KR20180030084A - 조작된 crispr-cas9 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 3 개의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시스템 (sn1-casPN/sn2-casPN/sn3-casPN) 및 2 개의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시스템 (sn1-casPN/sn2-casPN) 을 포함하여, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 시스템을 공개한다. Cas9 단백질과 함께, sn-casPNs 는 시험관내에서 및 생체내에서 표적 폴리뉴클레오타이드의, 절단 및 돌연변이유발을 포함하는, 자리-특이적 변형을 촉진한다. 더욱이, sn-casPNs 를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법에서 유용하다. 둘 이상의 sn-casPNs 를 포함하는 여러 가지 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 제작 방법이 본원에 기재되어 있다. 여러 가지 방법을 수행하기 위한 폴리뉴클레오타이드 서열, 발현 카세트, 벡터, 조성물, 및 키트가 또한 기재되어 있다. 더욱이, 본 명세서는 유전자 조작된 세포, 조작된 세포의 조성물, 트랜스제닉 유기체, 약학적 조성물, 뿐만 아니라 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템을 수반하는 여러 가지 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

조작된 CRISPR-CAS9 조성물 및 사용 방법 {ENGINEERED CRISPR-CAS9 COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 교차 참조
이 출원은 2015 년 8 월 7 일에 제출된, 현재 계류 중인, 미국 가 특허 출원 일련 번호 62/202,715 및 2015 년 8 월 24 일에 제출된, 현재 계류 중인, 미국 가 특허 출원 일련 번호 62/209,334 의 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원 연구 또는 개발에 관한 언급
해당 없음.
서열 목록
본 출원은 서열 목록을 함유하며, 이 서열 목록은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2016 년 8 월 5 일에 생성된, ASCII 카피는 CBI017-30_ST25.txt 로 명명되고 크기가 51kb 이다.
기술 분야
본 발명은 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (engineered Type II CRISPR-Cas9-associated split-nexus polynucleotides), 시스템, 조성물, 및 사용 방법에 관한 것이다.
유전자 조작은 특정 핵산 서열의 결실, 삽입, 돌연변이, 또는 치환에 의해 게놈을 변경하는 것을 포함한다. 변경은 유전자 또는 위치 특이적일 수 있다. 게놈 조작은 뉴클레아제를 사용하여 DNA 를 잘라서, 변경을 위한 자리를 생성할 수 있다. 특정 경우에, 절단은 표적 DNA 에 이중-가닥 끊어짐 (break) 을 도입할 수 있다. 이중-가닥 끊어짐은, 예를 들어, 내인성 비-상동 말단 연결 (endogenous non-homologous end joining) (NHEJ) 또는 상동성-지정 복구 (homology-directed repair) (HDR) 에 의해 복구될 수 있다. HDR 는 복구를 위해 주형의 존재에 의존한다. 게놈 조작의 일부 예에서, 공여자 폴리뉴클레오타이드, 또는 그의 일부는 끊어짐 내로 삽입될 수 있다.
군집을 이룬 규칙적으로 사이 공간을 둔 짧은 회문구조 리피트 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (CRISPR) 및 연합되는 Cas 단백질은 CRISPR-Cas 시스템을 구성한다. 이 시스템은 박테리아에서 외래 DNA 에 대항하여 적응 면역을 제공한다 (Barrangou, R. 등, "CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes", Science 315, 1709-1712 (2007); Makarova, K. S. 등, "Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems", Nat Rev Microbiol 9, 467-477 (2011); Garneau, J. E. 등, "The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA", Nature 468, 67-71 (2010); Sapranauskas, R. 등, "The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli", Nucleic Acids Res 39, 9275-9282 (2011)). RNA-가이드되는 Cas9 엔도뉴클레아제는 DNA 를 서열-의존적 방식으로 특이적으로 표적화하고 절단하고 (Jinek, M. 등, "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 337, 816-821 (2012); Sternberg, S. H. 등, "DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9", Nature 507, 62 (2014)), 여러 가지 유기체 및 모델 시스템에서 프로그램가능한 게놈 편집에 널리 사용되어 왔다 (미국 특허 출원 공개 번호 2015-0284727, 공개일 2015 년 10 월 8 일; Cong, L. 등, "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems", Science 339, 819-823 (2013); Jiang, W. 등, "RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems", Nat. Biotechnol. 31, 233-239 (2013); Sander, J. D., and Joung, J. K., "CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes", Nature Biotechnol. 32, 347-355. (2014)).
Jinek, M. 등, "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 337(6096), 816-21 (2012) 은 CRISPR-연합 (Cas) 시스템의 부분집합에서 트랜스-활성화 (trans-activating) crRNA (tracrRNA) 와 염기 쌍을 이루고 있는 성숙 CRISPR (crRNA) 가 이-부분 (two-part) RNA 구조를 형성하며, 이 구조가 CRISPR-연합 단백질 Cas9 를 지시하여 표적 DNA 에 이중-가닥 끊어짐을 도입하게 한다는 것을 보여줬다. crRNA-가이드 (스페이서 (spacer)) 서열에 상보적인 자리에서, Cas9 HNH 뉴클레아제 도메인은 상보적 가닥을 절단하고, Cas9 RuvC-유사 도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. Jinek, M. 등에서, 듀얼 (dual) crRNA/tracrRNA 분자는 단일-사슬 crRNA/tracrRNA 분자로 조작되었고, 이들 단일-사슬 crRNA/tracrRNA 는 표적 서열-특이적 Cas9 이중-가닥 DNA 절단을 지시했다.
Jinek, M. 등은 5' 말단에 표적 인지 서열 (스페이서) 및 그에 뒤이어 tracrRNA 와 crRNA 사이에 통상적으로 일어나는 염기-쌍형성 상호작용을 보유하는 헤어핀 구조를 함유하는 두가지 버전의 단일-사슬 crRNA/tracrRNA 를 디자인했다 (참고, Jinek, M. 등의 도 5B). 각각의 단일-사슬 crRNA/tracrRNA 에서, crRNA 의 3' 말단은 tracrRNA 의 5' 말단에 공유적으로 연결되어 있다. 플라스미드 DNA 를 사용하는 절단 어세이에서, Jinek, M. 등은 3' 절두된 (truncated) 단일-사슬 crRNA/tracrRNA 가 어세이에서 3' 말단에서 절두되지 않은 더 긴 단일-사슬 crRNA/tracrRNA 만큼 효율적으로 표적 DNA 를 절단하지 않았다는 것을 관찰했다 (참고, Jinek, M. 등의 도 5B 및 도 S14 A, B, 및 C). 이들 데이타는 "tracrRNA:crRNA 염기-쌍형성 상호작용을 넘어서 5 내지 12 위치가 효율적 Cas9 결합 및/또는 표적 인지에 중요하다" 는 것을 확인시켜줬다 (Jinek, M. 등, Science 337(6096), 820 (2012)).
Briner, A. 등, "Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality", Molecular Cell 56(2), 333-339 (2014) 은 Cas9 엔도뉴클레아제 활성을 지시하고 직교성을 정의하는 가이드 RNAs 내의 구별되는 서열 및 구조적 모듈을 동정 및 특성분석함으로써 선별적 Cas9/가이드-RNA 상호작용의 분자 기초를 해명했다. 그들은 3 개의 구별되는 Cas9 패밀리로부터의 사십-일 시스템 전체에 걸쳐 선천 crRNA:tracrRNA 듀플렉스 및 단일 가이드 (single guide) RNAs (sgRNAs) 내의 6 개의 모듈을 규명했다. 6 개의 동정된 모듈은 스페이서 (spacer), 하부 스템 (lower stem), 벌지 (bulge), 상부 스템 (upper stem), 넥서스 헤어핀 (nexus hairpin), 및 3' 헤어핀 (3' hairpin) 이다. 이들 모듈은 도 2 의 sgRNA 를 참조하여 예시된다.
스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) 로부터의 sgRNA/Cas9 시스템을 사용하여, Briner, A. 등은 시험관내 (in vitro) 및 생체내 (in vivo) 둘다에서 DNA 절단에 sgRNA 내의 벌지가 구조적으로 필수적이며, 한편 다른 영역에서 서열 치환이 관용된다는 것을 보여줬다. 더욱이, 소모적 (expendable) 특색이 제거되어 기능적 미니어처 sgRNA 를 생성할 수 있다. 그들은 또한 보존된 모듈을 동정했다 "넥서스로 명명됨; 이러한 특색은 절단에 중요한 서열 및 구조적 특색을 나타낸다" (Briner, A. 등, 페이지 2). 그들은 이러한 모듈, 넥서스가 "DNA 절단에 필수적이다" 라고 언급했다 (Briner, A. 등, 요약). 넥서스 헤어핀은 그것의 동족 (cognate) Cas9 에 활성을 부여한다. 이러한 넥서스 헤어핀의 위치는 Jinek, M. 등 (상기 참고) 에 의해 동정된 바와 같은 효율적 Cas9 결합 및/또는 표적 인지에 중요한 tracrRNA:crRNA 염기-쌍형성 상호작용을 넘어서는 5 내지 12 위치에 해당한다.
Briner, A. 등은 GC-풍부 스템 및 오프셋 (offset) 우라실을 갖는 일반적 넥서스 헤어핀 모양이 2 개의 스트렙토코쿠스 패밀리 사이에 공유된다는 것을 보여줬다. 이와 대조적으로, 넥서스 헤어핀의 특유의 이중 스템은 락토바실루스 (Lactobacillus) 시스템에 독특하고, 편재되어 있다. A52 및 C55 를 포함하여, 넥서스 헤어핀 내의 일부 염기는 구별되는 패밀리 사이에서도 엄격하게 보존되었으며, 이는 이러한 모듈의 중요한 역할을 추가로 강조한다. SpyCas9 (즉, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9) 의 결정 구조에서, A52 는 SpyCas9 의 결정 구조 내의 표적 가닥의 5' 말단에 가까운 잔기 1103-1107 의 백본과 상호작용하며, 이는 넥서스 헤어핀과 단백질 백본의 상호작용이 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif) (PAM) 결합에 요구될 수 있다는 것을 시사한다.
Wright, A. V. 등, "Rational design of split-Cas9 enzyme complex", PNAS 112(10), 2984-2989 (2015) 는 삼원 복합체를 형성하는 α-나선 및 뉴클레아제 로브 (lobe) 의 이종이합체화를 촉진하는 sgRNA 모티프의 RNA 분자 결정인자를 확인했다. sgRNA/DNA-결합된 Cas9 의 결정 구조는 sgRNA 의 5' 말단의 스페이서 및 스템-루프 모티프 (즉, Briner, A. 등에 의해 기재된 하부 스템, 벌지, 및 상부 스템 모듈) 는 주로 α-나선형 로브와 접촉하지만, 3' 말단의 2 개의 헤어핀 (즉, Briner, A. 등에 의해 기재된 헤어핀 모듈) 은 뉴클레아제 로브의 바깥쪽 면에 결합한다는 것을 보여줬다. 그들은 "최근에 활성에 결정적인 것으로 밝혀진, 넥서스 모티프" (Wright, A. V. 등, 페이지 2986, col. 1) 가 로브 사이에서 중심 위치를 차지하고 가교 나선과 광범위한 상호작용을 형성한다는 것에 주목했다. 이러한 상호작용 프로파일에 기초하여, Wright, A. V. 등은 전장 sgRNA 및 5' 또는 3' 말단으로부터 선별적으로 절두된 (결정적 넥서스 헤어핀에 변형 (modification) 이 만들어지지 않았음) 2 개의 더 짧은 sgRNA 구축물을 생성했고, 야생형 Cas9, 개별 α-나선형 및 뉴클레아제 로브, 및 스플릿-Cas9 에 대한 그들의 친화도를 확인했다.
선행 기술의 상기 교시와 반대로, 본 발명을 지지하기 위해 수행된 실험들은 Cas9 기능 (예를 들어, 이중-가닥 DNA 에 결합하여 자름) 이 스플릿 넥서스를 갖는 가이드 RNAs, 뿐만 아니라 스플릿 넥서스의 변형을 갖는 가이드 RNAs 에 의해 지지된다는 것을 예상외로 입증했다.
본 명세서에 제시된 결과들은 CRISPR 기술에 관한 새로운 디자인 및 조작의 길을 열고, 차세대 CRISPR-기반 기술의 개발을 위한 장을 마련한다.
본 발명의 양상들은 적어도 둘의 폴리뉴클레오타이드가 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템 (engineered Type II CRISPR-Cas9-associated split-nexus polynucleotide systems) 에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양상은 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 3 개의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 1 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 (stem element) 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 (nexus stem element) 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함한다. 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 2 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. sn1-casPN 의 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn2-casPN 의 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 3 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 핵산 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. sn1-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, sn1-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 은, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 (upper stem element) 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 (bulge element) 뉴클레오타이드 서열 I, 및 하부 스템 엘리먼트 (lower stem element) 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함한다. sn3-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는, 5' 에서 3' 방향으로, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함한다. 이 실시양태에서, sn1-casPN 의 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, sn1-casPN 의 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, sn2-casPN 는 하나 이상의 부속 (adjunct) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, sn2-casPN 는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. sn2-casPN 의 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 2 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 추가 실시양태에서, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 (loop element) 뉴클레오타이드 서열 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단은 sn2-casPN 의 3' 말단에 공유 결합되어 있다. 추가의 실시양태에서, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드의 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 3 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 추가 실시양태에서, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단은 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 공유 결합되어 있다.
더욱이, 본 발명의 실시양태는 sn1-casPN 과 연합되는 하나 이상의 보조 (auxiliary) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, sn1-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, sn2-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, sn1-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기에서 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 (effector binding element) 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함한다. sn2-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함한다. 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 효과기 결합 엘리먼트를 형성할 수 있다. 그러한 효과기 결합 엘리먼트의 하나의 예는 Csy4 단백질 결합 자리를 포함하는 이중-가닥 RNA 이다. 관련 실시양태는, 5' 에서 3' 방향으로, 링커 엘리먼트 (linker element) 뉴클레오타이드 서열 I 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드, 및, 5' 에서 3' 방향으로, 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 링커 엘리먼트를 형성할 수 있다. 추가 실시양태는, 헤어핀 (hairpin) (즉, 스템 루프 (stem loop) 구조) 을 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 헤어핀을 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 관련 실시양태는, 5' 에서 3' 방향으로, 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 헤어핀을 추가로 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드, 및, 5' 에서 3' 방향으로, 헤어핀 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 링커 엘리먼트를 형성할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 본원에 기재된 바와 같은 타입 II CRISPR-Cas9-연합 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 서열) 를 포함하는 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 시스템을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 서열) 를 추가로 포함한다.
본 발명에 또한 포함되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 Cas9 단백질을 포함하는 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체 (protein nucleoprotein complexes) 이며, 여기에서 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체는 핵산 표적 결합 서열에 상보적인 표적 핵산에 자리-지정 결합 (site-directed binding) 을 할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 그러한 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체 및, 예를 들어, 완충액 및/또는 사용에 관한 지침을 포함하는 키트를 포함한다. 본 발명의 방법은 표적 핵산을 자르는 방법 및 표적 핵산에 결합하는 방법을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 표적 핵산을 포함하는 핵산을 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체와 접촉시켜, 그에 의해 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체가 표적 핵산에 결합하고 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체에 의해 표적 핵산이 잘리는 것을 촉진하는 것을 포함하는 표적 핵산의 절단 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 표적 핵산을 포함하는 핵산을 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체와 접촉시켜, 그에 의해 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체가 표적 핵산에 결합하는 것을 촉진하는 것을 포함하는, 표적 핵산에 결합하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 및, 예를 들어, 완충액 및/또는 사용에 관한 지침을 포함하는 키트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 서열) 를 추가로 포함한다.
본 발명의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 본 발명의 이들 양상 및 기타 실시양태는 본원의 공개에 비추어 당업자에게 쉽게 발견될 것이다.
도 1A 및 도 1B 는 듀얼 가이드 (dual guide) 타입 II CRISPR-Cas9 연합 RNA 의 도해적 예를 제시한다. 도 1A 는 crRNA (도 1A, 101) 및 tracrRNA (도 1A, 102) 를 포함하는 이-RNA 성분 (two-RNA component) 타입 II CRISPR-Cas9 시스템을 보여준다. 도 1B 는 crRNA 와 tracrRNA 사이의 염기-쌍 수소 결합의 형성으로 2 차 구조를 형성하는 것을 도시한다 (참고, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0068797, 공개일 2014 년 3 월 6 일; 참고, 또한 Jinek, M. 등, "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science, 337, 816-21 (2012)). 도면은 하기를 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpyCas9) 의 crRNA 및 tracrRNA 의 2 차 구조적 엘리먼트의 개관 및 명명법을 제시한다: 스페이서 엘리먼트 (도 1B, 103); 하부 스템 엘리먼트 (도 1B, 104), 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 벌지 엘리먼트 (도 1B, 105), 및 상부 스템 엘리먼트 (도 1B, 106) 를 포함하는 제 1 스템 엘리먼트; 넥서스 엘리먼트 (도 1B, 107); 제 2 스템 엘리먼트를 포함하는 제 2 헤어핀 엘리먼트 (도 1B, 108); 및 제 3 스템 엘리먼트를 포함하는 제 3 헤어핀 엘리먼트 (도 1B, 109). 도면은 비례적으로 만들어져 있지 않고 일정한 비율이 아니다. 지표의 위치는 대략적이다.
도 2 는 CRISPR-Cas9 연합 RNA 의 또다른 예를 보여준다. 도면은 단일 가이드 (single guide) RNA (sgRNA) 를 도시하며, 여기에서 crRNA 는 tracrRNA 에 공유적으로 연결되어 있고 염기-쌍 수소 결합을 통해 RNA 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조를 형성한다 (참고, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0068797, 공개일 2014 년 3 월 6 일). 도면은 하기를 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 의 sgRNA 의 2 차 구조적 엘리먼트에 관한 개관 및 명명법을 제시한다: 스페이서 엘리먼트 (도 2, 201); 하부 스템 엘리먼트 (도 2, 202), 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 벌지 엘리먼트 (도 2, 205), 및 상부 스템 엘리먼트 (도 2, 203) 를 포함하는 제 1 스템 엘리먼트; 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 루프 엘리먼트 (도 2, 204); (제 1 헤어핀 엘리먼트는 제 1 스템 엘리먼트 및 루프 엘리먼트를 포함한다); 넥서스 엘리먼트 (도 2, 206); 제 2 스템 엘리먼트를 포함하는 제 2 헤어핀 엘리먼트 (도 2, 207); 및 제 3 스템 엘리먼트를 포함하는 제 3 헤어핀 엘리먼트 (도 2, 208) (참고, 예를 들어, Briner, A. E. 등, "Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality", Molecular Cell Volume 56(2), 333-339 (2014) 의 도면 1 및 3). 도면은 비례적으로 만들어져 있지 않고 일정한 비율이 아니다. 지표의 위치는 대략적이다.
도 3A, 도 3B, 도 3C, 도 3D, 도 3E, 도 3F, 도 3G, 및 도 3H 는 여러 가지 본 발명의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 폴리뉴클레오타이드를 제시한다. 본 발명의 "타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드" (sn-casPNs) 는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 백본은 넥서스 엘리먼트 내에서 끊어져 있다 (즉, 스플릿-넥서스 엘리먼트). 이들 도면은 예시적 sn-casPN 구조를 제시한다. sn-casPNs 의 기타 변형은 본 명세서에 기재되어 있다. 도면은 비례적으로 만들어져 있지 않고 일정한 비율이 아니다. 엘리먼트들에 상응하는 위치에 관한 지표는 오직 예시적 폴리뉴클레오타이드 내의 레퍼런스 포인트를 제공하기 위한 도시적인 것이다.
표 1 은 도 3A, 도 3B, 도 3C, 도 3D, 도 3E, 도 3F, 도 3G, 및 도 3H 에서 일관되게 사용되는 일련의 지표를 제시한다.
표 1
sn-casPNs 의 예와 관련되는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 도시하는데 사용되는 수치적 지표
Figure pct00001

도 3A 는 삼 (three) 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3A, 301 은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3A, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 도 3A, 303 은 스페이서 엘리먼트를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성되는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성하며, 제 1 스템 엘리먼트에 포함되는 sn1-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트를 형성하고, sn1-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 3B 는 이 (two) 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3B, 326 은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3B, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성하는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성하며, 제 1 스템 엘리먼트에 포함되는 sn1-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트를 형성하고, sn1-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 3C 는 삼 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3C, 327 은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3C, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 도 3C, 328 은 스페이서 엘리먼트를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성하는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 3D 는 이 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3D, 329 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3D, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성하는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 3E 는 사 (four) 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3E, 301 은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3E, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 도 3E, 330 은 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 를 도시한다. 도 3E, 331 은 스페이서 엘리먼트를 포함하는 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (sn4-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성하는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성하며, 제 1 스템 엘리먼트에 포함되는 sn1-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트를 형성하고, sn1-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 3F 는 삼 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3F, 332 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3F, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 도 3F, 331 은 스페이서 엘리먼트를 포함하는 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (sn4-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성하는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성하며, 제 1 스템 엘리먼트에 포함되는 sn1-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트를 형성하고, sn1-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 3G 는 사 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3G, 327 은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3G, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 도 3G, 333 은 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 를 도시한다. 도 3G, 331 은 스페이서 엘리먼트를 포함하는 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (sn4-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성하는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn3-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 3H 는 삼 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 도 3H, 334 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 3H, 302 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 를 도시한다. 도 3H, 331 은 스페이서 엘리먼트를 포함하는 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (sn4-casPN) 를 도시한다. 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성하는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다; sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn1-casPN 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다.
도 4A 및 도 4B 는 sn-casPNs 에 대한 변형을 제시한다. 도 4A 는 위에서 도 3A 내지 도 3H 에서 기재된 폴리뉴클레오타이드 1 (sn1-casPN) 및 폴리뉴클레오타이드 2 (sn2-casPN) 의 변형을 제시한다. 도 4B 는 위에서 도 4A 에서 기재된 폴리뉴클레오타이드 1 (sn1-casRNA; 위에서 도 3A 내지 도 3H 에서 기재됨) 및 폴리뉴클레오타이드 3 (sn3-casRNA; 위에서 도 3A, 도 C, 도 E, 및 도 3G 에서 기재됨) 에 대한 추가의 변형의 예를 제시하고, 도 4B 는 sn1-casPN, sn2-casPN, 및 sn3-casPN 구조의 예를 제시한다. sn1-casPN, sn2-casPN, 및 sn3-casPN 의 기타 변형은 본 명세서에 기재되어 있다. 도면은 비례적으로 만들어져 있지 않고 일정한 비율이 아니다. 엘리먼트들에 상응하는 위치에 관한 지표는 오직 예시적 폴리뉴클레오타이드 내의 레퍼런스 포인트를 제공하기 위한 도시적인 것이다. 표 2 는 도 4A 및 도 4B 에서 일관되게 사용되는 일련의 지표를 제시한다.
표 2
sn1-casPNs, sn2-casPNs, 및 sn3-casPNs 의 예와 관련되는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 도시하는데 사용되는 수치적 지표
Figure pct00002

도 4A, 401 은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분 및 스플릿-넥서스 엘리먼트의 3' 에 위치하는 임의적 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 4A, 402 는 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분, 임의적 제 2 커넥티브 (connective) 서열, 및 스플릿-넥서스 엘리먼트의 5' 에 위치하는 임의적 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 의 예를 도시한다. 도 4A, 402, 403 은 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn2-casPN 를 도시한다. 도 4A, 402, 403, 404 는 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 sn2-casPN 를 도시한다. 도 4A 에서, 5' 세 개의 점은 추가의 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
일부 실시양태에서, sn2-casPN 는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드, 또는 그들의 조합. 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 제 3 커넥티브 뉴클레오타이드 서열, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 또는 그들의 조합. 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 3' 뉴클레오타이드 서열, 또는 그들의 조합.
일부 실시양태에서, sn1-casPN 및 sn2-casPN 둘 중 어느 것도 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn1-casPN 및/또는 sn2-casPN 의 조합은 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: sn1-casPN-제 1 보조 폴리뉴클레오타이드/sn2-casPN; sn1-casPN/sn2-casPN-제 2 보조 폴리뉴클레오타이드; 또는 sn1-casPN-제 1 보조 폴리뉴클레오타이드/sn2-casPN-제 2 보조 폴리뉴클레오타이드. 더욱이, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 친화도 (affinity) 뉴클레오타이드 서열 I, 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 또는 그들의 조합. 게다가, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 친화도 뉴클레오타이드 서열 II, 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 또는 그들의 조합.
명시된 서열 (서열들이 존재할 때) 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 2 차 구조의 예는 하기를 포함한다: sn1-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트를 형성한다; sn2-casPN 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/제 1 부속 폴리뉴클레오타이드 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다; 및 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/제 2 부속 폴리뉴클레오타이드 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다.
더욱이, 일부 실시양태에서 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 명시된 서열 사이에 염기-쌍 수소 결합을 통해, 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 포함하는 2 차 구조를 형성할 수 있다: sn1-casPN 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드/ sn2-casPN 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 형태; sn1-casPN 친화도 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 친화도 뉴클레오타이드 서열 II; sn1-casPN 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II; 및 sn1-casPN 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I/sn2-casPN 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II.
그러나, 기타 실시양태에서 이들 서열 중 하나 이상 사이에 염기-쌍 수소 결합이 요구되지 않는다. 게다가, 일부 실시양태에서 2 차 구조는 명시된 서열 내에서의 염기-쌍 수소 결합을 통해 형성되며, 예를 들어, sn1-casPN 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀을 포함할 수 있고/거나 sn2-casPN 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀을 포함할 수 있다.
위에서 도 4A 에서 기재된 sn2-casPN 의 변이의 추가의 변형은 제 2 스템 엘리먼트 및 루프 엘리먼트를 포함하는 제 2 헤어핀 엘리먼트, 제 3 스템 엘리먼트 및 루프 엘리먼트를 포함하는 제 3 헤어핀 엘리먼트, 및 제 2 헤어핀 엘리먼트와 제 3 헤어핀 엘리먼트 둘다를 포함한다. 예를 들어, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단 (도 4A, 408) 을 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 5' 말단 (도 4A, 409) 에 연결시킴으로써 제 2 헤어핀 엘리먼트가 형성된다. 유사하게, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단 (도 4A, 412) 을 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 5' 말단 (도 4A, 413) 에 연결시킴으로써 제 3 헤어핀 엘리먼트가 형성된다.
일부 실시양태에서, sn2-casPN 는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드, 또는 그들의 조합. 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 제 3 커넥티브 뉴클레오타이드 서열, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 또는 그들의 조합. 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 3' 뉴클레오타이드 서열, 또는 그들의 조합.
도 4B, 401 은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분, 스플릿-넥서스 엘리먼트의 3' 에 위치하는 임의적 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 5' 에 위치하는 임의적 제 1 액세서리 (accessory) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 를 도시한다. 도 4B, 435 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 3' 에 위치하는 임의적 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 의 예를 도시한다.
일부 실시양태에서, sn1-casPN 및 sn3-casPN 둘 중 어느 것도 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn1-casPN 및/또는 sn3-casPN 의 조합은 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: sn1-casPN-제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드/sn3-casPN; sn1-casPN/sn3-casPN-제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드; 또는 sn1-casPN-제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드/sn3-casPN-제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드. 더욱이, 제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 링커 엘리먼트, 친화도 서열 (예를 들어 리간드 (ligand) 또는 리간드-결합 모이어티 (ligand-binding moiety)), 효과기 결합 엘리먼트, 또는 그들의 조합. 게다가, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 링커 엘리먼트, 친화도 서열 (예를 들어, 리간드 또는 리간드-결합 모이어티), 효과기 결합 엘리먼트, 또는 그들의 조합.
도 5A, 도 5B, 및 도 5C 는 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 실시양태에 관한 구조적 정보에 관한 것이며, 여기에서 sn1-casRNA, sn2-casRNA 는 도 3B 의 sn1-casPN 및 sn2-casPN 에 해당한다. 도 5A 및 도 5B 는 SpyCas9 의 클로즈업, 오픈 북 뷰를 제공한다. 도 5A 는 sn1-casRNA (도 5A, 502) 와 복합체로 있는 SpyCas9 의 α-나선형 로브 (도 5A, 501) 의 모델을 제시한다. 스페이서 엘리먼트 (즉, 핵산 표적 결합 서열) 에 해당하는 sn1-casRNA 의 부분은 괄호 (도 5A, 503) 로 표시되어 있다. sn1-casRNA 의 5' 말단 (도 5A, 504) 이 또한 표시되어 있다. sn1-casRNA 의 3' 말단은 스플릿 넥서스의 제 1 부분의 3' 말단 (도 5A, 505) 인 넥서스 엘리먼트 내의 끊어짐의 위치이다. 도 5B 는 sn2-casRNA (도 5B, 507) 와 복합체로 있는 SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브 (도 5B, 506) 의 모델을 제시한다. sn2-casRNA 의 5' 말단은 스플릿 넥서스의 제 2 부분의 5' 말단 (도 5A, 508) 인 넥서스 엘리먼트 내의 끊어짐의 위치이다. sn2-casRNA 의 3' 말단 (도 5B, 509) 이 또한 표시되어 있다. RuvC 도메인 (도 5B, 510; RNase H 도메인) 및 HNH 도메인 (도 5B, 511; HNH 뉴클레아제 도메인) 의 상대적 위치가 표시되어 있다. 도 5C 는 조립된 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 뷰를 제공한다. 하기 엘리먼트들의 상대적 위치가 표시되어 있다: SpyCas9 의 α-나선형 로브 (도 5C, 501); SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브 (도 5C, 506); sn1-casRNA (도 5C, 502); sn2-casRNA (도 5C, 507); sn2-casRNA 의 3' 말단 (도 5C, 509); sn1-casRNA 의 5' 말단 (도 5C, 504) 이 또한 표시되어 있다; RuvC 도메인의 상대적 위치 (도 5C, 510); 및 스플릿-넥서스 엘리먼트의 5' 및 3' 말단의 영역 (도 5C 508, 505).
도 6A, 도 6B 및 도 6C 는 이 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 이 시스템은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) (도 3B, 326) 및 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) (도 3B, 302) 에 해당한다. 도면은 비례적으로 만들어져 있지 않고 일정한 비율이 아니다. 엘리먼트들에 상응하는 위치에 관한 지표는 오직 예시적 폴리뉴클레오타이드 내의 레퍼런스 포인트를 제공하기 위한 도시적인 것이다. 표 3 은 도 6A 및 도 6B 에서 사용되는 일련의 지표를 제시한다.
표 3
sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 의 예와 관련되는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 도시하는데 사용되는 수치적 지표
Figure pct00003

도 6A 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 6A, 602 내지 604) 를 포함하는 sn1-casRNA 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 6A, 606 내지 608) 를 포함하는 sn2-casRNA 를 도시한다. 도면은 그들 사이의 연합 및 수소 결합 염기 쌍 (bp) 의 형성 전의 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 를 보여준다. 도 6B 는 그들 사이의 수소 결합 염기 쌍의 형성 후의 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn1-casRNA 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn2-casRNA 를 도시한다. 링커 엘리먼트는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I (도 6B, 602 내지 603) 과 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II (도 6B, 606 내지 607) 사이에 형성된다. 맨 아래 점선 박스 (도 6B, 609) 는 넥서스 스템 엘리먼트의 형성을 보여준다. 맨 위 점선 박스 (도 6B, 610) 는 효과기 결합 엘리먼트, 이 실시예에서 Csy4 RNA 결합 엘리먼트의 형성을 보여준다. 도 6C 는 sn2-casRNA 와 SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브의 연합 (도 6C, 613) 및 sn1-casRNA 와 SpyCas9 의 α-나선형 로브의 연합 (도 6C, 614) 을 도시한다. 또한 보여지는 것은 엔도리보뉴클레아제 활성이 없는 Csy4 의 변이체인 효과기 단백질 Csy4* (도 6C, 615) 이다. 더욱이, 스플릿 넥서스의 제 1 부분 (도 6C, 616), 스플릿 넥서스의 제 2 부분 (도 6C, 617), sn2-casRNA 의 3' 말단 (도 6C, 611), sn1-casRNA 의 5' 말단 (도 6C, 612), 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 6C, 602 내지 604), 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 6C, 606 내지 608) 가 표시되어 있다. 두꺼운 아래로 향하는 화살표는 sn2-casRNA/SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브 (도 6C, 613), sn1-casRNA/SpyCas9 의 α-나선형 로브 (도 6C, 614), 및 Csy4* 단백질 (도 6C, 615) 의 복합체 (도 6C, 618) 로의 조립을 나타낸다. 복합체 (도 6C, 618) 에서 sn2-casRNA/SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브 (도 6C, 613) 및 sn1-casRNA/SpyCas9 의 α-나선형 로브 (도 6C, 614) 는 활성 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 복합체 (도 6C, 619) 로 조립되어 있다. Csy4* 단백질 (도 6C, 615) 는 Csy4 RNA 결합 엘리먼트 (도 6C, 610) 에 결합되어 있다. 링커 엘리먼트 (620) 가 또한 표시되어 있다.
도 7A 및 도 7B 는 이 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 예를 도시한다. 이 시스템은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) (도 3B, 326) 및 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) (도 3B, 302) 에 해당한다. 도면은 비례적으로 만들어져 있지 않고 일정한 비율이 아니다. 엘리먼트들에 상응하는 위치에 관한 지표는 오직 예시적 폴리뉴클레오타이드 내의 레퍼런스 포인트를 제공하기 위한 도시적인 것이다. 표 4 는 도 7A 및 도 7B 에서 사용되는 일련의 지표를 제시한다.
표 4
sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 의 예와 관련되는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 도시하는데 사용되는 수치적 지표
Figure pct00004

도 7A 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 7A, 702 내지 703) 를 포함하는 sn1-casRNA 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 7A, 706 내지 707) 를 포함하는 sn2-casRNA 를 도시한다. 도면은 그들 사이의 연합 및 수소 결합 염기 쌍의 형성 전의 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 를 보여준다. 도면은 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 내의 염기 사이에 수소 결합 염기 쌍형성에 의해 형성된 헤어핀 엘리먼트 (도 7A, 704) 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 내의 염기 사이에 수소 결합 염기 쌍형성에 의해 형성된 헤어핀 엘리먼트 (도 7A, 708) 를 보여준다. 도 7B 는 활성 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 복합체로 조립된 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn1-casRNA 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn2-casRNA 를 도시한다. 도 7B 에서 Cas9 단백질 (도 7B, 709), 헤어핀 엘리먼트 (도 7B, 704) 를 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드, 및 헤어핀 엘리먼트 (도 7B, 708) 를 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드가 표시되어 있다.
도 8 은 AAVS-1 표적 이중-가닥 DNA 를 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 도면에서, sn-casRNAsEX 의 각각의 조합에 관해 셋의 레플리케이트 (replicates) 가 보여져 있다. 각각의 패널의 상부에, 어세이에서 사용된 sn-casRNAsEX 의 도해적 묘사가 있다. 도 8, 패널 A 는 sn1-casRNAEX, sn2-casRNAEX, sn3-casRNAEX-AAVS1 의 생화학적 활성을 보여준다. 도 8, 패널 B 는 sn1-casRNAEX 및 sn2-casRNAEX 의 생화학적 활성을 보여준다. 도 8, 패널 C 는 sn2-casRNAEX 및 sn3-casRNAEX-AAVS1 의 생화학적 활성을 보여주고, 도 8, 패널 D 는 sn1-casRNAEX 및 sn3-casRNAEX-AAVS1 의 생화학적 활성을 보여준다. 도 8, 패널 D 의 마지막 레인은 분자량 표준을 함유한다. 절단 백분율이 각각의 레인의 하부에서 보여진다. LOD 로서 표시된 레인에서, 임의의 절단 활성은 검출 한계 미만이었다.
도 9 는 부가적 Csy4 RNA 결합 서열을 포함하는 sn-casRNAs 의 절단 활성을 향상시키는 Csy4* 단백질을 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 절단 어세이는 도 3B 에 제시된 시스템의 변이체였던 2 개의 상이한 스플릿-넥서스 이 폴리뉴클레오타이드 시스템을 사용했다. 제 1 시스템에서, sn1-casRNA 는 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함했고, sn2-casRNA 는 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함했으며, 여기에서 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 연합하여 Csy4 RNA 결합 엘리먼트 (sn1-casRNAEXCsy-Csy/sn2-casRNAEXCsy-Csy) 를 형성한다. 제 2 시스템에서, sn1-casRNA 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함했고, sn2-casRNA 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함했으며, 여기에서 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 연합하여 링커 엘리먼트 및 Csy4 RNA 결합 엘리먼트 (sn1-casRNAEXCsy-lnkCsy/ sn2-casRNAEXCsy-lnkCsy) 를 형성한다. 각각의 2 개의 시스템이 사용되어 4 개의 상이한 표적을 절단했으며, 여기에서 sn1-casRNAs 각각은 하기 4 개의 표적 중 하나에 상보적인 스페이서를 포함했다: AAVS-1, CD-34, CD-151, 및 JAK-1. 도면에서, 절단 활성은 각각의 레인의 하부에서 보여진다 (분자량 표준인, 레인 1 및 10 은 예외). LOD 로서 표시된 레인에서, 임의의 절단 활성은 검출 한계 미만이었다. 각각의 Cas9 절단 어세이 반응에서 사용된 시스템은 표 5 에서 보여지는 바와 같았다.
표 5
Cas9 절단 어세이에서 사용된 스플릿 넥서스 폴리뉴클레오타이드 성분
Figure pct00005

도 10 은 sn1-casRNAsEX2 및 sn2-casRNAEX2 를 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 절단 백분율이 각각의 레인의 하부에서 보여지며, 분자량 표준인, 레인 1 은 예외이다. 도 10, 레인 2 는 sn1-casRNAEX2-AAVS1 및 sn2-casRNAEX2 시스템에 관한 절단 결과를 제시한다. 도 10, 레인 3 은 sn1-casRNAEX2-CD151 및 sn2-casRNAEX2 시스템에 관한 절단 결과를 제시한다. 도 10, 레인 4 는 sn1-casRNAEX2-JAK1 및 sn2-casRNAEX2 시스템에 관한 결과를 제시한다. 도면의 상부에서 어세이에서 사용된 sn-casRNAsEX2 의 도해적 묘사가 있다.
도 11 은 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 절단 어세이는 도 7A 에 도시된 시스템과 유사한 2 개의 상이한, 이 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템을 사용했다. 도면에서, 절단 활성은 각각의 레인의 하부에서 보여진다 (분자량 표준인, 레인 1 및 10 은 예외). LOD 로서 표시된 레인에서, 임의의 절단 활성은 검출 한계 미만이었다. 각각의 어세이에서 사용된 sn-casRNA(s) 의 도해는 도면이 상부에 도시되어 있다. 각각의 Cas9 절단 어세이 반응에서 사용된 시스템은 표 6 에서 보여지는 바와 같았다.
표 6
Cas9 절단 어세이에서 사용된 스플릿 넥서스 폴리뉴클레오타이드 성분
Figure pct00006

도 12 는 표 7 에 열거된 박테리아 종으로부터의 알려진 tracrRNA 서열에 기초하는 추정상의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 배열의 예를 제시한다. 도면에서, 제 1 칼럼은 표 7 의 "ID" 칼럼에 관한 박테리아 종에 대한 식별 번호이고, 도면의 제 2 칼럼은 스플릿-넥서스 tracrRNA (이들 각각은 sn1-casRNA/sn2-casRNA 의 예임) 의 서열이고, 제 3 칼럼은 올리고뉴클레오타이드의 SEQ ID NO 이다. 표 7 에 열거된 모든 박테리아 종은 적어도 하나의 식별된 타입 II CRISPR-Cas9 시스템을 갖는다.
표 7
박테리아 종 및 추정상의 스플릿-넥서스 tracrRNA 서열
Figure pct00007

도 13 은 본 명세서의 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 제시하는 올리고뉴클레오타이드 표이다. 제 1 칼럼은 올리고뉴클레오타이드에 대한 식별 문자이고, 제 2 칼럼은 올리고뉴클레오타이드의 서열이고, 제 3 칼럼은 올리고뉴클레오타이드의 SEQ ID NO 이다.
참조에 의한 포함
이 명세서에서 언급된 모든 특허, 공개, 및 특허 출원은 각각의 개별 특허, 공개, 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
발명의 상세한 설명
본원에서 사용되는 용어는 오직 특정 실시양태를 기술하는 목적을 위한 것이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 이 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은, 단수형은 문맥이 명백히 다르게 언급하지 않으면 복수형 지시대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "프라이머" 에 대한 언급은 하나 이상의 프라이머를 포함하고, "재조합 세포" 에 대한 언급은 하나 이상의 재조합 세포를 포함하고, "교차결합제" 에 대한 언급은 하나 이상의 교차결합제를 포함하는 등이다.
다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한, 또는 균등한 기타 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재되어 있다.
본 명세서의 교시에 비추어, 당업자는, 예를 들어, 하기 표준 교재에 의해 교시되는 바와 같은, 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전학, 및 재조합 폴리뉴클레오타이드의 종래의 기술을 적용할 수 있다: Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition, E. A. Greenfield, 2014, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1-936113-81-1; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition, R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell, ISBN 978-0-470-52812-9; Transgenic Animal Technology, Third Edition: A Laboratory Handbook, 2014, C. A. Pinkert, Elsevier, ISBN 978-0124104907; The Laboratory Mouse, Second Edition, 2012, H. Hedrich, Academic Press, ISBN 978-0123820082; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2013, R. Behringer, 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1936113019; PCR 2: A Practical Approach, 1995, M. J. McPherson, 등, IRL Press, ISBN 978-0199634248; Methods in Molecular Biology (Series), J.M. Walker, ISSN 1064-3745, Humana Press; RNA: A Laboratory Manual, 2010, D. C. Rio , 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-0879698911; Methods in Enzymology (Series), Academic Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), 2012, M. R. Green, 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1605500560; Bioconjugate Techniques, Third Edition, 2013, G. T. Hermanson, Academic Press, ISBN 978-0123822390; Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, 1997, W. V. Dashek, CRC Press, ISBN 978-0849394805; Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology), 2012, V. M. Loyola-Vargas, 등, Humana Press, ISBN 978-1617798177; Plant Transformation Technologies, 2011, C. N. Stewart, 등, Wiley-Blackwell, ISBN 978-0813821955; Recombinant Proteins from Plants (Methods in Biotechnology), 2010, C. Cunningham, 등, Humana Press, ISBN 978-1617370212; Plant Genomics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 2009, D. J. Somers, 등, Humana Press, ISBN 978-1588299970; Plant Biotechnology: Methods in Tissue Culture and Gene Transfer, 2008, R. Keshavachandran, 등, Orient Blackswan, ISBN 978-8173716164.
본원에서 사용되고 아래에서 상세히 기재되는, 용어 "sn-casPNs" 는 Cas9 단백질과 연합하여 복합체를 형성할 수 있는 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 발명은 본원에 기재된 sn-casPNs 에 관한 것이고, 일부 실시양태에서, sn-casPNs 는 Cas9 단백질과 복합체화된다. sn-casPNs 의 하나의 구별되는 특색은 둘 이상의 sn-casPNs 중 적어도 둘이 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적이라는 것이다. "타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템" 은 둘 이상의 sn-casPNs 를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "Cas 단백질" 및 "CRISPR-Cas 단백질" 은 Cas9 단백질, Cas9 오르토로그에 의해 인코딩되는 Cas9-유사 단백질, Cas9-유사 합성 단백질, Cpf1 단백질, Cpf1 오르토로그에 의해 인코딩되는 단백질, Cpf1-유사 합성 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, 및 그의 변이체 및 변형체를 포함하나 그에 제한되지 않는 CRISPR-연합 단백질을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, Cas 단백질은 클래스 2 CRISPR-연합 단백질, 예를 들어 클래스 2 타입 II CRISPR-연합 단백질이다. 각각의 야생형 CRISPR-Cas 단백질은 하나 이상의 동족 폴리뉴클레오타이드 (가장 전형적으로 RNA) 와 상호작용하여 핵단백질 복합체 (가장 전형적으로 리보핵단백질 복합체) 를 형성한다.
본원에서 사용되는 용어 "Cas9 단백질" 은 타입 II CRISPR-Cas9 시스템에서 유래하는 Cas9 야생형 단백질, Cas9 단백질의 변형체, Cas9 단백질의 변이체, Cas9 오르토로그, 및 그들의 조합을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "dCas9" 는 또한 "촉매적 불활성 Cas9 단백질", 또는 "효소적 불활성 Cas9" 로 명명되는, 뉴클레아제-탈활성화된 Cas9 단백질인, Cas9 단백질의 변이체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템" 또는 "타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 시스템" 은 적어도 sn-casPNs 및 Cas9 단백질 또는 발현가능한 형태의 sn-casPNs 및 Cas9 단백질 또는 sn-casPNs 및 Cas9 단백질 및 그의 발현가능한 형태의 조합을 포함하는 시스템을 지칭한다. sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템은 CRISPR Cas 성분, 예컨대 부가적 Cas 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "동족 (cognate)" 은 전형적으로 Cas 폴리뉴클레오타이드 중 하나 (예를 들어, Cas9 단백질의 동족 RNA 성분) 에 존재하는 표적 핵산 결합 서열에 상보적인 표적 핵산에 자리-지정 결합을 할 수 있는 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 Cas9 단백질 및 그것의 관련된 하나 이상의 Cas 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "야생형", "자연적으로 발생하는" 및 "변형되지 않은" 은 자연에 존재하는 전형적인 (또는 가장 흔한) 형태, 외관, 표현형, 또는 균주를 의미하는데 사용된다; 예를 들어, 자연에 존재하고 자연의 원천으로부터 단리될 수 있는 세포, 유기체, 형질, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 거대분자 복합체, 유전자, RNAs, DNAs, 또는 게놈의 전형적인 형태. 야생형 형태, 외관, 표현형, 또는 균주는 의도적 변형 전의 원래의 부모로서의 역할을 한다. 따라서, 돌연변이체, 변이체, 조작된, 재조합, 및 변형된 형태는 야생형 형태가 아니다.
본원에서 사용되는, 용어 "조작된", "유전자 조작된", "재조합", "변형된", 및 "비-자연적으로 발생하는" 은 호환가능하고, 의도적 인간 조작을 나타낸다.
본원에서 사용되는, 용어 "핵산", "뉴클레오타이드 서열", "올리고뉴클레오타이드", 및 "폴리뉴클레오타이드" 는 호환가능하다. 전부 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA) 또는 리보뉴클레오타이드 (RNA), 또는 그의 유사체일 수 있고, 임의의 길이를 가질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 기능을 수행할 수 있고 임의의 2 차 구조 및 3 차원 구조를 가질 수 있다. 이들 용어는 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티에서 변형되어 있는 자연적 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 망라한다. 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기-쌍형성 특이성 (예를 들어, T 와의 A 염기 쌍의 유사체) 을 갖는다. 폴리뉴클레오타이드 는 하나의 변형된 뉴클레오타이드 또는 복수의 변형된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 많은 변형된 뉴클레오타이드가 상업적 제공자 예컨대 TriLink (San Diego, CA) 및 Intregrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) 로부터 입수가능하다) 를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드의 예는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 뉴클레오타이드 구조는 중합체가 조립되기 전에 또는 중합체가 조립된 후에 변형될 수 있다. 중합 후에, 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 표지 성분 또는 표적-결합 성분과의 접합을 통해 부가적으로 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분을 통합할 수 있다. 상기 용어는 또한 (i) 합성, 자연적으로 발생하는, 및 비-자연적으로 발생하는, 및 (ii) 참조 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 와 유사한 결합 특성을 갖는, 변형된 백본 잔기 또는 연결기를 포함하는 핵산을 망라한다. 그러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩티드-핵산, 및 모르폴리노 구조를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
펩티드-핵산 (PNAs) 은 폴리뉴클레오타이드 포스페이트-당 백본이 가요성 슈도-펩티드 중합체로 대체되어 있는 핵산의 합성 상동체이다. 핵염기는 중합체에 연결되어 있다. PNAs 은 RNA 및 DNA 의 상보적 서열에 높은 친화도 및 특이성으로 하이브리드화하는 능력을 갖는다.
포스포로티오에이트 핵산에서, 포스포로티오에이트 (PS) 결합은 폴리뉴클레오타이드 포스페이트 백본 내의 비-가교 산소를 황 원자로 대체한다. 이러한 변형은 뉴클레오타이드간 연결기를 뉴클레아제 붕괴에 저항성으로 만든다. 일부 실시양태에서, 포스포로티오에이트 결합이 폴리뉴클레오타이드 서열의 5'- 또는 3'-말단의 마지막 3-5 개의 뉴클레오타이드 사이에 도입되어 엑소뉴클레아제 붕괴를 저해한다. 전체 올리고뉴클레오타이드 전체를 통한 포스포로티오에이트 결합의 배치는 엔도뉴클레아제에 의한 붕괴를 감소시키는 것을 또한 돕는다.
트레오스 핵산 (TNA) 은 인공 유전자 중합체이다. TNA 백본 구조는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복하는 트레오스 당을 포함한다. TNA 중합체는 뉴클레아제 붕괴에 저항성이다. TNA 는 염기-쌍 수소 결합에 의해 듀플렉스 구조로 자가-조립할 수 있다.
연결기 역위 (inversion) 가 "역전된 포스포라미다이트" 의 사용을 통해 폴리뉴클레오타이드 내로 도입될 수 있다 (참고, 예를 들어, www.ucalgary.ca/dnalab/synthesis/-modifications/linkages). 전형적으로 그러한 폴리뉴클레오타이드는 포스포라미다이트 기를 5'-OH 위치에 갖고, 디메톡시트리틸 (DMT) 보호기를 3'-OH 위치에 갖는다. 보통, DMT 보호기는 5'-OH 에 있고, 포스포라미다이트는 3'-OH 에 있다. 연결기 역위의 가장 흔한 용도는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단에 3'-3' 연결기를 첨가하는 것이다. 3'-3' 연결기는 2 개의 5'-OH 말단을 갖고 3'-OH 말단을 갖지 않는 올리고뉴클레오타이드를 생성함으로써 엑소뉴클레아제 붕괴에 대해 폴리뉴클레오타이드를 안정화시킨다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에서 관습적 5' 내지 3' 배향으로 표시된다.
본원에서 사용되는, 용어 "상보성" 은 또다른 핵산 서열과 (예를 들어, 전통적 Watson-Crick 염기 쌍형성을 통해) 수소 결합(들)을 형성하는 핵산 서열의 능력을 지칭한다. 퍼센트 상보성은 제 2 핵산 서열과 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 잔기의 백분율을 나타낸다. 2 개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 100% 상보성을 가질 때, 2 개의 서열은 완벽히 상보적이며, 즉, 제 1 폴리뉴클레오타이드의 모든 근접 잔기는 제 2 폴리뉴클레오타이드 내 동일한 수의 근접 잔기와 수소 결합한다.
본원에서 사용되는, 용어 "서열 동일성" 은 일반적으로 다양한 가중 파라미터를 갖는 알고리즘을 사용하여 제 1 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드를 제 2 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드과 비교할 때 뉴클레오타이드 염기 또는 아미노산의 퍼센트 동일성을 지칭한다. 2 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2 개의 폴리펩티드 사이의 서열 동일성은 다양한 방법 및 월드 와이드 웹을 통해 GENBANK (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk.) 를 포함하는 사이트에서 입수가능한 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, BLAST, CS-BLAST, FASTA, HMMER, L-ALIGN 등) 에 의한 서열 정렬을 사용하여 확인될 수 있다. 2 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2 개의 폴리펩티드 서열 사이의 서열 동일성은 일반적으로 다양한 방법 또는 컴퓨터 프로그램의 표준 디폴트 파라미터를 사용하여 계산된다. 2 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2 개의 폴리펩티드 사이의, 본원에서 사용되는, 높은 정도의 서열 동일성은 전형적으로 약 90% 동일성 내지 100% 동일성, 예를 들어, 약 90% 동일성 이상, 바람직하게는 약 95% 동일성 이상, 더욱 바람직하게는 약 98% 동일성 이상이다. 2 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2 개의 폴리펩티드 사이의, 본원에서 사용되는, 중간 정도의 서열 동일성은 전형적으로 약 80% 동일성 내지 약 85% 동일성, 예를 들어, 약 80% 동일성 이상, 바람직하게는 약 85% 동일성이다. 2 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2 개의 폴리펩티드 사이의, 본원에서 사용되는, 낮은 정도의 서열 동일성은 전형적으로 약 50% 동일성 내지 75% 동일성, 예를 들어, 약 50% 동일성, 바람직하게는 약 60% 동일성, 더욱 바람직하게는 약 75% 동일성이다. 예를 들어, Cas 단백질 (예를 들어, 아미노산 치환을 포함하는 Cas9) 은, 그것의 길이에 거쳐, 참조 Cas 단백질 (예를 들어, 야생형 Cas9) 에 대해 중간 정도의 서열 동일성, 또는 바람직하게는 높은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다. 또다른 예로서, Cas9-연합 폴리뉴클레오타이드 (즉, Cas9 단백질과 복합체화할 수 있는 Cas9-연합 폴리뉴클레오타이드) 는, 그것의 길이에 거쳐, 참조 Cas 단백질과 복합체화하는 참조 야생형 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, Cas9 와 자리-지정 복합체를 형성하는 sgRNA) 에 대해 중간 정도의 서열 동일성, 또는 바람직하게는 높은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "하이브리드화" 또는 "하이브리드화하다" 또는 "하이브리드화하는" 은 2 개의 상보적 단일-가닥인 DNA 또는 RNA 분자를 조합하고 그들이 수소 염기 쌍형성을 통해 단일 이중-가닥 분자 (DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA) 를 형성하는 것을 허용하는 과정이다. 하이브리드화 스트린전시 (stringency) 는 전형적으로 하이브리드화 온도 및 하이브리드화 완충액의 염 농도에 의해 결정되며, 예를 들어, 높은 온도 및 낮은 염은 높은 스트린전시 하이브리드화 조건을 제공한다. 상이한 하이브리드화 조건에 관한 염 농도 범위 및 온도 범위의 예는 다음과 같다: 높은 스트린전시, 대략 0.01M 내지 대략 0.05M 염, 하이브리드화 온도 Tm 아래로 5℃ 내지 10℃; 중간 스트린전시, 대략 0.16M 내지 대략 0.33M 염, 하이브리드화 온도 Tm 아래로 20℃ 내지 29℃; 낮은 스트린전시, 대략 0.33M 내지 대략 0.82M 염, 하이브리드화 온도 Tm 아래로 40℃ 내지 48℃. 듀플렉스 핵산의 Tm 은 당해 기술분야에 잘 알려진 표준 방법에 의해 계산된다 (Maniatis, T., et al (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; Casey, J. 등, (1977) Nucleic Acids Res., 4: 1539; Bodkin, D.K. 등, (1985) J. Virol. Methods, 10: 45; Wallace, R.B. 등 (1979) Nucleic Acids Res. 6: 3545). Tm 을 추정하는 알고리즘 예측 툴이 또한 널리 입수가능하다. 하이브리드화에 관한 높은 스트린전시 조건은 전형적으로 표적 서열에 대해 상보성을 갖는 핵산이 표적 서열과 지배적으로 하이브리드화하고, 비-표적 서열에 실질적으로 하이브리드화하지 않는 조건을 지칭한다. 전형적으로 하이브리드화 조건은 중간 스트린전시, 바람직하게는 높은 스트린전시이다.
본원에서 사용되는 "스템-루프 구조" 또는 "스템-루프 엘리먼트" 는 지배적으로 단일-가닥인 뉴클레오타이드의 영역 ("루프 엘리먼트") 에 의해 한 쪽에서 연결되어 있는 이중-가닥 영역 ("스템 엘리먼트") 을 형성하는 것으로 알려진 또는 예측되는 뉴클레오타이드의 영역을 포함하는 2 차 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "헤어핀" 엘리먼트가 또한 본원에서 스템-루프 구조를 지칭하는데 사용된다. 그러한 구조는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 염기 쌍형성은 정확할 수 있다. 그러나, 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, 그 스템 엘리먼트는 정확한 염기 쌍형성을 요구하지 않는다. 따라서, 스템 엘리먼트는 하나 이상의 염기 미스매치 또는 쌍을 이루지 않는 염기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "재조합" 은 2 개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전 정보의 교환 과정을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "공여자 폴리뉴클레오타이드", "공여자 주형" 및 "공여자 올리고뉴클레오타이드" 는 호환가능하게 사용되고, 핵산 서열의 적어도 일부가 선별된 핵산 표적 자리 내로 통합되는 것이 의도되는 핵산 서열을 제공하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 전형적으로, 공여자 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 본 발명의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 공여자 DNA 주형과 조합으로 사용되어 게놈 DNA 내의 DNA 표적 서열을 변형시킬 수 있으며, 여기에서 게놈 DNA 는 DNA 표적 서열에서 공여자 DNA 주형의 적어도 일부를 포함하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 공여자 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 표적화 벡터) 를 포함한다. 기타 실시양태에서에서, 공여자 폴리뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드이다.
본원에서 사용되는, 용어 "상동성-지정 복구 (HDR)" 는 세포에서, 예를 들어, DNA 에서의 이중-가닥 끊어짐의 복구 동안 일어나는 DNA 복구를 지칭한다. HDR 는 뉴클레오타이드 서열 상동성을 요구하고, 공여자 주형 (예를 들어, 공여자 DNA 주형) 또는 공여자 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 이중-가닥 끊어짐이 발생한 서열 (예를 들어, DNA 표적 서열) 을 복구한다. 이는, 예를 들어, 공여자 주형 DNA 로부터 DNA 표적 서열로의 유전 정보의 전달을 초래한다. 공여자 주형 DNA 서열 또는 올리고뉴클레오타이드 서열이 DNA 표적 서열과 상이하고 공여자 주형 DNA 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 일부 또는 전부가 DNA 표적 서열 내로 통합되는 경우에, HDR 는 DNA 표적 서열의 변경 (예를 들어, 삽입, 결실, 돌연변이) 을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 공여자 주형 DNA 폴리뉴클레오타이드, 공여자 주형 DNA 폴리뉴클레오타이드의 일부, 또는 공여자 폴리뉴클레오타이드의 한 카피가 DNA 표적 서열의 자리에서 통합된다.
본원에서 사용되는, 용어 "비-상동 말단 연결 (NHEJ)" 은 공여자 주형 DNA 에 대한 요구 없이 끊어짐의 하나의 말단의 끊어짐의 다른 말단으로의 직접 결찰에 의한 DNA 에서의 이중-가닥 끊어짐의 복구를 지칭한다. 공여자 주형 DNA 의 부재 하의 NHEJ 은 종종 이중-가닥 끊어짐의 자리에서 소수의 뉴클레오타이드가 무작위로 삽입 또는 결실 ("indel" 또는 "indels") 되는 것을 초래한다.
본원에서 사용되는 용어들 "벡터" 및 "플라스미드" 는 호환가능하게 사용되고, 유전 물질을 세포 내로 도입하는 폴리뉴클레오타이드 비히클을 지칭한다. 벡터는 선형 또는 원형일 수 있다. 벡터는 숙주 세포의 표적 게놈 내로 통합되거나 또는 숙주 세포에서 독립적으로 복제할 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 복제 원점, 멀티클로닝 자리, 및/또는 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 발현 카세트를 포함한다. 벡터 및 플라스미드는 통합하는 벡터, 원핵생물 플라스미드, 진핵생물 플라스미드, 식물 합성 염색체, 에피솜, 바이러스 벡터, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 카세트" 는 선별된 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되어 숙주 세포에서의 선별된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 촉진하는 조절 서열을 포함하는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된, 폴리뉴클레오타이드 구축물이다. 예를 들어, 조절 서열은 숙주 세포에서의 선별된 폴리뉴클레오타이드의 전사, 또는 숙주 세포에서의 선별된 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역을 촉진할 수 있다. 발현 카세트는, 예를 들어, 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 또는 발현 벡터에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 "표적화 벡터" 는 전형적으로 표적 유전자 또는 표적 서열의 결정적 엘리먼트의 측면에 있는 게놈 DNA 에 상동인 맞춤 (tailored) DNA 아암 (arms) 을 포함하는 재조합 DNA 구축물이다. 세포 내도 도입되었을 때 표적화 벡터는 상동 재조합을 통해 세포 게놈 내로 통합된다. 표적 유전자의 엘리먼트는 결실 및/또는 삽입을 포함하는 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 결손 (defective) 표적 유전자는 기능적 표적 유전자로 대체될 수 있거나, 또는 대안적으로 기능적 유전자는 녹아웃될 수 있다. 임의로 표적화 벡터는 표적 유전자 내로 도입되는 선별가능한 마커를 포함하는 선별 카세트를 포함한다. 표적 유전자에 인접한 또는 때때로 표적 유전자 내에 있는 표적화 영역이 사용되어 유전자 발현의 조절에 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "조절 서열", "조절 엘리먼트", 및 "제어 엘리먼트" 는 호환가능하고, 발현될 폴리뉴클레오타이드 표적의 업스트림에 (5' 비-코딩 서열), 내부에, 또는 다운스트림에 (3' 비-번역 서열) 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 서열은, 예를 들어, 전사의 타이밍, 전사의 양 또는 수준, RNA 가공 또는 안정성, 및/또는 관련된 구조적 뉴클레오타이드 서열의 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 활성화인자 결합 서열, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 인지 서열, 프로모터, 억제인자 결합 서열, 스템-루프 구조, 번역 개시 서열, 번역 리더 서열, 전사 종결 서열, 번역 종결 서열, 프라이머 결합 자리 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된" 은 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 서로와 기능적 관계로 배치되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 그것이 코딩 서열의 전사를 조절하거나, 또는 그의 조정에 기여하는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 조절 서열을 인코딩하는 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 전형적으로 코딩 서열에 근접해 있다. 그러나, 인핸서는 프로모터로부터 수 킬로베이스까지 또는 그 이상 분리되어 있을 때 기능할 수 있다. 따라서, 일부 폴리뉴클레오타이드 엘리먼트는 작동가능하게 연결되어 있으나 근접하지는 않을 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "발현" 은, 예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA 전사물 (예를 들어, 비-코딩, 예컨대 구조적 또는 스카폴딩 RNAs) 을 초래하는 DNA 주형으로부터의 폴리뉴클레오타이드의 전사를 지칭한다. 상기 용어는 추가로 전사된 mRNA 가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사물 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물" 로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA 에서 유래하는 경우에 발현은 진핵생물 세포에서의 mRNA 의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "유전자" 는 유전자 산물 (예를 들어, RNA 또는 단백질) 을 인코딩하는 DNA 영역, 뿐만 아니라, 그러한 조절 서열이 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 영역에 인접해 있는지 여부와 무관하게, 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 예를 들어, 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 영역에 더하여, 유전자는 프로모터 서열, 종결 서열, 번역 조절 서열 (예를 들어, 리보솜 결합 자리 및 내부 리보솜 입장 자리), 인핸서, 사일런서, 인설레이터, 바운더리 엘리먼트, 복제 원점, 기질 부착 자리, 좌위 (locus) 제어 영역, 및 그들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "조정하다" 는 기능의 수량, 정도 또는 양의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 본원에서 공개된 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템은 프로모터에서 또는 그 가까이에서 결합에 의해 프로모터 서열의 활성을 조정할 수 있다. 결합 후에 일어나는 작용에 따라, sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 유도, 향상, 억제, 또는 저해할 수 있다. 따라서, 유전자 발현의 "조정" 은 유전자 활성화 및 유전자 억제을 둘다 포함한다.
조정은 표적 유전자의 발현에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 받는 임의의 특성을 확인함으로써 어세이될 수 있다. 그러한 특성은, 예를 들어, RNA 또는 단백질 수준, 단백질 활성, 산물 수준, 연합된 유전자 발현, 또는 리포터 유전자의 활성 수준의 변화를 포함한다. 따라서, 용어 유전자의 "발현을 조정하는", "발현을 저해하는", 및 "발현을 활성화하는" 은 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템이 유전자의 전사를 변화시키는, 활성화시키는, 또는 저해하는 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "아미노산" 은 아미노산 유사체, 변형된 아미노산, 펩티드모사체, 글라이신, 및 D 또는 L 광학 이성질체를 포함하는 천연 및 합성 (비천연) 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질" 은 호환가능하고 아미노산의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 임의의 길이를 가질 수 있다. 그것은 분지형 또는 선형일 수 있고, 그것은 비-아미노산에 의해 개재될 수 있고, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는, 예를 들어, 아세틸화, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 교차-결합, 및/또는 접합 (예를 들어, 표지 성분 또는 리간드와의) 을 통해 변형된 아미노산 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드 서열은 본원에서 관습적인 N-말단에서 C-말단으로의 배향으로 표시된다.
폴리펩티드 및 폴리뉴클레오타이드는 분자 생물학 분야의 일상적 기술을 사용하여 만들어질 수 있다 (참고, 예를 들어, 위에서 논의된 표준 교과서). 더욱이, 필수적으로 임의의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드는 상업적 공급원으로부터 주문 제작될 수 있다.
본원에서 사용되는, "비-선천" 은 상응하는 선천 (또는 야생형) 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열에서 발견되지 않는 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 비-선천은 또한 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 기타 변형을 포함하는 자연적으로 발생하는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비-선천 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열은 자연적으로 발생하는 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열에 유전자 조작에 의해 연결되어 키메라 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열을 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는, "융합" 은 하나 이상의 비-선천 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열 ("융합 폴리펩티드") 및/또는 핵산 서열 ("융합 폴리뉴클레오타이드", "융합 핵산") 을 지칭한다. 융합은 또한 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열에 대한, 상응하는 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열에 선천이 아닌 모이어티의 부착을 지칭할 수 있다 (즉, 상응하는 야생형 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열은 그 모이어티를 포함하지 않는다). 융합 폴리펩티드 또는 융합 폴리뉴클레오타이드의 생성에 유용할 수 있는 서열 및 모이어티의 예는 하기를 포함한다: 세포하 국소화 신호 또는 그의 코딩 서열 (예를 들어, 핵으로 표적화하기 위한 핵 국소화 신호 (NLS), 미토콘드리아로 표적화하기 위한 미토콘드리아 국소화 신호, 엽록체로 표적화하기 위한 엽록체 국소화 신호, 세포질 세망 (ER) 체류 신호 등); 소 분자 예컨대 비오틴 또는 염료 (예를 들어, 알렉사 플루오르 염료, Cyanine3 염료, Cyanine5 염료); 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 모이어티를 포함하는 검출가능한 표지 (예를 들어, 효소, 방사성동위원소, 특이적 결합 쌍의 일원; 형광단; 형광 단백질; 양자 점; 등); FRET 쌍 (공여자/수용자) (예를 들어, EDANS/플루오레세인, IAEDANS/플루오레세인, 플루오레세인/테트라메틸로다민, 플루오레세인/Cy5, EDANS/DABCYL, 플루오레세인/QSY-7, 플루오레세인/LC Red 640, 플루오레세인/Cy 5.5 및 플루오레세인/LC Red 705) 의 일원; 형광단/양자 점 공여자/수용자 쌍; 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, Malacite 그린, 스틸벤, Lucifer Yellow, Cascade Blue™, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY® FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705 및 Oregon 그린); 효소 (홀스 래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 등); 형광 단백질 (예를 들어, 그린 형광 단백질 (GFP), 레드 형광 단백질, 옐로우 형광 단백질, 임의의 여러 가지 형광 및 착색 단백질); 나노입자 (예를 들어, 형광 또는 발광 나노입자, 및 자기 나노입자); 양자 점 (QDs) (QDs 은 여러 가지 상이한 물질을 포함하는 코팅 층을 적용함으로써 수용성으로 될 수 있다. 예를 들어, QDs 은 양쪽친매성 중합체를 사용하여 가용화될 수 있다; QDs 은 코팅층에 직접 또는 간접 연결될 수 있는 임의의 다수의 상이한 기능적 기 또는 연결제를 통해 폴리펩티드에 접합될 수 있다); 및 방사성동위원소.
본원에서 사용되는 용어 "결합" 은 거대분자 사이 (예를 들어, 단백질과 폴리뉴클레오타이드 사이, 폴리뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드 사이, 및 단백질과 단백질 사이) 의 비-공유적 상호작용을 지칭한다. 그러한 비-공유적 상호작용은 또한 "연합" 또는 "상호작용" 으로 지칭된다 (예를 들어, 제 1 거대분자가 제 2 거대분자와 상호작용할 때, 제 1 거대분자는 제 2 거대분자에 비-공유적 방식으로 결합한다). 결합 상호작용의 일부는 서열-특이적일 수 있다; 그러나, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요가 없으며, 예컨대 DNA 백본에서의 단백질과 포스페이트 잔기의 접촉점이 그러하다. 결합 상호작용은 해리 상수 (Kd) 에 의해 특성분석될 수 있다. "친화도" 는 결합의 강도를 지칭한다. 증가된 결합 친화도는 더 낮은 Kd 와 상호연관된다. 비-공유적 결합의 예는 염기 쌍 사이의 수소 결합 형성이다.
본원에서 사용되는, 용어 "효과기 단백질" 은 폴리뉴클레오타이드 내의 효과기 단백질 결합 엘리먼트에 선별적으로 또는 특이적으로 결합하는 기능적 효과를 갖는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 그러한 효과기 단백질 결합 엘리먼트는 단일-가닥 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 효과기 단백질은 효소적 활성, 리모델 생물학적 분자 (예를 들어, 폴딩 샤페론) 를 포함하거나, 또는 스카폴딩 단백질일 수 있다. 상응하는 효과기 단백질 결합 엘리먼트에 결합하는 것에 더하여, 효과기 단백질은 상응하는 효과기 결합 엘리먼트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다 (예를 들어, 절단, 효소적 변형, 전사 변형). 대안적으로, 효과기 단백질은 단지 그것의 상응하는 효과기 단백질 결합 엘리먼트에 결합할 수 있다. 효소적 활성을 갖는 효과기 단백질은 효소적 불활성으로 변형될 수 있으나, 그러나, 그들은 효과기 단백질 결합 엘리먼트에 결합하는 그들의 능력을 유지한다. 예를 들어, Csy4 는 Csy4 이중-가닥 RNA 결합 엘리먼트에 결합한다. Csy4 는 정상적으로는 활성 엔도리보뉴클레아제이나, Csy4 는 그것의 엔도뉴클레아제 활성이 제거된 변이체 (예를 들어, Csy4*) 를 갖는다. Cas7, Cas5, 및 Cas6 은 또한 효과기 단백질의 예이다. 효과기 단백질의 기타 예는 단일-가닥 RNA 결합 단백질 (예를 들어, p19 siRNA 결합 단백질), 단일-가닥 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 아데노바이러스 DBP, 극도의 열안정성 단일-가닥 DNA 결합 단백질), 이중-가닥 RNA 결합 단백질 (예를 들어, DICER), 이중-가닥 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 징크 핑거 단백질) 및 이중-가닥 RNA/DNA 하이브리드 (예를 들어, 리보뉴클레아제 H) 를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는, 용어 "단리된" 은, 인간의 손에 의해, 그것의 선천 환경에서 떨어져 존재하고 그러므로 자연의 산물이 아닌 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 단리된은 실질적으로 순수함을 의미한다. 단리된 핵산 또는 폴리펩티드는 정제된 형태로 존재할 수 있고/거나 비-선천 환경에 예컨대, 예를 들어, 재조합 세포에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는, "유기체" 는 하나 이상의 세포로 구성된 임의의 살아 있는 생물학적 실체, 예컨대 박테리아, 원생생물, 진균, 식물, 또는 동물을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "숙주 세포" 는 일반적으로 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 살아 있는 유기체의 기본 구조적, 기능적 및/또는 생물학적 단위체일 수 있다. 세포는 하나 이상의 세포를 갖는 임의의 유기체로부터 기원할 수 있다. 숙주 세포의 예는 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는다: 원핵생물 세포, 진핵생물 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일-세포 진핵생물 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물로부터의 세포 (예를 들어 식물 작물 (예컨대 콩, 토마토, 사탕무, 호박, 건초, 대마초, 담배, 플랜테인, 참마, 고구마, 카사바, 감자, 밀, 수수, 콩, 쌀, 밀, 옥수수, 기름-생산 브라시카 (예를 들어, 기름-생산 평지씨 및 카놀라), 면, 사탕수수, 해바라기, 조, 및 알팔파), 과일, 채소, 곡물, 종자, 현화 식물, 침엽수, 겉씨식물, 양치식물, 석송, 붕어마름, 우산이끼, 이끼로부터의 세포), 조류 세포 (예를 들어, 보트리오코쿠스 브라우니이 (Botryococcus braunii), 클라미도모나스 라인하르드티이 (Chlamydomonas reinhardtii), 나노클로로프시스 가디타나 (Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사 (Chlorella pyrenoidosa), 사르가숨 파텐스 씨. 아가르드흐 (Sargassum patens C. Agardh) 등), 해조 (예를 들어 켈프), 진균 세포 (예를 들어, 효모 세포, 버섯으로부터의 세포), 동물 세포, 무척추동물 (예를 들어 초파리, 자포동물, 극피동물, 선충 등) 로부터의 세포, 척추동물 (예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류) 로부터의 세포, 포유류 (예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 랫트, 마우스, 비-인간 영장류, 인간 등) 로부터의 세포. 더욱이, 세포는 줄기 세포 또는 선조 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "트랜스제닉 유기체" 는 재조합적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유기체를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "트랜스제닉 식물 세포" 및 "트랜스제닉 식물" 은 호환가능하고 재조합적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 식물 세포 또는 식물을 지칭한다. 용어 트랜스제닉 식물에 포함되는 것은 트랜스제닉 식물의 자손 (임의의 세대) 또는 종자로서, 재조합적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 분절을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 자손 또는 종자이다.
본원에서 사용되는, 구절 "트랜스제닉 식물 세포 또는 식물의 생성" 은 재조합 DNA 방법 및 기술을 사용하여 식물 형질전환을 위한 벡터를 구축하여 식물 세포 또는 식물을 형질전환시키고 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물을 생성하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "부형제" 는 전형적으로 본 발명의 약학적 조성물의 제형화 또는 투여에 사용되는 임의의 약리학적 불활성 물질, 예를 들어, 캐리어 또는 비히클을 지칭한다. 본 발명의 실시에서 유용한 부형제의 예는 본원에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생리학적 조건" 은 살아 있는 세포와 적합성일 수 있는 조건, 예를 들어, 지배적으로 수성인 조건의 온도, pH, 염도 등을 지칭한다.
용어들 "치료적 조성물", "약학적 조성물", "치료적 제제", 및 "약학적 제제" 는 본원에서 호환가능하게 사용되고, 대상체, 전형적으로 인간에 대한 적용 또는 투여에 적합한 본 발명의 조성물을 망라한다. 일반적으로 그러한 조성물은 안전하고, 살균되고, 바람직하게는 대상체에서 바람직하지 않는 반응을 유발할 수 있는 오염물이 없다 (즉, 조성물을 구성하는 화합물(들)은 약학적으로 허용가능하다). 조성물은 그것을 필요로 하는 대상체에게 경구 (즉, 입 또는 소화관에 의해 투여됨) 또는 비경구 (예를 들어, 볼, 직장, 경피, 경점막, 피하, 정맥내, 복강내, 피내, 기관내, 척수강내, 폐 등) 를 포함하는 다수의 상이한 투여 경로에 의해 적용 또는 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 는 아문 척색동물 (chordata) 의 임의의 일원, 이에 포함되는 것으로, 제한 없이, 인간 및 기타 영장류, 이에 포함되는 것으로 비-인간 영장류 예컨대 레서스 원숭이, 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 사육 포유류 예컨대 개 및 고양이; 실험실 동물, 이에 포함되는 것으로 설치류 예컨대 마우스, 랫트 및 기니아 피그; 조류, 이에 포함되는 것으로 사육, 야생 및 사냥감 조류 예컨대 닭, 칠면조 및 기타 가금 조류, 오리, 거위; 등을 지칭한다. 이 용어는 특정 연령을 지칭하지 않는다. 따라서, 다 자란, 어린, 및 갓 난 개체가 포함되는 것으로 의도된다.
CRISPR-Cas 시스템은 최근에 5 가지 타입 및 16 가지 서브타입을 포함하는 2 개의 클래스로 재분류되었다 (Makarova, K. 등, Nature Reviews Microbiology, 13, 1-15 (2015)). 이러한 분류는 CRISPR-Cas 좌위에서의 모든 cas 유전자를 동정하고 그 후 각각의 CRISPR-Cas 좌위에서의 서명 (signature) 유전자를 확인하는 것에 기초하며, 궁극적으로 CRISPR-Cas 시스템이 효과기 모듈, 즉, 간섭 시기에 관여되는 단백질을 인코딩하는 유전자에 기초하여 클래스 1 또는 클래스 2 중 어느 하나에 배치될 수 있다는 것을 확인한다. 최근에 제 6 CRISPR-Cas 시스템이 동정되었다 (Abudayyeh O. 등 "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector," Science, pii: aaf5573 [Epub] (June 2, 2016)).
클래스 1 시스템은 다중-아단위 crRNA-효과기 복합체를 갖지만, 클래스 2 시스템은 단일 단백질, 예컨대 Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, 또는 crRNA-효과기 복합체를 갖는다. 클래스 1 시스템은 타입 I, 타입 III 및 타입 IV 시스템을 포함한다. 클래스 2 시스템은 타입 II 및 타입 V 시스템을 포함한다.
타입 I 시스템은 모두 헬리카제 활성 및 절단 활성을 갖는 Cas3 단백질을 갖는다. 타입 I 시스템은 7 개의 서브-타입 (I-A 내지 I-F 및 I-U) 으로 추가로 나뉜다. 각각의 타입 I 서브-타입은 정의된 조합의 서명 유전자 및 구별되는 특색의 오페론 조직화를 갖는다. 예를 들어, 서브-타입 I-A 및 I-B 는 둘 이상의 오페론에서 조직화된 cas 유전자를 갖는 것으로 보이지만, 서브-타입 I-C 내지 I-F 는 단일 오페론에 의해 인코딩된 cas 유전자를 갖는 것으로 보인다. 타입 I 시스템은 CRISPR-Cas 면역계의 가공 및 간섭 시기에서 관여되는 다중단백질 crRNA-효과기 복합체를 갖는다. 이러한 다중단백질 복합체는 항바이러스 방어를 위한 CRISPR-연합 복합체로서 알려져 있다 (Cascade). 서브-타입 I-A 는 소 아단위 단백질을 인코딩하는 csa5 및 붕괴된 대 및 소 아단위를 인코딩하는 2 개로 스플릿되어 있는 cas8 유전자를 포함하고, 또한 스플릿 cas3 유전자를 갖는다. 서브-타입 I-A CRISPR-Cas 시스템을 갖는 유기체의 예는 아르캐오글로부스 풀기두스 (Archaeoglobus fulgidus) 이다.
서브-타입 I-B 는 cas1-cas2-cas3-cas4-cas5-cas6-cas7-cas8 유전자 배열을 갖고, csa5 유전자를 결여한다. 서브-타입 I-B 를 갖는 유기체의 예는 클로스트리디움 클루이베리 (Clostridium kluyveri) 이다. 서브-타입 I-C 는 cas6 유전자를 갖지 않는다. 서브-타입 I-C 를 갖는 유기체의 예는 바실루스 할로두란스 (Bacillus halodurans) 이다. 서브-타입 I-D 는 Cas8 대신에 Cas10d 를 갖는다. 서브-타입 I-D 를 갖는 유기체의 예는 시아노테세 종 (Cyanothece spp.) 이다. 서브-타입 I-E 는 cas4 를 갖지 않는다. 서브-타입 I-E 를 갖는 유기체의 예는 에스케리키아 콜리 (에스케리키아 콜라이) 이다. 서브-타입 I-F 는 cas4 를 갖지 않고, cas3 에 융합된 cas2 를 갖는다. 서브-타입 I-F 를 갖는 유기체의 예는 예르시니아 슈도튜베르쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis) 이다. 서브-타입 I-U 를 갖는 유기체의 예는 게오박테르 술푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens) 이다.
모든 타입 III 시스템은, 수많은 핵산 폴리머라제 및 시클라아제의 코어 도메인에 상동이고 타입 III crRNA-효과기 복합체의 최대 아단위인 Palm 도메인 (RNA 인지 모티프 (RRM) 의 변이체) 을 함유하는 다중도메인 단백질을 인코딩하는 cas10 유전자를 보유한다. 모든 타입 III 좌위는 또한 소 아단위 단백질, 하나의 Cas5 단백질 및 전형적으로 여러 개의 Cas7 단백질을 인코딩한다. 타입 III 는 추가로 4 개의 서브-타입, III-A 내지 III-D 로 나뉠 수 있다. 서브-타입 III-A 는 소 아단위를 인코딩하는 csm2 유전자를 갖고 또한 cas1, cas2 및 cas6 유전자를 갖는다. 서브-타입 III-A 를 갖는 유기체의 예는 스타필로코쿠스 에피데르미디스 (Staphylococcus epidermidis) 이다. 서브-타입 III-B 는 소 아단위를 인코딩하는 cmr5 유전자를 갖고, 또한 전형적으로 cas1, cas2 및 cas6 유전자를 결여한다. 서브-타입 III-B 를 갖는 유기체의 예는 파이로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 이다. 서브-타입 III-C 는 불활성 시클라아제-유사 도메인을 갖는 Cas10 단백질을 갖고, cas1 및 cas2 유전자를 결여한다. 서브-타입 III-C 를 갖는 유기체의 예는 메타노테르모박테르 테르마우토트로피쿠스 (Methanothermobacter thermautotrophicus) 이다. 서브-타입 III-D 는 HD 도메인을 결여하는 Cas10 단백질을 갖고, 그것은 cas1 및 cas2 유전자를 결여하고, csx10 로서 알려진 cas5-유사 유전자를 갖는다. 서브-타입 III-D 를 갖는 유기체의 예는 로세이플렉수스 종 (Roseiflexus spp.) 이다.
타입 IV 시스템은 부분적으로 붕괴된 대 아단위, Csf1, Cas5, Cas7, 및 일부 경우에, 추정상의 소 아단위를 포함하는 최소 다중아단위 crRNA-효과기 복합체를 인코딩한다. 타입 IV 시스템은 cas1 및 cas2 유전자를 결여한다. 타입 IV 시스템은 서브-타입을 갖지 않으나, 2 개의 구별되는 변이체가 존재한다. 하나의 타입 IV 변이체는 DinG 패밀리 헬리카제를 갖지만, 제 2 타입 IV 변이체는 DinG 패밀리 헬리카제를 결여하나, 소 α-나선형 단백질을 인코딩하는 유전자를 갖는다. 타입 IV 시스템을 갖는 유기체의 예는 아시디티오베실루스 페로옥시단스 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 이다.
타입 II 시스템은 cas1, cas2 및 cas9 유전자를 갖는다. cas9 는 crRNA-효과기 복합체의 기능을 표적 DNA 절단과 조합하는 다중도메인 단백질을 인코딩한다. 타입 II 시스템은 또한 tracrRNA 를 인코딩한다. 타입 II 시스템은 추가로 3 개의 서브-타입, 서브-타입 II-A, II-B 및 II-C 로 나뉜다. 서브타입 II-A 는 부가적 유전자, csn2 를 함유한다. 서브-타입 II-A 시스템을 갖는 유기체의 예는 스트렙토코쿠스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus) 이다. 서브타입 II-B 는 csn2 를 결여하나, cas4 를 갖는다. 서브-타입 II-B 시스템을 갖는 유기체의 예는 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) 이다. 서브-타입 II-C 는 박테리아에서 발견되는 가장 흔한 타입 II 시스템이고 오직 3 개의 단백질, Cas1, Cas2 및 Cas9 를 갖는다. 서브-타입 II-C 시스템을 갖는 유기체의 예는 네이세리아 락타미카 (Neisseria lactamica) 이다.
타입 V 시스템은 cpf1 유전자 및 cas1 및 cas2 유전자를 갖는다. cpf1 유전자는, Cas9 의 각각의 도메인에 상동인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 갖지만 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인을 결여하는, 단백질 Cpf1 을 인코딩한다. 타입 V 시스템은 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpf1), 라흐노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 (Lb3Cpf1), 부티리비리오 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibrio proteoclasticus) (BpCpf1), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA_33_10 (PeCpf1), 아시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus spp.) BV3L6 (AsCpf1), 포르피로모나스 마카캐 (Porphyromonas macacae) (PmCpf1), 라흐노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006 (LbCpf1), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) (PcCpf1), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) (PdCpf1), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237 (MbCpf1), 스미텔라 종 (Smithella spp.) SC_K08D17 (SsCpf1), 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai) (LiCpf1), 라흐노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020 (Lb2Cpf1), 프란시스셀라 노비시다 (Franciscella novicida) U112 (FnCpf1), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus methanoplasma termitum) (CMtCpf1), 및 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens) (EeCpf1) 를 포함하는 여러 박테리아에서 동정된 바 있다. 최근에 Cpf1 은 또한 RNase 활성을 갖고 그것은 프리-crRNA (pre-crRNA) 가공을 책임진다는 것이 입증되었다 (Fonfara, I. 등, "The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA," Nature 28, 532(7600):517-521 (2016)).
클래스 1 시스템에서, 발현 및 간섭 시기는 다중아단위 CRISPR RNA (crRNA)-효과기 복합체를 수반한다. 클래스 2 시스템에서, 발현 및 간섭 시기는 단일 대 단백질, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c1, 또는 C2c3 을 수반한다.
클래스 1 시스템에서, 프리-crRNA 는 다중아단위 crRNA-효과기 복합체에 결합되고, 성숙한 crRNA 로 가공된다. 타입 I 및 III 시스템에서 이는 RNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas6 을 수반한다. 클래스 2 타입 II 시스템에서, 프리-crRNA 는 Cas9 에 결합되고, RNase III 및 tracrRNA 를 수반하는 단계에서 성숙한 crRNA 로 가공된다. 그러나, 적어도 하나의 타입 II CRISPR-Cas 시스템, 네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis) 의 것에서, 성숙한 5' 말단을 갖는 crRNAs 는 내부 프로모터로부터 직접 전사되고, crRNA 가공은 일어나지 않는다.
클래스 1 시스템에서 crRNA 는 crRNA-효과기 복합체와 연합되고, crRNA 와 표적 핵산 사이의 염기 쌍 형성 및 뉴클레아제 활성과 RNA-결합 도메인의 조합에 의해 간섭을 달성한다.
타입 I 시스템에서, crRNA-효과기 복합체의 crRNA 및 표적 결합은 소 아단위 단백질에 융합된 Cas7, Cas5, 및 Cas8 을 수반한다. 타입 I 시스템의 표적 핵산 절단은 HD 뉴클레아제 도메인을 수반하며, 이러한 HD 뉴클레아제 도메인은 슈퍼패밀리 2 헬리카제 Cas3 에 융합되어 있거나 또는 별도의 유전자, cas3 에 의해 인코딩된다.
타입 III 시스템에서, crRNA-효과기 복합체의 crRNA 및 표적 결합은 Cas7, Cas5, Cas10 및 소 아단위 단백질을 수반한다. 타입 III 시스템의 표적 핵산 절단은 Cas7 및 Cas10 단백질과, 간섭 동안 단일-가닥 DNA 를 절단하는 것으로 여겨지는, Cas10 에 융합된 구별되는 HD 뉴클레아제 도메인의 조합된 작용을 수반한다.
클래스 2 시스템에서 crRNA 는 단일 단백질과 연합되고, crRNA 와 표적 핵산 사이의 염기 쌍 형성 및 뉴클레아제 활성과 RNA-결합 도메인의 조합에 의해 간섭을 달성한다.
타입 II 시스템에서, crRNA 및 표적 결합은 표적 핵산 절단이 그러한 것처럼 Cas9 를 수반한다. 타입 II 시스템에서, Cas9 의 RuvC-유사 뉴클레아제 (RNase H 폴드) 도메인 및 HNH (McrA-유사) 뉴클레아제 도메인은 각각 표적 핵산의 가닥 중 하나를 절단한다. 타입 II 시스템의 Cas9 절단 활성은 또한 crRNA 가 tracrRNA 에 하이브리드화하여 듀플렉스를 형성하는 것을 요구하며, 이 듀플렉스는 Cas9 에 의한 crRNA 및 표적 결합을 촉진한다.
타입 V 시스템에서, crRNA 및 표적 결합은 표적 핵산 절단이 그러한 것처럼 Cpf1 을 수반한다. 타입 V 시스템에서, Cpf1 의 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인은 표적 핵산의 하나의 가닥을 절단하고, 추정상의 뉴클레아제 도메인은 표적 핵산의 다른 가닥을 엇갈림 입체배치로 절단하여, 5' 오버행 (overhang) 을 생성하며, 이는 Cas9 절단에 의해 생성되는 무딘 말단 (blunt end) 과 대조적이다. 이들 5' 오버행은 비-상동 말단-연결 방법을 통해 DNA 의 삽입을 촉진할 수 있다.
타입 V 시스템의 Cpf1 절단 활성은 또한 crRNA 가 tracrRNA 에 하이브리드화하여 듀플렉스를 형성하는 것을 요구하지 않으며, 오히려 타입 V 시스템의 crRNA 는 내부 듀플렉스를 형성하는 스템 루프 구조를 갖는 단일 crRNA 를 사용한다. Cpf1 은 서열 및 구조 특이적 방식으로 crRNA 에 결합하며, 그것은 스템 루프 및 스템 루프에 인접한 서열, 가장 특히, 표적 핵산에 하이브리드화하는 스페이서 서열의 뉴클레오타이드 5' 를 인지한다. 이러한 스템 루프 구조는 전형적으로 길이가 15 내지 19 개 뉴클레오타이드 범위이다. 이러한 스템 루프 듀플렉스를 파괴하는 치환은 절단 활성을 폐지하지만, 스템 루프 듀플렉스를 파괴하지 않는 기타 치환은 절단 활성을 폐지하지 않는다. 타입 V 시스템에서, crRNA 는 5' 말단에서 스템 루프 구조를 형성하고, 3' 말단의 서열은 표적 핵산 내의 서열에 상보적이다.
타입 V crRNA 및 표적 결합 및 절단과 관련되는 기타 단백질은 클래스 2 후보 1 (C2c1) 및 클래스 2 후보 3 (C2c3) 을 포함한다. C2c1 및 C2c3 단백질은 길이에서 Cas9 및 Cpf1 단백질과 유사하며, 대략 1,100 개 아미노산 내지 대략 1,500 개 아미노산 범위이다. C2c1 및 C2c3 단백질은 또한 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하고, Cpf1 과 유사한 구조를 갖는다. C2c1 단백질은 표적 결합 및 절단에 crRNA 및 tracrRNA 를 요구하는 점에서 Cas9 단백질과 유사하지만, 50℃ 의 최적 절단 온도를 갖는다. C2c1 단백질은 Cpf1 와 유사하게 표적 서열의 5' 에 있는 AT-풍부 PAM 을 표적화한다 (참고, 예를 들어, Shmakov, S. 등 Molecular Cell 60(3), 385-397 (2015)).
클래스 2 후보 2 (C2c2) 는 기타 CRISPR 효과기 단백질과 서열 유사성을 공유하지 않고, 최근에 타입 VI 시스템으로서 동정되었다 (Abudayyeh O., 등, "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector," Science, pii:aaf5573 [Epub] (June 2, 2016)). C2c2 단백질은 2 개의 HEPN 도메인을 갖고 ssRNA-절단 활성을 보인다. C2c2 단백질은 표적 결합 및 절단에 crRNA 를 요구하는 점에서 Cpf1 단백질과 유사하지만, tracrRNA 를 요구하지는 않는다. 또한 Cpf1 과 같이, C2c2 단백질에 관한 crRNA 는 안정적 헤어핀, 또는 스템 루프 구조를 형성하며, 이는 C2c2 단백질과의 연합을 돕는다.
클래스 2 타입 II CRISPR Cas 시스템과 관련하여, 다수의 Cas9 오르토로그 뿐만 아니라 그들의 연합되는 폴리뉴클레오타이드 성분 (tracrRNA 및 crRNA) 이 당해 기술분야에 알려져 있다 (참고, 예를 들어, "Supplementary Table S2. List of bacterial strains with identified Cas9 orthologs," Fonfara, Ines, 등, "Phylogeny of Cas9 Determines Functional Exchangeability of Dual-RNA and Cas9 among Orthologous 타입 II CRISPR/Cas Systems," Nucleic Acids Research 42(4), 2577-2590 (2014), 모든 부록 데이타 포함; Chylinski K., 등, "Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems," Nucleic Acids Research, 42(10), 6091-6105 (2014), 모든 부록 데이타 포함.).
게다가, Cas9-유사 합성 단백질은 당해 기술분야에 알려져 있다 (참고, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일). 본 발명의 양상은 당업자에 의해 명세서의 지도에 따라 Cas9, Cas9-유사, Cas9 오르토로그에 의해 인코딩되는 단백질, Cas9-유사 합성 단백질, 및 그의 변이체 및 변형체를 포함하나 그에 제한되지 않는, 타입 II CRISPR Cas 단백질 및 Cas-단백질 인코딩 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 실시될 수 있다. 이들 Cas 단백질의 동족 RNA 성분은 본 명세서의 지도에 따라 당업자에 의해 본 발명의 실시에서 사용하기 위해 조작 및 변형될 수 있다.
타입 II CRISPR-Cas9 시스템은 추가로 II-A (Csn2 를 함유) 및 II-B (Cas4 를 함유) 및 타입 II-C (Csn2 도 아니고 Cas4 도 아님, 예를 들어 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides)) 로 세분된다. 다수의 Cas9 오르토로그 뿐만 아니라 그들의 연합되는 tracrRNA 및 crRNA 성분이 당해 기술분야에 알려져 있다 (참고, 예를 들어, "Supplementary Table S2. List of bacterial strains with identified Cas9 orthologs," Fonfara, Ines, 등, "Phylogeny of Cas9 Determines Functional Exchangeability of Dual-RNA and Cas9 among Orthologous 타입 II CRISPR/Cas Systems," Nucleic Acids Research 42(4), 2577-2590 (2014), 모든 부록 데이타 포함; Chylinski K., 등, "Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems," Nucleic Acids Research, 42(10), 6091-6105 (2014), 모든 부록 데이타 포함; Kevin M Esvelt, K. M., 등, "Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing," Nature Methods, 10, 1116-1121 (2013)).
게다가, Cas9 단백질의 변이체 및 변형체는 당해 기술분야에 알려져 있다. 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0273226 (공개일 2014 년 9 월 18 일) 은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 유전자, Cas9 단백질, 숙주-특이적 코돈 최적화된 Cas9 코딩 서열을 포함하는 Cas9 단백질의 변이체 (예를 들어, ¶¶0129-0137, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0273226, 공개일 2014 년 9 월 18 일) 및 Cas9 융합 단백질 (예를 들어, ¶¶233-240, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0273226, 공개일 2014 년 9 월 18 일) 을 논의한다. 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985 (공개일 2014 년 10 월 23 일) 은 다수의 예시적 야생형 Cas9 폴리펩티드 (예를 들어, SEQ ID NO:1-256, SEQ ID NO:795-1346, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일, 이에 포함되는 것으로 스트렙토코쿠스 피오게네스 로부터의 Cas9 의 서열 (SEQ ID NO:8), 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일) 를 교시한다. Cas9 단백질의 변형체 및 변이체가 또한 논의된다 (예를 들어, [[504-608, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일).
본 발명의 양상은 당업자에 의해 명세서의 지도에 따라 Cas9, Cas9-유사, Cas1, Cas2, Cas3, Csn2, Cas4, Cas9 오르토로그에 의해 인코딩되는 단백질, Cas9-유사 합성 단백질, 및 그의 변이체 및 변형체를 포함하나 그에 제한되지 않는 타입 II CRISPR Cas 단백질 및 Cas-단백질 인코딩 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 실시될 수 있다. 이들 Cas 단백질의 동족 RNA 성분은 본 명세서의 지도에 따라 당업자에 의해 본 발명의 실시에서 사용하기 위해 조작 및 변형될 수 있다.
Cas9 는 예시적 타입 II CRISPR Cas 단백질 (스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9, SEQ ID NO:127; 스트렙토코쿠스 써모필루스 CRISRP-1 Cas9, SEQ ID NO:128) 이다. Cas9 는 2 개의 구별되는 엔도뉴클레아제 도메인 (HNH 및 RuvC/RNase H-유사 도메인) 을 사용하여 표적 DNA 를, 자리-특이적으로, 자르도록 tracrRNA/crRNA 에 의해 프로그램될 수 있는 엔도뉴클레아제이다 (참고, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0068797, 공개일 2014 년 3 월 6 일; 참고, 또한 Jinek M. 등, "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science, 337, 816-21 (2012)). 타입 II CRISPR-Cas9 시스템의 2 개의 RNA 성분은 도 1A 에 도시되어 있다. 전형적으로 각각의 CRISPR-Cas9 시스템은 tracrRNA 및 crRNA 를 포함한다. Cas9 는 타입 II CRISPR-Cas9 시스템에 특징적인 서명 단백질이다.
crRNA 는 잠재적 DNA 표적 서열에 상보성인 영역을 갖고, tracrRNA 와 염기-쌍 수소 결합을 형성하여 2 차 구조를 형성하는, 전형적으로 적어도 스템 구조를 형성하는 제 2 영역을 갖는다. DNA 표적에 상보성인 영역은 스페이서이다. tracrRNA 및 crRNA 는 다수의 염기-쌍 수소 결합을 통해 상호작용하여 2 차 RNA 구조를 형성하며, 예를 들어, 도 1B 에 도시되어 있다. tracrRNA/crRNA 와 Cas9 단백질 사이의 복합체 형성은 Cas9 단백질의 입체구조 변화를 초래하며, 이러한 입체구조 변화는 DNA 에 대한 결합, Cas9 단백질의 엔도뉴클레아제 활성, 및 엔도뉴클레아제에 의한 crRNA-가이드되는 자리-특이적 DNA 절단을 촉진한다. Cas9 단백질/tracrRNA/crRNA 리보핵단백질 복합체가 DNA 표적 서열에 결합하거나 또는 DNA 표적 서열을 자르기 위해서, DNA 표적 서열은 Cas9 단백질/tracrRNA/crRNA 리보핵단백질 복합체와 연합되는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 에 인접해 있다.
용어 sgRNA 는 전형적으로 그것의 3' 말단에서 tracrRNA 의 5' 말단에 "루프" 서열을 통해 연결된 crRNA 를 본질적으로 포함하는 단일 가이드 RNA (즉, 단일, 근접 폴리뉴클레오타이드 서열) 를 지칭한다 (참고, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0068797, 공개일 2014 년 3 월 6 일). sgRNA 는 본질적으로 위에서 논의된 바와 같은 tracrRNA/crRNA 폴리뉴클레오타이드에 관해 기재된 바와 같이 동족 Cas9 단백질과 상호작용한다. crRNA 와 유사하게, sgRNA 는 스페이서 엘리먼트 (도 2, 201), DNA 표적 서열에 상보성인 영역, 2 차 구조, 전형적으로 스템 구조를 형성하는 염기-쌍 수소 결합을 형성하는 인접 제 2 영역을 갖는다 (예를 들어, 도 2, 202, 203, 204, 205).
sgRNA/Cas9 단백질 시스템을 사용하여, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일, 및 나중에 공개된 Briner, A. E. 등, "Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality", Molecular Cell Volume, 56(2), 333-339 (2014) 는, 소모성 특색이 제거되어 기능적 미니어처 sgRNAs 를 생성할 수 있다는 것을 입증했다. 이들 공개는 Cas9 에게 절단 활성을 부여하는, tracrRNA 에 해당하는 (crRNA 가 아닌) sgRNA 의 부분에 위치하는, "넥서스" 의 중요성을 논의한다. 넥서스는 sgRNA 또는 tracrRNA 가 그것의 동족 cas9 단백질에 결합하고 불완전효소 (apoenzyme) 에서 전효소 (haloenzyme) 로의 입체구조 전이를 부여하는 능력을 부여한다.
넥서스는 타입 II CRISPR-Cas9 시스템에서 하부 스템의 바로 다운스트림에 위치한다 (즉, 하부 스템으로부터 3' 방향에 위치한다). 넥서스의 상대적 위치의 예는 도 2, 206 에서 보여지는 sgRNA 에 도시되어 있다. 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일, 및 Briner, A.E. 등은, 또한 여러 sgRNA/Cas9 패밀리에 관한 예측된 sgRNAs 의 공통 서열 및 2 차 구조를 공개한다. 이들 참고문헌은 예측된 sgRNAs 에서 넥서스 까지의 2 차 구조의 일반적 배열이 본원에서 도 2 에서 보여지는 것들, 즉, 5' 에서 3' 방향으로, 스페이서, 제 1 스템, 및 넥서스에 해당한다는 것을 보여준다. 도 2 는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 의 sgRNA 의 엘리먼트에 관한 개관 및 명명법을 제시한다. 도 2 에 관하여, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 및 Briner, A.E. 등에서 도시된 sgRNAs 에서 넥서스의 3' 에 위치하는 스템 구조의 수 및 배열에서의 변이가 있다.
Fonfara 등, "Phylogeny of Cas9 Determines Functional Exchangeability of Dual-RNA 및 Cas9 among Orthologous 타입 II CRISPR/Cas Systems", Nucleic Acids Research, 42(4), 2577-2590 (2014), 모든 부록 데이타 포함, 특히 부록 도면 S11 은, 8 가지 타입 II CRISPR-Cas9 시스템의 crRNA/tracrRNA 서열 및 2 차 구조를 제시한다. RNA 듀플렉스 2 차 구조는 Vienna RNA 패키지의 RNA코폴드 (RNAcofold) 를 사용하여 예측되었다 (Bernhart, S.H., 등, "Partition function and base pairing probabilities of RNA heterodimers," Algorithms Mol. Biol., 1, 3 (2006); Hofacker, I.L., 등, "Secondary structure prediction for aligned RNA sequences," J. Mol. Biol., 319, 1059-1066 (2002) and RNAhybrid (bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)). 구조 예측은 그 후 VARNA 를 사용하여 시각화되었다 (Darty, K., 등, "VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure," Bioinformatics, 25, 1974-1975 (2009)). Fonfara, I. 등은, 캄필로박테르 제주니 (Campylobacter jejuni) 에 관한 crRNA/tracrRNA 복합체는 도 1B, 105 에 도시된 벌지 영역을 갖지 않는다; 그러나, 그것은 본원에서 도 1B 에서 보여지는 것들, 즉, 5' 에서 3' 방향으로, 스페이서, 제 1 스템, 및 넥서스에 상응하는 넥서스 까지의 2 차 구조의 일반적 배열을 보유한다는 것을 보여준다. Ran, F.A. 등, "In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9," Nature, 9, 520(7546), 186-291 (2015) 은, 모든 확장된 데이타 포함하여, 8 가지 타입 II CRISPR-Cas9 시스템의 crRNA/tracrRNA 서열 및 2 차 구조를 제시한다 (참고, Extended Data 도면 1 of Ran, F.A. 등). 예측된 tracrRNA 구조는 구속 생성 (Constraint Generation) RNA 폴딩 모델에 기초했다 (Zuker, M., "Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction," Nucleic Acids Res., 31, 3406-3415 (2003)). Ran, F.A. 등의 도면 1 에 제시된 8 가지 박테리아 종에 관한 crRNA/tracrRNA 구조는, 예측된 crRNA/tracrRNAs 에서 넥서스 까지의 2 차 구조의 일반적 배열이 본원에서 도 1B 에서 보여지는 것들, 즉, 5' 에서 3' 방향으로, 스페이서, 제 1 스템, 및 넥서스에 상응한다는 것을 보여준다.
위에서 및 본 명세서의 배경기술에서 논의된 바와 같이, Jinek, M. 등, "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity," Science, 337(6096), 816-21 (2012); Briner, A., 등, "Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality," Molecular Cell 56(2), 333-339 (2014); 및 Wright, A. V., 등, "Rational design of a split-Cas9 enzyme complex," PNAS 112(10), 2984-2989 (2015) 는 모두 가이드 RNA/Cas9 효소 복합체 활성에 관한 넥서스 헤어핀의 중요성에 주목했다.
그러나, 이들 교시와 반대로, 본 발명을 지지하여 수행된 실험들은 예상 외로 넥서스 헤어핀 구조가 파괴되고 변형될 수 있으며; 그에 따라 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 기술에 관한 새로운 디자인 및 조작 방안을 제공한다는 것을 입증했다.
첫번째 양상에서, 본 발명은 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 DNA 표적 서열을 포함하는 제 1 DNA 서열에 DNA 표적 결합 서열을 포함하지 않는 제 2 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 복합체는 제 1 DNA 서열을 자른다. 상기 시스템에서, 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘은 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적이다. 제 1 DNA 서열에 결합하는 것에 더하여, sn-casPNs/Cas9 복합체는 Cas9 단백질이 제 1 DNA 서열에 결합하고 그것을 절단하는 것을 야기할 수 있다. 바람직한 실시양태는 3 개의 sn-casPNs (sn1-casPN, sn2-casPN, 및 sn3-casPN; 2 개의 예가 도 3A, 도 3C 에서 보여진다) 를 포함하며, 여기에서 sn3-casPN 는 스페이서 엘리먼트 (즉, DNA 표적 결합 서열) 를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태는 2 개의 sn-casPNs (sn1-casPN, sn2-casPN; 2 개의 예가 도 3B, 도 3D 에서 보여진다) 를 포함하며, 여기에서 sn1-casPN 는 스페이서 엘리먼트 (즉, DNA 표적 결합 서열) 및 넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함한다. 3 개의 sn-casPNs 의 2 개의 변이가 도 3F, 도 3H 에서 제시된다. 4 개의 sn-casPNs 의 2 개의 변이가 도 3E, 도 3G) 에서 제시된다.
본 발명의 첫번째 양상의 하나의 실시양태에서, 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301; 도 3C, 327; 도 3E, 301; 도 3G, 327) 및 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 302; 도 3C, 302; 도 3E, 302; 도 3G, 302) 를 포함하며, 여기에서 (i) 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, (ii) 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 첫번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301; 도 3C, 327) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 303; 도 3C, 328) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있으며, 여기에서 제 3 폴리뉴클레오타이드는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 첫번째 양상의 기타 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 303) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성하고, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다.
본 발명의 첫번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 301; 도 3G, 327) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 330; 도 3G, 333) 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 331; 도 3G, 331) 는 DNA 표적 결합 서열을 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다. 이 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 및 스페이서 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 첫번째 양상의 추가의 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 301) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 330) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 331) 는 DNA 표적 결합 서열을 포함하며, 여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성하고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성한다.
추가 실시양태는 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 두번째 양상에서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 함유하는 표적 DNA 서열에 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 tracr 엘리먼트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 PAM 서열을 함유하는 DNA 서열에 우선적으로 결합하고 그것을 자른다. tracr 엘리먼트는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301; 도 3C, 327; 도 3E, 301; 도 3G, 327) 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 302; 도 3C, 302; 도 3E, 302; 도 3G, 302) 를 포함하며, 여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 두번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301; 도 3C, 327) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 303; 도 3C, 328) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있으며, 여기에서 제 3 폴리뉴클레오타이드는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 두번째 양상의 기타 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 303) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성하고, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다.
본 발명의 두번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 301; 도 3G, 327) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 330; 도 3G, 333) 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 331; 도 3G, 331) 는 DNA 표적 결합 서열을 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다. 이 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 및 스페이서 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 두번째 양상의 추가의 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 301) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 330) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 331) 는 DNA 표적 결합 서열을 포함하며, 여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성하고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성한다.
추가 실시양태는 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "tracr 엘리먼트" 에 관하여, 이 용어는 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 PAM 서열을 함유하는 DNA 서열에 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 둘 이상의 sn-casPNs 를 지칭한다. Sternberg, S.H. 등, "DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9," Nature, 507(7490), 62-67 (2014) 는 이중-결박된 (tethered) DNA 커튼을 사용하여 tracrRNA/crRNA/Cas 와 DNA 에 관한 모든 결합 사건의 위치 및 상응하는 수명을 조사하는 방법을 교시한다. 본 명세서의 지도에 따라, 당업자는 그러한 방법을 적용하여, 예를 들어, sn-casPNs/Cas9 복합체가 PAM 서열을 함유하는 DNA 서열에 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것 (더 높은 결합 친화도) 을 평가하여 둘 이상의 sn-casPNs 를 포함하는 tracr 엘리먼트의 존재를 확인할 수 있다.
sn-casPNs 에 관하여, 본원에서 사용되는 "스페이서" 또는 "스페이서 엘리먼트" 는 상보적 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 표적 결합 서열을 지칭하고, "스페이서 폴리뉴클레오타이드" 는 스페이서 엘리먼트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 스페이서 엘리먼트는 상보적 염기 쌍 (즉, 쌍을 이룬 염기) 사이에 수소 결합을 통해 표적 핵산 서열과 상호작용한다. 전형적으로, 스페이서 엘리먼트 (DNA 표적 결합 서열) 는 선별된 DNA 표적 서열에 결합한다. 스페이서 엘리먼트는 Cas9 단백질 자리-특이적 결합 및 엔도뉴클레오라이틱 (endonucleolytic) 절단의 위치를 결정한다. 스페이서 엘리먼트는 그들이 연합되는 Cas9 단백질에 따라 대략 17- 내지 대략 84 개 뉴클레오타이드 길이 범위이고, 36 개 뉴클레오타이드의 평균 길이를 갖는다 (Marraffini, L. A., 등, "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea," Nature Reviews Genetics, 11(3), 181-190 (2010)). 스페이서 엘리먼트에 관한 기능적 길이의 가변성은 당해 기술분야에 알려져 있다 (참고, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일). 스페이서 폴리뉴클레오타이드는 일부 실시양태에서 스페이서 엘리먼트에 더하여 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖고, 그러한 폴리뉴클레오타이드 서열은 전형적으로 스페이서 엘리먼트의 5' 말단, 스페이서 엘리먼트의 3' 말단, 스페이서 엘리먼트의 내부, 또는 그들의 조합에 위치한다.
염기-쌍 수소 결합을 통한 2 개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 2 차 구조 (예를 들어, 스템 엘리먼트 및 헤어핀) 의 형성은 당업자에게 알려진 다수의 방법 (예를 들어, X-선 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 저온 전자 현미경관찰법 (Cryo-EM), 화학적/효소적 프로빙, 열 변성 분석 (용융 연구), 및 질량 분광분석법을 포함하나 이에 제한되지 않는 실험 기술; 예측 기술, 예컨대 컴퓨터를 이용한 구조 예측; 바람직한 방법은 화학적/효소적 프로빙, 열 변성 분석 (용융 연구) 를 포함한다) 에 의해 확인 수 있다. 단일-가닥 RNA 또는 DNA 서열의 2 차 구조를 예측하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, "RNAfold 웹 서버" (rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) 는 단일-가닥 RNA 또는 DNA 서열의 2 차 구조를 예측한다 (참고, 예를 들어, Gruber, A.R. 등, "The Vienna RNA Websuite", Nucleic Acids Res. July 1:36 (Web Server issue) (2008); Lorenz, R. 등, "ViennaRNA Package 2.0", Algorithms for Molecular Biology, 6, 26 (2011)). RNA 2 차 구조를 평가하는 바람직한 방법은 조합된 실험적 및 컴퓨터를 이용한 SHAPE 방법을 사용하는 것이다 (Low J.T., 등, "SHAPE-Directed RNA Secondary Structure Prediction," Methods, 52(2), 150-158 (2010)).
본 발명의 세번째 양상에서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 각각 5' 및 3' 말단을 갖는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301; 도 3C, 327; 도 3E, 301; 도 3G, 327) 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하며, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 은, 5' 에서 3' 방향으로, Nw-N1-N2-Nx 를 포함하며, 여기에서 Nw 는 제 1 커넥티브 뉴클레오타이드 서열이며, 여기에서 w 는 커넥티브 뉴클레오타이드 서열의 길이이고, w 는 2 이상이고, N1 은 뉴클레오타이드이고, N2 는 뉴클레오타이드이고, Nx 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드이며, 여기에서 x 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 길이이고, x 는 0 이상이다. 일부 실시양태에서, Nw 에서, w 는 0 이상이고, 바람직하게는 w 는 1 이상이며, 더욱 바람직하게는 w 는 2 이상이다. 제 2 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 302; 도 3C, 302; 도 3E, 302; 도 3G, 302) 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는, 5' 에서 3' 방향으로, Ny-Nc2-Nc1-Nz 를 포함하며, 여기에서 Ny 는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드이며, 여기에서 y 는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 길이이고, y 는 0 이상이고, Nc2 는 N2 에 상보적인 뉴클레오타이드이고, Nc1 은 N1 에 상보적인 뉴클레오타이드이고, Nz 는 제 2 커넥티브 뉴클레오타이드 서열이며, 여기에서 z 는 제 2 커넥티브 뉴클레오타이드 서열의 길이이고, z 는 0 이상이다. 일부 실시양태에서, Nz 에서, z 는 1 이상이며, 바람직하게는 z 는 2 이상이다. 이러한 양상에서, 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 2 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열은 적어도 N1/Nc1 과 N2/Nc2 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 세번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301; 도 3C, 327) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 303; 도 3C, 328) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있으며, 여기에서 제 3 폴리뉴클레오타이드는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 세번째 양상의 기타 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 301) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3A, 303) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성하고, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다.
본 발명의 세번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 301; 도 3G, 327) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 330; 도 3G, 333) 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3E, 331; 도 3G, 331) 는 DNA 표적 결합 서열을 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성한다. 이 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 및 스페이서 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 세번째 양상의 추가의 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 301) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 3 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 330) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (도 3E, 331) 는 DNA 표적 결합 서열을 포함하며, 여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성하고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성한다.
추가 실시양태는 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 네번째 양상은 본 발명의 첫번째, 두번째, 및 세번째 양상의 변형을 포함하며, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 및 제 3 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단은 루프 엘리먼트에 의해 연결된다. 따라서, 본 발명의 네번째 양상에서는 "제 3 폴리뉴클레오타이드" 가 없으며, 그 이유는 그것이 "제 1 헤어핀을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드" 에 포함되었기 때문이다. 일부 실시양태에서, 이러한 제 1 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 제 1 스템 엘리먼트, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트는 제 1 헤어핀을 포함한다 (예를 들어, 도 3D, 329). 추가의 실시양태에서 제 1 스템 엘리먼트는 하부 스템 엘리먼트, 벌지 엘리먼트, 및 상부 스템 엘리먼트를 추가로 포함하며, 여기에서 하부 스템 엘리먼트는 벌지 엘리먼트에 인접하고, 벌지 엘리먼트는 상부 스템 엘리먼트에 인접하고, 벌지 엘리먼트는 하부 스템 엘리먼트와 상부 스템 엘리먼트 사이에 끼어 들어가 있고, 상부 스템 엘리먼트는 제 1 헤어핀을 포함한다 (예를 들어, 도 3B, 326). 일부 실시양태에서 스페이서 엘리먼트는 제 1 헤어핀을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3F, 332; 도 3H, 334) 로부터 분리되어 있고, 스페이서 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 3F, 331; 도 3H, 331) 는 스페이서 엘리먼트를 포함한다. 제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드 또는 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 아래 기재된 sn-casPNs 의 변이는 제 1 헤어핀을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn-casPNs 에 적용되지 않는다.
추가 실시양태는 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템의 성분은 도 5A, 도 5B, 및 도 5C 에 도시되어 있다. sn1-casRNA/sn2-casRNA 의 예는 도 3B 에서 제시되어 있으며, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드는 sn1-casRNA (도 3B, 326) 이고, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 sn2-casRNA (도 3B, 302) 이다. 도 5A 는 sn1-casRNA (도 5A, 502) 와 복합체로 있는 SpyCas9 의 α-나선형 로브 (도 5A, 501) 의 모델을 제시한다. 스페이서 엘리먼트 (즉, 핵산 표적 결합 서열) 에 상응하는 sn1-casRNA 의 부분이 괄호 (도 5A, 503) 에 의해 표시되어 있다. 5B 는 sn2-casRNA (도 5B, 507) 와 복합체로 있는 SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브 (도 5B, 506) 의 모델을 제시한다. RuvC 도메인 (도 5B, 510; RNase H 도메인) 및 HNH 도메인 (도 5B, 511; HNH 뉴클레아제 도메인) 의 상대적 위치가 표시되어 있다. 도 5C 는 조립된 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 뷰를 제공한다. sn1-casRNA 스플릿-넥서스 엘리먼트의 3' 말단 (도 5C, 505) 및 sn2-casRNA 스플릿-넥서스 엘리먼트의 3' 말단 (도 5C, 508) 의 상대적 위치가 표시되어 있다.
본 발명의 다섯번째 양상은 본 발명의 첫번째, 두번째, 및 세번째 양상의 변형을 포함하며, 여기에서 변형은 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 또는 제 1 폴리뉴클레오타이드와 제 3 폴리뉴클레오타이드 둘다에 임의적 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 첨가하는 것이다. 본 발명의 다섯번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 5' 에 위치하는 제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 제 1 폴리뉴클레오타이드의 제 1 스템 엘리먼트가, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함할 때, 그 때 제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 5' (예를 들어, 도 4B, 401, 427 내지 428) 에 위치한다.
본 발명의 다섯번째 양상의 기타 실시양태에서, 제 3 폴리뉴클레오타이드는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 3' 에 위치하는 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 제 3 폴리뉴클레오타이드의 제 1 스템 엘리먼트가, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함할 때, 그 때 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 3' (예를 들어, 도 4B, 435, 429 내지 430) 에 위치한다.
액세서리 폴리뉴클레오타이드는 친화도 태그, 리간드, 리간드-결합 서열, 링커 서열, 헤어핀, 친화도 뉴클레오타이드 서열, 효과기 결합 엘리먼트, 융합된 효과기 단백질, 세포하 국소화 신호 또는 그의 코딩 서열; 소 분자, 검출가능한 표지, FRET 쌍의 일원, 형광단/양자 점 공여자/수용자 쌍, 형광 표지, 효소, 형광 단백질, 나노입자, 양자 점을 포함하나 그에 제한되지 않는 여러 가지 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명의 여섯번째 양상은 sn-casPNs 의 제 2 폴리뉴클레오타이드의 변형에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 2 스템 엘리먼트를 포함하며, 여기에서 제 2 스템 엘리먼트는 헤어핀을 포함한다. 제 2 폴리뉴클레오타이드는 또한, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 제 2 스템 엘리먼트, 및 제 3 스템 엘리먼트를 포함할 수 있으며, 여기에서 제 3 스템 엘리먼트는 헤어핀을 포함한다. 더욱이, 제 2 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 2 스템 엘리먼트 (여기에서 제 2 스템 엘리먼트는 헤어핀을 포함한다), 및 제 3 스템 엘리먼트 (여기에서 제 3 스템 엘리먼트는 헤어핀을 포함한다) 를 포함한다 (예를 들어, 도 3A, 302).
본 발명의 여섯번째 양상의 또다른 실시양태에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 제 2 커넥티브 서열, 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I (예를 들어, 도 4A, 402, 406 내지 407) 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드 (도 4A, 403, 409 내지 410) 를 추가로 포함하며, 여기에서 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 2 스템 엘리먼트를 형성한다. 일부 실시양태에서, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 5' 말단 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단은 루프 엘리먼트에 의해 연결되어 제 2 헤어핀을 생성한다.
더욱이, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I (도 4A, 403, 411 내지 412) 을 포함할 수 있고, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드 (도 4A, 404) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II (도 4A, 404, 413 내지 414) 를 포함하며, 여기에서 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 3 스템 엘리먼트를 형성한다. 일부 실시양태에서, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 5' 말단 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단은 루프 엘리먼트에 의해 연결되어 제 3 헤어핀을 생성한다.
기타 실시양태에서 제 2 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단은 친화도 태그, 리간드, 리간드-결합 서열, 링커 서열, 헤어핀, 친화도 뉴클레오타이드 서열, 효과기 결합 엘리먼트, 융합된 효과기 단백질, 세포하 국소화 신호 또는 그의 코딩 서열; 소 분자, 검출가능한 표지, FRET 쌍의 일원, 형광단/양자 점 공여자/수용자 쌍, 형광 표지, 효소, 형광 단백질, 나노입자, 양자 점을 포함하나 그에 제한되지 않는 여러 가지 모이어티를 포함할 수 있는 3' 말단 서열을 포함한다.
본 발명의 일곱번째 양상은 제 1 폴리뉴클레오타이드의 스플릿 넥서스의 3' 말단 및 제 2 폴리뉴클레오타이드의 스플릿 넥서스의 5' 말단의 변형에 관한 것이며, 여기에서 변형은 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 또는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드 둘다에 임의적 보조 폴리뉴클레오타이드를 부가하는 것이다. 하나의 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서 링커 엘리먼트 폴리뉴클레오타이드가 넥서스 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열과 보조 폴리뉴클레오타이드 사이에 끼어 들어가 있다. 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 예컨대 단일-가닥 RNA 결합 단백질에 관한 결합 자리를 포함할 수 있다.
본 발명의 일곱번째 양상의 추가의 실시양태에서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 효과기 결합 엘리먼트를 형성할 수 있다. 따라서, 효과기 단백질이 결합할 수 있는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 효과기 결합 엘리먼트를 제공한다. 일부 실시양태에서 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 RNA 이고, 효과기 단백질은 효과기 결합 엘리먼트에 결합할 수 있는 이중-가닥 RNA 결합 단백질이다. 이중-가닥 RNA 결합 효과기 단백질의 예는 Cas5, Cas6, 및 Csy4 를 포함한다. 일부 실시양태에서 효과기 결합 단백질은 촉매적 불활성이며 (예를 들어, Csy4*), 그러나 여전히 효과기 결합 엘리먼트에 결합한다.
본 발명의 일곱번째 양상의 일부 실시양태에서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 제 1 친화도 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 친화도 뉴클레오타이드 서열은 폴리펩티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 친화도 뉴클레오타이드 서열은 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도 뉴클레오타이드 서열 중 하나는 리간드를 포함하고, 기타 친화도 뉴클레오타이드 서열은 상응하는 리간드-결합 모이어티를 포함한다.
도 4A 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 4A, 401, 419 내지 424) 를 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (도 4A, 401) [여기에서 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I (도 4A, 401, 419 내지 422), 친화도 뉴클레오타이드 서열 I (도 4A, 401, 422 내지 423), 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I (도 4A, 401, 423 내지 424) 을 포함한다], 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 4A, 402, 405 내지 418) 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (도 4A, 402) [여기에서 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II (도 4A, 402, 405 내지 416), 친화도 뉴클레오타이드 서열 II (도 4A, 402, 416 내지 417), 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II (도 4A, 402, 417 내지 418) 를 포함한다] 의 예를 도시한다.
효과기 단백질의 사용의 예는 Csy4* 이며, 상응하는 효과기 단백질 결합 엘리먼트가 이 도면을 참조하여 제공될 수 있다. 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I (도 4A, 401, 423 내지 424) 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II (도 4A, 402, 417 내지 418) 는 염기-쌍 수소 결합을 통해 이중-가닥 RNA 구조를 형성하여 Csy4* 이중-가닥 결합 엘리먼트를 형성한다. 이중-가닥 RNA 결합 엘리먼트의 형성 후에 Csy4* 단백질은 결합 엘리먼트에 결합하고 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드와 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 상호작용을 안정화시킨다. Csy4* 및 그것의 상응하는 결합 엘리먼트는 실시예 5 및 실시예 7 에 제시된 Cas9 절단 실험에서 이러한 방식으로 사용된다.
효과기 단백질의 사용의 관련예는 Csy4* 이며, 상응하는 효과기 단백질 결합 엘리먼트가 이 폴리뉴클레오타이드 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템에 관한 도 6A, 도 6B, 및 도 6C 에 제시되어 있다. 이 시스템은 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 1 부분을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) (도 3B, 326) 및 스플릿-넥서스 엘리먼트의 제 2 부분을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) (도 3B, 302) 에 해당한다.
Csy4* 가 4 개의 이중-가닥 DNA 표적의 sn-casRNAs/Cas9 단백질 절단을 촉진하는 능력이 실시예 5 에서 입증된다. 도 9 에 제시된 데이타는 효과기 결합 엘리먼트 (예를 들어, Csy4 RNA 결합 서열) 를 갖는 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템에 의한 표적 이중-가닥 DNA 의 효과기 단백질 (여기에서 Csy4*) 향상된 절단을 입증한다. Csy4* 가 이중-가닥 DNA 표적의 sn-casRNAs/Cas9 단백질 절단을 촉진하는 능력과 관련된 추가의 데이타가 실시예 7 에 제시되어 있다.
도 6A 는 그들 사이의 연합 및 수소 결합 염기 쌍의 형성 전의 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 를 보여준다. 도 6B 는 효과기 결합 엘리먼트의 형성을 도시하기 위해 그들 사이의 수소 결합 염기 쌍의 형성 후의 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn1-casRNA 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 sn2-casRNA 를 도시한다. 맨 위 점선 박스 (도 6B, 610) 는 효과기 결합 엘리먼트, 이 실시예에서 Csy4* RNA 결합 엘리먼트의 형성을 보여준다. 도 6C 는 sn2-casRNA 와 SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브의 연합 (도 6C, 613) 및 sn1-casRNA 와 SpyCas9 의 α-나선형 로브의 연합 (도 6C, 614) 을 도시한다. 또한 보여지는 것은 엔도리보뉴클레아제 활성이 없는 Csy4 의 변이체인 효과기 단백질 Csy4* (도 6C, 615) 이다. 두꺼운 아래로 향하는 화살표는 sn2-casRNA/SpyCas9 의 촉매적 뉴클레아제 로브 (도 6C, 613), sn1-casRNA/SpyCas9 의 α-나선형 로브 (도 6C, 614), 및 Csy4* 단백질 (도 6C, 615) 의 복합체 (도 6C, 618) 로의 조립을 나타낸다. 이 예는 자리-특이적 DNA 절단을 촉매작용하는 Cas9 의 활성을 요약하는 Csy4* 단백질의 결합에 의해 추가로 안정화된 삼원 복합체로 α-나선형 로브를 동원하는 sn1-casRNA 및 촉매적 뉴클레아제 로브를 동원하는 sn2-casRNA 를 도시한다.
본 발명의 일곱번째 양상의 추가의 실시양태에서, 효과기 단백질은 적어도 하나의 징크 핑거 도메인을 포함한다.
제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 헤어핀을 포함할 수 있다. 도 7A 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 7A, 702 내지 703) 를 포함하는 sn1-casRNA 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 (도 7A, 706 내지 707) 를 포함하는 sn2-casRNA 를 도시한다. 도면은 그들 사이의 연합 및 수소 결합 염기 쌍의 형성 전의 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 를 보여준다. 도면은 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 내의 염기 사이에 수소 결합 염기 쌍형성에 의해 형성된 헤어핀 엘리먼트 (도 7A, 704) 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 내의 염기 사이에 수소 결합 염기 쌍형성에 의해 형성된 헤어핀 엘리먼트 (도 7A, 708) 를 보여준다. 도 7B 는 Cas9 와의 활성 복합체로 조립된 sn1-casRNA/sn2-casRNA 를 도시한다.
더욱이, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 G-쿼드라플렉스 (G-quadraplex) (또한 G4-DNA 로 호칭됨) 를 포함할 수 있다. G-쿼드라플렉스는 구아닌-풍부 서열에 의해 핵산에서 형성된 구조이다. 전형적으로, 4 개의 구아닌 염기가 Hoogsteen 수소 결합을 통해 연합하여 사각 평면 구조 (구아닌 테트라드) 를 형성한다. 둘 이상의 더 많은 구아닌 테트라드가 쌓일 때, 그들은 G-쿼드루플렉스 (G-quadruplex) 를 형성한다. G-쿼드루플렉스 구조의 형성을 위한 예시적 리피트는 (GGN)n 이며, 여기에서 n 은 전형적으로 4 이상이다. 예를 들어, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 내의 서열에 의해, 분자 내에서 하나 이상의 쿼드루플렉스 구조가 형성될 수 있다. G-쿼드루플렉스는 또한 둘 이상의 분자간 상호작용을 통해 형성될 수 있으며, 예를 들어, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 상의 2 개의 리피트는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 상의 2 개의 상이한 리피트와 Hoogsteen 수소 결합을 통해 쿼드루플렉스를 형성한다. 게다가, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 서열 사이에 하나 이상의 쿼드라플렉스 구조가 형성될 수 있다. 쿼드루플렉스 구조는 양이온, 예를 들어, 소듐 또는 포타슘의 존재에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 그러한 양이온은 통상적으로 테트라드의 각각의 쌍 사이에서 중심 채널을 점유한다. 일부 실시양태에서, G-쿼드루플렉스 형성은 G-쿼드루플렉스 구조에 결합할 수 있는 분자의 도입에 의해 유도 및/또는 안정화될 수 있다. 그러한 분자, 소 분자 및 단백질 둘다의 수는 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 모든 양상은 Cas9 단백질 (또는 필요에 따라 Cas9 단백질을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 Cas9 융합 (또는 필요에 따라 Cas9 융합을 인코딩하는 핵산 서열) 을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도 태그" 는 하나의 sn-casPN 의 또다른 sn-casPN 에 대한 및/또는 Cas9 단백질에 대한 결합 친화도를 증가시키는 하나 이상의 모이어티를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태는 하나 이상의 친화도 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열인 "친화도 서열" 을 사용한다. 제 1 sn-casPN 를 변형시키는데 사용될 수 있는 친화도 서열의 예는 MS2 결합 서열, U1A 결합 서열, 스템-루프 서열, eIF4A 결합 서열, 전사 활성화인자-유사 효과기 (TALE) 결합 서열 (Valton, J., 등, "Overcoming Transcription Activator-like Effector (TALE) DNA Binding Domain Sensitivity to Cytosine Methylation," J Biol Chem., 287(46), 38427-38432 (2012)), 또는 징크 핑거 도메인 결합 서열 (Font, J., 등, "Beyond DNA: zinc finger domains as RNA-binding modules," Methods Mol Biol., 649, 479-91 (2010); Isalan, M., 등, "A rapid, generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated by targeting the HIV-1 promoter," Nat Biotechnol., 19(7), 656-660 (2000)) 의 사용을 포함한다. 기타 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질 코딩 서열은 상응하는 친화도 태그: MS2 코딩 서열, U1A 코딩 서열, 스템-루프 결합 단백질 코딩 서열, eIF4A 코딩 서열, TALE 코딩 서열, 또는 징크 핑거 도메인 코딩 서열 각각을 포함하도록 변형될 수 있다.
매우 다양한 친화도 태그가 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985 (공개일 2014 년 10 월 23 일) 에 공개되어 있다.
본원에서 사용되는 용어들 "리간드" 및 "리간드-결합 모이어티" 는 하나의 sn-casPN 의 또다른 sn-casPN 에 대한 또는 Cas9 단백질에 대한 결합을 촉진하는 모이어티를 지칭한다. 리간드 및 리간드-결합 모이어티는 상응하는 친화도 태그이다.
리간드 모이어티의 사용의 하나의 실시양태는 리간드-결합 모이어티를 Cas9 단백질 내에 포함되게 만들거나 또는 리간드-결합 모이어티를 제 1 sn-casPN 에 부착하고 상이한 sn-casPN 의 폴리뉴클레오타이드 서열을 변형시켜 리간드를 함유하도록 하는 것이다. 본 발명의 실시에서 유용한 리간드/리간드-결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘/비오틴이다 (참고, 예를 들어, Livnah, O., 등, "Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex," PNAS, 90(11), 5076-5080 (1993); Airenne, K.J., 등, "Recombinant avidin and avidin-fusion proteins," Biomol. Eng., 16(1-4), 87-92 (1999)). 리간드-결합 모이어티를 갖는 Cas9 단백질의 하나의 예는 비오틴일화된 sn-casPN 에 결합하도록 디자인된 리간드 아비딘 또는 스트렙타비딘에 융합된 Cas9 단백질이며, 여기에서 sn-casPN 는 비오틴이 연합되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 비오틴은 아비딘 또는 스트렙타비딘 단백질에 대한 높은 친화도 및 높은 특이성 리간드이다. 아비딘 또는 스트렙타비딘 폴리펩티드 사슬을 Cas9 단백질에 융합시킴으로써, Cas9 단백질은 비오틴일화된 sn-casPN-비오틴에 대해 높은 친화도 및 특이성을 갖는다.
비오틴일화는 바람직하게는 sn-casPN 의 5' 또는 3' 말단에 아주 근접해 있다. sn-casPN 의 서열 및 비오틴의 위치는 sn-casPN-비오틴의 합성에 관한 상업적 제조자에게 제공된다. sn-casPNs 및 Cas9 단백질의 리간드-결합 변형된 복합체의 절단 백분율 및 특이성에 대한 변화가, 예를 들어, 실시예 3, 실시예 4, 및/또는 실시예 9 에 기재된 바와 같이 평가된다.
유사하게 사용될 수 있는 기타 리간드 및 리간드-결합 모이어티의 예는 하기 (리간드/리간드-결합 모이어티) 를 포함하나 그에 제한되지 않는다: 에스트라디올/에스트로겐 수용체 (참고, 예를 들어, Zuo, J., 등, "Technical advance: An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants," Plant J., 24(2), 265-73 (2000)), 라파마이신/FKBP12, 및 FK506/FKKBP (참고, 예를 들어, B. Setscrew, 등, "A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation," Nature Biotechnology, 33, 139-142 (2015); Chiu M.I., 등, "RAPT1, a mammalian homolog of yeast Tor, interacts with the FKBP12/rapamycin complex," PNAS, 91(26), 12574-78) (1994)).
리간드 및 리간드-결합 모이어티의 또다른 예는 Cas9 단백질의 선별된 영역에 대해 높은 친화도 및 결합 특이성을 갖는 sn-casPN 의 폴리뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 앱타머 또는 변형된 앱타머를 제공하는 것이다. 하나의 실시양태에서, 리간드-결합 모이어티는 앱타머를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다 (참고, 예를 들어, Navani, N.K., 등, "In vitro Selection of Protein-Binding DNA Aptamers as Ligands for Biosensing Applications," Biosensors and Biodetection, Methods in Molecular Biology, 504, 399-415 (2009); A. V. Kulbachinskiy, "Methods for Selection of Aptamers to Protein Targets," Biochemistry (Moscow), 72(13), 1505-18 (2007)). 앱타머는 상응하는 리간드 인지 능력을 보유하는 단일-가닥 기능적 핵산이다. 전형적으로, 앱타머는 sn-casPN 의 5' 또는 3' 말단에 위치한다. 본 발명의 실시에서 리간드의 하나의 예는 casPN/Cas9 복합체이다.
또다른 실시양태에서, 리간드-결합 모이어티는 변형된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기에서 변형된 폴리뉴클레오타이드의 염기의 수소 결합 면, 예컨대 피리미딘의 5-위치 및 퓨린의 8-위치로부터 떠나가게 배향되는 위치에 비선천 기능적 기가 도입된다 (느린 오프-레이트 변형된 앱타머 또는 SOMAmer (Slow Off-rate Modified Aptamers or SOMAmers), 참고, 예를 들어, Rohloff, J.C., 등, "Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents," Molecular Therapy Nucleic Acids, 3, e201 (2014)). Cas9 단백질에 대해 높은 특이성 및 친화도를 갖는 앱타머가 앱타머 라이브러리의 시험관내 선별 및 스크리닝에 의해 얻어질 수 있다.
또다른 실시양태에서, 앱타머-결합 영역을 Cas9 단백질 내로 도입함으로써 확립된 앱타머 결합 서열/앱타머가 사용된다. 예를 들어, 비오틴-결합 앱타머는 sn-casPN 내로 도입될 수 있고, Cas9 단백질은 선별적으로 비오틴일화되어 비오틴-결합 앱타머에 대한 상응하는 결합 자리를 형성할 수 있다.
Cas9 단백질 상의 선별된 리간드에 대한 높은 친화도 결합 자리의 생성은 본 명세서의 지도에 비추어 당업자에게 알려진 여러 단백질 조작 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 그러한 단백질 조작 방법의 예는, 합리적인 단백질 디자인, 라이브러리에 대한 상이한 선별 및 스크리닝 방법 (예를 들어 파지 표시) 을 사용하는 유도 진화, DNA 셔플링, 컴퓨터를 이용한 방법 (예를 들어 ROSETTA, www.rosettacommons.org/software), 또는 Cas9 내로의 알려진 높은 친화도 리간드의 도입을 포함한다. 이들 방법에 의해 수득되는 라이브러리는, 예를 들어, 파지 표시 어세이, 세포 생존 어세이, 또는 결합 어세이를 사용하여 스크리닝되어 Cas9 단백질 높은 친화도 결합체를 선별할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상에서, sn-casPNs 중 적어도 하나는 원형 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 또다른 양상에서, 적어도 하나의 선형 sn-casPN 는 5' 말단 서열 및/또는 3' 말단 서열을 포함하고, 적어도 하나의 5' 말단 서열 및/또는 3' 말단 서열은 5' 말단 서열 및/또는 3' 말단 서열과 연합된 엑소뉴클레아제 저항성 모이어티를 포함한다. 엑소뉴클레아제 저항성 모이어티의 예는, 말단 서열에 있는 헤어핀, 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드가 결합하는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 결합 서열, 및 연결기 역위를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 양상은 본 발명의 sn-casPNs 의 제조 방법에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 제조 방법은 sn-casPNs 중 하나 이상을 화학적으로 합성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, sn-casPNs 는 RNA 염기, DNA 염기, 또는 RNA 염기와 DNA 염기의 조합을 포함한다. 더욱이, 포스포디에스테르 백본 이외의 또는 그에 더한 핵염기 백본은, 예를 들어, 핵산, 펩티드-핵산, 트레오스 핵산, 또는 그들의 조합을 사용하여 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조 방법은 시험관내 전사에 의해 sn-casPNs 중 하나 이상을 생산하는 것을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 둘 이상의 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명의 발현 카세트는 적어도 본 발명의 sn-casPN 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 실시에서 유용한 발현 카세트는 Cas9 단백질 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 발현 카세트는 sn-casPN 코딩 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 sn-casPN 코딩 서열 및 동족 Cas9 단백질 코딩 서열을 포함한다. 발현 카세트는 전형적으로 하기 중 하나 이상에 관여되는 조절 서열을 포함한다: 전사의 조절, 전사후 조절, 및 번역의 조절. 발현 카세트는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 및 식물 세포를 포함하는 매우 다양한 유기체 내로 도입될 수 있다. 발현 카세트는 전형적으로 그들이 도입되고 있는 숙주 세포 또는 유기체(들)에 상응하는 기능적 조절 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상은 sn-casPN 및/또는 Cas9 단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열을 포함하는, 발현 벡터를 포함하는, 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 벡터는 플라스미드, 바이러스 (파지를 포함함), 및 통합가능한 DNA 분절 (예를 들어, 상동 재조합에 의해 숙주 게놈 내로 통합가능한 분절) 을 포함한다. 벡터는 숙주 게놈에 독립적으로 복제하고 기능하거나, 또는, 어떤 경우에는, 게놈 자체 내로 통합될 수 있다. 적합한 복제하는 벡터는 의도되는 발현 숙주 세포와 적합성인 종에서 유래하는 레플리콘 및 제어 서열을 함유할 것이다. 벡터는 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열의 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 벡터는 박테리아 벡터, 효모 벡터, 조류 벡터, 곤충 세포 벡터, 포유류 벡터, 및 바이러스 벡터를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
형질전환된 숙주 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축된 벡터로 형질전환된 또는 트랜스펙트된 세포이다.
발현 벡터의 구축을 위한 일반적 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 대부분의 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 상업적으로 입수가능하다. 적당한 벡터의 선별 및 그의 구축을 촉진하도록 디자인된 여러 상업적 소프트웨어 제품, 예컨대 박테리아 세포에서의 박테리아 형질전환 및 유전자 발현을 위한 박테리아 플라스미드, 효모 및 기타 진균에서의 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 효모 플라스미드, 조류 세포에서 사용하기 위한 조류 발현 시스템, 곤충 세포에서의 곤충 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 곤충 세포 벡터, 포유류 세포 또는 포유류에서의 포유류 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 포유류 벡터, 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터 (레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노바이러스 벡터를 포함함), 및 그러한 폴리뉴클레오타이드의 클로닝을 쉽게 가능하게 해주는 방법이 있다. SnapGene™ (GSL Biotech LLC, Chicago, Ill.; snapgene.com/resources/plasmid_files/your_time_is_valuable/) 은, 예를 들어, 개별 벡터 서열, 및 벡터 맵을 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 많은 벡터의 상업적 공급원의 광범위한 목록을 제공한다.
발현 벡터는 또한 단백질 태그 (예를 들어, 폴리-His 태그, 헤마글루티닌 태그, 형광 단백질 태그, 생물발광 태그) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 그러한 단백질 태그에 대한 코딩 서열은 Cas9 단백질 코딩 서열에 융합될 수 있거나 또는 발현 카세트에, 예를 들어, 표적화 벡터에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 유도가능한 프로모터, 억제가능한 프로모터, 또는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
본 발명의 양상은 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서의 sn-casPNs 및 Cas9 단백질의 발현을 위한 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템에 관한 것이다. 대안적으로, sn-casPNs 및 Cas9 단백질은, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 전사될 수 있다. Cas9 단백질의 번역은 또한 시험관내에서 수행될 수 있다.
sn-casPNs 를 포함하는 벡터 (임의로 Cas9 단백질 코딩 서열을 포함함) 는 진핵생물 내에 도입되고 증식될 수 있다. 원핵생물 벡터는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로 원핵생물 벡터는 표적 숙주 세포에 적합한 복제 원점 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이에서 유래하는 oriC, pBR322 에서 유래하는 pUC, 살모넬라에서 유래하는 pSC101, 15A 원점 (p15A 에서 유래함) 및 박테리아 인공 염색체) 을 포함한다. 벡터는 선별가능한 마커 (예를 들어, 암피실린, 클로람페니콜, 겐타마이신, 및 카나마이신에 대한 저항성을 인코딩하는 유전자) 를 포함할 수 있다. Zeocin™ (Life Technologies, Grand Island, NY) 은 박테리아, 진균 (효모를 포함함), 식물 및 포유류 세포주에서 선별로서 사용될 수 있다. 따라서, 다수의 유기체에서의 선별 작업을 위한 Zeocin 에 대한 오직 하나의 약물 저항성 유전자를 보유하는 벡터가 디자인될 수 있다. 진핵생물에서의 단백질의 발현에 유용한 프로모터, 예를 들어, T5, T7, 람노스 (유도가능한), 아라비노스 (유도가능한), 및 PhoA (유도가능한) 가 알려져 있다. 더욱이, T7 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제를 또한 인코딩하는 벡터에서 널리 사용된다. 원핵생물 벡터는 또한 여러가지 강도의 리보솜 결합 자리, 및 분비 신호 (예를 들어, mal, sec, tat, ompC, 및 pelB) 를 포함할 수 있다. 게다가, 벡터는 sn-casRNAs 의 발현을 위한 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함할 수 있다. 원핵생물 RNA 폴리머라제 전사 종결 서열이 또한 잘 알려져 있다 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 전사 종결 서열).
진핵생물의 안정적 형질전환을 위한 통합하는 벡터가 또한 당업계에 알려져 있다 (참고, 예를 들어, Heap, J. T., 등, "Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counter-selection marker," Nucleic Acids Res., 40(8), e59 (2012)).
진핵생물에서의 단백질의 발현은 전형적으로 융합 또는 비-융합 단백질 중 어느 하나의 발현을 지도하는 구성적 또는 유도가능한 프로모터를 함유하는 벡터로 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 에서 수행된다.
sn-casRNAs 및 Cas9 단백질의 발현에 적합한 매우 다양한 RNA 폴리머라제 프로모터가 진핵생물에서 입수가능하다 (참고, 예를 들어, Jiang, Y., 등, "Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system," Environ Microbiol., 81(7), 2506-14 (2015); Estrem, S.T., 등, "Bacterial promoter architecture: subsite structure of UP elements and interactions with the carboxy-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit," Genes Dev.,15, 13(16), 2134-47 (1999)).
융합 벡터는 그안에 인코딩된 단백질에 (예를 들어, 재조합 단백질의 아미노 말단에) 다수의 아미노산을 부가한다. 그러한 융합 벡터는 하나 이상의 목적에 도움이 된다. 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: (i) 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 것; (ii) 재조합 단백질의 가용성을 증가시키는 것; 및 (iii) 친화도 정제에서 리간드로서의 역할을 함으로써 재조합 단백질의 정제를 돕는 것. 융합-발현 벡터에서, 단백질가수분해 절단 자리가 때때로 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 접합부에 도입된다. 이는 융합 단백질의 정제 후에 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 해준다. 그러한 효소, 및 그들의 상응하는 단백질가수분해 절단 자리는 Factor Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 융합-발현 벡터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A, 각각을, 표적 재조합 단백질에 융합하는 pGEX, pMAL, 및 pRIT5. 적합한 유도가능한 비-융합 에스케리키아 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc 및 pET 11d 를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 벡터는 sn-casPNs 를 포함하는 효모 발현 벡터이다. 발현 벡터는 또한 Cas9 단백질에 관한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces Cerevisiae) 에서의 발현을 위한 벡터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: pYepSec1, pMFa, pJRY88, p예2, 및 picZ. 효모 세포에서의 유전자 발현을 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다 (참고, 예를 들어, Methods in Enzymology, Volume 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part A," Christine Guthrie and Gerald R. Fink (eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, Calif. (2004)). 전형적으로, 효모에서의 단백질 인코딩 유전자의 발현은 관심의 코딩 영역과 전사 종료자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 요구한다. 다양한 효모 프로모터가 사용되어 효모에서의 유전자의 발현을 위한 발현 카세트를 구축할 수 있다. 프로모터의 예는 하기 효모 단백질을 인코딩하는 유전자의 프로모터를 포함하나 그에 제한되지 않는다: 알코올 데하이드로게나아제 1 (ADH1) 또는 알코올 데하이드로게나아제 2 (ADH2), 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK), 트리오스 포스페이트 아이소머라아제 (TPI), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH; 또한 TDH3, 또는 트리오스 포스페이트 데하이드로게나아제로서 알려짐), 갈락토스-1-포스페이트 우리딜-트랜스퍼라제 (GAL7), UDP-갈락토스 에피머라아제 (GAL10), 사이토크롬 ci (CYCl), 및 산 포스파타아제 (PHO5). 하이브리드 프로모터, 예컨대 ADH2/GAPDH, CYC1/GAL10 및 ADH2/GAPDH 프로모터 (이는 낮은 세포-글루코스 농도, 예를 들어, 약 0.1 퍼센트 내지 약 0.2 퍼센트에서 유도됨) 가 또한 사용될 수 있다. 에스. 폼베 (S. pombe) 에서, 적합한 프로모터는 pTL2M 에서 티아민-억제된 nmtl 프로모터 및 구성적 사이토메갈로바이러스프로모터를 포함한다.
효모 RNA 폴리머라제 III 프로모터 (예를 들어, 5S, U6 또는 RPR1 유전자로부터의 프로모터) 뿐만 아니라 폴리머라제 III 종결 서열은 당해 기술분야에 알려져 있다 (참고, 예를 들어, www.yeastgenome.org; Harismendy, O., 등, "Genome-wide location of yeast RNA polymerase III transcription machinery," EMBO J., 22(18), 4738-4747 (2003)).
단백질 발현 프로모터는 유도가능하거나 또는 구성적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 프로모터는 발현의 부재시에 높은 카피수가 달성될 수 있는, 엄격하게 조절되는 유도가능한 프로모터이다. 예는 글루코스 배지에서 엄격히 억제되고 비-억제성 탄소원 예컨대 글리세롤 또는 락테이트에 의한 성장에 의해 이화대사산물 억제가 완화된 후에 갈락토스에 의해 고도로 유도되는 보통 분지 GAL1p 및 GAL10p 프로모터를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 폴리펩티드를 인코딩하는 개방 해독틀이 GAL1p 벡터 내로 삽입될 수 있다 (참고, 예를 들어, Cartwright, 등, "Use of β-lactamase as a secreted reporter of promoter function in yeast," Yeast, 10, 497 (1994); and Harley, 등, "Transmembrane Protein Insertion Orientation in Yeast Depends on the Charge Difference across Transmembrane Segments, Their Total Hydrophobicity, and Its Distribution," J. Biol. Chem., 273, 24963 (1998)). 사용될 수 있는 기타 벡터 및 프로모터는 균주 PAP1502 에서의 Yep URA3 leu2d 벡터 pPAP1488 에서의 하이브리드 GALl-CYCp 프로모터를 포함한다 (참고, 예를 들어, Pedersen, 등, "Expression in High Yield of Pig α1β1 Na,K-ATPase and Inactive Mutants D369N and D807N in Saccharomyces cerevisiae," J. Biol. Chem., 271, 2514-222 (1996)). 이러한 균주는 Trpl 좌위에서 통합된 플라스미드 pPAP1488 을 갖는다. 이는 GAL10 프로모터에 의해 추진되는 GAL4 유전자의 부가적 카피를 제공하고, GAL 발현이 유도될 때, 높은 수준의 Gal4p 양성 활성화인자가 생산된다.
이러한 벡터 시스템에서, 우라실의 부재 하의 성장은 2-마이크론 복제 기능에 의해 확인되는 15 내지 20 의 벡터 카피수를 초래한다. 결손 leu2d 대립유전자와 연합된 매우 약한 프로모터 때문에, 효모 세포를 류신을 결여하는 배지에서 배양함으로써, 벡터의 카피수는 적어도 10 배 만큼 추가로 증가될 수 있다. GAL1p-추진되는 발현에서의 비례적 증가는 통합된 PAP1488 플라스미드에 의한 균주 PAP1502 에서 제공되는 Gal4p 활성화인자의 높은 갈락토스-유도되는 수준을 요구한다. 이러한 플라스미드가 삽입되는 임의의 기타 ura3 leu2 GaI+ 사카로마이세스 세레비지애 균주는 PAP1502 대신 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 또다른 효모 프로모터는 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나아제 유전자 (GPD1) 의 프로모터이다. GPD1 프로모터를 사용하는 폴리펩티드의 발현은 발효 배지 중 높은 수준의 글루코스 또는 수크로스의 존재 (억제) 또는 부재 (억제해제) 에 의해 조절될 수 있다. 대안적으로, 비-억제성 탄소원, 예컨대 에탄올 또는 글리세롤이 발효 배지에 첨가될 수 있다 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,667,986).
플라스미드 카피수의 조절은 RNA 폴리머라제 III 프로모터로부터 발현되는 RNA 산물의 수준에 대한 일부 제어를 제공할 수 있다. 더욱이, RNA 폴리머라제 III 전사는 효모에서 조절될 수 있다 (Dingermann, T., 등, "RNA polymerase III catalysed transcription can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by the bacterial tetracycline repressor-operator system," EMBO J., 11(4), 1487-92 (1992)).
프로모터에 더하여, 또한 인핸서로 호칭되는, 여러 업스트림 활성화 서열 (UASs) 이 사용되어 폴리펩티드 발현을 향상시킬 수 있다. 효모에서의 발현을 위한 예시적 업스트림 활성화 서열은 이들 단백질을 인코딩하는 유전자의 UASs 를 포함한다: CYCl, ADH2, GALl, GAL7, GAL10, 및 ADH2. 효모에서의 발현을 위한 예시적 전사 종결 서열은 α-인자, CYCl, GAPDH, 및 PGK 유전자의 종결 서열을 포함한다. 하나의 또는 복수의 종결 서열이 사용될 수 있다.
효모 세포에서 발현되는 임의의 단백질 코딩 영역은 조작될 특이적 숙주 효모 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다.
적합한 프로모터, 종료자, 및 코딩 영역이 에스케리키아 콜라이-효모 셔틀 벡터 내로 클로닝되고 효모 세포 내로 형질전환될 수 있다. 이들 벡터는 효모 및 에스케리키아 콜라이 균주 둘다에서 균주 증식을 허용한다. 전형적으로, 벡터는 선별가능한 마커 및 각각의 숙주에서의 자율적 복제 또는 염색체 통합을 가능하게 해주는 서열을 함유한다. 효모에서 전형적으로 사용되는 플라스미드의 예는 셔틀 벡터 pRS423, pRS424, pRS425, 및 pRS426 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 이다. 이들 플라스미드는 효모 2 마이크론 복제 원점, 에스케리키아 콜라이 복제 원점 (예를 들어, pMB1), 및 선별가능한 마커를 함유한다.
실시예 15 는 sn-casPNs 를 사용하는 사카로마이세스 세레비지애에서의 게놈 조작의 예시를 제시한다. Cas9 벡터 및 2 개의 sn1-casRNA/sn2-casRNA 벡터 쌍이 사용되어 효모의 게놈을 변형시킨다. 이러한 프로토콜은 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 효모에서 표적화된 내인성 게놈 좌위에서 특이적 RNA-매개되는 엔도뉴클레아제 활성을 제공한다는 것을 확인해 주는 데이타를 제공한다. 구축물이 또한 실험에서 사용되어 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 효모에서 표적화된 내인성 게놈 좌위에서 특이적 RNA-매개되는 엔도뉴클레아제 활성을 제공하고 그러한 좌위에서 공여자 DNA 를 사용하여 상동 재조합 사건을 자극할 수 있다는 것을 확인해 준다. 적당한 스페이서 서열 및 공여자 올리고뉴클레오타이드의 선별에 의한 변형을 위해 사카로마이세스 세레비지애에서의 기타 염색체 좌위가 유사하게 표적화될 수 있다. 내인성 유전자의 파괴 없이 기능적 유전자가 사카로마이세스 세레비지애 게놈 내로 도입될 수 있다. 더욱이, 내인성 표적 유전자 내로의 선별가능한 마커의 도입이 사용되어 표적 유전자의 선별가능한 녹-아웃 돌연변이를 제공할 수 있다.
통합하는 벡터가 또한 효모의 안정적 형질전환을 위해 널리 입수가능하다 (Stearns T., 등, "Manipulating yeast genome using plasmid vectors," Methods Enzymol., 185, 280-97 (1990)).
조류 세포에서의 sn-casPNs 의 사용에 관해, RNA 폴리머라제 III 프로모터 (참고, 예를 들어, Dieci, G., 등, "Eukaryotic snoRNAs: A paradigm for gene expression flexibility," Genomics, 94(2), 83-88 (2009)) 를 포함하는 적합한 벡터 및 발현 제어 서열이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (참고, 예를 들어, Hallmann, A., "Algal Transgenics and Biotechnology," Transgenic Plant Journal, 1(1), 81-98 (2007); Oey, M., 등, "Gateway-Assisted Vector Construction to Facilitate Expression of Foreign Proteins in the Chloroplast of Single Celled Algae," DOI: 10.1371/journal.pone.0086841 (2013)). 더욱이, 조류 발현 시스템은 상업적으로 입수가능하다 (Algae Expression and Engineering Products, ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY). 발현 벡터는 Cas9 단백질에 관한 코딩 서열을 또한 포함할 수 있다.
곤충 또는 곤충 세포에서의 sn-casPNs 의 사용에 관해, 적합한 발현 제어 서열이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 서열이 구성적 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다. 적합한 강한 프로모터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: piO 를 위한 바큘로바이러스프로모터, 폴리헤드린 (polh), p 6.9, 캡시드, UAS (Gal4 결합 자리를 함유함), Ac5, 카텝신-유사 유전자, 봄빅스 모리 액틴 유전자 프로모터; 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) hsp70, 액틴, α-1-튜불린 또는 유비퀴틴 유전자 프로모터, RSV 또는 MMTV 프로모터, 코피아 프로모터, 집시 프로모터, 및 사이토메갈로바이러스 IE 유전자 프로모터. 사용될 수 있는 약한 프로모터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: iel, ie2, ieO, etl, 39K (aka pp31), 및 gp64 유전자를 위한 바큘로바이러스프로모터. 약한 프로모터로부터의 유전자 발현의 양을 증가시키는 것이 바람직한 경우에, 인핸서 엘리먼트, 예컨대 바큘로바이러스인핸서 엘리먼트, hr5 가 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 발현 벡터는 Cas9 단백질에 관한 코딩 서열을 또한 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 제어 서열은 기관- 또는 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 많은 그러한 발현 제어 서열. 예를 들어, 곤충 견사선에서 발현을 지시하는 적합한 프로모터는 후부 견사선에서 기관-특이적 발현을 지시하는 봄빅스 모리 p25 프로모터, 및 정중 견사선에서 유전자의 특이적 발현을 지시하는 실크 피브로인 중쇄 유전자 프로모터를 포함한다.
곤충 조절가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 유도가능한 프로모터 및/또는 인핸서 엘리먼트를 포함함) 의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 드로소필라 hsp70 프로모터, 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터, 엑디손-조절되는 프로모터, 및 기타 잘 알려진 유도가능한 시스템. Tet-조절가능한 분자 스위치가 임의의 구성적 프로모터와 함께 (예를 들어, CMV-IE 프로모터 또는 바큘로바이러스프로모터와 함께) 사용될 수 있다. 또다른 타입의 유도가능한 프로모터는 바큘로바이러스에 의한 감염 후에만 활성화되는 바큘로바이러스 후기 또는 극후기 프로모터이다.
곤충에서의 sn-casPNs 의 발현에 관해, RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예를 들어, U6 프로모터가 당해 기술분야에 알려져 있다. 곤충에서의 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 보존된 특색이 또한 알려져 있다 (참고, 예를 들어, Hernandez, G., "Insect small nuclear RNA gene promoters evolve rapidly yet retain conserved features involved in determining promoter activity and RNA polymerase specificity," Nucleic Acids Res., 35(1), 21-34 (2007)).
트랜스제닉 곤충의 생성에 적합한 구축물 또는 곤충의 감염을 위한 벡터의 디자인 및 제조 방법은 관습적이다. 곤충 세포주의 형질전환, 배양, 및 조작 방법이 또한 관습적이다. 곤충 세포주의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 안테라에아 (Antheraea) 세포, Tn-368, 드로소필라 S2 세포, High Five™ 세포 (Life Technologies, Grand Island, NY), Sf21 세포, 및 Sf9 세포. 곤충 세포주는, 예를 들어, American Type Culture Collection (Manassas, VA) 로부터 상업적으로 입수가능하다.
여러 가지 불멸화된 인시목 (lepidopteran) 곤충 세포주가 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질을 포함하는 벡터/구축물에 의한 감염에 적합하다. 본 발명의 벡터/구축물에 의한 감염에 적합한 불멸화된 인시목 곤충 세포주의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: Sf9 및 Tn 5B1-4.
또다른 실시양태에서, 벡터는 트랜스포손-기반 벡터이다. 하나의 트랜스포손-기반 벡터는 관심의 유전자가 그 사이에서 클로닝되는 적합한 트랜스포손의 역방위 말단 리피트를 추가로 포함하는 바이러스 벡터이다. 적합한 발현 제어 서열의 제어 하의, 하나 이상의 유전자는 트랜스포손-기반 벡터 내로 클로닝된다. 일부 시스템에서, 트랜스포손-기반 벡터는 그것의 자신의 트랜스포사제를 운반한다. 그러나, 전형적으로 트랜스포손-기반 벡터는 적합한 트랜스포사제를 인코딩하지 않는다. 이 경우에, 벡터는 트랜스포사제를 제공하는 헬퍼 바이러스 또는 플라스미드와 함께 곤충 (예를 들어, 곤충 유충) 내로 동시-감염된다. 재조합 벡터는, 일반적으로 헬퍼와 함께, 종래의 방법 (예를 들어, 미세주입) 에 의해 알 또는 조기 배아 내로 도입된다. 이식유전자는 곤충 게놈에서 트랜스포손 자리 (예를 들어, 트랜스포손의 역방위 말단 리피트에 상응하는 서열) 에 통합된다. 적합한 타입의 트랜스포손-기반 벡터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 미노스 (Minos), 마리너 (mariner), 헤르메스 (Hermes), 슬리핑 뷰티 (sleeping beauty), 및 piggyBac.
TTAA-특이적, 짧은 리피트 엘리먼트는 유사한 구조 및 운동 특성을 갖는 트랜스포손 (클래스 II 이동 엘리먼트) 의 군이다. piggyBac 벡터는 이들 삽입 엘리먼트 중 가장 광범위하게 연구되어 있다. piggyBac 는 2.4 kb 길이이고 13bp 완벽 역방위 리피트로 종결되며, 부가적 내부 19bp 역방위 리피트가 말단에 대해 비대칭적으로 위치해 있다. piggyBac 벡터는 그것의 자신의 운동을 촉진하는 trans-작용 트랜스포사제를 인코딩할 수 있다. 대안적으로, 트랜스포사제 인코딩 서열은 결실될 수 있고 이러한 기능은 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스에서 공급된다. 일부 piggyBac 벡터는 결실된 비-필수적 유전자를 가져서 큰 삽입물의 클로닝을 촉진한다. 15 kB 만큼 큰 삽입물이 특정 piggyBac 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 이는 대략 6 또는 7 개의 유전자와 그들의 발현 제어 서열의 삽입을 허용한다. 예를 들어, sn-casPNs 의 컬렉션이 함께 단일 트랜스포손 벡터를 통해 곤충 게놈에서의 단일 자리 내로 도입될 수 있다.
여러 piggyBac 벡터가 곤충 트랜스제네시스를 위해 개발되었다. 트랜스포손의 경계의 내부 및 외부에서 결실 돌연변이의 분석에 의해 2 가지 구축물이 개발되었다. 그러한 구축물을 사용하여, 벡터의 크기를 최소화함으로써 piggyBac 트랜스포사제에 의해 이동되는 유전 물질의 양을 증가시키는 것이 가능하다. 운동을 위한 최소 요건은 5' 및 3' 말단 리피트 도메인 및 수반되는 TTAA 표적 서열을 포함한다. 엘리먼트의 TTAA 표적 자리를 분리하는 최소 50 개의 염기가 전형적으로 효율적 동원을 위해 요구된다.
piggyBac 엘리먼트는 마커 유전자를 운반하면서 곤충 세포에서 이동할 수 있고, piggyBac 엘리먼트의 운동은 그것이 기원하는 종과 멀리 관련되는 인시목 종으로부터의 세포에서 일어날 수 있다. 예를 들어, piggyBac 는 드로소필라 멜라노가스터, 아나스트레파 서스페나 (Anastrepha suspena) (동양 초파리), 박트로세라 도르살리스 (Bactrocera dorsalis), 봄빅스 모리 (Bombyx mori), 펙티노포라 글로시피엘라 (Pectinophora glossypiella), 트리볼리움 카스텔라니 (Tribolium castellani), 및 여러 모기 종을 형질전환시키는 것으로 밝혀졌다. 적어도 3 가지 인시목 종, 펙티노포라 글로시피엘라 (P. gossypiella), 티. 니 (T. ni) 및 봄빅스 모리가 piggyBac 엘리먼트를 사용하여 성공적으로 형질전환되었다.
전형적으로, 트랜스포사제를 발현하는 헬퍼 바이러스 또는 플라스미드는 트랜스포손-기반 벡터로 동시-감염된다. 트랜스포사제의 발현은 시험되는 곤충 시스템에 관한 프로모터의 선택에 의해 결정된다. 인시목 형질전환에 유용한 프로모터-추진되는 헬퍼 구축물의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 드로소필라 hsp70, 바큘로바이러스 iel 프로모터, 및 드로소필라 Actin 5C 프로모터. 바큘로바이러스-기반 벡터의 사용에 대한 추가의 안내에 관해, 예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호 WO/2005/042753 (공개일 2005 년 5 월 12 일) 을 참고한다.
트랜스제닉 곤충의 생성 방법은 관습적이다. 예를 들어, 도입될 하나 이상의 유전자가 적합한 발현 제어 서열의 제어 하에 배치되고 벡터 (예를 들어, 표적 곤충에 대해 감염성이 아닌 약독화된 바큘로바이러스벡터 또는 비-허용 바이러스 벡터) 내로 클로닝된다. 곤충 내로 도입될 서열의 측면에 곤충으로부터의 게놈 서열이 있다. 구축물은 그 후 곤충 알 내로 도입된다 (예를 들어, 미세주입에 의해). 이식유전자는 그 후 측면에 있는 서열의 곤충 게놈에서의 상보적 서열 내로의 상동 재조합에 의해 통합된다.
배아 내로 구축물을 도입하여 트랜스제닉 곤충을 생성하는 방법 (예를 들어, 미세주입에 의해) 이 알려져 있다. 생존은 미세주입된 배아에서 전형적으로 높다 (~ 75%). 일반적으로, 전-배아원기 (pre-blastoderm) 알이 플라스미드 DNA 및/또는 재조합 바이러스의 파인 글라스 모세관 보유 용액으로 갇힌다. 바이러스-주입된 알로부터 부화된 G0 유충은 트랜스펙트된 유전자의 발현에 관해 스크리닝된다. 트랜스제닉 G1 곤충을 정상 곤충과 함께 번식시키는 것은 멘델 유전을 초래한다.
일단 이식유전자가 곤충 알 또는 조기 배아의 게놈 내로 안정적으로 통합되면, 종래의 방법이 사용되어 이식유전자가 모든 곤충 체 세포 및 생식 세포에 존재하는 트랜스제닉 곤충을 생성할 수 있다. 동형접합 트랜스제닉 곤충의 생산 방법 (예를 들어, 적합한 역교배를 사용하는) 은 관습적이다.
각각의 유전자에 관한 적당한 발현 제어 서열을 선택함으로써, sn-casPNs 및 Cas9 단백질 유전자의 게놈에 통합된 카피를 포함하는 복수의 트랜스제닉 곤충이 디자인되어, 관심의 유전자가 곤충 성장 동안 요망되는 시간에 적합한 수준으로 발현되도록 할 수 있다.
또다른 양상에서, 포유류 세포에서의 사용을 위해 sn-casPNs 는 포유류 벡터 내로 통합된다. 발현 벡터는 Cas9 단백질에 관한 코딩 서열을 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 sn-casPNs 와 함께 사용하기에 적합한 다수의 포유류 벡터는 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, Life Technologies, Grand Island, NY; NeoBiolab, Cambridge, MA; Promega, Madison, WI; DNA2.0, Menlo Park, CA; Addgene, Cambridge, MA 로부터).
본 발명의 sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 포유류 세포에서 발현시키기 위해 포유류 바이러스에서 유래하는 벡터가 사용될 수 있다. 이들은 바이러스 예컨대 아데노바이러스, 파포바이러스, 헤르페스바이러스, 폴리오마바이러스, 사이토메갈로바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40) 에서 유래하는 벡터를 포함한다 (참고, 예를 들어, Kaufman, R. J., "Overview of vector design for mammalian gene expression," Molecular Biotechnology, 16(2), 151-160 (2000); Cooray S., 등, "Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning," Methods Enzymol., 507, 29-57 (2012)). sn-casPNs/Cas9 성분에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 활성화인자 결합 서열, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 인지 서열, 프로모터, 억제인자 결합 서열, 스템-루프 구조, 번역 개시 서열, 번역 리더 서열, 전사 종결 서열, 번역 종결 서열, 프라이머 결합 자리 등을 포함할 수 있다. 흔히 사용되는 프로모터는 구성적 포유류 프로모터 CMV, EF1a, SV40, PGK1 (마우스 또는 인간), Ubc, CAG, CaMKIIa, 및 베타-Act, 및 기타 당업계에 알려져 있는 것들이다 (참고, 예를 들어, Khan, K. H., "Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications," Advanced Pharmaceutical Bulletin, 3(2), 257-263 (2013)). 더욱이, 본 발명의 sn-casPNs 의 발현을 위해, H1 및 U6 을 포함하는, 포유류 RNA 폴리머라제 III 프로모터가 사용된다.
아데노바이러스는 아데노바이러스 과의 일원이다. 아데노바이러스벡터는 아데노바이러스에서 유래한다. 아데노바이러스는 중간 크기의, 비-외피보유 정20면체 바이러스이다. 그것은 뉴클레오캡시드 및 클로닝 벡터로서 사용될 수 있는 이중-가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된다. 아데노바이러스전사 조절에 대한 광범위한 지식 및 데이타는 삽입된 유전자의 발현을 위해 변형된 아데노바이러스벡터의 조작을 선호했다. 이러한 목적을 위해, 조기 영역 E1 및 E3 이 결실되었으며, 그에 따라 바이러스를 복제할 능력이 없게 만들었으며, 이는 숙주 세포가 이러한 기능을 인 트랜스 (in trans) 제공할 것을 요구한다. 단백질 코딩 서열 (예를 들어, Cas9 단백질) 을 포함하는 발현 카세트가 전형적으로 결실된 E1 영역을 대체하도록 삽입된다. 카세트에서, 유전자는 부가적 주 (major) 후기 프로모터의 제어 하에 또는 외인성 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 또는 선별된 조절가능한 프로모터의 제어 하에 배치된다.
아데노바이러스의 게놈은, 그것이 관심의 유전자 산물을 인코딩하고 발현하는 한편 동시에 정상적 용해 사이클을 통해 복제하는 아데노바이러스의 능력을 불활성화시키도록 조작될 수 있다. 일부 그러한 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 균주 Ad 타입 5 dl324 또는 기타 아데노바이러스 균주 (예를 들어, Ad2, Ad3, 및 Ad7) 에서 유래하는 것들을 포함한다. 특정 상황에서, 재조합 아데노바이러스는, 그들이 비-분열 세포를 감염시킬 수 없고 그들이 상피 세포 및 여러 가지 기타 세포 유형을 감염시키는데 사용될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 게다가, 바이러스입자는 상대적으로 안정적이고, 그것은 정제 및 농축을 잘 받아들인다. 아데노바이러스 게놈의 외래 DNA 운반 능력은 대략 8 킬로베이스 까지이며, 이는 기타 유전자 전달 벡터와 비교할 때 크다. Thr 대 이중-가닥 DNA 아데노바이러스는 게놈 내로 통합되지 않아서, 그것의 용도를 일시적, 에피솜 발현으로 국한시킨다. 그것은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않기 때문에 (레트로바이러스 DNA 와는 다르게) 잠재적 문제 예컨대 삽입 돌연변이유발이 회피된다.
파보바이러스 과의 단일-가닥 DNA 일원인, 아데노-연합 바이러스 (AAV) 는 자연적으로 복제-결핍성 바이러스이다. 아데노바이러스와 같이, 그것은 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다; 그러나, 그것은 통합 적격 (competence) 의 이점을 갖는다. AAV 벡터는 바이러스 벡터 중에서 가장 빈번히 유전자 치료에 사용된다. AAV 의 12 개의 인간 혈청형 (AAV 혈청형 1 [AAV-1] 내지 AAV-12) 및 비-인간으로부터의 100 개 초과의 혈청형이 알려져 있다. 바이러스의 병원성, 바이러스의 지속성, 및 많은 입수가능한 혈청형의 결여를 포함하는, 다수의 인자가 유전자 치료 적용을 위한 전달 비히클로서의 AAV 의 잠재성을 증가시켰다. AAV 는 선형 단일-가닥 DNA 게놈을 포함하는 소 (25-nm), 비-외피보유 바이러스이다. AAV 에 의한 증식성 감염은 전형적으로 오직 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스의 존재 하에 일어난다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에, AAV (혈청형 2) 는 인간 염색체 19q13.4 (좌위 AAVS-1) 내로 통합함으로써 잠복성으로 될 수 있다 (참고, 예를 들어, Daya, S., 등, "Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors," Clinical Microbiology Reviews, 21(4), 583-593 (2008)).
백시니아 (vaccinia) 바이러스는 폭스바이러스 과의 일원이다. 백시니아 벡터는 백시니아 바이러스에서 유래한다. 백시니아 바이러스게놈은 거의 200,000bp 의 이중-가닥 DNA 로 구성된다. 그것은 숙주 세포의 세포질에서 복제한다. 백시니아 바이러스로 감염된 세포는 세포 당 5000 개 까지의 바이러스입자를 생산하여, 인코딩된 유전자 산물의 높은 수준의 발현을 초래한다. 백시니아 시스템은 매우 큰 규모의 배양물 (1000 L) 에서 효율적으로 사용되어 HIV-1 rgp160 및 인간 프로-트롬빈을 포함하는 여러 단백질을 생산해 왔다.
레트로바이러스는 레트로바이러스 과의 일원이다. 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스에서 유래한다. 레트로바이러스는 이중-가닥 DNA 중간체를 통해 복제하는 RNA 바이러스이다. 레트로바이러스를 벡터로서 사용하는 경우의 하나의 이점은 대부분의 레트로바이러스가 숙주를 죽이지 않으나, 대신에 자손 비리온을 무한한 기간에 걸쳐 생산한다는 점이다. 그러므로, 레트로바이러스 벡터는 (i) 안정적으로 형질전환된 세포주를 제조하는데 사용될 수 있고, (ii) 전복되어 이식유전자의 발현을 제어할 수 있는, 강한 프로모터에 의해 추진되는 바이러스 유전자 발현을 제공하고; (iii) 넓은 숙주 범위 (예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 의 암포트로픽 균주) 를 갖는 레트로바이러스에서 유래하는 것들을 포함하여 그에 따라 많은 세포 유형의 트랜스펙션을 허용한다.
레트로바이러스 벡터에 기반하는 외인성 유전자-발현 시스템은 또한 안정적인, 고-발현성 포유류 세포주를 생성하는 방법이다.
렌티바이러스는 레트로바이러스 과의 일원이다. 단일-가닥 RNA 바이러스인, 그것은 분열 및 비분열 세포 둘다를 감염시킬 수 있을 뿐만 아니라 게놈 내로의 통합을 통해 안정적 발현을 제공한다. 렌티바이러스의 안전성을 증가시키기 위해서, 바이러스 벡터를 생산하는데 필수적인 성분들은 복수의 플라스미드 전체에 걸쳐 쪼개져 있다. 트랜스퍼 벡터는 전형적으로 복제 부적격이고 부가적으로 3'LTR 에 결실을 함유할 수 있으며, 이는 바이러스를 통합 후에 "자가-불활성화" (SIN) 로 만든다. 패키징 및 외피 플라스미드가 전형적으로 트랜스퍼 벡터와의 조합으로 사용된다. 예를 들어, 패키징 플라스미드는 Gag, Pol, Rev, 및 Tat 유전자를 인코딩할 수 있다. 트랜스퍼 플라스미드는 바이러스 LTRs 및 psi 패키징 신호를 포함할 수 있다. 5'LTR 는 약한 프로모터이고 발현을 활성화시키는 Tat 의 존재를 요구하기 때문에, 통상적으로 하나 이상의 적합한 프로모터가 발현될 유전자 (예를 들어, sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질 코딩 서열) 에 작동가능하게 연결되어 있다. 외피 플라스미드는 외피 단백질 (통상적으로 그것의 넓은 감염성 범위 때문에 VSVG) 을 포함한다.
인간 면역결핍 바이러스 유형-1 (HIV-1) 에 기반하는 렌티바이러스 벡터는 세포 분열의 부재 하에 통합을 가능하게 해주는 부가적 액세서리 단백질을 갖는다. HIV-1 벡터는 다수의 안전성 우려를 다루도록 디자인되어 왔다. 이들은 복제-적격 바이러스의 생성을 초래하는 재조합 사건을 방지하도록, 바이러스 유전자의 인 트랜스 (in trans) 별도의 발현을 포함한다. 더욱이, 자가-불활성화 (SIN) 벡터의 개발은 이웃 유전자의 트랜스활성화의 잠재성을 감소시키고, 유전자 발현을 특정 세포 유형으로 표적화하는 조절 엘리먼트의 통합을 허용한다 (참고, 예를 들어, Cooray, S., 등, " Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning," Methods Enzymol., 507, 29-57 (2012)).
일부 실시양태에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 유형에서의 핵산의 발현을 우선적으로 지시할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 엘리먼트를 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴). 조직-특이적 조절 엘리먼트는 당해 기술분야에 알려져 있고, 알부민 프로모터, 림프양-특이적 프로모터, 뉴런-특이적 프로모터 (예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터), 췌장-특이적 프로모터, 유선-특이적 프로모터 (예를 들어, 유장 프로모터), 및 특히 T 세포 수용체 및 면역글로불린의 프로모터를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 발달적으로 조절되는 프로모터가 또한 망라된다 (예를 들어, 뮤린 혹스 프로모터 및 알파-태아단백질 프로모터).
포유류 세포에서 사용하기 위한 다수의 벡터가 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 하기와 같다: pcDNA3 (Life Technologies, Grand Island, NY); 주문제작가능한 발현 벡터, 일시적 벡터, 안정적 벡터, 및 렌티바이러스 벡터 (DNA 2.0, Menlo Park, CA); 및 pFN10A (ACT) Flexi® 벡터 (Promega, Madison, WI). 더욱이, 포유류 세포에서 사용하기 위해 하기 엘리먼트가 벡터 내로 통합될 수 있다: Cas9 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 폴리머라제 II 프로모터; sn-casRNAs 에 관한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 폴리머라제 III 프로모터; 선별가능한 마커 (예를 들어, G418, 겐타마이신, 카나마이신 및 Zeocin™ (Life Technologies, Grand Island, NY)). 핵 표적화 서열이 또한, 예를 들어, Cas9 단백질 코딩 서열에 부가될 수 있다.
조절 엘리먼트는 또한 시간-의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있으며, 이는 또한 조직 또는 세포-유형 특이적이거나 그렇지 않을 수 있다 (예를 들어, 세포-주기 의존적 또는 발달 시기-의존적 방식으로). 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 RNA 폴리머라제 III 프로모터 (예를 들어, sn-casPNs 코딩 서열에 작동가능하게 연결된), 하나 이상의 RNA 폴리머라제 II 프로모터 (예를 들어, Cas9 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된), 하나 이상의 RNA 폴리머라제 I 프로모터, 또는 그들의 조합을 포함한다. 위에서 언급된 바와 같이, 포유류 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: U6 및 H1 프로모터. RNA 폴리머라제 II 프로모터의 예는 위에서 논의되었다. RNA 폴리머라제 I 프로모터는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
수많은 포유류 세포주가 HEK 293 (인간 배아 신장) 및 CHO (중국 햄스터 난소) 를 포함하는 유전자 산물의 발현에 이용되어 왔다. 이들 세포주는 표준 방법에 의해 (예를 들어, 칼슘 포스페이트 또는 폴리에틸렌이민 (PEI), 또는 전기천공법을 사용하여) 트랜스펙션될 수 있다. 기타 전형적 포유류 세포주는 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는다: HeLa, U2OS, 549, HT1080, CAD, P19, NIH 3T3, L929, N2a, 인간 배아 신장 293 세포, MCF-7, Y79, SO-Rb50, Hep G2, DUKX-X11, J558L, 및 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포.
본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템은 제조를 위한 포유류 세포 바이오프로세스를 조작하는데 사용될 수 있다. CHO 세포 및 마우스 골수종 세포 (Sp2/0 및 NS0 세포를 포함함) 는 가장 널리 사용되는 숙주 포유류 세포이다. CHO 세포주 중 2 가지 유도체, CHO-K1 및 CHO pro-3 은, 오늘날 바이오프로세스에서 2 가지 가장 흔히 사용되는 세포주, DG44 및 DUKX-X11 (이들 세포주는 둘다 다이하이드로폴레이트리덕타아제 활성에서 결핍성으로 조작되었다) 을 만들어 냈다.
실시예 14 는 산업적 적용을 위한 CHO 세포의 변형을 기재한다. 이 실시예는 CHO 세포의 게놈을 변형시키기 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다. 또한 기재되는 것은 산업적 적용에서 미래의 사용 (예를 들어, 항체의 생산) 을 위한 sn-casPN 변형된 세포의 서열 검증 및 선별에 관한 실험이다. 방법은 sn-casPNs 에 관한 적당한 스페이서 서열의 선별에 의한 CHO 세포 내의 염색체 좌위의 변형을 제공한다. 선별은 특정 유전자 표적에 특이적이고 실시예에 개요서술된 절차는 기타 유전자 표적에 관해 당업자에 의해 쉽게 수정가능하다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 발현 벡터) 를 도입하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고 전형적으로 숙주 세포의 종류에 기초하여 선별된다. 그러한 방법은, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 트랜스펙션, 접합, 전기천공법, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌이민-매개되는 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개되는 트랜스펙션, 원형질체 융합, 리포펙션, 리포솜-매개되는 트랜스펙션, 입자 총 기술, 직접 미세주입, 및 나노입자-매개되는 전달을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서 sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 포함하는 복합체에 관한 모든 성분을 숙주 세포에서 발현시키는 것이 유용하다. 숙주 세포에서의 sn-casRNAs 및 Cas9 단백질을 인코딩하는 서열의 발현은 위에 기재된 바와 같은 발현 카세트의 사용을 통해 달성될 수 있다. 그러나, 표적 세포에서의 sn-casDNA 의 발현은 표준 클로닝 벡터의 사용으로 달성되지 않는다. 세포내에서 단일-가닥 DNA 분자를 생성할 수 있는, 단일-가닥 DNA 발현 벡터가 개발되었다 (Chen, Y., 등, "Intracellular production of DNA enzyme by a novel single-stranded DNA expression vector," Gene Ther., 10(20), 1776-80 (2013); Miyata S., 등, "In vivo production of a stable single-stranded cDNA in Saccharomyces cerevisiae by means of a bacterial retron," Proc Natl Acad Sci USA, 89, 5735-39 (1992); Mirochnitchenko, O., 등, "Production of single-stranded DNA in mammalian cells by means of a bacterial retron," J Biol Chem, 269, 2380-2383 (1994); Mao J., 등, "Gene regulation by antisense DNA produced in vivo," J Biol Chem, 270, 19684-87 (1995)). 전형적으로 이들 단일-가닥 DNA 발현 벡터는 선별된 단일-가닥 DNA 서열의 전사로 RNA 전사물을 형성하고, 이러한 RNA 전사물이 역전사효소 및 RNaseH 의 기질이 되어 숙주 세포에서 선별된 단일-가닥 DNA 를 생성하는 것에 의지한다. 예를 들어, 단일-가닥 DNA 발현 벡터의 성분은 종종, 역전사효소 코딩 서열 (예를 들어, 마우스 Moloney 백혈병 바이러스 역전사효소 유전자), 역전사효소 프라이머 결합 자리 (PBS) 뿐만 아니라 역전사 개시에 필수적인 프로모터의 영역, 관심의 코딩 서열 (예를 들어, sn-casDNA 코딩 서열), 역전사 반응의 종결을 위해 디자인된 스템 루프 구조, 및 숙주 세포에서의 사용에 적합한 RNA 전사 프로모터 (이전 성분을 포함하는 mRNA 주형을 제작하는데 사용됨) 를 포함한다. 세포에서 발현되는 역전사효소는 내인성 tRNApro 를 프라이머로서 사용한다. 역전사 후에, 내인성 RNase H 또는 역전사효소의 RNase H 활성 중 어느 하나에 의해 주형 mRNA 가 붕괴될 때 단일-가닥 DNA 가 방출된다 (Chen, Y., 등, "Expression of ssDNA in Mammalian Cells," BioTechniques, 34, 167-171 (2003)). 그러한 발현 벡터는 숙주 세포에서의 본 발명의 sn-casDNAs 의 발현에 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템을 사용하여 질환, 장애, 및 상태를 예방 또는 치료하는 유전자 치료 방법을 망라한다. 하나의 실시양태에서, 유전자 치료 방법은 유기체 또는 유기체 (예를 들어, 환자) 의 세포 내로의 핵산 서열을 도입을 사용하여 본 발명의 sn-casPNs 및 Cas9 단백질 성분의 발현을 달성하여 표적 기능의 변형을 제공한다. 예를 들어, 유기체로부터의 세포는, 생체외에서, (i) sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 발현하는 발현 카세트를 포함하는 벡터의 도입, (ii) sn-casPNs (예를 들어, sn-casPNs: DNA 폴리뉴클레오타이드, RNA 폴리뉴클레오타이드, RNA/DNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드, 대안적 백본에 연결된 핵염기, 또는 그들의 조합) 및 Cas9 단백질의 직접 도입, 또는 (iii) 이들 성분의 조합의 도입에 의해 조작될 수 있다. 조작된 세포는 치료될 유기체 (예를 들어, 환자) 에게 제공된다.
유전자 치료 및 치료를 위한 전달 기술의 예는 당해 기술분야에 알려져 있다 (참고, 예를 들어, Kay, M.A., "State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead," Nature Reviews Genetics, 12, 316-328 (2011); Wang, D., 등, "State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies," Discov Med., 18(97), 67-77 (2014); Wang, D., 등, "State-of-the-art human gene therapy: part II. Gene therapy strategies and clinical applications," Discov Med., 18(98), 151-61 (2014); "The Clinibook: Clinical Gene Transfer State of the Art," Odile Cohen-Haguenauer (Editor), EDP Sciences, ISBN-10: 2842541715, (2012)).
실시예 11 은 본 발명의 sn-casRNAs 를 사용하여 인간 게놈 DNA 에 존재하는 표적을 변형시키고 그 자리에서 절단 활성의 수준을 측정하는 것을 예시한다. 표적 자리가 첫째로 게놈 DNA 로부터 선별되고 그 후 그 선별된 서열을 표적화하도록 sn-casRNAs 가 디자인된다. 측정이 그 후 수행되어 일어난 표적 절단의 수준을 확인한다. 절단 백분율 데이타 및 특이성 데이타는 여러 가지 적용을 위한 선택이 기초하는 기준을 제공한다. 예를 들어, 일부 상황에서 sn-casRNA 의 활성은 가장 중요한 인자일 수 있다. 기타 상황에서, 절단 자리의 특이성은 절단 백분율보다 상대적으로 더욱 중요할 수 있다.
일부 양상에서, 본 발명의 성분은 나노규모 전달 시스템을 사용하여 전달된다. 전달될 성분은 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, sn-casPNs 및/또는 Cas 9 단백질을 포함하는 발현 카세트, sn-casPNs, Cas 9 단백질, 및 그들의 조합을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 본 발명의 성분은 나노입자로서 제형화될 수 있다. 상이한 크기, 모양, 및 재료의 모음으로 구성되고, 다양한 화학적 및 표면 특성을 갖는 나노입자의 대규모 라이브러리가 널리 입수가능하다. 생명공학 및 나노의학에서 특히 유용한 나노입자의 예는 하기를 포함한다: 풀러렌 (예를 들어, 버키볼 및 탄소 튜브); 액정; 리포솜; 실리카 및 규소-기반 나노입자 (예를 들어, 메소포러스 실리카 나노입자); 나노쉘; 나노라드; 금속 및 금속 옥사이드 나노입자 (예를 들어, 구형 핵산, 골드 코어를 둘러싸는 빽빽히 채워진 폴리뉴클레오타이드); 다가양이온; 및 양이온성 사이클로덱스트린.
나노입자 형성의 하나의 예는 나노입자로 자가-조립되어 콜로이드성 입자를 형성할 수 있는 양이온성 사이클로덱스트린의 사용을 포함한다 (Draz, M. S., 등, "Nanoparticle-Mediated Systemic Delivery of siRNA for Treatment of Cancers and Viral Infections," Theranostics, 4(9), 872-892 (2014)). 실시예 18 은 Cas9 단백질 및 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA 성분의 생산을 기재한다. 이들 sn-casRNAs 및 Cas9 단백질 성분은 리보핵단백질 복합체로 형성되고 SC12CDClick프로필아민 벡터와의 입자로서 제조된다. SC12CDClick프로필아민 벡터가 siRNA 와의 사용에 관해 기재되었다 (참고, 예를 들어, O'Mahony, A. M., 등, "Cationic and PEGylated Amphiphilic Cyclodextrins: Co-Formulation Opportunities for Neuronal Sirna Delivery," PLOSONE 8(6), e66413 (2013)). SC12CDClick프로필아민 벡터 sn-casRNAs/Cas9 단백질 입자의 특성분석은 실시예 18 에 기재되어 있다.
양이온성 사이클로덱스트린은 카르복시에틸-β-사이클로덱스트린, 양쪽친매성 사이클로덱스트린 (예를 들어, 헵타키스[2-(오메가-아미노-올리고(에틸렌 글리콜))-6-데옥시-6-헥사데실티오]-β-사이클로덱스트린 및 헵타키스[2-(오메가-아미노-올리고(에틸렌 글리콜))-6-데옥시-6-도데실티오]-β-사이클로덱스트린); 및 양이온성 다중-아암 (multi-armed) α-사이클로덱스트린 (α-CD):PEG 폴리로탁산을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
리포솜은 나노입자 형성의 또다른 예이다. sn-casPNs 또는 본 발명의 sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 포함하는 복합체는 리포솜에 포착 (entrap) 될 수 있다. sn-casPNs 와의 사용을 위한 리포솜은 전형적으로 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 지질의 예는 DODAC (디옥타데실디메틸암모늄 클로라이드), DOTMA (N-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄), DDAB (디도데실암모늄 브로마이드), DOTAP (1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모니오 프로판), DC-Chol (3-베타-N-(N',N',-디메틸-아미노에탄)-카르바몰 콜레스테롤), DMRIE (1,2-디미리스토일옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸 암모늄), DOSPA (2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미눔 트리플루오로아세테이트), DSTAP (1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판), DODAP (디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판), DOGS (디옥타데실아미도글리실카르복시스페르민) 등을 포함한다. 단일 유형의 양이온성 지질이 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 둘 이상의 유형의 양이온성 지질의 조합이 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 전형적으로 기타 지질 (예를 들어, 인지질 및 콜레스테롤) 과 조합되어 리포솜을 형성한다.
리포솜 형성을 위한 인지질의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 포스파티딜콜린; L-α-포스파티딜콜린 (난 포스파티딜콜린 (EPC), 또는 수소첨가된 콩 포스파티딜콜린 (HSPC)); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC); 포스파티딜세린 (PS); 포스파티딜이노시톨 (PI); 포스파티딜글리세롤 (PG); 포스파티딜에탄올아민 (PE); 디올레오일 포스파티딜글리세롤 (DOPG); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (또는 디올레오일 포스파티딜콜린) (DOPC); 디올레오일 포스파티딜세린 (DOPS); 1,2-딜레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트 (DOPA); 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (MSPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) (DPPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) (DMPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) (DSPG); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC); 디아실포스파티딜콜린; 디아실포스파티드산; N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민: N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민: N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민: 라이실포스파티딜글리세롤; 스핑고지질 (예를 들어, 스핑고미엘린); 및 그들의 혼합물.
여러 가지 스테롤 및 그의 유도체 (예를 들어, 콜레스테롤) 가 사용되어 리포솜을 안정화시킬 수 있다. 콜레스테롤은 특정 기관 또는 세포 유형에 의해 인지되도록 디자인된 리간드 예컨대 장쇄 지방산, 아미노산, 아미노산 유도체, 단백질, 당단백질, 올리고당, 호르몬, 변형된 단백질 등으로 화학적으로 변형될 수 있다. 그러한 변형된 콜레스테롤을 함유하는 리포솜은 특이적 기관 또는 세포 유형으로 표적화되기에 적합하다 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,544,545).
친수성 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 기타 폴리에톡실화된 중합체가 사용되어 리포솜을 보호하여 리포솜의 순환 반감기를 향상시킬 수 있다. 그러한 친수성 중합체는 리포솜과 비-공유적으로 연합되거나 또는 리포솜의 특정 성분에 접합 또는 공유적으로 연결될 수 있다 (예를 들어, PEG-유도체화된 지질; 예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (암모늄 염) (mPEG-DSPE), 및 스테아릴화된 PEG2000). 부가적 예시적 친수성 중합체는 폴리비닐 알코올, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리글리세롤, 폴리아졸린, 폴리아미노산 (PAAs), 및 그들의 혼합물을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
리포솜 조성물의 제조 방법은 박막 수화 방법에 의해 형성된 리포솜을 포함하며, 여기에서 재수화는 본 발명의 sn-casPN/Cas9 단백질 시스템을 포함하는 수성 용액을 사용한다 (참고, 예를 들어, 실시예 18).
실시예 18 은 양이온성 분자를 포함하는 비-바이러스 전달 벡터 내의 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체를 기재한다. 이 실시예에서, Cas9 mRNA 및 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA 성분의 생산이 기재되어 있다. 이들 성분은 그 후 리보핵단백질 복합체 뿐만 아니라 리보핵단백질/ SC12CDClick프로필아민 입자로 형성된다. 복합체 및 입자는 리포솜에 포착된다. 이들 리포솜은 생체내 활성을 포함하는 다수의 기준을 사용하여 특성분석된다. 이 실시예는 본 발명의 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체의 캡슐화에 최적인 리포솜 조성물을 그들의 이점 및 제한에 따라 선별하는 기준을 확립한다.
기타 실시양태에서에서, 리포솜은 지질 용액 주입 방법에 의해 형성되며, 여기에서 지질 용액은 본 발명의 sn-casPN/Cas9 단백질 시스템의 성분을 포함하는 수성 용액 내로 주입된다. 지질은 전형적으로 용매, 예를 들어, 유기 용매 (예컨대 알코올; 예를 들어, 에탄올) 에 용해되며, 그에 뒤이어 sn-casPN/Cas9 단백질 시스템을 포함하는 수성 용액 내에 주입되는 한편 교반된다. 수성 용액 내로 주입 후에 리포솜 소포가 형성되어, 소포의 내부 수성 구획(들)에 소량의 수성 용액을 포착한다. 이러한 방법의 하나의 이점은 그것이 규모확대가능하다는 점이다.
리포솜에 포착될 수 있는 본 발명의 sn-casPNs 를 포함하는 실시양태의 예는 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, sn-casPNs 및/또는 Cas 9 단백질을 포함하는 발현 카세트, sn-casPNs, sn-casPNs 와 Cas9 단백질의 복합체, 및 그들의 조합을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 양상은 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는다: sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트; sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터를 포함하는, 하나 이상의 벡터; sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트의 생산을 포함하는 발현 카세트의 제조 방법; sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터의 생산을 포함하는, 발현 벡터를 포함하는, 벡터의 제조 방법; sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 선별된 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트의 도입 방법; sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(들)을 선별된 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 발현 벡터를 포함하는, 벡터의 도입 방법; sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포 (재조합 세포); sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터를 포함하는, 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포 (재조합 세포); sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포 (재조합 세포); sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 산물을 발현하는 숙주 세포 (재조합 세포); 시험관내 전사에 의해 sn-casPNs 를 생산하고 및/또는 시험관내 번역에 의해 Cas9 단백질을 생산하는 것을 포함하는 sn-casPNs 의 제조 방법; 및 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 산물을 발현하는 숙주 세포 (재조합 세포) 로부터 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 단리하는 것을 포함하는 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질의 제조 방법.
본 발명의 또다른 양상은 비-인간 유전자 조작된 유기체의 생성 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이들 방법에서 sn-casPNs 및 Cas9 단백질의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트, 뿐만 아니라 표적화 벡터가 접합자 (zygote) 세포 내로 도입되어 선별된 폴리뉴클레오타이드 서열을 게놈 내의 DNA 표적 서열에 자리-특이적으로 도입하여 게놈 DNA 의 변형을 생성한다. 선별된 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적화 벡터에 존재한다. 게놈 DNA 의 변형은 전형적으로 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입, 폴리뉴클레오타이드 서열의 결실, 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이, 예를 들어, 유전자 수정, 유전자 교체, 유전자 태깅, 이식유전자 삽입, 유전자 파괴, 유전자 돌연변이, 유전자 조절 서열의 돌연변이 등을 포함한다. 비-인간 유전자 조작된 유기체의 생성 방법의 하나의 실시양태에서, 유기체는 마우스이다. 본 발명의 이러한 양상의 하나의 실시양태는 유전자 조작된 마우스의 생성이다.
트랜스제닉 마우스의 생성은 5 개의 기본 단계를 수반한다 (Cho, A., 등, "Generation of Transgenic Mice," Current Protocols in Cell Biology; Chapter.Unit-19.11 (2009)). 첫째, 트랜스제닉 구축물 (예를 들어, sn-casPNs 및 Cas9 단백질의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트, 뿐만 아니라 표적화 벡터) 을 정제. 둘째, 공여자 접합자를 수확. 셋째, 마우스 접합자 내로 트랜스제닉 구축물을 미세주입. 넷째, 가임신한 수령자 마우스 내로 미세주입된 접합자를 이식. 다섯째, 시조 마우스에서 확립된 게놈 DNA 의 유전형분석 및 변형의 분석을 수행.
실시예 17 은 비-인간 동물에서 게놈 변형을 생성하기 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다. 이 실시예는 2 개의 sn-casRNAs (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA; 참고, 예를 들어, 도 3B) 를 사용하는 트랜스제닉 마우스의 생성을 기재한다. Cas9 mRNA 및 sn1-casRNA/sn2-casRNA 의 생산이 기재되어 있다. mRNAs 는 단세포 배아 주입에 사용된다. 이 실시예는 이중-유전자 돌연변이체 마우스의 생성 뿐만 아니라 sn-casRNAs/Cas9 단백질 시스템의 생체내 오프-타겟 (off-target) 효과의 평가를 기재한다. 더욱이, 이 실시예는 공여자 올리고뉴클레오타이드와 sn-casRNAs 및 Cas9 단백질을 사용하는 생체내 유전자 복구의 평가를 포함한다. 이들 분석의 결과는 본원에 기재된 sn-casPNs 및 Cas9 단백질의 복합체를 사용하여 복수의 유전자에서 게놈 복구 변형이 있는 마우스가 생성될 수 있다는 것을 입증한다.
비-인간 유전자 조작된 유기체의 생성 방법의 또다른 실시양태에서, 유기체는 식물이다. 본원에 기재된 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템은 식물 세포에서 효율적, 비용-효과적 유전자 편집 및 조작을 실시하는데 사용된다. 일반적으로 비-특이적 위치에서 식물 게놈에 기능적 재조합 DNA 를 삽입하는 것이 바람직하다. 그러나, 특정 경우에, 자리-특이적 통합을 사용하여 게놈 내에 재조합 DNA 구축물을 도입하는 것이 유용할 수 있다. 그러한 식물 내로의 재조합 DNA 의 도입은 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템을 사용하여 촉진된다. 식물에서 사용하기 위한 재조합 벡터는 당해 기술분야에 알려져 있다. 벡터는, 예를 들어, 스카폴드 부착 영역 (SARs), 복제 원점, 및/또는 선별가능한 마커를 포함할 수 있다.
sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 사용되어 식물을 형질전환시키는 실시양태에서, 그 특별한 종의 식물에서 코딩 서열의 발현을 추진하는 능력을 입증하는 프로모터가 선별된다. 상이한 식물 종에서 효과적으로 사용될 수 있는 프로모터는 또한 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 유도가능한, 바이러스성, 합성, 또는 구성적 프로모터가 식물에서 폴리펩티드의 발현을 위해 사용될 수 있다. 공간적으로 조절되는, 시간적으로 조절되는, 및 공간-시간적으로 조절되는 프로모터가 또한 유용할 수 있다. 바람직한 프로모터의 목록은 FMV35S 프로모터, 향상된 CaMV35S 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 오파인 프로모터, 외떡잎식물 프로모터, 식물 유비퀴틴 프로모터 (Ubi), 벼 액틴 1 프로모터 (Act-1), 메이즈 알코올 데하이드로게나아제 1 프로모터 (Adh-1) 를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
재조합 구축물에서 사용할 조절 서열을 결정하는 인자는 요망되는 발현 수준, 및 세포- 또는 조직-우선적 발현, 유도가능성, 효율, 및 선별가능성을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 당업자는 코딩 서열에 상대적으로 조절 서열을 선별하고 배치함으로써 코딩 서열의 발현을 조정할 수 있다.
적합한 조절 서열은 특정 세포 유형에서 주로 전사 또는 오직 전사를 개시한다. 식물 게놈 DNA 내의 조절 서열을 동정 및 특성분석하는 방법이 알려져 있다. 미국 특허 출원 공개 번호 2011-0177228 (공개일 2011 년 7 월 21 일) 은 다수의 그러한 조절 서열을 기재한다.
뿌리-활성 프로모터는 뿌리 조직, 예를 들어, 뿌리 관 조직, 뿌리 표피, 또는 뿌리 내피에서 전사를 부여한다. 일부 뿌리-활성 프로모터는 뿌리-우선적 프로모터이고 지배적으로 뿌리 조직에서 전사를 부여한다. 뿌리-우선적 프로모터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: PT0625, PT0660, PT0683, PT0758, YP0128, 및 YP0275. 기타 뿌리-우선적 프로모터는 PT0613, PT0672, PT0688, 및 PT0837 을 포함하며, 이들은 주로 뿌리 조직에서 뿐만 아니라 어느 정도 밑씨 및/또는 종자에서 전사를 촉진한다. 기타 뿌리-우선적 프로모터는 CaMV 35S 프로모터 및 담배 RD2 프로모터의 뿌리-특이적 서브도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 성숙하는 배젖에서 특이적으로 활성인 프로모터가 사용될 수 있다. 성숙하는 배젖 프로모터로부터의 전사는 일반적으로 수정 후에 시작하고 주로 배젖 조직에서 종자 발달 동안 일어난다. 전사는 보통 세포화 시기 동안 최고이다. 발현 벡터 구축물에서 사용될 수 있는 성숙하는 배젖 프로모터의 예는 나핀 프로모터, 대두 트립신 저해인자 프로모터, 베타-콘글라이시닌 프로모터의 대두 a' 아단위, Arcelin-5 프로모터, ACP 프로모터, 파세올린 프로모터, 스테아로일-ACP 디새튜라아제 프로모터, 올레오신 프로모터, 제인 프로모터 (예를 들어, 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 및 27 kD 제인 프로모터), 벼 글루텔린-1 유전자로부터의 Osgt-1 프로모터, 베타-아밀라아제 프로모터, 및 보리 호르데인 프로모터를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 기타 성숙하는 배젖 프로모터는 PT0676, PT0708 및 YP0092 프로모터를 포함한다.
난소 조직에서 활성인 프로모터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 폴리갈락투로니다아제 프로모터, 바나나 TRX 프로모터, 멜론 액틴 프로모터, YP0396, 및 PT0623. 게다가, 주로 밑씨에서 활성인 프로모터의 예는 YP0007, YP0008, YP0028, YP0039, YP0092, YP0103, YP0111, YP0115, YP0119, YP0120, YP0121, 및 YP0374 를 포함한다.
배낭/조기 배젖에서 발현을 달성하기 위해서, 극핵 및/또는 중심 세포에서, 또는 극핵으로의 전구체에서 활성인, 그러나 난세포 또는 난세포로의 전구체에서는 활성이 아닌 조절 서열이 사용된다. 극핵으로부터 조기 배젖 발달로 이어지는 전사의 패턴은 또한 배낭/조기 배젖-우선적 프로모터와 함께 발견될 수 있다 (그렇지만 전사는 전형적으로 세포화 시기 동안 및 후에 후기 배젖 발달에서 유의하게 감소한다). 접합자 또는 발달하는 배에서의 발현은 전형적으로 배낭/조기 배젖 프로모터와 함께 존재하지 않는다. 그러한 프로모터의 예는 하기 유전자에서 유래하는 것들을 포함하나 그에 제한되지 않는다: 아라비돕시스 비비파로우스-1 (Arabidopsis viviparous-1), 아라비돕시스 atmycl, 아라비돕시스 FIE, 아라비돕시스 MEA, 아라비돕시스 FIS2, FIE 1.1, 메이즈 MAC1, 및 메이즈 Cat3. 부가적 아라비돕시스 프로모터는 YP0039, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0119, YP0137, DME, YP0285, 및 YP0212 를 포함한다. 벼 프로모터의 예는 p530c10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102, 및 pOsYp285 를 포함한다.
수정 후에 우선적으로 접합자 세포에서 전사를 추진하는 조절 서열은 배-우선적 발현을 제공할 수 있다. 배-우선적 프로모터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 보리 지질 전달 단백질 (Ltpl) 프로모터, YP0088, YP0097, YP0107, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0740, PT0838, 및 PT0879.
광합성 조직에서 활성인 프로모터는 녹색 조직 예컨대 잎 및 줄기에서 전사를 부여한다. 광합성 조직 프로모터의 예는 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제 (RbcS) 프로모터 예컨대 동부 낙엽송 (라릭스 라르시나 (Larix laricina)) 로부터의 RbcS 프로모터, 소나무 cab6 프로모터, 밀로부터의 Cab-1 프로모터, 시금치로부터의 CAB-1 프로모터, 벼로부터의 cab1R 프로모터, 옥수수로부터의 피루베이트 오르토포스페이트 디키나아제 (PPDK) 프로모터, 담배 Lhcbl*2 프로모터, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) SUC2 수크로스-H+ 심포터 프로모터, 시금치로부터의 틸라코이드 막 단백질 프로모터 (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, 및 rbcS), 및 PT0668, PT0886, YP0144, YP0380, 및 PT0585 프로모터를 포함한다.
관다발에서 높은 또는 우선적 활성을 갖는 프로모터의 예는 YP0022, YP0080, YP0087, YP0093, 및 YP0108 을 포함한다. 기타 관 조직-우선적 프로모터는 글라이신-풍부 세포 벽 단백질 GRP 1.8 프로모터, 코멜리나 (Commelina) 황반엽 바이러스 (CoYMV) 프로모터, 및 벼 퉁그로 바실리폼 바이러스 (rice tungro bacilliform virus) (RTBV) 프로모터를 포함한다.
유도가능한 프로모터는 외부 자극 예컨대 화학작용제 또는 환경 자극에 응답하여 전사를 부여한다. 예를 들어, 유도가능한 프로모터는 호르몬 예컨대 지베렐린산 또는 에틸렌에 응답하여, 또는 빛 또는 가뭄에 응답하여 전사를 부여할 수 있다. 가뭄-유도가능한 프로모터의 예는 PD0901, PD1367, PT0710, PT0848, YP0286, YP0337, YP0356, YP0374, YP0377, YP0380, YP0381, YP0384, YP0385, YP0388, YP0396, PT0633, 및 PT0688 을 포함한다. 질소-유도가능한 프로모터의 예는 PT0863, PT0829, PT0665, 및 PT0886 을 포함한다. 그늘-유도가능한 프로모터의 예는 PRO924 및 PT0678 을 포함한다. 염에 의해 유도되는 프로모터의 예는 rd29A 이다.
줄기 프로모터는 하나 이상의 스템 조직에 특이적 또는 줄기 및 기타 식물 부분에 특이적일 수 있다. 줄기 프로모터는, 예를 들어, 표피 및 피질, 관 형성층, 전형성층, 또는 물관부에서 높은 또는 우선적 활성을 가질 수 있다. 줄기 프로모터의 예는 하기를 포함한다: YP0018, CryIA(b), 및 CryIA(c).
프로모터의 기타 클래스의 예는 싹-우선적, 캘러스-우선적, 모용 세포-우선적, 공변 세포-우선적 예컨대 PT0678, 괴경-우선적, 유조직 세포-우선적, 및 노쇠-우선적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 우선적으로 생식 조직에서 발현을 추진할 수 있다.
5' 미번역 영역 (UTR) 이 벡터 구축물에 포함될 수 있다. 5' UTR 은 전사되지만, 번역되지 않고, 전사물의 시작 자리와 번역 개시 코돈 사이에 놓여 있고 +1 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 3' UTR 은 번역 종결 코돈과 전사물의 말단 사이에 위치할 수 있다. UTRs 은 mRNA 안정성의 증가 또는 번역의 약화와 같은 특별한 기능을 가질 수 있다. 3' UTRs 의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열 (예를 들어, 노팔린 신타아제 종결 서열).
부가적 조절 서열이 미국 특허 출원 공개 번호 2011-0177228 (공개일 2011 년 7 월 21 일) 에 기재되어 있다.
sn-casPNs 의 발현을 위해 식물 벡터에서 사용될 수 있는 RNA 폴리머라제 III 프로모터는 7SL, U6 (예를 들어, U6 snoRNA 프로모터) 및 U3 (예를 들어, U3 snoRNA 프로모터) 을 포함한다.
임의의 형질전환 실험에서, DNA 는 오직 작은 백분율의 표적 세포에만 도입된다. 선별가능한 마커를 인코딩하는 유전자는, 트랜스제닉 DNA 구축물을 수령하고 자신의 게놈 내로 통합시킬 때 안정적으로 형질전환되는 세포를 동정하는데 유용하고 효율적이다. 바람직한 마커 유전자는 선별제, 예컨대 항생제 또는 제초제에 대한 저항성을 부여하는 선별적 마커를 제공한다. 식물이 저항성을 가질 수 있는 임의의 제초제는 선별적 마커에 유용한 물질이다.
선별가능한 마커가 사용되어 본 발명의 sn-casPNs 및/또는 Cas9 단백질을 포함하는 벡터를 함유하는 식물 또는 식물 세포를 선별할 수 있다. 선별가능한 마커는 식물 세포에게 선별가능한 표현형을 제공할 수 있다. 예를 들어, 마커는 항생제 (예를 들어, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신) 에 대한, 제초제 (비알라포스 저항성에 관해 인코딩하는 막대 유전자; 글라이포세이트 저항성을 인코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타아제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라아제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타아제 유전자 (ALS)) 또는 메토트렉세이트 (메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자) 에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현된 폴리펩티드의 검출 또는 조작을 촉진하도록 디자인된 태그 (tag) 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열은 보통 인코딩된 폴리펩티드와의 융합물로서 발현될 수 있다. 태그 서열의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 루시퍼라제, 베타-글루쿠로니다아제 (GUS), 그린 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 폴리히스티딘, c-myc, 헤마글루티닌, 또는 에피토프 (예를 들어, FLAG® 에피토프, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 그러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단 중 어느 하나에서를 포함하는 폴리펩티드 내의 어디에나 삽입될 수 있다.
잠재적으로 형질전환된 세포는 선별제에 노출되고, 살아남은 세포 중에서 저항성-부여 유전자가 통합되었고 세포 생존에 충분한 수준으로 발현되는 세포가 존재할 것이다. 세포는 외인성 DNA 의 안정적 통합을 확인하기 위해 추가로 시험될 수 있다.
발현을 모니터링하는데 사용될 수 있는, 스크리닝가능한 마커가 또한 본 발명의 재조합 벡터 또는 구축물에 포함될 수 있다. 스크리닝가능한 마커는 그에 관한 다양한 발색성 기질이 알려져 있는 효소를 인코딩하는 베타-글루쿠로니다아제 또는 uidA 유전자 (GUS); 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색 색소) 의 생산을 조절하는 산물을 인코딩하는, R-좌위 유전자; 베타-락타마아제 유전자, 그에 관한 다양한 발색성 기질이 알려져 있는 효소 (예를 들어, PADAC, 발색성 세팔로스포린) 를 인코딩하는 유전자; 루시퍼라제 유전자; 발색성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나아제를 인코딩하는 xylE 유전자; β-아밀라아제 유전자; 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이는 결국 멜라닌으로 농축됨) 으로 산화시킬 수 있는 효소를 인코딩하는 티로시나아제; 및 발색성 β-갈락토스 기질을 촉매작용하는 β-갈락토시다제를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 기타 유전자 엘리먼트, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 및 미번역 리더 서열과 함께, 영구적으로 또는 일시적으로, 식물 세포 내로 도입될 수 있다.
Xing, H. L. 등, "A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in Plants", BMC Plant Biology, 14, 327 (2014) 은 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물에서의 CRISPR-Cas9 시스템의 발현을 위한 모듈 벡터를 기재했다. 2 가지 유형의 백본을 갖는 바이너리 (binary) 벡터가 이용된다; pGreen 벡터에 기반하는 첫째 (Hellens, R.P., 등, "pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for agrobacterium-mediated plant transformation," Plant Mol. Biol., 42, 819-832 (2000)); 및 pCAMBIA 벡터에 기반하는 둘째. pGreen-유사 벡터는 상대적으로 작아서, 그들이 표적 자리의 효과성을 시험하기 위해 원형질체에서 일시적 Cas9 및 sn-casRNA 발현에 사용되는 것을 허용한다. 벡터는 원형질체에서 검증 후에 트랜스제닉 식물을 생성하는데 직접 사용될 수 있다. 아그로박테리움 (Agrobacterium) 에서, pGreen-유사 벡터는 증식을 위해 그들의 pSa 원점에 의존하고, 그들은 복제 단백질 (RepA) 을 제공하기 위해 헬퍼 플라스미드를 요구한다. pSoup 헬퍼 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움이 pGreen-유사 벡터를 위한 숙주로서 사용될 수 있다.
pCAMBIA-유도되는 바이너리 벡터 중에서, 하이그로마이신-저항성 유전자를 선별가능한 마커로서 갖는 벡터는 pCAMBIA1300 으로부터 유도되었으며, 한편 카나마이신-저항성 유전자를 갖는 벡터는 pCAMBIA2300 으로부터 유도되었고, Basta-저항성 유전자를 갖는 벡터는 pCAMBIA3300 으로부터 유도되었다. 벡터 pCAMBIA1300/2300/3300 (Curtis, M.D., 등, "A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in plants," Plant Physiol., 133, 462-469 (2003); Lee, L. Y., Gelvin, S. B., "T-DNA binary vectors and systems," Plant Physiol., 146, 325-332 (2008)) 및 그들의 유도체 (게이트웨이-적합성 (Gateway-compatible) pMDC 시리즈를 포함함) 는 여러 가지 식물 종에 관해 및 이들 벡터에 기초하여 특이적으로 최적화된 여러 식물 형질전환 프로토콜과 함께 가장 널리 사용되는 바이너리 벡터 중의 일부이다.
그러한 바이너리 벡터 시스템은 본 발명의 발현 카세트와 함께 사용되어, 예를 들어, 멀티플렉스 게놈 편집을 위한 복수의 sn-casRNAs 를 제공할 수 있다. 예를 들어, 삼 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템에서, sn1-casRNA 및 sn2-casRNA DNA 코딩 서열은 제 1 벡터 내의 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 제어 하에 배치된다. 각각 상이한 DNA 표적화 서열을 포함하는 복수의 sn3-casRNA 는 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 제어 하에 배치되고 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 선별된 식물에서의 발현에 최적화된 Cas9 단백질 코딩 서열이 또한 벡터에 포함한다.
바람직한 식물 형질전환 벡터 중에는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 의 Ti 플라스미드에서 유래하는 것들이 있다 (Lee, L.Y., 등, "T-DNA Binary Vectors and Systems," Plant Physiol., 146(2), 325-332 (2008)). 또한 유용하고 당업계에 알려져 있는 것은 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes) 플라스미드이다. 식물에서의 식물 세포 형질전환 및 유전자 발현에 적당한 식물 플라스미드의 선별을 촉진하도록 디자인된 여러 상업적 소프트웨어 제품 및 그러한 폴리뉴클레오타이드의 클로닝을 쉽게 가능하게 하는 방법이 있다. SnapGene™ (GSL Biotech LLC, Chicago, Ill.; www.snapgene.com/resources/plasmid_files/your_time_is_valuable/) 은, 예를 들어, 개별 벡터 서열 및 벡터 맵을 포함하는 식물 벡터, 뿐만 아니라 많은 벡터의 상업적 공급원의 광범위한 목록을 제공한다.
재조합 DNA 구축물을 식물 게놈 내로 도입하여 식물을 형질전환시키는 방법 및 조성물은 당업계에 알려져 있는 임의의 다수의 방법을 포함한다. 형질전환된 식물을 구축하는 하나의 방법은 미세투사물 포격 (microprojectile bombardment) 이다. 아그로박테리움-매개되는 형질전환은 형질전환된 식물을 구축하는 또다른 방법이다. 대안적으로, 식물 세포를 감염시키고 감염된 식물 세포의 게놈 내로 이종 뉴클레오타이드 서열을 도입할 수 있는 기타 비-아그로박테리움 종 (예를 들어, 리조비움 (Rhizobium)) 및 기타 원핵생물 세포가 사용될 수 있다. 추가의 형질전환 방법은 을 포함한다 전기천공법, 리포솜, 꽃가루 또는 바이러스를 사용하는 형질전환, 유리 DNA 흡수를 증가시키는 화학물질, 또는 미세투사물 포격에 의한 유리 DNA 전달. 본 발명의 DNA 구축물은 당업자에게 잘 알려져 있는 종래의 형질전환 기술을 사용하여 식물 숙주의 게놈 내로 도입될 수 있다 (참고, 예를 들어, Narusaka, Y., 등, "Methods to Transfer Foreign Genes to Plants," "Transgenic Plants - Advances and Limitations," ISBN 978-953-51-0181-9, 7 March 2012).
전형적으로, 아그로박테리움 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 하나의 염색체 내에 삽입된 하나의 단순한 재조합 DNA 서열을 함유한다; 이는 트랜스제닉 사건으로 지칭된다. 그러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 외인성 서열 때문에 이형접합체이다. 단일 외인성 유전자 서열을 함유하는 독립적 분리계 트랜스제닉 식물을 자신, 예를 들어 F0 식물에게, 성 교배하여 (즉, 자가수정) F1 종자를 생성함으로써, 이식유전자에 대해 동형접합체인 트랜스제닉 식물을 형성하는 것이 가능하다. F1 종자를 발아시켜 형성된 식물은 이형접합성에 대해 시험될 수 있다. 전형적 접합성 어세이는 동형접합자와 이형접합자 사이를 구별하는 열 증폭 어세이 및 단일 뉴클레오타이드 다형성 어세이를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
식물의 직접 형질전환을 위해 재조합 DNA 구축물을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 재조합 DNA 구축물로 형질전환된 제 1 식물을 구축물을 결여하는 제 2 식물과 이종교배하여 트랜스제닉 식물이 형성될 수 있다. 예로서, 유전자 억제를 위해 재조합 DNA 구축물이 내부에 도입된 제 1 식물 라인을 제 2 식물 라인에 이종교배시켜 재조합 DNA 를 제 2 식물 라인 내로 유전자이입시켜, 그에 따라 트랜스제닉 식물 라인을 형성할 수 있다.
본 발명의 sn-casPNs 는 식물 육성자에게 돌연변이를 유도하는 새로운 도구를 제공한다. 따라서, 당업자는 게놈 공급원을 분석하고, 요망되는 형질 또는 특질을 갖는 관심의 유전자 (예를 들어, 제초제 저항성 유전자) 를 동정하고, 본 발명의 sn-casPNs 를 사용하여 그 유전자를 결여하는 식물 변종 내로 그 유전자를 도입할 수 있다; 이 결과는 이전의 돌연변이유발제를 사용하는 경우보다 더욱 정확하게 달성될 수 있으며, 그에 의해 식물 육종 프로그램을 가속화 및 향상시킨다.
실시예 16 은 제아 메이스 (Zea mays) 에서 삼-부분 (three-part) sn-casRNA 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템 (sn1-casRNA, sn-2-casRNA, 및 sn3-casRNA) 을 사용하여 식물에서의 게놈 변형을 생성하는 표적화되는 돌연변이유발을 기재한다. 3 가지 상이한 메이즈 게놈 표적 서열이 절단을 위해 표적화된다. sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 시스템의 발현 카세트를 포함하는 벡터가 기재되어 있다. 표적화되는 자리에서의 돌연변이의 생성이 사용되어 본원에 기재된 바와 같은 sn-casPNs 와 Cas9 단백질의 복합체가 메이즈 염색체 DNA 를 절단하고 게놈 돌연변이를 생성하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
본 발명의 또다른 양상은 sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 사용하는 DNA 의 변형 방법을 포함한다. 일반적으로, DNA 의 변형 방법은 표적 DNA 를 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체 ("표적화 복합체") 와 접촉시키는 것을 수반한다. 일부 경우에, Cas9 단백질 성분은 sn-casPNs 에서의 DNA 표적 결합 서열에 상보적인 이중-가닥 DNA 에서의 자리에서 이중-가닥 DNA 표적의 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 나타낸다. 뉴클레아제-활성 타입 II Cas9 단백질의 경우에, 표적 DNA 의 자리-특이적 절단은 (i) sn-casPNs 에서의 DNA 표적 결합 서열과 표적 DNA 사이의 염기-쌍 상보성, 및 (ii) 표적 DNA 에 존재하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 에 의해 결정되는 자리에서 일어난다. 뉴클레아제 활성은 표적 DNA 를 절단하여 이중-가닥 끊어짐을 야기한다. 세포에서 이중-가닥 끊어짐은 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는 세포 메카니즘으로 복구된다: 비-상동 말단 연결 (NHEJ), 및 상동성-지정 복구 (HDR).
NHEJ 에 의한 이중-가닥 끊어짐의 복구는 끊어진 말단들 서로와의 직접 결찰에 의해 일어난다. 전형적으로 이중-가닥 끊어짐의 자리에서 새로운 폴리뉴클레오타이드 서열이 삽입되지 않는다; 그러나, 이중-가닥 끊어짐의 자리에서 소수의 뉴클레오타이드가 무작위로 삽입 또는 결실될 때 삽입 또는 결실이 일어날 수 있다. 더욱이, 2 개의 상이한 DNA 표적 서열을 표적화하는 DNA 표적 결합 서열을 포함하는 2 개의 상이한 sn-casPNs 가 사용되어 개재 DNA 서열 (즉, 2 개의 DNA 표적 서열 사이의 DNA 서열) 의 결실을 제공할 수 있다. NHEJ 가 2 개의 절단된 DNA 표적 서열의 말단을 서로에게 다시 연결시킬 때, 개재 서열의 결실이 일어난다. 유사하게, NHEJ 가 사용되어, 예를 들어, 적합성인 오버행을 함유하는, 공여자 주형 DNA 를 사용하여 공여자 주형 DNA 또는 그의 부분을 직접 삽입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시양태는 표적 DNA 자리에 삽입 및/또는 결실을 도입하는 것에 의하는 DNA 의 변형 방법을 포함한다.
HDR 에 의한 이중-가닥 끊어짐의 복구는 절단된 표적 DNA 서열에 상동성을 갖는 공여자 폴리뉴클레오타이드 (공여자 주형 DNA) 또는 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 표적 DNA 서열에서의 이중-가닥 끊어짐의 복구에 공여자 주형 DNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 사용되어, DNA 의 이중-가닥 끊어짐의 자리에서 공여자 주형 DNA 또는 올리고뉴클레오타이드로부터의 유전 정보 (즉, 폴리뉴클레오타이드 서열) 의 전달을 초래한다. 따라서, 표적 DNA 자리에서 새로운 유전 정보 (즉, 폴리뉴클레오타이드 서열) 가 삽입 또는 복사될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상은 핵산 표적 결합 서열 (예를 들어, DNA) 의 변형 방법에 관한 것이며, 이 방법은 핵산 표적 결합 서열 (예를 들어, DNA 폴리뉴클레오타이드에서의 DNA 표적 서열) 을 본 발명의 sn-casPNs 를 포함하는 복합체 (예를 들어, sn1-casPN/sn2-casPN/Cas9 단백질 복합체 (예컨대 도 3B, sn1-casPN, 도 3B, 326, 및 sn2-casPN, 도 3B, 302; 또는 도 3A sn1-casPN, 도 3A, 301, sn2-casPN, 도 3a, 302, 및 sn3-casPN, 도 3A, 303 에서 보여짐)) 와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서 sn-casPNs/Cas9 단백질은 복합체를 형성하며, 이 복합체가 핵산 표적 서열 (예를 들어, DNA 표적 서열) 에 결합하고 그것을 잘라서 표적 핵산 (예를 들어, DNA 표적 서열을 포함하는 DNA 폴리뉴클레오타이드) 의 변형을 초래한다. 이러한 방법은 시험관내에서 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 이 방법은, 예를 들어, 유기체로부터 단리된 세포 (예를 들어, 진핵생물 세포) 에서 유래하는 DNA 를 변형시키는데 사용될 수 있다. 더욱이, 일부 실시양태에서 이 방법은 게놈 DNA 에서의 DNA 표적 서열을 공여자 DNA 주형과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서 게놈 DNA 는 그것이 DNA 표적 서열에서 통합되는 공여자 DNA 주형의 적어도 부분을 포함하도록 변형된다.
공여자 폴리뉴클레오타이드를 표적 핵산에서의 이중-가닥 끊어짐의 자리 가까이로 가져오는 방법은 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985, 공개일 2014 년 10 월 23 일 (참고, 예를 들어, ¶0121, ¶¶0851-0860) 에 기재되어 있다.
실시예 1 은 본 발명의 예시적 sn-casPN 성분의 생산을 기재한다. 실시예 2 는 Cas9 절단 어세이에서 사용하기 위한 이중-가닥 DNA 표적 영역의 생산을 기재한다. 실시예 3 및 실시예 7 은 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질의 복합체 (sn1-casRNA/sn2-casRNA) 를 사용하는 DNA 의 변형 방법의 시험관내 실시예를 제공한다. 실시예 6 은 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열에 상대적인 선별된 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 퍼센트 절단을 평가 및 비교하기 위한, 상이한 sn-casPNs (sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA) 를 사용하는 DNA 의 변형 방법의 시험관내 실시예를 제공한다. 더욱이, 실시예 4 에 제시된 데이타는 진핵생물 세포에서의 표적 변형의 검출을 위한 딥 시퀀싱 분석 (deep sequencing analysis) 을 위한 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체의 사용을 입증한다.
실시예 19 는 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체 (예를 들어, sn1-casPN/sn2-casPN/Cas9 단백질 복합체) 를 사용하는 진핵생물 세포에서의 표적 변형의 검출을 위한 딥 시퀀싱 분석의 사용을 기재한다. 이 실시예에서 2 개의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 가 사용되어 인간 세포에서의 6 개의 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열을 변형시켰다. 스트렙토코쿠스 써모필루스 CRISPR-Cas sgRNA/Cas9 복합체가 대조군으로서 사용되었다. sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas 단백질 핵단백질 복합체의 세포내 (in cell) 활성에 관한 표 22 에 제시된 데이타는 진핵생물 세포에서의 표적 변형의 검출을 위한 딥 시퀀싱 데이타의 분석에 의해 수득되었다. 데이타는 본원에 기재된 바와 같은 Cas 단백질/sn1-casPN/sn2-casPN 구축물은 세포에서의 표적 이중-가닥 핵산의 Cas-매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증한다. 이들 데이타는 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 게놈 좌위의 세포내 Cas-매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 지지한다.
실시예 20 은 선별된 핵산 표적 서열에 상대적인 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체의 시험관내 퍼센트 절단을 평가 및 비교하는 대안적 sn-casPN 디자인의 사용을 예시한다. 이 실시예에서, sn1-casRNA/sn2-casRNA 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 넥서스 엘리먼트는 다수의 상이한 위치에서 쪼개져 있다 (즉, 넥서스 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열의 백본이 끊어졌다). 표 25 는 대안적 sn1-casRNA/sn2-casRNA 디자인을 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시하며, 여기에서 각각의 sn1-casRNA/sn2-casRNA 에서의 넥서스 스플릿은 넥서스 엘리먼트에서의 상이한 위치에 있다. 데이타는 넥서스 엘리먼트의 백본에서 상이한 위치에서 끊어짐이 있는 sn-casPNs 는 핵산 표적 서열의 시험관내 Cas9 단백질 매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증한다.
본 발명의 일부 방법에서, 세포는 활성 RuvC 및 HNH 뉴클레아제 도메인을 포함하는 sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현은 하나 이상의 유도가능한 프로모터의 제어 하여 배치된다. sn-casPNs 및 Cas9 단백질의 발현을 유도한 후에, sn-casPN 의 DNA 결합 서열이, 예를 들어, 유전자의 프로모터에서의, DNA 표적에 상보적일 때, 유전자로부터의 발현은 멈춘다 (sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체에 의한 프로모터 서열의 절단의 결과로서). 벡터, 또는 그들의 조합에 존재하는 sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 세포 게놈에 통합될 수 있다.
본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체를 사용하는 표적 DNA 의 변형 방법에서, NHEJ 및/또는 HDR 에 의한 이중-가닥 끊어짐의 복구는, 예를 들어, 유전자 수정, 유전자 교체, 유전자 태깅, 유전자 파괴, 유전자 돌연변이, 이식유전자 삽입, 또는 뉴클레오타이드 결실을 초래할 수 있다. 공여자 주형 DNA 와의 조합으로 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체를 사용하는 표적 DNA 의 변형 방법이 사용되어 DNA 표적 서열에서 폴리뉴클레오타이드 서열을 삽입 또는 교체하거나, 예를 들어, 단백질 또는 기능적 RNA (예를 들어, siRNA) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하거나, 단백질 태그를 도입하거나, 유전자의 조절 서열을 변형시키거나, 또는 유전자에 조절 서열 (예를 들어 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 서열, 시작 코돈, 종결 코돈, 국소화 신호, 또는 폴리아데닐화 신호) 을 도입하거나, 핵산 서열을 변형 (예를 들어, 돌연변이를 도입) 시키는 등을 할 수 있다.
본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템의 일부 실시양태에서, 돌연변이된 형태의 Cas9 단백질이 사용된다. 변형된 버전의 Cas9 단백질은 단일 불활성 촉매적 도메인 (즉, 불활성 RuvC 또는 불활성 HNH) 을 함유할 수 있다. 그러한 변형된 Cas9 단백질은 표적 DNA 의 오직 하나의 가닥을 절단하여 그에 따라 단일-가닥 끊어짐을 야기한다. 단일 불활성 촉매적 도메인을 갖는 변형된 Cas9 단백질은 sn-casPN-부여되는 특이성에 기초하여 DNA 에 결합할 수 있다; 그러나, 그것은 오직 이중-가닥 DNA 가닥 중 하나만 자를 것이다. 예로서, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 단백질에서 RuvC 도메인은 D10A 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있고, HNH 도메인은 H840A 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다. 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체에서 단일 불활성 촉매적 도메인을 갖는 변형된 Cas9 단백질을 사용할 때, NHEJ 가 단일-가닥 끊어짐 자리에서 일어날 가능성은 더 적다.
기타 변형된 버전의 Cas9 단백질에서 양쪽 촉매적 도메인이 불활성이다 (즉, 불활성 RuvC 및 불활성 HNH; "dCas"). 그러한 dCas9 단백질은 실질적 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다; 그러나, 그들은 sn-casPN-부여되는 특이성에 기초하여 DNA 에 결합할 수 있다. 예로서, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 단백질에서 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이는 실질적 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 dCas 9 단백질을 초래한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체를 사용하는 시험관내 또는 생체내 전사 조정 방법을 포함한다. 하나의 실시양태에서, sn-casPN 가 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체의 DNA 표적 결합을 유전자의 프로모터 영역으로 지향시킬 때, sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체는 전사를 간섭함으로써 유전자 발현을 억제할 수 있다. 전사를 감소시키기 위한 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체의 사용은 또한 dCas9 단백질이 표적 유전자의 하향 조절자 (예를 들어, 억제인자 폴리펩티드) 에 융합되어 있는 복합체를 포함한다. 예를 들어, 유전자의 발현은 억제인자 폴리펩티드가 결합될 수 있는 조절 서열의 제어 하에 있다. sn-casPN 는 sn-casPNs/Cas9 단백질-억제인자 단백질 복합체의 DNA 표적 결합을 조절 서열을 인코딩하는 또는 조절 서열에 인접하는 DNA 서열로 지향시킬 수 있으며, 그에 따라 sn-casPNs/Cas9 단백질-억제인자 단백질 복합체의 결합은 억제인자 단백질이 조절 서열과 작동가능하게 접촉하게 된다. 이는 표적 유전자의 발현의 억제를 초래한다. 유사하게, dCas9 가 활성화인자 폴리펩티드에 융합되어, 활성화인자 폴리펩티드가 결합할 수 있는 조절 서열의 제어 하에 있는 유전자의 발현을 활성화 또는 증가시킨다.
하나의 양상에서 본 발명은 전사 조절 엘리먼트를 포함하는 유전자의 발현의 조정 방법에 관한 것이며, 이 방법은 유전자 내의 DNA 표적 서열을 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기에서 sn-casPNs 및 Cas9 단백질은 복합체를 형성하며, 이 복합체가 DNA 표적 서열에 결합하여, 유전자의 발현의 조정을 초래한다. 하나의 실시양태에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제-결핍성인 Cas9 이다. 기타 실시양태에서에서, sn-casPNs/Cas9 복합체는 융합 단백질을 추가로 포함한다.
실시예 13 은 인간 세포에서 내인성 유전자의 억제 또는 활성화를 위한 본 발명의 sn-casPNs 의 사용을 기재한다. 돌연변이 D10A 및 H840A 를 갖는 뉴클레아제 결핍성 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (dCas9) 가 사용된다. sn1-casRNA-CD71 서열은 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체를 트랜스페린 수용체 CD71 의 업스트림 미번역 영역으로 지향시키는 20 개 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함한다. dCas9-VP64 트랜스펙트된 샘플에서 CD71 발현의 활성화는 FACS 소팅에 의해 검출되는 HeLa 세포의 비-트랜스펙트된 대조군 집단의 측정된 형광과 비교되는 검출된 형광의 증가에 의해 측정된다. dCas9-KRAB 트랜스펙트된 샘플에서 CD71 발현의 억제는 FACS 소팅에 의해 검출되는 HeLa 세포의 비-트랜스펙트된 대조군 집단의 측정된 형광과 비교되는 검출된 형광의 감소에 의해 측정된다. 이러한 절차는 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템이 내인성 유전자의 활성화 또는 억제에서 사용될 수 있다는 것을 확인해주는 데이타를 제공한다.
일부 실시양태에서, 비-선천 서열은 융합 단백질에 새로운 기능을 부여할 수 있다. Cas9 단백질 및 기타 조절 또는 기능적 도메인을 포함하는 융합 단백질의 예는 뉴클레아제, 트랜스포사제, 메틸라아제, 전사 인자 억제인자 또는 활성화인자 도메인 (예를 들어, 예컨대 KRAB 및 VP16), 공-억제인자 및 공-활성화인자 도메인, DNA 메틸 트랜스퍼라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라아제, 및 DNA 절단 도메인 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 FokI 로부터의 절단 도메인) 을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 추가의 예는 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는다: 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라아제 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타아제 활성, 알킬화 활성, 탈푸린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이합체 형성 활성, 인테그라아제 활성, 트랜스포사제 활성, 레콤비아나제 활성, 폴리머라제 활성, 리가아제 활성, 헬리카제 활성, 포토리아제 활성, 글리코실라아제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라아제 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모화 (sumoylating) 활성, 탈수모화 (desumoylating) 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 리모델링 활성, 프로테아제 활성, 산화환원효소 활성, 트랜스퍼라제 활성, 가수분해효소 활성, 리아제 활성, 아이소머라아제 활성, 신타아제 활성, 신테타아제 활성, 탈미리스토일화 활성, 및 그들의 임의의 조합.
또다른 양상에서, 본 발명의 sn-casPNs 는 고처리율 기능적 게놈 스크리닝 방법에서 사용된다. 정방향 유전자 스크린은 유전자 엘리먼트의 발견 및 기능적 주석달기에 강력한 도구이다 (참고, 예를 들어, Gilbert, 등, "CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes," Cell 18, 154(2), 442-51 (2013)). sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체는 비편파, 표현형 스크리닝을 위한 sn-casPNs 의 게놈-규모 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다. 게놈-규모 스크리닝을 위한 접근법은 게놈 좌위를 불활성화시키는 녹아웃 접근법 및 전사 활성을 조정하는 접근법을 포함한다. 녹아웃 스크리닝에서, sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체에 의해 매개되는 기능 돌연변이의 상실은 이중-가닥 끊어짐 유도 및 NHEJ-매개되는 복구에 의해 생성된다. 녹아웃 스크린은 필수적 유전자 기능, 예를 들어, 약물 및 독소 민감도와 관련된 유전자 기능을 동정하는데 유용하다. 그러한 기능적 게놈 스크리닝의 하나의 예가 실시예 12 에 제시되어 있다. 이 실시예에서, 이-부분 sn-casRNA (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템이 사용되어 sn1-casRNAs 의 렌티바이러스 라이브러리를 생성한다. 라이브러리는 약물 치료에 대한 저항성에서 중요한 후보 유전자를 동정하는 녹아웃 방법에서 사용된다. 이러한 절차는 본 발명의 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체가 유전자-기능을 게놈-와이드 규모로 조사하는 기능적 스크리닝에서 사용될 수 있다는 것을 확인해주는 데이타를 제공한다.
본 발명의 또다른 방법은 게놈 DNA (gDNA) 의 영역을 단리 또는 정제하기 위한 sn-casPNs/dCas 단백질 시스템의 사용이다. 그 방법의 실시양태에서, dCas9 단백질은 에피토프 (예를 들어, FLAG® 에피토프, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 에 융합되고 sn-casPN 는 sn-casPNs/dCas9 단백질-에피토프 복합체의 DNA 표적 결합을 단리 또는 정제될 게놈 DNA 의 영역 내의 DNA 서열로 지향시킨다. 친화도제가 사용되어 에피토프 및 sn-casPNs/dCas9 단백질-에피토프 복합체에 결합된 연합된 gDNA 를 결합시킨다.
추가의 양상에서, 본 발명은 sn-casPNs 또는 sn-casPNs 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 지침을 포함하는 키트를 포함한다. 키트는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: sn-casPNs 및 동족 Cas9 단백질; sn-casPNs 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 동족 단백질; sn-casPNs 를 포함하는 재조합 세포; sn-casPNs 및 동족 단백질을 포함하는 재조합 세포; 등. 본 발명의 임의의 키트는 기타 성분 예컨대 용액, 완충액, 기질, 세포, 지침, 벡터 (예를 들어, 표적화 벡터) 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열에 상대적인 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체의 생체내 퍼센트 절단을 평가 및 비교하는 T7E1 어세이의 사용 (실시예 9) 을 포함한다.
본 발명의 양상은 또한 본 발명의 sn-casPNs 및 방법에서 사용하기 위해 변형될 수 있는, 트랜스-활성화 CRISPR RNA 의 동정 및 스크리닝 방법 (실시예 8) 을 포함한다. 더욱이, 본 발명은, 예를 들어, 당업계에 알려진 또는 실시예 8 에 기재된 방법에 의해 동정된 crRNA/tracrRNAs 에 기초하는, tracrRNAs 에서의 스플릿 넥서스 변형의 생성 및 시험 방법 (실시예 10) 을 포함한다.
본 발명은 또한 sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체, 또는 sn-casPNs 및 Cas9 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 약학적 조성물, 예를 들어, 위에 기재된 sn-casPNs 를 포함하는 나노입자 조성물은 추가로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 임의의 본원에 기재된 sn-casPNs 와 기타 성분, 예를 들어, 부형제 (예를 들어, 캐리어, 안정화제, 희석제, 현탁제, 증점제, 및 기타 본원에 기재된 것들) 의 조합을 포함할 수 있다. 조성물은, 예를 들어, sn-casPNs/Cas9 단백질 복합체의 대상체에 대한 투여를 촉진한다. 약학적 조성물은 치료 유효량으로 다양한 형태 및, 예를 들어, 정맥내, 피하, 또는 흡입을 포함하는, 경로에 의해 투여될 수 있다.
sn-casPNs 를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법은 그들을 하나 이상의 불활성, 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제형화하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액일 수 있다. 본 발명의 실시에서 유용한 전형적 부형제는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 캐리어 또는 비히클 (예를 들어, 물 또는 완충되는 수성 용액); 완충액 시스템 (예를 들어, 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 보레이트, 타르트레이트, 히스티딘, 숙시네이트, 및 그들의 혼합물을 포함함); 항산화제 (예를 들어, 소듐 티오술페이트, 에틸렌디아민테트라아세트산, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화된 히드록사니솔, 부틸화된 히드록실톨루엔, 및 프로필 갈레이트, 및 그들의 혼합물); 등장성 유지제 (예를 들어, 소듐 클로라이드, 당, 폴리올 (당 알코올), 붕산, 소듐 타르트레이트, 프로필렌 글리콜, 및 그들의 혼합물); 하나 이상의 당 (예를 들어, 트레할로스, 말토스, 수크로스, 락토스, 만노스, 덱스트로스, 프룩토스 등) 또는 당 알코올 (예를 들어, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 만니톨, 글리세롤 등), 알코올 (예를 들어, 에탄올, t-부탄올 등); 및 보존제 (알코올, 벤조산, 살리실산, 페놀 및 그것의 유도체 (예를 들어, 크레솔, p-크레솔, m-크레솔 및 o-크레솔), 세트리미드, BHA (부틸화된 히드록시톨루엔), BHA (부틸화된 히드록시아니솔); 및 그들의 혼합물).
본 발명의 sn-casPNs 의 이점은 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 다중부분 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템의 사용은 생체내 시스템에 관한 활성의 개선된 제어를 허용한다. sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템의 모든 부분의 발현 제어는, 예를 들어, sgRNA/Cas9 단백질 시스템에 상대적인, 기능적 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템을 구성하는데 필요한 특이적 성분의 조립에 대한 조절의 추가의 층을 제공한다.
본 발명의 sn-casPNs 의 스플릿-넥서스 엘리먼트, 액세서리, 보조, 및 부속 폴리뉴클레오타이드는 기능적 모이어티 (예를 들어, 폴리펩티드, 소 분자, 표지 등) 를 부가 및/또는 계류 (tether) 시키기 위한 부가적 자리 (crRNA/tracrRNA/Cas9 및 sgRNA/Cas9 복합체에 상대적으로) 를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 예를 들어, 삼 폴리뉴클레오타이드 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 더 짧은 길이의 sn-casPNs (더 긴 길이의 crRNA/tracrRNA 및 sgRNA 에 상대적으로) 는sn-casPNs 의 더 높은 품질 및 더욱 신속한 화학적 합성을 허용한다. 더욱이, 더 짧은 길이의 sn-casPNs 는 바이러스-기반 벡터 내로의 패키징을 촉진한다.
더욱이, 본 발명의 삼 폴리뉴클레오타이드 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템 (예를 들어, 도 3A 에 도시된 바와 같은) 은 생체내 시스템에서 부분적으로 예비형성된 Cas9 복합체를 제공하여 신속한 활성화를 허용하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, sn1-casRNA, sn3-casRNA, 및 Cas9 단백질은 세포에서 발현된다. 이들 성분은 sn1RNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 복합체를 형성하며, 이러한 복합체는 표적 결합 또는 절단에 활성이 아니다. sn2 성분이 발현되거나 세포 내로 도입될 때, sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 복합체가 신속히 활성화되며, 이러한 복합체는 자리-특이적 표적화에 대한 시간적 제어를 가능하게 해준다.
본 발명의 부가적 이점은 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 DNA 표적 서열을 포함하는 제 1 DNA 서열에 DNA 표적 결합 서열을 포함하지 않는 제 2 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 3 개의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 3 개의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘은 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적이다. 일부 실시양태에서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 Cas9 단백질과의 복합체로의 3 개의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드인 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함한다. 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드인 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함한다. 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다.
추가의 실시양태에서 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 는 제 1 및/또는 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제 2 폴리뉴클레오타이드는 추가로, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 2 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 여기에서 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단은 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단에 공유적으로 결합되어, 그에 따라 헤어핀을 형성한다. 추가의 실시양태에서, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 3 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 여기에서 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단은 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단에 공유적으로 결합되어 있다.
본 발명의 부가적 실시양태는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN), 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN), 또는 각각 보조 서열을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 및 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 둘다를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 효과기 결합 엘리먼트를 형성할 수 있다. 효과기 결합 엘리먼트는, 예를 들어, 이중-가닥 RNA 일 수 있고, 효과기 단백질은 효과기 결합 엘리먼트에 결합할 수 있는 이중-가닥 RNA 결합 단백질이다. 선별된 실시양태에서 효과기 단백질은 Cas5, Cas6, 및 Csy4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질의 촉매적 불활성 변이체이다.
추가 실시양태에서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 링커 엘리먼트를 형성할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드, 또는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 둘다는 각각 헤어핀을 포함한다. 더욱이, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 헤어핀을 추가로 포함할 수 있고, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 헤어핀 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하거나, 또는 둘다가, 즉, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드도, 5' 에서 3' 방향으로, 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 헤어핀을 포함하고 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드도, 5' 에서 3' 방향으로, 헤어핀 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 링커 엘리먼트를 형성할 수 있다.
또다른 양상에서 본 발명의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 3 개의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함한다. 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 헤어핀을 포함하는 제 2 스템 엘리먼트, 및 헤어핀을 포함하는 제 3 스템 엘리먼트를 포함한다. 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 제 3 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN) 는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함한다. 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있다. 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 양상의 일부 실시양태에서 제 1 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN) 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 제 2 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN) 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에서 보여지고 기재되었지만, 그러한 실시양태가 오직 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 상기 설명 및 하기 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 주제 및 범위에서 벗어나지 않으면서, 본 발명을 다양한 용법 및 조건에 맞게 조정하기 위해서 본 발명의 변화, 치환, 변이, 및 변형을 만들 수 있다. 그러한 변화, 치환, 변이, 및 변형은 또한 본 공개의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
실험
본 발명의 양상은 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 농도, 퍼센트 변화 등) 에 관해서 정확성을 보장하기 위한 노력을 행했으나, 일부 실험적 오류 및 편차는 해명될 것이다. 다르게 명시되지 않으면, 온도는 섭씨 온도이고 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다. 이들 실시예는, 본 발명의 일부 실시양태를 명시하는 한편, 오직 예시로서 제시된다고 이해될 것이다.
하기 실시예는 발명자들이 본 발명의 다양한 양상으로 여기는 것들의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다.
재료 및 방법
올리고뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 도 13 에서 보여지는 프라이머 서열) 은 합성을 위해 상업적 제조자 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA; 또는 Eurofins, Luxembourg) 에게 제공되었다.
sn-casPNs 는 sn-casPNs 에 대한 상응하는 DNA 서열을 함유하는 3' 중복 (overlapping) 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 조립된다. 더욱이, sn-casPNs 를 인코딩하는 DNA 서열은 증식을 위해 적합한 벡터 내에서 클로닝될 수 있고 후속적으로 sn-casPN 서열이 단리된다 (예를 들어, 벡터의 제한 효소 절단을 사용하여 sn-casPN 를 산출함).
실시예 1
sn-casRNA 성분의 생산
이 실시예는 삼 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템 (예를 들어, 도 3A 에 도시된 시스템과 유사함) 의 생산을 기재했다.
RNA 성분을 DNA 서열의 5' 말단에 T7 프로모터가 편입된 이중-가닥 DNA 주형으로부터 시험관내 전사 (예를 들어, T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit, New England Biolabs, Ipswich, MA) 에 의해 생산했다.
실시예에서 사용된, 특이적 sn2-casRNA 성분 (본원에서 sn2-casRNAEX 로 지칭됨) 에 관한 이중-가닥 DNA 주형을 sn2-casRNAEX 성분에 대한 상응하는 DNA 서열을 함유하는 3' 중복 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 조립했다. 조립에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 표 8 에 제시되어 있다.
표 8
sn2-casRNA 성분 주형의 생성을 위한 중복 프라이머
Figure pct00008
DNA 프라이머는 각각 2nM 의 농도로 존재했다. T7 프로모터에 상응하는 2 개의 바깥쪽 DNA 프라이머 (정방향 프라이머: 올리고뉴클레오타이드 A, 표 8), 및 RNA 서열의 3' 말단 (역방향 프라이머: 올리고뉴클레오타이드 C, 표 8) 을 640nM 에서 사용하여 증폭 반응을 추진했다. PCR 반응을 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) 를 제조자의 지침에 따라 사용하여 수행했다. PCR 조립 반응을 하기 열 사이클링 조건을 사용하여 수행했다: 2 분 동안 98℃, 35 사이클의 98℃ 에서 15 초, 62℃ 에서 15 초, 72℃ 에서 15 초, 및 72℃ 에서 2 분 동안 최종 연장. DNA 품질을 아가로스 겔 전기영동 (1.5%, SYBR® Safe, Life Technologies, Grand Island, NY) 에 의해 평가했다.
실시예에서 사용된, 특이적 sn1-casRNA 및 sn3-casRNA 성분에 관한 이중-가닥 DNA 주형을, 2 개의 상보적 올리고뉴클레오타이드 서열 (sn1-casRNAEX 및 sn3-casRNAEX 로 지칭됨) 을 복합체화하여 조립했다. 조립에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 표 9 에 제시되어 있다.
표 9
sn-casRNAs 성분 주형의 생성을 위한 중복 프라이머
Figure pct00009
DNA 프라이머는 각각 10μM 의 농도로 존재했고, 10uL 의 각각의 프라이머를 함께 혼합하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고, 실온으로 평형되게 놔두었다.
각각의 sn-casRNA 성분에 관한 DNA 주형 0.25-0.5㎍ 을 T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA) 를 사용하여 대략 16 시간 동안 37℃ 에서 전사시켰다. 전사 반응물을 DNAse I (New England Biolabs, Ipswich, MA) 로 처리하고, GeneJet RNA Cleanup and Concentration Kit (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하여 정제했다. RNA 수율을 Nanodrop™ 2000 System (Thermo Scientific, Wilmington, DE) 을 사용하여 정량화했다. 전사된 RNA 의 품질을 아가로스 겔 전기영동 (2%, SYBR® Safe, Life Technologies, Grand Island, NY) 에 의해 체크했다. sn-casRNA 서열은 표 10 에서 보여지는 바와 같다.
표 10
sn-casRNA 서열
Figure pct00010
sn1-casRNAEX, sn2-casRNAEX, 및 sn3-casRNAEX 의 이러한 생산 방법은 본원에 기재된 바와 같은 기타 sn-casRNAs 의 생산에 적용될 수 있다.
실시예 2
Cas9 절단 어세이에서 사용하기 위한 이중-가닥 DNA 표적 영역의 생산
시험관내 Cas9 절단 어세이에서 사용하기 위한 표적 이중-가닥 DNA 를 게놈 DNA 로부터 표적 영역의 PCR 증폭을 사용하여 생산했다.
생화학적 어세이를 위한 이중-가닥 DNA 표적 영역 (예를 들어, AAVS-1) 을 페놀-클로로포름 제조된 인간 세포주 K562 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 게놈 DNA (gDNA) 로부터 PCR 증폭에 의해시켰다. PCR 반응을 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) 를 제조자의 지침에 따라 사용하여 수행했다. 20ng/μL gDNA 를 최종 부피 25μl 로 사용하여 선별된 표적 영역을 하기 조건 하에 증폭시켰다: 2 분 동안 98℃, 35 사이클의 98℃ 에서 20s, 60℃ 에서 20s, 72℃ 에서 20s, 및 72℃ 에서 2 분 동안 최종 연장. PCR 산물을 Spin Smart™ PCR 정제 튜브 (Denville Scientific, South Plainfield, NJ) 를 사용하여 정제하고, Nanodrop™ 2000 UV-Vis 분광광도계 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) 를 사용하여 정량화했다.
gDNA 로부터 선별된 표적화되는 서열의 증폭에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머는 다음과 같았다: AAVS-1, 올리고뉴클레오타이드 H 및 I (도 13). AAVS-1 에 관한 증폭된 이중-가닥 DNA 표적은 495bp 였다.
기타 적합한 이중-가닥 DNA 표적 영역을 본질적으로 동일한 방법을 사용하여 수득한다. 비-인간 표적 영역에 관해, 선별된 유기체 (예를 들어, 식물, 박테리아, 효모, 조류) 로부터의 게놈 DNA 를 인간 세포로부터 유래하는 DNA 대신에 사용한다. 더욱이, 게놈 DNA 이외의 폴리뉴클레오타이드 공급원이 사용될 수 있다 (예를 들어, 벡터 및 겔 단리된 DNA 분절).
실시예 3
Cas9 절단 어세이
이 실시예는 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열에 상대적인 선별된 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체의 퍼센트 절단을 평가 및 비교하는 시험관내 Cas9 절단 어세이에서의 본 발명의 삼 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 사용을 예시한다.
이중-가닥 DNA 표적 서열의 절단을 이중-가닥 DNA 표적 (AAVS-1; 실시예 2) 에 대해 실시예 2 의 sn-casRNAEX 성분에 관해 확인했다.
등몰량의 모든 3 개의 sn-casPNEX 성분을 어닐링 완충액 (1.25mM HEPES, 0.625mM MgCl2, 9.375mM KCl, pH7.5 에서) 에서 혼합하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고, 실온으로 평형되게 놔두었다. 3 개의 sn-casRNAsEX 중 2 개의 부가적 조합을 아래 기재된 바와 같이 도 8 에 제시된 데이타를 참조하여 시험했다. 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 오직 2 개의 성분을 사용했을 때 물을 제 3 sn-casRNAEX 성분 대신에 첨가했다.
sn-casRNAsEX 를 Cas9 반응 믹스에 첨가했다. Cas9 반응 믹스는 반응 완충액 (20mM HEPES, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 및 5% 글리세롤, pH7.4 에서) 에서 최종 농도 200μM 로 희석된 Cas9 단백질을 포함했다. 반응 믹스에서 각각의 sn-casRNAEX 의 최종 농도는 각각의 반응 믹스에서 500nM 였다. 각각의 반응 믹스를 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션했다. 절단 반응을 표적 DNA 를 최종 농도 15nM 로 첨가하여 개시했다. 샘플을 혼합하고, 간단히 원심분리한 후에 15 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 절단 반응을 프로테이나아제 K (Denville Scientific, South Plainfield, NJ) 를 최종 농도 0.2㎍/㎕ 및 0.44㎍/㎕ RNase A Solution (SigmaAldrich, St. Louis, MO) 에서 첨가하여 종결시켰다.
샘플을 37℃ 에서 25 분 및 55℃ 에서 25 분 동안 인큐베이션했다. 12 μL 의 총 반응물을 절단 활성에 관해 아가로스 겔 전기영동 (2%, SYBR® Gold, Life Technologies, Grand Island, NY) 에 의해 평가했다. AAVS-1 이중-가닥 DNA 표적에 관해, 대략 316bp 및 대략 179bp 에서의 DNA 밴드의 출현은 표적 DNA 의 절단이 일어났다는 것을 시사했다. 100bp DNA 래더 (ladder) 를 분자량 표준으로 사용했다 (New England Biolabs, Ipswich, MA). 절단 백분율을 각각의 절단 분절 및 표적 DNA 에 관해 FIJI (ImageJ; open source Java image processing program) 에 의해 계산되는 곡선하면적 값을 사용하고, 절단 분절의 합계를 절단 분절 및 표적 DNA 둘다의 합계로 나누어서 계산했다.
도 8 은 AAVS-1 표적 이중-가닥 DNA 를 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 도면에서, 3 개의 레플리케이트 (replicates) 가 sn-casRNAsEX 의 각각의 조합에 관해 보여진다. 각각의 패널의 상부에 어세이에서 사용된 sn-casRNAsEX 의 도해적 묘사가 있다. 도 8, 패널 A 는 sn1-casRNAEX, sn2-casRNAEX, sn3-casRNAEX-AAVS1 의 생화학적 활성을 보여준다. 도 8, 패널 B 는 sn1-casRNAEX 및 sn2-casRNAEX 의 생화학적 활성을 보여준다. 도 8, 패널 C 는 sn2-casRNAEX 및 sn3-casRNAEX-AAVS1 의 생화학적 활성을 보여주고, 도 8, 패널 D 는 sn1-casRNAEX 및 sn3-casRNAEX-AAVS1 의 생화학적 활성을 보여준다. 도 8, 패널 D 의 마지막 레인은 분자량 표준을 함유한다. 절단 백분율이 각각의 레인의 하부에서 보여진다. 도 8 에서의 데이타로부터 볼 수 있는 바와 같이, sn1-casRNAEX, sn2-casRNAEX, 및 sn3-casRNAEX-AAVS1 은 46.9% 의 평균 퍼센트 절단 (0.3% 의 표준 편차) 을 가졌다. 오직 2 개의 sn-casRNAEX 성분이 존재했던 모든 반응에 관해 (예를 들어 도 8, 패널 B, 도 8, 패널 C, 도 8, 패널 D) 절단 활성이 관찰되지 않았다 (LOD 로 표시된 레인에 관해, 임의의 절단 활성은 검출 한계 미만이었다.).
도 8 에 제시된 데이타는 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템이 표적 이중-가닥 DNA 의 Cas9 매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증한다. 데이타는 또한 모든 3 개의 sn-casRNA 성분이 Cas9 매개되는 자리-특이적 절단 활성을 지지하는데 필요하다는 것을 보여준다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 Cas9 절단 어세이는 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 4
진핵생물 세포에서 표적 변형의 검출을 위한 딥 시퀀싱 분석
이 실시예는 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열에 상대적인 선별된 sn-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 생체내 퍼센트 절단을 평가 및 비교하는 딥 시퀀싱 분석의 사용을 예시한다.
A. sn1-casRNAEX, sn2-casRNAEX, sn3-casRNAEX-AAVS1 및 Cas9 단백질의 RNP 복합체의 형성
스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 를 2 개의 핵 국소화 서열 (NLS) 로 C-말단에서 태그하고, 에스케리키아 콜라이에서 재조합적으로 발현시켰다. 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 2 개의 농도, 50pmol Cas9:150pmols sn-casRNAsEX 및 200pmols Cas9:600pmols sn-casRNAsEX 에서, 트리플리케이트 (triplicate) 로 설정했다. 등몰량의 모든 3 개의 sn-casRNAsEX (sn1-casRNAEX, sn2-casRNAEX, sn3-casRNAEX-AAVS1) 성분을 어닐링 완충액 (1.25mM HEPES, 0.625mM MgCl2, 9.375mM KCl, pH7.5 에서) 에서 요망되는 농도 (150pmols 또는 600pmols) 까지 최종 부피 5μL 로 혼합하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고, 실온으로 평형되게 놔두었다. Cas9 단백질을 결합 완충액 (20mM HEPES, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 및 5% 글리세롤, pH7.4 에서) 에서 적당한 농도까지 최종 부피 5μL 로 희석하고, 5μL 의 열-변성된 sn-casRNAs EX 와 혼합하고, 그에 뒤이어 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다.
B. sn-casRNAsEX/Cas9 단백질 RNPs 를 사용하는 세포 트랜스펙션
RNP 복합체를 K562 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 내로, Nucleofector® 96-웰 셔틀 시스템 (Lonza, Allendale, NJ) 및 하기 프로토콜을 사용하여 트랜스펙션시켰다. RNP 복합체를 10μL 최종 부피로 96-웰 플레이트의 개별 웰 내로 분주 (dispense) 했다. 배지에 현탁된 K562 세포를 배양 플라스크로부터 50mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포를 원심분리에 의해 3 분 동안 200 x g 에서 펠렛화하고, 배양 배지를 흡입하고, 세포 칼슘 및 마그네슘-프리 PBS 로 1 회 세척한다. K562 세포를 그 후 원심분리에 의해 3 분 동안 200 x g 에서 펠렛화하고, PBS 를 흡입하고, 세포 펠렛을 10mL 의 칼슘 및 마그네슘-프리 PBS 에 재현탁시켰다.
세포를 Countess® II 자동화 세포 계수기 (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하여 계수했다. 2.2 x 107 세포를 50ml 튜브로 옮기고 펠렛화한다. PBS 를 흡입하고 세포를 Nucleofector™ SF (Lonza, Allendale, NJ) 용액에 1 x 107 세포/mL 의 밀도로 재현탁시켰다. 20μL 의 세포 현탁액을 그 후 10μL 의 RNP 복합체를 함유하는 개별 웰에 첨가하고, 전체 부피를 96-웰 Nucleocuvette™ Plate (Lonza, Allendale, NJ) 의 웰로 옮겼다. 플레이트를 Nucleofector™ 96-웰 Shuttle™ (Lonza, Allendale, NJ) 위로 로딩하고, 세포를 96-FF-120 Nucleofector™ 프로그램 (Lonza, Allendale, NJ) 을 사용하여 뉴클레오펙션시켰다. 뉴클레오펙션 후에, 10% FBS (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), 페니실린 및 스트렙토마이신 (Life Technologies, Grand Island, NY) 이 보충된 70μL Iscove's 변형 둘베코 배지 (IMDM; Life Technologies, Grand Island, NY) 를 각각의 웰에 첨가하고, 50μL 의 세포 현탁액을 150μL 미리 데워진 IMDM 완전 배양 배지를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 그 후 조직 배양 인큐베이터로 옮기고, 37℃ 에서 5% CO2 에서 48 시간 동안 유지한다.
C. 딥 시퀀싱을 위한 표적 이중-가닥 DNA 생성
gDNA 를 K562 세포로부터 RNP 트랜스펙션 후 48 시간에 웰 당 50μL QuickExtract DNA 추출 용액 (Epicentre, Madison, WI) 을 사용하여 단리하고, 그에 뒤이어 37℃ 에서 10 분 동안, 65℃ 에서 6 분 동안 및 95℃ 에서 3 분 동안 인큐베이션하여 반응을 중단시켰다. 단리된 gDNA 를 그 후 50μL 물로 희석하고, 샘플을 -80℃ 에서 저장했다.
단리된 gDNA 를 사용하여, 제 1 PCR 을 1x 농도의 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA), 각각 0.5μM 의 프라이머 (도 13, 올리고뉴클레오타이드 H 및 I), 3.75μL 의 gDNA 를 최종 부피 10L 로 사용하고, 98℃ 1 분 동안, 35 사이클의 98℃ 에서 10s, 60℃ 에서 20s, 72℃ 에서 30s, 및 72℃ 에서 2 분 동안 최종 연장으로 증폭시켜 수행했다. PCR 반응물을 물에 1:100 로 희석했다.
"바코딩" PCR 을 각각의 샘플에 관해 독특한 프라이머를 사용하여 설정하여 멀티플렉스 시퀀싱을 촉진했다. 프라이머 쌍이 표 11 에서 보여진다.
표 11
바코딩 프라이머
Figure pct00011
바코딩 PCR 을 1x 농도의 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA), 각각 0.5μM 의 프라이머 (표 11), 1μL 의 1:100 희석된 제 1 PCR 을, 최종 부피 10μL 로 사용하고, 98℃ 1 분 동안, 12 사이클의 98℃ 에서 10s, 60℃ 에서 20s, 72℃ 에서 30s, 및 72℃ 에서 2 분 동안 최종 연장으로 증폭시켜 수행했다.
D. SPRIselect 클린-업
PCR 반응물을 시퀀싱을 위한 앰플리콘의 SPRIselect (Beckman Coulter, Pasadena, CA) 비드-기반 클린 업을 위해 단일 마이크로퓨즈 튜브 내로 푸울 (pool) 했다.
푸울된 앰플리콘에, 0.9x 부피의 SPRIselect 비드를 첨가하고, 혼합하고 실온 (RT) 에서 10 분 동안 인큐베이션했다. 마이크로퓨즈 튜브를 용액이 맑아질 때까지 자기 튜브 스탠드 (Beckman Coulter, Pasadena, CA) 위에 두었다. 상청액을 제거하고 버리고, 잔류 비드를 1 부피의 85% 에탄올로 세척하고, RT 에서 30s 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후에 에탄올을 흡입하고 비드를 RT 에서 10 분 동안 공기 건조시켰다. 마이크로퓨즈 튜브를 그 후 자기 스탠드로부터 제거하고, 0.25x 부피의 Qiagen EB 완충액 (Qiagen, Venlo, Netherlands) 을 비드에 첨가하고, 격렬히 혼합하고, 2 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 마이크로퓨즈 튜브를 자석으로 다시 보내고, 용액이 맑아질 때까지 인큐베이션하고, 정제된 앰플리콘을 함유하는 상청액을 깨끗한 마이크로퓨즈 튜브 내로 분주했다. 정제된 앰플리콘 라이브러리를 Nanodrop™ 2000 System (Thermo Scientific, Wilmington, DE) 을 사용하여 정량화하고, 라이브러리-품질을 Fragment Analyzer™ System (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA) 및 DNF-910 Double-stranded DNA Reagent Kit (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA) 를 사용하여 분석했다.
E. 딥 시퀀싱 설정
앰플리콘 라이브러리를 앰플리콘의 Nanodrop 값 및 크기로부터 계산되는 바와 같은 4 nmolar 농도로 정규화했다. 라이브러리를 MiSeq Sequencer (Illumina, San Diego, CA) 에서 MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina, San Diego, CA) 를 사용하여 300 사이클 동안 2 회의 151-사이클 페어드-엔드 런 (paired-end　run) + 2 회의 8-사이클 인덱스 리드 (index read) 로 분석했다.
F. 딥 시퀀싱 데이타 분석
시퀀싱 데이타에서 산물의 동일성을 PCR 의 바코딩 라운드에서 앰플리콘에 맞춰 조정된 인덱스 바코드 서열에 기초하여 확인했다. 하기 과제를 수행함으로써 컴퓨터 스크립트를 사용하여 MiSeq 데이타를 가공했다:
ㆍ 리드를 Bowtie (bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) 소프트웨어를 사용하여 인간 게놈 (build GRCh38/38) 에 정렬했다.
ㆍ 정렬된 리드를 예상된 야생형 AAVS-1 좌위 서열과 비교하고, AAVS-1 좌위의 임의의 부분과 정렬되지 않는 리드를 버렸다 (표 12, "기타").
ㆍ 야생형 AAVS-1 서열 (표 12, "WT") 과 매치하는 리드를 총계냈다.
ㆍ indels (염기의 삽입 또는 결실) 이 있는 리드를 indel 유형에 의해 카테고리화하고 총계냈다 (표 12, "indel").
ㆍ 총 indel 리드를 야생형 리드 및 indel 리드의 합계로 나누어서 퍼센트-돌연변이된 리드를 제공했다.
이러한 분석의 결과는 표 12 에 제시되어 있다.
표 12
딥 시퀀싱 데이타
Figure pct00012
표 12 의 레플리케이트 전체에 걸쳐 측정된 indels 로부터 볼 수 있는 바와 같이, sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템은 표적 좌위의 생체내 변형을 할 수 있다. 부가적으로, 증가된 트랜스펙트된 sn-casPNs/Cas9 농도의 결과로서의 증가된 indel 빈도는 용량 의존적 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템 매개되는 절단의 지표이다. 표 12 에 제시된 데이타는 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템이 게놈 좌위의 생체내 Cas9-매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 분석은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 5
Csy4* 촉진되는 sn-casRNA/Cas9 단백질 절단
이 실시예는 Csy4 RNA 결합 서열이 증대된 2 개의 sn-casRNAs 의 연합을 증가시키는, 본 발명의 sn-casRNAs 및 효과기 단백질, H29A 돌연변이 (Csy4*) 를 보유하는 뉴클레아제 결핍성 P. 에루기노사 (P. aeruginosa) Csy4 단백질의 사용을 예시한다.
A. sn-casRNA 성분의 생성
Csy4 결합 서열을 포함하는 특이적 sn-casRNAEXCsy 성분에 관한 이중-가닥 DNA 주형을 sn-casRNAEXCsy 성분에 대한 상응하는 DNA 서열을 함유하는 3' 중복 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 조립했다. 조립에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 표 13 에 제시되어 있다.
표 13
Csy4 RNA 결합 서열을 포함하는 sn-casRNAEXCsys 의 생성을 위한 중복 프라이머
Figure pct00013
DNA 프라이머는 각각 2nM 의 농도로 존재했다. T7 프로모터에 상응하는 2 개의 바깥쪽 DNA 프라이머 (정방향 프라이머: 올리고뉴클레오타이드 A, 표 13) 및 RNA 서열의 3' 말단 (역방향 프라이머: 올리고뉴클레오타이드 T, AC, 또는 W, 표 13) 을 640nM 에서 사용하여 증폭 반응을 추진했다. PCR 및 전사를 이 명세서에 기재된 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다. 전사된 sn-casRNAEXCsy 서열이 표 14 에서 보여진다.
표 14
sn-casRNAEXCsy 서열
Figure pct00014
B. 생화학적 어세이를 위한 이중-가닥 DNA 표적의 생성
시험관내 Cas9 절단 어세이에서 사용하기 위한 표적 이중-가닥 DNA 를 본원에서 실시예 2 에 기재된 바와 같은 PCR 증폭을 사용하여 생산했다. gDNA 로부터의 증폭에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 다음과 같았다: AAVS-1 올리고뉴클레오타이드는 J 및 K (도 13) 였고, AAVS-1 에 관한 증폭된 이중-가닥 DNA 표적은 288bp 였고; CD34 (조혈 선조 세포 항원) 올리고뉴클레오타이드는 AD 및 AE (도 13) 였고, CD34 에 관한 증폭된 이중-가닥 DNA 표적은 258bp 였고; CD151 (혈소판-내피 세포 테트라스파닌 항원) 올리고뉴클레오타이드는 AF 및 AG (도 13) 였고, 증폭된 CD151 이중-가닥 DNA 표적은 272bp 였고; JAK-1 (야누스 키나아제 1) 올리고뉴클레오타이드는 AH 및 AI (도 13) 였고, 증폭된 JAK-1 이중-가닥 DNA 표적은 298bp 였다.
C. Csy4* 지지되는 Cas9 절단 생화학적 어세이
sn-casRNAsEXCsy 를 본원에서 실시예 3 에 기재된 바와 같은 생화학적 어세이에서 사용하기 위해 제조했다. 다르게 한 점은, Cas9 의 첨가 전에, 250nM 의 Csy4* 단백질을 반응에 첨가하고 sn-casRNAsEXCsy 및 Csy4* 를 37℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션한 점이었다. 인큐베이션 후에, Cas9 를 첨가하고 생화학적 반응을 실시예 3 에 기재된 바와 같이 수행했다. 비-Csy4* 대조군이 포함되었다.
도 9 는 Csy4* 단백질 및 sn-casRNAsEXCsy 를 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 절단 어세이는 도 3B 에 존재하는 시스템의 변이체인 2 개의 상이한, 이 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템을 사용했다. 제 1 시스템에서 sn1-casRNAsEXCsy 는 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함했고 (sn1-casRNAEXCsy-Csy), sn2-casRNA 는 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함했으며 (sn2-casRNAEXCsy-Csy), 여기에서 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 연합하여 Csy4 RNA 결합 엘리먼트를 형성한다 (sn1-casRNA/sn2-casRNA/Csy4RNA). 제 2 시스템에서 sn1-casRNA 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함했고 (sn1-casRNAEXCsy-lnkCsy), sn2-casRNA 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 Csy4 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함했으며 (sn2-casRNAEXCsy-lnkCsy), 여기에서 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 연합하여 링커 엘리먼트 및 Csy4 RNA 결합 엘리먼트를 형성한다 (참고, 예를 들어, 도 6A 및 도 6B 의 일반적 묘사). 각각의 2 개의 시스템을 사용하여 4 개의 상이한 표적을 절단했으며, 여기에서 sn-casRNAsEXCsy 각각은 하기 4 개의 표적 중 하나에 상보적인 스페이서를 포함했다: AAVS-1, CD-34, CD-151, 및 JAK-1 (참고, 상기 표 13). 도면에서, 절단 활성은 각각의 레인의 하부에서 보여진다 (분자량 표준인, 레인 1 및 10 은 예외). LOD 로서 표시된 레인에서, 임의의 절단 활성은 검출 한계 미만이었다. 각각의 Cas9 절단 어세이 반응에서 사용된 시스템은 표 5/도 9 (참고, 도면의 간단한 설명, 도 9) 에서 보여지는 바와 같았다.
AAVS-1 이중-가닥 DNA 표적에 관해, 대략 174bp 및 대략 114bp 에서의 DNA 밴드의 출현은 표적 DNA 의 절단이 일어났다는 것을 시사했다. CD34 이중-가닥 DNA 표적에 관해, 대략 105bp 및 대략 153bp 에서의 DNA 밴드의 출현은 표적 DNA 의 절단이 일어났다는 것을 시사했다. CD151 이중-가닥 DNA 표적에 관해, 대략 109bp 및 대략 163bp 에서의 DNA 밴드의 출현은 표적 DNA 의 절단이 일어났다는 것을 시사했다. JAK-1 이중-가닥 DNA 표적에 관해, 대략 204bp 및 대략 94bp 에서의 DNA 밴드의 출현은 표적 DNA 의 절단이 일어났다는 것을 시사했다. 100bp DNA 래더를 분자량 표준으로 사용했다 (New England Biolabs, Ipswich, MA).
도 9 에서의 데이타로부터 볼 수 있는 바와 같이, Csy4* 의 첨가는 복수의 이중-가닥 DNA 표적 서열에 관한 sn-casRNAsEXCsy 시스템의 절단 활성을 향상시켰다: AAVS-1 에 관해 레인 2/3 (Csy4* 단백질이 없음) 을 레인 4/5 와 각각 비교한다; CD-34 에 관해 레인 6/7 (Csy4* 단백질이 없음) 을 레인 8/9 와 비교한다; CD-151 에 관해 레인 11/12 (Csy4* 단백질이 없음) 를 레인 13/14 와 비교한다; 및, JAK-1 에 관해 레인 15/16 (Csy4* 단백질이 없음) 을 레인 17/18 와 비교한다.
도 9 에 제시된 데이타는 효과기 단백질 (여기에서 Csy4*) 이 효과기 결합 엘리먼트 (여기에서 Csy4 RNA 결합 서열) 를 갖는 보조 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템에 의한 표적 이중-가닥 DNA 의 절단을 향상시켰다는 것을 입증한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 바와 같은 뉴클레아제 결핍성 P. 에루기노사 Csy4 단백질에 위한 Csy4 RNA 결합 서열을 포함하는 2 개의 sn-casRNAs 의 연합의 증가는 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 더욱이, 본 명세서 및 실시예의 지도에 비추어 당업자는 기타 효과기 단백질/효과기 결합 서열 조합을 Csy4* 단백질/Csy4 RNA 결합 서열에 의해 본원에서 예시된 바와 같이 사용할 수 있다.
실시예 6
sn1-CasRNA/sn2-casRNA/Cas9 절단 활성
이 실시예는 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열에 상대적인 선별된 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 퍼센트 절단을 평가 및 비교하는 시험관내 Cas9 절단 어세이에서 본 발명의 이 폴리뉴클레오타이드, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 사용을 예시한다.
이 실시예에서 사용된 sn-casRNAEX2 성분에 관한 이중-가닥 DNA 주형을 sn-casRNAEX2 성분에 대한 상응하는 DNA 서열을 함유하는 3' 중복 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 조립했다. sn-casRNAEX2 성분의 도해적 묘사가 도 10 에 제시되어 있다. 조립에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 표 15 에 제시되어 있다.
표 15
sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 의 생성을 위한 중복 프라이머
Figure pct00015
RNA 전사를 위한 이중-가닥 DNA 주형의 생성을 본원에서 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다. 전사된 sn-casRNAsEX2 서열이 표 16 에서 보여진다.
표 16
sn-casRNA 서열
Figure pct00016
시험관내 Cas9 절단 어세이에서 사용하기 위한 표적 이중-가닥 DNA 를 본원에서 실시예 2 에 기재된 바와 같은 PCR 증폭을 사용하여 생산했다. gDNA 로부터의 증폭에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 다음과 같았다: AAVS-1 올리고뉴클레오타이드는 J 및 K (도 13) 였고, AAVS-1 에 관한 증폭된 이중-가닥 DNA 표적은 288bp 였고; CD151 올리고뉴클레오타이드는 AF 및 AG (도 13) 였고, 증폭된 CD151 이중-가닥 DNA 표적은 272bp 였고; 및, JAK-1 올리고뉴클레오타이드는 AH 및 AI 였고, 증폭된 JAK-1 이중-가닥 DNA 표적은 298bp 였다. 시험관내 절단을 본원에서 실시예 3 에 기재된 바와 같이 수행했다.
도 10 은 위에 기재된 sn1-casRNAsEX2 및 sn2-casRNAEX2 를 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 절단 백분율이 각각의 레인의 하부에서 보여지며, 분자량 표준인, 레인 1 은 예외이다. 도 10, 레인 2 는 sn1-casRNAEX2-AAVS1 및 sn2-casRNAEX2 시스템에 관한 절단 결과를 제시하며, 이는 97.6% 의 절단 활성을 입증했다. 도 10, 레인 3 은 sn1-casRNAEX2-CD151 및 sn2-casRNAEX2 시스템에 관한 절단 결과를 제시하며, 이는 48.8% 의 절단 활성을 입증했다. 도 10, 레인 4 는 sn1-casRNAEX2-JAK1 및 sn2-casRNAEX2 시스템에 관한 결과를 제시하며, 이는 60.0% 의 절단 활성을 입증했다.
도 10 에 제시된 데이타는 본원에 기재된 바와 같은 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 구축물이 이중-가닥 DNA 표적의 시험관내 Cas9 매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증했다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 Cas9 절단 어세이는 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 7
sn1-CasRNA EX3Csy /sn2-casRNA EX3Csy /Cas9 절단 활성
이 실시예는 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열에 상대적인 그들의 퍼센트 절단 활성을 평가 및 비교하는 본 발명의 2 개의 상이한, 이 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 사용을 도시한다.
2 개의 상이한, 이 폴리뉴클레오타이드 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템은 다음과 같았다: 하나는 도 7A 에 도시된 시스템이었고 (sn1-casRNAEX3Csy-Csy-AAVS1/ sn2-casRNAEX3Csy-Csy); 및 두번째는 도 7A 에 존재하는 시스템의 변이체였다. 제 2 시스템에서 sn1-casRNAEX3Csy-lnkCsy-AAVS1 은, 5' 내지 3', 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드 (링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 헤어핀 형성 폴리뉴클레오타이드를 가짐) 를 포함했고, sn2-casRNAEX3Csy-lnkCsy-AAVS1 은, 5' 내지 3', 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드 (헤어핀 형성 폴리뉴클레오타이드 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 가짐) 및 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함했다. 각각의 2 개의 시스템을 사용하여 AAVS-1 표적의 절단을 표적화하며, 여기에서 sn1-casRNAEX3Csy-AAVS1 및 sn1-casRNAEX3Csy-lnkCsy-AAVS1 은 각각 AAVS-1 에 상보적인 스페이서를 포함했다.
이 실시예에서 사용된 sn-casRNAEX3-Cys 성분에 관한 이중-가닥 DNA 주형을 sn-casRNAEX3-Cys 성분에 대한 상응하는 DNA 서열을 함유하는 3' 중복 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 조립했다. 조립에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 표 17 에 제시되어 있다.
표 17
sn-casRNAEX3-Cys 성분의 생성을 위한 중복 프라이머
Figure pct00017
RNA 전사를 위한 이중-가닥 DNA 주형의 생성을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다. 전사된 sn-casRNAEX3-Cys 서열이 표 18 에서 보여진다.
표 18
sn-casRNA 서열
Figure pct00018
시험관내 Cas9 절단 어세이에서 사용하기 위한 표적 이중-가닥 DNA 를 실시예 2 에 기재된 바와 같은 PCR 증폭을 사용하여 생산했다. gDNA 로부터의 증폭에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 다음과 같았다: AAVS-1, 올리고뉴클레오타이드 H 및 I (도 13). AAVS-1 에 관한 증폭된 이중-가닥 DNA 표적은 495bp 였다. 시험관내 절단을 실시예 3 에 기재된 바와 같이 수행했다.
도 11 은 위에 기재된 sn-casRNAs 를 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시한다. 도면에서, 절단 활성은 각각의 레인의 하부에서 보여진다 (분자량 표준인, 레인 1 및 10 은 예외). LOD 로서 표시된 레인에서, 임의의 절단 활성은 검출 한계 미만이었다. 각각의 Cas9 절단 어세이 반응에서 사용된 시스템은 표 6 (참고, 도면의 간단한 설명, 도 11) 에서 보여지는 바와 같았다.
도 11 에 제시된 데이타에서 볼 수 있는 바와 같이, 둘다의 sn1-casRNAEX3Csy-Csy-AAVS1 및 sn2-casRNAEX3Csy-Csy (도 11, 레인 2 및 3) 또는 sn1-casRNAEX3Csy-lnkCsy-AAVS1 및 sn2-casRNAEX3Csy-lnkCsy 가 검출가능한 절단 활성에 필수적이다 (도 11, 레인 6 및 7). 더욱이, 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열이 스플릿-넥서스 엘리먼트 사이에 도입되었을 때 향상된 절단이 검출가능했다 (도 11, 레인 4 와 비교되는 레인 8). 부가적으로, Csy4* 단백질이 도입될 때 sn1-casRNAEX3Csy-lnkCsy-AAVS1 및 sn2-casRNAEX3Csy-lnkCsy 에서 향상된 절단이 관찰되지만 (도 11, 레인 8 과 비교되는 레인 9), 링커 서열의 부재시에는 그렇지 않다 (sn1-casRNAEX3Csy-Csy-AAVS1 및 sn2-casRNAEX3Csy-Csy; 도 11, 레인 4 와 비교되는 레인 5).
도 11 에 제시된 데이타는 본원에 기재된 바와 같은 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 구축물이 이중-가닥 DNA 표적의 시험관내 Cas9 매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 Cas9 절단 어세이는 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 8
트랜스-활성화 CRISPR RNA 의 동정 및 스크리닝
이 실시예는 CRISPR-Cas9 타입 II 시스템을 갖는 종의 트랜스-활성화 CRISPR RNAs (tracrRNAs) 를 동정할 수 있는 방법을 예시한다. 여기에 제시된 방법은 Chylinski, et. al., "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems", RNA Biol., 10(5), 726-37 (2013) 으로부터 개조한 것이다. 모든 하기 단계들이 스크리닝에 요구되는 것은 아니고, 단계들의 순서가 제시된 바와 같아야 하는 것은 아니다.
A. CRISPR-Cas9 타입-II 시스템을 함유하는 종의 동정
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 을 사용하여, 다양한 종의 게놈의 서치를 수행하여 Cas9 또는 Cas9-유사 단백질을 동정한다. CRISPR-Cas9 시스템은 종 전체에서 높은 서열 다양성을 보이며, 그러나 Cas9 오르토로그는 중심 HNH 엔도뉴클레아제 도메인 및 스플릿 RuvC/RNase H 도메인의 보존된 도메인 구성을 보인다. 일차 BLAST 결과는 동정된 도메인에 관해 필터링된다; 불완전 또는 절두된 서열은 버려지고 Cas9 오르토로그는 동정된다.
Cas9 오르토로그가 종에서 동정될 때, Cas9 오르토로그 코딩 서열에 인접한 서열을 기타 Cas 단백질 및 연합된 리피트-스페이서 어레이에 관해 프로브하여 CRISPR-Cas9 좌위에 속하는 모든 서열을 동정한다. 이는 밀접하게 관련된 종이 유사한 CRISPR-Cas9 좌위 구성 (즉, Cas 단백질 조성물, 크기, 배향, 어레이의 위치, tracrRNA 의 위치 등) 을 보인다는 지식에 기초하여 공개 도메인에서 이미 알려진 기타 CRISPR-Cas9 타입-II 좌위에 대해 정렬하여 수행할 수 있다. tracrRNA 엘리먼트는 전형적으로 CRISPR-Cas9 타입-II 좌위 내에 함유되고 리피트-스페이서 어레이에서 리피트 엘리먼트에 대한 그것의 서열 상보성 (tracr 항-리피트 서열) 에 의해 쉽게 동정된다.
일단 Cas9 오르토로그에 관한 CRISPR-Cas9 좌위의 서열이 종에서 동정되면, 인 실리코 (in silico) 예측적 스크리닝을 사용하여 항-리피트 서열을 추출하여 연합된 tracrRNA 를 동정한다. 추정상의 항-리피트를, 예를 들어, 다음과 같이 스크리닝한다.
리피트 서열이 알려진 종에서 유래하는 경우에, 그것을 CRISPRdb 데이타베이스 (crispr.u-psud.fr/crispr/) 에서 동정하고 검색한다. 리피트 서열이 종과 관련된다고 알려지지 않은 경우에, 리피트 서열을 CRISPRfinder 소프트웨어 (crispr.u-psud.fr/Server/) 를 사용하여 위에 기재된 바와 같은 종에 관한 CRISPR-Cas9 타입-II 좌위를 사용하여 예측한다.
종에 관해 동정된 리피트 서열을 사용하여 항-리피트 서열에 관해 CRISPR-Cas9 좌위를 프로브한다 (예를 들어, BLASTp 알고리즘 등을 사용하여). 서치는 전형적으로 CRISPR-Cas9 좌위의 유전자간 영역에 한정된다.
동정된 항-리피트 영역을 동정된 리피트 서열에 대한 상보성에 관해 검증한다.
추정상의 항-리피트 영역을 Rho-독립적 전사 종료자 (TransTerm HP, transterm.cbcb.umd.edu/) 에 관해 추정상의 항-리피트의 5' 및 3' 양쪽에서 프로브한다.
그에 따라, 항-리피트 엘리먼트 및 Rho-독립적 전사 종료자를 포함하는 동정된 서열은 주어진 종의 추정상의 tracrRNA 인 것으로 확인된다.
B. RNA-Seq 라이브러리의 제조
인 실리코 동정된 추정상의 tracrRNA 를 RNA 시퀀싱 (RNAseq) 을 사용하여 추가로 검증한다.
추정상의 tracrRNA 가 동정된 종으로부터의 세포를 상업적 보관소 (예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, VA; DSMZ, Braunschweig, Germany) 로부터 입수한다.
세포를 미드-로그기 (mid-log phase) 까지 성장시키고 총 RNA 를 Trizol 시약 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 을 사용하여 프렙하고 (prepped) DNaseI (Fermentas, Vilnius, Lithuania) 로 처리한다.
10ug 의 총 RNA 를 Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Illumina, San Diego, Ca) 로 처리하고, 남은 RNA 를 RNA Clean and Concentrators (Zymo Research, Irvine, CA) 를 사용하여 정제했다.
라이브러리를 그 후 TruSeq Small RNA Library Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA) 를 제조자의 지침에 따라 사용하여 제조하며, 이는 cDNA 와 연합되는 어댑터 서열의 존재를 초래한다.
결과적인 cDNA 라이브러리를 MiSeq Sequencer (Illumina, San Diego, CA) 를 사용하여 시퀀싱한다.
C. 시퀀싱 데이타의 가공
cDNA 라이브러리의 시퀀싱 리드를 하기 방법을 사용하여 가공한다.
어댑터 서열을 cutadapt 1.1 (pypi.python.org/pypi/cutadapt/1.1) 을 사용하여 제거하고, 15nt 를 리드의 3' 말단으로부터 트리밍하여 리드 품질을 개선한다.
리드를 다시 당해 종의 게놈 (이것으로부터 추정상의 tracrRNA 가 동정됨) 에 대해 정렬하며 미스매치 허용은 2 뉴클레오타이드이다.
리드 커버리지를 BedTools (bedtools.readthedocs.org/en/latest/) 을 사용하여 계산한다.
Integrative Genomics Viewer (IGV, www.broadinstitute.org/igv/) 를 사용하여 리드의 출발 (5') 및 종료 (3') 위치를 맵핑한다. 추정상의 tracrRNA 에 관해 검색된 총 리드를 정렬의 SAM 파일로부터 계산한다.
RNA-seq 데이타를 사용하여 추정상의 tracrRNA 엘리먼트가 생체내에서 활발히 전사된다는 것을 검증한다. 인 실리코 및 RNA-seq 스크린의 컴포지트 (composite) 로부터의 확인된 히트 (hit) 를 본원에서 개요서술된 방법 (참고, 실시예 1, 2, 및 3) 을 사용하여 이중-가닥 DNA 표적의 Cas9 매개되는 절단을 지지하는 동정된 tracrRNA 서열 및 그것의 동족 crRNA 의 기능적 능력에 관해 검증한다.
본 명세서 및 본원의 실시예의 지도에 따라, 신규한 tracrRNA 서열의 동정이 당업자에 의해 실시될 수 있다.
실시예 9
진핵생물 세포에서 표적 변형의 검출을 위한 T7E1 어세이
이 실시예는 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열에 상대적인 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템의 생체내 퍼센트 절단을 평가 및 비교하는 T7E1 어세이의 사용을 예시한다.
A. Cas 폴리뉴클레오타이드 성분을 사용하는 세포 트랜스펙션
sn-casPNs 를 SpyCas9-GFP 융합물 (HEK293-Cas9-GFP) 을 구성적으로 발현하는 HEK293 세포 내로, Nucleofector® 96-웰 셔틀 시스템 (Lonza, Allendale, NJ) 및 하기 프로토콜을 사용하여 트랜스펙트한다. 등몰량의 Cas 폴리뉴클레오타이드 성분을 어닐링 완충액 (1.25mM HEPES, 0.625mM MgCl2, 9.375mM KCl, pH7.5 에서) 에서 제조하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고, 실온으로 평형되게 놔두고, 10μL 최종 부피로 96-웰 플레이트에 분주한다. 배양 배지를 HEK293-Cas9-GFP 세포로부터 흡입하고, 세포를 칼슘 및 마그네슘-프리 PBS 로 1 회 세척하고 그 후 TrypLE (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 첨가하여 트립신화하고, 그에 뒤이어 37℃ 에서 3-5 분 동안 인큐베이션한다. 트립신화된 세포를 위아래로 약하게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 형성하고, 10% FBS (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 를 함유하고 페니실린 및 스트렙토마이신 (Life Technologies, Grand Island, NY) 이 보충된 DMEM 배양 배지 (Life Technologies, Grand Island, NY) 로 구성되는 DMEM 완전 배양 배지에 첨가한다.
세포를 그 후 원심분리에 의해 3 분 동안 200 x g 에서 펠렛화하고, 배양 배지를 흡입하고 세포를 PBS 에 재현탁시킨다. 세포를 Countess® II 자동화 세포 계수기 (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하여 계수한다. 2.2 x 107 개의 세포를 50ml 튜브로 옮기고 펠렛화한다. PBS 를 흡입하고 세포를 Nucleofector™ SF (Lonza, Allendale, NJ) 용액에 1 x 107 세포/mL 의 밀도로 재현탁시킨다. 20μL 의 세포 현탁액을 그 후 10uL 의 Cas 폴리뉴클레오타이드 성분을 함유하는 개별 웰에 첨가하고, 전체 부피를 96-웰 Nucleocuvette™ Plate (Lonza, Allendale, NJ) 의 웰로 옮긴다. 플레이트를 Nucleofector™ 96-웰 Shuttle™ (Lonza, Allendale, NJ) 위로 로딩하고, 세포를 96-CM-130 Nucleofector™ 프로그램 (Lonza, Allendale, NJ) 을 사용하여 뉴클레오펙션시킨다. 뉴클레오펙션 후에, 70 μL DMEM 완전 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 50μL 의 세포 현탁액을 150μL 미리 데워진 DMEM 완전 배양 배지를 함유하는 콜라겐 코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트로 옮긴다. 플레이트를 그 후 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 37℃ 에서 5% CO2 에서 48 시간 동안 유지한다.
B. T7E1 어세이를 위한 표적 이중-가닥 DNA 생성
gDNA 를 HEK-293-SpyCas9 세포로부터 Cas 폴리뉴클레오타이드 성분 트랜스펙션 후 48 시간에 웰 당 50μL QuickExtract DNA 추출 용액 (Epicentre, Madison, WI) 을 사용하여 단리하고, 그에 뒤이어 37℃ 에서 10 분 동안, 65℃ 에서 6 분 동안 및 95℃ 에서 3 분 동안 인큐베이션하여 반응을 중단시킨다. gDNA 를 그 후 150μL 물로 희석하고, 샘플을 -80℃ 에서 저장한다.
T7E1 를 위한 DNA 를 단리된 gDNA 로부터 표적 이중-가닥 DNA 서열 (예를 들어, AAVS-1) 의 PCR 증폭에 의해 생성한다. PCR 반응을 주형으로서의 8μL gDNA 와 KAPA HiFi Hot Start 폴리머라제를 사용하고 0.5U 의 폴리머라제, 1x 반응 완충액, 0.4mM dNTPs 및 표적 이중-가닥 DNA (예를 들어, AAVS-1, 올리고뉴클레오타이드 K 및 L (도 13)) 로 지향되는 300nM 정방향 및 역방향 프라이머를 총 부피 25μL 로 함유하도록 설정한다. 표적 DNA 를 하기 조건을 사용하여 증폭시킨다: 95℃ 5 분 동안, 4 사이클의 98℃ 에서 20 s, 70℃ 에서 20 s, - 2℃/사이클, 72℃ 에서 30 s, 그에 뒤이어 30 사이클의 98℃ 에서 15 s, 62℃ 에서 20 s, 72℃ 에서 20 s, 및 최종 연장 72℃ 에서 1 분 동안.
C. T7E1 어세이
T7E1 어세이를 위한 PCR 증폭된 표적 이중-가닥 DNA 를 95℃ 에서 10 분 동안 변성시키고, 그 후 열 사이클러에서 -0.5℃/s 로 25℃ 까지 냉각시켜 다시 어닐링되게 허용한다. 다시 어닐링된 DNA 를 총 부피 15μL 의 1x NEBuffer 2 완충액 (New England Biolabs, Ipswich, MA) 중 0.5μL T7 엔도뉴클레아제 I 과 함께 25 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션한다. T7E1 반응물을 Fragment Analyzer™ System (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA) 및 DNF-910 Double-stranded DNA Reagent Kit (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA) 를 사용하여 분석한다. Fragment Analyzer™ System 은 각각의 절단 분절 및 절단 후에 남아 있는 표적 이중-가닥 DNA 의 농도를 제공한다.
표적 이중-가닥 DNA 의 절단 백분율을 각각의 절단 분절 및 절단이 일어난 후 남아 있는 표적 이중-가닥 DNA 의 농도로부터 하기 식을 사용하여 계산한다:
Figure pct00019
등식 1 에서, "frag1" 및 "frag2" 농도는 이중-가닥 DNA 표적의 Cas9 절단 분절의 농도에 해당하고, "parent" 는 절단이 일어난 후 남아 있는 표적 이중-가닥 DNA 에 해당한다.
진핵생물 세포에서 표적 변형의 검출을 위한 T7E1 어세이는 본원에 기재된 바와 같은 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템이 표적 이중-가닥 DNA 의 Cas9-매개되는 자리-특이적 생체내 절단을 촉진한다는 것을 입증하는 데이타를 제공한다. sn-casPNs 와 동일한 DNA 표적 결합 서열을 갖는 sgRNA 및/또는 tracrRNA/crRNA 폴리뉴클레오타이드를 또한 어세이에 포함시켜 구축물 사이에 Cas9-매개되는 자리-특이적 절단 백분율을 비교할 수 있다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 T7E1 어세이는 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 10
동정된 tracrRNAs 의 스플릿-넥서스 시험
이 실시예는, 예를 들어, 당업계에 알려져 있는 또는 실시예 8 에 기재된 방법에 의해 동정된 crRNA/tracrRNAs 에 기초하는, tracrRNAs 에서의 스플릿 넥서스 변형의 생성 및 시험을 기재한다.
5' 내지 3' 극성을 유지하면서 crRNA 서열을 tracrRNA 서열의 5' 에 배치하여, 링커 서열로 tracrRNA 서열 및 그것의 동족 crRNA 서열을 연결시켜, sgRNA 를 생성한다. 적합한 링커 서열은 5' -GAAA- 3' 이다.
sgRNA 를 공개적으로 입수가능한 RNA 폴딩 소프트웨어를 사용하여 2 차 구조적 모티프에 관해 분석한다. 하나의 그러한 소프트웨어는 RNAstructure (rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html) 이다.
sgRNA 의 2 차 구조를, 전통적으로, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트, 제 2 스템 엘리먼트를 포함하는 헤어핀 엘리먼트 (본원에서 넥서스 엘리먼트로 지칭됨), 및 넥서스 엘리먼트의 3' 에 위치하는 0, 1, 또는 2 개의 헤어핀 엘리먼트를 포함하는, Cas9 지정 절단 활성을 지지하는 알려진 sgRNA 에 유사한 2 차 구조에 관해 분석한다.
sgRNA 를 그 후 넥서스 엘리먼트에서 적어도 2 개의 폴리뉴클레오타이드로 쪼갠다: 5' 에서 3' 방향으로, 선별된 DNA 표적화 결합 서열, 제 1 스템 엘리먼트, 및 넥서스의 제 1 부분 (즉, 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I) 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, sn1-casPN, 도 3B); 및, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스의 제 2 부분 (즉, 스플릿 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II), 및 0, 1, 또는 2 개의 3' 헤어핀을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, sn2-casPN, 도 3B).
제 1 폴리뉴클레오타이드 서열 및 제 2 폴리뉴클레오타이드 서열의 라이브러리를 본 명세서의 실시예 1 에 기재된 방법을 사용하여 구축하며, 여기에서 sgRNA 의 넥서스에서의 스플릿은 선천 넥서스를 포함하는 서열의 각각의 뉴클레오타이드 위치에서 만들어진다.
라이브러리를 그 후 본 명세서의 실시예 2 내지 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 선별된 이중-가닥 DNA 표적의 Cas9 매개되는 절단을 지지하는 각각의 스플릿 넥서스 제 1 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그것의 동족 스플릿 넥서스 제 2 폴리뉴클레오타이드 서열의 능력에 관해 시험한다.
다양한 종으로부터의 알려진 tracrRNA 서열의 추정상의 스플릿 넥서스 배열이 도 12 에서 보여진다. 도면에서, 첫번째 열은 박테리아 종에 관한 식별 번호이고 (참고, 도 12, 표 7, 도면의 간단한 설명), 두번째 열은 sn1-casRNA/sn2-casRNA 의 서열이다. 본 발명의 스트렙토코쿠스 피오게네스 sn1-casRNA/sn2-casRNA 의 스플릿 넥서스가 참조를 위해 보여진다 (도 12, 열 1).
단일 종은 동일한 타입의 1 개 초과의 CRISPR 좌위, 또는 상이한 타입의 1 개 초과의 CRISPR 좌위 (예를 들어, 타입-I 및 타입-II) 를 가질 수 있다고 알려져 있다. 전형적으로 하나의 CRISPR 좌위의 리피트 엘리먼트는 오직 동일한 CRISPR 좌위 내에 함유된 항-리피트 엘리먼트 (및 그러므로 tracrRNA 서열) 를 동정하는데 사용가능하다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 시험은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿 넥서스-엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 11
DNA 표적-결합 서열을 포함하는 복수의 sn-casRNAs 의 스크리닝
이 실시예는 인간 게놈 DNA 에 존재하는 표적을 변형하고 그 자리에서 절단 활성의 수준을 측정하는 본 발명의 sn-casRNAs 의 사용을 예시한다. 표적 자리를 첫째로 게놈 DNA 로부터 선별하고, 그 후 그 선별된 서열을 표적화하도록 sn-casRNAs 를 디자인한다. 측정을 그 후 수행하여 일어난 표적 절단의 수준을 확인한다. 모든 하기 단계들이 매번의 스크리닝에 요구되는 것은 아니고, 단계들의 순서가 제시된 바와 같아야 하는 것은 아니고, 스크리닝은 기타 실험과 연결되거나, 또는 더 큰 실험의 일부를 형성할 수 있다.
A. 게놈 DNA 로부터 DNA 표적 영역의 선별
선별된 게놈 영역 내의 모든 PAM 서열 (예를 들어 'NGG') 을 동정한다.
PAM 서열에 5' 인접한 하나 이상의 20 뉴클레오타이드 서열 길이 서열 (표적 DNA 서열) 을 동정 및 선별한다.
선별 기준은 하기를 포함할 수 있으나 그에 제한되지 않는다: 게놈에서의 기타 영역에 대한 상동성; 퍼센트 G-C 함량; 용융 온도; 스페이서 내의 동종중합체의 존재; 및 당업자에게 알려진 기타 기준.
동정된 표적 DNA 서열의 3' 말단에 적당한 sn-casRNA 서열 (예를 들어, 스페이서 서열이 제거된, 도 3B 에 도시된 바와 같은, sn1-casRNA) 을 첨부한다 (sn-casRNA-DNAtbs (DNA 표적 결합 서열)). sn-casRNA-DNAtbs 구축물을 전형적으로 상업적 제조자에 의해 합성하거나 또는 실시예 1 에 기재된 바와 같이 시험관내 전사에 의해 생산한다.
본원에 기재된 바와 같은 sn-casRNA-DNAtbs 를 동족 sn-casRNA(s) 와 함께 사용하여, 동족 Cas9 단백질과 함께 사용하기 위한 sn-casRNA 시스템 (예를 들어, sn1-casRNA-DNAtbs/sn2-casRNA 이 폴리뉴클레오타이드 스플릿 넥서스 시스템) 을 완성시킨다.
B. 절단 백분율 및 특이성의 확인
sn-casRNA-DNAtbs/sn-casRNA(s) 시스템과 관련되는 시험관내 절단 백분율 및 특이성을, 예를 들어, 실시예 3 의 Cas9 절단 어세이를 사용하여, 다음과 같이 비교한다:
(a) 오직 단일 표적 DNA 서열이 동정 또는 선별되는 경우에, DNA 표적 영역에 관한 절단 백분율 및 특이성을 확인한다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성을 추가의 실험들에서 RNA 의 변형, 효과기 단백질/효과기 단백질-결합 서열 또는 리간드/리간드 결합 모이어티의 도입을 포함하나 그에 제한되지 않는 본 발명의 방법을 사용하여 변화시킨다.
(b) 절단 어세이로부터 얻은 백분율 절단 데이타 및 자리-특이성 데이타를 표적 결합 서열을 포함하는 상이한 DNAs 사이에 비교하여 최상 절단 백분율 및 최고 특이성을 갖는 표적 DNA 서열을 동정한다. 절단 백분율 데이타 및 특이성 데이타는 여러 가지 적용을 위한 선택이 기초하는 기준을 제공한다. 예를 들어, 일부 상황에서 sn-casRNA 의 활성은 가장 중요한 인자일 수 있다. 기타 상황에서, 절단 자리의 특이성은 절단 백분율보다 상대적으로 더욱 중요할 수 있다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성을 추가의 실험들에서 RNA 의 변형, 효과기 단백질/효과기 단백질-결합 서열 또는 리간드/리간드 결합 모이어티의 도입을 포함하나 그에 제한되지 않는 본 발명의 방법을 사용하여 변화시킨다.
임의로, 또는 시험관내 분석 대신에, sn-casRNA-DNAtbs/sn-casRNA(s) 시스템과 관련되는 생체내 절단 백분율 및 특이성을, 예를 들어, 실시예 4 의 진핵생물 세포에서 표적 변형의 검출을 위한 딥 시퀀싱 분석을 사용하여, 다음과 같이 비교한다:
(a) 오직 표적 DNA 서열이 동정되는 경우에 DNA 표적 영역에 관한 절단 백분율 및 특이성을 확인한다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성을 추가의 실험들에서 RNA 의 변형, 효과기 단백질/효과기 단백질-결합 서열 또는 리간드/리간드 결합 모이어티의 도입을 포함하나 그에 제한되지 않는 본 발명의 방법을 사용하여 변화시킨다.
(b) 절단 어세이로부터 얻은 백분율 절단 데이타 및 자리 특이성 데이타를 상이한 표적 DNAs 사이에 비교하여 표적 DNA 에 관한 최고 백분율 절단 또는 표적 DNA 및 최고 특이성을 초래하는 sn-casRNA 서열을 동정한다. 절단 백분율 데이타 및 특이성 데이타는 여러 가지 적용을 위한 선택이 기초하는 기준을 제공한다. 예를 들어, 일부 상황에서 sn-casRNA 의 활성은 가장 중요한 인자일 수 있다. 기타 상황에서, 절단 자리의 특이성은 절단 백분율보다 상대적으로 더욱 중요할 수 있다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성을 추가의 실험들에서 RNA 의 변형, 효과기 단백질/효과기 단백질-결합 서열 또는 리간드/리간드 결합 모이어티의 도입을 포함하나 그에 제한되지 않는 본 발명의 방법을 사용하여 변화시킨다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 스크리닝은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 12
기능적 게놈 스크리닝
이 실시예는 기능적 스크리닝 방법 및 서열 데이타를 이용하는 유전자의 기능적 역할의 동정을 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다.
이-부분 sn-casRNA (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 시스템 (참고, 예를 들어, 도 3B) 을 Shalem, 등, "Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells," Science, 3, 343(6166), 84-87 (2014) 및 Zhou, 등, "High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells," Nature, 509, 487-491 (2014) (이는 연속 서열을 갖는 단일 가이드 RNA 를 사용했음) 에 기재된 방법의 수정에 사용한다. 본원에 기재된 스크린은 약물 베메라페닙에 대한 A375 흑색종 세포주의 취약성에 맞춰 디자인된다; 베무라페닙으로 처리될 때, 세포 성장은 저지된다. A375 세포를 sn1-casRNA 의 라이브러리로 형질도입하고, 이들 세포를 후속적으로 베메라페닙으로 처리한다. 베메라페닙에 대한 A375 민감도에 중요한 유전자의 sn1-casRNA 녹아웃은 살아 남은 세포 집단에서 풍부해질 것이고, 시퀀싱 및 동정될 수 있다.
적합한 벡터, 배지, 배양 조건 등의 예는 기재되어 있다. 이들 성분 및 조건의 수정은 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에 의해 이해될 것이다.
A. 렌티바이러스 라이브러리 및 Cas9 구축물
렌티바이러스 생산을 위한 트랜스퍼 플라스미드 (예를 들어 pD2107-CMV -DNA 2.0, Menlo Park, CA) 내로 클로닝하기 위한 범용 (universal) 태그 서열에 첨부된 디자인된 스페이서 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 sn1-casRNAs 의 바이러스 라이브러리를 생성한다.
올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 프로그램가능한 마이크로어레이에서 합성하고, 마이크로어레이로부터 어레이 제조자 (예를 들어 Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 에 의해 절단한다. 전장 올리고뉴클레오타이드를 PCR 에 의해 Q5 폴리머라제 (NEB) 및 범용 태그 서열을 함유하는 DNA 를 증폭시키도록 디자인된 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 트랜스퍼 벡터 내로의 클로닝을 당업자에게 알려진 표준 기술을 사용하여 수행한다. 하나의 예는 벡터를 타입 II 제한 효소 (예를 들어 BsbI) 로 소화시켜 단일-가닥 오버행을 드러내고, 알칼리성 포스파타아제 (Fermentas) 로 처리하고, 잘린 벡터를 안잘린 벡터로부터 겔 정제에 의해 정제하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 제한 효소로 소화시켜 호환가능한 말단 (compatible ends) 을 드러내고, DNA 리가아제 (Fermentas) 를 사용하여 벡터 내로 결찰시킨다.
트랜스퍼 벡터는 신장 인자-1α 짧은 프로모터 (EFS) 프로모터의 제어 하의 SV40 핵 국소화 신호로 N-말단에서 및 C-말단에서 태그된 인간 코돈 최적화된 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 NLS-Cas9-NLS 서열을 2A 자가-절단성 펩티드 및 포유류 세포에 적합한 선별 마커 (즉 푸로마이신) 에 연결시킨다.
대안적으로, Cas9 를 세포에 별도의 바이러스 벡터로 전달할 수 있거나, 또는 Cas9 를 구성적으로 발현하는 안정적 세포주를 생성할 수 있다. 바이러스 벡터-발현되는 sn1-casRNA 라이브러리를 그 후 사용하여 Cas9-발현 세포주를 형질도입시킬 수 있다.
B. 렌티바이러스 생산 및 정제
HEK293T 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS) 이 보충된 DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) 에 트랜스펙션 전 24 시간에 대략 40% 컨플루언스에서 시딩한다. 세포를 환원 혈청 OptiMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) 내로 전달하고, Lipofectamine 2000 및 Plus 시약을 제조자의 지침에 따라 사용하여 트랜스펙트시킨다. 트랜스펙션을 위해, 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터를 렌티바이러스 패키징을 위한 플라스미드 예컨대 Lenti-X™ HTX 패키징 시스템 (Takara Clontech, Mountain View, CA) 와 제조자의 지침에 따라 조합한다.
60 시간 후에, 배지를 제거하고 3000 rpm 에서 원심분리하여 세포 조직파편을 제거한다. 상청액을 0.45um 낮은 단백질 결합 막 (예를 들어 Millipore Steriflip HV/PVDF) 을 통해 여과한다. 푸울된 라이브러리를 초원심분리에 의해 농축시키고 그 후 10% FBS 및 1% BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 이 보충된 DMEM 에 재현탁시킨다.
C. 세포 배양
A375 (ATCC CRL-1619) 세포를 American Type Cell Culture (Manassas, VA) 로부터 얻고, 10% FBS (Life Technologies, Grand Island, NY), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 이 보충된 R8758 배지 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 에서 배양한다.
D. 렌티바이러스 형질도입
바이러스 벡터 라이브러리에 관한 감염 다중도 (MOI) 를 예정된 바이러스 부피로 세포를 형질도입하는 것에 기초하는 표준 방법을 사용하여 확인한다. 12 웰 플레이트 위에 8 ㎍/ml 폴리브렌 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 이 보충된 적당한 배지에 웰 당 대략 3x106 A375 세포를 플레이팅한다. 세포를 예정된 바이러스 부피와 혼합하여 0.3-0.5 사이의 감염 다중도 (MOI) 를 확인한다. 플레이팅된 세포를 2,000 rpm 에서 2 시간 동안 37℃ 에서 원심분리하고, 그 후에 배지를 흡입하고 각각의 세포 유형에 관한 신선한 배지를, 폴리브렌 없이 첨가한다. 세포를 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션한다. 비-형질도입된 대조군이 포함된다.
24 시간 후에, 세포를 탈착 및 계수하고, 대략 2.5x106 세포를 "선별 웰" 및 "비-선별 웰" 둘다 내로 다시 플레이팅한다. 선별 웰을 렌티바이러스 라이브러리 구축물에 특이적인 선별 하에 둔다 (즉 푸로마이신, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 비-선별 웰은 푸로마이신으로 처리하지 않는다. 비-형질도입된 대조군에서 선별 하에 놓인 살아 남은 세포가 남아 있지 않을 때까지 세포를 인큐베이션한다. 세포를 계수하고, "선별 웰" 내의 세포의 수를 상응하는 '비-선별 웰' 내의 세포의 수로 나누고 100 을 곱하여 MOI 를 산출하며, 0.4 에 가까운 MOI 가 이상적인 값이다.
E. 약물 저항성 스크린
세포를 웰 내로 시험될 각각의 조건에 관해 웰 당 2x106 세포를 플레이팅한다. 각각의 웰 내의 세포를 10ul 의 라이브러리로 형질도입시켜 형질도입 효율 30% 에 도달시킨다 (라이브러리 내의 클론 당 최소 3-400 세포). 형질도입 후 24 시간에 푸로마이신을 웰에 첨가하고, 세포를 7 일 동안 유지한다. 세포를 약물 조건 내로 듀플리케이트 (duplicate) 로 레플리케이트 웰 당 최소 2x 107 세포로 나눈다. 하나의 웰에 2uM 약물 화합물 (예를 들어 PLX4032, Thermo Fisher Scientific, South San Francisco, CA) 을 보충하고, 다른 웰에 DMSO (Thermo Fisher Scientific, South San Francisco, CA) 를 보충한다. 세포를 37℃, 5% CO2 에서 14 일 동안 인큐베이션하고, 적절히 PLX4032 또는 DMSO 로 보충된 신선한 배지 내로 2-3 일 마다 계대시킨다. 14 일 후에, QuickExtract DNA 추출 용액 (Illumina, San Diego, CA) 을 제조자 지침에 따라 사용하여 세포로부터 게놈 DNA (gDNA) 를 제조한다.
F. gDNA 시퀀싱
게놈 DNA 로부터 렌티바이러스 sn1-casPN 표적 서열을 증폭시키도록 PCR 프라이머를 디자인한다. 단리된 gDNA 를 사용하여, 제 1 PCR 을 Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent, Santa Clara, CA) 와 어댑터 서열 및 렌티바이러스 sn1-casPN 카세트에 특이적인 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 수행한다. 제 2 PCR 을 제 1 라운드의 앰플리콘을 주형으로서 제 2 PCR 반응 부피의 1/20th 부피로 사용하여 수행한다. 제 2 PCR 은 하기를 포함하는 제 2 세트의 프라이머를 사용한다: 제 1 프라이머 쌍의 범용 어댑터 서열에 상보적인 서열, 각각의 샘플에 독특한 바코드 인덱스 서열, 및 플로우 셀 어댑터 서열. PCR 반응을 푸울하여 각각의 형질도입된 샘플의 300x 시퀀싱 커버리지를 보장한다. 푸울된 PCR 반응을 2% TBE 겔에서 분석하고, 예상된 앰플리콘 크기의 밴드를 QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Venlo, Netherlands) 를 사용하여 겔 정제한다. 정제된 앰플리콘의 농도를 dsDNA BR Assay Kit 및 Qubit System (Life Technologies, Grand Island, NY) 을 사용하여 평가하고, 라이브러리 품질을 Agilent DNA100Chip 및 Agilent Bioanalyzer 2100 System (Agilent, Santa Clara, CA) 을 사용하여 확인한다. 푸울된 라이브러리를 MiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA) 에서 시퀀싱한다.
G. 시퀀싱 데이타의 가공 및 분석
미가공 시퀀싱 리드를 오직 sn1-casPN 카세트 서열을 함유하도록 가공한다. sn1-casPN 리드를 렌티바이러스 스크리닝 라이브러리 내에 함유된 표적 서열에 대해 정렬하고, 각각의 독특한 표적 서열에 관한 리드의 수를 계수한다. 표적 서열 당 계수된 리드를, 표적 당 리드를 샘플 내의 모든 표적에 관한 총 정렬된 리드로 나누고 106 을 곱하고 1 을 더하여 정규화시킨다.
약물-처리된 샘플에서 동정된 정규화된 표적 리드를 DMSO 대조군 처리된 샘플에서 동정된 정규화된 표적 리드와 비교한다. DMSO 대조군 처리된 샘플에서 부재하거나 또는 감소된 약물 처리된 샘플에 존재하는 높은 리드 계수의 표적은 약물 치료에 대한 저항성에서 중요한 후보 유전자로서 추가로 평가될 수 있다.
sn1-casRNA 라이브러리를 사용하는 기타 기능적 게놈 스크린 및 본원에 개요서술된 스크리닝 방법은 그 스크린에서 중요한 후보 유전자를 동정하는데 사용될 수 있다.
이러한 절차는 본 발명의 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 유전자-기능을 게놈-와이드 규모로 조사하는 기능적 스크리닝에서 사용될 수 있다는 것을 확인해주는 데이타를 제공한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 스크리닝은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 13
억제/활성화
이 실시예는 인간 세포에서 내인성 유전자의 억제 또는 활성화를 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다.
이-부분 sn-casRNA (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 시스템 (참고, 예를 들어, 도 3B) 을 Gilbert 등, "CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes," Cell, 154(2), 442-51, doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044 (2013) (이는 연속 서열을 갖는 단일 가이드 RNA 를 사용했음) 에 기재된 방법의 수정에 사용한다.
적합한 벡터, 배지, 배양 조건 등의 예는 기재되어 있다. 이들 성분 및 조건의 수정은 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에 의해 이해될 것이다.
A. dCas9 활성화인자 및 억제인자 구축물
돌연변이 D10A 및 H840A 를 갖는 뉴클레아제 결핍성 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (dCas9) 를 포유류 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, SV40 핵 국소화 신호 및 Kruppel 연합된 박스 (KRAB) 억제 도메인 (dCas9-KRAB) 또는 네 카피의 전사 활성화인자 VP16 (dCas9-VP64) 로 C-말단에서 태그한다. dCas9-KRAB 및 dCas9-VP64 둘다를 벡터 내에 적합한 포유류 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터에 인접하게 삽입한다. 하나의 그러한 벡터, pJ607-03 (DNA2.0, Menlo Park, CA) 은 상업적으로 입수가능하다.
B. sn-casPN 구축
sn1-casRNA-CD71 서열은 트랜스페린 수용체 CD71 의 업스트림 미번역 영역 (UTR) 을 향해 표적화되는 20 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함한다. sn1-casRNA-CD71 서열을 독립적 sn2-casRNA 서열을 또한 포함하는 적합한 벡터 내로 조립한다. 각각의 서열은 RNA 폴리머라제 III 에 의한 전사를 지시하는 인간 U6 프로모터에 의한 독립적 제어 하에 있다. sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 서열의 발현에 적합한 하나의 벡터 백본은 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, Merck, Darmstadt, Germany) 이다.
C. 세포 배양
HeLa (ATCC CCL-2) 세포를 American Type Cell Culture (Manassas, VA) 로부터 얻고, 10% FBS (Life Technologies, Grand Island, NY), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 2 mM 글루타민 (Life Technologies, Grand Island, NY) 이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) 에서 배양시키고, 37℃, 5% CO2 에서 배양한다.
D. 트랜스펙션 및 FACS 소팅
HeLa 세포를 동등 중량 Cas9-함유 플라스미드 및 sn1-casRNA-CD71 벡터로 TransIT-LT1 (Mirus, Madison, WI) 을 사용하여 일시적으로 트랜스펙트한다. 비-트랜스펙트된 대조군이 포함된다. 트랜스펙션 후 72 시간에 세포를 트립신화하고 (Life Technologies, Grand Island, NY), 10nM EDTA-PBS (Lonza, Allendale, NJ) 로 해리시킨다. 세포를 FITC 형광단 (eBioscience, San Diego, CA) 에 접합된 항-인간 CD71-특이적 항체의 존재 하에 Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, San Diego, CA) 에서 인큐베이션한다. 트랜스펙트된 세포의 형광-활성화되는 세포 소팅 (FACS) 을 CD71-FITC 항체의 검출을 위한 LSR II 플로우 사이토미터 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 및 블루 레이저 (여기 488nm) 를 사용하여 예비형성한다.
dCas9-VP64 트랜스펙트된 샘플에서 CD71 발현의 활성화는 FACS 소팅에 의해 검출되는 HeLa 세포의 비-트랜스펙트된 대조군 집단의 측정된 형광과 비교되는 검출된 형광 (a.u. Log10) 의 증가에 의해 측정된다.
dCas9-KRAB 트랜스펙트된 샘플에서 CD71 발현의 억제는 FACS 소팅에 의해 검출되는 HeLa 세포의 비-트랜스펙트된 대조군 집단의 측정된 형광과 비교되는 검출된 형광 (a.u. Log10) 의 감소에 의해 측정된다.
기타 유전자는 본 발명의 sn-casPN 및 본원에 개요서술된 방법을 사용하여 유사하게 활성화 또는 억제된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 기타 활성화 및 억제 도메인이 dCas9 에 융합되어 본원에 기재된 방법과 유사한 결과를 달성할 수 있다.
이러한 절차는 본 발명의 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 내인성 유전자의 활성화 또는 억제에서 사용될 수 있다는 것을 확인해주는 데이타를 제공한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 억제/활성화 어세이는 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 14
산업적 적용을 위한 CHO 세포의 변형
이 실시예는 CHO 세포의 게놈을 변형하기 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다. 이 실시예에서 또한 함유되는 것은 산업적 적용에서 미래의 용도 (즉 항체의 생산) 를 위한 sn-casPN 변형된 세포의 서열 검증 및 선별에 관한 개요이다.
이-부분 sn-casRNA (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 시스템 (참고, 예를 들어, 도 3B) 을 Ronda 등, "Accelerating genome editing in CHO cells using CRISPR Cas9 and CRISPy, a web-based target finding tool," Biotechnology and Bioengineering, 111(8), 1604-1616, (2014) (이는 연속 서열을 갖는 단일 가이드 RNA 를 사용했음) 에 기재된 방법의 수정에 사용한다.
적합한 벡터, 배지, 배양 조건 등의 예는 기재되어 있다. 이들 성분 및 조건의 수정은 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에 의해 이해될 것이다.
A. 플라스미드 구축
스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 서열을 CHO 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, SV40 핵 국소화 신호로 C-말단에서 태그하고, 벡터 내에 적합한 포유류 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터에 인접하게 삽입한다. 하나의 그러한 벡터, pJ607-03 (DNA2.0, Menlo Park, CA) 은 상업적으로 입수가능하다.
sn1-casRNA-FUT8 서열은 20 뉴클레오타이드 FUT8 스페이서 서열을 포함한다. sn1-casRNA-FUT8 서열을 독립적 sn2-casRNA 서열을 또한 포함하는 적합한 벡터 내로 조립한다. 각각의 서열은 RNA 폴리머라제 III 에 의한 전사를 지시하는 U6 프로모터에 의한 독립적 제어 하에 있다. sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 서열의 발현에 적합한 하나의 벡터 백본은 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, Merck, Darmstadt, Germany) 이다.
B. 세포 배양
CHO-K1 세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA) 로부터 얻고, CHO-K1 F-12K 배지 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), 10% FBS (Life Technologies, Grand Island, NY) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 에서 배양한다. CHO-K1 세포를 동등 중량 Cas9 함유 플라스미드 및 sn1-casRNA-FUT8/sn2-casRNA 포함 벡터로 Nucleofector 2b Device (Lonza, Allendale, NJ) 및 Amaxa Cell line Nucleofector Kit V (Lonza, Allendale, NJ) 를 제조자 권고에 따라 사용하여 트랜스펙트한다. 세포를 30℃ 에서 5% CO2 에서 첫번째 24 시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 37℃, 5% CO2 로 또다른 24 시간 기간 동안 옮긴다.
C. FUT8 녹아웃 세포의 선별
FUT8 녹아웃 세포를 Cas9 벡터 및 sn1-casRNA-FUT8 의 트랜스펙션 후 5 일에 50 μg/mL 렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris) 응집소 (LCA, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 를 첨가하여 선별한다. 세포를 LCA 를 이용한 7 일의 선별에 적용하고, 세포를 계대시키고, 신선한 배지를, LCA 와 함께, 2-3 일 마다 또는 필요에 따라 첨가한다. sn-casPN 시스템에 의해 야기되는, Fut8 유전자에서의 파괴가 있는 세포만 LCA 에 대한 저항성을 가질 것이다.
FUT8 녹아웃을 확인하기 위해서, 선별된 세포를 완전 배지 내로 LCA 없이 다시 시딩하고, 48 시간 동안 인큐베이션한다. 다시 시딩한 후에, 게놈 DNA (gDNA) 를 QuickExtract DNA 추출 용액 (Illumina, San Diego, CA) 을 제조자 지침에 따라 사용하여 프렙한다.
D. Cas9 변형 및 Miseq 라이브러리 구축의 서열 검증
150bp-200bp 사이의 시퀀싱 앰플리콘을 sn1-casRNA-FUT8 표적 자리를 포괄하도록 디자인한다. 이전에 단리된 gDNA 를 사용하여, 제 1 PCR 을 Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent, Santa Clara, CA) 와 어댑터 서열 및 FUT8 표적 자리 측면에 있는 영역에 특이적인 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 수행한다. 제 2 PCR 을 PCR 의 제 1 라운드의 앰플리콘을 주형으로서 at PCR 반응 부피의 1/20th 부피로 사용하여 수행한다. 제 2 PCR 은 하기를 포함하는 제 2 세트의 프라이머를 사용한다: 제 1 프라이머 쌍의 어댑터 서열에 상보적인 서열, 각각의 샘플에 독특한 바코드 인덱스 서열, 및 플로우 셀 어댑터 서열. 앰플리콘을 푸울하고, 2% TBE 겔에서 분석하고, 예상된 앰플리콘 크기의 밴드를 QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Venlo, Netherlands) 를 사용하여 겔 정제했다. 정제된 앰플리콘의 농도를 Double-strand DNA BR Assay Kit 및 Qubit System (Life Technologies, Grand Island, NY) 을 사용하여 평가하고, 라이브러리 품질을 Agilent DNA100Chip 및 Agilent Bioanalyzer 2100 System (Agilent, Santa Clara, CA) 을 사용하여 확인한다. 라이브러리 품질의 검증 후에, 라이브러리를 MiSeq Benchtop Sequencer (Illumina, San Diego, CA) 에서 MiSeq Reagent Kit v2 (300 사이클, Illumina, San Diego, CA) 를 제조자 지침에 따라 사용하여 151bp 쌍을 이룬 말단 리드에 관해 시퀀싱한다.
E. 딥 시퀀싱 데이타 분석
시퀀싱 데이타에서 산물의 동일성을 PCR 의 제 2 라운드에서 앰플리콘에 맞춰 조정된 인덱스 바코드 서열에 기초하여 확인했다 . 하기 과제를 수행함으로써 컴퓨터 스크립트를 사용하여 MiSeq 데이타를 가공했다:
1. 쌍을 이룬 말단 리드를 fastq-join (Aronesty 2011: code.google.com/p/ea-utils) 을 사용하여 연결시킨다
2. fastx_barcode_splitter (hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html) 를 사용하여 리드 서열의 5' 및 3' 말단 둘다에 존재하는 적당한 프라이머 서열에 관해 서열 리드를 검증한다. 양쪽 말단에서 올바른 프라이머 서열을 결여하는 리드는 버린다.
3. 리드 서열을 예상된 야생형 FUT8 서열과 비교하고, 일치하는 리드 서열을 동일한 indel 변형을 갖는 것으로 분류한다.
sn1-casRNA 에 관한 적당한 스페이서 서열의 선별에 의해 CHO 세포 내의 기타 염색체 좌위를 유사하게 변형시킨다. 선별은 특정 유전자 표적에 특이적이고 이 실시예에서 개요서술된 절차는 기타 유전자 표적에 관해 당업자에 의해 쉽게 수정가능하다.
이러한 절차는 본 발명의 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 CHO 세포 내의 표적된 좌위에서 서열 특이적 RNA-지정 엔도뉴클레아제 활성을 제공한다는 것을 확인해주는 데이타를 제공하고, 계속된 사용을 위한 상기 변형된 CHO 세포의 선별 방법을 개요서술한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 어세이는 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 15
사카로마이세스 세레비지애에서의 게놈 조작
이 실시예는 효모 사카로마이세스 세레비지애의 게놈을 변형시키기 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다.
이-부분 sn-casRNA (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 시스템 (참고, 예를 들어, 도 3B) 을 DiCarlo, 등, "Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems," Nucleic Acids Res., 41(7), 4336-43 (2013) (이는 연속 서열을 갖는 단일 가이드 RNA 를 사용했음) 의 방법의 수정에 사용한다.
적합한 벡터, 배지, 배양 조건 등의 예는 기재되어 있다. 이들 성분 및 조건의 수정은 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에 의해 이해될 것이다.
A. 자리-특이적 게놈 돌연변이
효모 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 유전자를 SV40 핵 국소화 신호로 C-말단에서 태그하고, 낮은 카피수 벡터 내에 유도가능한 프로모터, 예를 들어, GalL 프로모터 서열에 인접하게 삽입한다. 벡터는 또한 선별가능한 마커, 예컨대 URA3 선별가능한 마커를 함유한다. 하나의 그러한 벡터, p415-GalL-Cas9-CYC1t (Addgene, Cambridge, MA) 는 상업적으로 입수가능하다. Cas9 유전자의 발현은 GalL 프로모터의 유도가능한 제어 하에 있다.
sn1-casRNA-CAN1.Y 서열은 20 뉴클레오타이드 CAN1.Y 스페이서 서열을 포함한다. sn1-casRNA-CAN1.Z 는 20 뉴클레오타이드 CAN1.Z 스페이서 서열을 포함한다. 발현 카세트를 각각의 sn1-casRNA, SNR52 프로모터, 및 SUP4 30 측면 서열을 포함하도록 조립한다. 각각의 발현 카세트를 2 micron 복제 원점 및 선별가능한 마커, 예를 들어, p426 를 포함하는 벡터 내로 조립한다. sn1-casRNA 발현 카세트를 인코딩하는 DNA 서열을 HIS3 선별가능한 마커를 함유하는 벡터 내로 삽입한다. sn2-casRNA 발현 카세트를 인코딩하는 DNA 서열을 LEU2 선별가능한 마커를 함유하는 벡터 내로 삽입한다. sn-casRNA 인코딩 서열에 적합한 하나의 백본 벡터는 p426 GPD (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 이며, 여기에서 URA3 코딩 서열은 돌연변이 또는 결실되고 적당한 선별가능한 마커가 삽입되어 있다. sn-casRNA 서열의 발현은 RNA 폴리머라제 III 에 의한 전사를 지시하는 SNR52 프로모터의 구성적 제어 하에 있다.
Cas9 벡터 및 각각의 sn1-casRNA/sn2-casRNA 벡터 쌍을 표준 방법을 사용하여 ATCC 200895 (MATa his3delta200 leu2delta0 met15delta0 trp1delta63 ura3delta0) (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 내로 형질전환하고, 우라실, 히스티딘 또는 류신이 없는 SC 드롭아웃 배지를 사용하여 벡터의 존재에 관해 선별한다. sn1-casRNA-CAN1.Y, sn1-casRNA-CAN1.Z, sn2-casRNA, 및 Cas9 를 포함하는 개별 벡터를 ATCC 200895 내로 형질전환하여 음성 대조군 효모 균주를 또한 구축한다. 적당한 선별 배지를 각각의 벡터에 사용한다.
Cas9 및 sn1-casRNA/sn2-casRNA 를 포함하는 세포를 우라실, 히스티딘 및 류신을 함유하지 않고 2% 갈락토스 및 1% 라피노스를 함유하는 액체 SC 드롭아웃 배지에서 배양한다. 세포를 대략 16 시간 동안 성장시키고, 펠렛화하고, YPAD, 60 mg/ml L-카나바닌 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 을 함유하는 SC-우라실-히스티딘-류신 플레이트, 및 100 mg/ml 티아라이신 (S-2-아미노에틸-l-시스테인, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 을 함유하는 SC-라이신 플레이트에 플레이팅한다. 대략 107-108 세포를 카나바닌 및 티아라이신을 함유하는 배지에 플레이팅하고, 세포를 풍부 배지에 플레이팅하기 위해 적당히 희석한다.
각각의 배양물에 관해 카나바닌 또는 티아라이신 플레이트 상의 콜로니 총수를 풍부 배지 (YPAD) 플레이트 상의 콜로니 총수로 나눈 비율을 돌연변이 빈도의 척도로서 사용한다. 음성 대조군 균주를 유사하게 배양하고 플레이팅한다.
잠재적 게놈-와이드 돌연변이유발자 표현형에 관해 제어하기 위해, 독성 라이신 유사체, 티아라이신을 사용하여 lyp1 돌연변이체에 관해 선별함으로써 비-표적화된 내인성 LYP1 유전자, 라이신 퍼미아제의 돌연변이 빈도를 모니터링한다.
LYP1 및 CAN1 유전자는 별도의 염색체 상에 있다. 따라서, 각각의 좌위에서의 국소 돌연변이 빈도는 게놈-와이드 돌연변이유발자의 부재 하에 독립적일 것이다.
sn1-casRNA-CAN1.Y/sn2-casRNA 는 Cas9 엔도뉴클레아제 활성을 CAN1 유전자의 시작 코돈의 207bp 다운스트림에 위치하는 표적 자리로 지향시킨다. sn1-casRNA-CAN1.Z/sn2-casRNA 는 Cas9 엔도뉴클레아제 활성을 CAN1 유전자의 ATG 시작 코돈의 58bp 다운스트림에 위치하는 표적 자리로 지향시킨다.
Cas9 의 발현이 갈락토스에 의해 유도될 때, YPAD 배지와 비교되는, 60 mg/ml L-카나바닌을 함유하는 SC-우라실-히스티딘-류신 플레이트에서의 세포 생활력의 감소는 CAN1 유전자에서의 더 높은 돌연변이 빈도를 시사한다. LYP1 유전자에서의 돌연변이율은 배경 돌연변이율의 지시를 제공한다. LYP1 유전자 돌연변이율이 모든 균주 전체에 걸쳐 일정하게 유지될 때 그것은 sn1-casRNA/sn2-casRNA 및 Cas9 시스템이 게놈 전체에서 무작위 돌연변이를 유도하지 않는다는 것을 시사한다. 돌연변이가 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템에 의해 야기된다는 것을 추가로 검증하기 위해서, CAN1 유전자를 카나바닌 저항성 집단으로부터 단리하고 시퀀싱할 수 있다. 서열을 그 후 정렬하여, sn1-casRNA 에 존재하는 표적 결합 서열 (즉, 스페이서 서열) 에 상대적인 CAN1 유전자 내의 돌연변이의 위치 및 유형을 확인한다.
sn1-casRNA 에 관한 적당한 스페이서 서열의 선별에 의해 사카로마이세스 세레비지애 내의 기타 염색체 좌위를 변형을 위해 유사하게 표적화한다.
이 분석은 본 발명의 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 효모에서 표적화된 내인성 게놈 좌위에서 특이적 RNA-지정 엔도뉴클레아제 활성을 제공한다는 것을 확인해주는 데이타를 제공한다.
B. 공여자 DNA 와의 자리-특이적 상동 재조합
KanMX 올리고뉴클레오타이드 서열을 효모에서 유전자 녹아웃의 유발에 흔히 사용되는 pFA6a-KanMX6 플라스미드로부터의 CAN1 좌위에 대한 50bp 상동성 아암으로 PCR 증폭시킨다. KanMX 를 공여자 DNA 로서 사용한다. KanMX 올리고뉴클레오타이드는 G418 저항성을 부여하고, CAN1.Y 연합된 PAM 서열을 파괴하도록 디자인된다. 통합되면, 이러한 공여자 DNA 는 카나바닌 저항성 및 G418 저항성을 초래한다.
sn1-casRNA-CAN1.Y, sn2-casRNA, Cas9 발현 벡터를 함유하는 세포를 우라실, 히스티딘 및 류신이 없는 SC 드롭아웃 배지에서 포화 상태까지 성장시킨다. 이러한 배양물을 사용하여 우라실, 히스티딘 및 류신이 없는 액체 SC 배지를 접종하고, 배양물을 대략 1.8 의 OD600 까지 성장시킨다. 세포를 원심분리를 통해 수집하고, 공여자 올리고뉴클레오타이드를 전기천공법에 의해 세포 내로 형질전환시킨다. 전기천공된 세포를 2% 갈락토스 및 1% 라피노스를 함유하는 SC-ura-his-leu 배지 내로 옮기고, 대략 12 시간 동안 성장시킨다. 음성 대조군 균주는 유사하게 처리하지만, 공여자 올리고뉴클레오타이드는 제공하지 않는다.
대략 106 -107 세포를 선별적 배지에 플레이팅하고, 세포를 풍부 배지에서 적당히 희석한다. 음성 대조군 균주를 유사하게 배양하고, 플레이팅한다.
플라스미드를 함유하는 콜로니를 카나바닌 배지 뿐만 아니라 G418 함유 풍부 배지에 레플리카 플레이팅하여 KanMX 통합 사건에 관해 선별한다. 풍부 플레이트 상의 콜로니 총수에 대한 선별적 플레이트 상의 콜로니 총수 (즉, 카나바닌 및 G418 둘다에 저항성인 콜로니) 의 비율을 수정 빈도의 척도로 사용하며, 이 비율은 sn1-casRNA/sn2-casRNA 지정 절단의 자리에서 KanMX 서열의 상동 재조합을 시사한다. 통합 사건이 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템에 의해 지시된다는 것을 추가로 검증하기 위해서, 통합된 KanMX 서열을 포함하는 CAN1 유전자를 카나바닌/G418 저항성 집단으로부터 단리하고 시퀀싱할 수 있다. 서열을 그 후 정렬하여, sn1-casRNA 에 존재하는 표적 결합 서열 (즉, 스페이서 서열) 에 상대적인 CAN1 유전자 내의 삽입의 위치 및 유형을 확인한다.
sn1-casRNA 및 공여자 올리고뉴클레오타이드에 관한 적당한 스페이서 서열의 선별에 의해 사카로마이세스 세레비지애 내의 기타 염색체 좌위를 변형을 위해 유사하게 표적화한다. 내인성 유전자의 파괴 없이 기능적 유전자가 사카로마이세스 세레비지애 게놈 내로 도입될 수 있다. 또한, 내인성 표적 유전자 내로의 선별가능한 마커의 도입이 사용되어 표적 유전자의 선별가능한 녹-아웃 돌연변이를 제공할 수 있다.
이 분석은 본 발명의 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 효모에서 표적화된 내인성 게놈 좌위에서 특이적 RNA-지정 엔도뉴클레아제 활성을 제공하고 그러한 좌위에서 공여자 DNA 를 사용하여 상동 재조합 사건을 자극할 수 있다는 것을 확인해주는 데이타를 제공한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 방법은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 16
제아 메이스에서의 표적화된 돌연변이유발
이 실시예는 식물에서 게놈 변형을 유발하기 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다. 이 성분 sn-casRNA 폴리뉴클레오타이드 시스템이 기재되어 있지만, 본 발명의 기타 실시양태가 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 삼 성분 sn-casRNA 폴리뉴클레오타이드 시스템).
삼-부분 sn-casRNA (sn1-casRNA, sn-2-casRNA 및 sn3-casRNA) 시스템 (참고, 예를 들어, 도 3A) 을 Cigan, A. M., 등, "Genome modification using guide polynucleotide/cas endonuclease systems and methods of use", 미국 특허 출원 공개 번호 2015-0059010, 공개일 2015 년 2 월 26 일 (이는 연속 서열을 갖는 단일 가이드 RNA 를 각각 사용했음) 의 방법의 수정에 사용한다.
적합한 벡터, 배지, 배양 조건 등의 예는 기재되어 있다. 이들 성분 및 조건의 수정은 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에 의해 이해될 것이다.
A. 발현 카세트
스트렙토코쿠스 피오게네스 M1 GAS (SF370) 로부터의 Cas9 유전자를 당업계에 알려져 있는 표준 기술에 따라 메이즈 코돈 최적화한다. 감자 ST-LS1 인트론을 도입하여 에스케리키아 콜라이 및 아그로박테리움에서의 그것의 발현을 없앤다. Cas9 개방 해독틀의 아미노 및 카르복실-말단 각각에 통합된 시미안 바이러스 40 (SV40) 모노파르타이트 및 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 바이파르타이트 VirD2 T-DNA 경계 엔도뉴클레아제 핵 국소화 신호에 의해 메이즈 세포에서의 Cas9 단백질의 핵 국소화를 촉진한다. Cas9 유전자를 표준 분자 생물학 기술에 의해 메이즈 구성적 (예를 들어 식물 유비퀴틴 프로모터) 또는 조절되는 프로모터에 작동가능하게 연결시켰다.
sn1-casRNA, sn2-casRNA, 및 sn3-casRNA 의 발현을 위한 발현 카세트는 sn-casRNA 발현 카세트를 생성하는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 sn-casRNA DNA 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 메이즈 U6 폴리머라제 III 프로모터 (각각의 sn-casRNA 코딩 서열의 5') 및 메이즈 U6 폴리머라제 III 종료자 (각각의 sn-casRNA 코딩 서열의 3') 를 이용한다. 도 3A 에서 보이는 바와 같이, sn3-casRNA 는 DNA 표적 (VT 도메인) 에 상보적인 20 스페이서 영역을 포함한다. PAM 서열의 업스트림에 있는 표적 영역을 표적 자리 인지 및 절단을 위해 선별한다.
Cas9 단백질 및 sn-casRNAs 를 위한 발현 카세트를 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 적합한 백본 벡터에 배치할 수 있다 (예를 들어, Belhaj, K., 등, "Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system," Plant Methods, 9(1), 39 (2013); Weber E., 등, "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs," PLoS ONE 6(2), e16765 (2011) 에 의해 기재된 바와 같이).
B. 돌연변이 생성
3 개의 상이한 메이즈 게놈 표적 서열을 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 시스템을 사용하여 절단을 위해 표적화한다. 3 개의 표적 서열은 LIG 좌위 (Liguleless 1 유전자 시작 코돈의 대략 600bp 업스트림에) 에 위치하고, 돌연변이의 존재에 관해 딥 시퀀싱에 의해 조사된다. 각각의 표적 자리 (LIGCas-1, LIGCas-2, 및 LIGCas3) 에 관한 스페이서 서열은 미국 특허 출원 공개 번호 2015-0059010 (공개일 2015 년 2 월 26 일) 에 기재된 바와 같다 (참고, 미국 특허 출원 공개 번호 2015-0059010, 공개일 2015 년 2 월 26 일의 표 1 에 열거된 메이즈 게놈 표적 서열의 안티센스 가닥에 상보적인 VT 도메인). 결과적인 sn-casRNAs 는 다음과 같다: sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA-LIGCas-1; sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA-LIGCas-2; 및 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA-LIGCas-3.
삼 성분 sn-casRNA 시스템을 포함하는 발현 카세트 및 Cas9 발현 카세트를 60-90 Hi-II 미숙한 메이즈 배에 입자-매개되는 전달에 의해 동시전달한다. Hi-II 메이즈 배를 절단을 위해 LIGCas-3 게놈 표적 자리를 표적화하는 Cas9 및 긴 가이드 RNA 발현 카세트 (미국 특허 출원 공개 번호 2015-0082478, 공개일 2015 년 3 월 19 일에 기재된 바와 같음) 로 형질전환시켜 양성 대조군을 제공한다. 오직 Cas9 발현 카세트로만 형질전환시킨 Hi-II 메이즈 배는 음성 대조군을 제공한다.
메이즈 이삭을 겉껍질을 벗기고, 표면 멸균하고, 멸균수로 2회 헹군다. 미숙한 배를 단리하고, 배축 쪽을 아래로 (배반 쪽을 위로), 플레이트 당 25 개의 배를, 560Y 배지에 4 시간 동안 배치하고, 그 후 2.5-cm 표적 구역 내에 정렬하여 포격 (bombardment) 을 위해 준비한다.
sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 시스템을 포함하는 벡터를 발달 유전자 ODP2 (밑씨 발달 단백질 2), AP2 도메인 전사 인자를 함유하는 벡터로 동시-포격한다; 참고, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 2009-0328252, 공개일 2009 년 12 월 31 일; 미국 공개 특허 출원 번호 2011-0167516, 공개일 2011 년 7 월 7 일.
각각의 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 시스템에 관해, 상응하는 벡터를 수용성 양이온성 지질 트랜스펙션 시약을 사용하여 0.6 ㎛ (평균 직경) 골드 펠렛 위로 침전시킨다. DNA 용액을 얼음 위에서 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 벡터 및 발달 유전자 ODP2 및 Wushel 을 함유하는 플라스미드를 사용하여 제조한다. 제조된 골드 입자를 예비-혼합된 DNA 에 첨가한다. 수용성 양이온성 지질 트랜스펙션 시약을 물에 첨가하고 조심스럽게 혼합한다. 골드 입자를 마이크로퓨즈에서 펠렛화하고, 상청액을 제거한다. 결과적인 펠렛을 에탄올 (EtOH) 로 조심스럽게 헹구고 (펠렛을 재현탁시키기 않음), EtOH 헹굼물을 조심스럽게 제거한다. 100% EtOH 을 첨가하고, 입자를 간단한 초음파처리에 의해 재현탁시킨다. 그 후, 혼합물을 각각의 마크로캐리어의 중심 위로 점을 찍고 (spot), 포격 전 약 2 분 동안 건조되게 둔다 (Kikkert J.R., 등, "Stable transformation of plant cells by particle bombardment/biolistics," Methods Mol Biol., 286, 61-78 (2005)).
배를 함유하는 플레이트를 Helios® Gene Gun System (Bio-Rad, Hercules CA) 으로 수준 #4 로 포격한다. 모든 샘플은 제조된 입자/DNA 의 450 PSI 의 단일 샷 (shot) 을 받는다. 포격 후에, 배를 유지 배지에서 12 내지 48 시간 동안 26℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하고, 그 후 26℃ 에 둔다.
7 일 후에, 각각의 처리로부터 대략 30 개의 가장 균일하게 형질전환된 배를 푸울하고, 총 게놈 DNA 를 추출한다. 의도되는 표적 자리를 둘러싸고 있는 영역을 Phusion® HighFidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) 를 사용하여 PCR 증폭시킨다. PCR 증폭을 또한 사용하여 앰플리콘-특이적 바코드 및 Illumnia 시퀀싱 프라이머 (Illumina, San Diego, CA) 를 첨가한다. 결과적인 PCR 증폭 산물을 PCR 정제 스핀 칼럼 (Qiagen, Venlo, Netherlands) 으로 정제하고, Hoechst 염료-기반 형광측정 어세이로 농도를 측정하고, 등몰 비로 조합하고, 단일-리드 100 뉴클레오타이드-길이 딥 시퀀싱을 MiSeq Personal Sequencer (Illumina, San Diego, CA) 에서 수행한다.
3 개의 LIGCas 표적을 표적화하는 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 시스템에 관한 딥 시퀀싱에 의해 발견된 NHEJ 돌연변이의 빈도를, 상응하는 좌위를 표적화하는 단일 긴 가이드 RNA/Cas9 엔도뉴클레아제 시스템과 비교하여 확인한다. 이들 데이타는 본원에 기재된 바와 같은 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9 단백질 시스템이 메이즈 염색체 DNA 를 절단하고 NHEJ-매개되는 돌연변이를 생성한다는 것을 입증한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 방법은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 17
트랜스제닉 마우스의 생성
이 실시예는 동물에서 게놈 변형을 유발하기 위한 본 발명의 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn-casPNs) 의 사용을 기재한다.
이-부분 sn-casRNA (sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 시스템 (참고, 예를 들어, 도 3B) 을 Wang, 등, "One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering," Cell, 153(4), 910-918 (2013) (이는 연속 서열을 각각 갖는 단일 가이드 RNA 를 사용했음) 의 방법의 수정에 사용한다.
적합한 벡터, 배지, 배양 조건 등의 예는 기재되어 있다. 이들 성분 및 조건의 수정은 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에 의해 이해될 것이다.
A. Cas9 mRNA 및 sn1-casRNA/sn2-casRNA 의 생산
T7 프로모터를 포유류 발현에 최적화된 Cas9 코딩 영역에 첨가한다 (예를 들어, Cas9 코딩 서열을 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9; Addgene, Cambridge, MA 로부터 PCR 증폭시킬 수 있다). T7 프로모터를 PCR 증폭에 의해 첨가한다. T7-Cas9 PCR 산물을 겔 정제하고, mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Kit (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하는 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용한다. Cas9-mRNA 를 MEGAclear Kit (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하여 정제하고, RNase-프리 물에서 용출시킨다.
sn1-casRNAs 및 sn2-casRNAs 를 인코딩하는 DNA 서열 (참고, 예를 들어, 도 3B) 을 화학적으로 합성한다. sn1-casRNAs 에 관한 20 뉴클레오타이드 스페이서 서열은 다음과 같다: sn1-casRNA-Tet1, GGCTGCTGTC AGGGAGCTCA (SEQ ID NO:89); 및 sn1-casRNA-Tet 2, GAAAGTGCCA ACAGATATCC (SEQ ID NO:90) (참고, 도면 1A of Wang 등, Cell, 153(4), 910-918 (2013)). T7 프로모터를 각각의 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 주형에 PCR 증폭에 의해 첨가한다. T7-sn-casRNA PCR 산물을 겔 정제하고, MEGAshortscript T7 Kit (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하는 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용한다. sn-casRNAs 를 MEGAclear Kit (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하여 정제하고, RNase-프리 물에서 용출시킨다.
B. 일-세포 배아 주입
모든 동물 절차를 National Institutes of Health (NIH) 가이드라인에 따라 수행한다. B6D2F1 (C57BL/6 X DBA2) 암컷 마우스를 배아 공여자로서 사용한다. ICR 마우스 계통을 양모 (foster mother) 로서 사용한다. 과잉배란된, 7-8 주령 암컷 B6D2F1 마우스를 B6D2F1 수컷과 짝짓기시킨다. 수정된 배아를 난관으로부터 수집한다. Cas9 mRNAs (개별 배아에게 대략 20 ng/ml 내지 대략 200 ng/ml 의 범위에서 투여됨), sn1-casRNA/sn2-casRNA (개별 배아에게 20 ng/ml 내지 50 ng/ml 의 범위에서 투여됨) 를 M2 배지 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 에 있는 수정된 배아 (잘 인지되는 전핵을 가짐) 의 세포질 내로 주입한다.
공여자 올리고뉴클레오타이드가 또한 주입되고 있을 때 sn-casPNs/Cas9 단백질 시스템 성분의 농도는 다음과 같다: Cas9 mRNA (대략 100 ng/ml), sn1-casRNA/sn2-casRNA (50 ng/ml), 및 공여자 올리고뉴클레오타이드 (100 ng/ml). 성분들을 혼합하고, 전핵 시기의 접합자 내로 주입한다. 주입된 접합자를 PrimeQ™ KSOM Embryo Culture Medium (아미노산 및 페놀 레드를 함유함) (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD) 에서 37℃ 에서 5% CO2 하에 공기 중에서 약 3.5 일 동안 (배반포 시기까지) 배양한다. 교배후 대략 2.5 일에 가임신한 ICR 암컷의 자궁 내로 15-25 개의 배반포를 전달한다.
C. 이중-유전자 돌연변이체 마우스
sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA 및 sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNA 를 위에서 기재된 바와 같이 접합자 내로 동시주입한다. 새끼의 게놈 DNA 를 RFLP (제한 분절 길이 다형성 분석), 서던 블롯 분석, 및 시퀀싱 분석에 의해 평가하여, Tet1 및 Tet2 유전자의 모든 4 개의 대립유전자에서 표적화된 돌연변이를 보유하는 마우스를 확인한다. 이들 분석의 결과는 2 개의 상이한 유전자 (즉, Tet1 및 Tet2 유전자) 에서 두 개-대립유전자 돌연변이를 보유하는 출생후 마우스가 효율적으로 생성될 수 있다는 것을 입증한다.
생체내 오프-타겟 효과를 또한 평가한다. 시험관내, 박테리아에서, 및 배양된 인간 세포에서의 이전 작업은 프로토스페이서-인접 모티프 서열 NGG 및 스페이서 서열의 8 내지 12 염기 "시드 서열" 이 DNA 절단 특이성을 결정하는데 중요하다는 것을 시사한다 (Cong, L., 등, "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems," Science 339, 819-82 (2013); Jiang, W., 등, "RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems," Nat. Biotechnol., 31, 233-239 (2013); 및 Jinek, M., 등, "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity," Science, 337, 816-821 (2012)). 이러한 규칙을 사용하여, Wang 등은 오직 3 개의 Tet1 및 4 개의 Tet2 잠재적 오프-타겟 자리가 마우스 게놈에 존재한다는 것을 동정했다. 오프-타겟 효과를 Surveyor Assay (Guschin, D.Y., 등, "A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification," Methods Mol. Biol., 649, 247-256 (2010)) 를 사용하여 평가한다. 다수의 오프-타겟 효과는 sn1-casRNA/sn-2-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 생체내 표적화 정확도의 추정을 제공한다.
D. 생체내 유전자 복구 변형
sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 시스템을 사용하여 생체내 유전자 복구를 평가하기 위해, 공여자 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 Tet1 을 표적화하여 SacI 제한 자리의 2 개의 염기 쌍을 변화시켜 EcoRI 자리를 생성한다 (Tet1 올리고뉴클레오타이드; 126bp, 서열에 관해 Wang 등의 도면 3A 참고). 제 2 공여자 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 Tet2 를 표적화하여 EcoRV 자리의 2 개의 염기 쌍을 변화시켜 EcoRI 자리를 생성한다 (Tet2 올리고뉴클레오타이드; 126bp, 서열에 관해 Wang 등의 도면 3A 참고). 배반포는 Cas9 mRNA, sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA, 및 Tet1 올리고뉴클레오타이드, Cas9 mRNA, sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNA, 및 Tet2 올리고뉴클레오타이드, 및 Cas9 mRNA, sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA, Tet1 올리고뉴클레오타이드, sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNA, 및 Tet2 올리고뉴클레오타이드를 주입한 접합자로부터 유래한다.
DNA 를 Cas9 mRNA, sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA, 및 Tet1 올리고뉴클레오타이드 배반포로부터 단리하고, 증폭시키고, EcoRI 로 소화시켜 올리고뉴클레오타이드-매개되는 유전자 복구 사건을 검출한다. DNA 를 Cas9 mRNA, sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNA, 및 Tet2 올리고뉴클레오타이드 배반포로부터 단리하고, 증폭시키고, EcoRI 로 소화시켜 올리고뉴클레오타이드-매개되는 유전자 복구 사건을 검출한다. DNA 를 Cas9 mRNA, sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA, Tet1 올리고뉴클레오타이드, sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNA, 및 Tet2 올리고뉴클레오타이드 배반포로부터 단리하고, 증폭시키고, EcoRI 로 소화시켜 올리고뉴클레오타이드-매개되는 유전자 복구 사건을 검출한다. 배반포로부터의 게놈 DNA 를 RFLP, 서던 블롯 분석, 및 시퀀싱 분석에 의해 평가하여 Tet1 및 Tet2 유전자의 변형된 제한 자리를 보유하는 배반포를 확인한다. 이들 분석의 결과는 마우스 유전자 (즉, Tet1 및 Tet2 유전자) 의 생체내 복구가 효율적으로 수행될 수 있다는 것을 입증한다.
SacI 및 EcoRV 절단을 사용하여 Tet1 및 Tet2 좌위를 각각 평가하는 RFLP 분석을 사용하여, 선별된 Cas9 mRNA, sn1-casRNA-Tet1 또는 Tet2/sn2-casRNA, 및 올리고뉴클레오타이드 (각각의 위에 열거된 조합으로) 에 의해 표적화되지 않는 대립유전자는 영향을 받지 않는다는 것을 입증한다.
더욱이, 이중 올리고뉴클레오타이드 주입한 배반포를 양모 내로 이식한다. 결과적인 새끼로부터의 게놈 DNA 를 RFLP, 서던 블롯 분석, 및 시퀀싱 분석에 의해 평가하여 Tet1 및 Tet2 유전자의 변형된 제한 자리를 보유하는 배반포를 확인한다. 이들 분석의 결과는 복수의 유전자에서 게놈 복구 변형이 있는 마우스가 생성될 수 있다는 것을 입증한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 방법은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 18
양이온성 분자를 포함하는 전달 벡터 내의 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체
A. Cas9 mRNA 및 sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA 의 생산
T7 프로모터를 포유류 발현에 최적화된 Cas9 코딩 영역에 첨가하고 2 개의 핵 국소화 서열 (NLS) 로 C-말단에서 태그한다. T7 프로모터를 PCR 증폭에 의해 첨가한다. T7-Cas9 PCR 산물을 겔 정제하고, 무세포 단백질 발현을 위한 벡터 (예를 들어, 포유류 무세포 단백질 발현을 위한 pT7CFE1-NFtag 벡터, Life Technologies, Grand Island, NY) 내로 클로닝한다. Cas9 단백질을 발현시키고, 무세포 단백질 발현 시스템 (예를 들어, 1-Step CHO High-Yield IVT Kit, Life Technologies, Grand Island, NY) 을 사용하여 단리하고, RNase-프리 물에 현탁시킨다.
sn1-casRNA, sn2-casRNA, 및 sn3-casRNA-AAVS-1 을 인코딩하는 DNA 서열을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조한다. T7-sn-casRNA PCR 산물을 겔 정제하고, T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA) 를 사용하는 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용한다. sn-casRNAs 를 GeneJet RNA Cleanup and Concentration Kit (Life Technologies, Grand Island, NY) 를 사용하여 정제하고, RNase-프리 물에서 용출시킨다.
B. 리보핵단백질 복합체의 형성
리보핵단백질 (RNP) 복합체를 2 가지 농도, 50pmol Cas9:150pmols sn-casRNAs 및 200pmols Cas9:600pmols sn-casRNAs 로 제조한다. 등몰량의 모든 3 개의 sn-casRNA 성분을 어닐링 완충액 (1.25mM HEPES, 0.625mM MgCl2, 9.375mM KCl, pH7.5 에서) 에서 요망되는 농도 (150pmols 또는 600pmols) 까지 최종 부피 5μL 로 혼합하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고 실온으로 평형되게 놔두었다. Cas9 단백질을 결합 완충액 (20mM HEPES, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 및 5% 글리세롤, pH7.4 에서) 에서 적당한 농도까지 최종 부피 5μL 로 희석시키고, 5μL 의 열-변성된 sn-casRNAs 와 혼합하고, 그에 뒤이어 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하여 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체를 형성시킨다.
C. SC12CDClick프로필아민 벡터 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체의 제조
SC12CDClick프로필아민 (양이온성 베타사이클로덱스트린; O'Mahony A.M., 등, "Cationic and PEGylated Amphiphilic Cyclodextrins: Co-Formulation Opportunities for Neuronal Sirna Delivery," PLoS ONE 8(6), e66413 (2013)) 을 무게를 달고 클로로포름 (대략 1 mg/ml) 에 용해시키고, 그 후 적당한 부피로 함께 혼합하여 양이온성 대 PEG화된 (PEGylated)-사이클로덱스트린의 몰비를 제공한다 (미국 특허 출원 공개 번호 2014-0079770, 공개일 2014 년 3 월 20 일). 용매를 질소의 스트림 하에 제거하여 건조 사이클로덱스트린 (CD) 조성물을 제공한다.
CD 조성물을 결합 완충액 (최종 농도 대략 1 mg/ml) 으로 재수화시키고, 1 시간 동안 실온에서 초음파처리하고, 그에 뒤이어 결합 완충액 중 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체를 즉시 첨가한다. 결합 완충액 중 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체를 동등 부피로 첨가한다. 용액을 혼합하고, 20-30 분 동안 실온에서 인큐베이션하여 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체 (CD-sn-casRNAs/Cas9 단백질) 를 포함하는 CD 조성물을 생성한다.
D. 리포솜 포착된 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체의 제조
casRNAs/Cas9 단백질 복합체가 없는 리포솜을 형성하여 음성 대조군 (빈 리포솜) 을 제공한다.
적합한 크기의 둥근 바닥 플라스크에 리포솜 성분을 첨가하고 적합한 용매 또는 용매 혼합물에 용해시킨다. 리포솜 성분의 예는 다음과 같다:
리포솜 1: EPC (EtOH 용액) 및 콜레스테롤 (EtOH 용액) 을 70/30 의 몰비로 제조한다.
리포솜 1-PEG: 스테아릴화된 PEG2000 (EtOH 용액) 을 리포솜 1 (EPC+콜레스테롤) 의 총 지질 양에 대해 5 mol% 로 첨가한다.
리포솜 2: DOTMA (EtOH 용액), 콜레스테롤 (EtOH 용액), 및 EPC (EtOH 용액) 을 30/40/30 의 몰비로 제조한다.
리포솜 2-PEG: 스테아릴화된 PEG2000 (EtOH 용액) 을 리포솜 2 (DOTMA+콜레스테롤+EPC) 의 총 지질 양에 대해 5 mol% 로 첨가한다.
리포솜 3: DODAP (EtOH 용액), 콜레스테롤 (EtOH 용액), 및 EPC (EtOH 용액) 을 30/40/30 의 몰비로 첨가한다.
리포솜 3-PEG: 스테아릴화된 PEG2000 (EtOH 용액) 을 리포솜 3 (DODAP+콜레스테롤+EPC) 의 총 지질 양에 대해 5 mol% 로 첨가한다.
일정한 양의 EtOH 를 첨가하여 모든 성분을 용해시킨다. 플라스크를 50-100 rpm 으로 회전하는 회전 증발기에 부착하고, 사용된 지질의 최고 겔-액체 결정 상 전이 (Tc) 온도 위로 설정된 수조에 담근다. 플라스크를 수조에서 대략 1 분 동안 회전하게 놔두어서 평형시킨다. 느린 진공을, < 10 Torr 만큼 낮게, 빼내서, 침전 없이 플라스크의 벽에 얇은 건조 필름을 얻는다. 임의의 잔류 용매를 제거하기 위해서, 플라스크를 높은 진공에 실온에서 수 시간 동안 또는 밤새 적용한다.
sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체 또는 CD-sn-casRNAs/Cas9 단백질의 용액을 첨가하여 약 2mM 내지 약 0.5mM 의 최종 지질 농도를 얻는다. 지질 재수화를 실온에서 15 분 동안 또는 그보다 길게 수행한다. 리포솜을 대략 1 분 동안 초음파처리에 의해 제조한다.
상기 방법은 표 19 에서 보여지는 입자 조성물 및 리포솜 조성물을 생산한다.
표 19
Figure pct00020
E. 입자 조성물 및 리포솜 조성물의 특성분석
위에 기재된 입자 조성물 및 리포솜 조성물을 다음과 같이 표준 방법을 사용하여 특성분석한다 (참고, 예를 들어, Laouini, A., 등, "Preparation, Characterization and Applications of Liposomes: State of the Art," Journal of Colloid Science and Biotechnology, 1, 147-168 (2012)).
(i) 크기 분석
입자 및 리포솜의 크기를 표준 기술에 의해 평가한다. 현미경관찰 기술, 크기-배제 크로마토그래피 (SEC), 장흐름 분획법 (field-flow fractionation) 및 정적 또는 동적 광 산란을 포함하는 리포솜 크기 및 크기 분포를 평가하기 위한 여러 기술이 입수가능하다. 더욱이, 입자 크기는 비-변성 아가로스 겔 (예를 들어, 1.5% 아가로스 겔, SYBR® Safe, Life Technologies, Grand Island, NY) 을 사용하여 평가할 수 있다. 상이한 크기의 입자 및 리포솜은 상이한 적용, 예를 들어, 배양물에서의 세포 트랜스펙션 또는 동물에게의 치료적 투여에 유용하다.
(ii) 전하 측정
입자 및 리포솜의 평균 크기 및 전하를 동적 광 산란 (DLS) 을 사용하여 Zetasizer Nano ZS (Malvern, Westborough, MA) 로 측정한다. 현탁액 내의 모든 입자가 큰 음성 또는 큰 양성 제타 전위를 갖는 경우에 그들은 서로 밀어내는 경향이 있다. 그에 따라 응집하는 경향을 감소 또는 제거한다. 그러나, 낮은 제타 전위 값을 갖는 입자는 입자 엉김을 방지하는 힘을 갖지 않는다.
(iii) 형태
조성물의 형태를 투과 전자 현미경 (TEM), 예를 들어, JEOL 2000 FXII 투과 전자 현미경 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan) 을 사용하여 평가한다. 일반적으로, 균일한 입자 또는 리포솜 형태를 갖는 조성물이 가장 바람직하다.
(iv) 응집 연구
입자 및 리포솜의 응집에 대한 염-함유 배지 및 혈청의 효과를 복합체를 Opti-MEM® 트랜스펙션 배지 (Life Technologies, Grand Island, NY) 또는 소 태아 혈청에 24 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하여 평가한다. 크기 측정을 Zetasizer Nano ZS 을 사용하여 수행한다. 응집의 부재는 종종 바람직한 품질이다. 그러나, 일부 적용 (예를 들어, 트랜스펙션 실험) 에서 일부 응집이 바람직할 수 있다.
(v) 캡슐화 효율
리포솜 제제는 캡슐화된 및 미캡슐화된 CD-sn-casRNAs/Cas9 단백질 또는 sn-casRNAs/Cas9 단백질 분획의 혼합물이다. HPLC 및 장흐름 분획법을 포함하는 캡슐화 효율을 확인하기 위한 여러 기술이 알려져 있다. 전형적으로, 캡슐화 퍼센트는 동일한 초기 농도에서 참조 표준의 피크 영역에 대한 미캡슐화된 피크 영역의 비율로서 표현된다. 이러한 방법은 제조 후에 리포솜이 임의의 정제를 겪지 않는 경우에 적용할 수 있다. 일반적 높은 정도의 캡슐화 효율은 치료적 적용에서 리포솜에 중요한 파라미터이다. 낮은 캡슐화 효율은 캡슐화 후 분리 단계 (예컨대 투석, 크기 배제 크로마토그래피 또는 초여과) 를 편입시켜 미캡슐화된 복합체를 제거하는 것을 필요하게 만든다. 전형적으로 45% 초과, 더욱 바람직하게는 80% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과의 캡슐화 효율이 바람직하다.
(v) 생체내 활성
sn1-casRNA, sn2-casRNA, 및 sn3-casRNA-AAVS-1 을 포함하는 입자 조성물 및 리포솜 조성물을 유전자 복구를 위해 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체를 세포 내로 전달하는 그들의 상대적 능력에 관해 평가한다. 이러한 실험을 위해 공여자 DNA 분자가 입자 조성물 및 리포솜 조성물의 각각의 제제에 포함된다. 공여자 DNA 는 AAVS1 양성 대조군 EGIP 293T 리포터 세포주 (System Biosciences, Mountain View, CA) 와 함께 사용하기 위한 EGFP 분절이다. 기타 리포터 시스템이 이러한 분석에서 사용하기에 적합하다. 리포솜 조성물을 필요에 따라 표준 기술을 사용하여 농축시킨다.
입자 조성물 및 리포솜 조성물을 세포 내로 트랜스펙트한다. 트랜스펙션 하루 전에, 세포를 항생제 없는 성장 배지에 플레이팅한다. 트랜스펙션시에 세포는 컨플루언스에 있어야 한다. 입자 조성물 및 리포솜 조성물을 혈청 없는 Opti-MEM® I Medium (Life Technologies, Grand Island, NY) 내로 희석하여 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체에 관한 농도 범위를 제공한다. 전형적으로, 약 200 μl 부피의 이들 현탁액을 멀티웰 플레이트 내의 세포에 적용한다. 플레이트를 앞뒤로 흔들어서 세포 및 현탁액을 부드럽게 혼합한다. 세포를 37℃ 에서 CO2 인큐베이터에서 5-24 시간 동안 인큐베이션한다. 다음 날, 완전 성장 배지를 세포에 첨가한다. 세포를 시험 전 24-48 시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃ 에서 인큐베이션한다.
EGFP 공여자 DNA 의 HDR 효율을 모니터링하기 위해 AAVS1 양성 대조군 EGIP 293T 리포터 세포주를 사용하여 유전자 복구를 평가한다. sn3-casRNA-AAVS1 RNA 서열은 sn-casRNA/Cas9 단백질 복합체를 표적으로 지향시키고, 증강된 녹색 형광 단백질 (Enhanced Green Fluorescent Protein) (EGIP) 리포터 세포주에 통합된 53bp AAVS1 서열을 자른다. EGIP 는 중간에 종결 코돈을 포함하여 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 의 발현을 불활성화시킨다. 활성 sn-casRNA/Cas9 단백질 복합체의 존재 하에, EGFP 공여자 DNA 는 표적 자리에서 재조합하고, 상동 재조합에 의해 EGFP 유전자의 개방 해독을 복원한다. AAVS1 좌위를 표적화하는 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체의 절단 효율을 Surveyor 어세이를 사용하여 측정한다. EGFP 발현의 복원의 효율을 형광 현미경법을 사용하여 모니터링한다. 결과는 입자 조성물 (sn-casRNAs/Cas9 단백질 및 CD-sn-casRNA/Cas9 단백질) 및 빈 리포솜 대조군에 상대적인 퍼센트 EGFP 유전자 발현으로서 표현된다. 생체내 활성 연구의 결과는 최적 입자 및/또는 리포솜 성분 및 조성물의 선별을 위한 안내를 제공한다.
모두 합해서, 이들 데이타는 본 발명의 sn-casRNAs/Cas9 단백질 복합체의 캡슐화에 최적인 리포솜 조성물을 그들의 이점 및 제약에 따라 선별하는 기준을 확립하는 것을 허용하는 정보를 제공한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 방법은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 19
진핵생물 세포에서 표적 변형의 검출을 위한 추가의 딥 시퀀싱 분석
이 실시예는 인간 세포에서 6 개의 선별된 이중-가닥 DNA 표적 서열을 변형시키기 위한 스트렙토코쿠스 써모필루스 CRISPR-Cas9 sgRNA 및 이 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (본 공개의 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA) 의 사용을 기재한다.
A. 표적 선별 및 sn-casRNA 시약 생성
6 개의 표적 서열을 편집을 위해 인간 게놈으로부터 선별했다. 표적 자리는 20 뉴클레오타이드 길이였고, 스트렙토코쿠스 써모필루스 CRISPR1/Cas9 PAM 서열의 5' 에 존재했으며 (5' - NNAGAAW - 3'), 여기에서 'N' 은 임의의 뉴클레오타이드이고, 'W' 는 아데닌, 티민, 또는 우라실 염기이다. 선별된 표적 및 인간 게놈 좌표 ("Genome Reference Consortium", National Center for Biotechnology Information, 레퍼런스 조립체 GRCh37/hg19 에 상대적임) 는 표 20 에 제시되어 있다.
표 20
스트렙토코쿠스 써모필루스 CRISPR1/Cas9 표적 서열
Figure pct00021
표적 서열을 사용하여 스트렙토코쿠스 써모필루스 sgRNAs (sgRNAS.th), 스트렙토코쿠스 써모필루스 sn1-casRNAs (sn1-casRNAS.th) 및 수반하는 스트렙토코쿠스 써모필루스 sn2-casRNA (sn2-casRNAS.th) 에 관한 스페이서 엘리먼트를 디자인했다. 이중-가닥 DNA 주형 및 RNA 성분을 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 (실시예 1) 생산했다. sgRNA 및 sn-casRNA 서열이 표 21 에 열거되어 있다.
표 21
sgRNAS.th, sn1-casRNAS.th, 및 sn2-casRNAS.th 서열
Figure pct00022
Figure pct00023
C. sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas 단백질의 복합체의 형성
NLS-태그된 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 단백질을 Jinek, M. 등 (Science, 337, 816-21 (2012) 에 기재된 방법에 따라 에스케리키아 콜라이 (BL21 (DE3)) 에서 박테리아 발현 벡터로부터 발현시키고 친화도 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. Cas9 단백질에 관한 코딩 서열을 C-말단에서 2 개의 핵 국소화 서열 (NLS) 을 포함하도록 디자인했다. 농도 40pmols 의 Cas9 및 120pmols 의 sgRNAS.th 또는 sn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th 로 트리플리케이트로 복합체를 조립했다. sn1-casRNAS.th 및 sn2-casRNAS.th 성분을 등몰량으로 요망되는 농도 (120pmols) 까지 최종 부피 2.5μL 로 혼합하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고 실온으로 평형되게 놔두었다. 대조군 sgRNAsS.th 를 최종 농도 (120pmols) 까지 최종 부피 2.5μL 로 희석하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고 실온으로 평형되게 놔두었다. Cas9 단백질을 결합 완충액 (20mM HEPES, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 및 5% 글리세롤, pH7.4 에서) 에서 적당한 농도까지 최종 부피 2.5μL 로 희석하고, 각각의 2.5μL 의 열-변성된 sgRNAS.th 또는 각각의 sn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th 와 혼합하고, 그에 뒤이어 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다.
D. sgRNAS.th/Cas9 단백질 및 sn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th/Cas9 단백질 핵단백질 복합체를 사용하는 세포 트랜스펙션 및 딥 시퀀싱
sgRNAS.th/Cas9 단백질 또는 sn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th/Cas9 단백질 핵단백질 복합체를 HEK293 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 내로, Nucleofector® 96-웰 셔틀 시스템 (Lonza, Allendale, NJ) 을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 뉴클레오펙션 및 표적 변형의 검출을 위한 딥 시퀀싱을 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 (실시예 4) 수행했다.
6 개의표적 자리에 대한 sgRNAS.th/Cas9 및 sn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th/Cas9 편집에 관해 검출된 Indels 이 표 22 에서 보여진다. 값은 3 개의 기술적 레플리케이트의 평균이다.
표 22
세포내 편집에 관해 검출된 Indels
Figure pct00024
진핵생물 세포에서의 표적 변형의 검출을 위한 딥 시퀀싱 데이타의 분석에 의해 평가된 sn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas 단백질 핵단백질 복합체의 세포내 활성에 관한 표 22 에 제시된 데이타는 본원에 기재된 바와 같은 Cas 단백질/sn1-casPN/sn2-casPN 구축물이 세포에서의 표적 이중-가닥 핵산의 Cas-매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증하는 데이타를 제공한다. 이들 데이타는 본 발명의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템이 게놈 좌위의 세포내 Cas-매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 지지한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 방법은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 20
대안적 sn-casPN 디자인
이 실시예는 선별된 핵산 표적 서열에 상대적인 sn-casPNs/ 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 단백질 시스템의 시험관내 퍼센트 절단을 평가 및 비교하는 대안적 sn-casPN 디자인의 사용을 예시한다. 각각의 대안적 sn-casPNs 디자인에서 3 개의 sn-casPN 를 넥서스 엘리먼트 내의 상이한 위치의 넥서스 백본에 독특한 끊어짐이 있도록 만들었다. 3 개의 sn-casPNs 디자인을, 인간 게놈 DNA 표적으로 생화학적 절단 활성을 지향시키는 그들의 능력에 관해 시험했다.
표적 이중-가닥 DNA 를 이전에 기재된 바와 같이 (실시예 2) 생산했다. 모든 3 개의 표적 서열을 포함하는 단일 게놈 영역을 인간 게놈 DNA (gDNA) 로부터 증폭시켰다. gDNA 로부터 670bp 표적화되는 서열의 증폭에 사용되는 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 표 23 에서 보여진다.
표 23
이중-가닥 DNA 표적 서열을 생성하는 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열
Figure pct00025
RNA 성분에 관한 이중-가닥 DNA 주형을 이전에 기재된 바와 같이 (실시예 1) 생산했다. 670bp 표적화되는 서열의 절단은 표적-1 에서 375bp 및 295bp, 표적-2 에서 312bp 및 359bp, 및 표적-3 에서 215bp 및 457bp 의 분절 크기를 초래했다. 이 실시예에서, sn-casRNA 디자인을 v2.2, v2.3, 및 v2.4 로서 표지한다. 표적을 tgt1 (표적-1), tgt2 (표적-2), 및 tgt3 (표적-3) 으로서 지칭한다. sgRNA 및 sn-casRNA 서열이 표 24 에 열거되어 있다.
표 24
sgRNA 및 대안적 sn-casRNA 디자인에 관한 서열
Figure pct00026
Figure pct00027
각각의 표적에 관한 쌍을 이룬 sn1-casRNA 및 sn2-casRNA 성분 (표 24) 을 등몰량으로 어닐링 완충액 (1.25mM HEPES, 0.625mM MgCl2, 9.375mM KCl, pH7.5 에서) 에서 혼합하고, 2 분 동안 95℃ 에서 인큐베이션하고, 서모사이클러로부터 제거하고, 실온으로 평형되게 놔두었다. 양성 대조군 sgRNAs 를 어닐링 완충액에서 적당한 농도까지 희석시킨다. 음성 대조군 sn1-casRNA 단독 성분을 어닐링 완충액에서 적당한 농도까지 희석시킨다.
Cas9 절단 반응을 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 (실시예 3) 수행하고 분석했다. sn1-casRNA, sn2-casRNA, 및 sgRNA 성분은 반응에서 최종 농도가 500nM 이었다.
표 25 는 대안적 sn1-casRNA/sn2-casRNA 디자인을 사용하는 Cas9 절단 어세이의 결과를 제시하며, 여기에서 넥서스 백본에서의 끊어짐은 넥서스 엘리먼트 내의 상이한 위치에서 만들어졌다. 오직 sn1-casRNA 성분만 존재했던 모든 음성 대조군 반응에서, 절단 활성이 관찰되지 않았다 (즉, 검출 한계 미만).
표 25
생화학적 절단 활성
Figure pct00028
표 25 에 제시된 데이타는 상이한 sn1-casRNA/sn2-casRN 쌍 (여기에서 각각의 쌍은 넥서스 엘리먼트 내의 스플릿의 상이한 위치를 나타냄) 이 이중-가닥 DNA 표적의 시험관내 Cas9 단백질 매개되는 자리-특이적 절단을 촉진한다는 것을 입증한다.
본 명세서 및 실시예의 지도에 따라, 이 실시예에 기재된 방법은 당업자에 의해 Cas9 및 스플릿-넥서스 엘리먼트를 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 그들의 동족 폴리뉴클레오타이드 성분과 조합된 Cas9 융합물을 포함하나 그에 제한되지 않는 기타 타입 II CRISPR Cas9 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 하기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다:
1. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 DNA 표적 서열을 포함하는 제 1 DNA 서열에 DNA 표적 결합 서열을 포함하지 않는 제 2 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘은 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적임.
2. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 DNA 표적 서열을 포함하는 제 1 DNA 서열을 DNA 표적 결합 서열을 포함하지 않는 제 2 DNA 서열에 비해 우선적으로 자르는 것을 야기할 수 있는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘은 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적임.
3. 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드가 하기를 포함하는, 실시양태 1 또는 2 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 (i) 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, (ii) 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
4. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 DNA 표적 서열을 포함하는 제 1 DNA 서열에 DNA 표적 결합 서열을 포함하지 않는 제 2 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 3 개의 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 3 개의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘은 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적임.
5. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 DNA 표적 서열을 포함하는 제 1 DNA 서열을 DNA 표적 결합 서열을 포함하지 않는 제 2 DNA 서열에 비해 우선적으로 자르는 것을 야기할 수 있는 3 개의 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘은 넥서스 스템 엘리먼트를 형성하는데 필수적임.
6. 실시양태 4 또는 5 에 있어서, 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드, 및
넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드,
여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음; 및
5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음;
여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
7. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
둘 이상의 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 함유하는 DNA 서열에 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 tracr 엘리먼트를 포함하며, 여기에서 tracr 엘리먼트는,
(i) 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 여기에서 (ii) 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
8. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
둘 이상의 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 함유하는 DNA 서열에 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하여 자르는 것을 야기할 수 있는 tracr 엘리먼트를 포함하며, 여기에서 tracr 엘리먼트는,
(i) 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 여기에서 (ii) 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
9. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 함유하는 DNA 서열에 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하는 것을 야기할 수 있는 tracr 엘리먼트, 여기에서 tracr 엘리먼트는 하기를 포함함,
5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드, 및
넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드,
여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음; 및
5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음;
여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
10. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 함유하는 DNA 서열에 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA 서열에 비해 우선적으로 결합하여 자르는 것을 야기할 수 있는 tracr 엘리먼트, 여기에서 tracr 엘리먼트는 하기를 포함함,
5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드, 및
넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드,
여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음; 및
5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음;
여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
11. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
하기를 포함하는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드
5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하며, 여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 은, 5' 에서 3' 방향으로, Nw-N1-N2-Nx 를 포함하며, 여기에서 Nw 는 제 1 커넥티브 뉴클레오타이드 서열이며, w 는 커넥티브 뉴클레오타이드 서열의 길이이고, w 는 2 이상이고, N1 은 뉴클레오타이드이고, N2 는 뉴클레오타이드이고, Nx 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드이며, 여기에서 x 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 길이이고, x 는 0 이상임;
5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 2 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는, 5' 에서 3' 방향으로, Ny-Nc2-Nc1-Nz 를 포함하며, 여기에서 Ny 는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드이며, 여기에서 y 는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 길이이고, y 는 0 이상이고, Nc2 는 N2 에 상보적인 뉴클레오타이드이고, Nc1 은 N1 에 상보적인 뉴클레오타이드이고, Nz 는 제 2 커넥티브 뉴클레오타이드 서열이며, 여기에서 z 는 제 2 커넥티브 뉴클레오타이드 서열의 길이이고, z 는 0 이상임;
여기에서 (i) 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 2 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열은 적어도 N1/Nc1 과 N2/Nc2 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, (ii) 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
12. 하기를 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하며, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 은, 5' 에서 3' 방향으로, Nw-N1-N2-Nx 을 포함하며, 여기에서 Nw 은 제 1 커넥티브 뉴클레오타이드 서열이며, 여기에서 w 는 커넥티브 뉴클레오타이드 서열의 길이이고, w 는 2 이상이고, N1 은 뉴클레오타이드이고, N2 는 뉴클레오타이드이고, Nx 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드이며, 여기에서 x 는 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 길이이고, x 는 0 이상임;
5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 2 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는, 5' 에서 3' 방향으로, Ny-Nc2-Nc1-Nz 를 포함하며, 여기에서 Ny 는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드이며, 여기에서 y 는 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 길이이고, y 는 0 이상이고, Nc2 는 N2 에 상보적인 뉴클레오타이드이고, Nc1 은 N1 에 상보적인 뉴클레오타이드이고, Nz 는 제 2 커넥티브 뉴클레오타이드 서열이며, 여기에서 z 는 제 2 커넥티브 뉴클레오타이드 서열의 길이이고, z 는 0 이상임; 및
5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는, 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드;
여기에서 (i) 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 적어도 N1/Nc1 과 N2/Nc2 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, (ii) 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, (iii) 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
13. 실시양태 3, 7, 8, 또는 11 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 제 1 스템 엘리먼트, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하며, 여기에서 제 1 스템 엘리먼트는 제 1 헤어핀을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
14. 실시양태 13 에 있어서, 제 1 스템 엘리먼트는 하부 스템 엘리먼트, 벌지 엘리먼트, 및 상부 스템 엘리먼트를 추가로 포함하고,
여기에서 하부 스템 엘리먼트는 벌지 엘리먼트에 인접하고,
벌지 엘리먼트는 상부 스템 엘리먼트에 인접하고,
벌지 엘리먼트는 하부 스템 엘리먼트와 상부 스템 엘리먼트 사이에 끼어 들어가 있고,
상부 스템 엘리먼트는 제 1 헤어핀을 포함하는,
조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
15. 실시양태 3, 7, 8, 또는 11 중 어느 하나에 있어서, 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드,
5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드,
여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고,
제 3 폴리뉴클레오타이드, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 별개의 폴리뉴클레오타이드임.
16. 실시양태 3, 7, 8, 또는 11 중 어느 하나에 있어서, 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 제 3 폴리뉴클레오타이드,
여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고,
여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
17. 실시양태 6, 9, 10, 또는 12 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
제 3 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열; 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II; 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II; 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고;
제 1 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I; 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I; 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I; 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고;
여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
18. 실시양태 3, 7, 8, 또는 11 중 어느 하나에 있어서, 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
DNA 표적 결합 서열을 포함하는 스페이서 폴리뉴클레오타이드,
5' 에서 3' 방향으로, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 제 1 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 제 1 폴리뉴클레오타이드,
여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
19. 실시양태 3, 7, 8, 또는 11 중 어느 하나에 있어서, 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
DNA 표적 결합 서열을 포함하는 스페이서 폴리뉴클레오타이드,
제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드,
제 1 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하며,
여기에서 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
20. 실시양태 3, 7, 8, 또는 11 중 어느 하나에 있어서, 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
DNA 표적 결합 서열을 포함하는 스페이서 폴리뉴클레오타이드,
5' 에서 3' 방향으로, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II; 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II; 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 3 폴리뉴클레오타이드;
여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I; 벌지 엘리먼트 서열 I; 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I; 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하며,
여기에서 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
21. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 또는 19 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 5' 에 위치하는 제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
22. 실시양태 21 에 있어서, 제 3 폴리뉴클레오타이드는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 3' 에 위치하는 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
23. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 또는 19 중 어느 하나에 있어서, 제 3 폴리뉴클레오타이드는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 3' 에 위치하는 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
24. 실시양태 16, 17, 또는 20 에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 5' 에 위치하는 제 1 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
25. 실시양태 24 에 있어서, 제 3 폴리뉴클레오타이드는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 3' 에 위치하는 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
26. 실시양태 16, 17, 또는 20 에 있어서, 제 3 폴리뉴클레오타이드는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 3' 에 위치하는 제 2 액세서리 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
27. 실시양태 3, 또는 6 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 2 스템 엘리먼트를 포함하며, 여기에서 제 2 스템 엘리먼트는 헤어핀을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
28. 실시양태 27 에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 제 2 스템 엘리먼트, 및 제 3 스템 엘리먼트를 포함하며, 여기에서 제 3 스템 엘리먼트는 헤어핀을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
29. 실시양태 3, 또는 6 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템:
5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하는 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및
제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 2 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
30. 실시양태 29 에 있어서, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 여기에서 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단은 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단에 공유적으로 결합되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
31. 실시양태 29 또는 30 에 있어서, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고,
제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하며, 여기에서 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 3 스템 엘리먼트를 형성할 수 있는,
조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
32. 실시양태 31 에 있어서, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 여기에서 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단은 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 3' 말단에 공유적으로 결합되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
33. 실시양태 3, 또는 6 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
34. 실시양태 33 에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
35. 실시양태 3, 또는 6 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
36. 실시양태 33 에 있어서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질에 관한 결합 자리를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
37. 실시양태 36 에 있어서, 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 단일-가닥 RNA 결합 단백질인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
38. 실시양태 34 또는 35 에 있어서, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질에 관한 결합 자리를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
39. 실시양태 38 에 있어서, 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질은 단일-가닥 RNA 결합 단백질인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
40. 실시양태 34 에 있어서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 효과기 결합 엘리먼트를 형성할 수 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
41. 실시양태 40 에 있어서, 효과기 결합 엘리먼트는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
42. 실시양태 41 에 있어서, 효과기 단백질은 효과기 결합 엘리먼트에 결합할 수 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
43. 실시양태 42 에 있어서, 효과기 결합 엘리먼트는 이중-가닥 RNA 이고, 효과기 단백질은 효과기 결합 엘리먼트에 결합할 수 있는 이중-가닥 RNA 결합 단백질인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
44. 실시양태 43 에 있어서, 효과기 단백질은 Cas5, Cas6, 및 Csy4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질의 촉매적 불활성 변이체인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
45. 실시양태 43 에 있어서, 효과기 단백질은 적어도 하나의 징크 핑거 도메인을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
46. 실시양태 3, 또는 6 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
47. 실시양태 46 에 있어서, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
48. 실시양태 3, 또는 6 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
49. 실시양태 33 또는 34 에 있어서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 제 1 친화도 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
50. 실시양태 49 에 있어서, 폴리펩티드는 제 1 친화도 뉴클레오타이드 서열에 공유적으로 연결되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
51. 실시양태 49 에 있어서, 제 1 친화도 뉴클레오타이드 서열은 리간드를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
52. 실시양태 51 에 있어서, 리간드는 제 1 친화도 뉴클레오타이드 서열에 공유적으로 연결되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
53. 실시양태 49 에 있어서, 제 1 친화도 뉴클레오타이드 서열은 리간드-결합 모이어티를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
54. 실시양태 53 에 있어서, 리간드-결합 모이어티는 제 1 친화도 뉴클레오타이드 서열에 공유적으로 연결되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
55. 실시양태 34 또는 35 에 있어서, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 제 2 친화도 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
56. 실시양태 55 에 있어서, 폴리펩티드는 제 2 친화도 뉴클레오타이드 서열에 공유적으로 연결되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
57. 실시양태 55 에 있어서, 제 2 친화도 뉴클레오타이드 서열은 리간드를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
58. 실시양태 57 에 있어서, 리간드는 제 2 친화도 뉴클레오타이드 서열에 공유적으로 연결되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
59. 실시양태 55 에 있어서, 제 2 친화도 뉴클레오타이드 서열은 리간드-결합 모이어티를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
60. 실시양태 59 에 있어서, 리간드-결합 모이어티는 제 2 친화도 뉴클레오타이드 서열에 공유적으로 연결되어 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
61. 실시양태 3, 6, 7, 8, 9, 또는 10 중 어느 하나에 있어서, (i) 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 은 2 개의 근접 뉴클레오타이드를 포함하고, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 2 개의 근접 뉴클레오타이드에 상보적인 2 개의 근접 뉴클레오타이드를 포함하고, (ii) 넥서스 스템 엘리먼트는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 2 개의 근접 뉴클레오타이드와 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 2 개의 근접 뉴클레오타이드 사이에 염기-쌍 수소 결합을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
62. 실시양태 61 에 있어서, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 2 개의 근접 뉴클레오타이드는 퓨린 염기를 갖는 뉴클레오타이드 및 퓨린 염기를 갖는 뉴클레오타이드, 피리미딘 염기를 갖는 뉴클레오타이드 및 피리미딘 염기를 갖는 뉴클레오타이드, 및 퓨린 염기를 갖는 뉴클레오타이드 및 피리미딘 염기를 갖는 뉴클레오타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
63. 실시양태 3, 6 내지 10, 또는 13 내지 60 중 어느 하나에 있어서,
넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 은 2 개의 근접 뉴클레오타이드를 포함하며, 제 1 뉴클레오타이드 (N1) 는 제 2 뉴클레오타이드 (N2) 에 근접하며, 여기에서 N2 는 N1 의 3' 에 있고,
넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 2 개의 근접 뉴클레오타이드를 포함하며, 제 1 뉴클레오타이드 (Nc1) 는 제 2 뉴클레오타이드 (Nc2) 에 근접하며, 여기에서 Nc1 은 Nc2 의 3' 에 있고,
여기에서 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 의 N1-N2 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 의 Nc1-Nc2 에 상보적인,
조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
64. 실시양태 11, 12, 또는 63 중 어느 하나에 있어서, N1 은 퓨린 염기를 갖고, N2 는 퓨린 염기를 갖고, Nc1 은 피리미딘 염기를 갖고, Nc2 는 피리미딘 염기를 갖는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
65. 실시양태 64 에 있어서, N1 의 퓨린 염기는 아데닌이고, N2 의 퓨린 염기는 아데닌이고, Nc1 의 피리미딘 염기는 티민 또는 우라실이고, Nc2 의 피리미딘 염기는 티민 또는 우라실이며, 여기에서 Nc1 의 피리미딘 염기 및 Nc2 의 피리미딘 염기는 동일한, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
66. 실시양태 64 에 있어서, N1 의 퓨린 염기는 구아노신이고, N2 의 퓨린 염기는 구아노신이고, Nc1 의 피리미딘 염기는 시토신이고, Nc2 의 피리미딘 염기는 시토신인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
67. 실시양태 11, 12, 또는 63 중 어느 하나에 있어서, N1 은 피리미딘 염기를 갖고, N2 는 피리미딘 염기를 갖고, Nc1 은 퓨린 염기를 갖고, Nc2 는 퓨린 염기를 갖는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
68. 실시양태 67 에 있어서, N1 의 피리미딘 염기는 티민 또는 우라실이고, N2 의 피리미딘 염기는 티민 또는 우라실이고, Nc1 의 퓨린 염기는 아데닌이고, Nc2 의 퓨린 염기는 아데닌이며, 여기에서 N1 의 피리미딘 염기 및 N2 의 피리미딘 염기는 동일한, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
69. 실시양태 11, 12, 또는 63 중 어느 하나에 있어서, N1 은 피리미딘 염기를 갖고, N2 는 퓨린 염기를 갖고, Nc1 은 퓨린 염기를 갖고, Nc2 는 피리미딘 염기를 갖는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
70. 실시양태 11, 12, 또는 63 중 어느 하나에 있어서, N1 은 퓨린 염기를 갖고, N2 는 피리미딘 염기를 갖고, Nc1 은 피리미딘 염기를 갖고, Nc2 는 퓨린 염기를 갖는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
71. 실시양태 3, 7, 8, 11, 13, 14, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 RNA 염기, DNA 염기, 또는 RNA 염기와 DNA 염기의 조합을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
72. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 RNA 염기, DNA 염기, 또는 RNA 염기와 DNA 염기의 조합을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
73. 실시양태 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 RNA 염기, DNA 염기, 또는 RNA 염기와 DNA 염기의 조합을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
74. 실시양태 3, 7, 8, 11, 13, 14, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 RNA 를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
75. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 RNA 를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
76. 실시양태 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드는 RNA 를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
77. 실시양태 1 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드는 5' 말단 서열 및/또는 3' 말단 서열을 포함하고, 5' 말단 서열, 3' 말단 서열, 또는 5' 말단 서열 및 3' 말단 서열은 엑소뉴클레아제 저항성 모이어티를 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
78. 실시양태 3, 7, 8, 11, 13, 14, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 핵산, 펩티드-핵산, 트레오스 핵산, 또는 그들의 조합을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
79. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 핵산, 펩티드-핵산, 트레오스 핵산, 또는 그들의 조합을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
80. 실시양태 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 포스포로티오에이트 핵산, 펩티드-핵산, 트레오스 핵산, 또는 그들의 조합을 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
81. 실시양태 3, 7, 8, 11, 13, 14, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 원형인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
82. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 원형인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
83. 실시양태 19 또는 20 에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 및 스페이서 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 원형인, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
84. 실시양태 3, 7, 8, 11, 13, 14, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, Cas9 단백질을 추가로 포함하며, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 RNA 를 포함하고, 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 Cas9 단백질과의 복합체로 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
85. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나에 있어서, Cas9 단백질을 추가로 포함하며, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 RNA 를 포함하고, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드는 Cas9 단백질과의 복합체로 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
86. 실시양태 1 내지 83 중 어느 하나에 있어서, Cas9 단백질을 추가로 포함하며, 여기에서 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 Cas9 단백질과의 복합체로 있는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
87. 실시양태 1 내지 83 중 어느 하나에 있어서, Cas9 단백질 코딩 서열을 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
88. 실시양태 1 내지 83 중 어느 하나에 있어서, Cas9 단백질을 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
89. 실시양태 88 에 있어서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 폴리뉴클레오타이드와의 복합체로 Cas9 단백질을 추가로 포함하는, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템.
90. 실시양태 3, 7, 8, 11, 13, 14, 또는 18 중 어느 하나의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 제조 방법으로서, 방법은 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 또는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드 둘다를 화학적으로 합성하는 것을 포함하는, 방법.
91. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 제조 방법으로서, 방법은 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 또는 그들의 임의의 조합을 화학적으로 합성하는 것을 포함하는, 방법.
92. 실시양태 1 내지 89 중 어느 하나의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 제조 방법으로서, 방법은 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 화학적으로 합성하는 것을 포함하는, 방법.
93. 하기를 포함하는, 하나 이상의 발현 카세트:
실시양태 76 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터.
94. 실시양태 93 에 있어서, Cas9 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터 및 번역 조절 서열을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트를 추가로 포함하는, 하나 이상의 발현 카세트.
95. 하기를 포함하는, 하나 이상의 발현 카세트:
실시양태 75 의 제 1 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 제 1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, 실시양태 75 의 제 2 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 제 2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, 및 실시양태 75 의 제 3 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 제 3 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터.
96. 실시양태 95 에 있어서, Cas9 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터 및 번역 조절 서열을 포함하는 제 4 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트를 추가로 포함하는, 하나 이상의 발현 카세트.
97. 실시양태 93 의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 재조합 세포.
98. 실시양태 95 의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 재조합 세포.
99. 실시양태 97 에 있어서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 DNA 서열로부터 전사되는, 재조합 세포.
100. 실시양태 98 에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 제 1 DNA 서열로부터 전사되고, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 제 2 DNA 서열로부터 전사되고, 제 3 폴리뉴클레오타이드는 제 3 DNA 서열로부터 전사되는, 재조합 세포.
101. 실시양태 94 의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 재조합 세포.
102. 실시양태 96 의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 재조합 세포.
103. 실시양태 101 에 있어서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 DNA 서열로부터 전사되고, Cas9 단백질은 재조합 세포에서 발현되는, 재조합 세포.
104. 실시양태 102 에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오타이드는 제 1 DNA 서열로부터 전사되고, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 제 2 DNA 서열로부터 전사되고, 제 3 폴리뉴클레오타이드는 제 3 DNA 서열로부터 전사되고, Cas9 단백질은 재조합 세포에서 발현되는, 재조합 세포.
105. 실시양태 97 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 세포는 식물 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 또는 포유류 세포인, 재조합 세포.
106. 실시양태 105 에 있어서, 세포는 수수, 콩, 쌀, 밀, 옥수수, 기름-생산 브라시카, 면, 사탕수수, 해바라기, 조, 및 알팔파로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식물의 식물 세포인, 재조합 세포.
107. 실시양태 97 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 발현 카세트 중 적어도 하나의 발현 카세트는 재조합 세포의 게놈 DNA 내의 자리에서 통합되는, 재조합 세포.
108. 실시양태 107 에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트는 재조합 세포의 게놈 DNA 내의 자리에서 통합되고, Cas9 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 프로모터 및 번역 조절 서열을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트는 재조합 세포의 게놈 DNA 내의 자리에서 통합되는, 재조합 세포.
109. 실시양태 107 에 있어서, 발현 벡터는 하나 이상의 발현 카세트 중 적어도 하나를 포함하는, 재조합 세포.
110. 실시양태 97 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 발현 벡터는 하나 이상의 발현 카세트 중 적어도 하나를 포함하는, 재조합 세포.
111. 실시양태 76 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 를 포함하는, 재조합 세포.
112. 실시양태 75 의 제 1 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 제 1 DNA 서열, 실시양태 75 의 제 2 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 제 2 DNA 서열, 및 실시양태 75 의 제 3 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 제 3 DNA 서열을 포함하는, 재조합 세포.
113. 실시양태 76 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템 및 Cas9 단백질을 포함하는 재조합 세포로서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상 및 Cas9 단백질은 복합체로 있는, 재조합 세포.
114. 실시양태 75 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 및 Cas9 단백질을 포함하는 재조합 세포로서, 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 및 Cas9 단백질은 복합체로 있는, 재조합 세포.
115. 재조합 세포로부터 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드를 단리하는 것을 포함하는, 실시양태 99 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드의 제조 방법.
116. 재조합 세포로부터 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드를 단리하는 것을 포함하는, 실시양태 100 의 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드의 제조 방법.
117. 실시양태 1 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상 및 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 사용에 관한 지침을 포함하는 키트.
118. 실시양태 117 에 있어서, Cas9 단백질을 추가로 포함하는, 키트.
119. 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 및 제 3 폴리뉴클레오타이드, 및 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 사용에 관한 지침을 포함하는 키트.
120. 실시양태 119 에 있어서, Cas9 단백질을 추가로 포함하는, 키트.
121. 실시양태 93, 94, 95, 또는 96 중 하나 이상의 발현 카세트 및 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템의 사용에 관한 지침을 포함하는 키트.
122. 실시양태 121 에 있어서, 발현 벡터는 하나 이상의 발현 카세트 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
123. 하기를 포함하는, 약학적 조성물:
Cas9 단백질;
실시양태 76 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 여기에서 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상은 Cas9 단백질과의 복합체로 있음; 및
약학적으로 허용가능한 부형제.
124. 하기를 포함하는, 약학적 조성물:
Cas9 단백질;
실시양태 75 의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 폴리뉴클레오타이드는 Cas9 단백질과의 복합체로 있음; 및
약학적으로 허용가능한 부형제.
125. 하기를 포함하는, 약학적 조성물:
실시양태 93, 94, 95, 96 중 어느 하나의 하나 이상의 발현 카세트; 및
약학적으로 허용가능한 부형제.
126. 하기 단계를 포함하는, DNA 의 변형 방법:
DNA 내의 DNA 표적 서열을 실시양태 1 내지 83 중 어느 하나의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 및 Cas9 단백질과 접촉시키는 단계,
여기에서 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 및 Cas9 단백질은 복합체를 형성하며, 이 복합체가 DNA 표적 서열에 결합하여 잘라서, DNA 의 변형을 초래함.
127. 실시양태 126 에 있어서, 진핵생물 세포 내의 게놈 DNA 를 변형시키는 생체내 (in vivo) 방법인, 방법.
128. 실시양태 126 에 있어서, 유기체로부터 단리된 진핵생물 세포 내의 게놈 DNA 를 변형시키는 생체외 (ex vivo) 방법인, 방법.
129. 실시양태 126 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
게놈 DNA 내의 DNA 표적 서열을 공여자 DNA 주형과 접촉시키는 단계, 여기에서 변형은 공여자 DNA 주형의 적어도 일부가 DNA 표적 서열에서 통합되는 것을 포함함.
130. 실시양태 129 에 있어서, 표적화 벡터는 공여자 DNA 주형을 포함하는, 방법.
131. 하기 단계를 포함하는, DNA 의 변형 방법:
DNA 내의 DNA 표적 서열을 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 및 Cas9 단백질과 접촉시키는 단계,
여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 및 Cas9 단백질은 복합체를 형성하며, 이 복합체가 DNA 표적 서열에 결합하여 잘라서, DNA 의 변형을 초래함.
132. 실시양태 131 에 있어서, 진핵생물 세포 내의 게놈 DNA 를 변형시키는 생체내 방법인, 방법.
133. 실시양태 131 에 있어서, 유기체로부터 단리된 진핵생물 세포 내의 게놈 DNA 를 변형시키는 생체외 방법인, 방법.
134. 실시양태 131 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
게놈 DNA 내의 DNA 표적 서열을 공여자 DNA 주형과 접촉시키는 단계
여기에서 변형은 공여자 DNA 주형의 적어도 일부가 DNA 표적 서열에서 통합되는 것을 포함함.
135. 실시양태 134 에 있어서, 표적화 벡터는 공여자 DNA 주형을 포함하는, 방법.
136. 하기 단계를 포함하는, 전사 조절 엘리먼트를 포함하는 유전자의 발현의 조정 방법:
유전자 내의 DNA 표적 서열을 실시양태 1 내지 83 중 어느 하나의 조작된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 및 Cas9 단백질과 접촉시키는 단계,
여기에서 조작된 타입 II CRISPR-Cas9 폴리뉴클레오타이드 및 Cas9 단백질은 복합체를 형성하며, 이 복합체가 DNA 표적 서열에 결합하여, 유전자의 발현의 조정을 초래함.
137. 실시양태 136 에 있어서, Cas9 단백질은 뉴클레아제-결핍성인 Cas9 인, 방법.
138. 실시양태 136 또는 137 에 있어서, 복합체는 융합 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
139. 하기 단계를 포함하는, 전사 조절 엘리먼트를 포함하는 유전자의 발현의 조정 방법:
유전자 내의 DNA 표적 서열을 실시양태 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 또는 20 중 어느 하나의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 시스템, 및 Cas9 단백질과 접촉시키는 단계,
여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리펩티드 및 Cas9 단백질은 복합체를 형성하며, 이 복합체가 DNA 표적 서열에 결합하여, 유전자의 발현의 조정을 초래함.
140. 실시양태 139 에 있어서, Cas9 단백질은 뉴클레아제-결핍성인 Cas9 인, 방법.
141. 실시양태 139 또는 140 에 있어서, 복합체는 Cas9 융합 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
142. 실시양태 93, 94, 95, 또는 96 중 어느 하나의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
143. 실시양태 142 에 있어서, 벡터는 박테리아 벡터, 효모 벡터, 조류 벡터, 곤충 세포 벡터, 포유류 벡터, 및 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 벡터.
당업자에게 분명한 바와 같이, 본 발명의 주제 및 범위에서 벗어나지 않으면서 상기 실시양태의 다양한 변경 및 변화가 만들어질 수 있다. 그러한 변경 및 변화는 본 발명의 범위 내에 있다.
<110> Caribou Biosciences, Inc. <120> ENGINEERED CRISPR-CAS9 COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> CBI017.30 <150> 62/202,715 <151> 2015-08-07 <150> 62/209,334 <151> 2015-08-24 <160> 128 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Streptococcus pyogenes <400> 1 caaaacagca uagcaaguua aaauaaggcu a 31 <210> 2 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Streptococcus pyogenes <400> 2 guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuuuuu 46 <210> 3 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Streptococcus thermophilus CRISPR-I <400> 3 uaaaucuugc agaagcuaca acgauaaggc uuc 33 <210> 4 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Streptococcus thermophilus CRISPR-I <400> 4 augccgaaau caacacccug ucauuuuaug gcaggguguu uucguuauuu uuuu 54 <210> 5 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Listeria innocua <400> 5 caaaauaaca uagcaaguua 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ggcaaa 46 <210> 12 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Staphylococcus aureus <400> 12 augccguguu uaucucguca acuuguuggc gagauuuuu 39 <210> 13 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Corynebacterium diphtheriae <400> 13 agucacuaac uuaauuaaau agaacugaac cucaguaagc auuggcuc 48 <210> 14 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Corynebacterium diphtheriae <400> 14 guuuccaaug uugauugcuc cgccggugcu ccuuauuuuu aagggcgccg gcuuucuu 58 <210> 15 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Parvibaculum lavamentivorans <400> 15 uagcaaaucg agaggcgguc gcuuuucgca agcaaauuga ccccuu 46 <210> 16 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Parvibaculum lavamentivorans <400> 16 gugcgggcuc ggcaucccaa ggucagcugc cgguuauuau cgaaaaggcc caccgcaagc 60 agcgcguggg ccuuuuu 77 <210> 17 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Campylobacter lari <400> 17 aauucuugcu aaagaaauuu aaaaagagac uaaaauaagu gguuuuuggu c 51 <210> 18 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Campylobacter lari <400> 18 auccacgcag gguuacaauc ccuuuaaaac cauuaaaauu caaauaaacu agguuguauc 60 aacuuaguuu uuu 73 <210> 19 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Neisseria cinerea <400> 19 auugucgcac ugcgaaauga gaaccguugc uacaauaagg ccgucugaaa 50 <210> 20 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Neisseria cinerea <400> 20 agaugugccg caacgcucug ccccuuaaag cuucugcuuu aaggggcauc guuuauuucg 60 guuaaaaaug ccgucugaaa ccgguuuuu 89 <210> 21 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Streptococcus pasteurianus <400> 21 cuugcacggu uacuuaaauc uugcugagcc uacaaagaua aggcuuu 47 <210> 22 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Streptococcus pasteurianus <400> 22 augccgaauu caagcacccc auguuuugac augaggugcu uuu 43 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 23 agtaataata cgactcacta tag 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 24 aagcaccgac tcggtgccac tttt 24 <210> 25 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 25 taatacgact cactatagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctt 58 <210> 26 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 26 taatacgact cactatagca ggacagcata gcaagttgag ataaggcta 49 <210> 27 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 27 tagccttatc tcaacttgct atgctgtcct gctatagtga gtcgtatta 49 <210> 28 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 28 taatacgact cactataggg gccactaggg acaggatgtc tcagagctat gctgt 55 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 29 acagcatagc tctgagacat cctgtcccta 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Primer <400> 36 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctctccgaca ctctttccct acacgacg 58 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 37 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgactagaca ctctttccct acacgacg 58 <210> 38 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 38 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tctagctaca ctctttccct acacgacg 58 <210> 39 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 39 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ctagagtaca ctctttccct acacgacg 58 <210> 40 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 40 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tattaagaca ctctttccct acacgacg 58 <210> 41 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 41 ggcagtagcc ttatctcaac ttgctatgct gtcctgtttc caggacagca tagctctgag 60 ac 62 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 42 ggcagtagcc ttatctcaac 20 <210> 43 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 43 taatacgact cactataggc aggtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 60 ctt 63 <210> 44 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 44 ggcagtgaac tagccttatc tcaacttgct atgctgtcct gtttccagga cagcatagct 60 ctgagac 67 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 45 ggcagtgaac tagccttatc 20 <210> 46 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 46 taatacgact cactataggc agctaaggtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt 60 cggtgctt 68 <210> 47 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 47 taatacgact cactataggg gccactaggg acaggatgtc tcagagctat gctgtc 56 <210> 48 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 48 taatacgact cactatagtt tgtgtttcca taaactggtc 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<223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 108 gcggucgggg aauaagguau guuuuuguac ucgaaagaag cuacaaagau aagg 54 <210> 109 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 109 augccgaaau caacacccug ucauuuuaug gcaggguguu u 41 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 110 tgtaaggaag ctgcagcacc agg 23 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 111 tctttgcctg gacaccccgt tc 22 <210> 112 <211> 118 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9-associated sgRNA <400> 112 agacccaaua ucaggagacu gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau gaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuu 118 <210> 113 <211> 118 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9-associated sgRNA <400> 113 ugucccuagu ggccccacug gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau gaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuu 118 <210> 114 <211> 118 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9-associated sgRNA <400> 114 cggggacaca ggaucccugg gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau gaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuu 118 <210> 115 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 115 agacccaaua ucaggagacu gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aag 73 <210> 116 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 116 ugucccuagu ggccccacug gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aag 73 <210> 117 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 117 cggggacaca ggaucccugg gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aag 73 <210> 118 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 118 gcuaguccgu uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuu 45 <210> 119 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 119 agacccaaua ucaggagacu gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aaggcu 76 <210> 120 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 120 ugucccuagu ggccccacug gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aaggcu 76 <210> 121 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 121 cggggacaca ggaucccugg gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aaggcu 76 <210> 122 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 122 gaguccguua ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cuu 43 <210> 123 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 123 agacccaaua ucaggagacu gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aaggcuag 78 <210> 124 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 124 ugucccuagu ggccccacug gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aaggcuag 78 <210> 125 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 125 cggggacaca ggaucccugg gucucagagc uaugcugucc uggaaacagg acagcauagc 60 aaguugagau aaggcuag 78 <210> 126 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Split-nexus Cas9-associated RNA <400> 126 guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu u 41 <210> 127 <211> 1387 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 127 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1155 1160 1165 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys 1185 1190 1195 1200 Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1205 1210 1215 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1220 1225 1230 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 1280 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys 1285 1290 1295 His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu 1300 1305 1310 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp 1315 1320 1325 Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp 1330 1335 1340 Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1345 1350 1355 1360 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1365 1370 1375 Val Glu Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp 1380 1385 <210> 128 <211> 1168 <212> PRT <213> Streptococcus thermophilus <400> 128 Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Ser Asp Leu Val Leu Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Ile Gly Ser Val Gly Val Gly Ile Leu Asn Lys Val 20 25 30 Thr Gly Glu Ile Ile His Lys Asn Ser Arg Ile Phe Pro Ala Ala Gln 35 40 45 Ala Glu Asn Asn Leu Val Arg Arg Thr Asn Arg Gln Gly Arg Arg Leu 50 55 60 Thr Arg Arg Lys Lys His Arg Arg Val Arg Leu Asn Arg Leu Phe Glu 65 70 75 80 Glu Ser Gly Leu Ile Thr Asp Phe Thr Lys Ile Ser Ile Asn Leu Asn 85 90 95 Pro Tyr Gln Leu Arg Val Lys Gly Leu Thr Asp Glu Leu Ser Asn Glu 100 105 110 Glu Leu Phe Ile Ala Leu Lys Asn Met Val Lys His Arg Gly Ile Ser 115 120 125 Tyr Leu Asp Asp Ala Ser Asp Asp Gly Asn Ser Ser Val Gly Asp Tyr 130 135 140 Ala Gln Ile Val Lys Glu Asn Ser Lys Gln Leu Glu Thr Lys Thr Pro 145 150 155 160 Gly Gln Ile Gln Leu Glu Arg Tyr Gln Thr Tyr Gly Gln Leu Arg Gly 165 170 175 Asp Phe Thr Val Glu Lys Asp Gly Lys Lys His Arg Leu Ile Asn Val 180 185 190 Phe Pro Thr Ser Ala Tyr Arg Ser Glu Ala Leu Arg Ile Leu Gln Thr 195 200 205 Gln Gln Glu Phe Asn Pro Gln Ile Thr Asp Glu Phe Ile Asn Arg Tyr 210 215 220 Leu Glu Ile Leu Thr Gly Lys Arg Lys Tyr Tyr His Gly Pro Gly Asn 225 230 235 240 Glu Lys Ser Arg Thr Asp Tyr Gly Arg Tyr Arg Thr Ser Gly Glu Thr 245 250 255 Leu Asp Asn Ile Phe Gly Ile Leu Ile Gly Lys Cys Thr Phe Tyr Pro 260 265 270 Asp Glu Phe Arg Ala Ala Lys Ala Ser Tyr Thr Ala Gln Glu Phe Asn 275 280 285 Leu Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Thr Val Pro Thr Glu Thr Lys Lys 290 295 300 Leu Ser Lys Glu Gln Lys Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Val Lys Asn Glu 305 310 315 320 Lys Ala Met Gly Pro Ala Lys Leu Phe Lys Tyr Ile Ala Lys Leu Leu 325 330 335 Ser Cys Asp Val Ala Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Asp Lys Ser Gly 340 345 350 Lys Ala Glu Ile His Thr Phe Glu Ala Tyr Arg Lys Met Lys Thr Leu 355 360 365 Glu Thr Leu Asp Ile Glu Gln Met Asp Arg Glu Thr Leu Asp Lys Leu 370 375 380 Ala Tyr Val Leu Thr Leu Asn Thr Glu Arg Glu Gly Ile Gln Glu Ala 385 390 395 400 Leu Glu His Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Ser Gln Lys Gln Val Asp 405 410 415 Glu Leu Val Gln Phe Arg Lys Ala Asn Ser Ser Ile Phe Gly Lys Gly 420 425 430 Trp His Asn Phe Ser Val Lys Leu Met Met Glu Leu Ile Pro Glu Leu 435 440 445 Tyr Glu Thr Ser Glu Glu Gln Met Thr Ile Leu Thr Arg Leu Gly Lys 450 455 460 Gln Lys Thr Thr Ser Ser Ser Asn Lys Thr Lys Tyr Ile Asp Glu Lys 465 470 475 480 Leu Leu Thr Glu Glu Ile Tyr Asn Pro Val Val Ala Lys Ser Val Arg 485 490 495 Gln Ala Ile Lys Ile Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Tyr Gly Asp Phe 500 505 510 Asp Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Thr Asn Glu Asp Asp Glu 515 520 525 Lys Lys Ala Ile Gln Lys Ile Gln Lys Ala Asn Lys Asp Glu Lys Asp 530 535 540 Ala Ala Met Leu Lys Ala Ala Asn Gln Tyr 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Val Ser Pro Trp Arg Ala 965 970 975 Asp Val Tyr Phe Asn Lys Thr Thr Gly Lys Tyr Glu Ile Leu Gly Leu 980 985 990 Lys Tyr Ala Asp Leu Gln Phe Glu Lys Gly Thr Gly Thr Tyr Lys Ile 995 1000 1005 Ser Gln Glu Lys Tyr Asn Asp Ile Lys Lys Lys Glu Gly Val Asp Ser 1010 1015 1020 Asp Ser Glu Phe Lys Phe Thr Leu Tyr Lys Asn Asp Leu Leu Leu Val 1025 1030 1035 1040 Lys Asp Thr Glu Thr Lys Glu Gln Gln Leu Phe Arg Phe Leu Ser Arg 1045 1050 1055 Thr Met Pro Lys Gln Lys His Tyr Val Glu Leu Lys Pro Tyr Asp Lys 1060 1065 1070 Gln Lys Phe Glu Gly Gly Glu Ala Leu Ile Lys Val Leu Gly Asn Val 1075 1080 1085 Ala Asn Ser Gly Gln Cys Lys Lys Gly Leu Gly Lys Ser Asn Ile Ser 1090 1095 1100 Ile Tyr Lys Val Arg Thr Asp Val Leu Gly Asn Gln His Ile Ile Lys 1105 1110 1115 1120 Asn Glu Gly Asp Lys Pro Lys Leu Asp Phe Gly Ser Ala Tyr Pro Tyr 1125 1130 1135 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys 1140 1145 1150 Arg Lys Val Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Ser Gly 1155 1160 1165

Claims (23)

  1. 하기를 포함하는 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물:
    5' 에서 3' 방향으로, 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 1 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN);
    5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 2 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN), 여기에서 sn1-casPN 의 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn2-casPN 의 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음; 및
    5' 에서 3' 방향으로, 핵산 표적 결합 서열 및 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 3 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN), 여기에서 sn1-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 1 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
  2. 제 1 항에 있어서,
    sn1-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 은, 5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고,
    sn3-casPN 의 제 1 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는, 5' 에서 3' 방향으로, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 여기에서 sn1-casPN 의 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, sn1-casPN 의 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있는,
    타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물:
    제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드; 여기에서
    sn2-casPN 는, 5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고,
    sn2-casPN 의 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 2 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
  4. 제 3 항에 있어서, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하고, 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단은 sn2-casPN 의 3' 말단에 공유 결합되어 있는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물:
    제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드; 여기에서
    제 1 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열, 제 2 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하고,
    제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드의 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 제 3 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
  6. 제 5 항에 있어서, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 루프 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 및 제 3 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하며, 제 2 부속 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단은 제 1 부속 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단에 공유 결합되어 있는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, sn1-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, sn2-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    sn1-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고,
    sn2-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하고,
    제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 효과기 결합 엘리먼트를 형성할 수 있는,
    타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 추가로 포함하고,
    제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 효과기 결합 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하고, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 링커 엘리먼트를 형성할 수 있는,
    타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 효과기 결합 엘리먼트는 이중-가닥 RNA 이고, 효과기 결합 엘리먼트는 Csy4 단백질 결합 자리를 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  12. 제 7 항, 제 9 항, 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀을 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  13. 제 8 항, 제 9 항, 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀을 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    제 1 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 헤어핀을 추가로 포함하고,
    제 2 보조 폴리뉴클레오타이드는, 5' 에서 3' 방향으로, 헤어핀 및 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 추가로 포함하고,
    제 1 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드의 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 링커 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 링커 엘리먼트를 형성할 수 있는,
    타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  15. 하기를 포함하는 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물:
    5' 에서 3' 방향으로, 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I, 및 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 을 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 1 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn1-casPN);
    5' 에서 3' 방향으로, 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 헤어핀을 포함하는 제 2 스템 엘리먼트, 및 헤어핀을 포함하는 제 3 스템 엘리먼트를 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 2 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn2-casPN), 여기에서 sn1-casPN 의 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn2-casPN 의 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 넥서스 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음; 및
    5' 에서 3' 방향으로, DNA 표적 결합 서열, 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 벌지 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II, 및 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 를 포함하는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 제 3 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 (sn3-casPN), 여기에서 sn1-casPN 의 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 상부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 상부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있고, sn1-casPN 의 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 및 sn3-casPN 의 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 는 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 과 하부 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 사이에서 염기-쌍 수소 결합에 의해 하부 스템 엘리먼트를 형성할 수 있음.
  16. 제 15 항에 있어서, sn1-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 I 에 3' 인접한 제 1 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, sn2-casPN 는 넥서스 스템 엘리먼트 뉴클레오타이드 서열 II 에 5' 인접한 제 2 보조 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  17. 하기를 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 시스템:
    제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물; 및
    Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  18. 하기를 포함하는, 약학적 조성물:
    제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물; 및
    약학적으로 허용가능한 부형제.
  19. 하기를 포함하는, 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체:
    제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물; 및
    Cas9 단백질;
    여기에서 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체는 핵산 표적 결합 서열에 상보적인 표적 핵산에 자리-지정 결합을 할 수 있음.
  20. 하기 단계를 포함하는, 표적 핵산의 절단 방법:
    표적 핵산을 포함하는 핵산을 제 19 항의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체와 접촉시켜, 그에 의해 표적 핵산에 대한 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체의 결합을 촉진시키는 단계, 여기에서 결합된 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체는 표적 핵산을 절단함.
  21. 하기 단계를 포함하는, 표적 핵산의 결합 방법:
    표적 핵산을 포함하는 핵산을 제 19 항의 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체와 접촉시켜, 그에 의해 표적 핵산에 대한 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드/Cas9 단백질 핵단백질 복합체의 결합을 촉진시키는 단계.
  22. 하기를 포함하는 키트:
    제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 타입 II CRISPR-Cas9-연합 스플릿-넥서스 폴리뉴클레오타이드 조성물, 및
    완충액.
  23. 제 22 항에 있어서, Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 키트.
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