定および選択が必要である。加えて、所定の組織、細胞または細胞群に薬剤を迅速に内部移行可能な化合物を選択する方法が必要である。

細胞での内部移行の機構を分析することによって、特定のクラスの分子が細胞内に分子カーゴを送達できることが見出されている。この発見は、細胞内部移行および分子カーゴ送達のためのそのような分子の選択、最適化および／または修飾を可能にする方法を提供するために有効に使用されている。いくつかの態様により、特定の方法は、最も迅速に内部移行される分子の同定も可能にする。

一態様において、ヌクレアーゼ耐性であり、特定の実施形態においては安定化された、ＲＮＡ含有分子を選択するための方法が提供される。この方法は、細胞（例えば真核細胞または原核細胞）をＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触させるステップを含む。ランダムライブラリーと接触させた細胞は、次いで１つまたは複数のヌクレアーゼにさらされる。次いで全ＲＮＡが細胞から抽出され、細胞内に入りヌクレアーゼ耐性であるＲＮＡ含有分子が選択されるように増加される。したがって、方法は、細胞内に内部移行したヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ含有分子を選択する。具体的な実施形態においてＲＮＡは、陽イオン性脂質、リポソームまたは電気穿孔法などの他の送達機構の非存在下で細胞に化合物を内部移行する働きがある。

他の態様において、内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するための方法が提供される。この方法は、細胞（例えば真核細胞）または原核生物をＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触させるステップを必要とする。ランダムライブラリーと接触させた細胞は、１つまたは複数のヌクレアーゼにさらされる。全ＲＮＡは、細胞から抽出され、抽出されたＲＮＡ含有分子が増加されるように増加される。

いくつかの実施形態において、選択方法は、選択の１つのラウンドから同定されたＲＮＡ含有分子を使用して繰り返される。他の実施形態において、内部移行されたＲＮＡ含有分子は、選択方法の２つ以上のラウンドを使用して選択される。特定の実施形態において内部移行されたＲＮＡ含有分子は、選択方法の少なくとも１０ラウンドを使用して選択される。特定の実施形態において内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、選択の後の各ラウンドでの時間を短くするために細胞にさらされる。具体的な実施形態において内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、約２４時間細胞にさらされる。さらに具体的な実施形態において、内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、１０時間未満細胞にさらされる。さらなる実施形態において、内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、５時間未満細胞にさらされる。さらに他の実施形態において、内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、２時間未満、１時間未満、３０分間未満、２０分間未満、１０分間未満、５分間未満、２分間未満、１分間未満または３０秒間未満細胞にさらされる。

極めて詳細な実施形態において、方法は、選択の後の各ラウンドが、以前の選択ラウンドと比較して時間を短くするために以前の選択ラウンド由来の内部移行可能なＲＮＡ含有分子を細胞にさらすステップを必要とする、多数の選択ラウンドを通じて内部移行可能なＲＮＡ含有分子を単離するステップを含む。例えば、選択の最初のラウンドは、内部移行可能なＲＮＡ含有分子を細胞に１０時間さらすステップを含み、第２ラウンドは、最初のラウンドから選択されたＲＮＡ含有分子を細胞に５時間さらす必要があり、次に第２ラウンドで選択されたＲＮＡ含有分子を細胞に２時間さらすなどである。そのような手順は、目的の細胞へ最も迅速に内部移行する化合物を同定する。

他の実施形態において、ライブラリーは、ランダム化された配列のプール由来の機能的ＲＮＡ含有分子を含有する。特定の実施形態においてＲＮＡはそれぞれ少なくとも１つのランダム配列を含む。他の実施形態において、ＲＮＡ含有分子は、少なくとも１つの定常配列を含む。さらに詳細な実施形態においてＲＮＡは、２つ以上の定常配列を含む。

より多くの実施形態においてランダム配列は、少なくとも１０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においてランダム配列は、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。より確実な特定の実施形態においてランダム配列は、少なくとも３０ヌクレオチドを含む。具体的な実施形態においてランダム配列は、少なくとも４０ヌクレオチドを含む。より具体的な実施形態においてランダム配列は、少なくとも５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチドまたは１００を超えるヌクレオチドを含む。

多くの実施形態においてランダムライブラリーは、安定化されたＲＮＡを含む。特定の実施形態において安定化されたＲＮＡは、２’−フルオロ修飾ＲＮＡプールである。

一実施形態において方法は、内部移行された核酸の配列を決定するステップを含む。いくつかの実施形態においてこのステップは、直接配列決定、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、アレイへの結合、質量分析およびそれらの組合せを含む。

具体的な実施形態において、ヌクレアーゼとして、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ、リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、リボヌクレアーゼＬ、リボヌクレアーゼＨ、アンジオゲニンリボヌクレアーゼ、好酸球リボヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、哺乳類リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼ２、メッセンジャーＲＮＡリボヌクレアーゼ、５’−３’エキソリボヌクレアーゼ、３’−５’エキソリボヌクレアーゼ、デキャッピング酵素、脱アデニル化酵素、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＩＩＩ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＩ、Ｉ^＊、リボヌクレアーゼＨＩ、リボヌクレアーゼＨＩＩ、リボヌクレアーゼＭ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＩＶ、Ｆ；リボヌクレアーゼＰ２、０、ＰＩＶ、ＰＣ、リボヌクレアーゼＮ、リボヌクレアーゼＩＩ、ＰＮＰアーゼ、リボヌクレアーゼＤ、リボヌクレアーゼＢＮ、リボヌクレアーゼＴ、リボヌクレアーゼＰＨ、オリゴリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＳａ、リボヌクレアーゼＦ１、リボヌクレアーゼＵ２、リボヌクレアーゼＭｓもしくはリボヌクレアーゼＳｔおよびそれらの組合せまたは商業的に入手できるヌクレアーゼ混合物が挙げられる。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩａまたはデオキシリボヌクレアーゼＩＩβである。

特定の実施形態において、特定の核酸は、ＣＤ４受容体を発現している細胞（例えばＨｅＬａ）への内部移行について選択される。他の実施形態において、選択されたＲＮＡ含有分子は、ｓｉＲＮＡ、毒素、ｍｉＲＮＡ、小分子およびＨｅＬａ細胞などのＣＤ４発現細胞に送達するための他の分子に連結される。

特定の態様において、従来のトランスフェクションまたは送達機構（例えば陽イオン性リポソーム、電気穿孔法、トランスフェクション試薬など）の補助なしで細胞に内部移行可能なＲＮＡのための選択計画が開発されている。この計画は、特定の細胞、細胞の様々な状態または通常の細胞に内部移行するＲＮＡを産生するために採用され得る。ＲＮＡ含有分子は、治療用、診断用、または検出用のための種々の異なるカーゴを担うように選択され得る。これは、ｓｉＲＮＡノックダウン研究などの遺伝子発現調節；致死性薬物の送達；ＦＡＣＳ分析；腫瘍検出などをこれらに限定することなく含む、細胞への小分子の送達または細胞の標識に関与する多数の技術を含む。

他の態様において、定常配列領域を含有できるランダム核酸ライブラリーと１つまたは複数の細胞とを接触させ；細胞を洗浄し；細胞を１つまたは複数のヌクレアーゼにさらし；細胞から全リボ核酸を抽出し；内部移行されたリボ核酸を、例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応および抽出された核酸の転写によって増加させることによって、内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するための組成物および方法が提供され、時間を短くするために選択の後の各ラウンドが、細胞に増加された核酸プールを繰り返し接触させることを含む。ＲＮＡ含有分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡまたはキメラ核酸を含むことができる。分子は、少なくとも部分的にヌクレアーゼ耐性であることもできる。

一実施形態において、内部移行された核酸の配列を決定するステップが含まれる。このステップは、直接配列決定、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、アレイへの結合、質量分析およびそれらの組合せを含み得る。

特定の実施形態において、この方法で使用されるヌクレアーゼは、ＲＮＡ分解酵素またはリボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼとして、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ、リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、リボヌクレアーゼＬ、リボヌクレアーゼＨ、アンジオゲニンリボヌクレアーゼ、好酸球リボヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、哺乳類リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼ２、メッセンジャーＲＮＡリボヌクレアーゼ、５’−３’エキソリボヌクレアーゼ、３’−５’エキソリボヌクレアーゼ、デキャッピング酵素、脱アデニル化酵素、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＩＩＩ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＩ、Ｉ^＊、リボヌクレアーゼＨＩ、リボヌクレアーゼＨＩＩ、リボヌクレアーゼＭ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＩＶ、Ｆ；リボヌクレアーゼＰ２、０、ＰＩＶ、ＰＣ、リボヌクレアーゼＮ、リボヌクレアーゼＩＩ、ＰＮＰアーゼ、リボヌクレアーゼＤ、リボヌクレアーゼＢＮ、リボヌクレアーゼＴ、リボヌクレアーゼＰＨ、オリゴリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＳａ、リボヌクレアーゼＦ１、リボヌクレアーゼＵ２、リボヌクレアーゼＭｓもしくはリボヌクレアーゼＳｔおよびそれらの組合せまたは商業的に入手できるヌクレアーゼ混合物が挙げられる。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩａ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩβまたはそれらの組合せである。

他の実施形態において細胞は、細胞をライブラリーと接触させるステップの間の活発なエンドサイトーシスを抑制するために処理され得る。簡便な使用のためおよび特定の実施形態において核酸は、検出可能に標識される。具体的な実施形態において標識は、色素または蛍光、放射性もしくは化学発光の標識である。検出できる標識の例として、１つまたは複数の発光団、増幅できる核酸配列、酵素、ペプチド、金属、磁気ビーズ、重合体ビーズ、デンドリマー、リポソーム、量子ドット、蛍光共鳴エネルギー転移分子または他の核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において細胞は、ＲＮＡ含有分子のライブラリーと接触する前に固定される。

他の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、小分子、毒素、または細胞への送達用の他の分子である第２の分子を含有する、または第２の分子に連結される。さらに他の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ハイブリダイゼーション、共有結合型複合、ビオチン化、ストレプトアビジンへの複合、非特異的結合、キレート化、標的特異的アミノ酸配列およびそれらの組合せによる内部移行を標的とする分子に複合される。

さらに多くの実施形態においてＲＮＡ含有分子は、検出可能に標識される。具体的な実施形態において、ＲＮＡ含有物は、化学発光標識、放射性標識、または蛍光標識などの検出できる標識に機能的に連結される。特定の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、マイクロアレイまたは顕微鏡によって同定される。他の実施形態において、細胞内に入らず細胞外の溶液中に残存する核酸は、選択される。一実施形態において、細胞に入り、次いで細胞から再び出現する例えばサイクリングエンドサイトーシス経路を介して）核酸は、選択される。

他の態様において、方法は、宿主生物中の１つまたは複数の細胞を接触させるステップを含み、宿主のヌクレアーゼが標的細胞、器官またはコンパートメントによって取り込まれなかった核酸を破壊し、残存した核酸が単離される。内部移行した核酸の選択のための細胞は、細胞形態、蛍光タンパク質発現、表面マーカー発現またはアポトーシスを含む細胞のまたは分子の表現型に基づいて選択される。

さらに他の態様において、１つまたは複数の細胞を、安定化された核酸および定常配列領域を含むＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触させるステップを含む、安定化した、内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するための方法が提供される。細胞は、洗浄され、次いで１つまたは複数のヌクレアーゼにさらされる。次いで全リボ核酸が細胞から抽出され、内部移行したＲＮＡ含有分子が増加される。これらの選択ステップは、繰り返され、選択の後の各ラウンドは、時間を短くするために、増加されたリボ核酸プールに繰り返し細胞を接触させるステップを含む。いくつかの実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ＲＴ−ＰＣＲによって増加される。

いくつかの実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡまたはキメラ核酸を含む。特定の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、少なくとも部分的にヌクレアーゼ耐性である。具体的な実施形態において安定化されたＲＮＡ含有分子は、２’−フルオロ修飾核酸を含む。いくつかの実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、小分子、毒素またはアプタマーに連結される。ＲＮＡ含有分子の核酸は、具体的な実施形態において、蛍光、放射性または化学発光の標識などで検出可能に標識される。

いくつかの実施形態においてランダム配列ライブラリー中のＲＮＡ含有分子の配列は、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、または１００を超えるヌクレオチドを含む。特定の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、２つ以上の定常配列を含む。

いくつかの実施形態において１つまたは複数のヌクレアーゼは、ＲＮＡ分解酵素またはリボヌクレアーゼである。特定の実施形態において１つまたは複数のヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼであるか、または５’−３’エキソリボヌクレアーゼ、３’−５’エキソリボヌクレアーゼ、デキャッピング酵素、脱アデニル化酵素もしくはそれらの組合せである。他の実施形態において、１つまたは複数のヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩａ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩβまたはそれらの組合せなどのＤＮＡ分解酵素である。１つまたは複数のヌクレアーゼは、具体的な実施形態においてヌクレアーゼ混合物として混合される。

特定の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、マイクロアレイまたは蛍光顕微鏡によって同定される。いくつかの実施形態において方法は、活発なエンドサイトーシスを抑制するために細胞を処理するステップをさらに含む。加えて、内部移行された核酸の配列は、方法のいくつかの実施形態において決定され得る。特定の実施形態において配列決定は、直接配列決定、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ、質量分析またはそれらの組合せによって実施される。さらに、いくつかの実施形態において方法は、核酸ライブラリーとの接触の前に細胞を固定するステップをさらに含む。

他の態様において、内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するためのキットは、提供される。キットは、ランダム核酸ライブラリー；内部移行していないすべての核酸を分解するために十分な量の１つまたは複数のヌクレアーゼ；逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ転写酵素；１つまたは複数の緩衝剤および本発明で特許請求される方法による説明書を含む。特定の実施形態においてヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ、リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、リボヌクレアーゼＬ、リボヌクレアーゼＨ、アンジオゲニンリボヌクレアーゼ、好酸球リボヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、哺乳類リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼ２、メッセンジャーＲＮＡリボヌクレアーゼ、５’−３’エキソリボヌクレアーゼ、３’−５’エキソリボヌクレアーゼ、デキャッピング酵素、脱アデニル化酵素、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＩＩＩ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＩ、Ｉ^＊、リボヌクレアーゼＨＩ、リボヌクレアーゼＨＩＩ、リボヌクレアーゼＭ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＩＶ、Ｆ；リボヌクレアーゼＰ２、０、ＰＩＶ、ＰＣ、リボヌクレアーゼＮ、リボヌクレアーゼＩＩ、ＰＮＰアーゼ、リボヌクレアーゼＤ、リボヌクレアーゼＢＮ、リボヌクレアーゼＴ、リボヌクレアーゼＰＨ、オリゴリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＳａ、リボヌクレアーゼＦ１、リボヌクレアーゼＵ２、リボヌクレアーゼＭｓまたはリボヌクレアーゼＳｔである。

本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ含有分子を選択するための方法であって、
ａ）細胞をＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触させるステップ；
ｂ）前記接触させた細胞を１つまたは複数のヌクレアーゼにさらすステップ；
ｃ）前記接触させた細胞から全ＲＮＡを抽出するステップ；および
ｄ）前記細胞から単離された前記全ＲＮＡから前記ＲＮＡ含有分子を増加させるステップ
を含み、前記内部移行したヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ含有分子が選択される方法。
（項目２）
前記選択方法が、選択の１つのラウンドから同定された前記ＲＮＡ含有分子を使用して繰り返される、項目１に記載の方法。
（項目３）
内部移行したＲＮＡ含有分子が前記選択方法の２つ以上のラウンドを使用して選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択の後の各ラウンドでの時間を短くするために１つまたは複数の細胞と接触させる、項目３に記載の方法。
（項目５）
１つまたは複数の細胞を内部移行可能なＲＮＡ含有分子と２４時間未満、１０時間未満、５時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分間未満、２０分間未満、１０分間未満、５分間未満、２分間未満、１分間未満または３０秒間未満接触させる、項目１に記載の方法。
（項目６）
複数ラウンドの選択によって内部移行可能なＲＮＡ含有分子を単離するステップをさらに含み、以前の選択ラウンドと比較して時間を短くするために、選択の後の各ラウンドが以前のラウンドの選択によって得られた前記内部移行可能なＲＮＡ含有分子を前記細胞にさらすことを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ライブラリーがランダム配列のプール由来の機能性ＲＮＡを含有する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＲＮＡが少なくとも１つのランダム配列および少なくとも１つの定常配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＲＮＡが２つ以上の定常配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ランダム配列が少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチドまたは１００を超えるヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ランダムライブラリーが安定化ＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＲＮＡ分解酵素またはリボヌクレアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＤＮＡ分解酵素である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＲＮＡ含有分子がＣＤ４受容体を発現している細胞への内部移行について選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記選択されるＲＮＡ含有分子がｓｉＲＮＡ、毒素、ｍｉＲＮＡ、アプタマーまたは小分子に連結される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
活発なエンドサイトーシスを抑制するために前記細胞を処理するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＮＡ含有分子が検出可能に標識される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞がＲＮＡ含有分子の前記ライブラリーと接触する前に固定される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
安定化された内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するための方法であって、
ａ）１つまたは複数の細胞を、安定化された核酸を含み、かつ定常配列領域を含有するＲＮＡ含有分子のランダム核酸ライブラリーと接触させるステップ；
ｂ）前記細胞を洗浄するステップ；
ｃ）１つまたは複数のヌクレアーゼに前記細胞をさらすステップ；
ｄ）前記細胞から全リボ核酸を抽出するステップ；
ｅ）前記内部移行したリボ核酸を増加させるステップ；および
ｆ）選択ステップａ）〜ｅ）を繰り返すステップ
を含み、時間を短くするために選択の各後のラウンドが、前記細胞を前記増加された核酸プールに繰り返し接触させるステップを含む方法。
（項目２０）
前記ＲＮＡ含有分子が、少なくとも部分的にヌクレアーゼ耐性である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＲＮＡ分解酵素またはリボヌクレアーゼである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＤＮＡ分解酵素である、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
活発なエンドサイトーシスを抑制するために前記細胞を処理するステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記ＲＮＡ含有分子の前記核酸が検出可能に標識される、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記核酸ライブラリーと接触する前に前記細胞を固定するステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
前記ＲＮＡ含有分子がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、小分子、毒素、またはアプタマーに連結される、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
前記ＲＮＡ含有分子が２つ以上の定常配列を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記ライブラリー中の前記ＲＮＡ含有分子のランダム配列が少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチドまたは１００を超えるヌクレオチドを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するためのキットであって、
ａ）ランダム核酸ライブラリー；
ｂ）内部移行していないすべての核酸を分解するために十分な量の１つまたは複数のヌクレアーゼ；
ｃ）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ転写酵素；
ｄ）１つまたは複数の緩衝剤；および
ｅ）項目１の方法と一致する説明書
を含むキット。
本発明の特徴および利点のさらに完全な理解のために、添付の図と共に本発明の詳細な記載に参照物を作成する。

一実施形態による核酸の内部移行化のための選択計画を示す図である。 選択方法がＲＮＡの内部移行を向上させることを示すグラフである。 細胞へのラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡ複合体を送達するドープ化ＰＳＭＡラウンドの能力の向上を示すグラフである。 ドープ化ＰＳＭＡアプタマークローンがラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡ複合体を細胞に効率的に送達することを示すグラフである。 ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞でのＮ３０プール内部移行化選択の向上を示すグラフである。

本明細書で参照する特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書において引用された、取得された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、およびＧｅｎＢａｎｋデーターベース配列を含む参考文献は、それぞれが明確かつ個別に参照として組み込まれると示された場合と同様に参照として本明細書に組み込まれる。本発明の種々の実施形態の作製および使用が以下に詳細に論じられるが、多数の応用可能な概念は、多種多様な具体的内容に統合され得ることは理解されるべきである。本明細書において論じられる具体的な実施形態は、本発明を作製および使用する具体的方法の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定しない。

単離された核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの修飾物）の迅速な選択を、特定の型の細胞に容易に内部移行化される配列にかかわらず可能にする組成物、方法およびキットは、含まれる。一度、選択および単離されるとＲＮＡ含有分子の配列は決定され得る。ＲＮＡ含有分子は、癌細胞に特定の化合物を（例えば殺すために）または感染症もしくは病原体障害細胞に関連する他の疾患を治療するために治療薬を蓄積させるための特定の治療用分子または薬物送達機構を増強するために使用され得る。本明細書に記載の方法は、生産効率の増大または毒性の低下のために多いに価値がある。

本明細書では、従来のトランスフェクションまたは送達機構の補助なしで細胞に内部移行され得るＲＮＡ含有分子を選択するための組成物および方法が含まれる。これらの方法は、特定の細胞、細胞の様々な状態（例えば分化）または通常の細胞中に内部移行するＲＮＡ含有分子を産生するために採用される。本発明の利点は、ＲＮＡ含有分子が標的特異的であるように選択され得ること、およびいくつかの実施形態においては毒性を伴わないことである。内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、いくつかの実施形態において細胞またはＲＮＡ含有分子を特徴付けする必要がほとんどなく、特定の細胞または組織への「ペイロード」または「カーゴ」を標的にするために使用され得る。内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、細胞または組織の構造的統合性を損なうことなく細胞内部の状態を示すためにも使用され得る。

用語「遺伝子」は、機能タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位を意味して使用される。本明細書において使用する「遺伝子」は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列もしくは断片またはそれらの組合せならびに、ヒトの手によって改変され得るものを含む遺伝子産物を含む機能用語である。精製遺伝子、核酸、タンパク質などは、通常付随する少なくとも１つの混入核酸またはタンパク質から同定および分離された場合に、これらの実在物を意味して使用される。本明細書において使用される用語「配列」は、天然物または人工物、例えば修飾核酸またはアミノ酸、であるかにかかわらずヌクレオチドまたはアミノ酸を意味して使用される。「転写された核酸」は、対応する核酸配列の鋳型から産生されたリボ核酸を意味する。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子は、一次ＲＮＡ転写物の異なるスプライシングによって生成される多種のＲＮＡ種を産生できる。

本明細書において使用する用語「増加」は、試料中の標的分子の量または含量の増幅を意味する。標的分子として、これだけに限らないが、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡが挙げられる。増幅の例示的方法としてＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および標準的クローニング技術が挙げられる。

本明細書において使用する用語「増幅する」は、核酸に関して使用される場合、当技術分野において周知の任意の方法による核酸配列の多数のコピーの産生を意味する。用語「増幅」は、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸生分子に関与する反応を一般に意味する。「核酸増幅」は、核酸の濃度を、具体的には選択された核酸および／または選択された核酸の定義した一部分の濃度を増大させる任意の工程を一般に意味する。「増幅物または増幅産物」または「単位複製配列」は、核酸増幅反応の実行から生じる産生物を一般に定義する。

本明細書において使用する用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩および温度条件下で他の核酸と塩基対形成することによるポリヌクレオチドの自然な結合を意味する。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの１本鎖分子間の相補性は、核酸のいくつかだけが結合しているような部分的であることができ、または１本鎖分子の間に完全な相補性が存在する場合、完全であっても良い。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強さに顕著に影響する。これは、核酸鎖の間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。

本明細書において使用する用語「内部移行」は、細胞に結合し、かつ他の薬剤または条件（例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈澱法、ＤＥＡＦ−デキストラン媒介形質移入、ポリブレン媒介形質移入、電気穿孔法、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および遺伝子銃）の補助なしで細胞内に入り込むまたは内部移行される能力を有するＲＮＡ含有分子などの核酸または修飾核酸を意味する。例えば内部移行可能なＲＮＡ含有分子は、その内部移行を検出する前に細胞内に内部移行されている。加えて、内部移行可能な核酸は、元の核酸が内部移行について選択された後に、内部移行速度を増大する薬剤および条件と共に使用され得る。

本明細書において使用する用語「ＲＮＡ含有分子」は、ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡの少なくとも一部分を含有する分子を意味する。ＲＮＡ含有分子は、相互に連結した多数のセグメントから構成され得る。ＲＮＡ含有分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、小分子、脂肪酸および／または抗体などのカーゴに結合され得る。特定の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、少なくとも１つのＲＮＡ部分を有する単一分子である。いくつかの実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ｓｉＲＮＡまたはミクロＲＮＡなどのＲＮＡカーゴも含有する。

特定の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、カーゴの種類に依存して結合を介してカーゴに結合される。例えばそのような結合は、細胞内の還元性環境に入るとカーゴが切断され得るような、ＲＮＡとカーゴの間のジチオール結合を含むことができる。他の有用な結合は、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホン酸結合、ホスホラミダイト、カルバミン酸、炭酸塩、リン酸エステル、アセトアミドおよびカルボキシメチルエステルである（例えば、Ａｇｒａｗａｌら、（１９８７年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８号：３５３９〜３５４２頁；Ａｇｒａｗａｌら、（１９８８年）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５号：７０７９〜７０８３頁；Ｕｈｌｍａｎｎら、（１９９０年）Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．９０号：５３４〜５８３頁；Ａｇｒａｗａｌら、（１９９２年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０号：１５２〜１５８頁を参照されたい）。

ＲＮＡ含有化合物は、ＨＡペプチドもしくは類似の化合物、またはエンドソームからのカーゴの脱出を可能にする融合性ペプチドを介してカーゴに；あるいは、特定の波長の光にさらされた場合にＲＮＡ含有化合物からのカーゴの切断を可能にする光分解性成分に連結されることもできる。

本明細書において使用する用語「プライマー」は、精製された制限酵素消化物として、天然に存在する、または合成的に産生されたかにかかわらず、核酸に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわちヌクレオチドおよび、ＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下および適切な温度およびｐＨ）に置かれた場合に合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、増幅の最大効率のために１本鎖であって良いが、別法として２本鎖であっても良い。２本鎖である場合プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前にその鎖を分離するために最初に処理される。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を用意するために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および使用される方法を含む多数の要因に依存するであろう。

本明細書において使用する用語「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」は、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸を含む化合物を意味し、互換的に使用される。

本明細書において使用する「ランダムライブラリー」は、様々な配列を含む、ＲＮＡ含有分子などのオリゴヌクレオチドの収集物を意味する。ライブラリーの各要素は、少なくとも部分的にランダムであり得るが、１つまたは複数の共通のおよび／または既知の配列または配列領域を有することもできる。例えば、ライブラリーは、完全にランダム、部分的にランダム、核酸の特定の部分においてランダム、長さに関してランダムおよび／または１本鎖もしくは２本鎖であり得る。ランダム核酸ライブラリーは、合成的、組合せ的に作製されることができ、または天然供給源に由来し得る。

本明細書において使用する用語「検出できる標識」は、酵素、抗体、リンカー、放射性同位体、高電子密度粒子、磁気粒子および／もしくは発色団またはそれらの組合せ、例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などそれらの特異的な機能的特性および／もしくは化学的特徴によって検出され得る化合物および／もしくは要素を意味し、その使用は、それらが結合する薬剤が検出されることならびに／または所望によりさらに定量されることを可能にする。取り扱いが容易、安価かつ無毒である蛍光標識を含む検出できる標識の多数の型がある。

本明細書において使用する用語「接触する」は、第２の薬剤および条件の必要なく核酸の一部またはすべての内部移行を導くためにオリゴヌクレオチドライブラリーを１つまたは複数の標的、例えば細胞または組織に一定時間さらすことを意味する。

本明細書において使用する用語「標的細胞」は、細胞への内部移行のために核酸のプールを接触させる任意の細胞（例えば真核性または原核性）を意味する。本明細書において使用する内部移行は、核酸の機能によって定義される、すなわち核酸は、内部移行可能なおよび／あるいは標的化ベクターまたは標的細胞への核酸の侵入を促進する第２の薬剤もしくは条件の必要なく内部移行される。

標的特異的および迅速に内部移行されるＲＮＡ含有分子を単離し特徴付けるための組成物、方法およびキットが提供される。本明細書において開示する組成物および方法は、従来のトランスフェクションまたは送達機構（陽イオン性リポソーム、電気穿孔法、トランスフェクション試薬など）の補助なしで細胞内に内部移行可能な核酸の迅速な単離を可能にする。方法は、特定の細胞、細胞の様々な状態または通常の細胞中に内部移行するＲＮＡを産生するために採用され得る。ＲＮＡは、治療用、診断用、または検出用の種々の異なるカーゴを担うように選択され得る。これは：ｓｉＲＮＡノックダウン研究などの遺伝子発現調節；致死性薬物の送達；ＦＡＣＳ分析；腫瘍検出などをこれらに限定することなく含む、細胞への小分子の送達または細胞の標識に関与する多数の技術を含む。

詳細な実施形態において、ランダムライブラリーと接触した細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた組織または細胞から単離された細胞（例えば細胞系）を含む。さらに詳細な実施形態において細胞は、リンパ腫細胞、メラノーマ細胞、肉腫細胞、白血病細胞、網膜芽細胞腫細胞、肝細胞腫細胞、骨髄腫細胞、神経膠腫細胞、中皮腫細胞および癌細胞をこれだけに限らないが含む癌細胞であり得る。

他の実施形態において細胞は、細胞系であり得る。例示的な細胞系として、これだけに限らないが、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、２００８、ＰＣ３、Ｔ８４、ＨＣＴ−１１６、Ｈ６９、Ｈ４６０、ＨｅＬａおよびＭＯＬＴ４が挙げられる。細胞系は、当技術分野において十分に周知の技術によっても生成され得る（例えばＧｒｉｆｆｉｎら、（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ ３０９巻（５９６３号）：７８〜８２頁を参照されたい）。

さらに、ランダムライブラリーと接触した細胞は、原核細胞（すなわち細菌細胞）を含む。本明細書において記載される方法は、カーゴ（すなわち小分子、抗体、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、治療薬、抗生物質または毒物などの薬剤）を細菌細胞内に送達および内部移行するＲＮＡ含有分子を同定するために使用され得る。本明細書において記載される方法は、カーゴを真菌細胞に送達および内部移行可能なＲＮＡ含有分子を同定するためにも使用され得る。

特定の態様において本明細書で提供される方法は、内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択することを可能にする。そのようなＲＮＡ含有分子は、細胞内に内部移行する、および選択された細胞内にカーゴ（例えば薬物、細胞毒、アポトーシス剤）を運ぶ能力を有する。方法は、安定性を増大させるために修飾され得るＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーに細胞を接触させるステップを含む。

接触した細胞は、細胞の表面に接着している過剰なＲＮＡ含有分子を除去するために変性剤で洗浄され得る。有用な洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）などの非イオン性界面活性剤および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムなどの陽イオン性界面活性剤などの変性剤を含み、それらはすべて商業的に入手できる（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）。

ヌクレアーゼが、内部移行していないＲＮＡ含有分子を除去するために使用され得ることが見出されている。この結果は、ＲＮＡ含有分子が、下記にさらに十分記載する修飾および２次構造によって分解に対して一般に安定化されていることを考慮すると驚くべきことであった。この発見により、方法の特定の実施形態は、細胞の表面に残存し、細胞内に内部移行していないＲＮＡ含有分子を除去するためにヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの混合物に、ランダムライブラリーに接触した細胞をさらすステップを必要とする。ヌクレアーゼの例として、これだけに限らないが、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ、リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、リボヌクレアーゼＬ、リボヌクレアーゼＨ、アンジオゲニンリボヌクレアーゼ、好酸球リボヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、哺乳類リボヌクレアーゼ１、リボヌクレアーゼ２、メッセンジャーＲＮＡリボヌクレアーゼ、５’−３’エキソリボヌクレアーゼ、３’−５’エキソリボヌクレアーゼ、デキャッピング酵素、脱アデニル化酵素、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＩＩＩ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＩ、Ｉ^＊、リボヌクレアーゼＨＩ、リボヌクレアーゼＨＩＩ、リボヌクレアーゼＭ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＩＶ、Ｆ；リボヌクレアーゼＰ２、０、ＰＩＶ、ＰＣ、リボヌクレアーゼＮ、リボヌクレアーゼＩＩ、ＰＮＰアーゼ、リボヌクレアーゼＤ、リボヌクレアーゼＢＮ、リボヌクレアーゼＴ、リボヌクレアーゼＰＨ、オリゴリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＲ、リボヌクレアーゼＳａ、リボヌクレアーゼＦ１、リボヌクレアーゼＵ２、リボヌクレアーゼＭｓまたはリボヌクレアーゼＳｔおよびそれらの組合せが挙げられる。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩａまたはデオキシリボヌクレアーゼＩＩβである。加えてＲＮＡ分解酵素混合物は、Ａｍｂｉｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州）およびＥｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）から商業的に入手できる。

具体的な実施形態において方法は、ＲＮＡ含有分子の元のプールと対比して最も迅速に内部移行される分子であるＲＮＡ含有分子を得るために複数回繰り返される。これらの実施形態において、選択工程の経過にかかわる時間を短くするために核酸プールは、細胞に添加され、かつ細胞とインキュベートされる（すなわち、上に記載の方法は繰り返し実行される）。時間的経過が完了した後、細胞は数回洗浄されかつ／またはヌクレアーゼ処理ステップで処理される。

特定の実施形態において接触した細胞は、時間を短くするためにＲＮＡ含有分子とインキュベートされ得る。内部移行していないＲＮＡ含有分子を除去するための洗浄は、細胞がＲＮＡ含有分子と接触した後に１時間から２４時間、またはより長く実施され得る。それに続く各洗浄は、細胞がＲＮＡ含有分子と接触された後に短くした時間で実施され得る。接触した細胞は、任意の時間でＲＮＡ含有分子とインキュベートされ得る。時間として、これだけに限らないが、１分間から１０分間、１１分間から２０分間、２１分間から３０分間、３１分間から４０分間、４１分間から５０分間、５１分間から１時間、１時間から２時間、２時間から３時間、３時間から４時間、４時間から５時間、５時間から６時間、６時間から７時間、７時間から８時間、８時間から９時間、９時間から１０時間、１０時間以上、１５時間以上、２０時間以上または２４時間以上が挙げられる。

例示的な実施形態においてＲＮＡ含有分子は、ＲＮＡ含有分子と接触した細胞が２４時間インキュベートされる最初の洗浄によって選ばれる。接触した細胞は、洗浄され、内部移行したＲＮＡ含有分子が単離され、細胞と１時間接触させられる。これらの細胞は、洗浄され、内部移行したＲＮＡ含有分子が単離される。単離されたＲＮＡ含有分子は、洗浄される前に３０分間細胞と接触させられる。内部移行したＲＮＡ含有分子は、再び単離され、工程は洗浄の前のインキュベーションの時間を短くして継続する。

特定の実施形態において全ＲＮＡは、細胞から抽出され、内部移行されている任意の配列は、ＲＴ−ＰＣＲおよび／または転写によって回収され得る。これらのＲＮＡ含有分子は、細胞内に最も迅速に内部移行された分子のプールに相当する。

ＲＮＡ含有分子は、当技術分野で周知の任意の手順を使用して作製され得る。例えば、それらは、ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）または他の類似装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州を参照されたい）を使用して合成的に産生され得る。合成オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト法（例えばＰａｎら、（２００４年）Ｂｉｏｌ． Ｐｒｏｃ． Ｏｎｌｉｎｅ．６号：２５７〜２６２頁を参照されたい）、Ｈ−ホスホネート法（例えばＡｇｒａｗａｌら、（１９８７年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８巻（３１号）：３５３９〜３５４２頁を参照されたい）および亜リン酸トリエステル法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８４年）、１２号：４５３９頁；（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４号：５８４３頁）などの当技術分野において十分に周知の方法を使用しても産生され得る。

ＲＮＡ含有分子は、ＲＮＡ含有分子の機能を変化させることなく３’アミノリンカーまたは５’アミノリンカーなどのリンカーに結合され得る。同様に、追加のヌクレオチドは、リンカーとして作用するための核酸合成中にＲＮＡ含有分子の３’末端に結合され得る（例えばＳｔｅｉｎｂｅｒｇら、（２００４年）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ７３巻（５号）：５９７〜６０５頁を参照されたい）。

加えて、ＲＮＡ含有分子は、細胞内へ内部移行するそれらの能力を損なわない多くの方法で修飾され得る。核酸構造への修飾は、アルキルホスホン酸、ホスホラミダイト、カルバミン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、炭酸塩、リン酸エステル、アセトアミドおよびカルボキシメチルエステルなどの合成的結合を含むことができる（例えばＡｇｒａｗａｌら、（１９８７年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８号：３５３９〜３５４２頁；Ａｇｒａｗａｌら、（１９８８年）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５号：７０７９〜７０８３頁；Ｕｈｌｍａｎｎら、（１９９０年）Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．９０号：５３４〜５８３頁；Ａｇｒａｗａｌら、（１９９２年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０号：１５２〜１５８頁を参照されたい）。加えて、核酸修飾は、コレステロール結合などのヌクレオチド間リン酸結合、またはアミノ基と末端リボースとの間の炭素残基の数が様々なジアミン化合物を含む。ＲＮＡ含有分子の他の修飾は、アラビノース、またはヒドロキシル基以外の化学基を介してその３’および５’末端に結合した糖を有する３’、５’置換核酸などの糖成分への変更を含む。したがってＲＮＡ含有分子の内部移行またはカーゴ送達を損なわない修飾は、本発明の範囲内である。

ＲＮＡ含有分子はまた、当技術分野において十分に周知である標準的固相ＤＮＡ化学を使用して合成され得る。以下の記載は、ＲＮＡプールを産生する方法の例示的一法を示す。ランダム化された位置は、各塩基のカップリング効率がほぼ等しくなるように３：３：２：２．４のモル比でＡ、Ｃ、ＧおよびＵに対するホスホラミダイトを混合することによって生成され、ランダム化された位置の最終組成物は、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである可能性を２５％で有する。ドープ化されたプールの場合、ホスホラミダイトの混合物は、任意のドープ化ヌクレオチドについての各カップリング効率が、残りの３ヌクレオチドに対する１０％の効率を伴って７０％であるような、ドープ化Ａ、ドープ化Ｃ、ドープ化Ｇおよびドープ化Ｕの追加的プールを生成するためにさらに使用され得る。例えばドープ化Ａの瓶は、７０％Ａ、１０％Ｃ、１０％Ｇおよび１０％Ｕをもたらすであろう。脱保護および精製のステップに続いて、１本鎖ＤＮＡプールは、ＰＣＲまたはプライマー伸長によってｄｓＤＮＡに変換される。工程の間、Ｔ７プロモーターがプールの５’末端に付加され、得られた２本鎖ＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの基質にする。次いでＲＮＡまたは修飾ＲＮＡのプールは、ランオフ転写によって生成され得る。等価物プールは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、アイオワ州）のような商業的供給源を通じて購入することもできる。

特定の実施形態において、ＲＮＡ含有分子は、ランダム領域を含有する。ランダム領域は、合成および精製が実際に可能な任意の長さであることができる。具体的な実施形態においてランダム性は、１０ランダム位置（Ｎ３０）から１００を超えるランダム位置（Ｎ１００）の間で変動できる。ＲＮＡ含有分子は、ＰＣＲプライマーの結合および転写を可能にする定常領域も含む。このため、定常部の長さに対するランダム部の長さの比は、ランダム領域の長さに応じて変化する。すなわち、Ｎ３０プールは、ランダム領域とほとんど同じ量の固定された位置を有し易く、一方Ｎ１００プールは、定常領域と比べてより多いランダム位置を有するであろう。少数例では、定常領域は、最終的に選択された種の機能を共有するために選択後に見出された。

ＲＮＡ含有分子のプールは、様々な程度のランダム性を有して合成され得る。「ドープ化」プールは、既に存在している配列の位置を部分的にランダム化することによって作製される。例えば、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）に結合する配列の選択は、ＲＴの天然基質を取得すること、配列を部分的にランダム化すること、およびＲＴにその天然基質より良く結合する配列を選択することを必要とする。

他の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、安定性を増大させるために修飾される。例えばＲＮＡ含有分子は、アルカリ分解および天然に存在するヌクレアーゼに対する安定性を増大させるためにすべてのピリミジン残基において２’−フルオロ修飾で修飾され得る。他の塩基修飾は、当技術分野において十分に周知である。

本明細書に記載する方法について、工程のいくつかの異なる点において変更が導入され得る。ＲＮＡ含有分子は、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡ、ペプチド主鎖を有する核酸、またはそれらの組合せなどの様々な修飾を有することができる。加えて、様々なヌクレアーゼ溶液が、使用されることができ、ヌクレアーゼは、様々な長さの時間でインキュベートされ得る。

具体的な態様においてＲＮＡ含有分子は、検出可能に標識され得る。本明細書において使用する「検出可能に標識」は、ＲＮＡ含有分子が、検出できる部分に機能的に連結されていることを意味する。「機能的に連結」によって、部分が共有または非共有（例えばイオン性）結合によってプローブに結合されていることが意味される。共有結合を作るための方法は、周知である（一般的手順書、例えばＷｏｎｇ． Ｓ． Ｓ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１年；Ｂｕｒｋｈａｒｔら、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｏｒ Ａｍｉｎｏｐｌａｓｔｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ、ニューヨーク州、１９９９年を参照されたい）。

本発明により「検出できる標識」は、感知され得る部分である。そのような標識は、限定することなく、フルオロフォア（例えばフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、ローダミン）、化学色素または放射性、化学発光性、磁性、常磁性、プロマグネチックである化合物、または着色された、化学発光性もしくは磁性であり得る生成物を生じる酵素であり得る。シグナルは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段を含む任意の適切な手段によって検出可能である。特定の場合においてシグナルは、２つ以上の手段によって検出できる。特定の実施形態において核酸標識は、本発明の範囲を限定する目的ではない例である蛍光色素、放射標識および化学発光標識を含む（例えばＹｕら、（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻（１６号）：３２２６〜３２３２頁；Ｚｈｕら、（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻（１６号）：３４１８〜３４２２頁を参照されたい）。

例えば、ＲＮＡ含有分子のヌクレオチドは、Ｃｙ５／Ｃｙ３蛍光色素に複合され得る。これらの色素は、当技術分野において頻繁に使用される（例えばＹａｎｇら、（２００５年）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１巻（２ Ｐｔ １）：６１２〜２０頁を参照されたい）。蛍光標識は、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’ジアミノスチルベン類、ピレン類、四級フェナントリジン塩類、９−アミノアクリジン類、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン類、アントラセン類、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノプリジニウム塩、ヘレブリゲニン（ｈｅｌｌｅｂｒｉｇｅｎｉｎ）、テトラサイクリン、ステロフェノール（ｓｔｅｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチル酸、ストロファンチジン、ポルフィリン類、トリアリルメタン類、フラビン、キサンテン色素（例えばフルオレセインおよびローダミン色素）；シアニン色素；４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン色素ならびに蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、フィコビリタンパク質）などの非限定的例を含む種々の構造分類から選択され得る。

他の有用な色素は、化学発光色素であり、限定することなくビオチン複合ＲＮＡヌクレオチド類を含む。ＲＮＡの標識は、当技術分野において周知の手段、例えばＣｙＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（＃ＲＰＮ６２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）によって実行され得る。

ＲＮＡ含有分子は、ＲＮＡ含有分子にカーゴを付加することによって共内部移行カーゴになり得る。例えば、ｓｉＲＮＡおよび他の核酸配列は、選択されたＲＮＡに直接合成されることができ、選択されたＲＮＡにハイブリダイズされるか、または当技術分野において十分に周知のやり方を使用して化学的に結合される。例示的なカーゴとして、これだけに限らないがｓｉＲＮＡおよびミクロＲＮＡが挙げられる。

具体的な態様において、細胞にカーゴをうまく内部移行するＲＮＡ含有分子は、同定される。特定の実施形態においてＲＮＡ含有分子は、機能分析によって同定される。例えばＲＮＡ含有分子は、その経路によって影響をうける表現型を観察することによって同定され得る特定の経路を阻害するｓｉＲＮＡを送達できる。別法として、ｓｉＲＮＡ標的の発現レベルは、タンパク質またはＲＮＡのレベルで分析され得る。したがって、この方法は、細胞内の特定の経路へのカーゴ分子の送達のために有用である。

特許請求の範囲および／または明細書において単語「含んでいる」と共に使用される場合の単語「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数の」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つより多く」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択のみ、または選択が相互排他的であることを意味すると明確に示されない限りは「および／または」を意味して使用されるが、開示は、単なる選択および「および／または」を意味する定義を支持する。本明細書全体を通じて用語「約」は、値が±１０％などの誤差の固有の変動を含むことを示して使用される。

本明細書および（１つまたは複数の）請求項において使用される単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は、包括的であるか、または変更可能であり、追加的な列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。

本明細書において使用される用語「またはそれらの組合せ」は、用語に先行する列挙された項目のすべての並べ換えおよび組合せを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃまたはそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣ、および具体的な内容において順序が重要である場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢの内の少なくとも１つを含むことを意味する。この例を継続して、明白に含まれるのは、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢその他などの１つまたは複数の項目または用語の繰り返しを含有する組合せである。当業者は、典型的には、内容から明確である場合を除いて任意の組合せにおける項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。

本発明は、限定であると解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。

（実施例１）
配列およびプライマー
これらの選択に使用されるＮ３０プールは、以下の配列を有する：

ここで、Ｎは４塩基のいずれかである。プールは、下に記載の通り合成および精製した。

Ｎ３０プール用の増幅プライマーは以下の通り：

これらのアッセイにおいて使用された抗ＰＳＭＡアプタマー、Ａ９用の鋳型は、以下の配列を有した。

ここで、下線付きの配列は、アプタマーを増幅するために使用する定常領域を表す。

Ａ９用の増幅プライマーは以下の通りであった：

すべてのプライマーおよびＡ９鋳型は、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、アイオワ州）から取り寄せた。

プールの合成および精製
この選択において使用されたプールは、定常領域に隣接した無作為の３０残基から成った。プールは、ＡＢＩ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）で合成した。ランダム化された位置は、各塩基のカップリング効率がほぼ等しくなるようにモル比３：３：２：２．４でＡ、Ｃ、ＧおよびＴに対するホスホラミダイトを混合することによって生成され、ランダム位置の最終組成物は、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴとなる２５％の可能性を有する。

ＤＮＡを脱保護するために合成の固相樹脂を３０％ＮＨ_４ＯＨ １ｍｌ中に、一晩、５５℃で懸濁した。反応物を遠心分離して樹脂をペレット化し、ＤＮＡを含有するＮＨ_４ＯＨ層をｎ−ブタノール１０ｍｌ中に４℃、１３０００ｒｐｍ、４５分間で沈澱させた。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥させた。合成中断産物は、しばしば長い配列で存在することから、ＤＮＡを１０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルでゲル精製した。全長産物に相当するバンドをゲルから切り出し、細かく切り刻み、ｄＨ_２Ｏ中に一晩溶出させた。溶出したＤＮＡを、沈澱担体としてグリコーゲンを含む１００％エタノール中に沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させた。

脱保護および精製に続いて、１本鎖ＤＮＡプールを伸長およびプライマー４１．３０および２４．３０を使用する大規模ＰＣＲによってｄｓＤＮＡに転換した。４１．３０プライマーは、後の転写ステップでプールにＴ７プロモーター配列を添加するためにも役立った。１本鎖プールＤＮＡおよそ２．８ｎｍｏｌを２４．３０プライマー１１５ｎｍｏｌならびに各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）０．２ｍＭと合計容量４３ｍＬ中で混合した。試料を６５℃、５分間で変性させ、次いで４℃に冷却した。５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＬ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州）１４４０Ｕのマスターミックス総容量４３．３ｍＬを変性させたプールに加え、７２℃、１時間インキュベートした。伸長の終了時に、総容量２８．７ｍＬ中の４１．３０、１１５ｎｍｏｌを加え、反応は、９４℃を３０秒間、５０℃を３０秒間、および７２℃を１分間で、８から９周期繰り返し、７２℃のステップ２分間を続けた。ＰＣＲ産物を２．５×容量の１００％エタノール中に、４℃、４５分間で沈澱させ、続いて７０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥させた。

４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）、２６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＧＴＰ、５ｍＭ ２’−フルオロ−ＣＴＰ、２’−フルオロ−ＵＴＰ、ピロホスファターゼ ０．０１ＵおよびＹ６３９Ｆ Ｔ７ポリメラーゼ７５Ｕの転写混合物１．５ｍＬにプールＰＣＲ７５μｇを加えた開始ラウンド０プールを生成するために大規模転写を実施した。Ｎ３０プールは、およそ１０^１５個の配列の複雑度を有すると推定された。したがってこの投入量は、ゲノム約１．５個分の配列に相当する。この規模は、合成され得る各配列を適切に評価し、したがって最大の多様性に相当した。

転写反応は、３７℃で一晩実施した。インキュベーション後、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）７５Ｕを反応物に加え、反応物をさらに３０分間インキュベートした。等量の２×変性染料（７Ｍ尿素、９０ｍＭトリス塩基、９０ｍＭホウ酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ブロモフェノールブルー）を加え、上で記載の通り、ゲル精製の前に反応物を７０℃で３分間変性させた。

細胞系および培養
ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞をＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、メリーランド州）から入手した。ＬｎＣａｐ細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）を通じて購入した。どちらの系も１０％ｆｂｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）中で維持し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で増殖させた。トリプシン処理のために、細胞を１培養容量のＤＰＢＳで１回洗浄し、次いで１／１０容量の０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を細胞に加えた。細胞を３７℃でおよそ２分間、細胞が剥がれるまでインキュベートした。培養培地を加えることによってトリプシンを不活性化した。すべての細胞洗浄ステップは、室温のＰＢＳを使用した。すべての細胞遠心分離ステップは、４℃、１５００ｒｐｍ、５分間であった。

ヌクレアーゼアッセイ
修飾ＲＮＡおよび細胞が消化および選択手順を耐え得ることを確認するために、ｄｓＤＮＡプールを上に記載の通り規模を縮小した反応で転写した。本体に標識した放射性転写物を生成するためにα−^３２Ｐ標識ＧＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、コネティカット州）を反応物に含ませた。

アッセイ用にＨｅＬａ−ＣＤ４細胞およそ４×１０^６個を各チューブに分注し、１５００ｒｐｍ、４℃、５分間で遠沈した。５００μＬ ＰＢＳで１回洗浄後、各チューブの細胞をＲＮＡ ８５μＬに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。異なる量のＲｉｂｏｓｈｒｅｄｄｅｒまたはリボヌクレアーゼＴ１を加え、細胞をさらに３０分間インキュベートした。細胞を遠沈除去し、回収したＲＮＡを１×ＴＢＥおよび７Ｍ尿素を含む８％アクリルアミドゲルにかけた。ゲルをろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ニュージャージー州）上で乾燥させ、スキャニングのためにホスフォイメージャースクリーン上で一晩露光させた。

洗浄、インキュベーション、またはヌクレアーゼ処理のステップによって細胞が有害に影響されなかったことを確定するために、これらのヌクレアーゼ消化アッセイを繰り返し実施し、細胞を計数し、別々のチューブに分注した。異なる間隔で、各チューブからの細胞を混合し、再び計数した。細胞の状態の顕著な問題は観察されなかった。

内部移行アッセイ
内部移行アッセイを細胞表面アプタマー、抗ＰＳＭＡアプタマー、Ａ９（Ｌｕｐｏｌｄら、（２００２年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２巻（１４号）：４０２９〜３３頁）を使用して実施した。Ａ９は、上の「プール合成および精製」で述べたプール転写の小規模版を使用してオリゴ鋳型から転写した。

アッセイの３日前に、ＬｎＣａｐ細胞１×１０^５個を２４ウェルプレートに播種した。細胞が定着した後、細胞を洗浄し、新鮮培地を添加した。１時間、３７℃、５％ＣＯ_２で平衡化させた後、細胞を４種の条件の内の１つで処理した。「ＲＮＡ」試料では、５０ｎＭ Ａ９を細胞上の培地に４５分間、直接加えた。「ａｚ−ｄＧ」試料では、細胞を最初１０ｍＭアジ化ナトリウムおよび５０ｍＭデオキシグルコースでエンドサイトーシスを抑制するために１０分間処理し、次いでＤＰＢＳ ２５０μＬでの洗浄後にＲＮＡを培地に加えた。「Ｒｂ」試料では、ＲＮＡを細胞上でインキュベートし、次いで、結合剤を消化するための０．０２Ｕ／ｕＬ Ｒｉｂｏｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）での１５分間のヌクレアーゼ処理の前に細胞をＤＰＢＳ ２５０μＬで洗浄した。最後に、「ａｚ−ｄＧ／Ｒｂ」試料では、ＲＮＡを加える前に細胞をａｚ−ｄＧで処理し、ＲＮＡ消化後に細胞をヌクレアーゼ処理した。ＲＮＡの添加に続いて、ａｚ−ｄＧで処理したこれらの試料は、他の内部移行機構を抑止するために氷冷ブロックでもインキュベートした。各処理は、３回反復で実施した。

処理後、すべての試料をＤＰＢＳ ５００μＬで洗浄し、各試料からの全細胞ＲＮＡを、製造者の手順書（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ニューヨーク州）に従ってＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋチューブを使用してトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で抽出した。ＲＮＡの定量は、回収されたＲＮＡの量（データ未記載）が同程度であることを示し、含有量において有意に異なる処理法はなかったことを示唆した。全抽出ＲＮＡは、「プール合成および精製」において記載した反応に類似の小規模な反応においてアプタマー特異的プライマーで逆転写し、リアルタイムＰＣＲによってアッセイした。

リアルタイムＰＣＲ用に、６００ｎＭのｐｓｍａ５およびｐｓｍａ３を２×ＳｙｂｒＭｉｘ １２．５μＬおよびＲＴ反応物それぞれの１：１０希釈物１０μＬと混合した。試料をＡＢＩ ７３００リアルタイム装置にかけ、以下の通り反復させた：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で１分間を４０周期。反復に続いて、産物の完全性を調査するために以下の解離ステップ：９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間および９５℃で１５秒間を含めた。ΔＣＴを各試料のＣＴを未処理細胞対照と比較することによって決定した。

内部移行選択
選択ラウンドの１日前、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞４×１０^５個を２個の６０ｍｍ組織培養プレート上に置いた。各選択ラウンドの１時間前に培養培地を新鮮培地に置き換えた。選択の最初のラウンドのために、プールのおよそ１ゲノム分に相当する修飾プールＲＮＡ（１．２ｍＭ）５４μｇを２個のプレートの内の１個に添加した。３日間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、Ｄ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で２回洗浄し、両方のプレートからトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）１ｍＬおよびＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋチューブを製造者の手順書（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ニューヨーク州）に従って使用して全細胞ＲＮＡを抽出した。

回収した全細胞ＲＮＡを以下の通り逆転写した：全抽出ＲＮＡ ８４μｇおよび１×ＲＴ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）中の１０μＭ ２４．３０逆方向プライマーを含む反応物を７０℃ ５分間変性させ、次いで室温にゆっくり冷却した。１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰおよび２８Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）のマスターミックスを混合物に添加し、５０℃、１時間インキュベートした。プールにさらした細胞およびプールにさらしていない細胞の両方の、より小規模なＲＴを含まない対照も、回収されたいずれの産物も投入されたプールＲＮＡであって、細胞の人為現象またはＤＮＡ鋳型の持ち越し汚染ではないことを確認するために実施した。

ＲＴ反応物の半量を次のラウンドのための大規模ＰＣＲの種にするために使用した。各ラウンドのプールを各ラウンドの縮小された核酸用に調整する変更を伴って「プール合成および精製」に概説した手順の通りに再生した。後のラウンドにおいて、元のプール増幅において使用されたプライマー濃度は、著しく過剰量であったことも見出され、ＰＣＲプライマーの濃度を各プライマー０．４ｍＭに低減した。

選択のラウンドを、投入するＲＮＡを徐々に減らし、インキュベーション時間を短くし、洗浄ステップを増やして実施した。選択の進展は、増幅産物が観察できるまで必要としたＰＣＲサイクルの数を評価することによって決定した。これは、しばしば投入物質の量、この場合プールＲＮＡが選択ラウンド中にどれだけ回収され易いかに直接相関する。ラウンド３（細胞に入れたプールの量を顕著に減少させた最初のラウンド）および、細胞の新鮮保存物を使用したラウンド５の後に劇的なサイクル数の降下が見られた。ラウンド９の後、ＰＣＲは、サイクル数について改善されるとは考えられず、選択は、終了したとみなされた。

（実施例２）
１．ＲＮＡ含有分子の同定
内部移行ＲＮＡ配列、抗ＰＳＭＡアプタマー、Ａ９を本明細書において開示の新規条件を検査するため、ならびにＲＮＡ含有分子を同定するためおよび内部移行物の残存を確認するために使用した。

図１は、ヌクレアーゼ処理条件の有効性を示す。ＬｎＣａｐ細胞およそ１０^６個を４種の条件の内の１つで処理した：抗ＰＳＭＡアプタマーを細胞上の培地に直接添加した（ＲＮＡ）；細胞を最初に１０ｍＭアジ化ナトリウムおよび５０ｍＭデオキシグルコースでエンドサイトーシスを抑制するために１０分間処理し、次いで洗浄後にＲＮＡを培地に加えた（ａｚ−ｄＧ）；ＲＮＡを細胞上に加え、次いで、結合剤を消化するために０．０２Ｕ／ｕＬ Ｒｉｂｏｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で細胞をヌクレアーゼ処理した（Ｒｂ）；または、ＲＮＡを加える前に細胞をａｚ−ｄＧで処理し、ＲＮＡ消化後に細胞をヌクレアーゼ処理した。各処理は、３回反復で実施した。それぞれの処理由来の全細胞ＲＮＡをアプタマー特異的プライマーで逆転写し、リアルタイムＰＣＲサイクルをＧＡＰＤＨレベルと比較して決定した。ａｚ−ｄＧでの処理は、デルタＣＴシグナルをわずかに低減させた一方で、Ｒｂでの処理は、シグナルを劇的に低減させ、アプタマーの大部分が細胞外に残存したが、いくらかは保護されていたことを示している。ａｚ−ｄＧおよびＲｂの処理はどちらも、シグナルを完全に消失させた；Ｒｂ処理由来のシグナルは、内部移行したアプタマーによるものであった。

２．選択
アプタマーの各塩基位置を約３０％ドープ化した、Ａ９アプタマーに基づくドープ化２’−フルオロ修飾ＲＮＡプールを本明細書において提案する選択計画を検査するために使用した。ドープ化ＰＳＭＡプールの３から５マイクログラムをＴ２５フラスコ中の７０〜８０％コンフルエンスのＬｎＣａｐ細胞に加え、細胞を一晩インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．０１Ｕ／μＬ Ｒｉｂｏｓｈｒｅｄｄｅｒで１０分間処理した。次いで細胞を３回洗浄し、全細胞ＲＮＡを１ｍＬトリゾールで抽出した。回収したＲＮＡを逆転写し、次のラウンドの転写のための鋳型を生成するためにＰＣＲを介して増幅した。

５ラウンドの選択の後、Ａ９アプタマー自体で以前実施した通り（Ｃｈｕら、（２００６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４巻（１０号）：ｅ７３頁）、抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡと共に添加したストレプトアビジン／ビオチン複合体を内部移行させるそれらの能力についてラウンドを検査した。抗ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡは、陰性対照の役割を果たす（図３）。ラウンド５プールの５クローンを増幅し、配列決定し、ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡの内部移行について検査した。５クローン（ｐ１、ｐ２、ｐ６〜８）すべてが、ＧＡＰＤＨおよび対照細胞に標準化して、ラミンＡ／Ｃ発現の低減を示し、いかなるトランスフェクション方法とも無関係に細胞内に入るそれらの能力を示している。Ａ９を含まないｓｉＲＮＡ複合体またはそのクローンは、ラミンＡ／Ｃノックダウンを示さなかった。５クローンの内３個（ｐ１、ｐ７、ｐ８）は、野生型Ａ９アプタマーと比較して、わずかに良いラミンＡ／Ｃのノックダウンを示した（図４）。

核酸のランダムプール由来内部移行物の選択。最初の選択のために、３０塩基のランダム領域を有する２’−フルオロ修飾ＲＮＡプールを、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞に内部移行させる配列を選択するために使用した。ヌクレアーゼステップは、最初の２ラウンドには含まれなかった。ラウンド１〜６において、ＲＮＡプールを細胞と１日間インキュベートした。定期的に、プールで処理した細胞をトリゾール抽出し、細胞中のプールＲＮＡの存在について調べるために全ＲＮＡを逆転写し、リアルタイムＰＣＲ反応において増幅した。ラウンド６の後、増幅シグナルは、最大になったと思われた（図５を参照されたい）。１日のインキュベーションでさらに１ラウンドを実施し、後のラウンドでは、細胞を１時間インキュベートしただけにした。ラウンド９は、有意に改善されなかった。ラウンド９クローンを単離し、細胞にｓｉＲＮＡを輸送するそれらの能力について検査した。表１は、選択のそれぞれのラウンドを要約する。

（実施例３）
１．ＲＮＡ含有分子の同定
内部移行ＲＮＡ配列、抗ＰＳＭＡアプタマー、Ａ９を、細胞とＲＮＡ含有分子とを接触させる時間の長さを反復的に減少させる方法を検査するために使用する。条件および試薬は、上に記載のものと同一である。

２．選択
選択条件は、上に記載のものと実質的に同じである。簡潔には、アプタマーの各塩基位置を約３０％までドープ化した、Ａ９アプタマーに基づく、ドープ化２’−フルオロ修飾ＲＮＡプールを本明細書において提案する選択計画を検査するために使用する。ドープ化ＰＳＭＡプールの３から５マイクログラムをＴ２５フラスコ中の７０〜８０％コンフルエンスのＬｎＣａｐ細胞に加え、細胞を一晩インキュベートする。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．０１Ｕ／μＬ Ｒｉｂｏｓｈｒｅｄｄｅｒで１０分間処理する。細胞を３回洗浄し、全細胞ＲＮＡを１ｍＬトリゾールで抽出する。回収されるＲＮＡを逆転写し、次のラウンドの転写のための鋳型を生成するためにＰＣＲを介して増幅する。

次いで、インキュベーション時間を１２時間に減らす他は、上と同じ手順を使用して回収したＲＮＡをインキュベートする。選択の第２ラウンドから回収されるＲＮＡを、他のすべての洗浄および条件を第１ラウンドと同一にして１０時間インキュベートする。ラウンド４は、８時間のインキュベーション時間を有し、ラウンド５は、４時間を有し、ラウンド６は、２時間を有し、かつラウンド７から９は１時間を有する。最初の５ラウンドの選択の後、Ａ９アプタマー自体で以前実施した通り（Ｃｈｕら、（２００６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４巻（１０号）：ｅ７３頁）、抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡと共に添加したストレプトアビジン／ビオチン複合体を内部移行させるそれらの能力についてラウンドを検査する。抗ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡは、陰性対照の役割を果たす。ラウンド９プールのクローンを増幅し、配列決定し、ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡの内部移行について検査する。クローンは、ＧＡＰＤＨおよびｓｉＲＮＡにさらしていない対照細胞に標準化して、ラミンＡ／Ｃ発現の低減を示す。これは、いかなるトランスフェクション方法とも無関係に細胞内に入るそれらの能力を示す。Ａ９を含まないｓｉＲＮＡ複合体またはそのクローンは、ラミンＡ／Ｃノックダウンを示さない。インキュベーションの後のラウンドから同定されたクローンも、ラウンド１において同定されるクローンよりも速い内部移行を示し、より後の選択のラウンド由来のクローンは、より早く内部移行されることを示す。

等価物
当業者は、本明細書に記載の具体的な組成物および手順に対する多数の等価物を、単なる日常的な実験を使用して認識する、または確認できるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の請求項によって包含される。

本明細書において開示および特許請求するすべての組成物および／または方法は、本開示を考慮して、過度の実験を行うことなく作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の構想、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物ならびに／または方法および方法のステップもしくは方法の連続したステップに変更を適用できることは、当業者に明らかである。当業者に明らかなすべてのそのような類似の置換物および修飾物は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および構想の範囲内であるとみなされる。

Claims (29)

1. ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ含有分子を選択するための方法であって、
   ａ）細胞をＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触させるステップであって、前記ＲＮＡ含有分子の一部またはすべてが前記細胞内に内部移行される、ステップ；
   ｂ）前記接触させた細胞を１つまたは複数のヌクレアーゼにさらすステップ；
   ｃ）前記接触させた細胞から全ＲＮＡを抽出するステップ；および
   ｄ）前記細胞から単離された前記全ＲＮＡから前記ＲＮＡ含有分子を増加させるステップ
   を含み、選択の１つのラウンドが、ステップａ）〜ｄ）を含み、そして、内部移行したヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ含有分子が選択される方法。
2. 前記選択方法が、選択の１つのラウンドから同定された前記ＲＮＡ含有分子を使用して繰り返される、請求項１に記載の方法。
3. 内部移行したＲＮＡ含有分子が前記選択方法の２つ以上のラウンドを使用して選択される、請求項１に記載の方法。
4. 内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択の後の各ラウンドでの時間を短くするために１つまたは複数の細胞と接触させる、請求項３に記載の方法。
5. １つまたは複数の細胞を内部移行可能なＲＮＡ含有分子と２４時間未満、１０時間未満、５時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分間未満、２０分間未満、１０分間未満、５分間未満、２分間未満、１分間未満または３０秒間未満接触させる、請求項１に記載の方法。
6. 複数ラウンドの選択によって内部移行可能なＲＮＡ含有分子を単離するステップをさらに含み、以前の選択ラウンドと比較して時間を短くするために、選択の後の各ラウンドが以前のラウンドの選択によって得られた前記内部移行可能なＲＮＡ含有分子を前記細胞にさらすことを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記ＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーがランダム配列のプール由来の機能性ＲＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
8. 前記ＲＮＡ含有分子の各々が少なくとも１つのランダム配列および少なくとも１つの定常配列を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＲＮＡ含有分子の各々が２つ以上の定常配列を含む、請求項１に記載の方法。
10. ランダム配列が少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチドまたは１００を超えるヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーが安定化ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＲＮＡ分解酵素またはリボヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
13. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＤＮＡ分解酵素である、請求項１に記載の方法。
14. 前記ＲＮＡ含有分子がＣＤ４受容体を発現している細胞への内部移行について選択される、請求項１に記載の方法。
15. 前記選択されるＲＮＡ含有分子がｓｉＲＮＡ、毒素、ｍｉＲＮＡ、アプタマーまたは小分子に連結される、請求項１４に記載の方法。
16. 活発なエンドサイトーシスを抑制するために前記細胞を処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記ＲＮＡ含有分子が検出可能に標識される、請求項１に記載の方法。
18. 前記細胞が前記ＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触する前に固定される、請求項１に記載の方法。
19. 安定化された内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するための方法であって、
    ａ）１つまたは複数の細胞を、安定化された核酸を含み、かつ定常配列領域を含有するＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触させるステップであって、前記ＲＮＡ含有分子の一部または全てが前記細胞内に内部移行される、ステップ；
    ｂ）前記細胞を洗浄するステップ；
    ｃ）１つまたは複数のヌクレアーゼに前記細胞をさらすステップ；
    ｄ）前記細胞から全リボ核酸を抽出するステップ；
    ｅ）前記ＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーから前記内部移行したＲＮＡ含有分子のリボ核酸を増加させるステップ；および
    ｆ）選択ステップａ）〜ｅ）を繰り返すステップ
    を含み、選択の１つのラウンドが、ステップａ）〜ｅ）を含み、そして、時間を短くするために選択の各後のラウンドが、前記細胞を前記増加されたリボ核酸のプールに繰り返し接触させるステップを含む方法。
20. 前記ＲＮＡ含有分子が、少なくとも部分的にヌクレアーゼ耐性である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＲＮＡ分解酵素またはリボヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
22. 前記１つまたは複数のヌクレアーゼがＤＮＡ分解酵素である、請求項１９に記載の方法。
23. 活発なエンドサイトーシスを抑制するために前記細胞を処理するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
24. 前記ＲＮＡ含有分子の前記リボ核酸が検出可能に標識される、請求項１９に記載の方法。
25. 前記ＲＮＡ含有分子のランダムライブラリーと接触する前に前記細胞を固定するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
26. 前記ＲＮＡ含有分子がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、小分子、毒素、またはアプタマーに連結される、請求項１９に記載の方法。
27. 前記ＲＮＡ含有分子が２つ以上の定常配列を含む、請求項１９に記載の方法。
28. 前記ＲＮＡ含有分子のランダムライブラリー中の前記ＲＮＡ含有分子のランダム配列が少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチドまたは１００を超えるヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
29. 内部移行可能なＲＮＡ含有分子を選択するためのキットであって、
    ａ）ＲＮＡ含有分子のランダムライブラリー；
    ｂ）内部移行していないすべてのＲＮＡ含有分子を分解するために十分な量の１つまたは複数のヌクレアーゼ；
    ｃ）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ転写酵素；
    ｄ）１つまたは複数の緩衝剤；および
    ｅ）請求項１の方法と一致する説明書
    を含むキット。

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